JP2002536458A - プラスミノーゲンの脱グリコシル化クリングル１〜５領域フラグメント及びこれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 プラスミノーゲンのクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグメント、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているヌクレオチド及び脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体を開示する。本発明の組成物は以前に単離されたクリングル１〜５領域タンパク質と比較したとき、高い抗血管新生活性を有している。本発明には、本明細書に記載した組成物を使用して癌のような血管新生関連疾病及び状態を治療する方法も含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は米国立衛生研究所（ＮＩＨ）による助成金番号ＣＡ４５５４８のもと
に政府の支援でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有することがある。

【０００２】 ［関連出願の相互参照］ 本出願は、１９９９年２月１０日に出願された米国仮特許出願番号第６０／１
１９，５６２号及び１９９９年４月７日に出願された米国仮特許出願番号第６０
／１２８，０６２号の優先権を主張する。

【０００３】 ［発明の分野］ 本発明は血管新生を調節する組成物及び方法に関する。更に詳細には、本発明
は、癌のような血管新生に関連した疾病を治療するために有用な脱グリコシル化
クリングル１〜５領域タンパク質に関する。

【０００４】 ［発明の背景］ 本明細書で使用するとき、用語「血管新生」は新しい血管が組織又は器官内に
生成することを意味する。正常な生理学的条件下では、ヒト又は動物は非常に特
定の限定された状況下でしか血管新生を経験しない。例えば、血管新生は通常、
創傷治癒、胎児及び胚の発育並びに黄体、子宮内膜及び胎盤の形成で観察される
。しかしながら、血管新生は腫瘍の発現、増殖及び転移中のような異常な又は所
望されない条件下においても生起する。このタイプの血管新生は非制御血管新生
と呼ぶこともできる。

【０００５】 制御及び非制御血管新生は共に同様な態様で進行するものと考えられる。内皮
細胞と、基底膜で取り囲まれている周細胞は毛細血管を形成する。血管新生は内
皮細胞や白血球によって放出される酵素による基底膜の浸食で開始する。次いで
、血管内腔を裏張りしている内皮細胞が基底膜から突き出る。血管新生刺激物質
は、内皮細胞が浸食された基底膜から移動するように誘導する。移動中の細胞は
親血管から「新芽」を形成し、そしてそこで内皮細胞は有糸分裂をし、そして増
殖する。内皮細胞の新芽は互いに合体して毛細血管ループを形成し、新たな血管
を創製する。

【０００６】 制御されない永続的な血管新生は多様な疾病状態、腫瘍転移及び内皮細胞によ
る異常な増殖で生起する。制御されない血管新生が存在している多様な病理学的
疾病状態は血管新生依存性疾病又は血管新生関連疾病として一緒に分類されてき
た。腫瘍の増殖が血管新生依存性であるという仮説はエム．ジュダー・フォーク
マン（M. Judah Folkman）によって１９７１年に初めて提案された（J. Folkman
、「腫瘍性血管新生：治療的意味」、N. Engl. Jour. Med. ２８５：１１８２〜
１１８６（１９７１））。この仮定は、最も単純には次のように述べられている
：「一度腫瘍「生着(take)」が生起すると、腫瘍細胞集団における全ての増加は
その腫瘍に集まる新たな毛細血管の増加によって先行されるにちがいない」。腫
瘍「生着」は現在では腫瘍増殖の前血管相を表すものと理解されており、そして
この相では２，３立方ミリメーター容積を占め且つ２，３百万個の細胞を超えな
い腫瘍細胞集団が、存在する宿主の微小血管で生存可能である。この相を超えた
腫瘍容積の拡大には新たな毛細血管の誘導が必要である。

【０００７】 血管新生を阻害し、腫瘍増殖を阻害し、原発性腫瘍の退行を引き起こし、及び
／又は原発性腫瘍の転移を阻害する幾つかの分子が発見されている。これらの分
子は抗血管新生作用物質と呼ばれている。これら抗血管新生作用物質の１つはア
ンギオスタチンと命名されており、そしてこれはプラスミノーゲンタンパク質の
フラグメントである。アンギオスタチンは米国特許第５，６３９，７２５号中で
初めて記載された。

【０００８】 プラスミノーゲンタンパク質は５個のクリングル領域ドメインとカルボキシ末
端領域に位置するセリンプロテアーゼドメインを含んでいる。ヒトプラスミノー
ゲンのＤＮＡ配列は公表されている。（M.J. Browne等、「ＨｅＬａ細胞におけ
る組換えヒトプラスミノーゲン及びアグリコプラスミノーゲンの発現」、Fibrin
olysis ５（４）：２５７〜２６０（１９９１））。プラスミノーゲン分子の各
クリングル領域は概ね８０個のアミノ酸を含有しておりそして３個のジスルフィ
ド結合を含有している。（K.C. Robbins、「プラスミノーゲン−プラスミン酵素
系」、Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice、第２版、
R.W. Colman等編集、J.B. Lippincott Company、３４０〜３５７頁、１９８７年
）。ヒトプラスミノーゲンの各クリングルドメインのおおよそのアミノ酸スパン
は次のとおりである：クリングル１は典型的にはＣｙｓ８４〜Ｃｙｓ１６２を包
含し、クリングル２は典型的にはＣｙｓ１６６〜Ｃｙｓ２４３を包含し、クリン
グル３は典型的にはＣｙｓ２５６〜Ｃｙｓ３３３を包含し、クリングル４は典型
的にはＣｙｓ３５８〜Ｃｙｓ４３５を包含し、そしてクリングル５は典型的には
Ｃｙｓ４６２〜Ｃｙｓ５４１を包含している。（F.J. Castellino及びS.G. McCa
nce、「ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン」、Ciba Found. Symp.、２
１２：４６〜６５（１９９７））。各クリングルドメインは概ね２０個のアミノ
酸のクリングル間ドメインによって分離されているので、本明細書で定義されて
いるクリングル領域はこれらの隣接クリングル間ドメインの任意の部分を含むこ
とができる。

【０００９】 アンギオスタチンタンパク質は、プラスミノーゲンのこれら５個のクリングル
領域のうちの１つ又はそれより多くを含んでいる。アンギオスタチン生成に寄与
することが示唆されているプロテアーゼの中には、マクロファージメタロエラス
ターゼ、メタロプロテイナーゼ（ｍｍｐ）−３、−７及び−９並びにシステイン
のような遊離スルフヒドリルドナーの存在下でのプラスミンそれ自体がある。（
Z. Dong他、「マクロファージ由来のメタロエラスターゼはルイス肺癌における
アンギオスタチン産生に寄与する」、Cell、８８：８０１〜８１０（１９９７）
；H.R. Lijnen、「ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）によるプラスミノーゲ
ンからアンギオスタチン様フラグメントの生成」、Biochemistry、３７：４６９
９〜４７０２（１９９８）；B.C. Patterson及びQ.A. Sang、「ヒトマトリライ
シス（ＭＭＰ−７）及びゲラチナーゼＢ／ＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−９）の
アンギオスタチン変換酵素活性」、J. Biol. Chem. ２７２：２８８２３〜２８
８２５（１９９７））（P. Stathakis等、「プラスミンの還元及びタンパク質分
解によるアンギオスタチンの生成」、J. Biol. Chem. ２７２：２０６４１〜２
０６４５（１９９７）；S. Gately等、「プラスミノーゲンからその血管新生イ
ンヒビターアンギオスタチンへの癌介在性変換のメカニズム」、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA ９４：１０８６８〜１０８７２（１９９７））。

【００１０】 ヒトプラスミノーゲンタンパク質は、そのグリコシル化状態においては、アミ
ノ酸位置Ａｓｎ−２８９にＮ−結合炭水化物鎖を、そしてアミノ酸位置Ｓｅｒ−
２４９及びＴｈｒ−３４６にＯ−結合ムチンタイプ炭水化物鎖を含有している。
アンギオスタチンタンパク質はプラスミノーゲンタンパク質のフラグメントであ
るので、アンギオスタチンタンパク質も上記炭水化物鎖を含有している。例えば
プラスミンを産生させるｔＰＡやｕＰＡによるプラスミノーゲンのタンパク質分
解消化は、プラスミノーゲンの炭水化物含有量で調節されることが知られている
。更に、炭水化物鎖はプラスミノーゲンと細胞表面レセプターの結合を調節する
ことが知られている。炭水化物はまた、循環タンパク質の全身における半減期で
広い役割を果たすことも知られている。（K. Mori等、「Ｉ型及びＩＩ型組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターによる１型及び２型プラスミノーゲンの活性化因
子」、J. Biol. Chem. ２７０：３２６１〜３２６７（１９９５）；D.J. Davids
on及びF.J. Castellino、「天然及び組換えヒトプラスミノーゲンのウロキナー
ゼによる活性化並びにリシン結合特性に与えるアスパラギン２８９−結合オリゴ
糖の性質の影響」、J. Clin. Invest. ９２：２４９〜２５４（１９９３）；J.
Edelberg等、「新生児プラスミノーゲンは改変された細胞表面結合及び活性化動
力学を示す」、J. Clin. Invest. ８６：１０７〜１１２（１９９０）；M. Gonz
ales-Gronow等、「細胞プラスミノーゲン結合部位の更なる特徴分析：プラスミ
ノーゲン２とリポタンパク質ａが同一部位で競合することの証拠」、Biochemist
ry、２８：２３７４〜２３７７（１９８９）；N. Jenkins等、「グリコシル化権
利を取得すること：バイオテクノロジー産業に対する意味」、Nat. Biotechnol.
１４：９７５〜９８１（１９９６））。

【００１１】 アンギオスタチン及びその関連クリングルフラグメントがどのようにして内皮
細胞の増殖を特異的に阻害するのかということの基礎になっているメカニズムは
依然として特徴付けられていない。上記阻害が、増殖中の内皮細胞内で特異的に
発現されるレセプターによって介在されるのかどうか、又はアンギオスタチンが
内皮細胞によって内在化されそしてそれに続いて細胞の増殖を阻害するのかどう
かは依然として明白でない。或いは、アンギオスタチンはインテグリンａ_vｂ₃の
ような内皮細胞付着レセプターと相互に作用し、インテグリン介在性血管新生を
遮断することができる（P.C. Brooks等、「インテグリンアルファｖベータ３ア
ンタゴニストは、血管新生性血管のアポトーシスを誘導することによって腫瘍の
退行を促進する」、Cell ７９：１１５７〜１１６４（１９９４））。

