JP2002538819A - 多様な細胞型におけるＴＥＴｏｎリプレッサーの一貫した細胞発現のための改善された発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターと、リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードする核酸とを含むベクターであって、該トランス活性化因子の発現が該タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターの制御下にあるベクターを提供する。さらに本発明は、誘導性テトラサイクリン調節遺伝子発現のためのリバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子発現系を作製する方法であって、（a）制限酵素消化による、リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードするDNA断片の単離；（b）制限酵素消化による、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターの作製；（c）5’ EcoRI適合性制限酵素突出末端のライゲーションによる、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターへのリバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子の定方向クローン化；（d）リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードするDNA断片の3’ BamHI末端およびタンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターの3’ XbaI末端のクレノウ断片媒介性平滑末端形成による、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターへのリバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子の定方向クローン化；（e）リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子を発現するタンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターを生成するための、部分的に連結した断片の平滑クローン化、を含む上記方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野 本出願は、1999年3月15日に出願された米国特許出願第09/268,303号(参照によ
りその記載内容は本明細書中に含まれるものとする)に基づいて優先権を主張す
るものであり、該出願の一部継続出願である。

【０００２】 本明細書中に開示される本発明は、米国保健社会福祉省の国立健康研究所（Na
tional Institutes of Health）からの認可第CA35675号の下、政府による支援を
得て成されたものである。従って、米国政府は、本発明について一定の権利を有
する。

【０００３】 本出願全体を通して、様々な刊行物が引用されている。これら刊行物の全開示
内容を参照により本明細書中に組み込むことにより、本明細書中に記載され特許
請求の範囲に記載された本発明の出願日における技術水準を、当業者に公知の技
術水準と同程度までより充分に十分に記載するものとする。

【０００４】背景技術 GossenおよびBujardによる最初の報告（GossenおよびBujard、1992）、ならび
にその後の異なる形態についての文献発表（Gossenら、1995）以来、テトラサイ
クリン (Tc)-調節系は、目的の遺伝子の誘導性発現を必要とする実験において広
く採用され、また優れた方法として広く認められている。その最初に報告された
形態では、前記系は２つのプラスミドを使用する。１つは、tTAまたはrtTA cDNA
（以後は共にTAと称する）を発現し、単純ヘルペスウイルス（HSV）のC末端側酸
性活性化ドメインであるVP16転写トランス活性化因子に融合した細菌Tc-リプレ
ッサーの融合タンパク質である。第２のプラスミドは、七量体化Tc-オペレータ
ー転写調節DNA配列の下流に位置する目的のcDNAのクローン化を可能とし、CMV I
EまたはHSVチミジンキナーセプロモーターのいずれかに由来する基底プロモータ
ー活性を提供するDNAエレメントに融合している。目的の遺伝子のTcにより調節
可能な発現(Tc-regulatable expression)を有する細胞系の樹立には、２つの工
程が含まれる。まず最初に、Tc-応答性リポーターを用いた一過性トランスフェ
クションによるクローン選択および発現分析により、TA cDNAを安定して発現す
る細胞系を樹立し同定する。第２の工程では、Tc-応答性エレメントの制御下で
クローン化した目的の遺伝子を前工程で作製した細胞系に導入し、第２ラウンド
の選択を実施することにより、前記cDNAのTc-応答性誘導能を示すクローンを同
定する（GossenおよびBujard、1992；Gossenら、1995）。Tc-調節系は、発現の
基底レベルが高い、応答性が劣る、および、誘導剤に毒性がある等、初期の系に
みられた多くの欠点を効果的に解決した。さらに、このTc-誘導系は、誘導物質
のレベルの変動に応答性であり、いくつかの等級を含む範囲にわたって、段階的
に誘導を達成することができる。さらに、前記系は極めて用途が広く、また種々
のタイプの改変が可能であるため、目的とする非常に多様な細胞型において、特
定の遺伝子またはその組合わせの役割について研究することができる。遺伝子治
療プロトコルや薬理学的小分子スクリーニングを含む医療用途においてこの系を
用いる可能性について、熱心に研究が進められている。その多用性により、動物
または植物モデルにおいて、組織特異的または普遍的な様式で誘導性遺伝子発現
を必要とする状況への適応が可能となり、in vivoでの遺伝子機能研究に新たな
道を切り開いた。

【０００５】 Tc-誘導性発現系は、性能の向上、あるいは、特定の用途への調整のため、様
々な方法で改変されてきた。自己調節制御は、tTAおよび外因性cDNAの両方をTc-
オペレーター配列の制御下に置くことにより達成され（Shocketら、1995）、こ
れによって、誘導時のみ、利用可能なtTAレベルの調節が可能になるとされてお
り、さらにこのことにより、陽性クローンの誘導性および頻度に関して全体的な
性能を向上させた。複数回のクローン選択を行う必要を無くすため、tTA配列と
目的の遺伝子とを逆配向で含む単プラスミドベクターが開発されている（Baron
ら、1995；Schultzeら、1996；Weinmannら、1994）。トランスフェクションしに
くい細胞へのDNAの導入を阻む、しばしば無視できない障害は、２つの別個のウ
イルスの一方または組合わせのいずれかに前記記系の両成分を送達するレトロウ
イルスベクターの開発により、解決が可能となった（Bohlら、1997；Hofmannら
、1996；Kringsteinら、1998；Paulusら、1996；Rossiら、1998）。幾つかのプ
ロモーターを用いることにより、植物（Weinmannら、1994）または動物（Efrat
ら、1995；Fishmanら、1994；Furthら、1994；Henninghausenら、1995）におい
てtTAを普遍的もしくは組織特異的に発現させることが可能になった。プラスミ
ドを含むTc-オペレーターを修飾することにより、漏出性(leaky)発現を低減する
、あるいは組み込み部位の作用を低減することが試みられてきた。この目標に対
する戦略は、エピソームのように維持されるエプスタイン・バー・ウイルス（EB
V）複製起点に基づくベクター（Jostら、1997）、非誘導発現を低減するための
修飾基底プロモーター（Hofmannら、1997）、および組み込み部位においてエレ
メントに干渉が近接するのを防止する配列の組み込み（Henninghausenら、1995
；McKnightら、1992；Stiefら、1989）を含む。

