JP2002533129A - アブラナ属植物のプラスチド形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本方法は、植物細胞プラスチドから目的のＤＮＡ配列を発現するためのアブラナ属植物の形質転換方法を提供する。該方法は、異種ＤＮＡ構築物でアブラナ属植物組織の形質転換を可能にする。そのようなＤＮＡ構築物は、転写の５’から３’方向に、植物プラスチド中で機能的なプロモーター領域および目的のＤＮＡ配列を含む。本発明はさらに、該プラスチドが異種ＤＮＡ構築物を含有するアブラナ属植物細胞を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 序論 発明の分野 本発明は植物プラスチドを遺伝子的に形質転換する方法、より詳細にはアブラ
ナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物種のプラスチドゲノムを遺伝子的に形質転換する
方法に関する。

【０００２】 背景 高等植物のプラスチドは、遺伝子工学にとって魅力的な標的である。植物プラ
スチド（クロロプラスト、アミロプラスト、エライオプラスト、エチオプラスト
、クロモプラスト等）は、光合成に加えて、アミノ酸、炭水化物複合体、脂肪酸
、及び色素のような産業的に重要な化合物の生産を担う主要な生合成中心である
。プラスチドはプロプラスチドとして知られる共通の前駆体から得られ、このよ
うに該プラスチドは同じ遺伝的内容を持つ全ての一定の植物種に存在している。
一般に、植物細胞は小さな１２０−１６０キロベース環状ゲノム、それぞれが大
きな（ほぼ２５ｋｂ）逆方向反復を有する分子の５００−１０，０００コピーを
含有する。このように、それは外来遺伝子発現の非常に高いレベルを潜在的にも
たらし得る目的の個々の遺伝子の２０，０００コピーまでを含むように植物細胞
を操作することを可能にする。加えて、ほとんどの植物のプラスチドは、母性遺
伝される。したがって、核内で発現した異種遺伝子とは異なり、プラスチド内で
発現した異種遺伝子は花粉播種できず、それ故に、植物プラスチド中に導入され
た形質は野生型同族に伝達されないだろう。

【０００３】 高等植物のプラスチドは、遺伝子工学にとって魅力的な標的を提供する。上述
した通り、高等植物のプラスチドは母性遺伝される。これは、これらの形質が野
生型同族に伝達されないであろうような、除草剤耐性のような自然の又は化学的
な条件に対する耐性又は抵抗性のための植物の遺伝的操作の利点を提供する。顕
花植物のプラスチド形質転換の文献は、全体が参考として本明細書に組み込まれ
る、Ｍａｌｉｇａ （１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：
１０１−１０７によって提供される。

【０００４】 残念ながら、高等植物についてこれまでに記載された成功裏のプラスチド形質
転換技術は、タバコ（米国特許第５，４５１，５１３号；Ｓｖａｂら（１９９０
）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３
０とＳｖａｂら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：９１３−１９７）及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（Ｓ
ｉｋｄａｒら（１９９８）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １８：２
０−２４）のようなモデル栽培作物に制限されている。さらに、シロイヌナズナ
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）用に記載された該方法は、繁殖しない再生体を生産
する。ＰＣＴ公開ＷＯ／３２９７７もまた、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ）のプラスチド形質転換方法を記載し且つアブラナ属植物プラスチドのプ
ラスチド形質転換の予言的な実施例を提供する。しかしながら、トランスプラス
トミックアブラナ属植物は、そこに記載された方法を用いて現在までに生産され
ていない。このように、アブラナ属植物種のような、広範な栽培作物のための栽
培作物プラスチド、クロロプラスト形質転換技術への遺伝子工学技術の実践的な
適用が、当該分野で必要とされる。

【０００５】 アブラナ属植物種のような栽培種に適用可能なクロロプラスト形質転換方法は
、当該分野で必要とされる。そのような方法は、植物プラスチドの遺伝子操作を
経て栽培学的に、同じく品質的に重要な形質のためのプラスチド形質転換を経て
遺伝子操作の新規な手段を提供するであろう。

【０００６】 発明の開示 本発明は、植物細胞を含んでいるアブラナ属植物の形質転換と再生のための構
築物と方法を提供し、そのプラスチドは目的の外来ＤＮＡによって安定に形質転
換されている。本発明は概して、アブラナ属植物プラスチドゲノムから得られた
相同な領域を有しているＤＮＡ構築物によってアブラナ属植物細胞プラスチドを
形質転換する方法；該ＤＮＡ構築物を含む細胞を選択すること；及び該植物細胞
プラスチド中に該ＤＮＡ構築物を含む細胞の成熟多細胞植物を得ることを含む。

