JP2002533724A - Test system for the recognition of different markers, its preparation and use - Google Patents
Test system for the recognition of different markers, its preparation and useInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、複合体の形成と共に、少なくとも２つの異なるマーカーを認識する、少なくとも２つの認識種を含む、試験系、その調製および適切な検出法における使用に関する。 (57) Summary The present invention relates to test systems, including at least two recognition species that recognize at least two different markers, along with complex formation, their preparation and use in suitable detection methods.
Description
【０００１】 本発明は、複合体の形成と共に、少なくとも２つの異なるマーカーを認識する
、少なくとも２つの認識種を含む、試験系、その調製および適切な検出法（ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）における使用に関する。The present invention relates to a test system comprising at least two recognition species, which recognizes at least two different markers, together with the formation of a complex, a test system, its preparation and suitable detection methods (de
for use in the protection process).
【０００２】 試験系の適用、例えば診断法の領域は、生物学、生化学、医学および薬学に広
く行き渡っている。特に医学では、疾患を早期に認識することによってのみ、時
機を得た、そして有効な治療を行うことが可能であるため、生活の質を向上させ
るためには、疾患、例えばウイルス感染または癌の、信頼できる、そして明確な
診断が非常に重要である。疾患特異的マーカーまたはリガンド、例えば核酸配列
、タンパク質または抗原の認識に基づき、生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓａｍｐｌｅ）において、病原体または疾患を検出する。各場合において、Ｅ
ＬＩＳＡまたは増幅法、例えばＰＣＲ、ｂ−ＤＮＡ、サザン、ウェスタンまたは
ノーザンブロッティングにおけるように、１つのマーカーまたはある種の複数の
マーカーを検出する診断試験が広く行き渡っている。用いられる検出の種類は、
単純な染色法および蛍光エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｅｒ
ｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）および蛍光消光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）を介した熱量測定法から、シンチレーション近接アッ
セイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＳＰＡ
）にまで渡っている。The application of test systems, for example in the area of diagnostics, is widespread in biology, biochemistry, medicine and pharmacy. Especially in medicine, timely and effective treatment can only be carried out by early recognition of the disease, so that in order to improve the quality of life, a disease, such as a viral infection or cancer, A reliable, reliable and clear diagnosis is very important. Based on the recognition of disease specific markers or ligands, such as nucleic acid sequences, proteins or antigens, biological samples (biologicals)
sample) to detect a pathogen or disease. In each case, E
As in LISA or amplification methods, such as PCR, b-DNA, Southern, Western or Northern blotting, diagnostic tests that detect one marker or certain markers are prevalent. The type of detection used is
Simple staining method and fluorescence energy transfer
gy transfer (FRET) and fluorescence quenching (fluorescence).
calorimetry via quenching, scintillation proximity assay: SPA
).
【０００３】 １つのマーカーまたは１種類のマーカーのみを使用する場合、重大な不都合な
点は、偽陽性（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）試験結果が容易に生じ、これが
また特定の疾患に関する誤った結論につながることである。したがって、しばし
ば、疾患／健康に関する信頼できる言及を行うことを可能にするため、同一のま
たは相補的分析物（ｓａｍｅ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｎａｌｙ
ｔｅｓ）に対し、第二の試験またはさらに別の試験を行わなければならない。こ
れはより多い試験につながり、その結果を互いに比較しなければならず、これは
同時に困難で、そして費用がかかる。[0003] When only one marker or one type of marker is used, a significant disadvantage is that false-positive test results readily occur, which also lead to incorrect conclusions regarding certain diseases. It is. Thus, often the same or complementary analytes are used to enable reliable reference to the disease / health to be made.
tes), a second or further test must be performed. This leads to more tests, the results of which must be compared with each other, which is simultaneously difficult and expensive.
【０００４】 したがって、すでに知られているものより、品質がより優れ、より複雑でなく
、そしてより安価な分析試験（ａｎａｌｙｔｅ ｔｅｓｔｓ）を開発するのが本
発明の目的である。[0004] It is therefore an object of the present invention to develop better quality, less complex and cheaper analytical tests than what is already known.
【０００５】 驚くべきことに、ブール結合（Ｂｏｏｌｅａｎ ｌｉｎｋａｇｅ）の意味で、
本質的に互いに干渉しない、分子レベルの２つまたはそれ以上の異なる試験結果
を結合すると、品質が非常に優れた、単純でそして安価な分析試験が可能になる
ことがここに見出された。[0005] Surprisingly, in the sense of the Boolean linkage,
It has now been found that combining two or more different test results at the molecular level, which essentially do not interfere with each other, allows a very good quality, simple and inexpensive analytical test.
【０００６】 したがって、本発明は、以下の段階： （ａ）第一および第二のマーカーを含む試料（ｓａｍｐｌｅ）を、第一のマーカ
ーを認識する第一の認識種（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）で処理
し、 （ｂ）該試料を、第一のマーカーおよび第二のマーカーを両方、認識する第二の
認識種で処理し、 （ｃ）該試料を、第二のマーカーを認識する第三の認識種で処理し、 （ｄ）上で言及された認識種およびマーカーの複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の存在
または非存在を検出する 段階を含む、検出法に関する。Accordingly, the present invention provides the following steps: (a) treating a sample containing first and second markers with a first recognition species that recognizes the first marker. (B) treating the sample with a second recognition species that recognizes both a first marker and a second marker; and (c) treating the sample with a third recognition species that recognizes a second marker. And (d) detecting the presence or absence of a complex of the recognition species and marker referred to above.
【０００７】 さらに、本発明は、以下の段階： （ａ）第一および第二のマーカーを含む試料を、第一のマーカーを認識する第一
の認識種で処理し、 （ｂ）該試料を、第一のマーカーおよび第三の認識種を認識する第二の認識種で
処理し、 （ｃ）該試料を、第二のマーカーおよび第二の認識種を認識する第三の認識種で
処理し、 （ｄ）上で言及された認識種およびマーカーの複合体の存在または非存在を検出
する 段階を含む、検出法に関する。Further, the present invention provides the following steps: (a) treating a sample containing the first and second markers with a first recognition species that recognizes the first marker; Treating the sample with a second recognition species recognizing the first marker and the third recognition species; and (c) treating the sample with a third recognition species recognizing the second marker and the second recognition species. And (d) detecting the presence or absence of the complex of the recognition species and marker referred to above.
【０００８】 特異性を増加させるため、さらなる態様において、さらなるマーカーを認識す
る、さらなる認識種を、さらなる処理段階で使用することが好都合であり、これ
はｎリガンド（ｎは自然数に等しい）に広がるとｎ＋１の認識種をもたらす。In order to increase the specificity, in a further aspect, it is advantageous to use further recognition species, recognizing further markers, in a further processing step, which extends to n ligands (n equals a natural number) And n + 1 recognition species.
