JP2002537407A - 血清コレステロールを調節するための組成物及び方法。 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、血清コレステロールを調節するための組成物及び方法に関する。 【解決手段】 対象哺乳類において血清コレステロールを調節するための組成物及び方法を提供する。１つの態様では、発明は、少なくとも１つの同定された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体及び少なくとも１つの同定された血清コレステロール阻害剤を包含する新規の抗脂血剤を特徴とする。詳細には、薬剤は、同定された、血清コレステロール阻害剤に結合する、同定されたスフィンゴ脂質もしくはそのタンパク質改変を包含し、更に、哺乳類、特にヒト患者において血清コレステロールのレベルを安定化する又は下げることが可能な医薬剤を同定するために設計されるアッセイを含む、ＬＤＬ受容体、特にＳＲＥＢＰ−１の成熟を調節することが可能な抗脂血剤を同定する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、その全体を参考として本明細書に組み入れられている１９９９年２
月２４日に出願された米国特許仮出願、第６０／１２１，４４７号の利益を請求
する。

【０００２】 （米国政府の利害に関する陳述） 本発明の資金の一部分は、米国政府により、国立衛生研究所助成金ＲＯ−１
ＤＫ−３１７２２及びＰ５０−ＨＬ４８１２によって、提供された。従って、米
国政府は本明細書にて請求される発明において及びそれに対して確実な権利を有
する。

【０００３】 （発明の分野） 本発明は、血清コレステロールを調節するための組成物及び方法に関する。１
つの態様では、発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の少なくとも１つの同
定されたエフェクター及び少なくとも１つの同定された血清コレステロール阻害
剤を含む新規の抗脂血剤を特徴とする。詳細な態様では、抗脂血剤は血清コレス
テロール阻害剤に結合したスフィンゴ脂質又はタンパク質修飾スフィンゴ脂質を
包含する。さらに、対象哺乳類及び特にヒト患者において血清コレステロールの
レベルを有意に安定化する又は低下させるために抗脂血剤を使用する方法を提供
する。

【０００４】 （発明の背景） コレステロールは細胞膜の鍵となる脂質構成物質であるという、ほとんど普遍
的な意見の一致がある。コレステロールは、一般に、ほとんどの高等生物の正常
な発育及び生存に必須であると理解されている。多過ぎる血清コレステロールは
、高リポタンパク質血症、卒中、冠動脈心臓疾患及びアテローム性動脈硬化症並
びにその関連症状を含む、生命を脅かす脂質関連疾患に相関を持っている。一般
に、Stryer, L のBiochemistry 第３版（１９８８年）の５４７〜５７４ページ
（Ed. W. H. Freeman and Co. New York）及びM.S. Brown and Goldstein, J.L
のThe Pharmacological Basis of Therapeutics（第８版）の８７４〜８９６ペ
ージ（Gilman, A.G. et al., eds., McGraw~Hill/New york）を参照のこと。

【０００５】 哺乳類及び特に霊長類における血清コレステロールの調節は十分に注目を浴び
てきた。ヒト及びその他の哺乳類におけるコレステロール恒常性の調節には、コ
レステロール産生、胆汁酸の生合成及び特定の血清コレステロールキャリアの異
化の調節が関与していると報告されることが多い。重要な血清コレステロールキ
ャリアは、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）粒子と呼ばれる。ＬＤＬ受容体は、
コレステロールが必要な細胞へのＬＤＬ粒子の取り込みを促進すると報告されて
きた。Brown, M.S. and Goldstein, J.L.のScience ２３２号（１９８６年）の
３４〜４７ページ；Goldstein, J.L. and BrownのNature ３４８巻（１９８６
年）の４２５ページ及びその中で引用されている参考文献を参照のこと。

【０００６】 ＬＤＬ受容体は、ヒトにおいて血清コレステロールのレベルに影響を及ぼすと
して開示された。例えば、コレステロールが足りている細胞は、満足なＬＤＬ受
容体を作らず、それによって細胞によるコレステロールの取り込みを減らす、さ
らに阻止さえするという認識がある。この例では、血清コレステロールは実質的
に上昇し、疾患の進展又は重症度に寄与することがあり得る。逆に、コレステロ
ールが必要な細胞は、より多くのLDL受容体を作る能力を有し、それによって血
清コレステロールの低下を促進する。従って、ヒトの患者において血清コレステ
ロールのレベルを安定化する又は軽減するための１つの治療的アプローチとして
、LDL受容体を調節することに焦点が置かれて特別に注目された。

【０００７】 特に、LDL受容体遺伝子の転写は、ステロールが蓄積した場合抑制され、ステ
ロールが足りない場合誘導されることが報告されている。ステロール感受性は、
ステロール調節要素（SRE)として知られる、LDLｒ遺伝子の上流１０塩基対(ｂｐ
）配列により与えられていると考えられている。ステロール調節要素結合タンパ
ク質（ＳＲＥＢＰ−１）の成熟型はＳＲＥに結合し、転写を促進することが開示
されている。

【０００８】 ステロールが誘導するタンパク質分解によってＳＲＥＢＰ−１の活性が影響を
受けるという追加の報告もある。ＳＲＥＢＰ−１のタンパク質分解は、『サイト
カイン腫瘍壊死因子』（ＴＮＦ−α）と呼ばれる細胞受容体による設定の一部に
よって影響を受けるという認識がある。

【０００９】 特に、ＴＮＦ−α受容体は、幅広い範囲の生物学的効果に影響すると報告され
ている。しかしながら、ＴＮＦ−αの性状は完全には明らかにされていない。Ｔ
ＮＦ−α経路の解明は、少なくとも２つのＴＮＦ−α受容体の存在によって複雑
なものになることが多い。受容体は、下流の共通のエフェクターの一部を分かち
合うが、受容体特異的な経路を介するシグナルも分かち合う。ＴＮＦ−α受容体
に関する更なる開示については以下に引用した参考文献を参照のこと。

【００１０】 ＴＮＦ−αのシグナル伝達の結末の１つが中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−
ＳＭａｓｅ）の活性化であることは理解されてきた。中性スフィンゴミエリナー
ゼは、至適ｐＨ７．４でスフィンゴミエリンのセラミドとホスフォコリンへの加
水分解を触媒する膜結合型酵素である。シグナル伝達における中性スフィンゴミ
エリナーゼの役割は主として、脂質セカンドメッセンジャーであるセラミドを生
成する能力に関係している。ＴＮＦ−αに加えて、Ｆａｓ受容体リガンド、ビタ
ミンＤ３、インターロイキン−１β、神経成長因子、抗ＣＤ２８抗体及びγ−イ
ンターフェロンはすべてセラミドのレベルを高めることが明らかにされている。

【００１１】 特に、スフィンゴミエリナーゼＣ型（Ｅ．Ｃ．３．１．４．１２）は、以下の
反応（１）を介してスフィンゴミエリンの加水分解による切断を触媒するホスホ
リパーゼの一群である。 スフィンゴミエリン→セラミド＋ホスホコリン（１）

【００１２】 S. Chatterjeeの Adv. Lipid Res ２６巻（１９９３年）２５〜４８ページ； S.
Chatterjee, et al.,の J. Biol. Chem., ２６４巻（１９８９年）１２５４３
〜１２５６１ページ；及び S. Chatterjee, et al., Method in Enzymology , P
hospholipase の１９７巻（１９９１年）５４０〜５４７ページを参照のこと。

【００１３】 シグナル伝達経路におけるスフィンゴミエリンとセラミドの生物学的な役割に
加えて、ごく最近、スフィンゴミエリナーゼがコレステロールの恒常性及び特に
ＬＤＬ受容体活性の誘導に関与していることを示唆する証拠が現れてきた。S. C
hatterjeeの Adv. Lipid Res ２６巻（１９９３年）２５〜４８ページを参照の
こと。更なる研究は、プログラム細胞死及び／又は『アポトーシス』並びに核内
因子（ＮＦ）−κＢに対する遺伝子の活性化におけるセラミドの潜在的役割を支
持している。A. Alessenko and S. Chatterrjee, のMol. Cell Biochem., １４
３巻（１９９５年）の１６９ページを参照のこと。

【００１４】 コレステロール産生に関与する酵素はコレステロールの恒常性に有意な効果を
発揮することが示唆されてきた。従って、特に認容可能な範囲に血清コレステロ
ールを安定化する又は軽減するこのような酵素を調節する能力を持った薬剤を発
見することに実質的な関心があった。例証となる薬剤には、フルバスタチン、シ
ムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、及びアトルバスタチンのような
市販の血清コレステロール阻害剤が挙げられる。これらの及びメビノリン（コン
パクチン）のようなその他の薬剤に関する更なる開示については、Brown MS and
Goldstein JL（１９９３年）上記を参照のこと。

【００１５】 このような及びその他の血清レベル低下剤の使用に臨床効果が伴うことがある
ことも報告されているが、有意な副作用の報告がある。例えば、Brown MS and G
oldstein JL（１９９３年）上記；及びPhysician's Desk Referenceの１９９７
年版（５１版）（Medical Economics Co.）を参照のこと。従って、高められた
有効性及びより優れた患者への認容性のようなさらに望ましい性状を示す薬剤を
有するというニーズがある。患者の一部には投与されたコレステロール低下剤の
レベルを軽減するという特別のニーズがある。

【００１６】 さらに、ＳＲＥＢＰ−１タンパク質及び特にＬＤＬ受容体を調節することがで
きる薬剤を発見するというニーズもある。その上、自動化された、処理時間の速
い薬剤スクリーニングによる当該医薬品の同定のための方法は、種々の医薬品及
びバイオ薬剤の開発プログラムにおいてますます信頼されるものになっている。
残念ながら、そのような処理時間の速いスクリーニングアッセイに必須の薬剤は
広く行き渡ってはいない。この領域における進歩がない大きな理由は、ＳＲＥＢ
Ｐ−１及びＬＤＬ受容体に影響を及ぼす分子（即ち、エフェクター）についての
不十分な理解である。

【００１７】 従って、ＬＤＬ受容体レベル及び血清コレステロールのレベルを調節する二重
の能力を持った抗脂血剤を有することが望ましい。多数の血清コレステロール阻
害剤で現在用いられているものに近い又はそれより低い用量で対象哺乳類にかか
る抗脂血剤を投与することができれば特に望ましい。特にＳＲＥＢＰ−１タンパ
ク質の突然変異を含むＬＤＬ受容体を調節する可能性を持つ薬剤を同定するため
にｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイで有効性を有することがさら
に望ましい。

【００１８】 （発明の要約） 本発明は一般に、対象哺乳類における血清コレステロールを調節するための組
成物及び方法に関する。１つの態様では、本発明は、低密度リポタンパク質（Ｌ
ＤＬ）の少なくとも１つの同定されたエフェクター及び少なくとも１つの同定さ
れた血清コレステロール阻害剤を含む新規の抗脂血剤を特徴とする。より詳細な
態様としては、薬剤は血清コレステロール阻害剤に結合した１つの同定されたス
フィンゴ脂質又はタンパク質修飾スフィンゴ脂質を包含する。さらに、対象哺乳
類及び特にヒト患者において血清コレステロールのレベルを安定化する又は低下
させることが可能な医薬剤を同定するよう意図されたアッセイを含む、ＬＤＬ受
容体及び特にＳＲＥＢＰ−１突然変異を調節することが可能な抗脂血剤を同定す
るための方法を提供する。

【００１９】 我々は、コレステロールにより調節された疾患を治療する又は防ぐための、幅
広いスペクトルの組成物及び方法を発見した。疾患は本明細書では、『コレステ
ロール関連疾患』又は同様の用語で呼ぶことがある。さらに具体的には、我々は
、ＬＤＬ受容体の少なくとも１つの同定されたエフェクター、及び特にＳＲＥＢ
Ｐ−１のエフェクター並びに少なくとも１つの同定された血清コレステロール阻
害剤を含む抗脂血剤を同定した。複数のエフェクター及び阻害剤（例えばそれぞ
れ、約２〜５）を有する薬剤を考慮しているが、本発明の特別の抗脂血剤は、通
常各成分を１つ有する。好ましい抗脂血剤は、以下に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏ
又はｉｎ ｖｉｖｏのアッセイによって測定されるとき、対象哺乳類において血
清コレステロールのレベルを安定化する又は軽減する能力のような具体的に定義
された性状を特徴とする。

【００２０】 さらに具体的には、本発明は、種々の抗脂血剤及び対象哺乳類において１又は
それより多くのコレステロール関連疾患を治療する又は予防するために該抗脂血
剤を使用する方法を提供する。例示となる疾患は公知であり、高コレステロール
血症を含む高リポタンパク質血症、卒中、肥満、過食症、アテローム性動脈硬化
症を含む心臓疾患、脳アテローム性動脈硬化症、コレステロールエステル貯蔵病
、臓器移植不全及び肝硬変を含む肝疾患、胆汁系疾患、及びウイルス感染、特に
脳炎又は関連疾患を亢進するような感染が挙げられる。

【００２１】 本発明に基づいた特別の抗脂血剤は、１つのＳＲＥＢＰ−１のエフェクター及
びコレステロール生合成に関連した酵素の１つの合成又は半合成阻害剤を包含す
る。好ましい酵素は、広範に性状が調べられており、３−ヒドロキシ−３−メチ
ルグルタリル（ＨＭＧ）ＣｏＡ還元酵素及びＨＭＧＣｏＡ合成酵素が挙げられる
。さらに考慮された抗脂血剤は、エフェクター成分として、同定されているカス
パーゼ、特にｃｐｐ３２プロテアーゼ（カスパーゼ−３）、中性スフィンゴミエ
リナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）、セラミド、ＳＲＥＢＰ−１（前駆体）又はＳＲＥ
ＢＰ−１（成熟型）を特徴とする。Ｎ−ＳＭａｓｅ、ｃｐｐ３２プロテアーゼ、
ＳＲＥＢＰ−１（前駆体）又はＳＲＥＢＰ−１（成熟型）の有効な断片は、発明
の範囲内でエフェクター分子として考慮される。

【００２２】 さらに、具体的な抗脂血剤は、エフェクターが例えば、スフィンゴミエリン又
はセラミド；又はＮ−ＳｍＭａｓｅ又はその有効な断片であってもよいＳＲＥＢ
Ｐ−１のエフェクターを１つ包含する。抗脂血剤がセラミドを包含する実施態様
では、該セラミド分子は好ましくは天然に生じたものである（即ち、生物資源か
ら実質的に純粋に単離することができる）。 薬剤の中で使用するのにさらに好
ましいセラミドは、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−６、又はＣ−８セラミドのいずれか１
つである。好ましいＮ−ＳＭａｓｅ分子は、該酵素及びその有効な断片の酵素的
に活性のある型をコードするようなものを含む本明細書で開示される特定の核酸
配列にコードされている。本発明に基づいた好ましいエフェクターは、以下に記
載する具体的なアッセイで測定されるときＬＤＬ受容体及び特にＳＲＥＢＰ−１
の成熟を調節する実質的な能力を示す。

【００２３】 考察されるように、必要に応じてその他の薬剤がその他のエフェクターを包含
してもよいが、本発明の特定の抗脂血剤は、スフィンゴ脂質、特にスフィンゴミ
エリン又はセラミド、Ｎ−ＳＭａｓｅ又はその有効な断片のような好適なＳＲＥ
ＢＰ−１のエフェクターを包含する。この実施態様では、抗脂血剤はさらにＨＭ
ＧＣｏＡ還元酵素の阻害剤を包含する。薬剤が意図するものに対する機能を亢進
するという意味でエフェクターと阻害剤を組合せることが一般に好まれる。好ま
しい機能は、以下に記載する従来のｉｎ ｖｉｖｏアッセイによって測定される
とき血清コレステロールを安定化すること又は軽減することである。ほとんどの
例では、他の会合が適用の一部にとっては好適であるけれども、エフェクターと
阻害剤の間の共有結合が好まれる。好ましいコレステロール阻害剤は、還元酵素
を阻害する能力を認識しており、それによって血清コレステロールを低下させる
。阻害剤の例としては、ヒトに許容されている市販の血清コレステロール阻害剤
、例えば、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、パラバスタチン、
メビノリン（コンパクチン）、アトルバスタチン又は臨床的に許容可能なそれら
の誘導体などが挙げられる。