【０００６】 最初の報告書およびその他いくつかの研究結果には、考えられる落とし穴が記
載され、Tc調節系を用いての問題解決方法が提供されている（BlauおよびRossi
、1991；Gossenら、1994；ShockettおよびSchatz、1996を参照）。しかし、外部
から導入された遺伝子の有意なレベルでの発現または誘導性を示す細胞系の樹立
の失敗を、厳密ではないが、記録した事例証拠（Ackland-BerglundおよびLeib、
1995；GossenおよびBujard、1995）も存在する。CMVまたはSV-40由来の配列に基
づく強力なウイルスプロモーターを含む発現構築物を用いた以前の経験によれば
、トランス活性因子機能の発現の消去（extinction）は、Tc応答性細胞系の樹立
を不可能にする潜在的に重要な要因となり得る。これは、比較的遅い増殖速度お
よび／または分化能を有する細胞が、この現象に極めて敏感になっていることに
関連があると思われる。というのは、細胞生理学上の変化は、外部から導入され
たウイルスプロモーター構築物の活性に影響を及ぼし得るからである。初期TA発
現クローンの樹立と、目的の遺伝子を誘導可能に発現する細胞系の確認との間に
経過する時間は、十分長い時間であるが、恐らくはその間に、宿主細胞が、CMV
プロモーターエンハンサー発現を支持するのを止め、その結果TA発現の停止が起
こると思われる。近年、レトロウイルスベクターの導入により、単一工程、およ
びそれにより、比較的迅速な陽性クローンの選択が可能になったにも拘らず、こ
れらのベクターのいくつかは、１つ以上のエレメントを発現する際にウイルスプ
ロモーターに依存するため、同様の問題を起こしやすい。特定のレトロウイルス
の構築は、それ自体時間がかかり、細胞へのプラスミドDNAのトランスフェクシ
ョンまたは電気穿孔と比較して、多くの研究所ではまだ通常の手順とはなってい
ない。これらの要因に基づき、rtTA ｃDNA発現のための既存の構築物の改変は、
該構築物をヒトタンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーター（EF-1α）の
調節下に置くことにより達成された。この遺伝子は、すべての細胞においてハウ
スキーピング機能を有し、比較的高いレベルまで発現されることが報告されてい
る。さらに重要なことには、すべての細胞におけるその不可欠なハウスキーピン
グ機能のために、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーター（EF-1α）
発現は、時間的見地から一貫しており、細胞生理学上の変化からは比較的防御さ
れており、しかも細胞型に左右されない（Goldmanら、1996；Kimら、1990；Waka
bayashi-ItoおよびNagata、1994）。この構築物を、様々なヒト組織由来の細胞
系に用いたところ、これまで試みたすべてのケースで、Tc-調節可能系列の構築
に成功している。この改変ベクターは、普遍的に利用可能なだけではなく、Tc-
応答性クローンの樹立を成功させるのが困難であったケースに、特に有用となる
ことだろう。

【０００７】発明の概要 本発明は、前記のベクターを含む細胞を提供する。また、本発明では、該細胞
は、細胞系に由来するものとする。さらに、本発明では、該細胞系は、HeLa（ヒ
ト子宮頚管）、HO-1（ヒト黒色腫）、MCF-7（ヒト胸部）、PC3（ヒト前立腺）ま
たはDU-145（ヒト前立腺）とする。

【０００８】 本発明はまた、前記ベクターを含む動物を提供する。さらに本発明は、タンパ
ク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターと、リバース・テトラサイクリン制
御トランス活性化因子をコードする核酸であって、該トランス活性化因子の発現
が該タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターの制御下にある前記核酸
を含む動物を提供する。さらにまた、本発明では、前記動物は、限定するもので
はないが、マウスを含む。

【０００９】 本発明は、誘導性テトラサイクリン調節遺伝子発現のためのリバース・テトラ
サイクリン制御トランス活性化因子発現系を作製する方法であって、（a）制限
酵素消化による、リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコード
するDNA断片の単離；（b）制限酵素消化による、タンパク質翻訳ペプチド伸長因
子-1αプロモーターベクターの作製；（c）5’ EcoRI適合性制限酵素突出末端(o
verhangs)のライゲーションによる、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロ
モーターベクターへのリバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子の定
方向クローン化；（d）リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子を
コードするDNA断片の3’BamHI末端およびタンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1α
プロモーターベクターの3’ XbaI末端のクレノウ断片媒介性平滑末端形成による
、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターへのリバース・テ
トラサイクリン制御トランス活性化因子の定方向クローン化；（e）リバース・
テトラサイクリン制御トランス活性化因子を発現するタンパク質翻訳ペプチド伸
長因子-1αプロモーターベクターを生成するための、部分的に連結した断片の平
滑クローン化、を含む前記方法を提供する。