【０００９】 さらなる好ましい態様において、検出法は、均質型、部分的均質型（モジュー
ル（ｍｏｄｕｌａｒ）型）または固定化型で実行される。均質な態様において、
結合事象（ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ）は段階的に行われ、そして形成され
る可能性がある複合体を「近接アッセイ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ）」
で検出する。第一のおよび最後の構成要素は、好ましくは、互いに反対にある場
合のみ、シグナルを生じることが可能であるように標識される。好ましい検出法
は、例えば、ＬＯＣＩ（Ｕｌｌｍａｎ， Ｅ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， ５４２６）、蛍光エネルギ
ー移動（ＦＲＥＴ）（Ｃａｒｄｕｌｌｏ， Ｒ．Ａ．（１９９２）“Ｎｏｎｒａ
ｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”中， ４１４−４２３， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅ
ｒｌａｇ）、蛍光消光（Ｌａｄｏｋｈｉｎ， Ａ．Ｓ．（１９９７）“Ｄｉｓｔ
ｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｅｐｔｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ
： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．， ２７８， ４６２−４７３）またはシンチレーション近接アッセイ（ｓ
ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＳＰＡ）（Ｐｉ
ｃａｒｄｏ， Ｍ． ＆ Ｈｕｇｈｅｓ， Ｋ．Ｔ．（１９９７）“Ｓｃｉｎｔ
ｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙｓ． Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏ
ｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”， Ｄｅｖｌｉｎ， Ｊ．Ｐ．監修； Ｖ
ｅｒｌａｇ Ｄｅｋｋｅｒ， ニューヨーク州ニューヨーク， ３０７−３１６
）である。In a further preferred embodiment, the detection method is performed in a homogeneous, partially homogeneous (modular) or immobilized form. In a homogeneous embodiment,
The binding events are performed in a step-by-step manner and the complexes that may be formed are identified in a "proximity assay".
To detect. The first and last components are preferably labeled such that they can only generate a signal if they are opposite to each other. Preferred detection methods are described, for example, in LOCI (Ullman, E. et al. (1994) Proc.
tl. Acad. Sci. USA, 91, 5426), Fluorescent energy transfer (FRET) (Cardullo, RA (1992) "Nonra").
diactive Labeling and Detection of
Biomolecules ”, 414-423, Springer Ve
rlag), fluorescence quenching (Ladokhin, AS (1997) “Dist
ribation analysis of depth-dependent
fluoresence quenching in membranes
: A practical guide ", Methods Enzymo
l. , 278, 462-473) or scintillation proximity assay (s
Cintilation proxy assessment: SPA) (Pi
cardo, M .; & Hughes, K.M. T. (1997) "Scint
Illustration proxy assessments. High Tro
V., “Screening”, edited by Devlin, JP;
erlag Dekker, New York, NY, 307-316
).
【００１０】 部分的に均質な態様すなわちモジュール態様において、結合事象は段階的にそ
して溶液中で行われ、そして複合体は形成されると直ちに、構成要素の１つを介
し、固体支持体に結合される。形成された複合体は、マーカー、特に非放射能マ
ーカーまたは放射能マーカー、好ましくは蛍光マーカー、酵素的マーカー（ｅｎ
ｚｙｍａｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）、酸化還元マーカー（ｒｅｄｏｘ ｍａｒｋｅ
ｒ）またはスピンマーカー（ｓｐｉｎ ｍａｒｋｅｒ）（Ｋｅｓｓｌｅｒ， Ｃ
．（監修）Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９９２）， Ｓｐｉｎｇｅ
ｒ Ｖｅｒｌａｇ， ４１４−４２３）により、検出される。In a partially homogeneous or modular embodiment, the binding event occurs stepwise and in solution, and as soon as the complex is formed, it binds to the solid support via one of the components. Is done. The complex formed may be a marker, especially a non-radioactive or radioactive marker, preferably a fluorescent marker, an enzymatic marker (en
zymatic marker, redox marker
r) or a spin marker (Kessler, C
. (Supervision) Nonradioactive Labeling and Det
section of Biomolecules (1992), Spinge
r Verlag, 414-423).
【００１１】 固定化態様（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において、認
識種、好ましくは第一の認識種が、固体支持体に結合し、そして続いて、複合体
の他の構成要素の段階的な付加により、構築される。標識は、好ましくは、部分
的に均質な態様の場合のものと同一のまたは類似の方法により、実行される。In an immobilized embodiment, the recognition species, preferably the first recognition species, is attached to a solid support and subsequently constructed by the stepwise addition of other components of the complex. Is done. The labeling is preferably performed by the same or similar methods as in the case of a partially homogeneous embodiment.
【００１２】 固定化に適した支持体は、特に、固体またはゼラチン状素材（ｓｏｌｉｄ ｏ
ｒ ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）、特にチップ素材および／また
は素材の薄層、好ましくはセラミック、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチッ
ク、水晶素材（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、または（生）
分子フィラメント（（ｂｉｏ）ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）、特
にセルロースまたは構造タンパク質である。Supports suitable for immobilization are, in particular, solid or gelatinous materials (solid o).
r gelatinous material, in particular a chip material and / or a thin layer of material, preferably ceramic, metal, especially noble metal, glass, plastic, crystalline material, or (raw)
Molecular filaments (bio), especially cellulose or structural proteins.
【００１３】 本発明にしたがった検出法で使用される認識種および／またはマーカーは、特
に、合成物質（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、天然物質（ｎａｔ
ｕｒａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）および／または天然物質誘導体であって、好ま
しくはペプチド、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）、タンパク質、サッカリド（ｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅ）または核酸である。例えば、受容体またはその機能する部
分（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐａｒｔ）、特に膜に基づく受容体（ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ−ｂａｓｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の細胞外ドメイン由来の機能部分、抗体
またはその機能する部分、特にＦｖ断片（Ｓｋｅｒｒａ ＆ Ｐｌｕｅｃｋｔｈ
ｕｎ（１９８８）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０， １０３８）、Ｆｖ断片の一本
鎖（ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ）； Ｂｉ
ｒｄら（１９８８）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２， ４２３； Ｈｕｓｔｏｎら
（１９８８）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ
． ８５， ５８７９）またはＦａｂ断片（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）， Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４０， １０４１）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、例えば
ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーまたはその誘導体、例えば核酸化学に慣例の保護
基と共に提供されるアプタマー、細胞構成要素（ｃｅｌｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅ
ｎｔ）、特に脂質、糖タンパク質、フィラメント構成要素、レクチン（ｌｅｃｔ
ｉｎ）、リポソーム、マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）、抗原、二次代謝産物ま
たはハプテン、細胞、特にリンパ球細胞、またはウイルス、特にウイルス構成要
素、特にキャプシド（ｃａｐｓｉｄ）、またはウイロイド（ｖｉｒｏｉｄ）、ま
たは誘導体、特にアセテート、またはそれらの活性部分、または一本鎖または二
本鎖核酸、特にＤＮＡまたはＲＮＡ、ｐ−ＲＮＡ（Ｐｉｔｓｃｈ， Ｓ．ら，
Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ．（１９９３）， ７６， ２１６１； Ｐ
ｉｔｓｃｈ， Ｓ．ら， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， （１９９５）
， ７８， １６２１）、ｐ−ＤＮＡ（ＤＥ １９８ ３７ ３８７．２）、Ｐ
ＮＡ（ペプチド核酸； Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ．Ｅ．ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ， ２５４， １４９７）、ＣＮＡ（アミノシクロヘキシル核酸； ＰＣＴ
／ＥＰ９８／０６００２）またはアプタマー（例えばＢｏｃｋ， Ｌ．Ｃ．ら（
１９９２）Ｎａｔｕｒｅ， ３５５， ５６４を参照されたい）、または上で言
及された物質のハイブリッドが特に好ましい。The recognition species and / or markers used in the detection method according to the invention are, in particular, synthetic substances, natural substances (nat)
ural substances and / or natural substance derivatives, preferably peptides, peptoids, proteins, saccharides
or nucleic acids. For example, the receptor or a functional part thereof, in particular a membrane-based receptor (membra)
a functional part derived from the extracellular domain of a ne-based receptor, an antibody or a functional part thereof, particularly an Fv fragment (Skerra & Plueckth)
un (1988), Science 240, 1038), single-chain Fv fragment (ScFv (single-chain Fv fragment); Bi
rd et al. (1988), Science 242, 423; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A
. 85, 5879) or Fab fragments (Better et al. (1988), S
science 240, 1041), aptamers, such as DNA or RNA aptamers or derivatives thereof, such as aptamers provided with protecting groups conventional in nucleic acid chemistry, cell constituents.
