JP2002535717A - 高解像度顕微鏡法における連続画像収集に対する自動オン・ザ・フライ焦点合わせ - Google Patents

高解像度顕微鏡法における連続画像収集に対する自動オン・ザ・フライ焦点合わせ

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JP2002535717A JP2000595186A JP2000595186A JP2002535717A JP 2002535717 A JP2002535717 A JP 2002535717A JP 2000595186 A JP2000595186 A JP 2000595186A JP 2000595186 A JP2000595186 A JP 2000595186A JP 2002535717 A JP2002535717 A JP 2002535717A
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プライス，ジェフリー・エイチ
ブラボ−ザノゲラ，ミゲール
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キュー・スリー・ディ・エム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 この発明は、予め定められた焦点深度で複数個の画像平面を撮像することにより検体を連続的に立体撮像するための装置および関連する方法を提供する。各画像平面の焦点深度は、さまざまな所望の空間構成に従って調整可能である。画像平面で生成される画像は並列に処理し、検体場所での最適な焦点深度に対応する画像は、その場所で検体を撮像するように選択される。この発明の立体撮像装置は、高解像度で顕微鏡のスライド全体の高速な走査を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 この発明は顕微鏡撮像に関し、より特定的には、顕微鏡検体の連続撮像の間の
向上した自動焦点合わせのための、さまざまな焦点深度での同時画像走査に関す
る。この発明は、高画像解像度での顕微鏡スライド全体の高速走査に対して有利
である。
【０００２】 光学顕微鏡法に基づく走査型血球測定（cytometry）システムの性能は、走査
する装置の特徴および検体の特徴の両方に依存する。装置性能の基準は、横解像
度、被写界深度、焦点範囲、焦点精度、焦点周波数応答、スライドの走査速度、
測光感度およびダイナミックレンジを含む。重要な検体特徴は、装置の対物レン
ズ開口数（ＮＡ）に関連して、組織厚およびスライドの平坦度を含む。生物学的
検体は、顕微鏡スライドをわたる単一の焦点面には存在しないが、これは典型的
には狭い被写界深度の顕微鏡光学を用いる画像血球測定に対する検体の、自動化
された走査を複雑にする。
【０００３】 既存の走査システムを光学顕微鏡法に適用すると、しばしば結果として走査速
度と画像解像度との間で折り合いがつけられる。たとえば、時間遅延積分（Time
-delay-and-integrate;ＴＤＩ）センサを備えたウェブ（くもの巣）検査システ
ムは、連続的に動く対象物の欠陥を検出し、識別するために自動高速視認検査シ
ステムに用いられる。センサの視界内の対象物は平坦であると想定され、カメラ
の線周波数をウェブの動きに同期させることにより２Ｄ画像が形成される。ウェ
ブまたはコンベアが平坦でない場合、画像品質は劣化するおそれがある。したが
って、被写界深度は通常大きく作られ、軸位置における最大のばらつきを含むよ
う注意深く調整される。これらの用途において、解像度は制限因子ではなく、大
きな被写界深度を獲得してオートフォーカス系に対する必要性をなくすためには
犠牲にすることができる。顕微鏡での実現化の場合のように、ウェブ検査技術が
光学顕微鏡法に適用されると、オートフォーカスに対する必要性をなくすために
、低いＮＡ対物レンズを用いて大きな被写界深度を確実にする。これは限定され
た領域にわたる低解像度撮像には適切であるが、標準の顕微鏡スライドの長さに
わたって、１０ミクロン（μｍ）のオーダまたはそれ以上の被写界深度が必要と
なる。より高い解像度の撮像に対しては、被写界深度は約１．０μｍに限定され
ており、画像品質を向上させるためには視界ごとに再焦点合わせが必要となる。
【０００４】 別の例示的な走査システムは、光学表面形状測定（optical profilometry）で
ある。光学表面形状測定においては、点光源が検体上に結像される。最良の焦点
は主に、最小のポイントサイズによって決定され、表面形状を測定するために焦
点誤差検出システムが用いられる。最小のポイントサイズから、高さのばらつき
に比例する誤差信号を生成するためにいくつもの異なった方法が用いられ、この
誤差信号は最良の焦点をサーボ制御するために用いられる。次いで高さのばらつ
きは、走査の間にレンズ位置として記録される。データは、１から０．０１μｍ
の水平解像度と、０．５から０．００１μｍの垂直解像度とを示す。しかしなが
ら、検体の表面傾斜は測定精度に対して顕著な影響を有する。あるプロフィロメ
ータは、０．２μｍまでの検体高さばらつきにおいて１００ヘルツ（Ｈｚ）の再