【００１２】 アンギオスタチンは血管新生インヒビターとして同定されているが、当該技術
分野で求められているものは、高い抗血管新生活性を有しているプラスミノーゲ
ンのクリングル領域フラグメントである。これらの改善されたクリングル領域タ
ンパク質は血管新生介在性疾病、例えば癌の治療並びに他の血管新生プロセス、
例えば創傷治癒及び再生の調節に有用であろう。これらのタンパク質は、抗血管
新生クリングル領域タンパク質の性質が改善されているため、より少ない用量で
投与できるので、癌の治療費用を低下させるであろう。改善された抗血管新生ク
リングル領域タンパク質の検出、測定及び位置決定用の組成物や方法も当該技術
分野で求められている。

【００１３】 ［発明の概要］ 血管新生を調節しそして所望されない血管新生、特に腫瘍増殖に関連した血管
新生を阻害するのに有効な組成物及び方法が本発明で提供される。特に、本発明
は、プラスミノーゲンのフラグメントである脱グリコシル化クリングル１〜５領
域タンパク質を提供する。クリングル１〜５領域タンパク質の脱グリコシル化が
これらタンパク質の抗血管新生活性を劇的に上昇させるということは本発明の驚
くべき発見である。本明細書に記載されている脱グリコシル化クリングル１〜５
領域タンパク質には、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質が１つ又
はそれより多くの他のタンパク質と連続している融合タンパク質が含まれること
も理解すべきである。好ましい実施態様では、上記融合タンパク質は脱グリコシ
ル化クリングル１〜５領域タンパク質ともう１つの抗血管新生タンパク質を含ん
でいる。

【００１４】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているヌクレオチ
ド、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡ配
列を含有する発現ベクター、及び脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク
質をコードしているＤＮＡ配列を含有する１つ又はそれより多くの発現ベクター
を含有する細胞も本発明に含まれる。

【００１５】 本発明にはまた、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な
抗体、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体の結合を
阻害する抗体、及び脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプター
に特異的な抗体も含まれる。これらの抗体はポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体でありうる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的
な抗体は、血管新生によって介在される癌若しくは他の疾病の発症又は再発の診
断又は予後判定となる、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の存在
及び量を検出するために診断用キットで使用することができる。脱グリコシル化
クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体はまた、ヒト又は動物を脱グリ
コシル化クリングル１〜５領域タンパク質に対して受動的に免疫し、そしてそれ
によって血管新生の阻害を低下させるためにヒト又は動物に投与することもでき
る。

【００１６】 本発明は、ヒト又は動物において脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパ
ク質のインビボ濃度を高めることによって、望ましくなく且つ制御されない血管
新生によって介在される疾病やプロセスを治療するための方法及び組成物を提供
する。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質のインビボ濃度は、実質
的に精製された脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を、血管新生を
阻害するのに十分な用量で含んでいる組成物をヒト又は動物に投与することによ
って高めることができる。更に、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク
質のインビボ濃度は、ヒト又は動物において、脱グリコシル化クリングル１〜５
領域タンパク質又はプラスミノーゲン若しくはプラスミンから脱グリコシル化ク
リングル１〜５領域タンパク質を放出させる酵素をコードしているヌクレオチド
を投与することによって高めることができる。本発明は腫瘍増殖の治療又は抑制
に特に有用である。

【００１７】 従って、本発明の目的は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を
含んでいる組成物を提供することである。

【００１８】 本発明のもう１つの目的は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質
をコードしているヌクレオチド組成物を提供することである。

【００１９】 本発明のもう１つの目的は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質
のインビボ濃度を高める組成物及び方法を提供することである。

【００２０】 本発明のもう１つの目的は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質
に特異的であり且つプラスミノーゲンを認識しない脱グリコシル化クリングル１
〜５領域タンパク質の抗体を含んでいる組成物を提供することである。

【００２１】 本発明の目的は、体液中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に
特異的な抗体の存在を検出しそして定量する方法を提供することである。

【００２２】 本発明のもう１つの目的は、癌の検出又は予後判定の方法を提供することであ
る。

【００２３】 本発明のもう１つの目的は、血管新生によって媒介される疾病及びプロセスの
治療方法を提供することである。

【００２４】 本発明のもう１つの目的は、癌の増殖を治療又は抑制する組成物を提供するこ
とである。

【００２５】 本発明のなおもう１つの目的は、血管新生プロセスの調節のための遺伝子療法
に有用な組成物及び方法を提供することである。

【００２６】 これらの目的や他の目的、特徴並びに本発明の利点は、開示した実施態様及び
上記請求項に関する以下の詳細な説明を検討した後に明らかになろう。

【００２７】 [詳細な説明] 本発明はプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域の脱グリコシル
化フラグメントを含んでいる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質
を使用する方法並びに脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を検出す
るための方法及び組成物も本発明に含まれる。

【００２８】 本発明の驚くべき発見は、プラスミノーゲンのクリングル１〜５領域の脱グリ
コシル化フラグメントがプラスミノーゲンのクリングル１〜５領域のグリコシル
化フラグメントより一層劇的に抗血管新生的であるということである。従って、
本発明にはクリングル１〜５領域タンパク質の脱グリコシル化フラグメント及び
クリングル１〜５領域タンパク質の脱グリコシル化フラグメントを含んでいる組
成物が含まれる。１つの実施態様では、組成物は製薬的に許容可能な担体、及び
、プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグ
メントの天然グリコシル化形態より高い濃度の脱グリコシル化フラグメントを含
んでおり、該脱グリコシル化フラグメントは天然グリコシル化形態に結合してい
る１個又はそれより多くの炭水化物部分を欠失しておりそして該脱グリコシル化
フラグメントは抗血管新生活性を有している。更なる実施態様では、上記脱グリ
コシル化フラグメントの量対上記天然グリコシル化形態の量の比率は少なくとも
６０：４０、更に好ましくは少なくとも８０：２０、そして最も好ましくは１０
０：０である。脱グリコシル化フラグメント対天然グリコシル化形態の比率は少
なくとも９５：５、９６：４、９７：３、９８：２及び９９：１であってもよい
。

【００２９】 本明細書で使用するとき、用語「脱グリコシル化」とは、クリングル１〜５領
域タンパク質の天然グリコシル化形態に結合している１個又はそれより多くの炭
水化物部分が欠失したタンパク質又はペプチドに言及したものである。「天然グ
リコシル形態」とは、天然に見られるアミノ酸位置でグリコシル化されているク
リングル１〜５領域タンパク質フラグメント又はこのクリングル１〜５領域フラ
グメントが誘導される、より大きなタンパク質に言及したものである。例えば、
ヒトプラスミノーゲンの１つの天然グリコシル化形態はＳｅｒ−２４９、Ａｓｎ
−２８９及びＴｈｒ−３４６でグリコシル化されており、そしてそれ故、ヒトプ
ラスミノーゲンのクリングル１〜５領域のフラグメントの天然グリコシル化形態
はＳｅｒ−２４９、Ａｓｎ−２８９及び／又はＴｈｒ−３４６でグリコシル化さ
れている。本明細書に記載されているクリングル１〜５領域フラグメントの天然
グリコシル化形態は、天然でフラグメントとして存在する必要はなく、そしてよ
り大きなタンパク質の一部として天然に存在することができると理解すべきであ
る。

【００３０】 それ故、「脱グリコシル化プラスミノーゲン」とは、そうでない場合天然でグ
リコシル化されていることができる（即ち、プラスミノーゲンタンパク質の天然
グリコシル化形態ではグリコシル化されている）位置の炭水化物を欠失している
任意の種のプラスミノーゲンタンパク質を言う。例えば、本発明にはヒトプラス
ミノーゲンのアミノ酸位置２８９（Ａｓｎ−２８９）に相当するアミノ酸位置の
ビシアリル化−ビアンテナリー（biantenary）グリカン、ヒトプラスミノーゲン
のアミノ酸位置２４９（Ｓｅｒ−２４９）に相当するアミノ酸位置のＯ−結合ム
チンタイプ炭水化物鎖、及び／又はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置３４６
（Ｔｈｒ−３４６）に相当するアミノ酸位置のＯ−結合ムチンタイプ炭水化物鎖
を欠いているプラスミノーゲンタンパク質が含まれる。更に、用語「脱グリコシ
ル化プラスミノーゲン」は、炭水化物鎖がゼロ、１個又は２個であるプラスミノ
ーゲンタンパク質を包含する。本発明の１つの実施態様では、脱グリコシル化プ
ラスミノーゲンはヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２８９に相当するアミノ
酸の任意のＮ−結合炭水化物鎖を欠いている。更なる実施態様では、脱グリコシ
ル化プラスミノーゲンはヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２８９に相当する
アミノ酸の任意の炭水化物部分を欠いている。

【００３１】 更に本明細書で使用するとき、用語「脱グリコシル化クリングル１〜５領域タ
ンパク質」及び「脱グリコシル化フラグメント」とは、そうでない場合天然でグ
リコシル化されていることができる（即ち、脱グリコシル化クリングル１〜５領
域タンパク質の天然グリコシル化形態ではグリコシル化されている）位置に炭水
化物を欠失している任意の種のプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５
領域のフラグメントを言う。例えば、本発明にはヒトプラスミノーゲンのアミノ
酸位置２８９に相当するアミノ酸位置のビシアリル化−ビアンテナリーグリカン
、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２４９に相当するアミノ酸位置のＯ−結
合ムチンタイプ炭水化物鎖、及び／又はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置３
４６に相当するアミノ酸位置のＯ−結合ムチンタイプ炭水化物鎖を欠いている脱
グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質が含まれる。それ故、用語「脱グ
リコシル化クリングル１〜５領域タンパク質」は炭水化物鎖がゼロ、１個又は２
個であるクリングル１〜５タンパク質を包含する。本発明の１つの実施態様では
、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はアミノ酸位置２８９のビシ
アリル化−ビアンテナリーグリカンを欠いている。もう１つの実施態様では、ア
ミノ酸位置２８９の炭水化物鎖はビシアリル化−ビアンテナリーグリカンより小
さい。もう１つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク
質はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２８９に相当するアミノ酸の炭水化物
部分を欠いている。