nt), especially lipids, glycoproteins, filament components, lectins (lect)
in), liposomes, mitogens, antigens, secondary metabolites or haptens, cells, especially lymphocytes, or viruses, especially viral components, especially capsids, or viroids, or derivatives, especially Acetate, or active portions thereof, or single- or double-stranded nucleic acids, especially DNA or RNA, p-RNA (Pitsch, S. et al.,
Helv. Chim. Acta. (1993), 76, 2161; P
itsch, S.M. Et al., Helv. Chim. Acta, (1995)
, 78, 1621), p-DNA (DE 198 37 387.2), P
NA (peptide nucleic acid; Nielsen, PE et al. (1991) Science
ce, 254, 1497), CNA (aminocyclohexyl nucleic acid; PCT)
/ EP98 / 06002) or aptamers (eg, Bock, LC et al. (
1992) Nature, 355, 564), or hybrids of the above-mentioned substances.
【００１４】 本発明にしたがい、アプタマーは、核酸と異なる特定の分子、例えばタンパク
質に対するその結合特性のため、核酸に属さず、抗体誘導体に属する。ＤＮＡア
プタマーまたはＲＮＡアプタマーが好ましい。According to the present invention, aptamers do not belong to nucleic acids but belong to antibody derivatives because of their binding properties to specific molecules different from nucleic acids, such as proteins. DNA or RNA aptamers are preferred.
【００１５】 アプタマーを含む、本発明にしたがった核酸はまた、修飾してもよい。このた
めに、核酸化学から当業者に既知である方法を用いることができる。核酸の安定
化をもたらす修飾が好ましい（例えば、Ｕｌｌｍａｎｎ， Ｅ． ＆ Ｐｅｙｍ
ａｎ， Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０， ５４
３， Ｎｏ．４を参照されたい）。[0015] Nucleic acids according to the present invention, including aptamers, may also be modified. For this purpose, methods known to those skilled in the art from nucleic acid chemistry can be used. Modifications that result in stabilization of the nucleic acid are preferred (eg, Ullmann, E. & Peym).
an, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 54.
3, No. 4).
【００１６】 慣例として、認識種によるマーカーの認識は、非共有相互作用（ｎｏｎ−ｃｏ
ｖａｌｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）により、特に水素結合、塩架橋（ｓａ
ｌｔ ｂｒｉｄｇｅｓ）、スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、金属リガンドの
形成、電荷移動錯体（ｃｈａｒｇｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）
、ファンデルワールス力または疎水性相互作用により、行われる。例えば、核酸
は、完全にまたは部分的に相補的な核酸または合成物質、例えば化学的薬品によ
り、マーカーとして認識され、天然物質および／または天然物質誘導体は、適切
な抗体または抗体誘導体により、抗原性物質として認識される。本発明にしたが
った検出法にしたがい、マーカーは、任意の望ましい種類の物質に属してもよい
が、好ましくは、少なくとも２つの異なる種類に属する。[0016] By convention, recognition of a marker by a recognition species is a noncovalent interaction (non-co
especially through hydrogen bonding, salt bridging (sa).
lt bridges, stacking, metal ligand formation, charge-transfer complexes
, By van der Waals forces or hydrophobic interactions. For example, a nucleic acid may be recognized as a marker by a completely or partially complementary nucleic acid or synthetic substance, eg, a chemical, and the natural substance and / or natural substance derivative may be rendered antigenic by a suitable antibody or antibody derivative. Recognized as a substance. According to the detection method according to the invention, the markers may belong to any desired type of substance, but preferably belong to at least two different types.
【００１７】 本発明にしたがった検出法にしたがい、さらに、少なくとも１つの認識種が標
識されており、好ましくは、すべての認識種が標識されており、特に、少なくと
も２つの認識種が異なって標識されている。より詳細に上ですでに例示したよう
に、均質、部分的均質（モジュール）または固定化態様が関与しているか否かに
応じ、マーカーは、非放射能または放射能、好ましくはＬＯＣＩ、ＦＲＥＴ、蛍
光消光、ＳＰＡ、蛍光マーカー、酵素的マーカー、酸化還元マーカーまたはスピ
ンマーカーであってもよい。According to the detection method according to the invention, furthermore, at least one recognition species is labeled, preferably all recognition species are labeled, in particular at least two recognition species are differently labeled Have been. As already exemplified in more detail above, depending on whether a homogeneous, partially homogeneous (module) or immobilized mode is involved, the marker may be non-radioactive or radioactive, preferably LOCI, FRET, It may be a fluorescence quencher, SPA, fluorescent marker, enzymatic marker, redox marker or spin marker.
【００１８】 さらなる好ましい態様において、マーカーおよび／またはシグナルを増幅し、
検出法の感度の増加をもたらしてもよい。マーカーの増幅は、特に、例えばＰＣ
Ｒ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、Ｑβ複製またはＲＴ−ＰＣＲ（Ｋｅｓｓｌｅ
ｒ， Ｃ．（１９９２）上記）による、核酸の増幅に関係する。シグナル増幅は
、例えば、結合構成要素の「架橋」、抗体または核酸樹（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏ
ｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｅｅｓ）（例えばｂ−ＤＮＡ）、触媒性基
質反応（例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ）またはシグナルカスケード（ｓｉｇｎａｌ ｃａｓｃａｄｅｓ）により、
達成される。In a further preferred embodiment, the markers and / or signals are amplified,
It may result in increased sensitivity of the detection method. Amplification of markers can be performed, for example, by
R, NASBA, LCR, SDA, Qβ replication or RT-PCR (Kessle
r, C.I. (1992) supra). Signal amplification can be, for example, "cross-linking" of binding components, antibodies or nucleic acids.
r nucleic acid trees (eg, b-DNA), catalytic substrate reactions (eg, alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase) or signal cascades (signal cascades).
