EP1141725A2 - Test system for detecting different analytes - Google Patents

Test system for detecting different analytes

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Publication number
EP1141725A2
EP1141725A2 EP99968373A EP99968373A EP1141725A2 EP 1141725 A2 EP1141725 A2 EP 1141725A2 EP 99968373 A EP99968373 A EP 99968373A EP 99968373 A EP99968373 A EP 99968373A EP 1141725 A2 EP1141725 A2 EP 1141725A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
natural
nucleic acid
stranded
derivative
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99968373A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Thomas Wagner
Norbert Windhab
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanogen Recognomics GmbH
Original Assignee
Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Nanogen Recognomics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG, Nanogen Recognomics GmbH filed Critical Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Publication of EP1141725A2 publication Critical patent/EP1141725A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Definitions

  • the present invention relates to a test system containing at least two detection species. recognize the at least two different markers to form a complex. its manufacture and use in a suitable detection method.
  • test systems such as. B. Diagnostics are in biology, biochemistry. Medicine and pharmacology widely used. Especially in medicine, a reliable and clear diagnosis of diseases, such as B. viral infections or cancer. of extraordinary importance for increasing the quality of life, because timely and effective treatment can only be achieved by early detection of an illness.
  • disease-specific markers or ligands such as B. nucleic acid sequences, proteins or antigens
  • the pathogen or the disease is detected in the biological sample. Diagnostic tests are widespread, in which a marker or a class of markers is detected, such as. B. in ELISA or amplification methods such as PCR, b-DNA, Southern, Western or Northern blotting.
  • the types of detection used range from simple staining methods and calorimetric methods to fluorescence energy transfer (FRET) and fluorescence quenching to scintillation proximity assay (SPA).
  • FRET fluorescence energy transfer
  • SPA scintillation proximity assay
  • a major disadvantage when using only one marker or one marker class is that positive test results are easily erroneously produced, which also lead to incorrect conclusions regarding a specific disease. Often, therefore, a second Test or other tests on the same or complementary analytes are carried out in order to be able to make a reliable statement regarding ill / healthy. This leads to several tests, the results of which can be compared with one another, which is at the same time complex and cost-intensive.
  • the object of the present invention is therefore to develop qualitatively better, less complex and less expensive analytical tests than those already known.
  • the invention therefore relates to a detection method comprising the following steps: (a) Treatment of a sample containing a first and a second marker with a first recognition species. that recognizes the first marker,
  • the present invention furthermore relates to a detection method comprising the following steps:
  • the detection method is carried out in a homogeneous, partially homogeneous (modular) or immobilized form.
  • the binding events are generated step by step and the complex that may be formed is detected in a so-called proximity assay.
  • the first and last components are preferably marked so that they can only generate a signal when they are close together.
  • Preferred detection methods are e.g. B. LOCI (Ullmann, E. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426), Fluorescence Energy Transfer (FRET) Cordullo. RA (1992) in Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules' * , 414-423.
  • the binding events are generated step by step and in solution and, once the complex has formed, are bound to a solid support via one of the components.
  • the complex which is formed is detected by a label, in particular a non-radioactive label or radioactive label, preferably by means of fluorescent labeling, enzymatic labeling, redox labeling or spin labeling (Kessler, C. (Ed.) Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules (1992 ), Springer Verlag, 414-423).
  • a recognition species preferably the first recognition species, is bound to a solid support and the complex is subsequently built up by gradually adding the further components.
  • the marking is preferably carried out according to the same or similar methods as in the partially homogeneous embodiment.
  • Solid or gel-like material in particular chip material and / or thin layers of the material, preferably ceramic, metal, in particular noble metal, glasses, plastics, crystalline materials or (bio) molecular filaments, in particular cellulose or framework proteins, are particularly suitable as supports for the immobilization.
  • the recognition species and / or markers used in the detection method according to the invention are in particular a synthetic substance, a natural product and / or a natural product derivative, preferably a peptide, peptoid, protein, saccharide or a nucleic acid.
  • a receptor or a functional part thereof in particular a functional part originating from the extracellular domain of a membrane-standing receptor, an antibody or a functional part thereof, in particular an Fv fragment (Skerra & Plückthun (1988 ), Science 240, 1038), a single chain Fv fragment (scFv; Bird et al. (1988), Science 242, 423; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • an aptamer for example a DNA or RNA aptamer or derivatives thereof, for example aptamers provided with protective groups customary in nucleic acid chemistry, a cell component, in particular a Lipid, glycoprotein, filament component, lectin, liposome, mitogen, antigen.
  • a cell in particular a lymphoid cell, or a virus, in particular a virus component, in particular a capsid, or a viroid or a derivative, in particular an acetate, or its active parts, or a single-stranded or double-stranded nucleic acid , in particular DNA, RNA, p-RNA (Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta. (1993), 76, 2161; Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta. (1995), 78, 1621), p-DNA (DE 198 37 387.2), PNA (peptide nucleic acid (Nielsen, PE et al.
  • aptamers count due to their binding properties to specific molecules other than nucleic acids, such as. B. proteins, not to the nucleic acids, but to antibody derivatives. DNA aptamers or RNA aptamers are preferred.
  • nucleic acids according to the invention can also be modified.
  • the methods known to the person skilled in the art from nucleic acid chemistry can be used for this purpose. Modifications which lead to stabilization of the nucleic acids are preferred (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4).
  • a marker is usually recognized by a recognition species via non-covalent interactions, in particular via hydrogen bridges, salt bridges. Stacking, metal lining, charge transfer complexes, Van der Waals forces or hydrophobic interactions.
  • a nucleic acid is recognized as a marker by a completely or partially complementary nucleic acid or a synthetic substance, such as. B. a chemical, a natural product and / or a natural product derivative as antigenic substances are recognized by a corresponding antibody or antibody derivative.
  • the markers can belong to any substance class, but preferably from at least two different ones.
  • the marking can, depending on whether it is a homogeneous, partially homogeneous (modular) or immobilized embodiment, be non-radioactive or radioactive, preferably LOCI, FRET. Fluorescence quenching, SPA, a fluorescent label, enzymatic label, redox label or spin label.
  • the marker and / or the signal can be amplified, which leads to an increase in the sensitivity of the detection method.
  • Amplification of the marker relates in particular to the amplification of nucleic acids, for example by PCR, NASBA, LCR, SDA, Qß replication or RT-PCR (Kessler, C. (1992) supra).
  • the signal amplification is achieved, for example, by so-called cross-linking of binding partners, antibody or nucleic acid trees (e.g. b-DNA), catalytic substrate conversion (e.g. alkaline phosphatase, peroxidase, ß-galactosidase) or signal cascades.
  • in vivo amplification e.g. B. Detection of r-RNA, indirect detection of antigens possible.
  • the markers can be divided into two classes. In the case of so-called positive markers, the absence of these markers is detected, e.g. B. about the lack of a signal. Positive markers generally refer to markers present in a healthy organism, e.g. m-RNA. Negative markers are generally the substances of a pathogen or a diseased organism which can be determined using the detection method according to the invention.
  • either two or more negative, two or more positive or two or more positive and negative markers can be detected.
  • Evidence is thus provided either about the occurrence or the absence of a signal.
  • a displacement of a signal e.g. by displacing a molecule from a complex or from its binding conformation (e.g. Molecular Beacons, S. Tyaki, Kramer FR, Nature Biotechnology 14, 303-308, 1996; RP Ekins. Clinical Chemistry, 44/9, 2015-2030 , 1998) in a competitive assay.
  • a substance is added to the test system which displaces one of the markers to be detected, whereby the molecular complex built up from markers and recognition species and thus also the signal associated therewith disappears.
  • the concentration of the displaced marker can thus be determined in a simple manner via a titration.
  • At least one marker is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and each further marker is a synthetic substance, natural product or derivative of a natural substance, preferably an antigen, which is different from a nucleic acid.
  • the first marker and each additional marker is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid or alternatively a synthetic substance other than a nucleic acid, a natural product or a natural product derivative, preferably an antigen.
  • a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid as a marker is recognized by a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid as a recognition species.
  • a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative is recognized as a recognition species by a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably by an antibody or an antibody derivative.
  • At least one recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and each further recognition species is a synthetic substance, different natural product or different natural product derivative different from a nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative.
  • the first recognition species and each further recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid or alternatively a synthetic substance, different natural product or different natural product derivative different from a nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative.