【００３２】 アミノ酸に言及するとき、「に相当する」とは異なるタンパク質又はこれらの
フラグメントの同一領域における２個のアミノ酸の比較を示し、上記タンパク質
は相同体、オーソログ又はパラログである。相同体は実質的な相同性を有するタ
ンパク質として定義され、ここで「実質的な相同性」は以下で定義される。オー
ソログは同一でないアミノ酸配列及び類似する機能的特徴を有するタンパク質と
して定義され、これらタンパク質は異なる種に由来するが、これらの種は共通の
先祖起源を有している。パラログは同一でないアミノ酸配列及び類似する機能的
特徴を有するタンパク質として定義され、これらタンパク質は同一の種に由来す
る。本発明において、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３に位置するＡｓｎ−
２８９に相当するアミノ酸の例はマウスプラスミノーゲンのクリングル３に位置
するアミノ酸であり、そしてこのアミノ酸はこれに結合したＮ−結合炭水化物部
分、そして好ましくは、天然で見られるような、これに結合したビシアリル化−
ビアンテナリーグリカンを有しうるものである。本発明にはヒト以外の種に由来
するプラスミノーゲンのクリングル１〜５領域のフラグメントが含まれると理解
すべきである。

【００３３】 本発明のもう１つの実施態様では、クリングル１〜５領域タンパク質はヒトプ
ラスミノーゲンの２８９位に相当する位置に修飾アミノ酸を有しており、そのた
め該タンパク質の翻訳後修飾中にこの位置に炭水化物部分は付加されない。好ま
しい実施態様では、上記アミノ酸の置換は保存的置換である。更に好ましい実施
態様では、上記アミノ酸の置換はアスパラギンからグルタミン酸への置換である
。更になお好ましい実施態様では、クリングル１〜５領域タンパク質は、概ねク
リングル１〜３領域に相当する配列番号１に示されるアミノ酸配列を有している
。

【００３４】 本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はインビボ又はイン
ビトロで製造することができる。例えば、脱グリコシル化クリングル１〜５領域
タンパク質は血清、尿及び腹水を含むがこれらに限定されない体液から単離する
ことができ、又は化学的若しくは生物学的方法（例えば、組換え遺伝子発現、オ
リゴヌクレオチドの化学的合成、及びプラスミノーゲン又はプラスミンのような
より大きなタンパク質のインビトロ酵素触媒作用）で合成することができる。組
換え技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ源からの遺伝
子増幅及び逆転写酵素／ＰＣＲを使用するＲＮＡ源からの遺伝子増幅が含まれる
。例えば、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、天然ではグリコ
シル化可能なアミノ酸位置がグリコシル化されないアミノ酸で置換されている該
タンパク質をコードしている遺伝子を発現させることによって組換え的に産生さ
せることができる。この遺伝子は、以下で更に詳細に記載している遺伝子治療方
法を使用して個体に投与することができる。クリングル１〜５領域タンパク質は
脱グリコシル化プラスミノーゲンと脱グリコシル化プラスミノーゲンを開裂する
酵素を個体に投与することによってインビボで作成することもできる。好ましい
実施態様では、上記酵素はマクロファージメタロエラスターゼのようなエラスタ
ーゼ酵素である。脱グリコシル化クリングル１〜５タンパク質は、脱グリコシル
化プラスミノーゲンを特異的に開裂する酵素を投与することによってインビボで
作成することもできる。

【００３５】 プラスミノーゲン又はプラスミンのようなより大きなタンパク質から脱グリコ
シル化クリングル１〜５領域タンパク質を単離するとき、プラスミノーゲン又は
プラスミンのどちらかを酵素触媒作用の前に脱グリコシル化するか又は得られた
クリングル１〜５領域タンパク質自体を脱グリコシル化することができる。タン
パク質の脱グリコシル化方法は当該技術分野の熟練者に良く知られている。しか
しながら、エラスターゼによるグリコシル化プラスミノーゲンの酵素触媒作用と
比較したとき、エラスターゼによる脱グリコシル化プラスミノーゲンの酵素触媒
作用後にクリングル１〜５領域タンパク質の収量が増加することは本発明の驚く
べき発見である。それ故、本発明の好ましい実施態様では、クリングル１〜５領
域タンパク質は脱グリコシル化プラスミノーゲンのエラスターゼ消化によって単
離される。

【００３６】 「クリングル１〜５領域」は、本明細書ではヒトプラスミノーゲンの概ねアミ
ノ酸位置１から概ねアミノ酸位置５４１までに相当する領域として定義されてい
ると理解すべきである。かくして、本発明のクリングル１〜５領域の脱グリコシ
ル化フラグメントはクリングル１領域に先行するＮ−末端配列、クリングル領域
１、２、３、４及び５、クリングル間領域並びにこれらの抗血管新生フラグメン
トを含有することができ、上記領域は天然では連続配列又はそうでないとして見
いだされる。脱グリコシル化できるクリングル１〜５領域の抗血管新生フラグメ
ントは米国特許第５，６３９，７２５号及び第５，８３７，６８７号中で更に開
示されている。

【００３７】 本発明は任意の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質誘導体を含む
ように意図されていることも理解すべきである。クリングル１〜５領域タンパク
質誘導体には、プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域のアミノ酸
配列を有するタンパク質が含まれる。クリングル１〜５領域タンパク質誘導体に
はまた、クリングル１〜５領域の抗血管新生フラグメントに相当する配列を有す
るペプチドも含まれる。「抗血管新生フラグメント」は、アミノ酸配列が、「抗
血管新生サブ配列」と称されるクリングル１〜５領域のサブ配列に相当するペプ
チドであると定義される。「サブ配列」は、より大きな配列内に見られる一連の
連続アミノ酸である。サブ配列は一般的に、上記のより大きな配列の概ね少なく
とも７０％、更に好ましくは８０％、そして最も好ましくは９０％を構成する。

【００３８】 クリングル１〜５領域タンパク質誘導体にはまた、元の配列又はサブ配列中の
１個又はそれより多くのアミノ酸が天然生起のアミノ酸残基又はアミノ酸残基類
似体（これは修飾アミノ酸とも称される）で置換されている修飾配列を有してい
るタンパク質又はペプチドも含まれる。適当なクリングル１〜５領域タンパク質
誘導体は、クリングル１〜５領域タンパク質のアミノ酸配列又はクリングル１〜
５領域タンパク質の抗血管新生配列と実質的に相同性の修飾配列を有している。

【００３９】 「アミノ酸残基」はタンパク質又はペプチド内で見られる部分であり、そして
−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−によって表され、Ｒは天然生起アミノ酸の側鎖である。
ペプチド内で見られる部分に言及するとき、用語「アミノ酸残基」と「アミノ酸
」は相互交換可能的に使用される。「アミノ酸残基類似体」には次式：−ＮＨ−
ＣＨＲ−ＣＯ−（式中、Ｒは脂肪族基、置換脂肪族芳香族基、ベンジル基、置換
ベンジル基、芳香族基又は置換芳香族基であり、そしてＲは天然生起アミノ酸の
側鎖に相当しない）を有するＤ型又はＬ型立体配置が含まれる。

【００４０】 本明細書で記載されている脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質配
列中のアミノ酸残基の適当な置換には、血管新生脱グリコシル化クリングル１〜
５領域タンパク質誘導体を生じさせる保存的置換が含まれる。保存的置換は、置
換するアミノ酸（天然生起又は修飾された）が置換されるアミノ酸と構造的に関
連している置換である。「構造的に関連している」アミノ酸は概ね同一の大きさ
であり、そして側鎖中に同一又は同様な官能基を有している。

【００４１】 １つのグループ内の各アミノ酸が同様な電子及び立体特性を有している天然生
起及び修飾アミノ酸のグループを以下で提供する。かくして、保存的置換はアミ
ノ酸を同一グループから得られる別のアミノ酸で置換することによって行うこと
ができる。これらのグループは非限定的であり、そして更なる修飾アミノ酸を各
グループに含めることができると理解すべきである。

【００４２】 グループＩにはロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン及び次の側鎖：
エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチルの側鎖を有する修飾アミノ酸が含まれる。好
ましくは、グループＩにはロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニンが含
まれる。

【００４３】 グループＩＩにはグリシン、アラニン、バリン及びエチル側鎖を有する修飾ア
ミノ酸が含まれる。好ましくは、グループＩＩにはグリシン及びアラニンが含ま
れる。

【００４４】 グループＩＩＩにはフェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプ
トファン、シクロヘキシルメチル、及び置換ベンジル又はフェニル側鎖を有する
修飾アミノ酸残基が含まれる。好ましい置換基には、ハロゲン、メチル、エチル
、ニトロ、−ＮＨ₂、メトキシ、エトキシ及び−ＣＮのうちの１つ又はそれより
多くが含まれる。好ましくは、グループＩＩＩにはフェニルアラニン、チロシン
及びトリプトファンが含まれる。

【００４５】 グループＩＶにはグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラ
ギン酸の置換又は非置換脂肪族、芳香族又はベンジルエステル（例えば、メチル
、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、シクロヘキシル、ベンジル又は置換
ベンジル）、グルタミン、アスパラギン、−ＣＯ−ＮＨ−アルキル化グルタミン
又はアスパラギン（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソ−プロピル
）並びに側鎖−（ＣＨ₂）₃−ＣＯＯＨを有する修飾アミノ酸、これらのエステル
（置換又は非置換脂肪族、芳香族又はベンジルエステル）、これらのアミド及び
これらの置換又は非置換Ｎ−アルキル化アミドが含まれる。好ましくは、グルー
プＩＶにはグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸メチル、アスパラギ
ン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル及びグルタミン酸メチル、グルタミン酸エ
チル及びグルタミン酸ベンジル、グルタミン及びアスパラギンが含まれる。

【００４６】 グループＶにはヒスチジン、リシン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−ニトロア
ルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシ
トルリン及び２−アミノ−４−グアニジノブタン酸、リシンの相同体、アルギニ
ンの相同体及びオルニチンの相同体が含まれる。好ましくは、グループＶにはヒ
スチジン、リシン、アルギニン及びオルニチンが含まれる。アミノ酸の相同体は
、側鎖中に１個から約３個までの追加又は削除されたメチレン単位を含んでいる
。

【００４７】 グループＶＩにはセリン、トレオニン、システイン、及び−ＯＨ又は−ＳＨで
置換されたＣ１〜Ｃ５直鎖又は分岐アルキル側鎖、例えば、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、
−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ又は−ＣＨ₂ＣＨＯＨＣＨ₃を有する修飾アミノ酸が含ま
れる。好ましくは、グループＶＩにはセリン、システイン又はトレオニンが含ま
れる。