Achieved.
【００１９】 上で言及されたｉｎ−ｖｉｔｒｏ増幅に加え、ｉｎ−ｖｉｖｏ増幅、例えばｒ
−ＲＮＡ検出、抗原の間接的検出もまた可能である。 原則として、マーカーは、２つの種類に分けることが可能である。「陽性マー
カー（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒｓ）」の場合、これらのマーカーの非存
在を、例えばシグナルの非存在により、検出する。陽性マーカーは、一般的に、
健康な生物に存在するマーカー、例えばｍＲＮＡを指す。陰性マーカー（ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒｓ）は、一般的に、病原体のまたは病気の生物の物質
と称され、これは、本発明にしたがった検出法により、測定することが可能であ
る。In addition to the in-vitro amplification mentioned above, in-vivo amplification, such as r
-RNA detection, indirect detection of antigens is also possible. In principle, markers can be divided into two types. In the case of "positive markers", the absence of these markers is detected, for example, by the absence of a signal. Positive markers are generally
Refers to markers present in healthy organisms, for example, mRNA. Negative marker (neg
Active markers are generally referred to as pathogenic or diseased organisms substances, which can be measured by the detection method according to the invention.
【００２０】 本発明にしたがった検出法では、２つまたはそれ以上の陰性、２つまたはそれ
以上の陽性あるいは２つまたはそれ以上の陽性および陰性マーカーのいずれかを
検出してもよい。したがって、検出は、シグナルの発生を介し、またはシグナル
の非存在を介し、行う。同様に、競合的アッセイにおいて、シグナルの置換、例
えば複合体からのまたはその結合コンホメーションからの分子の置換によるもの
（例えば分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）、Ｓ． Ｔｙａ
ｇｉ， Ｋｒａｍｅｒ Ｆ．Ｒ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ １４， ３０３−３０８， １９９６； Ｒ．Ｐ． Ｅｋｉｎｓ， Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４４／９， ２０１５−２０３０， １９
９８）が可能である。このためには、物質を試験系に添加し、該物質が検出しよ
うとするマーカーの１つを置換し、マーカーおよび認識種から構築される分子複
合体そしてしたがってまた、それに関連するシグナルを消失させる。したがって
、滴定により、置換されたマーカーの濃度を、単純な方式で測定することが可能
である。The detection method according to the invention may detect either two or more negatives, two or more positives or two or more positive and negative markers. Thus, detection is through the generation of a signal or through the absence of a signal. Similarly, in competitive assays, by displacement of a signal, such as by displacement of a molecule from a complex or from its binding conformation (eg, Molecular Beacons, S. Tya).
gi, Kramer F .; R. , Nature Biotechnology
y 14, 303-308, 1996; P. Ekins, Cli
medical Chemistry, 44/9, 2015-2030, 19
98) is possible. To this end, a substance is added to the test system, which displaces one of the markers to be detected and eliminates the molecular complex constructed from the marker and the recognition species and thus also the signal associated therewith. . Thus, by titration, the concentration of the displaced marker can be determined in a simple manner.
【００２１】 本発明にしたがった検出法は、ここで、特に好ましい、以下の代替態様の少な
くとも１つに存在することが可能である： １．少なくとも１つのマーカーが、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸
であり、そしてさらなるマーカー各々が、合成物質、核酸以外の天然物質または
天然物質誘導体、好ましくは抗原である。 ２．第一のマーカーおよびさらなるマーカー各々が、天然または非天然、一本鎖
または二本鎖核酸、あるいは、合成物質、核酸以外の天然物質または天然物質誘
導体、好ましくは抗原である。 ３．マーカーとしての、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸が、認識種
としての、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸に認識される。 ４．合成物質、天然物質または天然物質誘導体が、認識種としての、合成物質、
天然物質または天然物質誘導体に、好ましくは抗体または抗体誘導体に認識され
る。 ５．少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸で
あり、そしてさらなる認識種各々が、合成物質、核酸以外の異なる天然物質また
は異なる天然物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体である。 ６．第一の認識種およびさらなる認識種各々が、天然または非天然、一本鎖また
は二本鎖核酸、あるいは合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然
物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体である。 ７．少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、
および別の天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸のハイブリッドである。
８．少なくとも１つの認識種が、合成物質、天然物質または天然物質誘導体、お
よび別の合成物質、別の天然物質または別の天然物質誘導体のハイブリッドであ
る。 ９．少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、
および合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物質誘導体、好ま
しくは抗体または抗体誘導体のハイブリッドである。 １０．第一の認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸であり、第
二の認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、および合成物質、
天然物質または天然物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体のハイブリッ
ドである。 １１．第一の認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸であり、第
二の認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、および別の天然ま
たは非天然、一本鎖または二本鎖核酸のハイブリッドであり、そして第三の認識
種が、さらに異なる天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸である。 １２．第一の認識種が、合成物質、天然物質または天然物質誘導体、好ましくは
抗体または抗体誘導体であり、第二の認識種が、合成物質、天然物質または天然
物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体、および別の合成物質、別の天然
物質または別の天然物質誘導体、好ましくは別の抗体または抗体誘導体のハイブ
リッドであり、そして第三の認識種が、さらに異なる合成物質、さらに異なる天
然物質またはさらに異なる天然物質誘導体、好ましくはさらに異なる抗体または
さらに異なる抗体誘導体である。The detection method according to the invention can now be present in at least one of the following preferred embodiments, which are particularly preferred: At least one marker is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, and each further marker is a synthetic substance, a natural substance or derivative of a natural substance other than a nucleic acid, preferably an antigen. 2. Each of the first marker and the further marker is a natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, or a synthetic, natural or non-nucleic acid derivative of a natural substance, preferably an antigen. 3. A natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid as a marker is recognized by a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid as a recognition species. 4. A synthetic substance, a natural substance or a natural substance derivative, as a recognized species, a synthetic substance,
Recognized by natural substances or natural substance derivatives, preferably antibodies or antibody derivatives. 5. The at least one recognition species is a natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, and each of the further recognition species is a synthetic substance, a different natural substance or a different natural substance derivative other than a nucleic acid, preferably an antibody or antibody It is a derivative. 6. Each of the first recognition species and the further recognition species is a natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, or a synthetic material, a different natural material or a different natural material derivative other than a nucleic acid, preferably an antibody or antibody derivative. . 7. At least one recognition species is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid;
And another hybrid of natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acids.
8. The at least one recognition species is a hybrid of a synthetic material, a natural material or a natural material derivative, and another synthetic material, another natural material or another natural material derivative. 9. At least one recognition species is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid;
And synthetic substances, different natural substances other than nucleic acids or different natural substance derivatives, preferably antibodies or hybrids of antibody derivatives. 10. The first recognition species is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid, and the second recognition species is a natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, and a synthetic substance.