  • At least one recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and another natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
  • At least one recognition species is a hybrid of a synthetic substance, a natural substance or a natural substance derivative and another synthetic substance, another natural substance or another natural substance derivative.
  • At least one recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and a synthetic substance different from a nucleic acid, a different natural product or a different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
  • a first recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid
  • a second recognition species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
  • a first recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid
  • a second recognition species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and another natural or non-natural single-stranded or double-stranded Nucleic acid
  • the third recognition species is another natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
  • a first recognition species is a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative, a second
  • the recognition species is a hybrid of a synthetic substance, a natural substance or a natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative, and another synthetic substance another natural product or another natural product derivative, preferably another antibody or antibody derivative, and a third recognition species is another synthetic substance, another natural product or another different natural product derivative, preferably another antibody or another antibody derivative.
  • Another object of the present invention is a test system containing at least two recognition species that recognize at least two different markers to form a complex, preferably the recognition species or markers already described above.
  • at least one recognition species is immobilized on a support, as preferably described above.
  • At least one recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and at least one other recognition species is another natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
  • At least one recognition species is a synthetic substance, a different natural product or a different natural product derivative different from a nucleic acid, preferably an antibody or antibody derivative, and at least one other recognition species is another synthetic substance, different natural product or different from a nucleic acid various natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
  • At least one recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and one of one Nucleic acid different synthetic substance, different natural product or different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
  • At least one recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and another natural or unnatural single-stranded or double-stranded nucleic acid.
  • At least one recognition species is a hybrid of a synthetic substance different from a nucleic acid, different natural product or different
  • Natural product derivative preferably an antibody or antibody derivative and another synthetic substance different from a nucleic acid, different natural product or different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
  • test system according to the invention can be produced, for example, by assembling the recognition species necessary for the individual embodiments. or that at least one recognition species is immobilized on a support, as already preferably described above, according to methods generally known to the person skilled in the art.
  • the test system according to the invention can be used in the detection method according to the invention. as described in more detail above.
  • it serves to detect the presence and / or absence of at least two different markers in a sample.
  • It is preferably in the form of a diagnostic agent or an analyte. It is therefore used in particular for the detection of diseases or for environmental analysis, in particular for the detection of toxins and / or allergens.
  • FIG. 1 schematically shows the detection of two analytes (A and B) in an assay in the immobilized embodiment.
  • FIG 2 schematically shows the detection of two analytes (antigens A and B) in an assay in the immobilized embodiment.
  • FIG 3 schematically shows the detection of two analytes (nucleic acid A and B) in an assay in the immobilized embodiment.
  • Example 4 schematically shows the complex of markers and recognition species according to Example 1.
  • the reagents required for the example such as Texas-Red® labeled oligonucleotide conjugate (24-mer DNA; from Interactiva; DNA 1), a biotinylated oligonucleotide conjugate (24-mer DNA; from Interactiva; DNA 3); a synthetic oligonucleotide (57-mer DNA; Interepteptavidin-conjugated anti-human IgG F (ab ') 2 (goat; Rockland) and a fluorescein labeled human IgG F (ab ') 2 fragment (Rockland) as antigen, are all commercially available
  • DNA 2 5'-ATT-GTC-ATA-ATC-ATC-TTG-AGA-CGC-TTT-TTT-TTT- TTT-ACA-TCA-CGA-CGA-CAT-GCA-TTT-3 '
  • the supernatant solution was pipetted off and the carrier was washed 5 times with 500 ⁇ l 0.9% NaCl solution.
  • 200 ⁇ l of a solution of 200 ⁇ l streptavidin-anti-human-IgG F (ab ') 2 (goat) solution (1.6 mg / ml) and 40 ⁇ l of the fluorescein-labeled solution, preincubated at RT for 2 h, were then added IgG F (ab ') 2 - fragment solution (5.0 mg / ml) and allowed to incubate for 1-2 h at RT.
  • the supernatant solution was again pipetted off and the carrier was washed 5 times with 500 ⁇ l 0.9% NaCl solution.
  • the formation of the complex was verified by measuring the fluorescence of the fluorescein ( ⁇ ma v 494 nm, ⁇ max E : 525 nm).
  • DNA 2 5'-ATT-GTC-ATA-ATC-ATC-TTG-AGA-CGC-TTT-TTT-TTT- TTT-ACA-TCA-CGA-CGA-CAT-GCA-TTT-3 ' (marker 1)
  • Antibody streptavidin-conjugated anti-human IgG F (ab ') (goat)

Abstract

The invention relates to a test system containing at least two detection species, which detect at least two different markers by forming a complex. The invention also relates to the production of said test system and to its use in a suitable detection method.

Description

Testsystem zur Erkennung verschiedener Marker, seine Herstellung sowie Verwendung Test system for the detection of different markers, its production and use
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem enthaltend mindestens zwei Erkennungs- spezien. die mindestens zwei verschiedene Marker unter Ausbildung eines Komplexes erken- nen. seine Herstellung sowie Verwendung in einem geeigneten Nachweisverfahren.The present invention relates to a test system containing at least two detection species. recognize the at least two different markers to form a complex. its manufacture and use in a suitable detection method.
Die Anwendungsbereiche von Testsystemen, wie z. B. Diagnostika, sind in der Biologie, Biochemie. Medizin und Pharmakologie weit verbreitet. Vor allem in der Medizin ist eine zuverlässige und eindeutige Diagnose von Krankheiten, wie z. B. virale Infektionen oder Krebs. von außerordentlicher Wichtigkeit zur Steigerung der Lebensqualität, da nur durch ein frühzeitiges Erkennen einer Krankheit eine rechtzeitige und effektive Behandlung erfolgen kann. Basierend auf der Erkennung krankheitsspezifischer Marker bzw. Liganden, wie z. B. Nu- kleinsäuresequenzen, Proteine oder Antigene, wird der Erreger oder die Krankheit in der biologischen Probe nachgewiesen. Weit verbreitet sind Diagnostiktests, in denen jeweils ein Marker oder eine Klasse von Markern nachgewiesen wird, wie z. B. bei ELISA oder bei Am- plifizierungsmethoden, wie PCR, b-DNA, Southern-, Western- oder Northern-Blotting. Die verwendeten Detektionsarten reichen von einfachen Färbungsmethoden und kalorimetrischen Methoden über Fluoreszenz-Energy-Transfer (FRET) und Fluoreszenz-Quenching bis zum Scintillation Proximity Assay (SPA).The application areas of test systems, such as. B. Diagnostics are in biology, biochemistry. Medicine and pharmacology widely used. Especially in medicine, a reliable and clear diagnosis of diseases, such as B. viral infections or cancer. of extraordinary importance for increasing the quality of life, because timely and effective treatment can only be achieved by early detection of an illness. Based on the detection of disease-specific markers or ligands, such as B. nucleic acid sequences, proteins or antigens, the pathogen or the disease is detected in the biological sample. Diagnostic tests are widespread, in which a marker or a class of markers is detected, such as. B. in ELISA or amplification methods such as PCR, b-DNA, Southern, Western or Northern blotting. The types of detection used range from simple staining methods and calorimetric methods to fluorescence energy transfer (FRET) and fluorescence quenching to scintillation proximity assay (SPA).