【００２４】 特定の実施態様では、抗脂血剤は、ＳＲＥＢＰ−１タンパク質のエフェクター
、例えば、Ｎ−ＳＭａｓｅ又は有効な断片；又はスフィンゴ脂質を１つ包含する
。この実施例では、エフェクターは好ましくはＨＭＧＣｏＡ還元酵素とも会合す
る。用語『会合する』又は『関係する』によって、ＳＰＥＢＰ−１と阻害剤が少
なくとも１つの結合、好ましくは少なくとも共有結合で結合していることを意味
する。結合の特定の実施例は、以下に記載される。例の一部では、共有結合と非
共有化学結合の好適な組合せによって会合を提供することができる。別の方法と
しては、エフェクターと阻害剤の、所望の対象哺乳類に対する本質的な共投与に
よってＳＲＥＢＰ−１のエフェクターと阻害剤との間の会合を提供することがで
きる。本発明の薬剤を製造する方法及び使用する方法は以下の考察と実施例にお
いて提供される。

【００２５】 １つの実施態様では、抗脂血剤は少なくとも１つの共有結合によって阻害剤に
結合したスフィンゴ脂質を包含する。注意したように、好ましいのは、フルバス
タチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン（コンパ
クチン）、アトルバスタチンのような認知されたコレステロール阻害剤である。
この例示では、スフィンゴ脂質は好ましくはセラミド又は関連分子であり、特に
、セラミドが阻害剤分子の反応性ヒドロキシル基と共有結合している前述した好
ましいセラミドのいずれか１つである。また、この実施例では、阻害剤のヒドロ
キシル基は通常、Ｃ−３炭素のようなセラミド上の反応性炭素に共有結合してい
る。

【００２６】 本発明の更なる抗脂血剤は、少なくとも１つの二官能価のスペーサー基、典型
的にはヘテロ官能価のスペーサー基で、基が阻害剤又はその他の薬剤部分からＳ
ＲＥＢＰ−１エフェクターに間を空けるものを包含する。この型の抗脂血剤の特
定の実施例には、ヘテロ官能性スペーサー基１つに共有結合した１つのＳＲＥＢ
Ｐ−１エフェクターを包含する。スペーサー基は好ましくは血清コレステロール
阻害剤に共有結合している。典型的には、二官能価スペーサーは、エフェクター
及び阻害剤の好適に反応する化学基、通常、それぞれ、特異的に反応する炭素原
子とヒドロキシル基に結合している。

【００２７】 さらに、本発明に基づいた抗脂血剤は、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−Ｓ
Ｍａｓｅ）又はその有効な断片のようなＳＲＥＢＰ−１のエフェクターを１つ包
含する。好ましい薬剤は、前述したように、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素の阻害剤又は
ＨＭＧＣｏＡ合成酵素と会合してＮ−ＳＭａｓｅ又はその断片を包含する。Ｎ−
ＳＭａｓｅ又はその断片の好ましい例は、以下に続く実施例及び考察で提供され
る。

【００２８】 さらに考慮された抗脂血剤は、ＳＲＥＢＰ−１のエフェクター、好ましくは、
エフェクターがＨＭＧＣｏＡ還元酵素の１つの阻害剤と共有結合している、中性
スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）又はその断片を包含する。還元酵素
の好ましい阻害剤はすでに考察した。好ましくは、共有結合は、酵素又は断片上
の化学的に活性のある基を結合することによって、好ましくはアミド結合によっ
て作られる。さらに特別の抗脂血剤は、酵素又はその断片と血清コレステロール
阻害剤の間のアミド結合を特徴として、以下で開示される。

【００２９】 本発明の好ましい抗脂血剤は、一般に意図された用途に適応して調合され、具
体的には、局所又は関連した用途のために調合された薬剤を包含する。さらに、
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏに好適なリポソーム製剤として
薬剤を提供するのに十分な構成成分を含む抗脂血剤を包含する。かかる好ましい
薬剤を製造し、使用する方法は以下に説明される。

【００３０】 一般に、本発明に基づいた治療法は、特に霊長類のような哺乳類、特にヒトの
ような対象に、少なくとも１つの当該抗脂血剤の治療上有効な量を投与すること
を包含する。該薬剤は単に活性剤として投与することができる。別の方法として
、抗脂血剤は、所望の医薬活性を示すその他の薬剤又は物質と組合せて投与して
もよい。ほとんどの場合では、抗脂血剤の使用量は、以下に記載するようなｉｎ
ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのアッセイにおける基準で良好な活性を呈する
量である。

【００３１】 考察しているように、本発明の抗脂血剤は、即ち、ＬＤＬ受容体活性を高める
ことによって、特にＬＤＬ受容体のレベルを高めることによって、及び血清コレ
ステロールのレベルを下げることによって二重の『抗−コレステロール』活性を
有利に提供する。このような活性を検出し、定量する特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ及
びｉｎ ｖｉｖｏのアッセイが以下、及びそれに続く考察及び実施例で提供され
る。

【００３２】 例示のように、本発明の好ましい抗脂血剤は、標準のＳＲＥＢＰ−１タンパク
質分解（成熟）アッセイで測定されるとき、少なくとも約２倍、ＳＲＥＢＰ−１
の成熟型の産生（成熟）を刺激することができる。該アッセイには以下に提供さ
れ、一般に、時間依存的及び用量依存的にＳＲＥＢＰ−１タンパク質の成熟をモ
ニターすることが含まれる。成熟ＳＲＥＢＰ−１タンパク質は核に移行し、ＬＤ
Ｌ受容体の産生を刺激すると考えられている。

【００３３】 さらに、本発明の好ましい抗脂血剤は、ノーザンブロット及び関連するｍＲＮ
Ａ検出アッセイによって測定されるように、約１０％、２０％、３０％、４０％
、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％までＬＤＬ受容体のｍＲＮＡレ
ベルを高めることができる。ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡレベルを検出し、任意で定
量する例示となるノーザンブロットアッセイは以下に記載する。

【００３４】 また、本発明の好ましい抗脂血剤は、標準ＨＭＧＣｏＡ還元酵素アッセイで測
定されるとき、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％から約９０
％までのＩＤ_５０を示す。このアッセイでは、抗脂血剤の存在下及び非存在下（
対照）にて還元酵素の活性がモニターされる。標準ＨＭＧＣｏＡ還元酵素アッセ
イの例は以下に提供される。

【００３５】 さらに好ましい抗脂血剤は、標準血清コレステロールアッセイで測定されると
き血清コレステロールを有意に下げることができる。好ましくは、投与された抗
脂血剤は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０
％、又は７０％まで対象哺乳類において血清コレステロールを下げることができ
る。アッセイの実施例は以下に提供される。典型的には、好適な対照被験者に関
して血清コレステロールの低下がモニターされる。血清コレステロールのアッセ
イは任意でｉｎ ｖｉｖｏで行われ、好ましくは、以下に提供される具体的なウ
サギ及びマウスの系統のような認知された動物モデルの使用を包含する。

【００３６】 本明細書で開示される血清コレステロールのアッセイ又はその他の好適なアッ
セイで使用される好ましい動物モデルは、同定されたコレステロール関連疾患に
関して認知された試験系である。典型的には、そのような動物モデルには、市販
のウサギ又はマウスの近交系、例えば、ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ及びアポ
リポタンパク質Ｅ欠損マウスが挙げられる。この実施例では、具体的な動物モデ
ルの使用に適応される周知の試験戦略を用いて、血清コレステロールの低下を評
価することができる。しかしながら、適用の中には、遺伝的に定義された（例え
ば、同系の）公知の野生型動物系統のような正常（野生型）動物において所望の
抗脂血剤を調べることが有用なこともある。

【００３７】 本発明の抗脂血剤は、好ましくは上記に要約された標準アッセイの少なくとも
１つ、好ましくはそのすべてによって調べられる。好ましいのは、１又はそれよ
り多くのアッセイにおいて明白に規定された活性範囲を示す抗脂血剤である。

【００３８】 重要なことに、単一の抗脂血剤と共に複数の試験戦略（例えば、１つのｉｎ
ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイの組合せ）を使用することによっ
て、必要に応じて試験の選択性及び有効性を広げることができる。すなわち、必
要であれば、特定のコレステロール関連疾患又は患者群の治療又は予防のために
試験戦略を誂えることができる。

【００３９】 かかる広域スペクトルの試験は更なる利点を提供する。例えば、好ましい抗脂
血剤はＬＤＬ受容体活性を高める能力を有し（典型的には、ＬＤＬ受容体の産生
を高めることによって）、血清コレステロールのレベルの低下を提供する。従っ
て、かかる二重『抗−コレステロール』活性を提供することによって、本発明は
、ある意味では、通常コレステロールの生合成を標的とすることにより血清コレ
ステロールを下げると報告されてきた従来の治療及び薬剤を上回る有意な前進で
ある。従って、本発明の好ましい抗脂血剤は、さらに優れた活性を特徴とし、従
来の薬剤よりも低い用量で投与することができる。抗脂血剤に対する患者の認容
度も、明確に影響を受ける。

【００４０】 もう１つの態様では、本発明は、哺乳類において血清コレステロールを調節す
る、特に下げる方法を包含する。この実施態様では、本発明の方法は、本明細書
で開示される抗脂血剤の少なくとも１つ、典型的には１つの治療上有効な量を哺
乳類に投与することを包含する。

【００４１】 また、本発明において、その方法が本明細書で開示される抗脂血剤の少なくと
も１つ、典型的には１つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、
哺乳類においてＬＤＬ受容体のレベルを調節する方法も提供する。

【００４２】 本発明はまた、高レベルの血清コレステロールを有する又は有することが疑わ
れる哺乳類における疾患を治療する方法も提供する。本実施態様では、本方法は
、本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも１つの治療上有効な量を哺乳類に
投与することを包含する。好ましい哺乳類は、霊長類、特にヒト患者であり、例
えば、冠動脈心臓疾患、肥満、過食症になりやすいヒト又は本明細書で記載され
るその他のコレステロール関連疾患に罹り易いヒトである。従って、方法は、例
えば有害な遺伝的影響又は食事の影響による、高レベルの血清コレステロールを
有すると診断された、有することが疑われる、又はそれに感受性が高いヒト患者
のような対象哺乳類に特に適用可能である。

【００４３】 また、本発明により、その方法が本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも
１つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類において血清
コレステロールのレベルを調節する方法も提供される。本実施態様では、ＳＲＥ
ＢＰ−１のエフェクターは、好ましくは中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭ
ａｓｅ）又はその有効な断片；又はセラミドのようなスフィンゴ脂質である。好
ましい方法はヒト患者のような霊長類を採用する。当該方法で使用するのに好ま
しい抗脂血剤は、典型的には、上記で考察したように、例えば、ワタナベ高脂血
症遺伝性ウサギ又はアポリポタンパク質Ｅ陰性マウスのような、コレステロール
関連疾患、特にアテローム性動脈硬化症に対して認知された動物モデルを用いて
、活性が調べられる。

【００４４】 さらに、本発明による方法が、本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも１
つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類においてＬＤＬ
受容体を調節する方法を熟考する。調節は好ましくはＬＤＬ受容体の合成を高め
ること（ＬＤＬ受容体の分解を低下させることもある）である。本実施例では、
ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターは、好ましくは中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ
−ＳＭａｓｅ）又はその有効な断片；又はセラミドのようなスフィンゴ脂質であ
る。ＬＤＬ受容体レベルの上昇又は低下を評価するための方法は公知であり、例
えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいてＬＤＬ受容体を検出し、定
量することができる抗ＬＤＬ抗体を用いた分子的及び免疫的アプローチが含まれ
る。

【００４５】 本発明の方法の詳細としては、本明細書で考察するように、血清コレステロー
ルの同定された阻害剤と会合したＳＲＥＢＰ−１の１つのエフェクターを含む少
なくとも１つの好適な抗脂血剤を含む。本実施例では、該エフェクターは、好ま
しくはセラミドのようなスフィンゴ脂質である。セラミドの好ましい例には天然
で生じるセラミド及び上記で考察したその他の型のセラミドが挙げられる。考察
するように、霊長類、特に、開示されたようなコレステロール関連疾患を有する
と診断された、有することが疑われた、又はそれに感受性であるヒト患者のよう
な哺乳類対象を用いて、好ましい方法は実施される。

【００４６】 本明細書で開示された方法の実施態様では、抗脂血剤は好ましくはリポソーム
製剤として処理される。本実施例では、リポソーム製剤は標準診療に従った肝投
与に適合することができる。また、本実施例では、リポソーム製剤は、例えば、
経口、筋肉内、腹腔内、ステント又は関連した器具による投与を含む標準的な医
療技術に従ってヒト患者において肝臓又は関連する臓器に投与することができる
。投与の特定の経路は以下に提供される。

【００４７】 発明のその他の態様は以下で考察される。

【００４８】 （発明の詳細な説明） 考察したように、発明はヒト患者又は対象哺乳類において血清コレステロール
のレベルを安定化する又は下げる抗脂血剤及び抗脂血剤を使用する方法に関する
。好ましい抗脂血剤は一般に、１つの同定された血清コレステロール阻害剤に会
合したＳＲＥＢＰ−１タンパク質の１つの同定されたエフェクターを包含する。
エフェクター成分と阻害剤成分が単一の製剤として特異的に共に共有結合してい
る抗脂血剤がさらに好ましい。

【００４９】 用語『抗脂血剤』は、対象哺乳類においてＬＤＬ受容体を調節し、血清コレス
テロールのレベルを安定化する又は下げることによって血清コレステロールのレ
ベルを調節する二重の能力を有する、一般的に本発明の組成物、好ましくは、具
体的な合成薬剤又は半合成薬剤を称して本明細書では使用される。 好ましいの
は、以下に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの具体的なアッセイ
によって測定されるとき、ＬＤＬ受容体レベルを下げる且つ血清コレステロール
のレベルを下げる能力を示す抗脂血剤である。以下に考察するように、阻害剤成
分によって血清コレステロールのレベルを下げる能力には、一般にＨＭＧＣｏＡ
還元酵素の調節、典型的には血清コレステロールを下げるのに十分な該酵素の阻
害が介在している。同様に考察されるように、エフェクター部分は好ましくはＬ
ＤＬ受容体の産生を高める。

【００５０】 本明細書で開示される抗脂血剤は公知の認知された方法によって製造すること
ができる。例えば、具体的なスフィンゴ脂質及び特にセラミド及びセラミド関連
化合物の製造方法は、その開示が参考として本明細書に組み入れられている、現
在、米国特許第５，９７２，９２８号として１９９９年１０月２６日に発行され
た『ラクトシルセラミドに会合する条件の処理方法』と題する、１９９７年１２
月２４日に提出された米国特許同時係属出願、出願番号第０８／９９８，２６２
号の中で開示されている。Abe, A, et al.,の J. Biochem.１１１巻（１９９２
年）の１９１〜１９６ページ； Inokuchi, J. et al., のJ. Lipid Res., ２８
巻（１９８７年）の５６５〜５７１ページ；Shukla, A, et al., J.の Lipid Re
s.,３２巻（１９９１年）の７３ページ Vunnam, R. R., et al., のChem. and P
hysics of Lipids２６巻（１９８０年）の２６５ページ Carson, K. et al.,の
Tetrahedron Lets.,３５巻（１９９４年）の２６５９ページ；及び Akira A. e
t al., の J. Lipid Research３６巻（１９９５年）の６１１ページも参照のこ
と。

【００５１】 本発明のさらに具体的な抗脂血剤には、共有結合した構成成分としてのエフェ
クター及び血清コレステロール阻害剤が挙げられる。しかしながら、適用の中に
は、非共有結合した構成成分を含むものなどのようなその他の抗脂血剤が適当で
ある場合もある。実施例は、本質的に共に投与される製剤として提供されるよう
な薬剤を包含する。