It is a natural substance or a natural substance derivative, preferably an antibody or a hybrid of an antibody derivative. 11. The first recognition species is a natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, and the second recognition species is a natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, and another natural or non-natural nucleic acid. Hybrids of natural, single-stranded or double-stranded nucleic acids, and the third recognition species are further different natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acids. 12. The first recognition species is a synthetic substance, a natural substance or a natural substance derivative, preferably an antibody or an antibody derivative, and the second recognition species is a synthetic substance, a natural substance or a natural substance derivative, preferably an antibody or an antibody derivative; And another synthetic substance, another natural substance or another natural substance derivative, preferably a hybrid of another antibody or antibody derivative, and the third recognition species is a further different synthetic substance, a further different natural substance or a further different Natural substance derivatives, preferably further different antibodies or different antibody derivatives.
【００２２】 本発明の別の主題は、複合体の形成と共に、少なくとも２つの異なるマーカー
を認識する、少なくとも２つの認識種を含む、試験系であって、好ましくは、す
でに上述された認識種またはマーカーである、試験系である。好ましい態様にお
いて、少なくとも１つの認識種が、好ましくは、より詳細にすでに上述されたも
のなどの、支持体上に固定化されている。Another subject of the present invention is a test system, comprising at least two recognition species, which recognizes at least two different markers with the formation of the complex, preferably a recognition species already described above or It is a test system that is a marker. In a preferred embodiment, at least one recognition species is preferably immobilized on a support, such as those already described in more detail above.
【００２３】 本発明にしたがった試験系は、以下の好ましい態様で使用してもよい： １．少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸で
あり、そして少なくとも１つの他の認識種が、別の天然または非天然、一本鎖ま
たは二本鎖核酸である。 ２．少なくとも１つの認識種が、合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異
なる天然物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体であり、そして少なくと
も１つの他の認識種が、別の合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる
天然物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体である。 ３．少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、
および合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物質誘導体、好ま
しくは抗体または抗体誘導体のハイブリッドである。 ４．少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、
および別の天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸のハイブリッドである。
５．少なくとも１つの認識種が、合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異
なる天然物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体、および別の合成物質、
核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物質誘導体、好ましくは抗体または
抗体誘導体のハイブリッドである。The test system according to the invention may be used in the following preferred embodiments: At least one recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, and at least one other recognition species is another natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid. . 2. The at least one recognition species is a synthetic substance, a different natural substance or a different natural substance derivative other than a nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative, and the at least one other recognition species is another synthetic substance, a different non-nucleic acid. It is a natural substance or a different natural substance derivative, preferably an antibody or antibody derivative. 3. At least one recognition species is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid;
And synthetic substances, different natural substances other than nucleic acids or different natural substance derivatives, preferably antibodies or hybrids of antibody derivatives. 4. At least one recognition species is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid;
And another hybrid of natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acids.
5. At least one recognition species is a synthetic substance, a different natural substance or a different natural substance derivative other than a nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative, and another synthetic substance;
Hybrids of different natural substances or different natural substance derivatives other than nucleic acids, preferably antibodies or antibody derivatives.
【００２４】 本発明にしたがった試験系は、例えば、個々の態様に必要な認識種を組み合わ
せることにより、または少なくとも１つの認識種を、当業者に一般的に知られる
方法により、好ましくは、すでに上述されたような、支持体上に固定化すること
により、産生してもよい。The test system according to the invention can be prepared, for example, by combining the required recognition species for the individual embodiments, or by at least one recognition species by methods generally known to the person skilled in the art, preferably It may be produced by immobilization on a support, as described above.
【００２５】 本発明にしたがった試験系は、より詳細に上述されたように、本発明にしたが
った検出法に使用してもよい。特に、該系は、試料中の、少なくとも２つの異な
るマーカーの存在および／または非存在を検出するために用いられる。該系は、
好ましくは、診断法（ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）の形または分析法（ａｎ ａ
ｎａｌｙｔｅ）の形で存在する。該系は、したがって、特に、障害の検出のため
、または環境分析のため、特に毒素（ｔｏｘｉｎｓ）および／またはアレルゲン
の検出のために用いられる。A test system according to the invention may be used in a detection method according to the invention, as described above in more detail. In particular, the system is used to detect the presence and / or absence of at least two different markers in a sample. The system comprises:
Preferably, in the form of a diagnostic or an analytical method (an a
(nally). The system is therefore used in particular for the detection of disorders or for environmental analysis, in particular for the detection of toxins and / or allergens.
【００２６】 以下の図および実施例は、本発明を制限することなく、より詳細に記載するこ
とを意図する。The following figures and examples are intended to describe the invention in more detail without limiting it.
【００２７】[0027]
【実施例】デオキシリボ核酸および標識抗体／抗原の同時検出 出発化合物： 実施例に必要な試薬、例えばＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）標識オリゴヌク
レオチド結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（２４量体ＤＮＡ；Ｉｎｔｅｒａｃｔｉ
ｖａ；ＤＮＡ１）、ビオチン化オリゴヌクレオチド結合体（２４量体ＤＮＡ；Ｉ
ｎｔｅｒａｃｔｉｖａ；ＤＮＡ３）；２つの他のＤＮＡに相補的な配列を有する
、合成オリゴヌクレオチド（５７量体ＤＮＡ；Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ；ＤＮＡ
２）；ストレプトアビジン結合抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2（ヤギ；Ｒｏｃｋ
ｌａｎｄ）および抗原としてのフルオレセイン標識ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2
断片（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）は、すべて商業的に入手可能である。EXAMPLES Simultaneous detection of deoxyribonucleic acid and labeled antibody / antigen Starting compounds : Reagents required for the examples, such as Texas Red® labeled oligonucleotide conjugate (24 mer DNA; Interacti)
va; DNA1), biotinylated oligonucleotide conjugate (24-mer DNA; I
synthetic oligonucleotides (57-mer DNA; Interactiva; DNA) having sequences complementary to two other DNAs
2); streptavidin-conjugated anti-human IgG F (ab ') 2 (goat; Rock
land) and fluorescein-labeled human IgG F (ab ') 2 as antigen
All fragments (Rockland) are commercially available.