【０００７】 本発明の第１の態様は、転写の５’から３’方向に、植物細胞プラスチド中で
機能的なプロモーター領域、目的のＤＮＡ配列、及び植物細胞プラスチド中で機
能的な転写終止領域を一般に含んでいるＤＮＡ構築物によってアブラナ属植物細
胞のプラスチドを形質転換するための方法を提供する。該構築物は、アブラナ属
植物プラスチド配列に由来する相同な領域をさらに含む。

【０００８】 本発明の別な態様は、アブラナ属植物細胞プラスチド中で機能的なプロモータ
ー領域、目的の核酸配列、及び植物細胞プラスチド中で機能的な転写終止配列を
有する核酸構築物を提供する。該構築物は、宿主細胞プラスチドゲノム内への該
構築物の組み込み用の相同な領域をもまた含むことができる。該相同な領域は、
アブラナ属植物プラスチドゲノム配列から好ましくは得られる。

【０００９】 本発明の別な態様において、宿主アブラナ属植物細胞プラスチドにおいて核酸
配列を発現するための方法が提供される。一般に、該方法は、プラスチド中で機
能的なプロモーター、目的の核酸配列、及び植物細胞プラスチド中で機能的な転
写終止配列を有している組換え核酸構築物を宿主アブラナ属植物細胞に導入する
ことを含む。

【００１０】 本発明のさらに別な態様において、本明細書中に記載された方法により得られ
た多細胞アブラナ属植物が提供される。

【００１１】 本発明はまた、そのプラスチドが目的のＤＮＡ構築物で形質転換されている多
細胞アブラナ属植物をも提供する。

【００１２】 本発明はまた、転写の５’から３’方向に、植物細胞プラスチド中で機能的な
プロモーター、緑色蛍光タンパク質（以下、ＧＦＰと言う）をコードするＤＮＡ
配列、及び植物細胞プラスチド中で機能的な転写終止領域機能を含むＤＮＡ構築
物によりそのプラスチドが安定に形質転換されているアブラナ属植物細胞を得る
ための方法も提供する。

【００１３】 図面の簡単な説明 図１は、ＧＦＰ発現マーカーを含んでいるトランスプラストミックアブラナ属
植物系の調製のための構築物を提供する。ｐＣＧＮ６４０８構築物の概略とタバ
コプラスチドゲノムへの組み込みの描写が上部に示される。ａａｄＡとＧＦＰボ
ックス上のラインは、転写の方向を示す。ＳｔｕＩフラグメントの予想したサイ
ズは入来ＤＮＡ、同じく野生型ＤＮＡ（ｐｔＤＮＡ）用に提供される。

【００１４】 図２は、非形質転換（野生型、Ｂｎ）及びトランスプラストミックアブラナ属
植物系のサザンハイブリダイゼーションの結果を提供する。

【００１５】 図３は、生長の連続ラウンドについてのサザンハイブリダイゼーション結果を
提供し、ライン６４０８ ９９−１Ｙ、ｃｃ、及びｄｄは約８０％ホモプラスミ
ックである。

【００１６】 発明の詳細な記述 本発明によると、構築物と方法が、異種ＤＮＡが挿入されているプラスチドを
含んでいるアブラナ属植物細胞を得るために提供される。該方法は一般に、プラ
スチド発現ベクターによりアブラナ属植物細胞を形質転換することを包含する。
該プラスチド発現構築物は一般に、転写の５’から３’方向に機能的に結合した
構成要素として、植物プラスチド中で機能的なプロモーター領域、目的のＤＮＡ
配列、及び植物プラスチド中で転写を終止することができる転写終止領域を含ん
でいる核酸配列を含む。使用のための該構築物は、宿主植物細胞プラスチドゲノ
ム内に組み込むための相同な領域を好ましくは含む。その相同な領域は、アブラ
ナ属植物ゲノム配列から好ましくは得られる。ここで使用される用語「得られる
」とはアブラナ属植物プラスチドゲノム配列の相同な領域に類似する任意の配列
をさす。そのような配列は、当該分野における周知の方法に従って作製すること
ができ、合成、プラスチドゲノム配列から増幅、あるいはアブラナ属植物プラス
チドゲノム配列からのクローニングを含むが、これらに限定されない。

【００１７】 本発明の方法の一態様は、アブラナ属植物種から植物細胞を生産する方法であ
って、植物のプラスチドが、植物細胞プラスチドからの目的の核酸配列の発現を
導くための組換え核酸配列を含む方法である。