【００５２】 詳細には、抗脂血剤の分子量は、例えば選択されるＳＲＥＢＰ−１のエフェク
ター及び血清コレステロール阻害剤によって、並びに薬剤を作るエフェクター及
び阻害剤の数によって異なる。しかしながら、ほとんどの場合では、特にエフェ
クター分子が、本明細書で開示されるＮ−ＳＭａｓｅ配列又はその断片のような
タンパク質又はポリペプチド配列である場合、抗脂血剤は約１０，０００ｋＤ〜
３５，０００ｋＤ未満の分子量を有する。エフェクターがスフィンゴミエリン又
は関連分子である場合、分子量は一般に、例えば約１００ｋＤ〜１０００ｋＤの
間、好ましくは約２００ｋＤ〜５００ｋＤの間のように有意に低くなる。分子量
を決定する方法は既知であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法のよう
な標準分子サイズ法が挙げられる。

【００５３】 本発明に基づいた具体的な抗脂血剤の例示的実施例を図２５に示す。図２５は
特に、種々のヒト病態においてＳＲＥＢＰ−１成熟の上方調節を行う（エフェク
ター）セラミド、Ｎ−ＳＭａｓｅ、及び種々の脂質を下げる分子；ＨＭＧＣｏＡ
還元酵素阻害剤（スタチン）の組合せを使用することを示す。

【００５４】 ＬＤＬ受容体及び特にＳＲＥＢＰ−１タンパク質の『エフェクター』は、以下
に記載する標準ＳＲＥＢＰ−１成熟アッセイによって測定されるようなＬＤＬ受
容体及び特にＳＲＥＢＰ−１タンパク質の成熟を調節する能力を示す、分子、通
常、アミノ酸配列、リポタンパク質、脂質などの分子である。例示となるエフェ
クターは、実施例及び図１９に提供されている。

【００５５】 用語としての『血清コレステロール阻害剤』は、対象哺乳類特にヒト患者にお
いて血清コレステロールのレベルを下げることができる認知された化合物を称し
て本明細書で使用される。好ましい血清コレステロール阻害剤はコレステロール
の生合成、特に例えば肝臓におけるＨＭＧＣｏＡ還元酵素の活性を妨害する。さ
らに好ましい血清コレステロール阻害剤は、手軽に市販されているものであり、
メバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、及びシムバス
タチンが挙げられる。図２６及び以下の考察を参照のこと。

【００５６】 ＴＮＦ−αが、Ｎ−ＳＭａｓｅの作用を介して細胞においてＳＲＥＢＰ−１の
成熟を有意に刺激することは予想外に見い出された。すなわち、我々は、ＴＮＦ
−αが時間依存的及び用量依存的にＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導することができ
ることを見い出した。この誘導は、ＴＮＦ−αが介在する中性スフィンゴミエリ
ナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）の活性化の反応動態に一致した。Ｎ−ＳＭａｓｅに対
する抗体がＴＮＦ−α誘導のＳＲＥＢＰ−１の成熟を阻害したということは、Ｎ
−ＳＭａｓｅがこのシグナル伝達経路に必要な分子であることを示唆している。
スフィンゴミエリンの加水分解産物である、セラミドもまた、ＳＲＥＢＰ−１の
成熟を誘導する能力があることが見い出されている。理論に束縛されることを望
まずに、ＴＮＦ−α、スフィンゴミエリナーゼ又はセラミド処理により生じるＳ
ＲＥＢＰ−１の成熟型は、核に移行して、ステロール調節要素（ＳＲＥ）に結合
すると思われる。このことは、ＳＲＥの上流の遺伝子の転写を促進すると考えら
れている。この知見の模式図については図１９を参照のこと。さらに、ＳＲＥＢ
Ｐ−１のエフェクターは、特にＳＲＥＢＰ−１の成熟を高めることによってＬＤ
Ｌ受容体を刺激し、それによって対象哺乳類の血清コレステロールを安定化する
又は下げると思われる。

【００５７】 本発明の治療法は一般に、例えば霊長類、特にかかる治療におけるヒト患者の
ような対象哺乳類に、本明細書で開示される少なくとも１つの、典型的には１つ
の抗脂血剤の治療上有効な量を投与することを含む。治療的処置法は、さらに具
体的には、対象に、特に本明細書で開示される適応に対するかかる治療の必要な
ヒトのような哺乳類に抗脂血剤の有効量を投与することを包含する。

【００５８】 問題とされる典型的な対象には、例えば、高コレステロール血症を含む高リポ
タンパク質血症、卒中、過食症を含む肥満、アテローム性動脈硬化症を含む心臓
疾患、脳アテローム性動脈硬化症、コレステロールエステル貯蔵病、臓器移植不
全及び肝硬変を含む肝疾患；胆汁系疾患及び特に脳炎又は関連疾患を亢進するよ
うな感染を含むウイルス感染のような、本明細書で開示される症状、障害又は疾
患に罹っている、罹っていることが疑われる、又はそれらに感受性の高いヒトが
挙げられる。このような疾患をスクリーニングし、診断するための認知された方
法を含むこのような及びその他のコレステロール関連疾患に関するさらに具体的
な開示が報告されている。Brown, MA and Goldstein, J.L（１９９３年）上記及
びその中で引用されている文献を参照のこと。

【００５９】 本発明で、特に記載される治療方法において種々の具体的な抗脂血剤を用いる
ことができる。日常的な試験、例えば、任意選択でその他のｉｎ ｖｉｔｒｏ及
び／又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイと組合せた標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセ
イによって、ほとんどの場合、標的となる障害又は疾患に関して所望の選択性及
び活性を呈する好適な抗脂血剤を容易に同定することができる。注意したように
、好ましい抗脂血剤は、Ｎ−ＳＭａｓｅ、又はその有効な断片、スフィンゴ脂質
、及び特にセラミド、例えばｃｐｐ３２タンパク質（カスパーゼ３）のようなカ
スパーゼ、又はその有効な断片のようなＳＲＥＢＰ−１タンパク質の詳細なエフ
ェクター及び本明細書で考察するその他の詳細なエフェクターを特徴とする。

【００６０】 さらに、以下に続く実施例及び考察においてエフェクターの詳細を開示する。
例えば、本発明の抗脂血剤の１つは、配列において共有結合した：１）化学的に
反応性である基を含むＳＲＥＢＰ−１；及び２）エフェクターの反応基と一般に
共有結合で特異的に結合することができるもう１つの化学的に反応性である基を
含む、本明細書で開示されるもののような血清コレステロール阻害剤を包含する
。任意選択で、抗脂血剤はさらに、１）と２）との間で共有結合した例えばヘテ
ロ二官能性スペーサーのような二官能性スペーサーを包含する。

【００６１】 さらに好ましい抗脂血剤は、配列において共有結合した１）スフィンゴ脂質及
び特にスフィンゴミエリン又はセラミド、及び２）本明細書で開示される具体的
な血清コレステロール阻害剤を包含する。本実施態様では、セラミドは好ましく
は天然に生じたものであり、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−６又はＣ−８セラミドのいず
れであってもよい。ＳＲＥＢＰ−１エフェクターがセラミドである実施態様では
、反応基は典型的にはＣ−３群のセラミドである。好ましいのは、例えば、フル
バスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン（コ
ンパクチン）又はアトルバスタチンのような好適に化学的に反応性であるヒドロ
キシル（−ＯＨ）基を含む血清コレステロール阻害剤である。任意選択で、抗脂
血剤は、１）と２）の間に共有結合した、即ちＣ３基とヒドロキシル基の間に共
有結合を提供する二官能性スペーサーを包含してもよい。

【００６２】 スフィンゴミエリン及び特定のセラミド（Ｃ−２セラミド、ジヒドロＣ−２セ
ラミド）の化学構造を図２７及び２８に示す。

【００６３】 また、配列において共有結合した１）中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭ
ａｓｅ）又はその有効な断片、及び２）本明細書で開示されるような特定の血清
コレステロール阻害剤を包含する抗脂血剤も好ましい。ＳＲＥＢＰ−１エフェク
ターがＮ−ＳＭａｓｅ又はその断片である本実施態様では、化学的に反応性であ
る基は好適なアミド結合である。例えば、フラバスタチン、シムバスタチン、ロ
バスタチン、プラバスタチン、メビノリン（コンパクチン）、又はアトルバスタ
チンのような好適に化学的に反応性であるヒドロキシル基（−ＯＨ）を含む血清
コレステロール阻害剤が好ましい。任意選択で、抗脂血剤は、１）と２）の間に
共有結合で、二官能性スペーサー及び特にヘテロニ官能性スペーサーを包含して
もよい。好適なリンカーの配列は、公知であり、一般にアミノ酸配列のような好
適なポリマー配列の各端に化学的に反応性である基を包含する。

【００６４】 本発明に基づいて使用するのに例示となるＮ−ＳＭａｓｅ及びその断片は、そ
の開示が参考として本明細書に組み入れられる、１９９９年６月６日に発行され
た米国特許第５，９１９，６８７号で、『組換えＮ−ＳＭａｓｅ及びそれをコー
ドする核酸』と題する１９９６年１２月２４日に提出された米国特許同時係属出
願、出願番号第０８／７７４，１０４と同様に、以下に続く実施例及び考察に提
供されている。

【００６５】 特に、好ましい中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）は、図２４（
ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．：１）又はその相補物に示される配列に少なくとも７０％
、８０％、９０％又は９５％の配列同一性を有する配列によってコードされる。
Ｎ−ＳＭａｓｅの好ましい断片は、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．：１又はその相補物の
ヌクレオチド８６２〜１４１４に少なくとも７０％、８０％、又は９０％の配列
同一性を有する配列を包含する。さらに特に好ましいのは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１又はその相補物のヌクレオチド８６２〜１４１４から成るＮ−ＳＭａｓｅ断
片である。ヌクレオチド配列の同一性を決定する方法は公知であり、ＦＡＳＴＡ
及びＢＬＡＳＴのような周知のコンピュータによるプログラムの使用が含まれる
。ＢＬＡＳＴ及び関連するプログラムに関する開示については、S. Altschul et
al., のJ. Mol. Biol. ２１５巻（１９９０年）の４０３ページ及びS. Altschu
l et al., のNuc. Acids Res２５巻（１９９７年）の３３８９〜３４０２ページ
を参照のこと。

【００６６】 好ましいＮ−ＳＭａｓｅのヌクレオチド断片に関するとき、用語『有効な断片
』は、以下に記載する標準ｉｎ ｖｉｔｒｏＳＲＥＢＰ−１成熟アッセイにおい
て有意な活性を有する特定のヌクレオチドを称して本明細書では使用される。Ｎ
−ＳＭａｓｅの有効な断片の特別に好ましい例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌ
クレオチド８６２〜１４１４である。

【００６７】 考察するように、本発明の好ましい抗脂血剤は、標準ＳＲＥＢＰ−１成熟アッ
セイにおいて有意な活性を呈する。好ましくは、アッセイで測定されるとき、該
薬剤は、少なくとも２倍、好ましくは約２〜１０倍の間、さらに好ましくは約２
〜５倍の間を呈する。好ましいアッセイには一般に： ａ）例えばＨＨ−２５細胞のような好適な細胞を培地中で培養し、約２〜６０分
の間、好ましくは約１０〜３０分の間、一般的には約１５分が好ましいがその間
抗脂血剤を加え、次いで洗浄し、そして、 ｂ）以下に記載するような抗ＳＲＥＢＰ−１抗体でウエスタン免疫ブロットを行
うことにより成熟ＳＲＥＢＰ−１（即ちタンパク質分解で切断された）及びＳＲ
ＥＢＰ−１前駆体を検出することが含まれる。一般に、前駆型に対してＳＲＥＢ
Ｐ−１の成熟型の質量を決定することができる。成熟型の存在は、ＳＲＥＢＰ−
１の成熟とタンパク質分解を示している。アッセイを行うさらに具体的な方法は
、以下に続く実施例中に提供されている。典型的には、好適な対照細胞は、細胞
が薬剤に暴露されていない参照として含まれる。

【００６８】 また、考察するように、本発明の好ましい抗脂血剤は、ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ
を検出する、好ましくは定量するためのノーザンブロットにおいて良好な活性を
呈する。さらに、好ましい抗脂血剤は、ノーザンブロットアッセイ又は関連する
ｍＲＮＡ検出アッセイで測定するとき、少なくとも約１０％、好ましくは少なく
とも約２０％〜５０％までの間でＬＤＬ受容体ｍＲＮＡのレベルを高めることが
できる。ノーザンブロットアッセイを行う方法は一般に知られており、Sambrook
et al の分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning; A Labora
tory Manual、第２版、１８９８年）及び Ausubel et al の分子生物学の現代
プロトコール（ Current Protocol in Molecular Biology、１９８８年） (Joh
n Wiley & Sons, New York)に記載されている。

【００６９】 ＬＤＬのｍＲＮＡを検出するための好適なプローブは一般に入手可能であり、
Ｇｅｎｂａｎｋから入手できるヒトＬＤＬ受容体のクローニングした配列及び関
連した哺乳類の配列が挙げられる。Ｇｅｎｂａｎｋに関する情報は、米国医療図
書館（National Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda,
MD, 20894）から入手することができる。Ｇｅｎｂａｎｋはインターネットアド
レスhttp//www.ncbi.nlm.nih.govからも利用できる。Ｇｅｎｂａｎｋに関するさ
らに完全な説明については一般にBenson, D. A. et al., のNucl Acids Res.２
５巻（１９９７年）１ページを参照のこと。

【００７０】 ＬＤＬ受容体ｍＲＮＡのレベルを検出する及び任意選択で定量するための例示
となるノーザンブロットアッセイは以下で考察される。

【００７１】 ＨＭＧＣｏＡ還元酵素の好ましい阻害剤は一般に、肝臓においてコレステロー
ルの合成を低下させ又は阻止し、それによって血漿ＬＤＬの還元を導くことがで
きる代償性反応を促進する。この現象を測定する好ましいアッセイは標準ＨＭＧ
ＣｏＡ還元酵素アッセイである。前述したように、本発明の好ましい抗脂血剤は
、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素アッセイで測定されるとき、約２０％、３０％、４０％
、５０％、６０％、７０％、又は８０％〜約９０％までの間、好ましくは約３０
％〜５０％の間のＩＤ_５０を呈する。 標準ＨＭＧＣｏＡ還元酵素アッセイは、
Brown et al の I. Biol. Chem.２５３巻（１９７８年）の１１２１ページに記
載されている。本アッセイでは、好適な対照と比較した場合増加した酵素の量を
蓄積することによる還元酵素の阻害に対して培養したヒト線維芽細胞が反応する
。

【００７２】 また、考察するように、さらに好ましい抗脂血剤は、標準コレステロールアッ
セイで測定されるとき、血清コレステロールを下げることができる。該薬剤はア
ッセイで測定されるとき、好ましくは、少なくとも 約５％又は１０％〜２０％
、３０％、４０％又は５０％の低下を記録し、好ましくは少なくとも約３０％〜
５０％の低下を記録する。ＬＤＬコレステロールを測定する好ましいアッセイは
、シグマ（ミズーリ州、セントルイス）から市販されており、免疫的な分離が含
まれる。ヒトでの許容可能なコレステロールのレベルに関する情報については、
米国コレステロール教育プログラムも参照のこと。

【００７３】 『高い』又は『高いリスク』のコレステロールレベル又はそれに関連する用語
は、さらに一般的に高血清コレステロールを示すことが理解されている２４０ｍ
ｇより高い又はそれと同等なレベルとともに、約２００〜２４０ｍｇの間のコレ
ステロールであるとして本明細書では定義される。本明細書では、正常血清コレ
ステロールのレベルは約２００ｍｇ未満であると定義される。コレステロール試
験を行うことについては、１９８８年のＮＣＥＰ報告の指針を考察しているBrow
n M.S. and Goldstein, J.Lの上記文献を参照のこと。

【００７４】 従って、血清コレステロールの『安定化』又は『低下』は、そのような用語が
本明細書で使用されるとき、対象哺乳類において正常又は正常に近い血清コレス
テロールレベルの発現を意味すると理解されるであろう。また、本発明に基づい
た好適な対象哺乳類は、標準血清コレステロール試験で測定されるとき、好まし
くは正常又は正常に近い血清コレステロールのレベルを有する。

【００７５】 本発明の追加の方法は、その方法が本明細書で開示される抗脂血剤の少なくと
も１つ及び典型的には１つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する
哺乳類におけるＳＲＥＢＰ−１のレベルを調節することを包含する。典型的には
、ＳＲＥＢＰ−１の調節は、以下の実施例に記載されるＳＲＥＢＰ−１成熟試験
によって測定されるとき、タンパク質の成熟を測定することによって評価される
。