【００２８】[0028]
【表１】 [Table 1]
【００２９】 表１：使用した認識種およびマーカー実施例１ １ ｎｍｏｌのＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識オリゴヌクレオチド結合体（ＤＮＡ１
）、１ ｎｍｏｌのビオチン標識オリゴヌクレオチド結合体（ＤＮＡ３）および
１ ｐｍｏｌの５７量体オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ２）を、各場合で、１５０
μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５ ｘ ＳＳＣ、０．０２％ ＳＤＳ）
に取った。これらの構成物質を６０℃で３０分間加熱し、互いに混合し、そして
３７℃で３時間インキュベーションした。これらを室温（ＲＴ）に冷却し、１
ｎｍｏｌのストレプトアビジン抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2結合体および１
ｎｍｏｌのフルオレセイン標識ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2断片を添加し、そして混
合物を室温で一晩置いた。形成された複合体を、非変性ゲル（１５％強度ＴＥＢ
ゲル、ＢｉｏＲａｄ）中の黄色いバンドにより、検出した。実施例２ １ ｎｍｏｌのビオチン標識オリゴヌクレオチド結合体（ＤＮＡ１）、１ ｎ
ｍｏｌのビオチン標識オリゴヌクレオチド結合体（ＤＮＡ３）および１ ｐｍｏ
ｌの５７量体オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ２）を、各場合で、１５０μｌのハイ
ブリダイゼーション緩衝液（５ ｘ ＳＳＣ、０．０２％ ＳＤＳ）に取った。
これらの構成物質を６０℃で５分間加熱し、互いに混合し、そして３７℃で３時
間インキュベーションした。溶液を室温（ＲＴ）に冷却し、そしてストレプトア
ビジン被覆マイクロタイタープレート（ＢＩＯＴＥＺ、注文番号０４０２９８９
２０）に添加した。上清溶液をピペットにより除き、そして支持体を、５００μ
ｌの０．９％ ＮａＣｌ溶液で５回洗浄した。その後、あらかじめＲＴで２時間
インキュベーションした、２００μｌのストレプトアビジン抗ヒトＩｇＧ Ｆ（
ａｂ’）2（ヤギ）溶液（１．６ｍｇ／ｍｌ）および４０μｌのフルオレセイン
標識ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2断片溶液（５．０ ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして
混合物をＲＴで１−２時間インキュベーションした。続いて、上清溶液をピペッ
トにより除き、そして支持体を、５００μｌの０．９％ ＮａＣｌ溶液で５回洗
浄した。複合体の形成は、フルオレセインの蛍光（λmax,A：４９４ ｎｍ、λm ax,E ：５２５ ｎｍ）を測定することにより、検出した。Table 1: Recognition species and markers used Example 1 1 nmol of Texas Red labeled oligonucleotide conjugate (DNA1
), 1 nmol of the biotin-labeled oligonucleotide conjugate (DNA3) and 1 pmol of the 57-mer oligonucleotide (DNA2) were in each case 150 min.
μl hybridization buffer (5 × SSC, 0.02% SDS)
I took it. The components were heated at 60 ° C. for 30 minutes, mixed with each other, and incubated at 37 ° C. for 3 hours. These are cooled to room temperature (RT) and
nmol streptavidin anti-human IgG F (ab ') 2 conjugate and 1
nmol of fluorescein-labeled IgG F (ab ') 2 fragment was added and the mixture was left overnight at room temperature. The formed complex is subjected to a non-denaturing gel (15% strength TEB).
Gel, BioRad) was detected by a yellow band. Example 2 1 nmol of biotin-labeled oligonucleotide conjugate (DNA1), 1 n
mol of biotin-labeled oligonucleotide conjugate (DNA3) and 1 pmo
One liter of 57-mer oligonucleotide (DNA2) was taken up in each case in 150 μl of hybridization buffer (5 × SSC, 0.02% SDS).
The components were heated at 60 ° C. for 5 minutes, mixed with each other, and incubated at 37 ° C. for 3 hours. The solution is cooled to room temperature (RT) and streptavidin-coated microtiter plates (BIOTEZ, order no.
20). The supernatant solution is removed by pipette and the support is
Washed 5 times with 1 l of 0.9% NaCl solution. Thereafter, 200 μl of streptavidin anti-human IgG F (pre-incubated for 2 hours at RT)
ab ′) 2 (goat) solution (1.6 mg / ml) and 40 μl of a fluorescein-labeled IgG F (ab ′) 2 fragment solution (5.0 mg / ml) and the mixture is allowed to stand at RT for 1-2 hours Incubate. Subsequently, the supernatant solution was removed by pipette and the support was washed 5 times with 500 μl of 0.9% NaCl solution. Complex formation, fluorescence of fluorescein (λ max, A: 494 nm , λ m ax, E: 525 nm) by measuring and detection.
【００３０】[0030]
【表２】 [Table 2]
【００３１】 表２：使用した認識種およびマーカーTable 2: Recognition species and markers used
【図１】 図１は、固定化態様のアッセイにおける、２つの分析物（Ａおよ
びＢ）の検出を図式的に示す。FIG. 1 schematically shows the detection of two analytes (A and B) in an immobilized assay.
【図２】 図２は、固定化態様のアッセイにおける、２つの分析物（抗原Ａ
およびＢ）の検出を図式的に示す。FIG. 2 shows two analytes (antigen A) in an immobilized assay.
And B) schematically shows the detection.
【図３】 図３は、固定化態様のアッセイにおける、２つの分析物（核酸Ａ
およびＢ）の検出を図式的に示す。FIG. 3 shows two analytes (nucleic acid A) in an assay in an immobilized mode.
And B) schematically shows the detection.
【図４】 図４は、実施例１にしたがった、マーカーおよび認識種の複合体
を図式的に示す。FIG. 4 schematically shows a complex of a marker and a recognition species according to Example 1.
【図５】 図５は、実施例２にしたがった、マーカーおよび認識種の複合体
を図式的に示す。FIG. 5 schematically shows a complex of a marker and a recognition species according to Example 2.
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment
【提出日】平成１２年１０月３１日（２０００．１０．３１）[Submission date] October 31, 2000 (2000.10.31)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｇ０１Ｎ 33/553 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 33/553 G01N 33/553
Claims (36)
の認識種で処理し、 （ｂ）該試料を、第一のマーカーおよび第二のマーカーを両方、認識する第二の
認識種で処理し、 （ｃ）該試料を、第二のマーカーを認識する第三の認識種で処理し、 （ｄ）言及された認識種およびマーカーの複合体の存在または非存在を検出する
段階を含む、検出法。1. The following steps: (a) treating a sample containing first and second markers with a first recognition species that recognizes the first marker; (C) treating the sample with a third recognition species that recognizes the second marker, and (d) treating the sample with a third recognition species that recognizes the second marker. A detection method comprising detecting the presence or absence of a complex of a species and a marker.
の認識種で処理し、 （ｂ）該試料を、第一のマーカーおよび第三の認識種を認識する第二の認識種で
処理し、 （ｃ）該試料を、第二のマーカーおよび第二の認識種を認識する第三の認識種で
処理し、 （ｄ）言及された認識種およびマーカーの複合体の存在または非存在を検出する
段階を含む、検出法。2. The following steps: (a) treating a sample containing the first and second markers with a first recognition species that recognizes the first marker; (C) treating the sample with a third recognition species that recognizes the second marker and the second recognition species, and (c) treating the sample with a third recognition species that recognizes the second recognition species. A) detecting the presence or absence of the complex of the noted recognition species and marker;
ーを認識する、さらなる認識種を、さらなる処理段階で使用することで特徴付け
られる、前記検出法。3. The detection method according to claim 1 or 2, characterized in that a further recognition species recognizing a further marker is used in a further processing step.