【００４８】 本発明のもう１つの態様では、本明細書で記載したアミノ酸配列中のアミノ酸
残基に対する適当な置換には、抗血管新生性であるクリングル１〜５領域タンパ
ク質誘導体を生じさせる「過酷な（severe）置換」が含まれる。抗血管新生性ク
リングル１〜５領域タンパク質誘導体を生じさせる過酷な置換は、高度に保存さ
れる位置におけるより高度には保存されない位置においてはるかに一層可能であ
るように思われる。本発明では、過酷な置換はクリングル間領域とクリングル１
に先行するＮ−末端配列においてはるかに一層可能であるように思われる。「過
酷な置換」は、置換するアミノ酸（天然生起又は修飾された）が置換されるアミ
ノ酸と比較したとき、顕著に異なるサイズ及び／又は電気的特性を有している置
換である。例えば、置換するアミノ酸の側鎖は置換されるアミノ酸の側鎖より顕
著に大きい（又は小さい）ことができ、及び／又は置換されるアミノ酸とは顕著
に異なる電気的特性を有する官能基を有していることができる。

【００４９】 このタイプの過酷な置換の例には、アラニンに対するフェニルアラニン又はシ
クロヘキシルメチルグリシンによる置換、グリシンに対するイソロイシンによる
置換、対応するＬアミノ酸に対するＤアミノ酸による置換、又はアスパラギン酸
に対する−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ₂）₅−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−による置換が含まれ
る。或いは、官能基を側鎖に加えることができるか、側鎖から欠失させることが
できるか、又は別の官能基と交換することができる。このタイプの過酷な置換の
例には、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンの脂肪族側鎖に対するアミン若
しくはヒドロキシル、カルボン酸の付加、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸
の側鎖中のカルボン酸のアミンによる交換、又はリシン若しくはオルニチンの側
鎖中のアミン基の欠失が含まれる。なおもう１つの代替法では、置換するアミノ
酸の側鎖は置換されるアミノ酸の官能基とは顕著に異なる立体及び電気的特性を
有していることができる。このような修飾の例には、グリシンに対するトリプト
ファン、アスパラギン酸に対するリシン及びセリンの側鎖に対する−（ＣＨ₂）₄ ＣＯＯＨが含まれる。これらの例は限定的であることを意味するものではない。

【００５０】 「実質的な相同性」は、各アミノ酸配列の対応する位置における十分な数のア
ミノ酸残基が同一であるか又は構造的に関連しており、その結果第１のアミノ酸
配列を有するタンパク質又はペプチドと第２のアミノ酸配列を有するタンパク質
又はペプチドが同様な生物学的活性を示すときに、これら２つのアミノ酸配列間
に存在する。一般的に、第１のアミノ酸配列中のアミノ酸の少なくとも３０％、
更に好ましくは少なくとも４０％、そして最も好ましくは少なくとも５０％が第
２のアミノ酸配列と同一であるか又は構造的に関連しているとき、これらアミノ
酸配列間に実質的な配列相同性が存在する。相同性はしばしば、配列分析ソフト
ウエア、例えば、ＢＬＡＳＴＩＮ又はＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで入手可能）を使用して測定され
る。ＢＬＡＳＴＩＮ（ヌクレオチド配列用）で２つの配列を比較する（例えば、
２つの配列を互いに「撃ち合う（Blast)」）ためのデフォールトパラメーターは
マッチ報酬＝１、ミスマッチペナルティ＝−２、オープンギャップ＝５及びエク
ステンションギャップ＝２である。タンパク質配列に対してＢＬＡＳＴＰを使用
するとき、デフォールトパラメーターはマッチ報酬＝０、ミスマッチペナルティ
＝０、オープンギャップ＝１１及びエクステンションギャップ＝１である。

【００５１】 本発明に関して、プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜３のクリング
ル領域モチーフは他の生物学的に活性のタンパク質中に存在していることも知ら
れている。これらのタンパク質にはプロトロンビン、肝細胞増殖因子、散乱因子
及びマクロファージ刺激タンパク質が含まれるが、これらに限定されない（T. Y
oshimura等、「ヒトマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ、ＭＳＴ１）のクロ
ーニング、配列決定及び発現によって、ＭＳＰはクリングルタンパク質のファミ
リーのメンバーとして確認され、そしてＭＳＰ遺伝子の位置は第３染色体上に決
定される」、J. Biol. Chem.、２６８：１５４６１〜１５４６８、（１９９３）
）。インビボで抗血管新生活性を有する三次元クリングル様立体配座又はシステ
インモチーフを有する任意のクリングル１〜５領域タンパク質又はペプチドは本
発明の一部であるように意図されている。

【００５２】 本明細書で使用するとき、用語「単離された」とは、その天然状態で通常随伴
する構成成分の少なくとも幾つかを実質的に又は本質的に有していない組成物を
言うものと理解すべきである。それ故、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜
５領域タンパク質は、通常これらのin situ環境と関連している物質の幾つかを
含有していない。典型的には、本発明の単離された脱グリコシル化クリングル領
域１〜５タンパク質は、銀染色ゲル上のバンド強度で測定するとき、少なくとも
約８０％純粋、通常は少なくとも約９０％純粋、そして好ましくは少なくとも約
９５％純粋である。用語「単離された」は、脱グリコシル化クリングル１〜５領
域タンパク質を含んでいる融合タンパク質を本発明から除外しないものと理解す
べきである。本発明は、本明細書に記載したクリングル１〜５領域タンパク質及
び他のタンパク質を含んでいる融合タンパク質又はキメラタンパク質を意図して
いる。好ましい実施態様では、融合タンパク質は脱グリコシル化クリングル１〜
５領域タンパク質及び他の抗血管新生タンパク質、例えばエンドスタチンタンパ
ク質を含んでおり、該エンドスタチンタンパク質はコラーゲンタンパク質のＣ末
端非コラーゲン領域の抗血管新生フラグメントとして定義される。

【００５３】 本明細書に記載した脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、血管
新生が介在するか又は血管新生に係わる疾病又はプロセスを治療するのに有用で
ある。特に、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は血管新
生介在性癌の治療に有用である。本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域
タンパク質はまた、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に
特異的な抗体の産生並びに本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパ
ク質のレセプター及び化学的模擬物の同定及び単離にも有用である。

【００５４】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に加えて、本発明は本明細書
に記載したクリングル１〜５領域タンパク質をコードしているヌクレオチド配列
を含んでいる組成物を包含する。本発明の１つの実施態様では、上記ヌクレオチ
ド配列は、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸２８９に相当する位置に修飾アミノ
酸を含有するクリングル１〜５領域タンパク質をコードしている。好ましい実施
態様では、上記ヌクレオチド配列は配列番号２に示されているとおりである。本
発明はまたクリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有
するベクターも含んでおり、該ベクターは、細胞内に存在するとき、クリングル
１〜５領域タンパク質を発現することができる。この細胞は１個のベクター又は
多数のベクターを含んでいてもよい。本明細書に記載されているヌクレオチド配
列は本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を組換え的に産生
するのに有用であり、そして遺伝子療法によって血管新生関連疾病及び状態を治
療するのに有用である。

【００５５】 更に尚、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を使用して、脱グリ
コシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらのレセプターの抗体を産生
させることができる。特に、脱グリコシル化クリングル１〜５領域と特異的に結
合するが、グリコシル化プラスミノーゲン又はグリコシル化クリングル１〜５領
域タンパク質とは結合しない抗体を産生させることができる。本明細書で使用す
るとき、用語「抗体（単数）」及び「抗体（複数）」にはモノクローナル、ポリ
クローナル、キメラ、単鎖、二重特異性、サル化及びヒト化抗体、並びにＦａｂ
免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物を含むＦａｂフラグメントが含まれる
。

【００５６】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に対する抗血清（又はアゴニ
スト及びアンタゴニスト）の発生における高い特異性の可能性を高めるために、
ジーンバンク（GenBank）、ブルックハーベン・プロテイン（Brookhaven Protei
n）、スイス−プロット（SWISS-PROT）及びＰＩＲのようなタンパク質配列デー
タベースを使用してタンパク質配列を既知の配列と比較して潜在的な配列相同性
を決定することができる。この情報によって、他の分子に対して高度の配列相同
性を示す配列の排除が助長される。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパ
ク質又はこれらのレセプターと特異的に結合するこれらの抗体は、当該技術分野
の通常の技術を有する者に良く知られている診断方法及びキットで使用して、体
液又は組織中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質又はこれらのレ
セプターを検出又は定量することができる。これらの試験から得られた結果を使
用して、癌又は他の血管新生介在性疾病の発症又は再発を診断又は予測すること
ができる。

【００５７】 抗体に言及するとき、句「と特異的に結合する」又は「に特異的な」とは、タ
ンパク質及び他の生物学的物質の異種集団の存在下でペプチドの存在に決定的な
結合反応を言う。かくして、指定された免疫アッセイ条件下では、特定の抗体は
特定のペプチドと優先的に結合し、そして試料中に存在する他のタンパク質とは
顕著な量では結合しない。このような条件下でペプチドと特異的に結合するため
には、特定のタンパク質に対する特異性で選択される抗体が必要である。特定の
タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために多様な免疫アッセイフ
ォーマットを使用することができる。例えば、固相エリザ（ＥＬＩＳＡ）免疫ア
ッセイを定型的に使用して、タンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル
抗体を選択する。特異的な免疫反応性を決定するために使用できる免疫アッセイ
フォーマット及び条件の説明については、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane
）（１９８８）、「抗体（Antibodies）、実験室マニュアル（A Laboratory Man
ual）」、コールド・スプリング・ハーバー・パブリケーションズ（Cold Spring
Harbor Publications）、ニューヨーク、参照。

【００５８】 検出可能な生物分子又は化学品で標識するとき、上記した脱グリコシル化クリ
ングル１〜５領域タンパク質、核酸及び抗体は、以下に記載する方法やアッセイ
を使用するインビボ及びインビトロ診断並びに実験室研究のような目的に有用で
ある。種々のタイプの標識及びこれら標識をポリペプチドや抗体と抱合させる方
法は、当該技術分野の熟練者に良く知られている。標識の例には、放射性標識、
生物発光標識、蛍光原及び色素原が含まれるが、これらに限定されない。更に尚
、本発明は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質、脱グリコシル化ク
リングル１〜５領域タンパク質抗血清、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タ
ンパク質レセプターアゴニスト又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパ
ク質レセプターアンタゴニストを包含し、そしてこれらは製薬的に許容可能な賦
形剤及び任意に持続性放出化合物又は組成物、例えば生物分解性ポリマー、と組
み合わせて以下に記載する治療方法で使用される治療用組成物を形成する。