位置決め周波数で、非常に良好に検体表面を追う。オープンループモードにおい
ては、対物レンズは固定され、表面高さは焦点誤差から直接導出される。オープ
ンループモードは測定周波数を増大させるが、生物学的検体の場合のように軸範
囲が大きい場合は、サーボが必要となる。データが一度に一点に集められるため
に、この方法は遅く、多数の表面から反射し得る（組織のような）半透明の検体
に対しては適用されたことはないようである。
【０００５】 したがって、生物学的検体を含む顕微鏡スライド全体を、高解像度で高速走査
できる自動顕微鏡走査システムに対する絶対的な必要性が存在する。この発明は
これらの必要性を満たし、さらなる関連の利点を提供する。
【０００６】 発明の概要 この発明は、完全に自動化された高速の高解像度の画像血球測定のための撮像
装置と、関連の方法に実現化される。この撮像装置は、従来の顕微鏡視界をわた
って何度も焦点を更新する一方で、ステージを連続的な動きで一定の速度で移動
させる。向上した焦点精度は、高速での高解像度走査画像血球測定と、数分間で
の顕微鏡スライド全体の分析とを行なうことを可能にする。
【０００７】 この発明の他の特徴と利点とは、例示の目的でこの発明の原理を示す添付の図
面と併せ、以下の好ましい実施例の説明から明らかとなるであろう。
【０００８】 好ましい実施例の詳細な説明 この発明は、連続的なステージ移動の間に画像を鮮明に焦点合わせさせたまま
に保つ高解像度画像血球測定のためのオン・ザ・フライ（on-the-fly）オートフ
ォーカス系に対する装置および関連の方法を提供する。この発明の立体カメラ１
０は、図１に示す専用撮像アレイ１４によって、検体１２の同時の光学的区画分
けによって画像立体を収集する。撮像アレイは、焦点面１６への調整可能な光学
経路長さを有する多数の予め定められた画像面１５を有し、異なった被写界深度
と倍率とを有する対物レンズ１８に簡単に適合させる。顕微鏡スライドのサイズ
領域をわたる高い精度を備えた自動追跡焦点は、薄い高密度細胞単層を有するス
ライドでさえも厚みにおいては不完全であるために、特に有利である。
【０００９】 オートフォーカス技術は、オートフォーカスを連続的な走査に拡張するために
、一連の焦点で収集された画像に対してシャープネス測定を並行して行なう。画
像がシャープネス測定のために収集された一連の焦点は、拡大された３Ｄ検体ス
ペースにおける光学面を表わす。通常は、３Ｄ画像は、２Ｄ画像の積層内での平
面間の軸方向の微細な連続的な移動によって収集される。しかしながら、検体の
拡大された画像（すなわち、画像センサの近傍の領域）は検体スペースの３Ｄ表
現であるということもまた真である。もしセンサがこの３Ｄ空間において公称焦
点よりも過度に離れて配置されると、画像品質は劣化し得る。しかしながら、ニ
コン２０ｘ０．７５ＮＡ Fluor対物レンズ（１６０ｍｍチューブ長さ）に対し
ては、実験的ＭＴＦ測定は対物レンズの前焦点（すなわち、検体における焦点）
を±５０μｍ変化させた範囲にわたって、カットオフ周波数におけるいかなる変
化も示さないことを実証した。こうして、多数のセンサ２２は光学品質を減じる
ことなく、極めて広い範囲にわたる画像空間における異なった軸位置（ｚ１−ｚ
９）に配置し得る。するとこれらのセンサは、立体画像を作る光学区画を同時に
収集できる。専用撮像アレイ（立体カメラ）の設計は、連続的な走査の間の焦点
の追跡のためのモデルと併せて提示される。
【００１０】 図１に示すように、立体カメラ１０は画像センサを異なった焦点に配置するこ
とにより作られる。この構成においては、センサは横向きに変位されてもよい。
この隣接配置が用いられる場合、画像（または焦点指数）位置合わせはバッファ
を介して達成される。
【００１１】 軸倍率は横倍率の平方にほぼ等しいことから、検体スペース１４の準解像（su
bresolution）軸サンプリングは容易に達成される。この構成によって、光学性
能における劣化なしに、通常の検出器位置の近傍に存在する軸方向に変位した光
学面の収集が可能になる。軸方向に変位された検出器は、ステージ速度２４に同
期されたラインアレイセンサである。我々は、１３×１３μｍピクセルを備えた
１０２４ピクセル×９６ラインＴＤＩ ＣＣＤアレイである、ＥＧ＆Ｇ（カリフ
ォルニア州サニーベイル）のＴＤ１０９６を用いた。ＴＤＩカメラはラインの数
に比例して集積され、信号対ノイズ比と感度とを向上させた。システムはまた、
ＴＤＩセンサの軸方向の調整が、異なった被写界深度および倍率を備えた対物レ
ンズに対する最適な軸サンプリングを収集し得るよう設計された。
【００１２】 焦点を動的に計算し調整することに対する演算的な要求は、３Ｄ画像をリアル
タイムで測定する並列オートフォーカス回路のアレイによって解消された。
【００１３】 オートフォーカス機能を有する立体撮像装置は「走査顕微鏡法に対するオート
フォーカス系（Autofocus System For Scanning Microscopy）」と題する米国特
許番号（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／０１４３８、１９９６年１月１８日公開）に