【００７６】 本発明は、その方法が、本明細書で開示される抗脂血剤の少なくとも１つ及び
好ましくは１つの治療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類に
おいてＳＲＥＢＰ−１のレベルを調節するための方法を提供する。本実施態様で
は、ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターは、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭ
ａｓｅ）又はその治療上有効な断片；又はスフィンゴ脂質である。考察するよう
に、ＳＲＥＢＰ−１の調節は典型的には、以下の実施例に記載されるＳＲＥＢＰ
−１成熟試験によって測定されるとき、タンパク質の成熟を測定することによっ
て評価される。好ましいアッセイは、実施例で以下に記載されるＳＲＥＢＰ−１
タンパク質分解アッセイである。

【００７７】 本発明の方法は、本明細書に開示されるもののような一次の、培養した又は不
死化した細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することがで
きる。一般に、このような細胞は、以下に記載されるＨＨ−２５ヒト肝細胞を含
めて、本明細書で定義されるようなＳＲＥＢＰ−１成熟型を示すことができる。
当該抗脂血剤を調べる方法、及び特にヒト患者において使用する方法は好ましく
はｉｎ ｖｉｖｏで実施され、使用される方法によって好適な動物モデルの使用
を含めてもよい。別の方法としては、方法はヒト患者のような好適な霊長類にお
いて実施することができる。好ましいのは、上記で定義したようなコレステロー
ル関連疾患を有する、有することが疑われる、又はそれに感受性が高いと診断さ
れているヒト患者である。

【００７８】 ヒト患者が１又はそれより多くのコレステロール関連疾患に感受性が高い実施
態様では、感受性は、コレステロール関連疾患に対する遺伝的又は環境的素因に
関係しうる。かかる素因を決定する方法は公知であり、遺伝的試験が含まれる。
Brown M.S. and Goldstein, J.Lの上記文献を参照のこと。

【００７９】 従って発明は、不適切な（即ち高い）血清コレステロールレベル及びそれに関
連した疾患又は症状を治療する方法を提供する。一般に、このような方法は、高
血清コレステロールレベルに悩んでいる又は感受性が高い対象哺乳類、特にヒト
に、本発明の抗脂血剤化合物の１又はそれより多くの治療上有効な量を投与する
ことを包含する。さらに、不適当な血清コレステロールレベルの発生を防ぐ又は
その重症度を軽減するためのタンパク質分解薬剤としての本抗脂血剤を熟考する
。

【００８０】 本発明の化合物は、本明細書で開示されるようなコレステロールに関連した疾
患、障害又は症状を有する又は有することが疑われるヒト患者に特に有用である
。発明の化合物は、ヒト患者において血清コレステロールを正常又は正常に近い
レベルまで下げるのに特に有用である。発明に従って治療してもよい疾患の具体
例には、高リポタンパク質血症、卒中、心臓血管系疾患及び特にアテローム性動
脈硬化症、並びに本明細書で言及されるその他の具体的な疾患の症状が挙げられ
る。

【００８１】 単に理論にしばられることから離れれば、本発明の複数の区別できる共有結合
した化合物（即ち、少なくとも１つの同定されたＳＲＥＢＰ−１エフェクターと
組合せられた少なくとも１つの同定された抗脂血剤）が、例えば対象細胞におい
てＬＤＬ受容体の合成を高めることによって抗脂血剤の有効性を有意に高めるこ
とができると考えられている。

【００８２】 その上、共有結合によって、本発明の共役体は、化合物を共有結合せずに薬剤
の『カクテル』製剤で同じ化合物を投与することによっては容易に達成すること
ができない効果である、対象細胞に抗脂血剤とＳＲＥＢＰ−１エフェクターを本
質的に同時に提示している。

【００８３】 １つの薬剤による治療が今度はもう１つの薬剤に対して患者を感作することも
報告されている。従って、発明の共役体を介して対象細胞に対して抗脂血剤とＳ
ＲＥＢＰ−１エフェクターを本質的に同時に提示することは、例えば、相乗効果
を提供することによって及び／又はＬＤＬ受容体の産生を高めることによって、
薬剤の活性を高める可能性がある。問題とされる特定のＳＲＥＢＰ−１エフェク
ターには、スフィンゴミエリン及び特にセラミド及び関連化合物が挙げられる。
また、好ましいのは、Ｎ−ＳＭａｓｅ及び該酵素の治療上有効な断片である。

【００８４】 本発明の化合物の投与は、経口、局所（経皮、経頬又は舌下を含む）、鼻内及
び非経口（腹腔内、皮下、静脈内、皮内、又は筋肉内注射を含む）を含む種々の
好適な経路によって行ってよく、経口又は非経口が一般的には好ましい。好まし
い投与方法及び投与量は、例えば、受入者の症状及び年齢によって異なってもよ
い。

【００８５】 本発明の化合物は、血漿リポタンパク質の濃度を下げるような認知された薬学
活性をもったものなどのその他の薬剤と併せて治療に用いてもよい。Brown M.S.
and Goldstein, J.Lの上記文献を参照のこと。例示となる薬剤は、レスコール
^ＴＭ（登録商標名：サンド薬品のフルバスタチン）、メバコール^ＴＭ及びゾコー
ル^ＴＭ（それぞれメルクのシムバスタチン及びロバスタチン）、プラバコール^{Ｔ Ｍ} （ブリストルメイヤーズ・スクイブのプラバスタチン）及びメビノリン（コン
パクチン）のような認知された血清コレステロール阻害剤（即ち、ＨＭＧＣｏＡ
還元酵素を阻害すると報告されている）である。

【００８６】 本発明の化合物は、単独で、又は例えば、ゲンビブロジル、クロフィブレート
、フェノフィブレート、シプロフィブレート、又はベザフィブレートのようなフ
ィブリン酸；コレスチラミン又はコレスチポールのような胆汁酸結合樹脂；及び
プロブコールの使用を実施するようなものを含むその他の許容されている抗−脂
肪血療法と併用で使用してもよい。本発明の化合物は、必要に応じてかかる療法
の前、最中又は後に投与することができる。

【００８７】 発明の１又はそれより多くの化合物は単独で投与されてもよいが、それらはまた
、活性のある化合物に対して有害に反応しない且つそれらの受入者に有害ではな
い、非経口、経口、又はその他の所望の投与に好適な、例えば薬学的に許容可能
な有機又は無機キャリアのような従来の賦形剤との混合物における医薬組成物の
一部として存在してもよい。薬学的に許容可能な、好適なキャリアには、水、塩
溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、ラクトース
、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘性パラフィン、芳
香油、脂肪酸モノグリセリド並びにジグリセリド、石油エーテル脂肪酸エステル
、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、こ
れに限定されない。医薬調製物は滅菌することができ、所望であれば、例えば、
潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、
着色剤、矯味剤、及び／又は芳香族物質など、活性化合物と有害に反応しない補
助剤と混合することができる。

【００８８】 非経口の適用については、特に好適なのは、溶液、好ましくは油状溶液又は水
溶液、及び懸濁液、エマルション、又は座薬を含む埋め込み剤である。アンプル
は都合の良い単位用量である。

【００８９】 経腸適用については、特に好適なのは、タルク及び／又は炭水化物のキャリア
結合剤などを有する錠剤、糖衣錠又はカプセルであり、好ましくはキャリアはラ
クトース及び／又はコーンスターチ及び／又はポテトスターチである。甘味媒体
を用いたシロップ、エリキシルなどを使用することもできる。例えば、マイクロ
カプセル化、多重被覆などによって差次的に分解するコーティングで活性化合物
が保護されるものを含めて、徐放性組成物を調合することができる。

【００９０】 発明の治療用化合物はリポソームに組み入れてもよい。例えば、高周波分解及
び押出しのような既知のリポソーム調製法に従って組み入れを行うことができる
。リポソーム調製の好適な従来の方法は、A.D. Bangham et al の J. Mol. Biol
.の２３巻（１９６５年）の２３８〜２５２ページ； F.Olson et al の Bioche
m. Biophys. Acta ５５７巻（１９７９年）の９〜２３ページ； F. Szoka et al
の Proc. Natl. Acad. Sci. ７５巻（１９７８年）の４１９４〜４１９８ペー
ジ； S. Kim et al のBiochem. Biophys. Acta７２８巻（１９８３年）の３３９
〜３４８ページ及びMayer et al のBiochem. Biophys. Acta ８５８巻（１９８
６年）の１６１〜１６８ページにも記載されている。

【００９１】 リポソームは、１又はそれより多くの上記で考察した共役体のみで作製しても
よいし、さらに好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノール
アミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセ
リン又はホスファチジルイノシトールのような、卵、植物又は動物資源のような
天然資源から得られたリン脂質を含む、従来の合成又は天然リン脂質リポソーム
素材のいずれかと組合せて作製してもよい。例えば、ジミリストイルホスファチ
ジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジコリン
及び相当する合成ホスファチジルエタノールアミン並びにホスファチジルグリセ
ロールのような合成リン脂質を用いてもよい。コレステロール、又はその他のス
テロール、コレステロールヘミスクシネート、糖脂質、１，２−ビス（オレオイ
ロキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−
（２，３−オレオイル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロ
リド（ＤＯＴＭＡ）及びその他のカチオン系脂質をリポソームに組み入れてもよ
い。リポソームの中で使用される１又はそれより多くの化合物及び添加物の相対
量は、相対的に幅広く変化してもよい。本発明のリポソームは、約６０〜９０モ
ルパーセントの天然又は合成リン脂質を含有し； コレステロール、コレステロ
ールヘミスクシネート、脂肪酸又はカチオン系脂質は、０〜５０モルパーセント
の範囲の量で使用されてもよく；及び発明の１又はそれより多い治療用化合物が
約０．０１〜約５０モルパーセントの量で好適に存在してもよい。

【００９２】 任意の治療において使用される活性化合物の実際の好ましい量は、利用される
特定の化合物、調合される特定の化合物、適用方式、特定の投与部位などによっ
て変化することは十分理解されるだろう。投与の任意のプロトコールに関する最
適な投与速度は、前述の指針に関して行われる従来の用量決定試験を用いて当業
者は容易に確認することができる。

【００９３】 一般に、本明細書で開示されるような脂質関連疾患、及び特に高リポタンパク
質血症、卒中、冠動脈心臓疾患特にアテローム性動脈硬化症の治療については、
本発明の１又はそれより多くの化合物の好適な有効量は、1日当り、受入者の体
重ｋｇ当り０．０１〜１００ｍｇの範囲であり、好ましくは1日当り、受入者の
体重ｋｇ当り０．１〜５０ｍｇの範囲であり、さらに好ましくは1日当り、受入
者の体重ｋｇ当り１〜２０ｍｇの範囲である。所望の用量は好適には1日１回投
与し、又は1日を通して適切な間隔で、又はその他の適切なスケジュールで、例
えば２〜５回のように、数回に分けて投与する。

【００９４】 本発明の多数の化合物の好ましい用量は、同定されたＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻
害剤に対して許容された用量の範囲内であり、多数の患者に対して好ましい範囲
よりも低いものである。抗−脂肪血活性を伴ったＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤の
推奨される用量に関するさらに具体的な情報については、Physicians' Desk ref
erence、上記を参照のこと。

【００９５】 もう１つの態様では、本発明は、ステロール調節要素結合タンパク質−１（Ｓ
ＲＥＢＰ−１）のエフェクターを検出する方法を提供する。１つの実施態様では
、発明は： ａ）ＳＲＥＢＰ−１を発現することができる細胞集団を提供する、 ｂ）ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導するのに十分な量でエフェクターの候補を細胞
に接触させる、 ｃ）培地中で細胞を培養する、及び、 ｄ）ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターであることを示す、ＳＲＥＢＰ−１の成熟を
検出する工程を包含する。

【００９６】 本発明の方法で使用するのに例示となるエフェクターには、例えば、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ−α）、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）又はその
有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、ｃｐｐ３２、又はコレステロール
のような、実施例及び図１９に具体的に記載されたものが挙げられる。図２５も
参照のこと。

【００９７】 本発明は、ＬＤＬ受容体生合成のエフェクターを検出する方法も包含する。１
つの実施態様では、方法は： ａ）セラミドに反応性であり、ＳＲＥＢＰ−１を発現することができる細胞集団
を提供する、 ｂ）ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導するのに十分な量でエフェクターの候補を細胞
に接触させる、 ｃ）培地中で細胞を培養する、及び、 ｄ）ＬＤＬ受容体のエフェクターであることを示す、ＬＤＬ受容体の生合成を検
出する工程を包含する。

【００９８】 本発明の方法の1つの実施態様では、ＬＤＬ受容体の例示となるエフェクター
の候補は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−Ｓ
Ｍａｓｅ）又はその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、ｃｐｐ３２、
又はコレステロールである。

【００９９】 本発明によって、哺乳類においてコレステロール関連疾患を治療するためのＳ
ＲＥＢＰ−１のエフェクターの治療能力を測定する方法も提供される。1つの実
施態様では、その方法は： ａ）ＳＲＥＢＰ−１を発現することができる細胞集団を提供する、 ｂ）ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導するのに十分な量で化合物の候補を細胞に接触
させる、 ｃ）培地中で細胞を培養する、及び ｄ）疾患を治療することにおいてエフェクターの治療能力を示す、ＳＲＥＢＰ−
１の成熟を検出する工程を包含する。

【０１００】 本発明はまた、哺乳類においてコレステロール関連疾患を治療するために本明
細書で開示される抗脂血剤のいずれか１つの治療能力を測定する方法を提供する
。１つの実施態様では、その方法は： ａ）ＳＲＥＢＰ−１を発現することができる細胞集団を提供する、 ｂ）ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導するのに十分な量で抗脂血剤を細胞に接触させ
る、 ｃ）培地中で細胞を培養する、及び ｄ）疾患を治療することにおいて抗脂血剤の治療能力を示す、ＳＲＥＢＰ−１の
成熟を検出する工程を包含する。

【０１０１】 また、本明細書では、動物モデルとしてワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ又はア
ポリポタンパク質陰性マウスを用いて、本明細書で開示される１又はそれより多
くの抗脂血剤の治療能力を測定する方法が提供される。１つの実施態様では、そ
の方法は： ａ）標準コレステロールアッセイで測定されるとき、少なくとも約１０〜２０％
血清コレステロールのレベルを下げるのに十分な量で、ウサギ又はマウスに抗脂
血剤の少なくとも1つを投与すること；及び ｂ）コレステロール関連疾患を治療するための抗脂血剤の治療能力を示すものと
して、ウサギ又はマウスにおける血清コレステロールの減少を検出することを包
含する。

【０１０２】 本発明の方法は、任意で、ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターを示すものとしてＬ
ＤＬ受容体活性をモニターすることを包含することができる。本実施態様では、
好適に受容体活性をモニターすることができ、所望であれば、１つ又は標準戦略
の組合せによってそれを定量することができる。例えば、ＬＤＬ受容体活性をモ
ニターするために、特にＬＤＬ受容体レベルにおける増加又は低下を検出するた
めに種々の具体的な方法が報告されている。Brown, M.S. and Goldstein, J.L
（１９９３年）上記及び数種の免疫的並びに分子的アプローチに関してその中で
引用されている参考文献を参照のこと。好ましい方法は本明細書で開示される標
準ＬＤＬ受容体ノーザンブロットアッセイである。

【０１０３】 本発明の方法で使用するのに好適な細胞は、以下に続く実施例で記載される。

【０１０４】 ＳＲＥＢＰ−１を包含し、本明細書で開示される標準アッセイで測定されると
き、ＳＲＥＢＰ−１の成熟が可能である細胞が好ましい。さらに好ましいのは、
以下の実施例で提供されるヒト肝細胞のような、細胞内スフィンゴ脂質、特にセ
ラミド又は関連する化合物における増減に反応性の細胞である。