【００１０】 本発明は前記断片を提供するが、該断片は、限定するものではないが、EcoRI-
BAM HI断片を含む。前記哺乳動物発現ベクターは、限定するものではないが、pC
DEF3を含む。クローン化は、挿入物の5’ EcoRI部位および3’ BAM HI部位で、
またライゲーションは、pCDEF3の5’ EcoRI部位および3’ XbaI部位で、それぞ
れ生じるものとする。

【００１１】 本発明は、前記ベクターを用いて、薬理学的産物をスクリーニングする方法を
提供する。最後に、本発明は、上記ベクターを用いて、組織特異的または普遍的
な様式で誘導性遺伝子発現をモニターする方法を提供する。

【００１２】本発明の詳細な説明 本発明は、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターと、リバース・
テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードする核酸とを含むベクターで
あって、上記トランス活性化因子の発現が、上記タンパク質翻訳ペプチド伸長因
子-1αプロモーターの制御下にあるベクターを提供する。ある実施形態において
は、前記ベクターはプラスミドである。別の実施形態では、前記ベクターは図１
に記載の通りのものである。

【００１３】 本発明はさらに、前記ベクターを含む細胞を提供する。１実施形態では、該細
胞は、細胞系に由来するものである。別の実施形態では、該細胞系は、HeLa（ヒ
ト子宮頚管）、HO-1（ヒト黒色腫）、MCF-7（ヒト胸部）、PC3（ヒト前立腺）も
しくはDU-145（ヒト前立腺）である。

【００１４】 また、本発明は、前記ベクターを含む動物を提供する。本発明の１実施形態で
は、前記ベクターを該動物または該動物の祖先に、胚の段階で導入する。該動物
にはマウスが含まれるが、これに限定されるものではない。

【００１５】 本発明は、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターと、リバース・
テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードする核酸とを含む細胞を含む
動物であって、該トランス活性化因子の発現が該タンパク質翻訳ペプチド伸長因
子-1αプロモーターの制御下にある動物を提供する。

【００１６】 本発明は、誘導性テトラサイクリン調節遺伝子発現のためのリバース・テトラ
サイクリン制御トランス活性化因子発現系を作製する方法であって、(a)制限酵
素消化による、リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードす
るDNA断片の単離；(b)制限酵素消化による、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1
αプロモーターベクターの作製；(c)5’ EcoRI適合性制限酵素突出末端のライゲ
ーションによる、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターへ
のリバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子の定方向クローン化；(d
) リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードするDNA断片の3
’BamHI末端およびタンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクター
の3’ XbaI末端のクレノウ断片媒介性平滑末端形成による、タンパク質翻訳ペプ
チド伸長因子-1αプロモーターベクターへのリバース・テトラサイクリン制御ト
ランス活性化因子の定方向クローン化；(e)リバース・テトラサイクリン制御ト
ランス活性化因子を発現するタンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーター
ベクターを生成するための、部分的に連結した断片の平滑クローン化、を含む上
記方法を提供する。

【００１７】 本発明の方法によれば、前記断片にはEcoRI-BAM HI断片が含まれるが、これら
に限定されるわけではなく、哺乳動物発現ベクターはpCDEF3を含むが、これに限
定されない。クローン化は、挿入断片の5’ EcoRI部位および3’ BAM HI部位で
、またライゲーションはpCDEF3の5’ EcoRI部位および3’ XbaI部位で生じる。

【００１８】 本発明は、細胞における、テトラサイクリン・リプレッサーの一貫した細胞発
現を提供するために指令されたベクターを提供する。このようなベクターは、動
物もしくは植物モデルにおいて、組織特異的または普遍的な様式で誘導性遺伝子
発現を必要とする場合に有用でありうる。本発明の１実施形態では、薬理学的産
物をモニターすることにより、医療用途における使用について決定する。好まし
い実施形態では、老化、癌、発生、分化および増殖といった細胞過程に関連する
遺伝子変化についてモニターする。

【００１９】 さらに具体的には、当業者には公知の方法を用いて、細胞におけるテトラサイ
クリン・リプレッサーの細胞発現を提供するよう指令されたベクターを構築する
ことができる。これらの方法は、細胞培養技術の中でも、ノーザンブロッティン
グ、酵素活性分析、プラスミドの構築および配列決定を含む。例えば、Maniatis
ら、1989、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labo
ratory、N.Y.およびAusubelら、1989、Current Protocols in Molecular Biolog
y、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.に記載の技術
を参照のこと。

【００２０】 本明細書で用いる用語「テトラサイクリン制御トランス活性化因子(tetracycl
ine controlled transactivator)」とは、テトラサイクリンが存在する場合のみ
、下流のテトラサイクリン誘導オペレーター結合エレメントと結合してその転写
を活性化するタンパク質を発現するベクターを包含する。

【００２１】 本発明は、ベクターを用いて、薬理学的産物をスクリーニングする方法を提供
する。最後に、本発明は、ベクターを用いて、誘導性遺伝子発現をモニターする
方法を提供する。

【００２２】 本発明を、以下に示す「実験の詳細」の節で説明する。この節は、本発明の理
解を助けるために記載したものであり、特許請求の範囲に記載した本発明を決し
て制限する意図はなく、また、これを制限すると解釈すべきではない。