開示される。ＷＯ／０９１４３８出願に開示される画像処理およびオートフォー
カス系はこの発明にも適用可能である。
【００１４】 図２を参照すると、第１のスライド位置（ａ）は細胞が存在しない場合の低信
号の影響を示す。第２のスライド位置（ｂ）は、細胞単層で収集される画像と焦
点指数とを示す。第３のスライド位置（ｃ）は重なり合う細胞を示す。画像血球
測定において遭遇する典型的な問題は、スライドにわたる細胞密度の差異に対応
する。図２（ｂ）は、最適密度の細胞単層を示し、図２（ａ）および図２（ｃ）
は、一方の領域では細胞が存在せず、他方では多層において多くの重なり合う細
胞が存在する、対極の状態を示す。低信号フィールドの焦点関数曲線（図２（ａ
））は、見かけ上の最大点、鋭い傾斜、およびノイズの多いバックグラウンドを
特徴とする。細胞多層（図２（ｃ））は、システムがマルチモーダル焦点応答に
よって混乱して、主要な最良の平均焦点ピークではなく傾斜を追跡するおそれが
あることを示す。広い領域をわたって焦点の高速トラッキングをするよう設計さ
れたシステムは、細胞が少な過ぎるかまたは多過ぎる場合においてさえも、健全
に働くよう設計される。
【００１５】 高度な横解像度での自動化された細胞走査を行なっている場合、細胞パターン
および構造などの特徴は細胞分類のためには重要であるが、これらの特徴の分別
力は焦点に大きく依存する。顕微鏡画像からの正確な測定のためには、良好な横
解像度を得るために高い開口数（ＮＡ）が好ましい。しかしながら、被写界深度
はＮＡの平方に反比例し、適度なＮＡ（≧０．５）においてさえも鮮明な焦点は
クリティカルになる。より狭い被写界深度においては、生物学的検体はスライド
をわたって単一の焦点面内には位置せず、画像血球測定に対する自動化された走
査はオートフォーカスによって達成されねばならない。より高い解像度は画像デ
ータの量を劇的に増大させるので、オートフォーカスは高速走査と組合わされね
ばならない。
【００１６】 特徴抽出における焦点の影響は、図３における異なった焦点（ａ−ｃ）での同
じ対象物の３つの異なった画像によって実証される。第１の画像（ａ）は最適な
焦点位置よりも前方に設定された焦点に合わせられる。第２の画像（ｂ）は、最
適な焦点位置に設定された焦点に合わされる。第３の画像（ｃ）は、最適な焦点
位置よりも後方に設定された焦点に合わされる。焦点における差異は対象物の被
写界深度未満である。元のデジタル画像の各々は、同一の後画像収集処理を行な
われたが、対応するエッジマップは異なる。内部のパターンにも差異があり、こ
れらの差異は細胞分類の誤りを引き起こし、反復可能性を減じ、後の診断誤りを
増加させる。焦点がぼけた画像を復元するために付加的な処理を加えることがで
きるが、これらの複雑な反復アルゴリズムもまた遅く、大抵いくらかの誤差なし
にはぼけを除くことはできない。したがって画像シャープネスを精密に維持する
リアルタイムオートフォーカスは、アルゴリズム訂正技術よりも有利である。
【００１７】 図４に示すように、焦点曲線は、スライドが走査されるにつれて検体特徴の曲
率に従う。水平方向の試料のサイズは６５０ｎｍであって、焦点測定領域は２０
Ｘ０．７５ＮＡ位相差対物レンズで３１２μｍ（Ｖ）×３２５μｍ（Ｈ）である
。スライド位置ごとに、８５の焦点位置が単一の焦点関数曲線を形成する。
【００１８】 焦点面３０は、さまざまな予め定められた相対的な間隔配置で構成することが
できる。たとえば、図５Ａに示すように、平面はずらして配列した矢印構成に構
成される。さらに、図５Ｂに示すように、平面は、撮像面の一端における平面が
他端における平面よりも焦点深度においてより広く間隔がとられている、湾曲し
た構成においても可能である。これに代えて、図５Ｃに示すように、画像平面は
両端でより広く間隔をとられ、中央部分でより接近して間隔をとられてもよい。
同様に、撮像面は、図５Ｄに示すようにＶ字形または逆Ｖ字形に構成されてもよ
い。図５Ｅに示すように、焦点面における別の構成はＷ字形である。
【００１９】 図６から図１０を参照して、この発明の立体撮像装置１０またはカメラの一実
施例を説明する。この実施例においては、隣接する画像平面からの画像は、予め
定められた画像平面位置に配置される画像面３６を有するコヒーレントな光ファ
イバ束３４によって別々の検出器３２に転送される。立体カメラの機械的構造は
、画像面の各々の相対的な軸方向の調整を可能にする。立体カメラは、４つの剛
性支持ロッド４０によって頂部プレート３９に機械的に結合される底部プレート
３８を有し、該支持ロッド４０は４つの剛性支持ロッドの間の領域のほぼ中央で
頂部および底部プレートに固定される。頂部および底部プレートを、これらをス
ペースに固定して保持する剛性支持ボックスから切りぬいて示す。
【００２０】 この発明のこの実施例は、支持構造と撮像センサとに対応する９つの光ファイ
バ束を有する。９つの束によって、０．２５μｍの増加分における２μｍ範囲に
わたる画像面の配置が可能になる。この発明に従ってより多くの、またはより少
ないファイバ束を用いてもよく、画像面の間でのより小さな、またはより大きな