Ein wesentlicher Nachteil bei der Verwendung von nur einem Marker bzw. einer Markerklasse ist, daß leicht fälschlicherweise positive Testergebnisse entstehen, die auch zu falschen Rückschlüssen bezüglich einer bestimmten Krankheit führen. Oftmals muß daher ein zweiter Test oder noch weitere Tests auf den gleichen oder komplimentären Analyten durchgeführt werden, um eine zuverlässige Aussage bezüglich krank/gesund treffen zu können. Dies führt zu mehreren Tests, deren Ergebnisse miteinander zu vergleichen sind, was zugleich aufwendig und kostenintensiv ist.A major disadvantage when using only one marker or one marker class is that positive test results are easily erroneously produced, which also lead to incorrect conclusions regarding a specific disease. Often, therefore, a second Test or other tests on the same or complementary analytes are carried out in order to be able to make a reliable statement regarding ill / healthy. This leads to several tests, the results of which can be compared with one another, which is at the same time complex and cost-intensive.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, qualitativ bessere, weniger aufwendigere und kostengünstigere Analytentests als die bereits bekannten zu entwickeln.The object of the present invention is therefore to develop qualitatively better, less complex and less expensive analytical tests than those already known.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Verknüpfung von zwei oder mehreren Testergebnissen auf molekularer Ebene im Sinne der Boofschen Verkettung einen qualitativ sehr guten, einfachen und kostengünstigen Analytentest erlaubt, wobei sich die verschiedenen Testergebnisse untereinander nicht im wesentlichen stören.Surprisingly, it has now been found that the linking of two or more test results at the molecular level in the sense of the Boof chaining allows a qualitatively very good, simple and inexpensive analyte test, the various test results not essentially interfering with one another.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Nachweisverfahren enthaltend folgende Schritte: (a) Behandlung einer Probe enthaltend einen ersten und einen zweiten Marker mit einer ersten Erkennungsspezie. die den ersten Marker erkennt,The invention therefore relates to a detection method comprising the following steps: (a) Treatment of a sample containing a first and a second marker with a first recognition species. that recognizes the first marker,
(b) Behandlung der Probe mit einer zweiten Erkennungsspezie, die sowohl den ersten Marker, wie auch den zweiten Marker erkennt,(b) treating the sample with a second recognition species that recognizes both the first marker and the second marker,
(c) Behandlung der Probe mit einer dritten Erkennungsspezie, die den zweiten Marker erkennt,(c) treating the sample with a third recognition species that recognizes the second marker,
(d) Nachweis von Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes aus den genannten Erkennungsspezien und Markern.(d) Detection of the presence or absence of a complex from the above-mentioned recognition species and markers.
Des Weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Nach weis verfahren enthaltend folgende Schritte:The present invention furthermore relates to a detection method comprising the following steps:
(a) Behandlung einer Probe enthaltend einen ersten und einen zweiten Marker mit einer ersten Erkennungsspezie, die den ersten Marker erkennt,(a) treatment of a sample containing a first and a second marker with a first recognition species that recognizes the first marker,
(b) Behandlung der Probe mit einer zweiten Erkennungsspezie, die den ersten Marker, und eine dritte Erkennungsspezie erkennt, (c) Behandlung der Probe mit einer dritten Erkennungsspezie, die den zweiten Marker und die zweite Erkennungsspezie erkennt,(b) treating the sample with a second recognition species that recognizes the first marker and a third recognition species, (c) treating the sample with a third recognition species which recognizes the second marker and the second recognition species,
(d) Nachweis von Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes aus den genannten Erkennungsspezien und Markern.(d) Detection of the presence or absence of a complex from the above-mentioned recognition species and markers.
Zur Erhöhung der Spezifität ist es in einer weiteren Ausführungsform vorteilhaft, daß weitere Erkennungsspezien, die weitere Marker erkennen, in weiteren Behandlungsschritten eingesetzt werden, was bei einer Erweiterung auf n-Liganden mit n gleich eine natürliche Zahl n + 1 Erkennungsspezien zur Folge hat.To increase the specificity, it is advantageous in a further embodiment that further recognition species which recognize further markers are used in further treatment steps, which, when expanded to n ligands with n equal to, results in a natural number n + 1 recognition species.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird das Nachweisverfahren in homogener, teilhomogener (modularer) oder immobilisierter Form durchgeführt. Bei einer homogenen Ausführungsform werden schrittweise die Bindungsereignisse erzeugt und der sich eventuell gebildete Komplex in einem sogenannten Proximity Assay nachgewiesen. Dabei werden die erste und die letzte Komponente vorzugsweise so markiert, daß sie nur bei gegenseitiger Nähe ein Signal erzeugen können. Bevorzugte Detektionsverfahren sind z. B. LOCI (Ullmann, E. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 5426), Fluoreszenz-Energy-Transfer (FRET) Car- dullo. R.A. (1992) in „Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules'*, 414-423. Springer Verlag), Fluoreszenz-Quenching (Ladokhin, A.S. (1997) „Distribution analysis of depth-dependent fluorescence quenching in membranes: a practical guide"'. Methods- Enzymol., 278, 462-473) oder Scintillation Proximity Assay (SPA) (Picardo, M. & Hughes, K.T. (1997) „Scintillation proximity assays. High Throughput Screening"; Ed. Devlin, J. P.; Verlag Dekker, New York, N.Y., 307-316).In further preferred embodiments, the detection method is carried out in a homogeneous, partially homogeneous (modular) or immobilized form. In a homogeneous embodiment, the binding events are generated step by step and the complex that may be formed is detected in a so-called proximity assay. The first and last components are preferably marked so that they can only generate a signal when they are close together. Preferred detection methods are e.g. B. LOCI (Ullmann, E. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426), Fluorescence Energy Transfer (FRET) Cordullo. RA (1992) in Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules' * , 414-423. Springer Verlag), fluorescence quenching (Ladokhin, AS (1997) "Distribution analysis of depth-dependent fluorescence quenching in membranes: a practical guide"'. Methods- Enzymol., 278, 462-473) or Scintillation Proximity Assay (SPA) (Picardo, M. & Hughes, KT (1997) "Scintillation proximity assays. High Throughput Screening"; Ed. Devlin, JP; Verlag Dekker, New York, NY, 307-316).
Bei einer teilhomogenen oder modularen Ausführungsform werden die Bindungsereignisse schrittweise und in Lösung erzeugt, und, sobald der Komplex sich ausgebildet hat, über eine der Komponenten an einen festen Träger gebunden. Der sich bildende Komplex wird durch eine Markierung, insbesondere eine nicht-radioaktive Markierung oder radioaktive Markierung, vorzugsweise über eine Fluoreszenzmarkierung, enzymatische Markierung, Redoxmar- kierung oder Spinmarkierung nachgewiesen (Kessler, C. (Ed.) Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules (1992), Springer Verlag, 414-423). Bei einer immobilisierten Ausführungsform wird eine Erkennungsspezie, vorzugsweise die erste Erkennungsspezie an einen festen Träger gebunden und nachfolgend durch schrittweise Zugabe der weiteren Komponenten der Komplex aufgebaut. Die Markierung erfolgt vorzugsweise nach gleichen oder ähnlichen Methoden wie bei der teilhomogenen Ausführungsform.In a partially homogeneous or modular embodiment, the binding events are generated step by step and in solution and, once the complex has formed, are bound to a solid support via one of the components. The complex which is formed is detected by a label, in particular a non-radioactive label or radioactive label, preferably by means of fluorescent labeling, enzymatic labeling, redox labeling or spin labeling (Kessler, C. (Ed.) Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules (1992 ), Springer Verlag, 414-423). In an immobilized embodiment, a recognition species, preferably the first recognition species, is bound to a solid support and the complex is subsequently built up by gradually adding the further components. The marking is preferably carried out according to the same or similar methods as in the partially homogeneous embodiment.
Als Träger für die Immobilisierung eignen sich vor allem festes oder gelartiges Material, insbesondere Chipmaterial und/oder dünne Schichten des Materials, vorzugsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien oder (bio)molekulare Filamente, insbesondere Zellulose oder Gerüstproteine.Solid or gel-like material, in particular chip material and / or thin layers of the material, preferably ceramic, metal, in particular noble metal, glasses, plastics, crystalline materials or (bio) molecular filaments, in particular cellulose or framework proteins, are particularly suitable as supports for the immobilization.