【００１８】 該方法は一般に、アブラナ属植物種から調製した組織ソース中の植物細胞プラ
スチドに組換え核酸構築物を導入することを含む。該核酸構築物は、該プラスチ
ドゲノム中に組み込むことができ、あるいは該プラスチド内の自己複製プラスミ
ドとして含ませることができる。好ましくは、該構築物は、アブラナ属植物プラ
スチドゲノムから得られた相同組換え配列を用いて植物細胞プラスチドゲノム内
に組み込まれる。

【００１９】 本発明の方法において使用される植物細胞は、プラスチドを含有し、且つ成熟
植物への再生能力を有するいずれかの植物組織ソース又は成熟植物を生起するだ
ろう構築物から得ることができる。そのような組織は、葉組織、子葉（子葉ノッ
チを含む）、胚軸、上胚軸、幹切片、胚形成カルス、カルス、茎、プロトプラス
ト、幹薄層、小胞子、同じく幾つかの種子と胚を包含するが、これらに限定され
ない。好ましくは、本発明の方法において使用される細胞は、葉組織から得られ
る。さらに、該組織ソースは、インビトロ、土壌培養などを含む各種の条件中で
培養した植物から得ることができる。

【００２０】 形質転換に先立って、該組織ソースは各種浸透圧で処理することができる。浸
透圧処理は、ソルビトール及びマンニトールを含むがこれらに限定されない糖ア
ルコールを含む培地上で該組織を培養することをさす。該浸透圧処理は、形質転
換後、形質転換の間、あるいは形質転換の前、間及び後に実行することもできる
。該処理において使用する糖アルコールの濃度は、約０．０１Ｍから約１．０Ｍ
まで、好ましくは約０．０５Ｍから約０．７Ｍまで、より好ましくは約０．１Ｍ
から約０．５Ｍまで、最も好ましくは約０．２Ｍから約０．４Ｍまでの範囲を含
む。

【００２１】 アブラナ属植物細胞への形質転換用の構築物は、いずれかの利用可能な方法を
用いて導入することができる。導入のための方法は、バイオリスティック形質転
換、ＰＥＧ媒介形質転換、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限
定されない。好ましくは、目的のＤＮＡ構築物は、粒子銃ボンバードメント（ｐ
ａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を用いて望ましい宿主組織
からの植物細胞のプラスチド内に形質転換される。バイオリスティック形質転換
の一般的な方法は、Ｓａｎｆｏｒｄら（１９９３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：４８３−５０９、及びＹｅら（１９９０）、Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：８０９−８１９により記
載される。粒子ボンバードメントによるタバコプラスチドの安定な形質転換は報
告されている（Ｓｖａｂら（１９９０上掲）及びＳｖａｂら（１９９３上掲））
。それらに報告された方法は、本発明の形質転換方法において利用することがで
きる。他の方法が当該分野で知られており、且つＯ’Ｎｅｉｌら（１９９３）、
Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ３：７２９−７３８及びＧｏｌｄｓら（１９９３
）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：９５−９７に記載される。

【００２２】 形質転換において用いた形質転換組織に含まれる形質転換細胞からの全植物の
再生は幾つかの生長段階を包含する。典型的に、成熟植物から又は発芽した苗か
ら削り取った組織は、滅菌条件下で化学的に定義した培地に配置される。一定期
間そのような制御した条件下で該移植片を増殖することによって、カルスと呼ば
れる分化していない細胞の塊を形成できる。

【００２３】 例えば栄養、光、温度、湿度の適切な条件の組み合わせ下でこのカルスを培養
することによって、且つ植物生長調節剤の適切な組み合わせと濃度を提供するこ
とによって、該カルスは分化下細胞を形成すると共に、植物シュート再生を誘導
することができる。分裂組織を含んでいる、時折苗木（ｐｌａｎｔｌｅｔｓ）と
呼ばれる、植物シュート（ｐｌａｎｔ ｓｈｏｏｔｓ）は、次に根の生産の誘導
用培地に移される。

【００２４】 好ましくは、プラスチド構築物が導入されている組織は、遅延培地と呼ばれる
、細胞分裂、又は細胞拡張、開始培地上で培養される。該遅延培地は、液状又は
固体、又は寒天のような固体化試薬の添加による半固体のいずれかとし得る。該
組織は、該植物組織が阻害量の特有の選択試薬、同じく特有のホルモン及びその
特有の植物種のための再生を得るために必要な他の物質を含む選択培地に移した
後、約０日から約１４日まで、好ましくは約１日から約１０日まで、より好まし
くは約１日から約７日まで、最も好ましくは約２日から約７日までの期間の間、
遅延培地上で好ましく培養される。シュートは、ホモプラスミックシュートの生
産と選択に入るため、より高い、より低い又は同じ濃度の該特有の選択試薬を含
んでいる同じ選択培地上で継代培養される。