軸方向のステップを用いてもよい。
【００２１】 コヒーレントな光ファイバ束の各々はベースプレート４２によって支持される
。ベースプレートは、締り嵌め孔４４を有し、これによりベースプレートが剛性
支持ロッドのうちの２つに沿って滑動できる（図１０）。ベースプレートの各々
はまた、調整ねじ４８−１から４８−４を受けるためのねじ孔４６をも有する。
調整ねじ４８−１から−４までの各々は、インチごとに８０回転数を有し、ベー
スプレートの位置決めに対してマイクロメートルの調整を行なう。頂部プレート
に隣接するベースプレートを除くすべてのベースプレートは、調整ねじ４８−１
のうちの１つの端部を受けるための軸受孔５０をも有する。頂部プレートは、調
整ねじを受けて最上部のベースプレートの位置を頂部プレートに対して調整する
ための軸受孔と付加的な調整装置とを含む。残りの調整ねじ４８−２から−４は
ベースプレートの間に構成されて、さまざまな予め定められた面プレート構成に
対する調整を参酌する。
【００２２】 調整ねじの各々は、手動で、または図１３に関して以下に説明するように、モ
ータコントローラによって自動的に駆動し得る。一般的には、選択された撮像面
３６の構成は、特定の対物レンズの種類と検査される検体１４とに対応する。
【００２３】 カメラ１０は、撮像ファイバ束３４（ＩＦＢ）を直接ＣＣＤ装置に結合するこ
とにより撮像面に光ファイバ様に結合される、ＣＣＤセンサ３２を含む。ファイ
バ束は画像平面をＣＣＤの表面に並進させる。ＣＣＤセンサの各々は、取付ブラ
ケット５２によって対応のベースプレートに装着される、回路基板５０に結合さ
れる。対物レンズ１８は検体の画像をＩＦＢの各々の入射面に投射し、束はこの
画像の強度分布を他方の端部面およびセンサ上に伝送する。アレイの分岐形状は
同じ長さのＩＦＢによって考案されているために、画像伝送特質は同一である。
ファイバの曲げは、カメラが小さなカメラパッケージに嵌まり、軸方向に滑動し
得るよう設定される。
【００２４】 軸サンプリングは、入力ファイバ面を軸方向にシフトさせることにより制御す
ることができ、ファイバ束３４の横分離は視界の各々を獲得する間の遅延をもた
らす。一連のファイバ束面３６をシフトさせて、画像面（たとえば、直線または
「Ｖ」字形の階段）でパターンを生成して画像立体をサンプリングさせることが
できる。
【００２５】 図１１および図１２に関して、オートフォーカス調整を実現化し、センサ２２
によって受取られた画像を処理するためのシステムを説明する。
【００２６】 画像処理方法およびオートフォーカス方法のより詳細な説明は、米国特許第５
，７９０，７１０号および米国特許番号（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／０１４３８
）に記載される。
【００２７】 処理および制御システム６０は、ホストコンピュータ６２、タイミングシーケ
ンサ６４、並列オートフォーカス回路６０および遠隔センサ６８を含む。
【００２８】 タイミングシーケンサは、遠隔ＣＣＤセンサをトリガし、かつ焦点測定バーチ
ャルフレーム間隔を設定することにより、ビデオ獲得および焦点測定を制御する
。バーチャルフレームは、焦点測定と水平ラインの各々におけるウィンドウ長さ
を含むよう、いくつかのラインから作られる。これらの値、すなわちラインの数
と水平ウィンドウ持続時間とはプログラム可能である。水平ラインはアクティブ
部分と空白領域とからなる。このラインの合計の長さが、集積時間であってプロ
グラム可能である。集積期間の間に、ＣＣＤセンサ要素は投射された画像から光
を収集する。集積時間値は、速度−検体照射条件関係である。タイミングシーケ
ンサにおける区画は以下を含む。
【００２９】 （ａ） マスタクロック７０：論理タイミング信号のすべてを生成するために
用いられる参照クロック。
【００３０】 （ｂ） 集積時間７２：ビデオラインの持続時間を計る。 （ｃ） ライン開始７４：新しいビデオラインの開始でパルスを発する。
【００３１】 （ｄ） フレームサイズ７６：プログラム可能な数のラインの最後でパルスを
発する。
【００３２】 （ｅ） 水平ウィンドウ７８：焦点測定のためにアクティブビデオの部分の信
号を発する。焦点測定回路のフィルタにおいてもたらされる過渡をなくす。
【００３３】 （ｆ） ドライバ８０、レシーバ８２：長距離をわたって高速論理信号を送受
信するために用いられる。
【００３４】 遠隔センサ６８は立体カメラのビデオ信号を生成する。遠隔センサの区画は以
下を含む。
【００３５】 （ａ） 走査コントローラ８４：ＣＣＤセンサによって要求されるクロック位
相を生成するためにローカルクロックまたは外部のクロックを用いる。また、ビ
デオのアクティブ部分が発生している場合、外部に向けて信号を発する。
【００３６】 （ｂ） ローカルクロック８６：ＣＣＤの参照クロック。 （ｃ） ＴＤＩ ＣＣＤ８８：光を電荷に変換するセンサ。
【００３７】 （ｄ） 信号プロセッサ９０：プログラム可能な利得、およびデジタイザ；Ｃ
ＣＤの出力を処理して、独立して獲得され見ることが可能な直接的な高性能デジ
タル立体画像を生成する。これはまた、焦点測定回路によって用いられるアナロ