【０１０５】 本発明の方法と共に使用するのに好適なエフェクター又は候補化合物は、本明
細書で開示される具体的な化合物のようなもの、中性スフィンゴミエリナーゼ（
Ｎ−ＳＭａｓｅ）又はその有効な断片；スフィンゴミエリン、セラミド、ｃｐｐ
３２又はコレステロールである。例示となる中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−
ＳＭａｓｅ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はその相補物で示される配列に対し
て少なくとも７０％、８０％又は９０％の配列同一性を有する配列によってコー
ドされている。別の方法としては、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓ
ｅ）の有効な断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はその相補物のヌクレオチド８
６２〜１４１４に対して少なくとも７０％、８０％又は９０％の配列同一性を有
する配列を包含することができる。

【０１０６】 抗脂血剤は、その化合物（例えばセラミド）と同様に実質的に純粋であること
が好ましい。すなわち、薬剤は少なくとも９０〜９５％の均質性（ｗ／ｗ）で存
在するであろう。薬学上、臨床上及び研究上の多数の適用には、少なくとも９８
〜９９％の均質性（ｗ／ｗ）を有する抗脂血剤が最も好ましい。いったん実質的
に精製されると、薬剤は治療用途として実質的に汚染物がゼロとなるべきである
。いったん部分的に又は実質的に純粋に精製されれば、治療用に、又は本明細書
で開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの好ましいアッセイを行うの
に薬剤を使用することができる。クロマトグラフィ及びゲル電気泳動のような種
々の標準法によって実質的な純度を決定することができる。

【０１０７】 以下の実施例１〜８は、ステロールの存在に関係なくＴＮＦ−αがＳＲＥＢＰ
−１のタンパク質分解を誘導する能力があることを例示する。外部から供給され
たスフィンゴミエリナーゼ及びセラミドも時間及び用量依存的にＳＲＥＢＰ−１
のタンパク質分解を誘導することができる。ＳＲＥＢＰ−１の成熟の反応動態は
、ＴＮＦ−αによる中性スフィンゴミエリナーゼの活性化の速度に一致する。
さらに、抗Ｎ−ＳＭａｓｅ抗体によってＳＲＥＢＰ−１の成熟を阻害することが
できるということは、中性スフィンゴミエリナーゼはＴＮＦ−αが誘導する、ス
テロールに無関係のＳＲＥＢＰ−１の切断に必要であることを示している。ステ
ロールに無関係なＳＲＥＢＰ−１タンパク質分解の産物は核への転移が可能であ
り、ステロール調節要素に結合する。

【０１０８】 本明細書で記述した文献はすべて参考にされて本明細書に組み入れられている
。

【０１０９】 以下の実施例を含め、本開示を通して、必要に応じて以下の略語を使用する：
Ｎ−ＳＭａｓｅ、中性スフィンゴミエリナーゼ；ＬＤＬｒ、低密度リポタンパク
質受容体；ＳＲＥＢＰ−１、ステロール調節要素結合タンパク質−１。数字の付
いた引用は、以下に数字の順に掲げる。

【０１１０】

【実施例】

実施例１：中性スフィンゴミエリナーゼ活性に対するＴＮＦ−αの影響 ＴＮＦ−αの添加と共に中性スフィンゴミエリナーゼの活性は急速に増加した
。 図１を参照のこと。ＴＮＦ−αを細胞に添加した後１５分間で最大２．５倍
の活性の増加が認められた。Ｎ−ＳＭａｓｅの活性は1時間以内に徐々に対照レ
ベルまで戻り、急速な活性の立ち上がりとは対照的であり、観察された非対称性
の反応動態に反映している。

【０１１１】 図１は中性スフィンゴミエリナーゼ活性におけるＴＮＦ−αの影響を示してお
り、以下のようにさらに詳細に説明される：集密的に培養したＨＨ−２５細胞を
ＰＢＳにて１回洗浄し、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加に先だって３０分
間、血清を含まない培地中でインキュベートした。示されている時間で、細胞を
ＰＢＳ中に回収し、沈殿物にして凍結した。続いて、材料及び方法に記載するよ
うに細胞を溶解した。記載されるようにＮ−ＳＭａｓｅのアッセイは２つ１組で
行った。エラーバーは平均からの±１標準偏差を表す。

【０１１２】 実施例２：ＳＲＥＢＰ−１タンパク質分解の反応動態 ＴＮＦ−αに反応した、ステロールに無関係なＳＲＥＢＰ−１の成熟は、ＴＮ
Ｆ−αが誘導したＮ−ＳＭａｓｅの活性化の反応動態に密接に並行していた。成
熟型ＳＲＥＢＰ−１の質量は、ＴＮＦ−αとのインキュベート５分後で２倍、１
５分後で３倍に増加することが見い出された。図２を参照のこと。成熟型ＳＲＥ
ＢＰ−１の量は１時間以内に対照のレベルに戻った。ＥＧＦ又はＰＤＧＦによる
処理ではこの効果は再現できなかった。成熟ＳＲＥＢＰ−１レベルの増加には、
ＳＲＥＢＰ−１前駆体に相当するバンドの強度における付随した低下を伴ってい
た。図３を参照のこと。６０分後、有意に少なくなったＳＲＥＢＰ−１前駆体が
見られた。

【０１１３】 成熟型ＳＲＥＢＰ−１の観察された増加と前駆型ＳＲＥＢＰ−１の付随する低
下を単一の変数に組み入れるために、前駆体ＳＲＥＢＰ−１対成熟型の比をプロ
ットした。図３を参照のこと。ＴＮＦ−αを培地に添加した４５分後に、前駆体
と成熟型の比は最大１．５倍低下した。前駆体と成熟型の比の低下は、処理して
から最初の３０分間ではさらに顕著だった。これもまた、ＴＮＦ−αが誘導した
Ｎ−ＳＭａｓｅの活性化の反応動態に一致している。

【０１１４】 原形質膜のスフィンゴミエリナーゼが、ＳＲＥＢＰ−１のタンパク質分解を導
くシグナル伝達経路に関与している可能性を探求するために、外から供給された
細菌由来のスフィンゴミエリナーゼで細胞を処理した。スフィンゴミエリナーゼ
は、前駆体ＳＲＥＢＰ−１と成熟型ＳＲＥＢＰ−１の相対量に劇的な変化を誘導
した。図２及び図３に見られるように、処理１５分後、成熟型ＳＲＥＢＰ−１レ
ベルで２．５倍の増加が認められた。ＴＮＦ−αとは異なって、スフィンゴミエ
リナーゼにより誘導された成熟型ＳＲＥＢＰ−１の増加は６０分後も持続した。 スフィンゴミエリナーゼも前駆体ＳＲＥＢＰ−１のレベルを下げることができ
た。 図２及び図３を参照のこと。精製したヒト組換えスフィンゴミエリナーゼ
による処理も同様の結果を生じた。

【０１１５】 Ｎ−ＳＭａｓｅのシグナル伝達能の大半は、その脂質セカンドメッセンジャー
であるセラミドを生成する能力に帰する。従って、ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導
するために、細胞浸透性のセラミド類縁体であるＣ２−セラミド（Ｎ−アセチル
スフィンゴシン）の能力を調べた。Ｃ２−セラミドもまた、ＴＮＦ−α又はスフ
ィンゴミエリナーゼで観察されたよりも大きく、ステロールには無関係にＳＲＥ
ＢＰ−１の成熟を誘導する。処理後３０分で、Ｃ２−セラミドは成熟型ＳＲＥＢ
Ｐ−１のレベルを４倍高めた。図２及び図３を参照のこと。スフィンゴミエリナ
ーゼ処理で観察された成熟型ＳＲＥＢＰ−１レベルの持続した上昇は、Ｃ２−セ
ラミド処理でも同様であった。成熟型ＳＲＥＢＰ−１における増加はウシの脳セ
ラミドの添加で再現されたが、Ｃ−２ジヒドロセラミド、ＰＬ−Ａ２又はリン脂
質Ｄ処理では誘導できなかった。

【０１１６】 この実施例で提示されたＳＲＥＢＰ−１成熟の反応動態は、ＳＲＥＢＰ−１の
タンパク質分解が、アポトーシスを受けている細胞にコレステロールを提供する
ことに関与する早期事象であることを示唆している。しかしながら、本試験で使
用したＨＨ−２５ヒト肝細胞株ではアポトーシスの証拠はなかった。理論に束縛
されることを望まなければ、肝細胞におけるステロールに無関係なＳＲＥＢＰ−
１成熟の誘導は、アポトーシスが誘導されることを必要としない生理的過程であ
ると考えられる。代替的には、細胞がアポトーシスに向かう前に２つの経路が分
岐する可能性があり、ステロールに無関係なＳＲＥＢＰ−１のタンパク質分解が
アポトーシスの誘導とは無関係に採用される様式が示唆される。

【０１１７】 ヒト肝細胞で観察されたステロールに無関係なＳＲＥＢＰ−１の切断は、ＴＮ
Ｆ−αが誘導するＮ−ＳＭａｓｅの活性化によって生成されるセラミドにより起
きる。この現象は、Ｎ−ＳＭａｓｅ及び又はＣ２−セラミドの肝細胞への外から
の添加によって再構築される可能性がある。

【０１１８】 図２〜図６は、ＳＲＥＢＰ−１成熟の反応動態におけるＴＮＦ−α、スフィン
ゴミエリナーゼ及びＣ２−セラミドの影響を例示している。図２〜図６は、以下
のようにさらに詳細に説明される：実験の前２４時間、１μｇ／ｍｌの２５−ヒ
ドロキシコレステロール及び１５μｇ／ｍｌのコレステロールを添加した培地中
で細胞を維持した。材料と方法に記載するように示された時間、細胞を処理した
。次いでＰＢＳ中に細胞を回収し、沈殿物として凍結した。記載されたように、
溶解及び核分画を行った。７．５％ポリアクリルアミドゲル上で核分画（５０μ
ｇのタンパク質）を電気泳動してＰＶＤＦ膜に移した。記載されたようにウエス
タンブロットを行った。デンシトメータによってバンドの強度を定量した。誤差
バーは平均からの±１標準誤差を表す。図２）成熟型ＳＲＥＢＰ−１の増加によ
り測定されるときのＳＲＥＢＰ−１成熟の反応動態をプロットしている。増加倍
率は、各時点で相当する対照の値と比較することにより算出した（ＴＮＦ−αは
斜線棒で表し、細菌性スフィンゴミエリナーゼは明るい灰色で示し、Ｃ−２セラ
ミドは暗い棒で表す）。図３）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で細胞を処理し、
上記で記載したように調製した。前駆体ＳＲＥＢＰ−１及び成熟型ＳＲＥＢＰ−
１に相当するバンドを定量してその比をプロットした。図４〜６）数値データが
由来する代表的なウエスタンブロット。インキュベート時間は上に示し、全条件
に適用される。膜をフィルムに１５秒間暴露した。Ｐ及びＭはそれぞれ前駆体Ｓ
ＲＥＢＰ−１及び成熟型ＳＲＥＢＰ−１を示す。

【０１１９】 実施例３：肝細胞のアポトーシスにおけるＴＮＦ−α、スフィンゴミエリナー
ゼ及びＣ２−セラミドの影響 観察されたＳＲＥＢＰ−１の成熟がアポトーシスによって誘導されるタンパク
質分解というさらに一般的な現象に対する作為でないことを立証するために、我
々は、ＤＮＡラダーアッセイを行った。アポトーシスを受けている細胞に特徴的
な１６０塩基対のＤＮＡラダーは試料のいずれにも観察されなかった。

【０１２０】 ＴＮＦ−α、Ｃ２−セラミド及びスフィンゴミエリナーゼがアポトーシスを誘
導しなかったということは、肝細胞におけるＳＲＥＢＰ−１の成熟は、アポトー
シスによって誘導されるタンパク質分解というさらに一般的な現象の一部ではな
いことを示している。

【０１２１】 実施例４：ＳＲＥＢＰ−１の成熟におけるＴＮＦ−α、スフィンゴミエリナー
ゼ及びＣ２−セラミドの濃度の影響 ＴＮＦ−αが誘導したＳＲＥＢＰ−１成熟の程度は、濃度によって感知できる
ほど変化しなかった。最大の効果は１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで認められた。
図７〜９を参照のこと。２５０ミリ単位のスフィンゴミエリナーゼ活性は、前駆
体対成熟型の比で８０％の低下を誘導した。１μＭほどの少ない量のＣ２−セラ
ミドが最大８１％の効果を生じるのに有効であった。しかしながら、最大の効果
は５０Ｍの濃度のＣ２セラミドで得られた。図７〜９を参照のこと。

【０１２２】 図７〜９は、ＳＲＥＢＰ−１の成熟におけるＴＮＦ−α、スフィンゴミエリナ
ーゼ及びＣ２−セラミドの濃度の影響を示す。図７〜９は以下のようにさらに詳
細に説明される。示された濃度にてＴＮＦ−α、スフィンゴミエリナーゼ及びＣ
２−セラミドのいずれかで細胞を処理した。核沈殿物を調製して電気泳動を行っ
た（５０μｇのタンパク質）。前駆体及び成熟型のＳＲＥＢＰ−１に相当するバ
ンドを定量した。前駆体対成熟型の比を単一対照に対して標準化して比較を円滑
にした。対照の比は任意に１という値を割り振った。スフィンゴミエリナーゼ1
単位は３７℃にて１分当り１．０μモルのスフィンゴミエリンを加水分解する。
図７（μｇ／ｍｌのＴＮＦ−α）；図８（ミリ単位のスフィンゴミエリナーゼ）
；図９（ミリＭのＣ２−セラミド）

【０１２３】 実施例５：ＴＮＦ−αが介在するＳＲＥＢＰ−１の成熟に対する抗Ｎ−ＳＭａ
ｓｅ抗体の影響 抗Ｎ−ＳＭａｓｅ抗体が利用できたので、我々はＮ−ＳＭａｓｅの活性化に無
関係にこの経路におけるＴＮＦ−αの効果を調べることができた（１０）。希釈
倍率１：２００にてポリクローナルの抗Ｎ−ＳＭａｓｅ抗体はＴＮＦ−α誘導の
ＳＲＥＢＰ−１の成熟を完全に阻害した。図１０を参照のこと。ＴＮＦ−α誘導
のＳＲＥＢＰ−１の成熟の抑制は、抗体の希釈を増やすことによって解除された
。同じ希釈倍率での免疫前の血清との予備インキュベートでは感知されるほどの
影響はなかった。

【０１２４】 本実施例は、抗Ｎ−ＳＭａｓｅ抗体との事前のインキュベートによってＴＮＦ
−α誘導のＳＲＥＢＰ−１の成熟が効果的に阻止されることを示す。免疫前の血
清による処理では阻害は認められず、阻害は抗体の希釈を高めることによって解
除された。コレステロールエステル合成におけるＴＮＦ−α誘導の増加、［^{１２ ５} ］Ｉ−ＬＤＬ結合におけるＮ−ＳＭａｓｅ誘導の増加、ヒト線維芽細胞におけ
る取り込みと分解を阻害する抗体の能力を示すようなほかの試験によっても、か
かる知見は確認される（１５、１６）。

【０１２５】 図１０は、ＴＮＦ−αが誘導するＳＲＥＢＰ−１の成熟における抗Ｎ−ＳＭａ
ｓｅ抗体の影響を示す。図１０は以下のようにさらに詳細に説明される。実験の
前２４時間、１μｇ／ｍｌの２５−ヒドロキシコレステロール及び１５μｇ／ｍ
ｌのコレステロールを添加した培地中で細胞を維持した。血清を含まない培地に
細胞を１５分間移し、次いで、ＴＮＦ−αを添加する前３０分間、示された希釈
で抗Ｎ−ＳＭａｓｅ抗体又は免疫前のウサギの血清と共にインキュベートした。
次いで記載されたように、細胞を回収し、沈殿物として、溶解した。７．５％ポ
リアクリルアミドゲル上で試料を電気泳動してＰＶＤＦ膜に移した。記載された
ようにバンドを視覚化した。フィルムを１５秒間感光した。