Die in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren eingesetzten Erkennungsspezien und/oder Marker sind insbesondere eine synthetische Substanz, ein Naturstoff und/oder ein Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Peptid, Peptoid, Protein, Saccharid oder eine Nukleinsäure. Beson- ders bevorzugt sind beispielsweise ein Rezeptor oder ein funktioneller Teil davon, insbesondere ein funktioneller Teil, der aus der extrazellulären Domäne eines membran-ständigen Rezeptors entstammt, ein Antikörper oder ein funktioneller Teil davon, insbesondere ein Fv- Fragment (Skerra & Plückthun (1988), Science 240, 1038), ein einzelkettiges Fv-Fragment (scFv; Bird et al. (1988), Science 242, 423; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85, 5879) oder ein Fab-Fragment (Better et al. (1988), Science 240, 1041), ein Aptamer, beispielsweise ein DNA- oder RNA-Aptamer oder Derivate davon, beispielsweise mit in der Nukleinsäurechemie üblichen Schutzgruppen versehene Aptamere, ein Zellbestandteil, insbesondere ein Lipid, Glykoprotein, Filamentbestandteil, Lektin, Liposom, Mitogen, Antigen. sekundärer Matabolit oder Hapten, eine Zelle, insbesondere eine lymphoide Zelle, oder ein Virus, insbesondere ein Virusbestandteil, vor allem ein Kapsid, oder ein Viroid oder ein Derivat, insbesondere ein Acetat, oder deren wirksame Teile, oder eine einzelsträngige oder dop- pelstängige Nukleinsäure, insbesondere DNA, RNA, p-RNA (Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta. (1993), 76, 2161; Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta. (1995), 78, 1621), p-DNA (DE 198 37 387.2), PNA (peptidische Nukleinsäure (Nielsen, P.E. et al. (1991) Science, 254, 1497), CNA (Aminocyclohexylnukleinsäure; PCT/EP98/06002) oder ein Aptamer (siehe z. B. Bock, L.C. et al. (1992) Nature, 355, 564) oder Hybride der genannten Substanzen. Gemäß der vorliegenden Erfindung zählen Aptamere aufgrund ihrer Bindungseigenschaften an spezifische von Nukleinsäuren unterschiedliche Moleküle, wie z. B. Proteine, nicht zu den Nukleinsäuren, sondern zu Antikörper-Derivaten. Bevorzugt sind DNA-Aptamere oder RNA-Aptamere.The recognition species and / or markers used in the detection method according to the invention are in particular a synthetic substance, a natural product and / or a natural product derivative, preferably a peptide, peptoid, protein, saccharide or a nucleic acid. Particularly preferred are, for example, a receptor or a functional part thereof, in particular a functional part originating from the extracellular domain of a membrane-standing receptor, an antibody or a functional part thereof, in particular an Fv fragment (Skerra & Plückthun (1988 ), Science 240, 1038), a single chain Fv fragment (scFv; Bird et al. (1988), Science 242, 423; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) or a Fab fragment (Better et al. (1988), Science 240, 1041), an aptamer, for example a DNA or RNA aptamer or derivatives thereof, for example aptamers provided with protective groups customary in nucleic acid chemistry, a cell component, in particular a Lipid, glycoprotein, filament component, lectin, liposome, mitogen, antigen. secondary matabolite or hapten, a cell, in particular a lymphoid cell, or a virus, in particular a virus component, in particular a capsid, or a viroid or a derivative, in particular an acetate, or its active parts, or a single-stranded or double-stranded nucleic acid , in particular DNA, RNA, p-RNA (Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta. (1993), 76, 2161; Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta. (1995), 78, 1621), p-DNA (DE 198 37 387.2), PNA (peptide nucleic acid (Nielsen, PE et al. (1991) Science, 254, 1497), CNA (aminocyclohexyl nucleic acid; PCT / EP98 / 06002) or an aptamer ( see e.g. Bock, LC et al. (1992) Nature, 355, 564) or hybrids of the substances mentioned. According to the present invention, aptamers count due to their binding properties to specific molecules other than nucleic acids, such as. B. proteins, not to the nucleic acids, but to antibody derivatives. DNA aptamers or RNA aptamers are preferred.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren einschließlich Aptamere können auch modifiziert sein. Hierzu sind die dem Fachmann aus der Nukleinsäurechemie bekannten Methoden anwendbar. Bevorzugt sind Modifikationen, die zu einer Stabilisierung der Nukleinsäuren führen (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90. 543, No. 4).The nucleic acids according to the invention, including aptamers, can also be modified. The methods known to the person skilled in the art from nucleic acid chemistry can be used for this purpose. Modifications which lead to stabilization of the nucleic acids are preferred (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4).
Üblicherweise erfolgt die Erkennung eines Markers durch eine Erkennungsspezie über nicht- kovalente Wechselwirkungen, insbesondere über Wasserstoffbrücken, Salzbrücken. Stapelungen, Metalligandierungen, Charge-Transfer-Komplexe, Van-der-Waals-Kräfte oder hydrophobe Wechselwirkungen. Beispielsweise wird eine Nukleinsäure als Marker durch eine voll- ständig oder teilweise komplementäre Nukleinsäure erkannt oder eine synthetische Substanz, wie z. B. eine Chemikalie, ein Naturstoff und/oder ein Naturstoffderivat als antigene Stoffe werden von einem entsprechenden Antikörper oder Antikörper-Derivat erkannt. Gemäß dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren können die Marker jeder beliebigen Substanzklasse angehören, vorzugsweise jedoch aus mindestens zwei verschiedenen.A marker is usually recognized by a recognition species via non-covalent interactions, in particular via hydrogen bridges, salt bridges. Stacking, metal lining, charge transfer complexes, Van der Waals forces or hydrophobic interactions. For example, a nucleic acid is recognized as a marker by a completely or partially complementary nucleic acid or a synthetic substance, such as. B. a chemical, a natural product and / or a natural product derivative as antigenic substances are recognized by a corresponding antibody or antibody derivative. According to the detection method according to the invention, the markers can belong to any substance class, but preferably from at least two different ones.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren ist des Weiteren mindestens eine Erkennungsspezie markiert, vorzugsweise sind alle Erkennungsspezien markiert, vor allem sind mindestens zwei Erkennungsspezien unterschiedlich markiert. Wie bereits oben näher erläutert, kann die Markierung je nachdem ob es sich um eine homogene, teilhomogene (modulare) oder immobilisierte Ausführungsform handelt, nicht-radioaktiv oder radioaktiv sein, vorzugsweise LOCI, FRET. Fluoreszenz-Quenching, SPA, eine Fluoreszenzmarkierung, enzy- matische Markierung, Redoxmarkierung oder Spin-Markierung.According to the detection method according to the invention, at least one recognition species is also marked, preferably all recognition species are marked, and above all at least two recognition species are marked differently. As already explained in more detail above, the marking can, depending on whether it is a homogeneous, partially homogeneous (modular) or immobilized embodiment, be non-radioactive or radioactive, preferably LOCI, FRET. Fluorescence quenching, SPA, a fluorescent label, enzymatic label, redox label or spin label.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der Marker und/oder das Signal ampli- fiziert werden, was zu einer Erhöhung der Sensitivität des Nach weis Verfahrens führt. DieIn a further preferred embodiment, the marker and / or the signal can be amplified, which leads to an increase in the sensitivity of the detection method. The
Amplifizierung des Markers betrifft insbesondere die Amplifizierung von Nukleinsäuren, beispielsweise durch PCR, NASBA, LCR, SDA, Qß-Replikation oder RT-PCR (Kessler, C. (1992) supra). Die Signalamplifizierung wird beispielsweise durch sog. Cross-Linking von Bindungspartnern, Antikörper- oder Nukleinsäure-Bäumen (z. B. b-DNA), katalytische Substratumsetzung (z. B. alkalische Phosphatase, Peroxidase, ß-Galaktosidase) oder Signalkaskaden erreicht.Amplification of the marker relates in particular to the amplification of nucleic acids, for example by PCR, NASBA, LCR, SDA, Qß replication or RT-PCR (Kessler, C. (1992) supra). The signal amplification is achieved, for example, by so-called cross-linking of binding partners, antibody or nucleic acid trees (e.g. b-DNA), catalytic substrate conversion (e.g. alkaline phosphatase, peroxidase, ß-galactosidase) or signal cascades.
Neben der genannten in vitro Amplifizierung ist auch eine in vivo Amplifizierung, z. B. De- tektion von r-RNA, indirekte Detektion von Antigenen, möglich.In addition to the in vitro amplification mentioned, in vivo amplification, e.g. B. Detection of r-RNA, indirect detection of antigens possible.