【００２５】 該選択培地は、液体又は固体又は寒天のような固体化剤の添加によって半固体
とすることができる。液体選択培地は、特有のホルモン、特に選択試薬及び再生
を得るための他の物質を含む選択培地と該植物組織の非常に大きな接触表面積を
与える。

【００２６】 選択試薬の量は、再生の間、該培地中に定常量残存し得る。あるいは、選択剤
の量は、最初に最も高いレベル、次いで再生の後の段階の間は低下させることが
できる。さらに、選択試薬の量は再生の最初の段階の間低く、再生後期に増加さ
せることができる。

【００２７】 トランスプラストミック植物は、形質転換プラスチドゲノムの純粋な集団用に
分析される（ホモプラスミック系）。ホモプラスミーは、トランスジーン及びク
ロロプラストゲノムの核酸プローブスパンニング領域（すなわち、挿入領域）を
利用したサザン分析を用い確証することができる。ヘテロプラスミックであるト
ランスプラストミック植物（すなわち、トランスジーンを含んでいる及び欠いて
いるプラスチドゲノムの混合物を含む）は、野生型及びトランスジーンのハイブ
リダイゼーションパターンによって特徴付けられる。ホモプラスミック植物は、
野生型バンドを欠いているハイブリダイゼーションパターンを示す。

【００２８】 あるいは、ホモプラスミーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて確証す
ることができる。ＰＣＲプライマーは、挿入領域からの配列から増幅するために
標的化され利用される。例えば、プライマーの対がＰＣＲ反応において利用され
得る。一つのプライマーはトランスジーン中の領域から増幅し、一方、第２のプ
ライマーは、該挿入領域に向かい隣接領域から該挿入領域まで増幅する。第２の
ＰＣＲ反応は、目的の領域を増幅するように設計したプライマーを用いて実行さ
れる。ホモプラスミックと同定されたトランスプラストミック系は、最初の反応
において予期されたサイズのフラグメントを生産する一方、それらは第２反応に
おいて予期されたサイズのフラグメントを生産しない。

【００２９】 後述の実施例でより詳細に記載した通り、トランスプラストミックアブラナ属
植物は、ここに記載した方法から製造される。

【００３０】 他のアブラナ属植物種は、本発明の方法を用いて同様に形質転換することがで
きる。本発明の実践のために好適な植物は、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅ
ａ及びＢ．ｎｉｇｒａを含む二倍体アブラナ属植物種、同じくＢ．ｎａｐｕｓ、
Ｂ．ｊｕｎｃｅａ及びＢ．ｃａｒｉｎａｔａを含む複二倍体種を含むが、これら
に限定されない。本発明の方法は、シロイヌナズナのような密接に関連した植物
のプラスチドの形質転換においての使用もまた見出すことができる。

【００３１】 本発明の別な態様は、植物細胞プラスチド中で機能的なプロモーター、目的の
核酸、及び植物細胞プラスチド中で機能的な転写終止領域を有している組換え核
酸構築物を提供する。

【００３２】 本明細書で用いる「組換え核酸構築物」とは、標的細胞中の特有の核酸の転写
を許す一連の特徴付けられた核酸要素を持つ核酸構築物、遺伝的に組み換えた又
は合成された核酸構築物である。組換え核酸構築物は、プラスミド、クロモソー
ム、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸フラグメン
ト内に組み込むことができる発現カセットを含む。典型的に、核酸構築物の組換
え発現カセット部分は、他の配列の中で、転写されるべき核酸配列とプロモータ
ーを含む。

【００３３】 植物細胞プラスチド中で機能的な多くのプロモーターは、当業者に利用可能で
ある。そのようなプロモーターは、１６ＳリボソームＲＮＡオペロン（Ｐｒｒｎ
）、ｐｓｂＡ遺伝子（ＰｐｓｂＡ）又はｒｂｃＬ遺伝子（ＰｒｂｃＬ）からのプ
ロモーター領域のような高度発現プラスチド遺伝子のプロモーター領域から得ら
れるそれらを含むが、これらに限定されない。他の要素もまた、転写、翻訳、又
は両方を増大するためのプロモーター領域とともに使用することができる。その
ような要素は、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガルノ配列、エンハンサー
要素などを含むが、これらに限定されない。

【００３４】 該組換え構築物において使用するための核酸配列は、宿主植物細胞プラスチド
において転写又は転写と翻訳（発現）のための目的のいずれかの核酸配列とする
ことができる。目的の配列は、除草剤に対する耐性に係わった遺伝子、リポータ
ー遺伝子、選択可能マーカー、哺乳動物タンパク質、及び病原体抵抗性をコード
している遺伝子を含むが、これらに限定されない。