グビデオ信号をも生成する。
【００３８】 （ｅ） レシーバ９２およびトランスミッタ９４：長距離をわたって高速論理
信号を送受信する。
【００３９】 並列オートフォーカス回路６６は、並列にオートフォーカス回路のアレイを使
用することにより、いくつかのビデオ入力に対して連続的焦点測定を行なう。各
オートフォーカス回路は、タイミングシーケンサ６４からの２つの論理信号：フ
レームおよびウィンドウを必要とする。フレームは、焦点測定間隔をいつ開始す
べきかについて、および最近の測定値をホストコンピュータにいつ与えるべきか
について信号を与える。ラインウィンドウは、焦点測定回路が計算のためにビデ
オ入力を考慮することを可能にするパルスである。このパルス持続時間は、アク
ティブなビデオの一部の間有効である。オートフォーカス回路の部分は以下を含
む： （ａ） プログラム可能な遅延およびタイミング制御９６：測定を遅延させ、
焦点測定回路が必要とする制御信号：集積、リセットおよびイネーブルを生成す
る。また、新しい焦点計算の準備が整ったとき、ホストコンピュータ６２へ割込
み信号を与える。
【００４０】 （ｂ） 焦点測定回路９８：測定されたバーチャルビデオフレームの焦点指数
および平均照度に対応する２つの出力電圧を発生する。
【００４１】 論理制御信号群、スタート（start）、フレームスタート（frame＿start）ラ
インウィンドウ（line＿Window）およびバリッドビデオ（valid＿video）はその
機能によってグループ化され、個々の信号は、同じグループの他の信号に依存せ
ず活性であり得る。タイミング生成器はこれらを活性化し、それによりカメラボ
ードが所望に応じて異なった時点で起動可能となり、焦点測定を対応の遠隔セン
サと同期化させる。最初の目標は同じ空間領域（視界）における焦点を測定する
ことではあるが、センサは横方向に移動されてもよく、測定された値のバッファ
がこの遅延を補償するために必要である。
【００４２】 図１２は、タイミングシーケンサ６４と、遠隔センサ６８と、オートフォーカ
ス回路６６と、ホストコンピュータ６２との間の信号のタイミング図を示す。割
込み１（Interrupt＿１）パルスが現われた後、ホストコンピュータは焦点指数
ＦＩ＿１および平均照度ＡＩ＿１の値をオートフォーカス回路１から読出す。同
じタイミングは他のチャネルに対して有効であるが、それらは非同期に現われる
可能性がある。米国特許出願連続番号第０８／７９６，１９６号に示すように、
デジタル自動利得信号が与えられても良い。
【００４３】 焦点を動的に計算するという計算処理要求の多くは、リアルタイムで３Ｄ画像
の各平面の焦点指数を測定する並列オートフォーカス回路６６のアレイによって
吸収される。オートフォーカス系のブロック図が図１１に示される。この系は、
ＣＣＤおよびオートフォーカス電子部品を含む。この系の出力（焦点指数）は、
コンピュータ６２によって読出され、コンピュータは圧電性の対物レンズポジシ
ョナ（Polytee PI, Costa Mesa, CA）で焦点を調整する。リアルタイムで焦点指
数および平均照度を測定する高性能で低コストなアナログ回路が、ＴＤＩライン
スキャンビデオのために変形されており、多面のアレイになったＣＣＤセンサの
各々のために複製されている。タイミングシーケンサ６４は、アレイのカメラ６
８および並列オートフォーカス回路６６の中央コントローラとして働き、焦点測
定と画像収集を同期化する。ＴＤＩ信号は、ライン間の水平方向のブランクによ
って中断されるラインごとのビデオ信号からなる。ラインカウンタは、ビデオ信
号の垂直ブランクによって先に与えられた焦点指数タイミングを与える。ＣＣＤ
の集積時間を設定するシーケンサ６４は、バーチャルフレームを生成して焦点指
数集積間隔を与える、プログラム可能なラインカウンタも含む。連続焦点測定回
路９８は、各バーチャルフレーム間隔の終りにリセットし、Ａ／Ｄ変換、最良の
焦点の計算および圧電再焦点合せのために、ホストコンピュータ６２に割込みを
かける。
【００４４】 並列オートフォーカス回路６６が抱える、多くのオートフォーカス計算負担に
より、コンピュータ６２は、ほぼいかなるオートフォーカスアルゴリズムをも実
行するようプログラム可能である。アルゴリズムは、過去の値に対して現在の焦
点の値を優先して重み付けし、来るべき焦点指数のために予測子を利用する。こ
れは、従来の負帰還ループと異なる。シャープネス測定値からの最良の焦点の計
算（または焦点指数）は、連続的試行位置での比較のために反復的アルゴリズム
を必要としないので、それは、高速の焦点調整のためにリアルタイムで実行可能
である。
【００４５】 これらの高速計算処理方法は、圧電対物レンズポジショナの１０ｍｓ応答を、
焦点測定および更新シーケンスにおいて最も遅い要素にする。立体カメラおよび
連続オートフォーカス系は、走査の間１００〜１０００Ｈｚのレートで焦点位置
を計算し更新する。比較的平らな検体では、走査速度は、最終的には、ＴＤＩカ
メラのビデオレートによって制限され得る。バーチャルフレーム（焦点測定ウィ
ンドウ）における、プログラム可能な数のビデオラインでは、焦点位置決め応答