識種、好ましくは第一の認識種が、支持体上に固定化されていることで特徴付け
られる、前記検出法。4. The detection method according to claim 1, wherein the recognition species, preferably the first recognition species, is immobilized on a support. , The detection method.
ラチン状素材、特にチップ素材および／または素材の薄層、好ましくはセラミッ
ク、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチック、水晶素材、または（生）分子フ
ィラメント、特にセルロースまたは構造タンパク質より選択されることで特徴付
けられる、前記検出法。5. The detection method according to claim 4, wherein the support is a solid or gelatinous material, in particular a chip material and / or a thin layer of material, preferably a ceramic, a metal, especially a noble metal, a glass, a plastic, Said detection method characterized by being selected from quartz material or (raw) molecular filaments, especially cellulose or structural proteins.
及された認識種および／またはマーカーが、合成物質、天然物質および／または
天然物質誘導体であって、好ましくはペプチド、ペプトイド、タンパク質、サッ
カリドまたは核酸より選択されることで特徴付けられる、前記検出法。6. The detection method according to claim 1, wherein the recognition species and / or the marker is a synthetic substance, a natural substance and / or a natural substance derivative, Said detection method characterized by being preferably selected from peptides, peptoids, proteins, saccharides or nucleic acids.
は天然物質誘導体が、受容体またはその機能する部分、特に膜に基づく受容体の
細胞外ドメイン由来の前記部分、抗体またはその機能する部分、特にＦｖ断片、
Ｆｖ断片の一本鎖（ＳｃＦｖ）またはＦａｂ断片、細胞構成要素、特に脂質、糖
タンパク質、フィラメント構成要素、レクチン、リポソーム、マイトジェン、抗
原、二次代謝産物またはハプテン、細胞、特にリンパ球細胞、またはウイルス、
特にウイルス構成要素、特にキャプシド、またはウイロイド、または誘導体、特
にアセテート、またはそれらの活性部分、または一本鎖または二本鎖核酸、特に
ＤＮＡまたはＲＮＡの形の天然核酸または非天然核酸、好ましくはｐ−ＲＮＡ、
ｐ−ＤＮＡ、ＰＮＡまたはＣＮＡ、または上記物質のハイブリッドであることで
特徴付けられる、前記検出法。7. The detection method according to claim 6, wherein the synthetic substance, natural substance or natural substance derivative is a receptor or a functional part thereof, in particular the part derived from the extracellular domain of a membrane-based receptor, An antibody or a functional part thereof, particularly an Fv fragment;
Single chain (ScFv) or Fab fragment of Fv fragment, cell component, especially lipid, glycoprotein, filament component, lectin, liposome, mitogen, antigen, secondary metabolite or hapten, cell, especially lymphocyte cell, or Virus,
In particular, viral components, especially capsids, or viroids, or derivatives, especially acetate, or active parts thereof, or single- or double-stranded nucleic acids, especially natural or unnatural nucleic acids in the form of DNA or RNA, preferably p -RNA,
The above detection method, which is characterized by being p-DNA, PNA or CNA, or a hybrid of the above substances.
識種によるマーカーの認識が、非共有相互作用により、特に水素結合、塩架橋、
スタッキング、金属リガンドの形成、電荷移動錯体、ファンデルワールス力また
は疎水性相互作用により、行われることで特徴付けられる、前記検出法。8. The detection method according to any one of claims 1 to 7, wherein the recognition of the marker by the recognition species is carried out by non-covalent interaction, especially by hydrogen bonding, salt crosslinking,
The above-described detection method, characterized in that the detection is performed by stacking, formation of a metal ligand, a charge transfer complex, van der Waals force or hydrophobic interaction.
なくとも１つの認識種が標識されており、特に、すべての認識種が標識されてお
り、好ましくは、少なくとも２つの認識種が異なって標識されていることで特徴
付けられる、前記検出法。9. The detection method according to any one of claims 1 to 8, wherein at least one recognition species is labeled, in particular, all recognition species are labeled, preferably The above-described detection method, wherein at least two recognition species are differently labeled.
ーカーまたは放射能マーカー、好ましくはＬＯＣＩマーカー、ＦＲＥＴマーカー
、蛍光消光マーカー、ＳＰＡマーカー、蛍光マーカー、酵素的マーカー、酸化還
元マーカーまたはスピンマーカーであることで特徴付けられる、前記検出法。10. The detection method according to claim 9, wherein the marker is a non-radioactive marker or a radioactive marker, preferably a LOCI marker, FRET marker, fluorescent quenching marker, SPA marker, fluorescent marker, enzymatic marker, oxidation. The above-described detection method, which is characterized by being a reducing marker or a spin marker.
、マーカーおよび／またはシグナルが増幅されることで特徴付けられる、前記検
出法。11. The detection method according to claim 1, wherein the marker and / or the signal are amplified.
、検出が方法の段階（ｄ）にしたがい、競合的に行われることで特徴付けられる
、前記検出法。12. The detection method according to claim 1, wherein the detection is performed competitively according to step (d) of the method.
、少なくとも１つのマーカーが、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸で
あり、そしてさらなるマーカー各々が、合成物質、核酸以外の異なる天然物質ま
たは異なる天然物質誘導体、好ましくは抗原であることで特徴付けられる、前記
検出法。13. The detection method according to any one of claims 1 to 12, wherein the at least one marker is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid and each of the further markers Is a different natural substance or a different natural substance derivative other than a synthetic substance or nucleic acid, preferably an antigen.
、第一のマーカーおよびさらなるマーカー各々が、天然または非天然、一本鎖ま
たは二本鎖核酸、あるいは、合成物質、天然核酸以外の異なる天然物質または異
なる天然物質誘導体、好ましくは抗原であることで特徴付けられる、前記検出法
。14. The detection method according to any one of claims 1 to 12, wherein each of the first marker and the further marker is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, or Said detection method characterized in that it is a synthetic substance, a different natural substance other than a natural nucleic acid or a different natural substance derivative, preferably an antigen.
、マーカーとしての、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸が、認識種と
しての、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸に認識されることで特徴付
けられる、前記検出法。15. The detection method according to any one of claims 1 to 14, wherein the marker is a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, which is a natural or non-natural nucleic acid as a recognition species. The above-described detection method, which is characterized by being recognized by a non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
、合成物質、天然物質または天然物質誘導体が、認識種としての、合成物質、天
然物質または天然物質誘導体に、好ましくは抗体または抗体誘導体に認識される
ことで特徴付けられる、前記検出法。16. The detection method according to any one of claims 1 to 15, wherein the synthetic substance, the natural substance, or the natural substance derivative is converted to a synthetic substance, a natural substance, or a natural substance derivative as a recognition species. The detection method as described above, which is preferably characterized by being recognized by an antibody or an antibody derivative.
、少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸であ
り、そしてさらなる認識種各々が、合成物質、核酸以外の異なる天然物質または
異なる天然物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体であることで特徴付け
られる、前記検出法。17. The detection method according to any one of claims 1 to 16, wherein the at least one recognition species is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid, and further recognized. Said detection method, wherein each species is characterized by being a different natural substance or a different natural substance derivative, preferably an antibody or an antibody derivative, other than a synthetic substance, a nucleic acid.