【０１２６】 実施例６：ＳＲＥＢＰ−１の細胞内局在におけるＴＮＦ−α、Ｃ２−セラミド
及びスフィンゴミエリナーゼの影響 ＴＮＦ−α、Ｃ２−セラミド又はスフィンゴミエリナーゼによって生成された
ＳＲＥＢＰ−１の断片が核移行できるかどうかを確定するために、免疫蛍光試験
を実行した。以前の免疫蛍光試験は前駆体と成熟型のＳＲＥＢＰ−１の過剰発現
を基にしていた（１４）。ＳＲＥＢＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに対するポリク
ローナル抗体で処理した細胞及び処理しない細胞において我々は、内因性ＳＲＥ
ＢＰ−１を視覚化することができた。ＤＮＡ結合ドメインは前駆体及び成熟型に
共通なので、内因性ＳＲＥＢＰ−１の全体としての分布を調べることは可能だっ
た。

【０１２７】 ＴＮＦ−α、Ｃ２−セラミド及びスフィンゴミエリナーゼはすべてＳＲＥＢＰ
−１の細胞内局在の変化を誘導することができる。図１１を参照のこと。無処理
の細胞は、細胞体をとおして一様なパターンを示す。このことは前駆体ＳＲＥＢ
Ｐ−１の細胞内の膜への局在と一致する（１４）。しかしながら、ＴＮＦ−α、
Ｃ２−セラミド又はスフィンゴミエリナーゼで処理した細胞は、核の染色の増加
及び核外染色の低下を示す。図１２〜１４を参照のこと。ＳＲＥＢＰ−１の細胞
内局在の迅速な変化は、２つの型の間の前駆体／産物の関係に一致し、処理によ
り生成されたＳＲＥＢＰ−１断片が核移行の能力を持つという追加の証拠を提供
する。

【０１２８】 図１１〜１４はＳＲＥＢＰ−１の間接免疫蛍光を示す。図１１〜１４は以下の
ようにさらに詳細に考察される。前駆体と成熟型の両方に共通であるＤＮＡ結合
ドメインのＮ末端に対するポリクローナルのウサギ抗体でＳＲＥＢＰ−１を視覚
化した。実験の前２４時間、１μｇ／ｍｌの２５−ヒドロキシコレステロール及
び１５μｇ／ｍｌのコレステロールを添加した培地中で細胞を維持した。記載さ
れたように免疫蛍光法を行った。拡大倍率はすべて４０倍であり、写真はすべて
、処理開始後３０分で固定された試料から得た。図１１）対照細胞、図１２）Ｔ
ＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した細胞、図１３）スフィンゴミエリナーゼ
（１００ミリ単位で処理した細胞）、図１４）Ｃ２−セラミド（１０μＭ）で処
理した細胞。

【０１２９】 実施例７：電気泳動移動度シフトアッセイ 成熟型ＳＲＥＢＰ−１断片がさらにコンセンサス配列に結合することができる
ことを明らかにするために、電気泳動移動度シフトアッセイを実行した。ＴＮＦ
−α処理の後、時間と共に電気泳動上で遅れたプローブの量が増加する。図１５
を参照のこと。この過程の反応動態は、Ｎ−ＳＭａｓｅの活性化に一致した。結
合したプローブの量はスフィンゴミエリナーゼ及びセラミド処理と共に増加する
。予想どおり、Ｃ２−セラミドは、ＴＮＦ−α又はスフィンゴミエリナーゼより
も迅速な、活性型の核ＳＲＥＢＰ−１の蓄積を誘導する。図１５〜１７を参照の
こと。ＳＲＥＢＰのＤＮＡ結合ドメインに対する抗体は、結合についてオリゴヌ
クレオチドのプローブとうまく競合する。図１８を参照のこと。プローブの結合
は、無関係なオリゴヌクレオチドでは滴定できないが、非放射性の競合プローブ
の添加によって低下する。

【０１３０】 図１５〜１８は電気泳動移動度シフトアッセイを示す。図１５〜１８は以下の
ようにさらに詳細に説明される。ステロールを補完した培地中で細胞を維持した
。材料と方法に記載するように、核沈殿物を調製してアッセイを行った。成熟型
ＳＲＥＢＰ−１によってすでに結合しているプローブは『結合型』として示す。
結合していないプローブは『遊離型』として示す。（図１５）ＴＮＦ−α（１０
ｎｇ／ｍｌ）、（図１６）スフィンゴミエリナーゼ（１００ミリ単位）及び（図
１７）Ｃ２−セラミド（１０Ｍ）での処理に反応したＳＲＥＢＰ−１のプローブ
への結合の反応動態（分で）（図１８）。ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、スフ
ィンゴミエリナーゼ（１００ミリ単位）又はＣ２−セラミド（１０Ｍ）のいずれ
かで細胞を１５分間処理した。次いで、ＳＲＥＢＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに
対する抗体によってスーパーシフトアッセイを行った。抗体の存在及び非存在は
それぞれ（＋）及び（−）によって示す。免疫前のＩｇＧを対照として用いた。

【０１３１】 図１５〜１８におけるゲル移動度シフト実験は、ＴＮＦ−α、Ｎ−ＳＭａｓｅ
及びＣ２−セラミドのすべてが肝細胞でＳＲＥＢＰ−１のレベルを誘導すること
を明瞭に示している。ＴＮＦ−αは培養したヒト線維芽細胞においてステロール
の代謝を誘導し（１５）、ＬＤＬ受容体を誘導する（１６、１７）することが知
られている。本データは、実際、ＴＮＦ−αがヒト肝細胞においてＬＤＬ受容体
のｍＲＮＡレベルを誘導することを示す。ＴＮＦ−αが誘導する成熟型ＳＲＥＢ
Ｐ−１の増加には、ＬＤＬ受容体の増加及びステロール代謝が伴うというのが1
つの結果である。

【０１３２】 実施例８：培養ヒト肝細胞におけるステロール調節要素結合タンパク質−１の
成熟及び低密度リポタンパク質受容体発現に対する中性スフィンゴミエリナーゼ
（Ｎ−ＳＭａｓｅ）及び組換えＮ−ＳＭａｓｅの過剰発現の影響 本実施例は、２つの別のプラスミドＤＮＡを用いた（ＰＨＨ−Ｉ、Ｎ−ＳＭａ
ｓｅのｃＤＮＡにおける全ヌクレオチド配列を表す、及びＰＨＨ−ＩＩ、ヌクレ
オチド配列８６２〜１４１４を表す）Ｎ−ＳＭａｓｅの過剰発現が、ヒト肝細胞
株ＨＨ−１１におけるＳＲＥＢＰ−１の成熟及びＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ発現を
高めるかどうかを解決するために行われた。偽のプラスミドｃＤＮＡ（ＰＳＶ−
ＳＰＯＴ）を導入した細胞を対照とし、ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導することが
前に明らかにされているＣ−２セラミドと共にインキュベートした細胞を陽性対
照とした。

【０１３３】 つまり、抗生物質を含まない、１０％の透析した熱非働化ウシ胎児血清を含有
する１００ｍｍ^２の無菌培地中にヒト肝細胞（１ｘ１０^４個）を播いた。２４時
間後培地を新鮮な９ｍｌの血清を含まない培地に取り換えた。３７℃にて３０分
間のインキュベート後、１ｍｌのＣａＣｌ_２溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液及びＨＥＰ
ＥＳ緩衝液ｐＨ６．９５中の等容量の０．２５〜２．５ＭのＣａＣｌ_２溶液と混
合した）中の５〜４０μｇのプラスミドＤＮＡ。穏かに混合した後、細胞のイン
キュベートを３７℃にて５〜２４時間継続した。遺伝子導入反応は、培地を取り
除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄することにより停止した。次に、新鮮な
培地を補完した培地を加え、さらに２４時間インキュベートを継続して、適当な
緩衝液に細胞を回収し、遠心してさらに分析するまで凍結して保存した。細胞沈
殿物をホモジネートし、好適な部分試料を、以下及び上記実施例１〜７に記載の
ウエスタンブロット分析にかけた。上記のように遺伝子移入した別のバッチの細
胞から全ＲＮＡを単離し、^３２Ｐで標識したＬＤＬ受容体コンセンサス配列を用
いたノーザン解析を行った。オートラジオグラフを現像して写真撮影した。

【０１３４】 ０．２μｇ／ｍｌのＰＨＨＩ又はＰＨＨＩＩで遺伝子移入した細胞は、偽のｃ
ＤＮＡを移入した細胞に比べてＮ−ＳＭａｓｅ活性で２倍の増加を示した。これ
には、ヒト肝細胞におけるＳＲＥＢＰ−１の成熟でのＰＨＨＩ及びＰＨＨＩＩの
濃度依存性の増加が伴っていた。図１９を参照のこと。レーン３〜６で見られる
ように、ディシュ当り５、１０、２０、４０μｇのＰＨＨＩプラスミドで遺伝子
移入した細胞は、偽のｃＤＮＡを移入した細胞に比べて、緩やかなしかし顕著な
ＳＲＥＢＰ−１の成熟における増加を生じた（図１９、レーン１）。それに対し
て、ディッシュ当り２０μｇのＰＨＨＩＩプラスミドＤＮＡで遺伝子移入した細
胞（図１９のレーン９）ではＳＲＥＢＰ−１の成熟で顕著な増加が注目されたが
、高い濃度では戻っていた。上記実施例１〜７から予想したように、Ｃ−２セラ
ミド（μＭ）と共にインキュベートした細胞はＳＲＥＢＰ−１の成熟を顕著に増
加させた（図１９のレーン２）。追加の実験で、我々は８時間から２４時間の遺
伝子移入の時間の増加が肝細胞においてＳＲＥＢＰ−１の成熟を減らすことを認
めた。その上、ＣａＣｌ_２の２．５Ｍから０．２５Ｍの濃度の低下は有効ではな
かった。

【０１３５】 ノーザンゲル解析は、偽のｃＤＮＡで遺伝子移入した細胞（図２０、レーン１
）に比べて、ＰＨＨＩ及びＰＨＨＩＩ（それぞれ図２０のレーン２及び３）によ
る遺伝子移入はＬＤＬ受容体ｍＲＮＡのレベルを有意に高めることを示した。

【０１３６】 もう１つの実験では、精製した細菌性の組換えＮ−ＳＭａｓｅと共に肝細胞を
インキュベートした。組換えＮ−ＳＭａｓｅを作製し、使用する好ましい方法は
、今や米国特許第５，９１９，６８７号として発行されている、米国特許同時係
属出願、出願番号第０８／７７４，１０４号に記載されている。ＳＲＥＢＰ−１
に対する抗体を用いて、該Ｎ−ＳＭａｓｅでウエスタン免疫ブロット分析を行っ
た。図２１に示すように、Ｃ−２セラミドと共にインキュベートした細胞は、Ｓ
ＲＥＢＰ−１の成熟を顕著に高めた（レーン１）。比較においては、Ｎ−ＳＭａ
ｓｅは、ＳＲＥＢＰ−１の成熟で濃度依存性の増加を発揮した（レーン２、３、
４、５はそれぞれ０．４、０．８、２及び４μｇ／ｍｌのｒＮ−ＳＭａｓｅを表
す）。

【０１３７】 本実施例は、Ｎ−ＳＭａｓｅの過剰発現又は肝細胞にＮ−ＳＭａｓｅを与える
ことは、ＳＲＥＢＰ−１の成熟を刺激し、その結果、ＬＤＬ受容体のｍＲＮＡレ
ベルを高めることを示している。

【０１３８】 上記実施例１〜８は、それによってステロール非依存性の方法でＳＲＥＢＰ−
１の成熟が影響を被る新規の経路を強調している。ＴＮＦ−αは、ヒト肝細胞に
おいてステロール非依存性にＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導する能力があることが
見い出された。このような知見は、それらがＥＧＦ又はＰＤＧＦで再現できない
ので、増殖因子に対する一般的な反応ではない。ＴＮＦ−αに反応したＳＲＥＢ
Ｐ−１の成熟、転移及びＳＲＥ結合活性は、Ｎ−ＳＭａｓｅ活性化の反応動態に
密接に平行する。ＳＲＥＢＰ−１の成熟におけるＴＮＦ−αの効果は、細菌性又
はヒトのスフィンゴミエリナーゼ、Ｃ２―セラミドの外部からの供給によって再
構築されうるが、ジヒドロセラミド、ＰＬ−Ａ２又はＰＬ−Ｄでは再現できなか
った。

【０１３９】 特に、実施例１〜７は、Ｃ２―セラミド、水溶性セラミド類縁体又は細菌性ス
フィンゴミエリナーゼの添加がＳＲＥＢＰ−１の成熟におけるＴＮＦ−αの効果
を模倣することを示している。Ｃ２−セラミドとスフィンゴミエリナーゼはＴＮ
Ｆ−αよりも強くＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導した。単に理論にしばられるので
なければ、この知見は、外因性のセラミド又はスフィンゴミエリナーゼによって
効果的に迂回されるセラミド生成の上流の調節事象の存在を反映している可能性
がある。また、ＴＮＦ−α処理で見られた明瞭な用量依存性の欠如は、ＴＮＦ−
α受容体の飽和可能な結合又はＴＮＦ−α受容体のシグナル伝達能を低減する内
部調節事象に起因する可能性がある。

【０１４０】 本データ及び考察は、ＴＮＦ−αがＳＲＥＢＰ−１のタンパク質分解を開始す
るモデルを示している。１又はそれより多くのその細胞表面受容体へのＴＮＦ−
αの結合及びそうしてＮ−ＳＭａｓｅの活性化を促進することを示すモデル（図
１９）。Ｎ−ＳＭａｓｅは膜のスフィンゴミエリンをセラミドとホスホコリンに
加水分解する。セラミドは代わって、プロテアーゼ、おそらく、ＳＲＥＢＰ−１
の成熟に介在するＣＰＰ３２を活性化する。モデルに従って、成熟型ＳＲＥＢＰ
−１は示されるように次いで核に移行し、上流のステロール調節要素と共に遺伝
子の転写を作動させる。

【０１４１】 図１９に例示されたモデルは、ＳＲＥＢＰ−１の成熟を抑制することが予測さ
れる、上昇した細胞質ステロールの存在下でステロールの恒常性がどのように生
じうるのかを明らかにしている。コレステロールの恒常性に中性スフィンゴミエ
リナーゼが加わることによって得られる利点の１つは、原形質膜のコレステロー
ルの移動を介してコレステロール不足に短期の解決を提供することができ、ＳＲ
ＥＢＰ−１の成熟を促進することによって長期の補完メカニズムを助長すること
ができることである。

【０１４２】 図１９で示されるモデルは、ＴＮＦ−αは、ステロールの存在に関係なく、Ｓ
ＲＥＢＰ−１のタンパク質分解を誘導できることを示している。外から供給され
たスフィンゴミエリナーゼ及びセラミドも時間及び用量依存的にＳＲＥＢＰ−１
のタンパク質分解を誘導することができる。ＳＲＥＢＰ−１成熟の反応動態は、
ＴＮＦ−αによるスフィンゴミエリナーゼの活性化と一致する。さらにヒト組換
えＮ−ＳＭａｓｅも時間及び用量依存性のＳＲＥＢＰ−１成熟の誘導を誘起する
。さらに、抗Ｎ−ＳＭａｓｅ抗体はＳＲＥＢＰ−１の成熟を阻止する。このよう
な知見は、ＴＮＦ−αが誘導する、ステロール非依存性のＳＲＥＢＰ−１の切断
には中性スフィンゴミエリナーゼが必要であることを示している。

【０１４３】 本実施例及び考察によって、ＳＲＥＢＰ−１の成熟を招くＴＮＦ−αにより開
始されるシグナル伝達経路においてＮ−ＳＭａｓｅが同定され、セラミドが用い
られるセカンドメッセンジャーであるという証拠が提供されている。また、コレ
ステロールの恒常性の調節におけるＴＮＦ−αの重要な役割が示されている。

【０１４４】 本知見は以下のように要約される。ＳＲＥＢＰ−１成熟のメディエータとして
のＴＮＦ−αの役割がヒト肝細胞において調べられた。

【０１４５】 上記実施例及び考察における1つの重要な態様は、セラミドは、両者共にＳＲ
ＥＢＰ−１の成熟を抑制することが知られているコレステロール及び２５−ヒド
ロキシコレステロールの存在下でさえ、ＳＲＥＢＰ−１の成熟を刺激したという
ことである。このことは、セラミドが介在するＳＲＥＢＰ−１の成熟は、新規の
、それによってコレステロールの恒常性が調節される、ステロール非依存性のメ
カニズムであることを示している。