および焦点指数信号ノイズ比との組合せが、実際の焦点更新周波数および最終的
な焦点精度を決定する。
【００４６】 インクリメンタルな走査での経験は、焦点テスト範囲が狭すぎたり視野が完全
に空白であったりするとき、焦点追跡を失う可能性があるということを示した。
バーチャルビデオフレームを小さいもの（顕微鏡ＦＯＶのサブ領域）とすると、
連続的なステージ移動の間、より速い焦点位置決め応答を要求するために、局所
的詳細（例えば、細胞および表面不整）は、軸方向の変動を増大させ勾配を強調
することができる。反対に、バーチャルリビデオフレームがより大きければ、高
い傾斜の領域が平均化され、空間的勾配は、バーチャルフレームにおけるビデオ
ラインの数に比例して減少する。テスト範囲のパラメータは、各検体および対物
レンズについて完全に決定可能であるが、空隙視野（焦点測定のための画像内容
がない）はなおも実質的な問題を呈し得る。しかしながら、この発明のオートフ
ォーカス回路での最近の実験は、単一の細胞よりもはるかに小さい破片でも精度
の高い焦点追跡に十分であるということを示した。線形予測と組合さって、この
高い焦点測定感度は、少量の破片さえも欠いている小さい領域にわたって精度の
高い追跡を可能にする。
【００４７】 精度および追跡安定性を最大にするよう立体カメラパラメータを設定するため
に、焦点関数曲線（図２ａ−ｃ（下部））および被写界深度を用いて、光学的区
画間の間隔あけの設定への案内としてもよい。間隔をあけるためのさらなる考慮
は、シャープネス測定値における実質的な差をもたらす光学的区画間の最小の間
隔と、焦点関数幅を含むのに必要とされる範囲とを含む。焦点探索範囲は、検体
の平坦さからの変動および焦点関数曲線範囲の適切な一部に合せて適合し得る。
焦点関数フィルタパラメータ（たとえば、帯域幅、中央周波数および減衰）も、
最良の焦点関数応答を達成するように調整可能である。
【００４８】 Ｎ個のセンサからなる立体カメラでの走査の事象は以下を含む： （ａ） 各バーチャルフレームの終りに、新しい焦点測定が平面の１つについ
て完了したという、割込み信号をコンピュータに与える。オートフォーカス回路
の出力は、非同期にコンピュータに伝送され、最良の焦点計算より前にそこにバ
ッファ可能である。
【００４９】 （ｂ） すべてのＮ個の焦点測定値が収集され、１個のバーチャルフレームの
ためにバッファされる。
【００５０】 （ｃ） ある１個のバーチャルフレームに対応する、データのバッファされた
組の各々に対して、最良の焦点が計算され（たとえば、べきで重み付けされた平
均を用いる）、レンズが最良の焦点に合せて位置決めされる。
【００５１】 同じ視界に対応する測定値間の最大の時間遅延は下式の通りである。
【００５２】
【数１】
【００５３】 式中、Ｍは倍率であり、ｆsは、顕微鏡カメラシステムの空間標本化周波数で
あり、Ｆlは、ＣＣＤセンサのラインレートであり、Ｖfは、以下の式によって与
えられるバーチャルビデオフレーム長さである、
【００５４】
【数２】
【００５５】 式中、Ｎlは、焦点測定ウィンドウにおけるラインの数であり、Ｄは画素サイ
ズである。
【００５６】 検体の傾斜が傾斜センサアレイと一致するのであれば、センサの横方向の移動
は、２つ以上のセンサが同じかまたはほぼ同じ焦平面をサンプリングすることを
可能にする。この理由および他の考慮のために、単純な線形の階段がセンサアレ
イについての焦点の最良の配置ではないことがあり得る。
【００５７】 検体および立体カメラ特性を組合せる同時多面画像収集モデルのフレームワー
クは、焦点を追跡するためのストラテジィを評価するために開発されてきた。図
４は、（ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の単層での）スライドにわたってある方向の一回の
走査に対する、焦点関数曲線のファミリーを示す。曲線のこの３Ｄファミリーの
隆起線は、走査における、一連の最良の焦点に対応する。焦点応答の形状は、光
学系の設定および検体に依存する。我々の先の実験においてオートフォーカスの
ためのテストがなされた焦点の数は、７から１１であったが、図４の曲線は、８
５個のテスト焦点を利用して、より精度高く、焦点関数曲線の形状の輪郭をつけ
た。インクリメンタルな走査から集められたこれらの焦点指数は、さまざまな焦
点追跡アルゴリズムをテストするためにバーチャルテスト検体を生成する。
【００５８】 多くの光学平面からの点を有する焦点関数の使用は、検体試料を通じて長い横
方向の区画を記憶するのに必要とされるデータの量を低減することにより、いか
なる生物検体をもシミュレートするのに効率的な方法を提供する。この検体モデ
ルは、観察される試料の焦点評価のために主に有用である。インクリメンタルな
最良の焦点と連続的な走査の最良の焦点との比較により、さまざまなアルゴリズ
ムおよびセンサ位置の性能を測定することができる。
【００５９】 表１は、立体カメラにおける光学平面の分布に対応する焦点測定値のマトリッ
クスを表わす。これらの焦点値およびその座標（ｚ、ｘ）を用いて、検体の焦点
関数のふるまいを再構築し、その後の焦点調整のために最良の焦点位置を計算す
る。
【００６０】
【表１】