、第一の認識種およびさらなる認識種各々が、天然または非天然、一本鎖または
二本鎖核酸、あるいは合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物
質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体であることで特徴付けられる、前記
検出法。18. The detection method according to any one of claims 1 to 16, wherein each of the first recognition species and the further recognition species is a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, Alternatively, the detection method is characterized by being a different natural substance or a different natural substance derivative other than a synthetic substance or nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative.
、少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、お
よび別の天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸のハイブリッドであること
で特徴付けられる、前記検出法。19. The detection method according to any one of claims 1-16, wherein the at least one recognition species is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid, and another natural or non-natural nucleic acid. The foregoing detection method, characterized by being a hybrid of non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
、少なくとも１つの認識種が、合成物質、天然物質または天然物質誘導体、およ
び別の合成物質、別の天然物質または別の天然物質誘導体のハイブリッドである
ことで特徴付けられる、前記検出法。20. The detection method according to any one of claims 1 to 16, wherein the at least one recognition species is a synthetic substance, a natural substance or a natural substance derivative, and another synthetic substance, another natural substance. The above-mentioned detection method, characterized by being a hybrid of the substance or another natural substance derivative.
、少なくとも１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、お
よび合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物質誘導体、好まし
くは抗体または抗体誘導体のハイブリッドであることで特徴付けられる、前記検
出法。21. The detection method according to claim 1, wherein the at least one recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, and a synthetic substance, nucleic acid. Said detection method characterized by being a hybrid of a different natural substance or a different natural substance derivative, preferably an antibody or an antibody derivative.
、第一の認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸であり、第二の
認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、および合成物質、天然
物質または天然物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体のハイブリッドで
あることで特徴付けられる、前記検出法。22. The detection method according to any one of claims 1 to 16, wherein the first recognition species is a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, The above-described detection method, wherein the recognition species is characterized by being a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, and a synthetic substance, a natural substance or a natural substance derivative, preferably an antibody or an antibody derivative.
、第一の認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸であり、第二の
認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、および別の天然または
非天然、一本鎖または二本鎖核酸のハイブリッドであり、そして第三の認識種が
、さらに異なる天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸であることで特徴付
けられる、前記検出法。23. The detection method according to any one of claims 1 to 16, wherein the first recognition species is a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, The recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid, and another natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, and the third recognition species is a further different natural Or the non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
、第一の認識種が、合成物質、天然物質または天然物質誘導体、好ましくは抗体
または抗体誘導体であり、第二の認識種が、合成物質、天然物質または天然物質
誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体、および別の天然物質または別の天然
物質誘導体、好ましくは別の抗体または抗体誘導体のハイブリッドであり、そし
て第三の認識種が、さらに異なる合成物質、天然物質または天然物質誘導体、好
ましくはさらに異なる抗体または抗体誘導体であることで特徴付けられる、前記
検出法。24. The detection method according to any one of claims 1 to 16, wherein the first recognition species is a synthetic substance, a natural substance or a natural substance derivative, preferably an antibody or an antibody derivative, The second recognition species is a hybrid of a synthetic substance, a natural substance or natural substance derivative, preferably an antibody or antibody derivative, and another natural substance or another natural substance derivative, preferably another antibody or antibody derivative; and The above-described detection method, wherein the third recognition species is further characterized as being a different synthetic substance, natural substance or natural substance derivative, preferably a further different antibody or antibody derivative.
を認識する、少なくとも２つの認識種を含む、試験系。25. A test system comprising at least two recognition species that recognize at least two different markers with complex formation.
識種が、支持体上に固定化されていることで特徴付けられる、前記試験系。26. The test system of claim 25, wherein the at least one recognition species is characterized by being immobilized on a support.
も１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸であり、そして
少なくとも１つの他の認識種が、別の天然または非天然、一本鎖または二本鎖核
酸であることで特徴付けられる、前記試験系。27. The test system according to claim 25 or 26, wherein at least one recognition species is a natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, and at least one other recognition species. Said test system, characterized in that it is another natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
も１つの認識種が、合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物質
誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体であり、そして少なくとも１つの他の
認識種が、合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物質誘導体、
好ましくは抗体または抗体誘導体であることで特徴付けられる、前記試験系。28. The test system according to claim 25 or 26, wherein the at least one recognition species is a synthetic substance, a different natural substance or a different natural substance derivative other than a nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative, and At least one other recognition species is a synthetic substance, a different natural substance or a different natural substance derivative other than a nucleic acid,
Said test system, characterized in that it is preferably an antibody or an antibody derivative.
も１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、および合成物
質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物質誘導体、好ましくは抗体ま
たは抗体誘導体のハイブリッドであることで特徴付けられる、前記試験系。29. The test system according to claim 25 or 26, wherein the at least one recognition species is a natural or non-natural, single- or double-stranded nucleic acid, and a synthetic substance, a different natural substance other than the nucleic acid or Said test system characterized by being a derivative of a different natural substance derivative, preferably an antibody or an antibody derivative.
も１つの認識種が、天然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸、および別の天
然または非天然、一本鎖または二本鎖核酸のハイブリッドであることで特徴付け
られる、前記試験系。30. The test system of claim 25 or 26, wherein the at least one recognition species is a natural or unnatural, single- or double-stranded nucleic acid, and another natural or non-natural, single-stranded. Alternatively, the test system is characterized by being a double-stranded nucleic acid hybrid.
も１つの認識種が、合成物質、核酸以外の異なる天然物質または異なる天然物質
誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体、および別の合成物質、核酸以外の異
なる天然物質または異なる天然物質誘導体、好ましくは抗体または抗体誘導体の
ハイブリッドであることで特徴付けられる、前記試験系。31. The test system according to claim 25 or 26, wherein the at least one recognition species is a synthetic substance, a different natural substance or a different natural substance derivative other than a nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative, and another Said test system characterized in that it is a synthetic substance, a different natural substance other than nucleic acid or a different natural substance derivative, preferably an antibody or a hybrid of antibody derivatives.
法であって、個々の認識種を組み合わせることで特徴付けられる、前記産生法。32. A method for producing the test system according to any one of claims 25-31, characterized by combining individual recognition species.
種が、支持体上に固定化されていることで特徴付けられる、前記方法。33. The method of claim 32, wherein the at least one recognition species is characterized by being immobilized on a support.
び／または非存在を検出するための、請求項２５−３１のいずれか１項に記載の
試験系の使用。34. Use of a test system according to any one of claims 25 to 31 for detecting the presence and / or absence of at least two different markers in a sample.
験法の使用。35. Use of the test method according to claim 32 in the form of a diagnostic or analytical method.
患病原体、疾患マーカー、毒素および／またはアレルゲンの検出のための、請求
項３２または３３記載の試験法の使用。36. Use of a test method according to claim 32 or 33 for the detection of a disorder or for environmental analysis, in particular for the detection of disease pathogens, disease markers, toxins and / or allergens.
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