【００５９】 本発明の方法には、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質
の作成、検出及び測定方法、並びに本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領
域タンパク質を使用する血管新生関連状態及び疾病の治療方法が含まれる。脱グ
リコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、化学反応によって合成的にか又
は発現系と共同した組換え技術によって産生させることができる。これらの脱グ
リコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は動物又はヒト起源であり得る。１
つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は組換え的
に産生され、そして配列番号１のアミノ酸配列を有している。

【００６０】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はまた、プラスミノーゲン若
しくはプラスミンを酵素的に開裂して抗血管新生活性を有するタンパク質を生成
させることによってか又は脱グリコシル化プラスミノーゲンを脱グリコシル化ク
リングル１〜５領域タンパク質に開裂する内因性酵素の作用を模擬する化合物を
使用することによってインビトロ又はインビボで産生させることもできる。脱グ
リコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の産生は、プラスミノーゲン開裂酵
素の活性に影響を与える化合物によって調節することもできる。特に、プラスミ
ノーゲンのグリコシル化が、エラスターゼによるプラスミノーゲンの開裂に伴う
クリングル１〜５領域タンパク質の収量を低下させるということは本発明の驚く
べき発見である。それ故、本発明の１つの実施態様では、脱グリコシル化クリン
グル１〜５領域タンパク質を作成する方法はエラスターゼを使用して脱グリコシ
ル化プラスミノーゲンを開裂することを含んでいる。クリングル１〜５領域タン
パク質の生成における本明細書で報告したエラスターゼの役割を所与のものとす
ると、クリングル３のＮ−結合炭水化物は、クリングル１〜５領域タンパク質の
生成に潜在的に寄与する他のプロテイナーゼの反応メカニズムも調節するであろ
う。

【００６１】 本発明はまた、治療の有効性を決定する目的や癌のような血管新生関連疾病の
予後判定及び診断のために体液及び組織中の脱グリコシル化クリングル１〜５領
域タンパク質を検出する方法も含んでいる。特に、本明細書では循環中のプラス
ミノーゲンより脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体
の使用方法が提供される。これらの方法は、脱グリコシル化クリングル１〜５領
域タンパク質をグリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質やグリコシル化プ
ラスミノーゲンから検出しそして識別する手段を提供する。本発明はまた、細胞
や組織中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質結合部位及びレセプ
ターの検出も含んでいる。

【００６２】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらのレセプターの検
出及び測定用キットは本発明の一部分として意図されている。最も高い力価及び
特異性を有しそして血漿抽出物、尿、組織及び細胞培養培地中の脱グリコシル化
クリングル１〜５領域タンパク質を検出することができる抗血清を更に試験して
、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の迅速で、信頼でき、感度が
良く且つ特異的な測定及び位置決定用キットの容易な使用が確立される。これら
のアッセイキットには次の技術；競合及び非競合アッセイ、ラジオイムノアッセ
イ、生物発光及び化学発光アッセイ、蛍光定量アッセイ、サンドイッチアッセイ
、免疫放射線定量アッセイ、ドットブロット法、エリザ法を含む固相酵素アッセ
イ、尿又は血液の迅速なモニタリング用の抗体被覆片又は測定棒、並びに免疫細
胞化学が含まれるが、これらに限定されない。各キットに関しては、アッセイの
範囲、感度、精度、信頼性、特異性及び再現性を確立する。アッセイ内及びアッ
セイ間変動は、置換又は活性の標準曲線に対して２０％、５０％及び８０％のポ
イントで確立する。

【００６３】 本発明には、関節炎や腫瘍を含むがこれらに限定されない血管新生性疾病及び
プロセスを、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の産生を刺激する
ことによって、及び／又は実質的に精製された脱グリコシル化クリングル１〜５
領域タンパク質、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードして
いるヌクレオチド、又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質アゴニ
スト若しくはアンタゴニスト及び／又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タ
ンパク質抗血清若しくは脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清
に対する抗血清を患者に投与することによって治療又は予防する方法も含まれる
。これらのアンギオスタチン脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質、
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清、脱グリコシル化クリン
グル１〜５領域タンパク質レセプターアゴニスト若しくはアンタゴニスト、又は
これらの組み合わせは、製薬的に許容可能な賦形剤及び任意に持続性放出マトリ
ックス、例えば生物分解性ポリマーと組み合わせて治療用組成物を形成する。更
なる治療方法には、細胞毒性物質と結合した脱グリコシル化クリングル１〜５タ
ンパク質、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質類似体、脱グリコシ
ル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清、又は脱グリコシル化クリングル１
〜５領域タンパク質レセプターアゴニスト及びアンタゴニストを投与することが
含まれる。

【００６４】 本発明の１つの態様では、個体における血管新生を阻害する方法は、個体にお
いて、プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域のグリコシル化フラ
グメントのインビボ濃度と比較してプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１
〜５領域の脱グリコシル化フラグメントのインビボ濃度を高めることを含んでお
り、そして上記クリングル１〜５領域タンパク質の脱グリコシル化フラグメント
はインビボで抗血管新生活性を有している。脱グリコシル化フラグメントのイン
ビボ濃度は任意の体液又は組織中で高めることができるが、好ましくは血清中で
高められる。更なる実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパ
ク質は、このような治療を必要としている個体に治療的有効量で投与される。も
う１つの実施態様では、プラスミノーゲンのクリングル１〜５領域の脱グリコシ
ル化フラグメントをコードしている遺伝子は、以下で更に詳細に考察する遺伝子
治療方法を使用して個体に投与される。好ましくは、上記遺伝子は、クリングル
１〜５領域のフラグメントの翻訳後修飾中におけるグリコシル化を防止するアミ
ノ酸置換を含有しており、そして更に好ましくは上記置換はヒトプラスミノーゲ
ンのアミノ酸Ａｓｎ−２８９に相当するアミノ酸における置換である。

【００６５】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、血管新生によって媒介さ
れるか又は血管新生に係わる疾病又はプロセスの治療で有効である。本発明には
、有効量の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質、若しくは一緒にな
って抗血管新生活性を有する脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の
組合せ、又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質アゴニスト及びア
ンタゴニストで血管新生介在性疾病を治療する方法が含まれる。血管新生介在性
疾病には固形腫瘍、白血病のような血液性腫瘍、腫瘍転移、良性腫瘍、（例えば
血管腫、聴覚腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫）、リウマチ様関節
炎、乾癬、眼の血管新生性疾病（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑
変性、角膜移植片拒絶、血管新生性緑内障、後水晶体線維増殖、ルベオーシス）
、オスラー・ウエーバー症候群、心筋血管新生、プラーク血管新生、毛細血管拡
張症、血友病関節症、血管線維腫、及び創傷顆粒形成が含まれるが、これらに限
定されない。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は内皮細胞の過剰
又は異常刺激による疾病の治療に有用である。これらの疾病には、腸癒着、クロ
ーン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症及び肥厚性瘢痕、即ちケロイドが含ま
れるが、これらに限定されない。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク
質は、胎児着床に必要な血管新生を防止することによる産児制限剤として使用す
ることができる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はまた、ネコ
ひっかき病（Rochele minalia quintosa）及び潰瘍（Helicobacter pylori）の
ような病因論的結果として血管新生を有している疾病の治療にも有用である。

【００６６】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は疾病治療用の他の組成物や
方法と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍は、今までのように脱
グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質と組み合わせた外科手術、放射線
又は化学療法によって治療することができ、そしてその後脱グリコシル化クリン
グル１〜５領域タンパク質を引き続き患者に投与して、微小転移の休止を延長し
そして任意の残存する原発性腫瘍を安定化させ且つその増殖を阻害することがで
きる。

【００６７】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を投与する方法に加えて、本
発明には受動的抗体治療方法が含まれる。１つの実施態様では、脱グリコシル化
クリングル１〜５領域タンパク質抗体は過剰の内因性脱グリコシル化クリングル
１〜５領域タンパク質の作用を遮断する。過剰の内因性脱グリコシル化クリング
ル１〜５領域タンパク質の作用を特異的に遮断すること（内因性グリコシル化ク
リングル１〜５領域タンパク質に対して）は、脱グリコシル化クリングル１〜５
領域タンパク質がグリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質より抗血管新生
性であるという本発明における新たな教示を考慮すると、重要である。この処置
は、生殖、発生並びに創傷治癒及び組織修復のような血管新生依存性プロセスを
調節し、そして異常な排卵、月経及び胎盤形成並びに血管新生を治療する改善さ
れた方法を提供する。この方法はまた、転移プロセスに与える脱グリコシル化ク
リングル１〜５領域タンパク質除去の影響を試験する有用なツールも提供する。

【００６８】 もう１つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗
体のＦａｂ領域に対する抗血清を投与して、内因性脱グリコシル化クリングル１
〜５領域タンパク質抗血清が脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質と
結合する能力を遮断することができる。この処置の正味の効果は、内因性で循環
中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質が標的細胞に到達する能力
を助長し、そしてそれによって転移拡散を低下させることである。

【００６９】 上記した脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらに対する
抗体は、当該技術分野の通常の技術を有する者に既知の製剤化方法を使用して、
製薬的に許容可能な製剤中に、単離され且つ実質的に精製されたタンパク質及び
タンパク質フラグメントとして提供することができる。上記した脱グリコシル化
クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらに対する抗体は固体、液体又はエア
ロゾルであってもよい。固体治療用組成物の例にはピル、クリーム及び埋め込み
可能な投与ユニットが含まれる。ピルは経口的に投与することができ、そして治
療用クリームは局所的に塗布することができる。埋め込み可能な投与ユニットは
局所的に、例えば、腫瘍部位に投与することができるか、又は治療用血管新生調
節組成物の全身放出用に、例えば皮下に埋め込むことができる。液体組成物の例
には、皮下、静脈内、動脈内注射用に適合させた製剤、並びに局所及び眼内投与
用製剤が含まれる。エアロゾル製剤の例には肺に投与するための吸入器用製剤が
含まれる。しかしながら一般的に、本発明の製剤は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋
内、脳血管内、脳内、膣内、子宮内、経口、直腸又は非経口（例えば、静脈内、
脊髄内、皮下又は筋肉内）経路を含むがこれらに限定されない任意の経路で投与
することができる。

【００７０】 更に、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらに
対する抗体は、化合物の持続性放出を可能にする生物分解性ポリマー中に組み入
れることができ、これらのポリマーは、医薬送達が望ましい場所、例えば腫瘍部
位の近位に埋め込まれるか又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質
若しくは抗体が全身に徐々に放出されるように埋め込まれる。生物分解性ポリマ
ー及びこれらの使用は、例えば、ブレム（Brem）等の「再発性神経膠腫治療用の
医薬品ポリマー移植片による間質性化学療法」、J. Neurosurg. ７４：４４１〜
４４６（１９９１）中で詳細に記載されている。浸透圧ミニポンプを使用してカ
ニューレから問題の部位に、例えば転移増殖又は当該腫瘍への血管供給体に直接
、高濃度の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらに対する
抗体の制御された送達を提供することができる。