Grundsätzlich kann man die Marker in zwei Klassen aufteilen. Bei sog. Positivmarkern wird das Fehlen dieser Marker nachgewiesen, z. B. über das Fehlen eines Signals. Positive Marker beziehen sich im allgemeinen auf in einem gesunden Organismus vorhandene Marker, z.B. m-RNA. Als negative Marker werden im allgemeinen die Substanzen eines Pathogens oder eines kranken Organismus bezeichnet, der über das erfindungsgemäße Nachweisverfahren bestimmt werden kann.Basically, the markers can be divided into two classes. In the case of so-called positive markers, the absence of these markers is detected, e.g. B. about the lack of a signal. Positive markers generally refer to markers present in a healthy organism, e.g. m-RNA. Negative markers are generally the substances of a pathogen or a diseased organism which can be determined using the detection method according to the invention.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren können entweder zwei oder mehrere negative, zwei oder mehrere positive oder zwei oder mehrere positive und negative Marker nachgewiesen werden. Der Nachweis erfolgt somit entweder über das Auftreten oder über das Fehlen eines Signals. Ebenso ist eine Verdrängung eines Signals z.B. durch das Verdrängen eines Moleküls aus einem Komplex oder aus seiner bindenden Konformation (z.B. Molecular Beacons, S. Tyaki, Kramer F. R., Nature Biotechnology 14, 303-308, 1996; R.P. Ekins. Clini- cal Chemistry, 44/9, 2015-2030, 1998) in einem kompetitiven Assay möglich. Hierzu wird eine Substanz dem Testsystem zugegeben, die einen der nachzuweisenden Marker verdrängt, wobei der aus Markern und Erkennungsspezien aufgebaute Molekülkomplex und damit auch das damit verbundene Signal verschwindet. Über eine Titration läßt sich somit auf einfache Art und Weise die Konzentration des verdrängten Markers bestimmen.According to the detection method according to the invention, either two or more negative, two or more positive or two or more positive and negative markers can be detected. Evidence is thus provided either about the occurrence or the absence of a signal. Also a displacement of a signal e.g. by displacing a molecule from a complex or from its binding conformation (e.g. Molecular Beacons, S. Tyaki, Kramer FR, Nature Biotechnology 14, 303-308, 1996; RP Ekins. Clinical Chemistry, 44/9, 2015-2030 , 1998) in a competitive assay. For this purpose, a substance is added to the test system which displaces one of the markers to be detected, whereby the molecular complex built up from markers and recognition species and thus also the signal associated therewith disappears. The concentration of the displaced marker can thus be determined in a simple manner via a titration.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann nun in mindestens einer der folgenden alternativen Ausführungsformen vorliegen, die besonders bevorzugt sind: 1. Mindestens ein Marker ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure und jedere weitere Marker ist eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, Naturstoff oder Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antigen.The detection method according to the invention can now be present in at least one of the following alternative embodiments, which are particularly preferred: 1. At least one marker is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and each further marker is a synthetic substance, natural product or derivative of a natural substance, preferably an antigen, which is different from a nucleic acid.
2. Der erste Marker und jeder weitere Marker ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure oder alternativ eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antigen.2. The first marker and each additional marker is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid or alternatively a synthetic substance other than a nucleic acid, a natural product or a natural product derivative, preferably an antigen.
3. Eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure als Marker wird von einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure als Erkennungsspezie erkannt.3. A natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid as a marker is recognized by a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid as a recognition species.
4. Eine synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat wird von einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat, vorzugsweise von einem Antikörper oder einem Antikörper-Derivat als Erkennungsspezie erkannt.4. A synthetic substance, a natural product or a natural product derivative is recognized as a recognition species by a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably by an antibody or an antibody derivative.
5. Mindestens eine Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzel- strängige oder doppelsträngige Nukleinsäure und jede weitere Erkennungsspezie ist eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder ein Antikörper-Derivat.5. At least one recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and each further recognition species is a synthetic substance, different natural product or different natural product derivative different from a nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative.
6. Die erste Erkennungsspezie und jede weitere Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelstränge oder doppelsträngige Nukleinsäure oder alternativ eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder ein Antikörper-Derivat. 7. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nichtnatürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure.6. The first recognition species and each further recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid or alternatively a synthetic substance, different natural product or different natural product derivative different from a nucleic acid, preferably an antibody or an antibody derivative. 7. At least one recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and another natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
8. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat und einer anderen synthetischen Substanz, einem anderen Naturstoff oder einem anderen Naturstoffderivat.8. At least one recognition species is a hybrid of a synthetic substance, a natural substance or a natural substance derivative and another synthetic substance, another natural substance or another natural substance derivative.
9. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nichtnatürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, einem verschiedenen Naturstoff oder einem verschiedenen Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat.9. At least one recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and a synthetic substance different from a nucleic acid, a different natural product or a different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
10. Eine erste Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure, eine zweite Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoff- derivat, vorzugsweise einem Antikörper oder Antikörper-Derivat.10. A first recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, a second recognition species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
1 1. Eine erste Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure, eine zweite Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nu- kleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure, und die dritte Erkennungsspezie ist eine weitere andere natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure.1 1. A first recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, a second recognition species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and another natural or non-natural single-stranded or double-stranded Nucleic acid, and the third recognition species is another natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
12. Eine erste Erkennungsspezie ist eine synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat, eine zweite12. A first recognition species is a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative, a second
Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat, vorzugsweise einem Antikörper oder Antikörper- Derivat, und einer anderen synthetischen Substanz einem anderen Naturstoff oder einem anderen Naturstoffderivat, vorzugsweise einem anderen Antikörper oder Antikörper-Derivat, und eine dritte Erkennungsspezie ist eine weitere andere synthetische Substanz, ein weiterer anderer Naturstoff oder ein weiteres anderes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein weiterer anderer Antikörper oder ein weiteres anderes Antikörper- Derivat.The recognition species is a hybrid of a synthetic substance, a natural substance or a natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative, and another synthetic substance another natural product or another natural product derivative, preferably another antibody or antibody derivative, and a third recognition species is another synthetic substance, another natural product or another different natural product derivative, preferably another antibody or another antibody derivative.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testsystem enthaltend mindestens zwei Erkennungsspezien, die mindestens zwei verschiedene Marker unter Ausbildung eines Komplexes erkennen, vorzugsweise die oben bereits beschriebenen Erkennungsspezien bzw. Marker. In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eine Erkennungsspezie an einen Träger, wie vorzugsweise oben bereits näher beschrieben, immoblisiert.Another object of the present invention is a test system containing at least two recognition species that recognize at least two different markers to form a complex, preferably the recognition species or markers already described above. In a preferred embodiment, at least one recognition species is immobilized on a support, as preferably described above.
Das erfindungsgemäße Testsystem kann in folgenden bevorzugten Ausführungsformen eingesetzt werden:The test system according to the invention can be used in the following preferred embodiments:
1. Mindestens eine Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure und mindestens eine andere Erkennungs- spezie ist eine andere natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure.1. At least one recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and at least one other recognition species is another natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
2. Mindestens eine Erkennungsspezie ist eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Naturstoffde- rivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat, und mindestens eine andere Erkennungsspezie ist eine andere von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat.2. At least one recognition species is a synthetic substance, a different natural product or a different natural product derivative different from a nucleic acid, preferably an antibody or antibody derivative, and at least one other recognition species is another synthetic substance, different natural product or different from a nucleic acid various natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
3. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nichtnatürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörperderivat.3. At least one recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and one of one Nucleic acid different synthetic substance, different natural product or different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
4. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nichtnatürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure.4. At least one recognition species is a hybrid of a natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and another natural or unnatural single-stranded or double-stranded nucleic acid.
5. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz verschiedener Naturstoff oder verschiedenes5. At least one recognition species is a hybrid of a synthetic substance different from a nucleic acid, different natural product or different
Naturstoffderivat vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat und einer anderen von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat.Natural product derivative preferably an antibody or antibody derivative and another synthetic substance different from a nucleic acid, different natural product or different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
Das erfindungsgemäße Testsystem läßt sich beispielsweise dadurch herstellen, daß die für die einzelnen Ausführungsformen notwendigen Erkennungsspezien zusammengestellt werden. bzw. daß mindestens eine Erkennungsspezie an einen Träger, wie oben bereits vorzugsweise beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren immobilisiert wird.The test system according to the invention can be produced, for example, by assembling the recognition species necessary for the individual embodiments. or that at least one recognition species is immobilized on a support, as already preferably described above, according to methods generally known to the person skilled in the art.
Das erfindungsgemäße Testsystem läßt sich in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren. wie oben näher beschrieben, einsetzen. Insbesondere dient es zum Nachweis von An- und/oder Abwesenheit von mindestens zwei verschiedenen Markern in einer Probe. Vorzugsweise liegt es in Form eines Diagnostikums oder eines Analyten vor. Es dient daher ins- besondere für den Nachweis von Erkrankungen oder für die Umweltanalytik, insbesondere zum Nachweis von Toxinen und/oder Allergenen.The test system according to the invention can be used in the detection method according to the invention. as described in more detail above. In particular, it serves to detect the presence and / or absence of at least two different markers in a sample. It is preferably in the form of a diagnostic agent or an analyte. It is therefore used in particular for the detection of diseases or for environmental analysis, in particular for the detection of toxins and / or allergens.