【００６１】 表中、特定の視界における軸方向位置の数を表わすｊ、ｋおよびｍは、必ずし
も等間隔に対応するとは限らない。Ｘn+1＞Ｘnであるが、ＺnはＺn-1に対して条
件付けされない。Ｆ（Ｚ，Ｘ）値は、視界の軸方向位置Ｚおよび横方向位置Ｘで
の撮像平面の焦点尺度を表わす。Ｘは、センサ間の横方向の間隔を表わす。
【００６２】 平面の数、それらの間の間隔、および焦点を追跡するのに必要とされる探索範
囲は、画像立体上に拡大される検体の厚さ、検体の傾斜、および走査の速度に依
存する。したがって、用途および検体が、最良の追跡性能のために、光学平面の
数、間隔および範囲を決定するであろう。
【００６３】 焦点追跡は、検体の軸方向の勾配およびその速度によっても制限され得る。図
４において、概してｘで平らになる最良の焦点の隆起線に、初期ｚ勾配がある。
この勾配が大きすぎれば、システムは高速で焦点を追跡しないようになる。数学
的モデルの第２の部分は、追跡中、レンズ位置決め応答を考慮する。ステージ運
動の方向の速度がＶｓ＝ｄｘ／ｄｔであれば、これは以下の式によってシステム
パラメータで表わすことができる。
【００６４】
【数３】
【００６５】 焦点測定間隔に含まれる検体の長さは下式のとおりである。
【００６６】
【数４】
【００６７】 式中、Ｎlは、バーチャルフレームにおけるラインの数である。検体の勾配、
Ｇ＝ｄｚ／ｄｘは、所与のステージ速度での対物レンズポジショナ応答を超える
ほど大きくあってはならない。したがって、距離ΔＸにおいて、正確に追跡可能
である最大の検体の軸方向シフトΔＺは、方程式３および４を以下のように合成
することにより概算される。
【００６８】
【数５】
【００６９】 式中、ＺRは焦点探索範囲であり、τSは、ポジショナの整定時間である。この
最後の式は、最良焦点アルゴリズムおよび位置決めにおける起こり得る誤差に依
存しない、良い概算である；すなわち、計算される最良の焦点が真の焦点に等し
く、圧電対物レンズポジショナが完全に正確であるという推測に基づく。表２は
、いくつかの典型値に対して正確に追跡可能である検体の詳細を示す。これらの
計算について、他の起こり得る誤差を斟酌するために、（圧電ポジショナに対し
て特定された１０ｍｓの代わりに）２０ｍｓのより控えめなτSを選択した。
【００７０】
【表２】
【００７１】 オートフォーカスの精度は、バーチャルフィールドサイズおよび対物レンズ位
置決めの速度に依存する：大きいバーチャルフレームは、検体の追跡における精
度を低減し、軸次元における対物レンズポジショナ応答平均を遅くする。
【００７２】 ファイバ束３４の画像面３６の軸位置は、図１３に示す自動位置決めモジュー
ル１０２によって調整され得る。ホストコンピュータ６２は、各画像面と関連付
けられるモータコントローラ１０４に結合され、モータコントローラに信号を送
り、対応する画像面の所望の位置を示す。モータコントローラは、対応する調整
ねじ４８に機械的に結合されるモータ１０６を駆動する。図６〜図１０に示すよ
うに、調整ねじは、ファイバ束の画像面の軸位置を制御する。
【００７３】 図１４および図１５は、ビームスプリッタ１１２を使用して、画像立体の複数
の平面１１４を得る、この発明に従う立体画像装置１０′を示す。この実施例で
は、各センサ１１６への光路長（ｚ１からｚ４）は、（ΔＺ分）異なっており、
センサ自体を移動させることにより調整可能である。撮像装置は、４つの像経路
を生成するために３つのビームスプリッタを有する。ビームスプリッタは、５０
％のスプリッタであり、光の５０％がビームスプリッタの表面から反射され、光
の５０％がビームスプリッタを透過する。第１のビームスプリッタは、顕微鏡光
学部品１１８からの視準光を２つの経路に分ける。２つの経路の各々は、合計で
４つの経路を生成するそれぞれのビームスプリッタによって分割される。４つの
経路の各々は、この発明に従って、８個以上の経路にさらに分割可能である。
【００７４】 各ビームスプリッタ１１２は、経路を一回分割し、必要とされるビームスプリ
ッタの総数は、収集される平面の数に依存する。いくつかの経路においては、さ
らなるミラー（図示せず）が、センサで同一の鏡映を維持するために必要とされ
るだろう。
【００７５】 この発明の立体カメラ１０″の別の実施例を図１６に示す。検体１２２は、対
物レンズアセンブリ１２４によって拡大され、検体スライド内の複数の平面は同
時に焦点が合っている。レンズアセンブリは、検体を画像空間１２６に拡大し、
ここでそれは、異なった軸方向場所および横方向場所に位置決めされるいくつか
のセンサによって捕獲される。アレイ状の各センサは、固有の焦平面を集め、対
応する画像の各々は、焦点の合ったおよび焦点の合っていない、異なった情報を
含む。
【００７６】 前の説明はこの発明の具体的な実施例を参照したが、これらは例示のみであり
、これらの実施例における変更がこの発明の原理から逸脱することなしになされ
得ることが当業者には認められ、この発明の範囲は前掲の特許請求の範囲によっ
て規定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 この発明に従った、調整可能な焦点深度を有する画像面を用いる