【００７１】 本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及び抗体の用量は治
療される疾病状態又は状況、並びにヒト又は動物の体重や状態及び該化合物の投
与経路のような他の臨床因子に依存するであろう。ヒト又は動物を治療するため
には、１日当たり概ね０．５ｍｇ／キログラムから１日当たり５００ｍｇ／キロ
グラムの間の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を投与することが
できる。特定の動物又はヒトにおける脱グリコシル化クリングル１〜５領域タン
パク質の半減期に依存して、該タンパク質は１日当たり数回から１週間に１回の
間で投与することができる。本発明はヒト及び獣医学の両用途用の適用を有して
いるものと理解すべきである。本発明の方法は単回並びに多数回投与を意図して
おり、一度にか又は長期間に亘るかのどちらかで投与される。

【００７２】 本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質製剤は好都合には単
位用量形態で提供することができ、そして慣用の製薬技術で製造することができ
る。このような技術には、活性成分と製薬的担体（単数又は複数）又は賦形剤（
単数又は複数）を一緒に合わせる段階が含まれる。適当な製薬的担体及び賦形剤
は当該技術分野の熟練者に知られているが、適当な製薬的賦形剤の例は水である
。一般的に、本発明の製剤は活性成分を液体担体若しくは微細分割固体担体又は
これらの両方と、均一に且つ十分に一緒に合わせ、そしてその後、必要な場合、
生成物を成形することによって製造される。

【００７３】 非経口投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤及び意図される受容
者の血液と製剤を等張にする溶質を含有していることができる水性及び非水性の
無菌注射溶液；並びに懸濁化剤及び濃厚化剤を含んでいることができる水性及び
非水性の無菌懸濁物が含まれる。本発明の製剤は単位用量又は多数回用量容器、
例えば密封アンプル又はバイアルで提供することができ、そして使用直前に無菌
液体担体、例えば、注射用水を加えることしか必要としないフリーズドライ（凍
結乾燥）状態で貯蔵することができる。即時調整の注射溶液や懸濁物は、これま
でに記載した種類の無菌散剤、顆粒及び錠剤から製造することができる。

【００７４】 好ましい単位用量製剤は、投与される成分の１日用量若しくは単位、１日のサ
ブドーズ（sub-dose）若しくはこれらの適当な部分を含有するものである。本発
明の製剤は、特に上記で言及した成分に加えて、製剤のタイプを考慮して当該技
術分野で慣用の他の作用物質を含み得ることが理解されよう。任意に、細胞毒性
物質を脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質フラグメントに配合する
又はそれらの生物学的に機能的なタンパク質に取り入れるか又はそうでない場合
これらタンパク質と組み合わせて、患者に二重療法を提供することができる。

【００７５】 本発明はまた、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードして
いる遺伝子を患者において調節する遺伝子療法も包含する。遺伝子産生物を発現
させるためにＤＮＡを細胞に導入又は送達する種々の方法、或いは遺伝子療法と
称される方法は「インビボでの哺乳動物体細胞への遺伝子導入」、エヌ．ヤング
（N. Yang）、Crit. Rev. Biotechn. １２（４）：３３５〜３５６（１９９２）
中に開示されている。遺伝子療法は、エクスビボ又はインビボ療法のどちらかで
使用するためにＤＮＡ配列を体細胞又は生殖系細胞中に組み入れることを包含し
ている。遺伝子療法は遺伝子を置換し、正常又は異常な遺伝子機能を増大させ、
そして感染性疾病や他の病理学と闘うように機能する。

【００７６】 遺伝子療法で医学的問題を治療する戦略には、欠陥遺伝子を機能的遺伝子で置
換するか、又は機能的遺伝子を加えて僅かに機能的な遺伝子の作用を増大させる
ような治療戦略が含まれる。挿入された遺伝子は疾病又は状態を治療するか又は
組織若しくは器官を治療方式に対して一層感受性にすることができる。本発明に
関しては、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の遺伝子を細胞のサ
ブセットに入れ、そしてその結果、形質転換された細胞において血管新生の発生
を防止することができる。

【００７７】 本発明では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質ＤＮＡ又は脱グ
リコシル化クリングル１〜５領域タンパク質調節配列を導入するための多数のプ
ロトコールが予想される。遺伝子治療方法としては、通常脱グリコシル化クリン
グル１〜５領域タンパク質と特異的に結合して見いだされるもの以外のプロモー
ター配列、又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の産生を増加さ
せる他の配列のトランスフェクションが予想される。このような「遺伝子スイッ
チ」を使用して、通常は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質（又は
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプター）を発現しない細胞
内で脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質（又は脱グリコシル化クリ
ングル１〜５領域タンパク質レセプター）を活性化することができよう。

【００７８】 遺伝子療法のための遺伝子導入方法は３つの広範な範疇：（１）化学的（脂質
に基づく担体又は他の非ウイルスベクター）、（２）生物学的（ウイルス由来ベ
クター及びレセプター取込み）、及び（３）物理的（エレクトロポレーション、
直接的遺伝子導入及び粒子衝撃）に属する。遺伝子治療方法論はまた送達部位に
よって記載することもできる。遺伝子を送達する基本的な方法には、エクスビボ
遺伝子導入、インビトロ遺伝子導入及びインビボ遺伝子導入が含まれる。エクス
ビボ遺伝子導入では、細胞を患者から取り出しそして細胞培養で増殖させる。Ｄ
ＮＡは細胞中にトランスフェクションされ、これらのトランスフェクションされ
た細胞の数を拡大させ、そしてその後患者に再度移植する。本発明は患者から内
皮細胞を取り出し、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードし
ているＤＮＡ又はその調節配列をトランスフェクションし、そしてこれらのトラ
ンスフェクションされた内皮細胞を患者に再度導入することを包含している。イ
ンビトロ遺伝子導入では、培養物中で増殖している形質転換細胞、例えば内皮細
胞を患者に導入する。これらの形質転換細胞は、遺伝子療法を受ける患者から取
り出されたものではない。インビボ遺伝子導入は、細胞が患者の内部にあるとき
に患者の細胞内にＤＮＡを導入することに係わっている。これらの方法は、遺伝
子を患者に導入するために非感染性ウイルスを使用するか、又はネーキド（nake
d）ＤＮＡを患者の部位に注射しそしてそれによって或る割合の細胞にＤＮＡを
取り込ませてそこで該遺伝子産生物タンパク質を発現させることを含んでいる。
本発明においては、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードし
ているＤＮＡを血管を裏張りしている内皮細胞内に導入し、そしてそれによって
血管新生を阻害することができる。好ましい実施態様では、脱グリコシル化クリ
ングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡを、腫瘍に密接した血管を
裏張りしている内皮細胞内に導入する。

【００７９】 遺伝子療法の化学的方法は、細胞膜を横切ってＤＮＡを輸送するために使用さ
れる脂質に基づく化合物（必ずしもリポソームではない）に係わることができる
。リポフェクチン又はサイトフェクチン、即ち負に荷電したＤＮＡと結合する脂
質に基づく陽性イオンは細胞膜を横切ることができるコンプレックスを作り、そ
して細胞内部にＤＮＡを提供する。リポソーム／ＤＮＡコンプレックスは患者の
静脈内に直接注射することができる。リポソーム／ＤＮＡコンプレックスは肝臓
で濃縮され、そしてそこでこれらコンプレックスはＤＮＡをマクロファージやク
ッパー細胞に送達すると考えられている。これらの細胞は長期間生存するので、
送達されたＤＮＡは長期間発現する。更に、ベクター又は遺伝子の「ネーキド」
ＤＮＡは、治療用ＤＮＡを標的化して送達するために、所望の器官、組織又は腫
瘍内に直接注射することができる。他のＤＮＡ担体系は、インビボ遺伝子導入の
ためにＤＮＡを肝細胞に運ぶアシアロ糖タンパク質／ポリリシン抱合系、及び核
に直接運ばれる特異的に操作された小胞コンプレックス中で核タンパク質と結合
させたＤＮＡを含んでいる。

【００８０】 遺伝子療法技術で使用される生物学的方法は、レセプターに基づくエンドサイ
トーシス又はレセプターに基づくファーゴサイトーシスに係わっていることがで
き、そしてこれらは特定のリガンドを細胞表面レセプターに結合させてエンベロ
ープを形成させ、そして細胞膜を横切ってリガンドを輸送することに係わってい
る。詳細には、リガンド／遺伝子コンプレックスを創製しそして血流中に注射す
る。このリガンドのレセプターを有する標的細胞はこのリガンドと特異的に結合
しそしてリガンド−ＤＮＡコンプレックスを細胞内に輸送する。更なる生物学的
方法はウイルスベクターを使用して遺伝子を細胞内に挿入する。例えば、改変さ
れたレトロウイルスベクターは、遺伝子を末梢及び腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、
表皮細胞、筋細胞及び他の体細胞内に導入するためにエクスビボ方法で使用され
ている。次に、これらの改変された細胞を患者に導入する。

【００８１】 ウイルスベクターはまた、インビボプロトコールを使用して遺伝子を細胞内に
挿入するためにも使用されている。外来遺伝子の組織特異的な発現を達成するた
めには、組織特異的であることが知られているシス作用性調節エレメント又はプ
ロモーターを使用することができる。或いは、組織特異的な発現は、インビボで
特定の解剖学的部位へのＤＮＡ又はウイルスベクターのin situ送達を使用して
達成することができる。例えば、インビボにおける血管への遺伝子導入は、イン
ビトロで形質導入された内皮細胞を動脈壁上の選択された部位に移植することに
よって達成されている。周囲の細胞はウイルスによって感染され、そしてそれ故
これら細胞も遺伝子産生物を発現した。ウイルスベクターは、例えばカテーテル
によってインビボ部位に直接送達することができ、その結果一定の領域だけをウ
イルスで感染させることができる。レトロウイルスベクターを使用するインビボ
遺伝子導入はまた、器官につながっている血管に改変ウイルスを注射することに
よって哺乳動物組織及び肝臓組織内でも証明されている。