【００３５】 除草剤耐性に係わったタンパク質をコードしている核酸配列は当該分野で知ら
れ、且つ５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェート合成酵素（ＥＰＳ
ＰＳ、米国特許第５，６２７，０６１号と５，６３３，４３５号、Ｐａｄｇｅｔ
ｔｅら（１９９６）、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｒｏｐｓ，
Ｌｅｗｉｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ５３−８５、及びＰｅｎａｌｏｚａ−
Ｖａｚｑｕｅｚら（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ１４：
４８２−４８７）及びグリホセート耐性用のａｒｏＡ（米国特許第５，０９４，
９４５号）、ブロモキシニル耐性用のブロモキシニルニトリラーゼ（Ｂｘｎ）（
米国特許第４，８１０，６４８号）、ノルフラゾン耐性用のフィトエンデサチュ
ラーゼ（ｃｒｔＩ）（Ｍｉｓａｗａら（１９９３）、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ４：８３３−８４０、及び（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ ６：４８１
−４８９）、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ（Ｓａｔｈａｓｉｉｖａｎ
ら（１９９０）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２１８８−２１９３）
）及びグルフォシネートに対する抵抗性用のｂａｒ遺伝子（ＤｅＢｌｏｃｋら（
１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３−２５１９）をコードしているＤＮＡ
配列を含むが、これらに限定されない。

【００３６】 本発明の発現構築物が他のストレス耐性、例えば昆虫又は病気抵抗性／耐性遺
伝子に係わった遺伝子をコードしている配列をも含むことができることに留意す
べきである。そのような昆虫抵抗性遺伝子は、例えばバシラス・チューリンゲン
シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ）ｃｒｙ１Ａｃタンパク質
のように当該分野で知られる。

【００３７】 加えて、該発現構築物は、植物プラスチドからのヒト生物学的タンパク質（薬
学タンパク質）の生産を導くことにおける使用もまた見出される。ヒト成長ホル
モン（ｈＧＨ）をコードしている核酸配列は、本発明のプラスチド発現構築物に
おいて利用できる。

【００３８】 ヒト生物学的タンパク質の生産のため本発明の発現構築物における使用のため
の目的の他の配列は、アプロチニンの生産である。

【００３９】 ヒトの生物学的物質の生産における使用が見出される他の配列は、インスリン
又はインスリン前駆体をコードしている配列を含む。当業者は、ヒトの生物学的
物質をコードしている多くの核酸配列が、ＧｏｏｄｍａｎとＧｅｌｍａｎ （１
９９０）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃｓ， Ｐｅｒｇａｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， 第８版、１４及び１５章中に
記載されたそれらのように、植物プラスチドからのそれらの発現を導くため、本
発明の該構築物が利用できることを理解するであろう。

【００４０】 多くのリポーター遺伝子が当業者に利用可能であり、且つＧＵＳ及び緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）を含むが、これらに限定されない。トランスジェニック組
織からのＧＵＳの発現のための分析技術は、染色に先立つ組織の破壊を含む。一
般に、該組織は、グルコロニド含有溶液を浸透させ、次いでクロロフィルのバッ
クグラウンドを取り除くためアルコール溶液で脱染色される。染色した組織は、
細胞発現ｂ−グルコロニダーゼの青色着色によって実証されるように、ＧＵＳ染
色で視覚的観測される。他のリポーター遺伝子もまた当該分野で知られ、例えば
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は非破壊分析法を用い利用可能である。ＧＦＰの
一般的文献は、参考としてその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｓｉｅｎ （
１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９−５４４によって
提供される。

【００４１】 後述する実施例においてより詳細に論じる通り、ＧＦＰを利用している構築物
は、形質転換したアブラナ属植物がプラスチドからのＧＦＰの発現を導くため構
築物がクロロプラストゲノム中に組み込まれるようにアブラナ属植物を形質転換
するために用いられる。ＧＦＰを発現している植物の細胞は、破壊方法の必要な
しに、紫外（ｕｖ）光下で可視化できる。ｕｖ光下で可視化される、ＧＦＰを発
現している細胞は、緑色の蛍光を発する。ＧＦＰコード配列における突然変異は
、緑色植物表面上での発現のより好都合な視覚化を与える青色光に励起波長をシ
フトする。