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu beschränken. BESCHREIBUNG DER FIGURENThe following figures and examples are intended to describe the invention in more detail without restricting it. DESCRIPTION OF THE FIGURES
Fig. 1 zeigt schematisch den Nachweis von zwei Analyten (A und B) in einem Assay in der immobilisierten Ausführungsform.1 schematically shows the detection of two analytes (A and B) in an assay in the immobilized embodiment.
Fig. 2 zeigt schematisch den Nachweis von zwei Analyten (Antigene A und B) in einem Assay in der immobilisierten Ausführungsform.2 schematically shows the detection of two analytes (antigens A and B) in an assay in the immobilized embodiment.
Fig. 3 zeigt schematisch den Nachweis von zwei Analyten (Nukleinsäure A und B) in einem Assay in der immobilisierten Ausführungsform.3 schematically shows the detection of two analytes (nucleic acid A and B) in an assay in the immobilized embodiment.
Fig. 4 zeigt schematisch den Komplex aus Markern und Erkennungsspezien gemäß Beispiel 1.4 schematically shows the complex of markers and recognition species according to Example 1.
Fig. 5 zeigt schematisch den Komplex aus Markern und Erkennungsspezien gemäß Beispiel5 schematically shows the complex of markers and recognition species according to the example
2.Second
BEISPIELEEXAMPLES
Gleichzeitige Detektion einer Desoxyribonucleinsäure und eines markierten Antikörper- Antigens.Simultaneous detection of a deoxyribonucleic acid and a labeled antibody antigen.
Ausgangsverbindungen: Die für das Beispiel benötigten Reagenzien, wie Texas-Red® markiertes Oligonukleotidkon- jugat (24-mer DNA; Fa. Interactiva; DNA 1), ein biotinyliertes Oligonukleotidkonjugat (24- mer DNA; Fa. Interactiva; DNA 3); ein synthetisches Oligonukleotid (57-mer DNA; Fa. In- teraktiva; DNA 2), das zu den beiden anderen DNAs komplementäre Sequenzen besitzt, Streptavidin-konjugiertes anti-Human IgG F(ab')2 (Ziege; Fa. Rockland) und ein Fluorescein- markiertes human IgG F(ab')2-Fragment (Fa. Rockland) als Antigen, sind alle käuflich erhältlichStarting compounds: The reagents required for the example, such as Texas-Red® labeled oligonucleotide conjugate (24-mer DNA; from Interactiva; DNA 1), a biotinylated oligonucleotide conjugate (24-mer DNA; from Interactiva; DNA 3); a synthetic oligonucleotide (57-mer DNA; Interaktiva; DNA 2), which has sequences complementary to the other two DNAs, streptavidin-conjugated anti-human IgG F (ab ') 2 (goat; Rockland) and a fluorescein labeled human IgG F (ab ') 2 fragment (Rockland) as antigen, are all commercially available
Reagenz SpezifikationReagent specification
DNA 1 TexasRed-5 '-AAA-TGC-ATG-TCG-TCG-TGA-TGT-AAA-3 'DNA 1 TexasRed-5 ' -AAA-TGC-ATG-TCG-TCG-TGA-TGT-AAA-3'
(Erkennungsspezie 1)(Recognition species 1)
DNA 2 5'-ATT-GTC-ATA-ATC-ATC-TTG-AGA-CGC-TTT-TTT-TTT- TTT-ACA-TCA-CGA-CGA-CAT-GCA-TTT-3' DNA 2 5'-ATT-GTC-ATA-ATC-ATC-TTG-AGA-CGC-TTT-TTT-TTT- TTT-ACA-TCA-CGA-CGA-CAT-GCA-TTT-3 '
(Marker 1)(Marker 1)
DNA 3 Biotin-5 '-GCG-TCT-C AA-CAT-GAT-TAT-GAC-AAT-3 ' DNA 3 Biotin-5 ' -GCG-TCT-C AA-CAT-GAT-TAT-GAC-AAT-3 '
(Erkennungsspezie 2)(Detection Species 2)
Antikörper Streptavidin-konjugiertes anti-Human IgG F(ab,)2 (Ziege)Antibody streptavidin-conjugated anti-human IgG F (ab , ) 2 (goat)
(Erkennungsspezie 3)(Recognition species 3)
Antigen Fluorescein-markiertes Human IgG F(ab')2 FragmentAntigen fluorescein-labeled human IgG F (ab ' ) 2 fragment
(Marker 2) Tabelle 1 : verwendete Erkennungsspezien und Marker(Marker 2) Table 1: recognition species and markers used
Beispielexample
1 nmol TexasRed-markiertes Oligonucleotidkonjugat (DNA 1), 1 nmol Biotin-markiertes Oligonucleotidkonjugat (DNA 3) und 1 pmol des 57-meren Oligonucleotids (DNA 2 wurden in jeweils 150 μl Hybridisierungspuffer (5 x SSC, 0,02 % SDS) aufgenommen. Anschließend wurde für 30 min auf 60 °C erwärmt, miteinander vermischt und 3 h bei 37 °C inkubiert. Man ließ auf Raumtemperatur (RT) abkühlen, addierte 1 nmol des Streptavidin-anti-Human-IgG F(ab') -Konjugats und 1 nmol des Fluorescein-markierten IgG F(ab') -Fragments und ließ über Nacht bei RT stehen. Der sich bildende Komplex wurde durch eine gelbe Bande in einem nicht-denaturierenden Gel (15%-iges TEB-Gel, Fa. BioRad) nachgewiesen. Beispiel 2:1 nmol of TexasRed-labeled oligonucleotide conjugate (DNA 1), 1 nmol of biotin-labeled oligonucleotide conjugate (DNA 3) and 1 pmol of the 57-mer oligonucleotide (DNA 2 were each taken up in 150 μl hybridization buffer (5 × SSC, 0.02% SDS) The mixture was then heated to 60 ° C. for 30 min, mixed with one another and incubated for 3 h at 37 ° C. The mixture was allowed to cool to room temperature (RT), and 1 nmol of the streptavidin-anti-human-IgG F (ab ') conjugate was added and 1 nmol of the fluorescein-labeled IgG F (ab ') fragment and left to stand at RT overnight. The complex which formed was separated by a yellow band in a non-denaturing gel (15% TEB gel, from BioRad ) proven. Example 2:
1 nmol Biotin-markiertes Oligonucleotidkonjugat (DNA 1). 1 nmol Biotin-markiertes Oligonucleotidkonjugat (DNA 3) und 1 pmol des 57-meren Oligonucleotids (DNA 2) wurden in jeweils 150 μl Hybridisierungspuffer (5 x SSC, 0,02 % SDS) aufgenommen. Es wurde für 5 min auf 60 °C erwärmt, miteinander vermischt und 3 h bei 37 °C inkubiert. Man ließ auf Raumtemperatur (RT) abkühlen und gab die Lösung auf einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte (Fa. BIOTEZ, Best.-Nr. 040298920). Die überstehende Lösung wurde abpi- pettiert und der Träger 5x mit 500 μl 0,9 % NaCl-Lösung gewaschen. Nun addierte man 200 μl einer, bei RT für 2 h vorinkubierten Lösung aus 200 μl Streptavidin-anti-Human-IgG F(ab')2 (Ziege)-Lösung (1,6 mg/ml) und 40 μl des Fluorescein-markierten IgG F(ab')2- Fragment-Lösung (5,0 mg/ml) und ließ 1-2 h bei RT inkubieren. Die überstehende Lösung wurde wiederum abpipettiert und der Träger 5x mit 500 μl 0,9 % NaCl-Lösung gewaschen. Durch das Messen der Fluorescenz des Fluoresceins (λma v 494 nm, λmax E: 525 nm) wurde die Bildung des Komplexes nachgewiesen.1 nmol biotin-labeled oligonucleotide conjugate (DNA 1). 1 nmol of biotin-labeled oligonucleotide conjugate (DNA 3) and 1 pmol of the 57-mer oligonucleotide (DNA 2) were each taken up in 150 μl hybridization buffer (5 × SSC, 0.02% SDS). The mixture was heated to 60 ° C. for 5 min, mixed with one another and incubated at 37 ° C. for 3 h. The mixture was allowed to cool to room temperature (RT) and the solution was placed on a microtiter plate coated with streptavidin (BIOTEZ, order no. 040298920). The supernatant solution was pipetted off and the carrier was washed 5 times with 500 μl 0.9% NaCl solution. 200 μl of a solution of 200 μl streptavidin-anti-human-IgG F (ab ') 2 (goat) solution (1.6 mg / ml) and 40 μl of the fluorescein-labeled solution, preincubated at RT for 2 h, were then added IgG F (ab ') 2 - fragment solution (5.0 mg / ml) and allowed to incubate for 1-2 h at RT. The supernatant solution was again pipetted off and the carrier was washed 5 times with 500 μl 0.9% NaCl solution. The formation of the complex was verified by measuring the fluorescence of the fluorescein (λ ma v 494 nm, λ max E : 525 nm).