【００８２】 遺伝子療法プロトコールで使用されているウイルスベクターには、レトロウイ
ルス、例えばマウス白血病レトロウイルス、ＲＮＡウイルス、例えばポリオウイ
ルス又はシンドビスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペス
ウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア及び他のＤＮＡウイルスが含まれるが、これら
に限定されない。複製欠陥マウスレトロウイルスベクターは最も広範に使用され
る遺伝子導入ベクターである。遺伝子導入でのレトロウイルスベクターの基本的
な利点には、大部分の細胞タイプにおける効率的な感染及び遺伝子発現、標的細
胞染色体ＤＮＡへの正確な単一コピーベクター統合並びにレトロウイルスゲノム
の操作の容易性が含まれる。アデノウイルスは新規な遺伝子配列をインビボで標
的細胞に導入することができる。アデノウイルスに基づくベクターは高レベルで
遺伝子産生物タンパク質を発現し、そして、たとえウイルスの力価が低くても、
高い感染効率を有している。更に、このウイルスは細胞不含ビリオンとして十分
に感染性であるので、発現細胞株を注射する必要はない。アデノウイルスベクタ
ーのもう１つの潜在的な利点は、インビボで異種遺伝子の長期間発現を達成でき
ることである。

【００８３】 ＤＮＡを送達する機械的な方法には、ＤＮＡの直接的な注射、例えば生殖又は
体細胞内へのＤＮＡの微量注射、空気的に送達されるＤＮＡ被覆粒子、例えば「
遺伝子ガン」で使用される金粒子、リン酸カルシウムトランスフェクションのよ
うな無機化学的手法及びエレクトロポレーションが含まれる。筋細胞内にプラス
ミドＤＮＡを注射すると、トランスフェクションされそしてマーカー遺伝子を持
続的に発現する細胞が高い割合で得られることが見いだされている。プラスミド
のＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれても、または組み込まれなくても良い。ト
ランスフェクションしたＤＮＡが組み込まれないと、突然変異的挿入、欠失、又
は細胞若しくはミトコンドリアゲノムにおける改変を懸念しないで長期間、最終
的に分化した非増殖性組織における遺伝子産生物タンパク質のトランスフェクシ
ョンと発現が可能になるであろう。治療用遺伝子を特定の細胞に、必ずしも永久
的ではないが、長期間導入することによって、遺伝子疾病の治療又は予防的使用
の処置を提供することができる。ＤＮＡを定期的に再度注射して、受容細胞のゲ
ノムに突然変異を生起させることなく、遺伝子産生物値を維持することができよ
う。外来性ＤＮＡが組み込まれないときには、１個の細胞内で幾つかの異なる外
来性ＤＮＡ構築物が存在することができ、そしてこれら構築物は全て種々の遺伝
子産生物を発現する。

【００８４】 粒子介在性遺伝子導入方法とエレクトロポレーションは共にインビトロ系でか
、又はエクスビボ若しくはインビボ技術と一緒に使用して、ＤＮＡを細胞、組織
又は器官内に導入することができる。粒子介在性遺伝子導入に関しては、ＤＮＡ
被覆高密度粒子（例えば、金又はタングステン）を加速するために動力を発生す
る粒子衝撃デバイス又は「遺伝子ガン」が使用される。これらの粒子は標的器官
、組織又は細胞に浸透する。エレクトロポレーション介在性遺伝子導入は、ＤＮ
Ａ分子が細胞に浸透できるような方法で膜の透過性を高めるために使用される一
定の場強度による短時間の電気インパルスを使用することを含んでいる。

【００８５】 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡを患
者内にトランスフェクションする遺伝子療法プロトコールは、脱グリコシル化ク
リングル１〜５領域タンパク質ＤＮＡを細胞のゲノム内に、ミニクロモソーム内
に組み込むか、又は細胞の細胞質若しくは核質における別個の複製若しくは非複
製ＤＮＡ構築物とするかのどちらかによってもよい。脱グリコシル化クリングル
１〜５領域タンパク質の発現は長期間継続してよいし、又はＤＮＡを定期的に再
度注射して、血清又は細胞、組織若しくは器官内の脱グリコシル化クリングル１
〜５領域タンパク質の所望の値を維持することがしてもよい。

【００８６】 本発明は以下の実施例によって更に説明され、そしてこれら実施例はいずれに
しても本発明の範囲に対して限定を課すものと解釈してはならない。本明細書の
説明を読んだ後に、本発明の精神及び／又は上記請求項の範囲から逸脱すること
なく、当該技術分野の熟練者に示唆され得る他の種々の実施態様、修正及び等価
物の手段を取り得ることを明確に理解すべきである。

【００８７】 実施例１ グリコシル化及び脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の単離 ヒトプラスミノーゲンは、ダブリュ．ジェイ．ブロックウェイ（W.J. Brockwa
y）及びエフ．ジェイ．カステリノ（F.J. Castellino）の「抗線維溶解性アミノ
酸の測定及びこれらアミノ酸と種々のプラスミノーゲンとの結合」、Arch. Bioc
hem. Biophys. １５１：１９４〜１９９（１９７２）中に記載されているアフィ
ニティクロマトグラフィーを使用して精製した。ヒト血漿（Children's Hospita
l血液バンク）１リットルを、２〜３ｍｌ／分の流速度で２００ｍｌのｌｙｓ−
セファロース４ｂ（Pharmacia）カラムに適用した。次に、前もって５０ｍＭの
トリス ｐＨ７．４で平衡化したカラム（Sigma）を５０ｍＭトリス／１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）５００ｍｌで洗浄した。結合プラスミノーゲンを、５０ｍＭ
トリス／２００ｍＭ ε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）２００ｍｌで溶出した
。この物質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価したとき、９５％以上であった。
ヒトプラスミノーゲンは、レクチンアフィニティクロマトグラフィーを使用して
グリコシル化プラスミノーゲン（プラスミノーゲン１）及び脱グリコシル化プラ
スミノーゲン（プラスミノーゲン２）に更に分画した。ヒトプラスミノーゲン（
１０ｍｇ）を、５０ｍＭトリス ｐＨ７．４／１ｍＭ ＭｇＣｌ₂／１ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂で平衡化した５ｍｌのｃｏｎＡ ＨｉＴｒａｐカラム（Pharmacia）に適用し
た。Ｎ−結合炭水化物を欠失しているプラスミノーゲン２はこのカラムと結合し
ない。カラムを５カラム容量の平衡化用緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭトリス
ｐＨ７．４／１ｍＭ ＭｇＣｌ₂／１ｍＭ ＣａＣｌ₂の溶液を使用してプラスミノ
ーゲン１を溶出した。タンパク質濃度は、１．６のＡ^0.1%/1cm（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／で入手可能なprotparamツールから計算した）を
使用して、分光光度計で２８０ｎｍの波長で測定した。

【００８８】 プラスミノーゲン１及び２を２０ｍＭトリス ｐＨ７．６で透析した。次に、
等量のこれらグリコ形態（Ａ２８０ｎｍで測定）を、エム．エス．オーレイリー
（M.S. O'Reilly）等の「アンギオスタチンはマウスにおいてヒト原発性腫瘍の
休止を誘発しそして維持する」、Nature Medicine ２：６８９〜６９２（１９９
６）に記載されているようにして、ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）で消化した
。本質的に、プラスミノーゲンはプラスミノーゲン１ミリグラム当たり０．８単
位のＰＰＥ（Calbiochem）によって３７℃で消化された。５時間インキュベート
した後、ｌｙｓ−セファロース４ｂカラム（１０ｍｌ）に上記反応混合物を適用
し、そして２００ｍＭ εＡＣＡ／５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）５ｍｌでプラ
スミノーゲンの概ねクリングル１〜３フラグメント及び他のリシン結合フラグメ
ント、例えば、クリングル４を溶出して反応を停止させた。このクリングル１〜
３領域タンパク質は、スーパーデックス（Superdex）２００ ＨＲ １０／３０カ
ラム（Pharmacia）でゲルろ過を使用してクリングル４や他のより小さな（＜１
２ｋＤａ）フラグメントから分離した。スーパーデックス２００カラムはＰＢＳ
で平衡化した。クリングル１〜３領域タンパク質濃度は、１．８７のＡ^0.1%/1cm 値（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／で入手可能なprotparamツー
ルから計算した）を使用して、分光光度計で２８０ｎｍの波長で測定した。

【００８９】 ウシ毛細血管内皮細胞は、エム．エス．オーレイリー等の「アンギオスタチン
：ルイス肺癌転移抑制に介在する新規な血管新生インヒビター」、Cell ７９：
３１５〜３２８（１９９４）に以前に記載されたようにして取得し、そして１０
％の熱不活性化ＢＣＳ、抗生物質及び３ｎｇ／ｍｌの組換えヒトｂＦＧＦ（Scio
s Nova、カリフォルニア州）を有するＤＭＥＭ中で維持した。細胞をＰＢＳで洗
浄し、そしてトリプシンの０．０５％溶液に分散させた。ＤＭＥＭ／１０％ＢＣ
Ｓ／１％抗生物質を使用して細胞懸濁物を作成し、そして濃度を２５，０００細
胞／ｍｌに調整した。ゼラチン化した２４ウェル培養プレート上に細胞を播き（
０．５ｍＬ／ウェル）、そして１０％ＣＯ₂中３７℃で２４時間インキュベート
した。培地をＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％抗生物質０．２５ｍｌと取り替え、そ
して試験試料を適用した。２０分間インキュベートした後、培地及びｂＦＧＦを
各ウェルに添加して、ＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％抗生物質／１ｎｇ／ｍｌ ｂ
ＦＧＦの最終容量０．５ｍｌを得た。７２時間後、細胞をトリプシン中に分散さ
せ、ヘマテル（Hematell）（Fisher scientific、ペンシルベニア州）中に再度
懸濁させ、そしてクールター（Coulter）計数器で計数した。内皮細胞増殖アッ
セイから得たデータをプロットし、そしてＩＣ₅₀値はシグマプロット（SigmaPlo
t）を使用して決定した。データ点は全て、クリングル１〜５領域タンパク質の
４つの別々の調製物の３重複物として測定した。