【００２３】実験の詳細 材料と方法 プラスミドの構築： pHUD 17-1neo（Gossenら、1995）からrtTAオープン・リーディング・フレームを
含むEcoRI-BamHI断片を単離した。哺乳動物発現ベクターpCDEF3（Goldmanら、19
96）に、該ベクターのマルチクローニングサイトの5’ EcoRI部位および3’ Xba
I部位において、この断片を定方向でクローン化することで、EF1prtTAと呼ばれ
る最終構築物を生成した。pCDEF3の3’ XbaI部位と、上記断片の3’BamHI部位と
のライゲーションは、突出末端をクレノウで充填し、これらを平滑末端とした後
、可能であった。この改変されたベクターは、上記rtTA遺伝子を、ヒトポリペプ
チド鎖伸長因子-1αプロモーター（EF-1a）の直接の転写制御下に置く。単離し
たcDNA断片をクレノウ充填平滑ベクターに平滑クローン化することにより、Mda-
7およびJun B cDNAを発現するプラスミドを、pUHD10-3（GossenおよびBujard、1
992）中に構築した後、確認のために配列分析を行った。

【００２４】細胞培養および安定した細胞系の誘導： この研究で用いた細胞系はすべて、以前に記載されている標準的条件（Giang
ら、1996）の下で、増殖させ、維持した。個々の細胞系に応じて、500〜1,000μ
g／ml のG148（Life Technologies Inc.）の存在下で、EF1prtTAを用いて、rtTA
cDNAを発現する安定したクローンの選択を実施した。選択時間の後、肉眼で見
えるコロニーを採取し、増殖させ、rtTA発現についてのルシフェラーゼ活性のア
ッセイ、あるいは、それぞれのMda-7またはJun Bのような誘導性cDNAのノーザン
ブロット分析により、活性を分析した。

【００２５】ノーザンブロッティング： RNAeasy キット（Qiagen）を用いてRNAを単離した後、変性ホルムアルデヒド
アガロースゲル電気泳動により全細胞RNAを分離した。次に、Hybondナイロン膜
（Amercham）上へと転写した後、Mda-7およびJun Bについて適当に標識したcDNA
プローブで探索した。

【００２６】ルシフェラーゼ活性分析： ルシフェラーゼアッセイは、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用
いて実施し、ターナー・デザイン(Turner Design) TD 20/20ルミノメーターで、
定量を実施した。等量のRNAを各ゲルにロードした後、260 nmで分光測光法によ
る評価を行った。サンプル間のRNAレベルの正規化を、臭化エチジウム染色ゲル
上でRNAを視覚化することにより、確認した。ルシフェラーゼ活性の正規化は、
タンパク質を定量し、抽出物の量を一定量のタンパク質に対して調整することに
より、達成した。

【００２７】結果 EF-1aプロモーターに基づくrtTA発現ベクターの構築および初期試験 EF-1aプロモーターrtTA（EF1prtTA）発現ベクターの構築で実施したクローン
化段階の詳細は、「材料と方法」、ならびに、図１に記載されている。このcDNA
により発現されるタンパク質である本来の細菌Tc-リプレッサーの突然変異体形
態（Gossenら、1995）は、Tcが存在する場合のみ、Tc-オペレーター結合エレメ
ントの下流にある遺伝子と結合し、これらの転写を活性化する。HO-1ヒト黒色腫
細胞中に、EF1prtTAをTc-応答性ルシフェラーゼ・リポーター・プラスミドであ
るpUHC13-3（Gossenら、1995）と、一過性の同時トランスフェクションを実施し
、該構築物が活性であるか否かを決定した。本来のCMV IEに基づく構築物である
pUHD17-1neo（Gossenら、1995）を用いて、１μg／mlのドキシサイクリン（Dox
）の不在または存在下で、並行セット（parallel set）のトランスフェクション
を実施した。トランスフェクションから48時間後、細胞を回収し、ルミノメータ
ーによるルシフェラーゼアッセイ系（Promega）を用いて、ルシフェラーゼ活性
（図２）を測定した。以前記録されている（Gossenら、1994；GossenおよびBuja
rd、1992；Gossenら、1995）ように、いったんプラスミドDNAがクロマチンに組
み込れると、発現の基本レベルが急激に変化するため、一過性アッセイは、安定
したクローンの最終的選択後に実際に得られる誘導性のレベルを十分に反映する
ものではない。初期の実験により、EF1prtTA発現ベクターは、一過性アッセイに
おける本来のpUHD17-1neo構築物に匹敵するレベルで機能的であることが明らか
にされた。得られた正の活性に基づき、EF1prtTA構築物を用いて、HeLa（ヒト子
宮頚癌）、HO-1（ヒト黒色腫）、MCF-7（ヒト乳癌）、ならびに、PC3およびDU-1
45（ヒト前立腺癌）癌細胞系に、rtTAを発現する安定した細胞系を樹立した。

【００２８】EF-1αプロモーターの調節下でのrtTA cDNAを発現する安定した細胞系の分析 取扱いプロトコルで推奨される標準的条件に基づくスーパーフェクト（Superf
ect）トランスフェクション試薬（Qiagen）を用いて、細胞をEF1prtTA構築物で
トランスフェクトした。トランスフェクションの効率は、選択時間の終了時に得
られたクローン数によって表されるが、これは、細胞系によって様々であった。
構築物内に存在するマーカーによって賦与されるネオマイシン耐性を用いて、コ
ロニーを選択した。各細胞系について、24個のネオマイシン耐性コロニーをさら
なる分析のために単離した。これらの個別に選択したクローンを、Tc-応答性ル
シフェラーゼリポーターpUHC13-3（Gossenら、1995）と、一過性にトランスフェ
クトさせることにより、rtTA活性の存在およびレベルを決定した。この一連の実
験で使用したいくつかの細胞系は、CMV IEに基づく構築物pUHD17-1neo（Gossen
ら、1995）を利用した以前の試行では、Tc-応答性クローンを産生することがで
きなかった。