Reagenz SpezifikationReagent specification
DNA 1 ' Biotin-5 '-AAA-TGC-ATG-TCG-TCG-TGA-TGT-AAA-3 ' DNA 1 'Biotin-5 ' -AAA-TGC-ATG-TCG-TCG-TGA-TGT-AAA-3 '
(Erkennungsspezie 1 ')(Recognition species 1 ')
DNA 2 5'-ATT-GTC-ATA-ATC-ATC-TTG-AGA-CGC-TTT-TTT-TTT- TTT-ACA-TCA-CGA-CGA-CAT-GCA-TTT-3 ' (Marker 1)DNA 2 5'-ATT-GTC-ATA-ATC-ATC-TTG-AGA-CGC-TTT-TTT-TTT- TTT-ACA-TCA-CGA-CGA-CAT-GCA-TTT-3 ' (marker 1)
DNA 3 Biotin-5 '-GCG-TCT-CAA-CAT-GAT-TAT-GAC-AAT-3 ' DNA 3 Biotin-5 ' -GCG-TCT-CAA-CAT-GAT-TAT-GAC-AAT-3 '
(Erkennungsspezie 2)(Detection Species 2)
Antikörper Streptavidin-konjugiertes anti-Human IgG F(ab') (Ziege)Antibody streptavidin-conjugated anti-human IgG F (ab ') (goat)
(Erkennungsspezie 3)(Recognition species 3)
Antigen Fluorescein-markiertes Human IgG F(ab')2 Fragment (Marker 2)Antigen fluorescein-labeled human IgG F (ab ') 2 fragment (marker 2)
Tabelle 2: verwendete Erkennungsspezien und Marker Table 2: Detection species and markers used

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Patent claims
1. Nachweisverfahren enthaltend folgende Schritte:1. Verification procedure comprising the following steps:
(a) Behandlung einer Probe enthaltend einen ersten und einen zweiten Marker mit einer ersten Erkennungsspezie, die den ersten Marker erkennt, (b) Behandlung der Probe mit einer zweiten Erkennungsspezie, die sowohl den ersten(a) treatment of a sample containing a first and a second marker with a first recognition species that recognizes the first marker, (b) treatment of the sample with a second recognition species that both the first
Marker, wie auch den zweiten Marker erkennt,Marker, as the second marker recognizes,
(c) Behandlung der Probe mit einer dritten Erkennungsspezie, die den zweiten Marker erkennt,(c) treating the sample with a third recognition species that recognizes the second marker,
(d) Nachweis von Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes aus den genannten Erkennungsspezien und Markern.(d) Detection of the presence or absence of a complex from the above-mentioned recognition species and markers.
2. Nachweisverfahren enthaltend folgende Schritte:2. Verification procedure comprising the following steps:
(a) Behandlung einer Probe enthaltend einen ersten und einen zweiten Marker mit einer ersten Erkennungsspezie, die den ersten Marker erkennt, (b) Behandlung der Probe mit einer zweiten Erkennungsspezie, die den ersten Marker. und eine dritte Erkennungsspezie erkennt,(a) treatment of a sample containing a first and a second marker with a first recognition species that recognizes the first marker, (b) treatment of the sample with a second recognition species that recognizes the first marker. and recognizes a third recognition species
(c) Behandlung der Probe mit einer dritten Erkennungsspezie, die den zweiten Marker und die zweite Erkennungsspezie erkennt,(c) treating the sample with a third recognition species which recognizes the second marker and the second recognition species,
(d) Nachweis von Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes aus den genannten Erkennungsspezien und Markern.(d) Detection of the presence or absence of a complex from the above-mentioned recognition species and markers.
3. Nachweisverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß weitere Erkennungsspezien, die weitere Marker erkennen, in weiteren Behandlungsschritten eingesetzt werden. 3. Detection method according to claim 1 or 2, characterized in that further recognition species that recognize further markers are used in further treatment steps.
4. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Erkennungsspezie, vorzugsweise die erste Erkennungsspezie, an einen Träger immobilisiert wird.4. Detection method according to one of claims 1-3, characterized in that a recognition species, preferably the first recognition species, is immobilized on a carrier.
5. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ausgewählt ist aus einem festen oder gelartigem Material, insbesondere Chipmaterial und/oder dünne Schichten des Materials, vorzugsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall. Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien oder (bio)molekulare Filamente, insbesondere Cellulose oder Gerüstproteine.5. Detection method according to claim 4, characterized in that the carrier is selected from a solid or gel-like material, in particular chip material and / or thin layers of the material, preferably ceramic, metal, in particular noble metal. Glasses, plastics, crystalline materials or (bio) molecular filaments, in particular cellulose or framework proteins.
6. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Erkennungsspezie und/oder der Marker eine synthetische Substanz, ein Naturstoff und/oder ein Naturstoffderivat ist, vorzugsweise ausgewählt aus einem Peptid, Peptoid. Protein, Saccharid oder einer Nukleinsäure.6. Detection method according to one of claims 1-5, characterized in that said recognition species and / or the marker is a synthetic substance, a natural product and / or a natural product derivative, preferably selected from a peptide, peptoid. Protein, saccharide or a nucleic acid.
7. Nachweisverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat ausgewählt ist aus einem Rezeptor oder einem funktionellen Teil davon, insbesondere aus der extrazellulären Domäne eines Membran-ständigen Rezeptors, einem Antikörper oder einem funktionellen Teil davon, insbesondere einem Fv-Fragment, einem einzelkettiges Fv-Fragment (scFv) oder einem Fab-Fragment, einem Zellbestandteil, insbesondere einem Lipid, Glykoprotein, Fila- mentbestandteil, Lectin, Liposom, Mitogen, Antigen, sekundärer Metabolit oder Hapten, einer Zelle, insbesondere einer lymphoide Zelle, oder einem Virus, insbesondere einem Virusbestandteil, vor allem einem Kapsid, oder einem Viroid, oder einem Derivat, insbesondere einem Acetat, oder deren wirksame Teile, oder einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure, insbesondere eine natürliche Nukleinsäure in Form einer DNA oder RNA oder eine nicht-natürliche Nukleinsäure, vorzugsweise p-RNA, p-DNA, PNA oder CNA, oder Hybriden der genannten Substanzen.7. Detection method according to claim 6, characterized in that the synthetic substance, a natural product or a natural product derivative is selected from a receptor or a functional part thereof, in particular from the extracellular domain of a membrane-based receptor, an antibody or a functional part thereof, in particular an Fv fragment, a single-chain Fv fragment (scFv) or a Fab fragment, a cell component, in particular a lipid, glycoprotein, filament component, lectin, liposome, mitogen, antigen, secondary metabolite or hapten, a cell, in particular a lymphoid cell, or a virus, in particular a virus component, especially a capsid, or a viroid, or a derivative, in particular an acetate, or its active parts, or a single-stranded or double-stranded nucleic acid, in particular a natural nucleic acid in the form of a DNA or RNA or a non-natural nucleic acid, preferably p-RNA, p-DNA, PNA or CNA, or hybrids of the substances mentioned.
8. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennung eines Markers durch eine Erkennungsspezie über nicht-kovalente Wechselwir- kungen erfolgt, insbesondere über Wasserstoffbrücken, Salzbrücken, Stapelungen, Me- talligandierungen, Charge-Transfer-Komplexe, Van-der-Waals-Kräfte oder hydrophobe Wechselwirkungen.8. Detection method according to one of claims 1-7, characterized in that the recognition of a marker by a recognition species via non-covalent interactions kung occurs, in particular via hydrogen bridges, salt bridges, stacking, metal ligations, charge transfer complexes, Van der Waals forces or hydrophobic interactions.
9. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie markiert ist, insbesondere sind alle Erkennungsspezien markiert, vorzugsweise sind mindestens zwei Erkennungsspezien unterschiedlich markiert.9. Detection method according to one of claims 1-8, characterized in that at least one recognition species is marked, in particular all recognition species are marked, preferably at least two recognition species are marked differently.
10. Nachweisverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine nicht-radioaktive Markierung oder radioaktive Markierung, vorzugsweise eine LOCI-10. Detection method according to claim 9, characterized in that the marking is a non-radioactive marking or radioactive marking, preferably a LOCI-
Markierung, FRET-Markierung, Fluoreszenz-Quenching-Markierung, SPA-Markierung. Fluoreszenzmarkierung, enzymatische Markierung, Redoxmarkierung oder Spinmarkierung ist.Labeling, FRET labeling, fluorescence quenching labeling, SPA labeling. Is fluorescent labeling, enzymatic labeling, redox labeling or spin labeling.
1 1. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker und/oder das Signal amplifiziert wird.1 1. Detection method according to any one of claims 1-10, characterized in that the marker and / or the signal is amplified.
12. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 -1 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis gemäß Schritt (d) des Verfahrens kompetitiv erfolgt.12. Detection method according to one of claims 1 -1 1, characterized in that the detection according to step (d) of the method is carried out competitively.
13. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Marker eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure und jeder weitere Marker eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Natur- stoffderivat, vorzugsweise ein Antigen ist.13. Detection method according to any one of claims 1-12, characterized in that at least one marker is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and each further marker is a synthetic substance different from a nucleic acid, a different natural product or a different natural product derivative , preferably an antigen.
14. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Marker und jeder weitere Marker eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure oder alternativ eine von einer natürlichen Nu- kleinsäure verschiedene synthetische Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antigen ist. 14. Detection method according to any one of claims 1-12, characterized in that the first marker and each further marker is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid or alternatively a synthetic substance, a different natural product or different from a natural nucleic acid is a different natural product derivative, preferably an antigen.
15. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure als Marker von einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträn- gigen Nukleinsäure als Erkennungsspezie erkannt wird.15. Detection method according to any one of claims 1-14, characterized in that a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid is recognized as a marker by a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid as a recognition species.
16. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß eine synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat von einer synthtischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat, vorzugsweise von einem Anti- körper oder einem Antikörperderivat als Erkennungsspezie erkannt wird.16. Detection method according to any one of claims 1-15, characterized in that a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative is recognized as a recognition species by a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably by an antibody or an antibody derivative.
17. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure und jede weitere Erkennungsspezie eine von einer Nu- kleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.17. Detection method according to any one of claims 1-16, characterized in that at least one detection species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and each further detection species is preferably a synthetic substance, different natural substance or different natural substance derivative different from a nucleic acid is an antibody or antibody derivative.
18. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Erkennungsspezie und jede weitere Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht- natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure oder alternativ eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.18. Detection method according to any one of claims 1-16, characterized in that the first recognition species and each further recognition species, preferably a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid or alternatively a synthetic substance different from a nucleic acid, different natural product or different natural product derivative is an antibody or antibody derivative.
19. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß min- destens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure ist.19. Detection method according to any one of claims 1-16, characterized in that at least one recognition species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and another natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
20. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß min- destens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer synthetische Substanz, einem Natur- stoff oder einem Naturstoffderivat und einer anderen synthetischen Substanz, einem anderen Naturstoff oder einem anderen Naturstoffderivat ist.20. Detection method according to one of claims 1-16, characterized in that at least one recognition species is a hybrid of a synthetic substance, a natural substance or a natural product derivative and another synthetic substance, another natural product or another natural product derivative.
21. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, einem verschiedenen Naturstoff oder einem verschiedenen Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.21. Detection method according to any one of claims 1-16, characterized in that at least one recognition species, preferably a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and a synthetic substance different from a nucleic acid, a different natural product or a different natural product derivative is an antibody or antibody derivative.
22. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure ist, eine zweite Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat, vorzugs- weise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist22. Detection method according to any one of claims 1-16, characterized in that a first recognition species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, a second detection species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and one synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative
23. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure ist, eine zweite Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürli- chen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure ist, und die dritte Erkennungsspezie eine weitere andere natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure ist.23. Detection method according to one of claims 1-16, characterized in that a first detection species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, a second detection species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and another natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid, and the third recognition species is another different natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
24. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1 -16, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Erkennungsspezie eine synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist, eine zweite Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Natur- stoffderivat, vorzugsweise aus einem Antikörper oder Antikörper-Derivat, und einem an- deren Naturstoff oder einem anderen Naturstoffderivat, vorzugsweise ein anderer Antikörper oder Antikörper-Derivat ist, und eine dritte Erkennungsspezie eine weitere andere synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat, vorzugsweise ein weiterer anderer Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.24. Detection method according to any one of claims 1-16, characterized in that a first recognition species is a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative, a second recognition species is a hybrid of a synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably from an antibody or antibody derivative, and another natural product or another natural product derivative, preferably another antibody or antibody derivative, and a third recognition species another one is synthetic substance, a natural product or a natural product derivative, preferably another other antibody or antibody derivative.
25. Testsystem enthaltend mindestens zwei Erkennungsspezien, die mindestens zwei ver- schiedene Marker unter Ausbildung eines Komplexes erkennen.25. Test system containing at least two recognition species that recognize at least two different markers to form a complex.
26. Testsystem nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie an einen Träger immobilisiert ist.26. Test system according to claim 25, characterized in that at least one detection species is immobilized on a carrier.
27. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure ist und mindestens eine andere Erkennungsspezie eine andere natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure ist.27. Test system according to claim 25 or 26, characterized in that at least one detection species is a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and at least one other detection species is another natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
28. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist, und mindestens eine andere Erkennungsspezie eine andere von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Natur- Stoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-28. Test system according to claim 25 or 26, characterized in that at least one recognition species is a synthetic substance different from a nucleic acid, a different natural product or a different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative, and at least one other recognition species is another one Nucleic acid different synthetic substance, different natural substance or different natural substance derivative, preferably an antibody or antibody
Derivat ist.Is derivative.
29. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngi- gen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und eine von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.29. Test system according to claim 25 or 26, characterized in that at least one recognition species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded or double-stranded nucleic acid and a synthetic substance different from a nucleic acid, a different natural product or a different natural product derivative, preferably is an antibody or antibody derivative.
30. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngi- gen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nichtnatürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure ist.30. Test system according to claim 25 or 26, characterized in that at least one recognition species is a hybrid of a natural or non-natural, single-stranded gene or double-stranded nucleic acid and another natural or unnatural, single-stranded or double-stranded nucleic acid.
31. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungspezie ein Hybrid aus einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist, und einer anderen von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.31. Test system according to claim 25 or 26, characterized in that at least one recognition species is a hybrid of a synthetic substance different from a nucleic acid, different natural product or different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative, and another synthetic one different from a nucleic acid Substance, different natural product or different natural product derivative, preferably an antibody or antibody derivative.
32. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß einem der Ansprüche 25-31, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Erkennungsspezien zusammengestellt werden.32. A method for producing a test system according to one of claims 25-31, characterized in that the individual recognition species are compiled.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungs- spezie an einen Träger immobilisiert wird.33. The method according to claim 32, characterized in that at least one detection species is immobilized on a carrier.
34. Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 25-31 zum Nachweis von An- und/oder Abwesenheit von mindestens zwei verschiedenen Markern in einer Probe.34. Use of the test system according to one of claims 25-31 for the detection of presence and / or absence of at least two different markers in a sample.
35. Verwendung des Testsystems nach Anspruch 32 in Form eines Diagnostikums oder eines Analyten.35. Use of the test system according to claim 32 in the form of a diagnostic or an analyte.
36. Verwendung des Testsystems nach Anspruch 32 oder 33 für den Nachweis einer Erkrankung oder für die Umweltanalytik, insbesondere zum Nachweis von Krankheitserregern, Markern von Krankheiten, Toxinen und/oder Allergenen. 36. Use of the test system according to claim 32 or 33 for the detection of a disease or for environmental analysis, in particular for the detection of pathogens, markers of diseases, toxins and / or allergens.
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