【０１４６】 上記実施例１〜８では必要に応じて以下の材料及び方法を用いた。

【０１４７】 １． 材料：ＨＨ−２５と名付けられたヒト肝細胞の細胞株は、正常なヒ
ト組織から調製された（１８）。アルファ改変最小必須培地はメディテック（Ｖ
Ａ、ハーンドン）から購入した。ウシ胎児血清は、ユタ州、ソルトレークシティ
のハイクローンから購入した。Ｆ１０培地及びインスリン−トランスフェリン−
セリン添加剤はギブコＢＲＬ（ＭＤ、ゲーサーズバーグ）から購入した。ヒト組
換えＥＧＦ、ＰＤＧＦ及びＴＮＦ−αは、アップステート・バイオテクノロジー
（ＮＹ、レークプラシッド）から購入した。Ｃ２−セラミド（Ｎ−アセチルスフ
ィンゴシン）は、マトレヤ（ＰＡ、プレーザントギャップ）から入手した。［^{１ ４} Ｃ］−スフィンゴミエリン（比活性、５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）はアメリカン・
ラジオラベルド・ケミカルズ（ＭＯ、セントルイス）から入手した。抗ＳＲＥＢ
Ｐ−１抗体は、サンタクルーズ・バイオテクノロジー（ＣＡ、サンタクルーズ）
から購入した。ストレプトマイセス種由来のスフィンゴミエリナーゼ及びその他
の試薬はすべてシグマから入手した。

【０１４８】 ２． 細胞培養：１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｇ／ｍｌのスト
レプトマイシン、１０ｇ／ｍｌのインスリン、０．１μＭのセリン、５．５μｇ
／ｍｌのトランスフェリン、０．５μｇ／ｍｌのリノレン酸及び１０％のウシ胎
児血清を添加したアルファ最少必須培地（培地Ａ）にてＨＨ−２５細胞を増殖さ
せた。ＴＮＦ−α、Ｃ２−セラミド又はスフィンゴミエリナーゼでの処理を開始
するのに先だって３０〜６０分間、血清を含まないＦ１０培地にて細胞をインキ
ュベートした。

【０１４９】 ３． 細胞の分画：処理後、５ｍｌのＰＢＳにて細胞を洗浄し、４℃にて
１５００ｘｇで１０分間により沈殿物とした。沈殿物を−７０℃にて保存し、０
．５ｍｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、５ｍＭのＥＤＴＡ、
０．２５ｍＭのＥＧＴＡ、５０ｍＭのＮａＦ、７ｍＭのβメルカプトエタノール
、０．３５Ｍのスクロース、０．１％のＮＰ４０及びプロテアーゼ阻害剤、１ｍ
ＭのＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのリューペプチン
及び５μｇ／ｍｌのペプスタチン）中で溶解した。４℃にて１２，０００ｘｇで
１５分間、溶解物を遠心して核分画を調製した。この試料のタンパク質濃度は、
Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ（１９）の方法によって測定した。

【０１５０】 ４． 中性スフィンゴミエリナーゼアッセイ：示された時間間隔にてＴＮ
Ｆ−αで刺激した後、５ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄して回収した。沈殿物を−７
０℃に保存し、０．５ｍｌの緩衝液Ｂ（トリスＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１％の
トリトンＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤）中に再浮遊し
た。超音波破壊プローブを用いて細胞浮遊液に３回（３秒間ずつ）超音波を当て
、４℃にて５分間５００ｘｇで遠心した。酵素源として上清を用いた。

【０１５１】 ５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％のトリトンＸ−１００、０．
１ｍｇのＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ及び５０モルの［^１４Ｃ］スフィンゴミエリ
ン（１２，０００ｄｐｍ）から成る緩衝液中にて中性スフィンゴミエリナーゼに
ついて１００μｇのタンパク質をアッセイした。３７℃にて１．５時間アッセイ
をインキュベートし、１０％のＴＣＡを加えることにより停止した。析出物を遠
心し（４℃にて１０００ｘｇで２０分間）、１ｍｌの無水ジエチルエーテルで１
ｍｌの上清を抽出した。液体シンチレーションカウントのために０．５ｍｌの水
性層を除いた。

【０１５２】 ５． 免疫ブロット：７．５％のポリアクリルアミドゲル上でのゲル電気
泳動によって５０μｇの核タンパク質を分離した。高い範囲の分子量マーカー（
ＮＹ、ニューヨークのバイオラッド、製品番号１６１−０３０３）でゲルを補正
し、ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移して、クマシー染色にて視覚化
した。 製造元の指示書に従って０．５μｇ／ｍｌで、ＳＲＥＢＰ−１に対する
ウサギのポリクローナル抗体を用いた。増強化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロ
ット検出システムキット（アマシャム）を用いて、ロバで作製した抗ウサギＩｇ
Ｇに西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したもので抗体を視覚化した。示された
時間、ＰＶＤＦ膜をハイパーフィルムＥＣＬ（アマシャム）に暴露した。ＳＰＡ
ＲＣ ＩＲＣワークステーションに結合したＰＤＩデンシトメータ スキャナー
（２０Ｊ７型）で実行するデンシトメトリによって免疫ブロットを定量した。

【０１５３】 ５． 間接免疫蛍光法：カバーグラス上で培養ＨＨ−２５細胞を増殖させ
、記載されたように処理した。処理後、１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び０．１ｍＭのＣ
ａＣｌ_２を含有するＰＢＳ（溶液Ａ）で５分間、細胞を３回洗浄した。溶液Ａ中
の３％パラホルムアルデヒドで１０分間細胞を固定し、室温にて６分間、溶液Ａ
中の０．５％トリトンＸ−１００で透過化した。次いで、溶液Ａにて５分間、カ
バーグラスを３回洗浄した。

【０１５４】 一次抗体（抗ＳＲＥＢＰ−１）はＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈して用い
、穏かに振盪しながら１時間適用した。上記のように細胞を洗浄し、製造元の指
示書に従い、ＦＩＴＣを結合した抗ウサギＩｇＧ二次抗体を１／２時間適用した
。カバーグラスを洗浄し、顕微鏡スライドに載せ、ツァイス・アキスオバート蛍
光顕微鏡にて示された倍率で観察し、写真撮影した。

【０１５５】 ６． ＤＮＡラダーアッセイ：ＳＲＥＢＰ−１の成熟試験で用いたのと同
じ濃度にて、ＴＮＦ−α、スフィンゴミエリナーゼ又はＣ２−セラミドのいずれ
かで細胞を処理した。次いで最小必須培地で細胞を２回洗浄し、培地Ａにて６時
間培養した。細胞を回収し、記載されたようにゲノムＤＮＡを調製した（２２）
。ゲノムＤＮＡを電気泳動して、臭化エチジウムで染色した。

【０１５６】 ７． 電気泳動移動度シフトアッセイ：以下のようにゲル移動度シフトア
ッセイを行った。各２０μｌの反応混合物は、結合緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ ｐＨ７．５、０．５ｍＭのスペルミジン、０．１５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍ
Ｍのジチオスレイトール、０．３５ｍＭのスクロース）中で８〜１０μｇの核タ
ンパク質及びＳＲＥＢＰ−１結合部位（１４）を含有するα−［^３２Ｐ］標識２
５塩基対のオリゴヌクレオチドのプローブを含有していた。反応混合物を室温に
て１５分間インキュベートして、２５ｍＭのトリスホウ酸（ｐＨ８．０）、０．
２５ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液中の６．５％ポリアクリルアミドゲル（４９：０．６
アクリルアミド／ビスアクリルアミド）上に直接載せた。実験の一部では、ＳＲ
ＥＢＰに特異的な血清又は免疫前の血清を反応混合物に加え、タンパク質−プロ
ーブ複合体の組成を決定した。このような『スーパーシフト』アッセイについて
は、α−［^３２Ｐ］標識プローブを加える前に、１μｌの免疫前血清又は等量の
抗ＳＲＥＢＰ抗血清と共に、４℃にて３０分インキュベートした。すべての実験
で、室温にて２００Ｖで２時間電気泳動することによってタンパク質を分離した
。ゲルを乾燥し、増感紙とともにコダックＸＡＲフィルムに暴露した。３回の特
定の実験で得られた核抽出物についてアッセイを反復し、写真画像解析によって
評価して結果の再現性を確認した。

【０１５７】 引用文献 １） Goeddel, D.V., Aggarwal, B. B., Gray, P.W., Leung,D.W., Nedwin, G.
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【０１５８】 本発明はその好ましい実施態様を引用して説明している。しかしながら、当業
者が、本開示を考慮する際に、発明の精神及び範囲の中で、改変し、改善し得る
ことは十分理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）活性におけるＴＮＦ
−αの効果を示すグラフである。

【図２】 図２は、ＳＲＥＢＰ−１成熟の反応動態におけるＴＮＦ−α、スフィンゴミエ
リナーゼ及びＣ２−セラミドの効果を例示するグラフであり、ＳＲＥＢＰ−１成
熟の反応動態を示す。

【図３】 図３は、ＳＲＥＢＰ−１成熟の反応動態におけるＴＮＦ−α、スフィンゴミエ
リナーゼ及びＣ２−セラミドの効果を例示するグラフであり、時間に対する未成
熟／成熟ＳＲＥＢＰ−１の比を示す。

【図４】 図４は、ＴＮＦ−αの発現を示すウエスタン免疫ブロットの代表例である。

【図５】 図５は、スフィンゴミエリナーゼの発現を示すウエスタン免疫ブロットの代表
例である。

【図６】 図６は、Ｃ２−セラミドの発現を示すウエスタン免疫ブロットの代表例である
。

【図７】 図７は、ＳＲＥＢＰ−１の成熟に対するＴＮＦ−αの効果を示すグラフである
。

【図８】 図８は、ＳＲＥＢＰ−１の成熟に対するスフィンゴミエリナーゼの効果を示す
グラフである。

【図９】 図９は、ＳＲＥＢＰ−１の成熟に対するＣ２−セラミドの効果を示すグラフで
ある。

【図１０】 図１０は、ＴＮＦ−αが誘導するＳＲＥＢＰ−１の成熟における抗Ｎ−ＳＭａ
ｓｅ抗体の効果を示すウエスタン免疫ブロットの代表例である。

【図１１】 図１１は、細胞におけるＳＲＥＢＰ−１の発現を示す間接免疫蛍光の顕微鏡写
真である。

【図１２】 図１２は、細胞におけるＳＲＥＢＰ−１の発現を示す間接免疫蛍光の顕微鏡写
真である。

【図１３】 図１３は、細胞におけるＳＲＥＢＰ−１の発現を示す間接免疫蛍光の顕微鏡写
真である。

【図１４】 図１４は、細胞におけるＳＲＥＢＰ−１の発現を示す間接免疫蛍光の顕微鏡写
真である。

【図１５】 図１５は、電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示すゲルの代表例である。

【図１６】 図１６は、電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示すゲルの代表例である。

【図１７】 図１７は、電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示すゲルの代表例である。

【図１８】 図１８は、電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示すゲルの代表例である。

【図１９】 図１９は、ヒト肝細胞においてＴＮＦ−αがどのようにＳＲＥＢＰ−１のタン
パク質分解（成熟）を誘導し、膜コレステロールを動員するのかを示すモデルで
ある。ＬＤＬ受容体及び特にＳＲＥＢＰ−１の効果を模式的に示す。

【図２０】 図２０は、Ｎ−ＳＭａｓｅ（ＰＨＨＩ、レーン３〜６；ＰＨＨＩＩ、レーン９
）をコードする組換えベクターの増加した量を発現する細胞におけるＮ−ＳＭａ
ｓｅを示すウエスタン免疫ブロットの代表例である。

【図２１】 図２１は、Ｎ−ＳＭａｓｅタンパク質（レーン２、ＰＨＨＩ；レーン３、ＰＨ
ＨＩＩ）をコードするベクターの発現を示すノーザンブロットの代表例である。

【図２２】 図２２は、細胞におけるＳＲＥＢＰ−１の発現及び成熟を例示するウエスタン
免疫ブロットの代表例である。

【図２３】 図２３は、ヒトＮ−ＳＭａｓｅをコードする単離されたｃＤＮＡの核酸配列で
ある配列表１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す図面である。

【図２４】 図２４は、ヒトＮ−ＳＭａｓｅの推定アミノ酸配列である配列表２（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す図面である。

【図２５】 図２５は、特定の抗脂血剤、標的臓器及び薬剤の特定の作用の例を示す図面で
ある。

【図２６】 図２６は、具体的な血清コレステロール阻害剤、メバスタチン、フルバスタチ
ン、プラバスタチン、ロバスタチン、及びシムバスタチンの化学構造を示す図面
である。該阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である。フルバスタチンは
完全に合成したメバロノラクトンの誘導体である。残りの還元酵素阻害剤は、ヒ
ドロナフタレン環を基にした真菌のコンパクチン誘導体である。

【図２７】 図２７は、スフィンゴミエリンを示す図面である。

【図２８】 図２８は、Ｃ−２セラミド並びにジヒドロＣ−２セラミドを示す図面である。
スフィンゴシン主鎖における３−ヒドロキシル基及び４，５−トランス炭素二重
結合は矢印で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/366 Ａ６１Ｋ 31/366 ４Ｃ０８６ 31/40 31/40 ４Ｃ２０６ 31/4045 31/4045 38/46 45/06 45/06 47/48 47/48 Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 3/04 3/04 3/06 3/06 9/10 １０１ 9/10 １０１ 31/12 31/12 37/06 37/06 43/00 １０１ 43/00 １０１ １２１ １２１ １２３ １２３ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1/44 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/44 Ｇ０１Ｎ 33/92 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/92 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB22 BB50 BB51 DA69 FB01 FB03 FB05 FB08 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA03 EA04 GA11 HA12 4B063 QA19 QQ08 QQ32 QQ53 QR08 QR33 QR42 QR48 QR56 QR66 QS02 QS25 QS34 QX02 QX07 4C076 AA01 AA12 AA13 AA14 AA17 AA19 AA22 AA37 AA43 AA53 AA61 BB01 BB05 BB13 BB15 BB16 BB22 BB25 BB29 BB31 BB32 CC07 CC11 CC16 CC21 CC35 CC42 DD63N EE59Q FF66 4C084 AA01 AA02 AA03 AA20 BA44 CA53 CA59 DC01 DC32 MA02 MA17 MA22 MA23 MA24 MA31 MA35 MA36 MA37 MA38 MA52 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 NA15 ZA362 ZA452 ZA702 ZA752 ZB082 ZB332 ZC202 ZC332 ZC752 4C086 AA01 AA02 BA17 BC05 BC13 DA42 MA02 MA04 MA17 MA22 MA23 MA24 MA31 MA35 MA36 MA37 MA52 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 NA15 ZA36 ZA45 ZA70 ZA75 ZB08 ZB33 ZC20 ZC33 ZC75 4C206 AA01 AA02 DB56 GA25 KA04 MA02 MA04 MA13 MA14 MA37 MA42 MA43 MA44 MA51 MA55 MA56 MA57 MA72 MA77 MA79 MA80 MA83 MA86 MA87 NA14 NA15 ZA36 ZA45 ZA70 ZA75 ZB08 ZB33 ZC20 ZC33 ZC75