【００４２】 さらに、トランスプラストミックアブラナ属植物は、ＧＦＰ遺伝子をコードし
ている目的のＤＮＡ配列のヘテロプラスミックであることで同定される。トラン
スプラストミックアブラナ属植物は、植物細胞プラスチドにおいて機能的である
プロモーター配列から発現した、ＧＦＰのようなマーカー遺伝子を含んでいるＤ
ＮＡ構築物を形質転換するため本発明の方法を用いて得られる。ここで得られた
トランスプラストミック植物は、ｕｖ顕微鏡下の視覚化によって検出されるＧＦ
Ｐ発現を示す。

【００４３】 該構築物の開発において調節領域とオープンリーディングフレームを含む各種
フラグメントは、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、制限酵素消化、ＰＣＲ、インビト
ロ変異誘発、リンカーとアダプター付加、などのような異なる加工条件に付すこ
とができる。このように、ヌクレオチド転移、転換、挿入、欠失などが、該調節
領域において利用されるＤＮＡ又は該プラスチドにおける発現のため目的のＤＮ
Ａ配列において実行できる。制限消化、クレノウ平滑断端処理、連結、などの方
法は、当業者に周知であり、且つ例えばＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （１９８９
）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）に記載される。

【００４４】 該構築物の調製の間、ＤＮＡの各種フラグメントは、ＤＮＡの増幅、配列、リ
ンカーの結合又は除去によるＤＮＡの変更又はＤＮＡの操作などを考慮して、適
当なクローニングベクター中でしばしばクローンされるだろう。好ましくは、該
ベクターは、少なくとも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における高いコピー数に匹敵す
る複製ができるであろう。ｐＢＲ３２２，ｐＵＣシリーズのベクター、Ｍ１３シ
リーズベクター、及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
； Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）のようなベクターを含め、多くのベクターがクロ
ーニング用に現在利用可能である。

【００４５】 望まれる植物細胞を選択する手段を提供するため、プラスチド形質転換用のベ
クターは、選択可能なマーカー遺伝子の発現を提供する構築物を典型的に含む。
マーカー遺伝子は、選択物質、すなわち抗生物質、除草剤などの効力を弱める、
又は不活性化することによって自然の抑制に抵抗するポリペプチドを発現する植
物発現可能ＤＮＡ配列である。

【００４６】 あるいは、マーカー遺伝子は、幾つかの他の明らかな反応応答を提供でき、す
なわち植物又は植物細胞に直接適用されるかあるいは植物又は植物細胞培地中に
存在しているかのいずれかで、何らかの物質の存在において該選択可能なマーカ
ー遺伝子を発現していない植物又は植物細胞に比較して示差的な外観又は生長パ
ターンをもたらすことができる。

【００４７】 いずれかのケースにおいて、そのような選択可能なマーカー遺伝子を含んでい
る植物又は植物細胞は、同定の目的のために示差的な表現型を有するであろう、
すなわちそれらは非形質転換細胞と区別可能であろう。その特有の表現型により
、該構築物を含んでいる細胞、細胞群、組織、器官、植物部分又は全体の植物が
同定される。

【００４８】 該マーカー表現型の検出は、該マーカー遺伝子が結合されている第２の遺伝子
を有する細胞の選択を可能にする。この第２の遺伝子は典型的に、形質転換細胞
中の容易に同定可能ではないが、しかし一様な条件下で、該植物細胞又はその派
生物が成熟体まで生長した際に存在している望まれる表現型を含み、該選択可能
なマーカー表現型それ自身は現れない。

【００４９】 プラスチド構築物を含んでいる植物細胞の同定用のそのようなマーカーの使用
は、Ｓｖａｂら（１９９３，上掲）に記載されている。後で提供された実施例に
おいて、細菌ａａｄＡ遺伝子は、クロロプラスト５’プロモーターと３’転写終
止領域、特にｔｈｅｐｓｂＡ遺伝子の調節領域（Ｓｔａｕｂら、ＥＭＢＯ Ｊ．
（１９９３）１２（２）：６０１−６０６中に記載される）の調製制御下で該マ
ーカーとして発現される。多数の付加プロモーター領域もまた、植物プラスチド
において機能することが示されている各種のプラスチドプロモーター及び細菌プ
ロモーターを含む、選択可能なマーカー遺伝子の発現を導くために使用できる。

【００５０】 ａａｄＡ遺伝子の発現は、スペクチノマイシンとストレプトマイシンに対する
抵抗性を与え、そしてこのマーカーを発現している植物細胞の同定を考慮する。
該ａａｄＡ遺伝子産物は、クロロプラストが選択可能なマーカー遺伝子産物を含
む細胞の継続した生長及び緑化を考慮する。該選択可能なマーカー遺伝子産物を
含んでいない細胞は脱色され又は紫色である。ａａｄＡ遺伝子マーカーの選択は
、植物生長培地中のストレプトマイシン、より好ましくはスペクチノマイシンの
存在によって脱色されない植物細胞の同定に基づく。