【００２９】 HO-1、MCF-7、PC3およびDU-145細胞におけるTc-応答性クローン細胞系を同定
するためのスクリーニングで得られた結果は、１細胞系につき、24以下のクロー
ンのうち、平均して少なくとも２つのクローンが最終的に分析されたことを示し
、これは、ある程度のTc-応答性レベルを示している。この陽性クローンの頻度
は、以前に報告されているもの（GossenおよびBujard、1992；Gossenら、1995）
より高くはないとしても同等である。前述したように、Tcの存在下で観察された
フォールド（fold）誘導は、比較的低いものの、この初期のスクリーニングで用
いられた一過性のトランスフェクション条件による、非誘導条件下での漏出性発
現を表すものと考えられる。この漏出性にも拘わらず、誘導性の相対レベルが高
いまたは低いクローンは、すべての場合で同定可能であり、潜在的に使用可能な
細胞系が比較的容易に同定された。

【００３０】EF1prtTAの誘導性調節下でcDNAを発現する安定したクローンの機能分析 引き続き、本発明者らの研究の主眼を黒色腫分化における特定の遺伝子の役割
分析に絞りながら、Tc-調節下で、転写因子Jun Bおよび腫瘍サプレッサーMda-7
（Jiangら、1996）を含む分化関連遺伝子を発現する安定した細胞を、HO-1黒色
腫細胞において樹立した。このヒト黒色腫細胞系は、インターフェロンβと、プ
ロテインキナーゼC（PKF）活性化因子であるメゼレイン双方の存在下で、最終分
化する能力を有する。これは、その分化能力のために、培養条件に対して感受性
があり、トランスフェクトすることが難しく、しかも、選択の間、細胞のクロー
ン集団として再単離するのに適した可視コロニーを形成するのに、比較的長い時
間を要する。従って、HO-1は、EF-1αプロモーターに基づくベクターの効力につ
いて、理想的な準備基盤を提供する。前述した以前のスクリーニング（図３）で
同定された好適なrtTA発現細胞系を用いて、ベクターpUHD10-3（GossenおよびBu
jard、1992）中にクローン化された潜在的にTc-調節可能なJun BおよびMda-7 cD
NAで、トランスフェクションを実施した。コロニーを単離し、ノーザンブロッテ
ィングにより、Jun BおよびMda-7の発現および誘導について、個々のクローンを
分析した。個々のクローンの誘導性レベルを測定するため、Doxの不在または存
在下で増殖させた各クローンからRNAを単離した。Jun BおよびMda-7 cDNAプロー
ブで探索したノーザンブロット（図４）は、各cDNAについて、複数の陽性クロー
ンが得られたことを示した。予想した通り、様々な度合いのクローン依存性基本
レベルおよび誘導性レベルの発現が観察された。初期スクリーニング（前節、図
３）から選択された親EF1prtTA細胞系は、一過性アッセイで、それほど高いレベ
ルのフォールド誘導性を示さなかったことを認めることができる。しかし、安定
して組み込まれた形態で、Tc-オペレーター調節可能な構築物を導入すると、個
々のクローンで、高いレベルのTc-依存性誘導が観察された（図４Aは、誘導およ
び非誘導レベルについてレーン１、３、９、10および17を、同様に、図４Bは、
レーン１、４および９を比較する）。全体として、様々なクローンで得られた頻
度、変動性、および基本レベルから誘導レベルは、Tc-系について報告されたも
のと非常に近似している（Gossenら、1994；GossenおよびBujard、1992；Gossen
ら、1995）。

【００３１】論考 ある細胞型では、所与の型のプロモーター、特にウイルスを起原とするものは
継続的な強い発現を支持することができないことが記載されている（Gormanら、
1985；Hasegawaら、1990；Liら、1992；MillerおよびRizzino、1995；Sleigh、1
987）。この研究の主な目的は、Tc-誘導性細胞をうまく樹立する際の、有意な、
かつ、これまで取り組まれていない変数を低減することである。Tc-オペレータ
ー発現構築物であるpUHD 10-3（GossenおよびBujard、1992）もしくはその誘導
体（そこに、目的とするcDNAを通常クローン化する）の発現は、最終的に、tTA
またはrtTA遺伝子産物の発現に左右される。細胞系の樹立の間、もしくはその後
に、TA cDNA発現が停止されることを防止または回避すれば、細胞型に関連する
と思われる変数（Ackland-BerglundおよびLeib、1995；GossenおよびBujard、19
95）は、成功率をかなり引き上げるに違いない。時間的要因、細胞型、細胞の生
理学的状態および細胞の継代数とはあまり関係なく、着実かつ適切なレベルのTA
cDNA発現を達成するために、本発明者らは、CMV IEプロモーター・エンハンサ
ーに代わり、細胞性EF-1αプロモーターを用いた（Goldmanら、1996；Kimら、19
90；Wakabayashi-ItoおよびNagata、1994）。pUHD 17-1neo（Gossenら、1995）
を用いた経験から、ルシフェラーゼリポーターを用いた感受性検出方法を使用し
た一過性アッセイでの活性および誘導性は、合理的にうまく機能したが、サザン
分析（データは示していない）を用いたところ、ゲノム中に発現構築物DNAが存
在したにも拘わらず、個々の細胞系のクローン選択後に、目的遺伝子の何らかの
活性レベルを示す細胞を生成することはできなかった。