Claims (75)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ステロール調節要素結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ−１）の少
   なくとも１つの有効成分の治療上有効な量を含む抗脂血剤。
2. 【請求項２】 治療上有効な量が、好適な対照哺乳類に比べて、哺乳類にお
   ける血清コレステロールのレベルを下げるのに十分である請求項１に記載の抗脂
   血剤。
3. 【請求項３】 薬剤が、さらに、コレステロール生合成に関係する酵素の合
   成阻害剤又は半合成阻害剤を少なくとも１つ含む請求項１に記載の抗脂血剤。
4. 【請求項４】 該酵素がＨＭＧＣｏＡ還元酵素又はＨＭＧＣｏＡ合成酵素で
   ある請求項３に記載の抗脂血剤。
5. 【請求項５】 薬剤が、さらに、カスパーゼを少なくとも１つ含む請求項１
   に記載の抗脂血剤。
6. 【請求項６】 カスパーゼがｃｐｐ３２プロテアーゼ（カスパーゼ３）であ
   る請求項５に記載の抗脂血剤。
7. 【請求項７】 阻害剤が、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン
   、プラバスタチン、メビノリン（コンパクチン）、アトルバスタチン又はそれら
   の誘導体から成る群より選ばれる薬剤である請求項３に記載の抗脂血剤。
8. 【請求項８】 少なくともＳＲＥＢＰ−１のエフェクターの１つが、スフィ
   ンゴ脂質、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）又は治療上有効なそ
   の断片である請求項２に記載の抗脂血剤。
9. 【請求項９】 スフィンゴ脂質がセラミドである請求項８に記載の抗脂血剤
   。
10. 【請求項１０】 セラミドが天然に生じるセラミド、又はＣ−２、４、６若
    しくは８セラミドのいずれかである請求項９に記載の抗脂血剤。
11. 【請求項１１】 薬剤が、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素の阻害剤又はＨＭＧＣｏＡ
    合成酵素に関係するスフィンゴ脂質を含む請求項１に記載の抗脂血剤。
12. 【請求項１２】 薬剤が、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバスタチン
    、プラバスタチン、メビノリン（コンパクチン）、アトルバスタチン又はそれら
    の誘導体の１つと共有結合するスフィンゴ脂質を含む請求項１１に記載の抗脂血
    剤。
13. 【請求項１３】 スフィンゴ脂質がセラミドであり、該セラミドが阻害剤上
    のヒドロキシル（−ＯＨ）基を介して阻害剤の１つと結合する請求項１２に記載
    の抗脂血剤。
14. 【請求項１４】 阻害剤上のヒドロキシル（−ＯＨ）基がセラミドのＣ−３
    基に共有結合する請求項１３に記載の抗脂血剤。
15. 【請求項１５】 抗脂血剤が、順に共有結合した １ ）セラミド、 ２）セラミドのＣ−３基に結合したヘテロ二官能性スペーサー基、及び、 ３）ヘテロ二官能性スペーサー基上の反応性炭素原子に結合したフルバスタチ
    ン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン（コンパクチ
    ン）、アトルバスタチン又はそれらの誘導体のヒドロキシル（−ＯＨ）基 を含む請求項１４に記載の抗脂血剤。
16. 【請求項１６】 薬剤が、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）
    又は治療上有効なその断片；ＨＭＧＣｏＡ還元酵素の阻害剤又はＨＭＧＣｏＡ合
    成酵素と会合するＮ−ＳＭａｓｅ又は断片を含む請求項１に記載の抗脂血剤。
17. 【請求項１７】 薬剤が、さらに、フルバスタチン、シムバスタチン、ロバ
    スタチン、プラバスタチン、メビノリン（コンパクチン）、アトルバスタチン又
    はそれらの誘導体の１つと共有結合した中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭ
    ａｓｅ）又はその断片を含む請求項１６に記載の抗脂血剤。
18. 【請求項１８】 薬剤が、セラミド、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−Ｓ
    Ｍａｓｅ）又は治療上有効なその断片を含む請求項１に記載の抗脂血剤。
19. 【請求項１９】 中性スフィンゴミエリナーゼが、配列表１（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：１）又はその相補的な配列で表される配列に少なくとも７０％の配列同
    一性を有する配列によってコードされている請求項１６又は１８に記載の抗脂血
    剤。
20. 【請求項２０】中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）の有効な断
    片が、配列表１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はその相補的な配列のヌクレオチ
    ド８６２〜１４１４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む
    請求項１９に記載の抗脂血剤。
21. 【請求項２１】 中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）の治療上
    有効な断片が、配列表１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はその相補的な配列のヌ
    クレオチド８６２〜１４１４から成る請求項２０に記載の抗脂血剤。
22. 【請求項２２】 中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）又はその
    断片が、Ｎ−ＳＭａｓｅ又は断片のアミド結合を介して阻害剤の１つに結合する
    請求項８〜２１のいずれか１項に記載の抗脂血剤。
23. 【請求項２３】 抗脂血剤が、順に共有結合した １ ）中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）又は治療上有効なその
    断片、 ２ ）Ｎ−ＳＭａｓｅ又はその断片のアミド基に結合するヘテロ二官能性スペ
    ーサー、及び、 ３ ）ヘテロ二官能性のスペーサーの反応性炭素原子に結合したフルバスタチ
    ン、シムバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、メビノリン（コンパクチ
    ン）、アトルバスタチン又はそれらの誘導体のヒドロキシル（−ＯＨ）基 を含む請求項８〜２２のいずれか１項に記載の抗脂血剤。
24. 【請求項２４】 局所用に又は関連した使用のために薬剤が特別に調製され
    る請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗脂血剤。
25. 【請求項２５】 薬剤が、リポソーム製剤としての薬剤を提供するのに十分
    な成分をさらに含む請求項２４に記載の抗脂血剤。
26. 【請求項２６】 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗脂血剤の治療上
    有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類において血清コレステロールの
    レベルを調節する方法。
27. 【請求項２７】 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗脂血剤の治療上
    有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてＳＲＥＢＰ−１のレベ
    ルを調節する方法。
28. 【請求項２８】 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗脂血剤の治療上
    有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてＬＤＬ受容体のレベル
    を調節する方法。
29. 【請求項２９】 哺乳類がアテローム性動脈硬化症又は関連疾患の認知され
    た動物モデルである請求項２８の方法。
30. 【請求項３０】 哺乳類がワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ又はアポリポタン
    パク質Ｅ陰性マウスである請求項２９の方法。
31. 【請求項３１】 哺乳類が霊長類である請求項２６〜２８のいずれか１項に
    記載の方法。
32. 【請求項３２】 霊長類が、コレステロール関連疾患を有すると診断されて
    いる、有することが疑われている、又はそれに感受性が高いヒト患者である請求
    項３１の方法。
33. 【請求項３３】 コレステロール関連疾患が、高コレステロール血症を含む
    高リポタンパク質血症、卒中、肥満、アテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、
    大脳性アテローム性動脈硬化症、コレステロールエステル貯蔵病、臓器移植不全
    及び肝硬変を含む肝疾患、胆汁系疾患、脳炎を亢進するウイルス感染の少なくと
    も１つである請求項３２の方法。
34. 【請求項３４】 ヒト患者の感受性がコレステロール関連疾患に対する遺伝
    的又は環境的素因に関係する請求項３２又は３３の方法。
35. 【請求項３５】 血清の高コレステロールレベルに関連した哺乳類の疾患を
    治療する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗脂血剤の治療
    上有効な量を哺乳類に投与することを含んでなる方法。
36. 【請求項３６】 哺乳類が霊長類である請求項３５に記載の方法。
37. 【請求項３７】 霊長類が、血清の高コレステロールレベルを有すると診断
    されている、有することが疑われている、又はそれに感受性が高いヒト患者であ
    る請求項３６に記載の方法。
38. 【請求項３８】 請求項１に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投
    与することを含み、その際、ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターが、中性スフィンゴ
    ミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）又は治療上有効なその断片；又はスフィンゴ脂
    質である、哺乳類において血清のコレステロールを調節する方法。
39. 【請求項３９】 哺乳類がアテローム性動脈硬化症又は関連疾患に対する認
    知されたモデルである請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 哺乳類がワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ又はアポリポタン
    パク質Ｅ陰性マウスである請求項３９に記載の方法。
41. 【請求項４１】 請求項１に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投
    与することを含み、その際、ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターが、中性スフィンゴ
    ミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）又は治療上有効なその断片；又はスフィンゴ脂
    質である、哺乳類においてＳＲＥＢＰ−１のレベルを調節する方法。
42. 【請求項４２】 請求項１に記載の抗脂血剤の治療上有効な量を哺乳類に投
    与することを含み、その際、ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターが、中性スフィンゴ
    ミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）又は治療上有効なその断片；又はスフィンゴ脂
    質である、哺乳類においてＬＤＬ受容体のレベルを調節する方法。
43. 【請求項４３】 中性スフィンゴミエリナーゼが、配列表１（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：１）又はその相補的な配列で表される配列に少なくとも７０％の配列同
    一性を有する配列によってコードされている請求項３８〜４２のいずれか１項に
    記載の方法。
44. 【請求項４４】 中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）の有効な
    断片が、配列表１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はその相補的な配列のヌクレオ
    チド８６２〜１４１４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含
    む請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
45. 【請求項４５】 スフィンゴ脂質がセラミドである請求項３８〜４２のいず
    れか１項の方法。
46. 【請求項４６】 哺乳類が霊長類である請求項３８〜４２のいずれか１項の
    方法。
47. 【請求項４７】 霊長類が、コレステロール関連疾患を有すると診断されて
    いる、有することが疑われている、又はそれに感受性が高いヒト患者である請求
    項４６の方法。
48. 【請求項４８】 コレステロール関連疾患が、高コレステロール血症を含む
    高リポタンパク質血症、卒中、肥満、アテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、
    大脳性アテローム性動脈硬化症、コレステロールエステル貯蔵病、臓器移植不全
    及び肝硬変を含む肝疾患、胆汁系疾患の少なくとも１つである請求項４７の方法
    。
49. 【請求項４９】 ヒト患者の感受性がコレステロール関連疾患に対する遺伝
    的又は環境的素因に関係する請求項４７又は４８に記載の方法。
50. 【請求項５０】 抗脂血剤がリポソーム製剤として提供される請求項２６〜
    ４９のいずれか１項に記載の方法。
51. 【請求項５１】 リポソーム製剤が具体的に肝臓への投与に適合される請求
    項５０に記載の方法。
52. 【請求項５２】 リポソーム製剤が、経口、筋肉内、腹腔内、又はステント
    若しくは関連する埋め込み器具で肝臓に投与される請求項５０又は５１に記載の
    方法。
53. 【請求項５３】 各方法が、標準コレステロールアッセイにより測定される
    とき、好適な対照哺乳類に比べた場合、哺乳類において少なくとも２０％血清コ
    レステロールのレベルを下げる請求項２６〜５２のいずれか１項に記載の方法。
54. 【請求項５４】 イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）標準ＨＭＧＣｏＡ還元
    酵素アッセイで測定されるとき、薬剤が約２０％〜９０％の間のＩＤ_５０を示す
    請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗脂血剤。
55. 【請求項５５】 標準血清コレステロール結合アッセイによって測定される
    とき、好適な対照哺乳類に比べた場合、薬剤が哺乳類において少なくとも約２０
    ％血清コレステロールを下げることができる請求項５４に記載の抗脂血剤。
56. 【請求項５６】 ステロール調節要素結合タンパク質−１（ＳＲＥＢＰ−１
    ）のエフェクターを検出する方法であって、 ａ）ＳＲＥＢＰ−１を発現することができる細胞集団を提供すること、 ｂ）ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導するのに十分な量で候補エフェクターを細胞
    に接触させること、 ｃ）培地中で細胞を培養すること；及び、 ｄ）ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターであることを示すＳＲＥＢＰ−１の成熟を
    検出すること を含んでなる方法。
57. 【請求項５７】 ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ
    −α）、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）若しくはその有効な断
    片、スフィンゴミエリン、セラミド、ｃｐｐ３２、又はコレステロールである請
    求項５６に記載の方法。
58. 【請求項５８】 ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターを示すこととしてのＬＤＬ
    受容体の活性をさらにモニターすることを含む請求項５６又は５７に記載の方法
    。
59. 【請求項５９】 ＬＤＬ受容体の生合成のエフェクターを検出する方法であ
    って、 ａ）セラミドに反応性で且つＳＲＥＢＰ−１を発現することができる細胞集団
    を提供すること、 ｂ）ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導するのに十分な量で候補エフェクターを細胞
    に接触させること、 ｃ）培地中で細胞を培養すること；及び、 ｄ）ＬＤＬ受容体のエフェクターを示すＬＤＬ受容体の生合成を検出すること
    を含んでなる方法。
60. 【請求項６０】 ＬＤＬ受容体のエフェクターが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−
    α）、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）若しくはその有効な断片
    、スフィンゴミエリン、セラミド、ｃｐｐ３２、又はコレステロールである請求
    項５８又は５９に記載の方法。
61. 【請求項６１】 哺乳類においてコレステロール関連疾患を治療するために
    ＳＲＥＢＰ−１のエフェクターの治療能力を決定する方法であって、 ａ）ＳＲＥＢＰ−１を発現することができる細胞集団を提供すること、 ｂ）ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導するのに十分な量で候補化合物を細胞に接触
    させること、 ｃ）培地中で細胞を培養すること；及び、 ｄ）疾患を治療することにおけるエフェクターの治療能力を示すＳＲＥＢＰ−
    １の成熟を検出すること を含んでなる方法。
62. 【請求項６２】 細胞が、さらに、細胞内セラミドレベルの増減に反応する
    ことができる請求項６１に記載の方法。
63. 【請求項６３】 候補化合物の治療活性を示すＬＤＬ受容体の活性をモニタ
    ーすることをさらに含む請求項６１又は６２に記載の方法。
64. 【請求項６４】 候補化合物が、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａ
    ｓｅ）若しくはその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、ｃｐｐ３２、
    又はコレステロールである請求項６３に記載の方法。
65. 【請求項６５】 中性スフィンゴミエリナーゼが、配列表１（ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：１）又はその相補的な配列で表される配列に少なくとも７０％の配列同
    一性を有する配列によってコードされている請求項５７〜６４のいずれか１項に
    記載の方法。
66. 【請求項６６】 中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）の有効な
    断片が、配列表１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はその相補的な配列のヌクレオ
    チド８６２〜１４１４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含
    む請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。
67. 【請求項６７】 哺乳類においてコレステロール関連疾患を治療するために
    請求項１〜２５に記載の抗脂血剤のいずれか１つの治療能力を決定する方法であ
    って、 ａ）ＳＲＥＢＰ−１を発現することができる細胞集団を提供すること、 ｂ）ＳＲＥＢＰ−１の成熟を誘導するのに十分な量で抗脂血剤を細胞に接触さ
    せること、 ｃ）培地中で細胞を培養すること；及び、 ｄ）疾患を治療することにおける抗脂血剤の治療能力を示すＳＲＥＢＰ−１の
    成熟を検出すること を含んでなる方法。
68. 【請求項６８】 細胞が細胞内セラミドレベルの増減にさらに反応すること
    ができる請求項６７に記載の方法。
69. 【請求項６９】 抗脂血剤の治療活性を示すＬＤＬ受容体の活性をモニター
    することをさらに含む請求項６７又は６８に記載の方法。
70. 【請求項７０】 抗脂血剤が、中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓ
    ｅ）若しくはその有効な断片、スフィンゴミエリン、セラミド、ｃｐｐ３２又は
    コレステロールである請求項６９に記載の方法。
71. 【請求項７１】 中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）が、配列
    表１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はその相補的な配列で表される配列に少なく
    とも７０％の配列同一性を有する配列によってコードされている請求項７０に記
    載の方法。
72. 【請求項７２】 中性スフィンゴミエリナーゼ（Ｎ−ＳＭａｓｅ）の有効な
    断片が、配列表１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）又はその相補的な配列のヌクレオ
    チド８６２〜１４１４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含
    む請求項５６〜５７に記載のいずれか１項の方法。
73. 【請求項７３】 ワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ又はアポリポタンパク質陰
    性マウスにおいて請求項１〜２５に記載の抗脂血剤のいずれか１つの治療能力を
    決定する方法であって、 ａ）少なくとも約１０〜２０％血清コレステロールレベルを下げるのに十分な
    量で、ウサギ又はマウスに少なくとも１つの抗脂血剤を投与すること、及び、 ｂ）ウサギ又はマウスにおいて、コレステロール関連疾患を治療するための抗
    脂血剤の治療能力を示す血清コレステロールの低下を検出すること を含んでなる方法。
74. 【請求項７４】 対象哺乳類に請求項１〜２５に記載の抗脂血剤のいずれか
    １つの治療上有効な量を投与することを含む、アミロイド前駆体タンパク質（Ｂ
    ＡＰＰ）の調節生産のための方法。
75. 【請求項７５】 対象哺乳類に請求項１〜２５に記載の抗脂血剤のいずれか
    １つの治療上有効な量を投与することを含む脂肪酸合成を調節する方法。