【００５１】 クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ヒグロマイシンなどに対
する抵抗性のような、多くのマーカーが植物細胞で使用するために開発されてい
る。クロロプラスト代謝に関与した産物をコードする他の遺伝子もまた、選択可
能なマーカーとして使用することができる。例えば、グリホセート、ブロモキシ
ニル又はイミダゾリノンのような植物除草剤に対する抵抗性を提供する遺伝子は
、特有な使用を見出し得る。そのような遺伝子は報告されている（Ｓｔａｌｋｅ
ｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０：４７２４−４７２８（グ
リホセート抵抗性ＥＰＳＰ）；Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（
１９８５）２６３−６３１０−６３１４（ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ遺
伝子）；及びＳａｔｈａｓｉｖａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９
９０）１８：２１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン抵抗性遺伝子））。

【００５２】 プラスチド形質転換に使用するためのベクターは、プラスチド中で自律的に複
製することを導入された構築物に許容する複製の起源を提供する配列を含み得る
。そのような配列は当該分野で周知であり、且つ参考によりその全体が本明細書
に組み込まれる米国特許第５，６９３，５０７号中に記載される。

【００５３】 プラスチド形質転換に使用するためのベクターは、好ましくはプラスチドゲノ
ム内への該プラスチド発現構築物と選択可能なマーカー構築物の安定な転移を提
供するための手段を含む。これは、プラスチドゲノムに相同な領域により最も利
便的に提供される。該相同な領域は転移されるべき発現構築物をはさみ、且つ該
ゲノムへの二重交差を経て、相同組換えによって該プラスチドゲノムへの移入を
提供する。タバコの該プラスチドゲノムの完全ＤＮＡ配列は報告されている（Ｓ
ｈｉｎｏｚａｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８６）５：２０４３−２０４９）。
ゼニゴケ類からの（Ｏｈｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ （１９８６）３２２：５７
２−５７４）及びコメ（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
（１９８９）２１７：１８５−１９４）からのプラスチドゲノムの完全ＤＮＡ配
列もまた報告される。

【００５４】 相同な領域がプラスチドゲノムの逆方向反復領域中に存在する場合（ＩＲＡと
ＩＲＢとして知られる）、形質転換プラスチド当り２コピーのトランスジーンが
予測される。相同な領域がプラスチドゲノムの逆方向反復領域の外側にある場合
、形質転換プラスチド当り１コピーのトランスジーンが予測される。プラスチド
ゲノム内の相同な領域は、ほぼ１ｋｂないし３ｋｂのサイズである。より小さい
相同な領域もまた使用することができ、１００ｂｐ程度のものはプラスチドゲノ
ム内への相同組換えに供することができる。しかしながら、組換えの頻度、した
がって形質転換プラスチドを有している植物が得られる頻度は、該相同領域のサ
イズ減少に従って低下する。

【００５５】 タバコプラスチドゲノムに相同な領域を有している構築物の実例は、Ｓｖａｂ
ら（１９９０上掲）、Ｓｖａｂら（１９９０上掲）及びＺｏｕｂｅｎｋｏら（Ｎ
ｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ （１９９４）２２（１９）：３８１９−３８２４）中
に記載される。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）プラスチドゲノムに
相同な領域を有している構築物の実例は、Ｓｉｋｄａｒら（１９９８）上掲に記
載される。

【００５６】 ここに記載したような構築物は、プラスチドゲノムの逆方向反復領域への異種
ＤＮＡの相同組換えを導くためにアブラナ属植物プラスチドゲノムの配列から得
られた相同な配列を用いて調製される。そのような相同な領域は、アブラナ属植
物中の相同な領域（本明細書中では相同プラスチドゲノムとも呼ぶ）に一致して
いる配列を単離するためＰＣＲ反応を利用することによって得られる。このよう
に、ここで用いたような相同なプラスチドゲノムに相同な領域は、該領域が得ら
れたと同じ植物遺伝子のプラスチドゲノムへの発現構築物の組み込みを導くため
構築物の調製において使用されるＤＮＡ配列に関する。

【００５７】 当業者は、付加的な相同の領域が本発明の方法に従って利用できることを認識
するだろう。例えば、他の植物種、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ）、又はタバコのプラスチドゲノムから得られた相同な領域もまた利用する
ことができる。また、相同な領域は、巨大単一コピー領域に一致するプラスチド
ゲノムにおける相同組換えにも提供することができる。