【００３２】 文献では、性能の向上を目的とする、基本的なTc-調節可能な系の多数の改変
が報告されている。複数の代替プロモーターを用いて、TA cDNAの発現の推進が
なされてきた。これらの多くは、植物（Weinmannら、1994）、キイロショウジョ
ウバエ（Bieschkeら、1998）またはマウス（Bohlら、1997；Dhawanら、1995；Fa
issら、1997；Hennighausenら、1995；Hoffmannら、1997；Holwellら、1997；Li
ら、1992；Liangら、1996；MillerおよびRizzino、1995；ThompsonおよびMyatt
、1997）における、組織または種特異的発現のための要件に基づいている。TA発
現構築物の別の改変は、反対方向に配向されたプロモーターにより、TA cDNAお
よびTc-オペレーター調節cDNAの両方の発現を推進する２シストロンもしくは多
シストロン的プラスミド構築物を用いることにより、主に、各プラスミドの２回
のトランスフェクションを回避することを含む（Baronら、1995；Fusseneggerら
、1997；Liangら、1996；Schultzeら、1996；Weinmannら、1994）。しかし、こ
れらは、ウイルスプロモーターの１つまたは組合わせに基づくものであり、前述
した欠点を伴う。異なる成分を発現する、多シストロン的単一レトロウイルス、
もしくは、２つ以上のレトロウイルスの組合わせも構築されている（Bohlら、19
97；Hofmannら、1996；Kringsteinら、1998；Paulusら、1996；Rossiら、1998）
。これらは、細胞への遺伝子送達に際しての障壁を解決するが、ここでも、発現
は、多くの場合、ウイルスプロモーター配列に基づいているため、細胞型によっ
ては、停止を起こしやすい。目的とする所与のcDNA用のウイルスの作製に関与す
る比較的複雑な工程には、ベクターのサイズが大きく、時間がかかることから、
複雑なクローン化ストラテジーが含まれており、従来のDNAトランスフェクショ
ン方法に対して、それらが提供する利点をいくらか相殺してしまう。レトロウイ
ルスベクターの作製は、現在、ごく一部の実験室に限られており、安全上の懸念
から、複数の装置での使用に制限が設けられている。従って、これらのベクター
は、かなり有望であるものの、広く普及しているDNAトランスフェクション方法
から、それらの使用へと大きく移行するには、まだ長い時間を要すると思われる
。従って、改善されたプラスミドベクターの妥当性は依然として強い。

【００３３】 本来のTA-発現構築物に対する一般に適用可能な改変は、Tc-オペレーター配列
の調節下でのTA-cDNAおよび外来性cDNAの両方の発現を含むものであった（Liang
ら、1996；Shockettら、1995）。理論的根拠は、活性化因子と目的とする調節可
能な遺伝子の両方が、自動制御ループを介して、同じ誘導物質の制御下にある場
合、誘導性の非常に高い正確な調節を系中に構築することができるというもので
ある。残念ながら、誘導の結果として産生された高レベルのtTAタンパク質によ
り、細胞に有毒な副作用が起こり（GalliaおよびKhalili、1998；GossenおよびB
ujard、1992）、このことは、恐らく、TAタンパク質に存在するHSV、VP16タンパ
ク質の酸活性化ドメインによる細胞代謝の干渉に起因すると考えられる。これは
、特定の細胞型が、時間が長引くと、TA-cDNAの発現を見かけ上停止する付加的
な理由でありうる。あるいは、TAタンパク質を強く発現する細胞は、毒性レベル
のTAタンパク質が蓄積するために、特に、倍加時間の長い細胞では、選択上不利
となる可能性がある。本発明者らは、TA発現の見かけ上の喪失の真の理由につい
て推測することしかできないが、EF-1α発現カセットに切り換えることにより、
これらの問題を相殺し、解決することができると思われる。

【００３４】 結論は、HO-1黒色腫において樹立したもの等の特定のEF1prtTA細胞系の場合に
は、ほぼ12ヶ月にわたる期間の観察に基づく。親HO-1 EF1prtTA細胞系を作製し
、初めに所定期間（＞60日）にわたり分析した後、増殖させ、将来の使用のため
に凍結した。これらの親細胞を用いて、誘導性Jun BおよびMda-7発現（図４、Ａ
およびＢ）を樹立したが、該細胞系を初めに樹立および凍結して、数ヶ月および
数継代後に解凍したところ、機能的レベルのTA発現および誘導性を示した。この
細胞系および他の細胞系（図３）は、Tc-応答性を保持し続け、すべてが、抗生
物質選択の不在下で維持された。このことは、正の選択圧の欠如、ならびに、プ
ラスミドDNAの導入および組込みと最終的使用との間に経過した継代数および時
間とは関係なく、rtTA cDNAの発現が継続することを示している。全体として、
本発明者らは、rtTA cDNAの発現構築物を改変した後、これによって、Tc-調節可
能な細胞系を樹立する可能性を有意に高めることができることを示した。以前報
告されたものより高い頻度で、陽性クローンが得られ、しかも長い時間にわたっ
て一貫した発現およびクローン安定性が達成されることが明らかになった。これ
らの観察に基づいて、本発明者らは、改変されたEF1prtTAがTc-調節可能な細胞
を樹立する上で、広い用途を有する有用な試薬を提供すると結論付ける。