【００９０】 実施例２ プラスミノーゲンの脱グリコシル化によってクリングル１〜５領域タンパク質の
収量が上昇する 等量のプラスミノーゲン１とプラスミノーゲン２をＰＰＥで消化し、そしてク
リングル１〜５領域タンパク質は、プラスミノーゲンのクリングル１〜５領域タ
ンパク質と他のリシン結合フラグメントを精製するためにアフィニティクロマト
グラフィー（ｌｙｓ−セファロース）の組合せを使用し、そしてクリングル４か
らクリングル１〜５領域タンパク質を分離するためにゲルろ過（Superdex200）
を使用して、実施例１に記載されているようにして精製した。図２はアフィニテ
ィカラムから得られる典型的なクロマトグラムを示し、そしてこれはプラスミノ
ーゲン２と比較して基質としてプラスミノーゲン１を使用したとき、得られる収
量が減少していることを証明している。図３は、実施例１に記載されている典型
的なゲルろ過実験から得られたクロマトグラムを示す。プラスミノーゲン１から
得られるクリングル１〜５領域タンパク質は、このグリコシル化フラグメントか
ら予想されるように、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質（１４．
３６分）より僅かに短い保持時間（１３．７７分）を有していることが認められ
た。プラスミノーゲン２から得られるクリングル１〜５領域タンパク質の収量は
、基質としてプラスミノーゲン１を使用したクリングル１〜５領域タンパク質の
収量より４〜５倍高かった。グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで概ね４０ｋＤａに移動し、そして脱グリコシル化クリングル１
〜５領域タンパク質は３８ｋＤａに移動した（データは示していない）。両クリ
ングル１〜５領域タンパク質グリコ体のエドマン分解アミノ末端配列分析によっ
て、Ａｒｇ８７で開始する同一の配列、即ちクリングル１の開始を表すシステイ
ン残基までの１６残基アミノ末端が得られた。

【００９１】 それ故、Ａｓｎ−２８９にＮ−結合炭水化物が存在するとヒトプラスミノーゲ
ンから得られるクリングル１〜５領域タンパク質の生成が調節されることが決定
された。炭水化物が存在すると、ＰＰＥを使用してプラスミノーゲン由来のクリ
ングル１〜５領域タンパク質を開裂するとき、クリングル１〜５領域タンパク質
の収量は４〜５分の１に低下する。レクチンアフィニティクロマトグラフィーを
使用して、グリコシル化プラスミノーゲン（プラスミノーゲン１）と脱グリコシ
ル化プラスミノーゲン（プラスミノーゲン２）を４０：６０の比率で含有してい
る材料から生成されたクリングル１〜５領域タンパク質を分画すると、僅か５〜
１０％のグリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質しか得られない（データ
は示していない）ことも測定された。このデータは更に、Ｎ−結合炭水化物がク
リングル１〜５領域タンパク質生成に関して負のモジュレーターであることを示
した。両クリングル１〜５領域グリコ体は同一のＮ−末端配列を有していたので
、炭水化物はタンパク質分解開裂部位に干渉しないことが示された。

【００９２】 グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はさほど効率的に生成されずそ
して血管新生のインヒビターとしてさほど効率的でなかったが、Ｎ−結合炭水化
物を含有するクリングル１〜５領域タンパク質は脱グリコシル化クリングル１〜
５領域タンパク質より長いクリアランス時間を有していると思われる。これは、
値は低いが、抗内皮細胞活性の持続を全身的に確保するメカニズムであると思わ
れる。

【００９３】 実施例３ 脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、グリコシル化クリングル１
〜５領域タンパク質と比較したとき、高い抗血管新生活性を有している 両クリングル１〜５領域タンパク質グリコ体は、実施例１に記載されているウ
シ内皮細胞の増殖を阻害する能力についてアッセイした。両クリングル１〜５領
域タンパク質グリコ体は内皮細胞の増殖を阻害した。しかしながら、Ｎ−結合炭
水化物を含有するグリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は概ね１３μｇ
／ｍｌの測定ＩＣ₅₀値を有しており、一方、脱グリコシル化クリングル１〜５領
域タンパク質、即ちＮ−結合炭水化物を欠失しているグリコ体は概ね２．４μｇ
／ｍｌの測定ＩＣ₅₀値を有している。かくして、脱グリコシル化クリングル１〜
５領域タンパク質は内皮細胞増殖のはるかにより効率的なインヒビターであるこ
とが明らかになり、そして特に、内皮細胞増殖のインヒビターとして４〜５倍効
率的であった。

【００９４】 上記で引用した全ての特許、刊行物及び抄録は本明細書で参照する。上記は本
発明の好ましい実施態様とだけ関係しており、そして上記請求項に記載した本発
明の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施態様に多数の修正又は改変を
行い得ることが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 好ましい脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質のアミノ酸配列（配
列番号１）及びこれをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。

【図２】 ｌｙｓ−セファロースを使用したグリコシル化及び脱グリコシル化クリングル
１〜５領域タンパク質の精製を示す。

【図３】 ゲルろ過クロマトグラフィーを使用したグリコシル化及び脱グリコシル化クリ
ングル１〜５領域タンパク質の精製を示す。

【図４】 グリコシル化及び脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質による内皮
細胞増殖の阻害を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/02 35/02 35/04 35/04 43/00 １０１ 43/00 １０１ Ｃ０７Ｋ 14/745 Ｃ０７Ｋ 14/745 Ａ６１Ｋ 37/47 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ピリエ−シェファード，スティーブン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02542 ウォルサム ナンバー 58 トラ ペロ ロード 81 (72)発明者 フォルクマン，エム．ユダ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02115 ブルックリン チャットハム サ ークル 18 (72)発明者 リャン，ホン アメリカ合衆国 メリーランド 20878 ゲイザースバーグ ベイリッジ ドライブ 852 (72)発明者 マクドナルド，ニコラス ジェー． アメリカ合衆国 メリーランド 20815 チェビー チェイス スタンフォード ス トリート 4312 (72)発明者 シム，キム リー アメリカ合衆国 メリーランド 20878 ゲイザースバーグ アルゴシー ドライブ 308 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA03 GA11 HA01 HA17 4C084 AA01 AA02 BA01 BA22 CA18 CA53 DC06 MA05 MA13 MA16 MA34 MA52 MA55 MA56 MA60 MA63 MA66 MA67 ZA332 ZA812 ZA892 ZB152 ZB262 ZB272 ZC542 4H045 AA10 AA30 BA10 BA53 CA42 EA24 EA28 FA72 FA74

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 製薬的に許容可能な担体、及び、プラスミノーゲンタンパク
   質のクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグメントの天然グリコシル化形
   態より多量の該脱グリコシル化フラグメントを含み、該脱グリコシル化フラグメ
   ントは、天然グリコシル化形態と結合している１つ又はそれより多くの炭水化物
   部分を欠失しておりそして該脱グリコシル化フラグメントは抗血管新生活性を有
   している前記組成物。
2. 【請求項２】 前記脱グリコシル化フラグメントがビシアリル化−ビアンテ
   ナリーグリカンを欠失している請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記脱グリコシル化フラグメントがＮ−結合炭水化物部分を
   欠失している請求項１に記載の組成物。
4. 【請求項４】 前記脱グリコシル化フラグメントがヒトプラスミノーゲンの
   アミノ酸位置Ａｓｎ−２８９の炭水化物鎖を欠失している請求項１に記載の組成
   物。
5. 【請求項５】 前記脱グリコシル化フラグメントが概ねクリングル１〜３タ
   ンパク質である請求項１に記載の組成物。
6. 【請求項６】 前記脱グリコシル化フラグメントがヒトプラスミノーゲンの
   概ねアミノ酸８７で開始している請求項５に記載の組成物。
7. 【請求項７】 前記脱グリコシル化フラグメントアミノ酸配列が配列番号１
   に示されている請求項５に記載の組成物。
8. 【請求項８】 前記脱グリコシル化フラグメントが組換え的に産生される請
   求項１に記載の組成物。
9. 【請求項９】 前記脱グリコシル化フラグメントがヒトプラスミノーゲンの
   アミノ酸位置２８９にアミノ酸置換を有している請求項１に記載の組成物。
10. 【請求項１０】 前記脱グリコシル化フラグメントと前記グリコシル化形態
    が少なくとも６０：４０の比率である請求項１に記載の組成物。
11. 【請求項１１】 前記脱グリコシル化フラグメントと前記グリコシル化形態
    が少なくとも８０：２０の比率である請求項１に記載の組成物。
12. 【請求項１２】 前記脱グリコシル化フラグメントと前記グリコシル化形態
    が１００：０の比率である請求項１に記載の組成物。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載の脱グリコシル化フラグメントをコードし
    ているヌクレオチド配列。
14. 【請求項１４】 配列番号２に示されている請求項１３に記載のヌクレオチ
    ド配列。
15. 【請求項１５】 前記脱グリコシル化フラグメントがインビトロで抗血管新
    生活性を有している請求項１に記載の組成物。
16. 【請求項１６】 前記脱グリコシル化フラグメントがインビボで抗血管新生
    活性を有している請求項１に記載の組成物。
17. 【請求項１７】 プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域の脱
    グリコシル化フラグメントのインビボ濃度を該脱グリコシル化フラグメントの天
    然グリコシル化形態のインビボ濃度と比較して個体で増大させることを含み、前
    記脱グリコシル化フラグメントは天然グリコシル化形態と結合している１つ又は
    それより多くの炭水化物部分を欠失しておりそして該脱グリコシル化フラグメン
    トはインビボで抗血管新生活性を有している、個体の血管新生を阻害する方法。
18. 【請求項１８】 前記脱グリコシル化フラグメントが前記個体に投与される
    請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記脱グリコシル化フラグメントがビシアリル化−ビアン
    テナリーグリカンを欠失している請求項１７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記脱グリコシル化フラグメントがＮ−結合炭水化物を欠
    失している請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記脱グリコシル化フラグメントがヒトプラスミノーゲン
    のアミノ酸位置Ａｓｎ−２８９の炭水化物鎖を欠失している請求項２０に記載の
    方法。
22. 【請求項２２】 前記脱グリコシル化フラグメントが概ねクリングル１〜３
    タンパク質である請求項１７に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記脱グリコシル化フラグメントがヒトプラスミノーゲン
    の概ねアミノ酸８７で開始している請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記脱グリコシル化フラグメントアミノ酸配列が配列番号
    １に示されている請求項２２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記脱グリコシル化フラグメントが組換え的に産生される
    請求項１７に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記脱グリコシル化フラグメントがヒトプラスミノーゲン
    のアミノ酸位置２８９にアミノ酸置換を有している請求項１７に記載の方法。
27. 【請求項２７】 プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域の脱
    グリコシル化フラグメントであって、そのアミノ酸配列は配列番号１に示されて
    いる前記フラグメント。
28. 【請求項２８】 プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域の脱
    グリコシル化フラグメントをコードしており、該脱グリコシル化フラグメントの
    核酸配列は配列番号２に示されている核酸。