検体の連続的な撮像のための立体撮像装置の概略図である。
【図２】 隣接した、画像および焦点指数対垂直位置のグラフによる、異な
ったセル分布の３つの位置におけるスライド画像の図である。
【図３】 最適な焦点、ポジティブな焦点外れ、ネガティブな焦点外れにお
ける、細胞の元の蛍光画像、処理された画像、および輪郭画像を示す図である。
【図４】 単一の単方向走査に対する焦点関数曲線の３次元プロットの図で
ある。
【図５Ａ−図５Ｄ】 この発明に従った、画像面に対するさまざまな予め定
められた間隔配置を表わす概略図である。
【図６】 この発明に従った、調整可能な焦点深度を有する画像面を用いる
連続的な検体の撮像のための立体撮像装置の実施例の斜視図である。
【図７】 図６の立体撮像装置の立面図である。
【図８】 画像面からの画像をＣＣＤセンサと回路基板とに結合するコヒー
レントなファイバ束を支持する機械的構造を示す、図６の立体撮像装置の半分を
示す斜視図である。
【図９】 この発明に従った、画像面の相対的な焦点深度を調整するための
機械的構造を示す、図６の立体撮像装置の半分を示す斜視図である。
【図１０】 この発明に従った、コヒーレントなファイバ束のうちの１つを
支持し、対応の画像面の相対的な焦点深度を調整するための機械的な構造を示す
、図６の立体撮像装置の半分を示す拡大斜視図である。
【図１１】 この発明の立体撮像装置から得られる立体画像を焦点合わせし
生成し、かつ処理するための、ホストコンピュータ、タイミングシーケンサ、遠
隔センサ、および並列オートフォーカス回路のブロック図である。
【図１２】 図１１のタイミングシーケンサ、遠隔センサ、オートフォーカ
ス回路およびホストコンピュータの間の信号を示す、タイミング図である。
【図１３】 画像面を予め定められた相対的な位置に位置決めするための軸
方向の調整ねじを制御するための、自動位置決めモジュールに対するブロック図
である。
【図１４】 この発明に従った、調整可能な焦点深度を有する画像を提供す
るためのビームスプリッタを用いる顕微鏡検体の連続的な撮像のための、立体撮
像装置の実施例の概略図である。
【図１５】 この発明に従った、立体撮像装置において用いるためのビーム
スプリッタの概略図である。
【図１６】 それぞれが固有の焦点面に対応した異なった軸方向および横位
置に位置決めされるいくつかのセンサを用いる、顕微鏡検体の連続的な撮像のた
めの立体撮像装置の実施例の概略図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年７月２７日（２００１．７．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブラボ−ザノゲラ，ミゲール アメリカ合衆国、92037 カリフォルニア 州、ラ・ホッラ、ミラマー・ストリート、 4059・シィ Ｆターム(参考） 2H052 AA07 AB04 AB19 AB24 AB29 AD09 AF14 AF25

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 立体画像を生成するための装置であって、 隣接する画像平面に位置決めされる複数個の撮像デバイスを含み、少なくとも
    １つの画像デバイスが、予め定められた焦点深度で調整可能に移動されるよう構
    成される、立体画像を生成するための装置。
  2. 【請求項２】 複数個の撮像デバイスに結合され、複数個の画像平面のそれ
    ぞれの画像平面での画像を表わす複数個の電子的表現を形成するための画像形成
    デバイスをさらに含む、請求項１に記載の立体画像を生成するための装置。
  3. 【請求項３】 最適な焦点深度に関連付けられた撮像デバイスの１つを選択
    し、立体画像の画像対象物の画像表現を生成するための、焦点合せデバイスをさ
    らに含む、請求項１に記載の立体画像を生成するための装置。
  4. 【請求項４】 隣接する画像平面に位置決めされる複数個の撮像デバイスを
    使用する立体撮像のための方法であって、少なくとも１つの画像デバイスが、予
    め定められた焦点深度で調整可能に移動されるよう構成される方法であって、前
    記方法は、 撮像デバイスが画像対象物の平面において画像対象物を観察するように、複数
    個の撮像デバイスを配向するステップと、 複数個の撮像デバイスを用いて、画像対象物の複数個の画像を得るステップと
    を含み、複数個の画像の各画像は、それぞれの撮像デバイスで得られ、さらに、 複数個の画像を複数個の電子的画像表現に変換するステップと、 複数個の電子的画像表現を記憶するステップとを含む、方法。
  5. 【請求項５】 画像対象物は、画像対象物の平面と平行な方向で撮像デバイ
    スに対して画像対象物を並進させることにより連続的に撮像される、請求項４に
    記載の立体撮像のための方法。
  6. 【請求項６】 電子的表現は、カウンタ信号に応答して画像フレームに分割
    される、請求項５に記載の立体撮像のための方法。
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