【００３５】EF-1αプロモーターの制御下でrtTA cDNAを発現するトランスジェニックマウス
の作製 トランスジェニック技術を用いて、マウスのあらゆる組織でrtTAタンパク質の
発現を達成する実験が、現在進行中である。EF-1α遺伝子およびそのプロモータ
ーは、あらゆる動物組織で遍在的に発現されるため、この目標を達成するのに適
した発現系である。rtTA cDNAに連結されたヒトEF-1α遺伝子プロモーターから
成るトランスジェニック発現カセットはすでに構築されており、ラット、マウス
およびヒト細胞系で、機能について試験されている（pEF1prtTA（Gopalkrishnan
ら、Nuc. Acids Res. 27：4775-4782、1999およびその中の参照文献）のように
文献に記載されている）。トランスジェニックマウス系の作製に、標準的方法を
実施した。簡潔に言えば、マウスの受精卵の前核にpEF1prtTAのマイクロインジ
ェクションを行い、これらを偽妊娠雌マウスに着床させた。これらの操作により
、最終的に３匹の同腹子が生まれた。これらを、尾先端（tail-tip）サンプル由
来のゲノムDNAにトランスジーンが存在するかどうかについて、放射能標識したr
tTA cDNAプローブを用いたゲノムサザンブロット分析により分析した。この分析
から、３匹の創始マウスのうち１匹は、オートラジオグラフィーにより検出した
際、適切なサイズのバンドを示したことから、トランスジーンについて陽性であ
ることが明らかとなった。次に、この創始マウス（雌）を野生型雄マウスと交雑
させることにより、F1子孫を生み出した。F1世代由来の尾先端DNAの分析により
、本発明者らは、創始マウスが、トランスジーンを伝達する能力を有するか否か
を決定することができた。15匹のF1世代由来の尾先端DNAのサザンブロット分析
から、（８）匹のマウスが、トランスジーンについて陽性であることがわかり、
最初の創始動物が、挿入遺伝子を伝達する能力を有することを確認した。トラン
スジェニックマウス系統の作製成功に続き、本発明者らは、現在、さらに別の動
物を育種し、トランスジーンの広範な発現分析を開始して、発現レベルを測定す
ることができる位置にある。これは、F1もしくはそれ以降の世代のマウスについ
て実施されるであろうが、その際、将来的な使用および分布のために、子孫から
安定した発現系統を生み出すことができることを確信するまで、最初の創始マウ
スは維持する。これらのマウス系統を用いて、テトラサイクリンの調節下で、特
定の遺伝子を誘導可能に発現することのできるマウスを作製し、動物における特
定遺伝子のin vitro効果を研究したり、あるいは、薬剤もしくは小分子の抗腫瘍
効果またはその他の薬理学的効果についてスクリーニングすることができる。

【００３６】一貫した発現を有する安定した細胞系を樹立する成功を有意に高めることを目的 とする、EF-1αプロモーターの制御下でのtTA、テトラサイクリン・リプレッサ
ーを発現する発現ベクターである、pEF1ptTAの構築 tTAオープン・リーディング・フレームを含むEcoRI-BamHI断片をpUHDから単離
した。この断片を、哺乳動物の発現ベクターpCDEF3に該ベクターのマルチクロー
ニングサイトの5’ EcoRIおよび3’ XbaI部位において、定方向にクローン化す
ることにより、EF1ptTAと呼ばれる最終構築物を産生した。pCDEF3の3’ XbaI部
位と該断片のBamHI部位とのライゲーションは、突出末端をクレノウで充填し、
これらを平滑末端にした後に、可能であった。この改変ベクターは、tTA遺伝子
をヒトEF-1αプロモーターの直接の転写制御下に置く。該構築物を、制限酵素お
よびDNA配列決定分析により確認した。げっ歯類動物およびヒト細胞系における
機能試験は、現在進行中であり、本質的にはpEF1prtTAについて記載されるよう
に実施されるであろう。遺伝子発現が誘導物質（テトラサイクリンまたはドキシ
サイクリン）の存在下で誘導される初期の構築物(pEF1prtTA)と比較して、本発
明の構築物は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの不在下で活性であり
、遺伝子発現は、これら試薬の存在下で停止される。両方のプラスミドは、細胞
系またはマウスにおいて、誘導性遺伝子発現系を樹立するのに用いることができ
、その選択は、化学的薬剤の存在もしくは不在下のいずれで細胞を増殖させるか
に依存するであろう。

【００３７】参考文献 1. Ackland-Berglund, C. E.,およびLeib, D. A., (1995) 「テトラサイクリン
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【図面の簡単な説明】

【図１】 タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1α発現構築物のプラスミド地
図：この地図には、rtTA ORF、ヒトEF-1αプロモーター、ウシ成長ホルモン（BG
H）ポリアデニル化（ポリA）シグナル、およびクローン化後のベクターpCDEF3（
Goldmanら、1996）から維持されたマルチクローニングサイトを含む、ベクター
の個々の成分要素が示されている。また、SV40プロモーターとポリAシグナルと
が隣接するネオマイシン耐性マーカー（NeoR）、細菌の増殖および選択用のアン
ピシリン耐性マーカー（AmpR）、ならびにいくつかの基準制限部位も示されてい
る。

【図２】 タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターの活
性を試験するためのルシフェラーゼアッセイ：原（pUHD17-1neoと記された棒）
または改変された（EF1p TET onと記された棒）rtTA発現ベクターおよびTcルシ
フェラーゼリポーターpUHC 13-3を用いて一時的に(transiently)同時トランスフ
ェクトしたヒトHO-1黒色腫細胞由来の抽出物を、ルシフェラーゼ活性について定
量した。これらの抽出物は、誘導物質（-Dox）なしで、または誘導物質を用いて
（+Dox）処理した細胞から調製した。誘導物質を用いた処理は、「材料と方法」
で記載したように48時間である。

【図３】 Tc-誘導性クローンを選択するためのルシフェラーゼアッセイ：
パネルは、ヒト前立腺（DU-145およびPC3）、子宮頚管（HeLa）、胸部（MCF-7）
および黒色腫（HO-1）腫瘍に由来する、クローン化により単離した個々のネオマ
イシン耐性細胞系から得た、ルシフェラーゼアッセイの定量結果を示す。誘導物
質の不在（-Dox）または存在（+Dox）下で、TcルシフェラーゼリポーターpUHC 1
3-3を用いて、各安定クローンを一過性トランスフェクションに付した。これら
の細胞から調製した抽出物をルシフェラーゼ活性についてアッセイすることによ
り、「材料と方法」に記載した各細胞型に対して適切なレベルの誘導性を示すク
ローンを同定した。

【図４】 調節可能なMda-7またはJun B cDNAを発現する個々のTc応答性ク
ローンのノーザンブロット分析：Tcの調節下で、Mda-7（A）またはJun B（B） c
DNAを用いて安定にトランスフェクションしたクローン選択細胞において発現さ
れた誘導RNAメッセージレベルのレベルのオートラジオグラフィー検出。その際
、ナイロン膜への転写後、それぞれの放射標識cDNAプローブを用いて探索した。
同様に番号付けした各サンプルは、誘導なし［１〜17（A）および１〜９（B）］
、または誘導物質の添加後［１’〜17’（A）および１’〜９’（B）］の同じク
ローンに由来するものである。

【図５】 プラスミド名：pEF1ptTA。プラスミドサイズ：7.02 kb。構築者
：Gopalkrishnanら、Nucleic Acids Research 27：4775〜4782（1999）およびそ
の中の参照文献。構築日：2000年1月。所見／参考文献：ヒトEF-4αプロモータ
ーにより駆動されたテトラサイクリン・リプレッサーVP16AAD融合体用のORF。tT
Aの供給源はpUHD15-1であり、EcoRI/BamHI断片として単離した後、pCDEF3の5’
EcoRI-BamHI（平滑化）3’ XbaI（平滑化）部位にクローン化した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴパルクリシュナン，ラウル アメリカ合州国 10024 ニューヨーク ニューヨーク，アパートメント ２エイ， ウエスト 79番 ストリート 302 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 EA04 FA02 GA11 HA20 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ08 QQ43 QQ53 QQ61 QQ79 QR32 QR55 QS31 4B065 AA90Y AA93X AB01 AC14 BA02 CA24 CA46

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 a）タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーター、お
   よび b）リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードする核酸で
   あって、該トランス活性化因子の発現が前記タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1
   αプロモーターの制御下にあるもの を含むベクター。
2. 【請求項２】 前記ベクターがプラスミドである、請求項１に記載のベクタ
   ー。
3. 【請求項３】 前記ベクターが図１に記載の通りのものである、請求項１に
   記載のベクター。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のベクターを含む、細胞。
5. 【請求項５】 前記細胞が細胞系に由来するものである、請求項４に記載の
   細胞。
6. 【請求項６】 前記細胞系が、HeLa（ヒト子宮頚管）、HO-1（ヒト黒色腫）
   、MCF-7（ヒト胸部）、PC3（ヒト前立腺）またはDU-145（ヒト前立腺）である、
   請求項５に記載の細胞。
7. 【請求項７】 テトラサイクリン・リプレッサーを一貫して発現する、請求
   項４に記載の細胞。
8. 【請求項８】 タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターと、リバ
   ース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードする核酸とを含む細胞
   であって、該トランス活性化因子の発現が該タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1
   αプロモーターの制御下にある、前記細胞。
9. 【請求項９】 請求項１に記載のベクターを含む、動物。
10. 【請求項１０】 前記動物がマウスである、請求項９に記載の動物。
11. 【請求項１１】 誘導性テトラサイクリン調節遺伝子発現のためのリバース
    ・テトラサイクリン制御トランス活性化因子発現系を作製する方法であって、 a）制限酵素消化による、リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因
    子をコードするDNA断片の単離、 b）制限酵素消化による、タンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーター
    ベクターの作製、 c）5’ EcoRI適合性制限酵素突出末端のライゲーションによる、タンパク質翻
    訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターへのリバース・テトラサイクリン
    制御トランス活性化因子の定方向クローン化、 d）リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子をコードするDNA断片
    の3’ BamHI末端およびタンパク質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベク
    ターの3’ XbaI末端のクレノウ断片媒介性平滑末端生成による、タンパク質翻訳
    ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターへのリバース・テトラサイクリン制
    御トランス活性化因子の定方向クローン化、 e）リバース・テトラサイクリン制御トランス活性化因子を発現するタンパク
    質翻訳ペプチド伸長因子-1αプロモーターベクターを生成するための、部分的に
    連結された断片の平滑クローン化 を含む上記方法。
12. 【請求項１２】 請求項11（a）の断片がEcoRI-BAM HI断片である、請求項1
    1に記載の方法。
13. 【請求項１３】 請求項11（b）の哺乳動物発現ベクターがpCDEF3である、
    請求項11に記載の方法。
14. 【請求項１４】 請求項11（a）のクローン化が、5’ EcoRI部位および3’
    BAM HI部位で生じる、請求項11に記載の方法。
15. 【請求項１５】 請求項11（c）のライゲーションがpCDEF3の5’ EcoRI部位
    で生じる、請求項11に記載の方法。
16. 【請求項１６】 請求項11（d）のライゲーションがpCDEF3の3’ XbaI部位
    で生じる、請求項11に記載の方法。
17. 【請求項１７】 請求項11に記載の方法により作製されるベクター。
18. 【請求項１８】 請求項１に記載のベクターを用いて、薬理学的産物をスク
    リーニングする方法。
19. 【請求項１９】 請求項１に記載のベクターを用いて、組織特異的または普
    遍的な様式で誘導性遺伝子発現をモニターする方法。