【００５８】 さらに、ここで提供された発現構築物は、アブラナ属植物プラスチドゲノムか
ら得られた調節領域に利用される。例えばアブラナ属植物１６ＳリボソームＲＮ
Ａ（Ｐｒｒｎ）は、選択可能なマーカーａａｄＡの発現用に使用される。ｒｐｓ
１６のターミネーター配列、同じくｐｓｂＡのプロモーターと転写終止領域の両
方のようなアブラナ属植物プラスチドゲノムから得られた他の調節領域もまた、
本発明の構築物において使用される。当業者は、タバコ又はシロイヌナズナ（Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のような異種プラスチドゲノムから得られた調節要素も
また、本発明の構築物において使用できることを認識するだろう。

【００５９】 本発明において単独アブラナ属植物細胞プラスチドへの２つ以上の構築物の導
入もまた意図される。そのような方法は、形質転換、共形質転換などを含むが、
これらに限定されない。プラスチドの共形質転換の方法は、Ｃａｒｒｅｒら（１
９９５）、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３；７９１−７９４によってタ
バコについて記載されている。そのような方法は、一つの選択試薬での選択、続
いて第２の選択試薬での選択を許容する。例えば、一つの構築物は、スペクチノ
マイシン／ストレプトマイシンについての選択用のａａｄＡ発現カセットを含む
ことができ、及び第２の構築物はグリホセートについての選択用のＣＰ４ＥＰＳ
ＰＳ発現カセットを含むことができる。

【００６０】 このように、本発明の方法において使用するための発現構築物は、広範な植物
遺伝子工学適用に関与する遺伝子をコードしているＤＮＡ配列の発現を導くこと
においての使用が見出される。そのような遺伝子は、除草剤耐性及び病気抵抗性
のような作物学的形質（インプット形質）、又は脂肪酸組成変更及びカロテノイ
ド生産性のような質的形質（アウトプット形質）に関与するタンパク質をコード
することができる。さらに、植物細胞プラスチドにおけるヒトの生物学的物質の
生産のためのタンパク質をコードしているＤＮＡ配列もまた、本発明の発現構築
物における使用が見出される。

【００６１】 構築物は、植物細胞プラスチドからの目的のＤＮＡ配列の転写及び／又は転写
と翻訳（発現）を調節するためにもまた調製することができる。そのような構築
物は当該分野で知られ、且つ参考により本明細書に組み込まれる、米国特許第５
，５７６，１９８号に記載される。そのような構築物は、宿主植物中の選択した
組織の細胞からの発現を導くために使用することができる。例えば、アブラナ属
植物の種子細胞中のプラスチドからの目的のＤＮＡ配列の転写及び／又は転写と
翻訳（発現）を導くために、種子中での発現を増加するために提供しているプロ
モーターが、該植物細胞核からＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を導くために使用
される。

【００６２】 アブラナ属植物の核形質転換の方法は当該分野で知られ、且つ例えば、Ｒａｄ
ｋｅら（Ｔｈｅｏｒ， Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８８）７５：６８５−６
９４及びＰｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ （１９９２）１１：４９９−
５０５）中に記載される。

【００６３】 そのような方法は、例えば種子プラスチドにおける優先的なカロテノイド生合
成経路を変更するために用いることができる。種子におけるカロテノイド生合成
の変更は、参考によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開ＷＯ９８
／０６８６２中に例えば記載される。

【００６４】 本発明はこれまで一般的に記載され、説明のみの目的のために包含され、且つ
本発明を制限することを意図するものではない以下の実施例を参考することによ
ってより容易に理解されるであろう。

【００６５】 実施例 実施例１ ベクターの構築 高等植物のプラスチドの形質転換に使用するための構築物と方法は、Ｚｏｕｂ
ｅｎｋｏら（Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ （１９９４）２２（１９）：３８１９
−３８２４）、Ｓｖａｂら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９
０）８７；８５２６−８５３０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
１９９３）９０；９１３−９１７）、Ｓｔａｕｂら（ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９３
）１２：６０１−６０６）及び米国特許第５，５７６，１９８号中に記載される
。タバコのプラスチドゲノムの完全ＤＮＡ配列は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら（ＥＭ
ＢＯ Ｊ．（１９８６）５：２０４３−２０４９）に報告される。

【００６６】 Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ）は、２つのオリゴヌ
クレオチド、潜在ステム−ループ構造およびシャイン−ダルガルノ配列を連結す
ることによって構築される。使用されるオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＧＧＧ
ＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴ
ＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’（配列番号：１）及び
５’−ＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡ
ＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＣＣＴ−３’（配列
番号：２）である。

【００６７】 ベクター、ｐＭＯＮ３０１２５は、第２の変異ＧＦＰ（ＧＦＰ−２）リポータ
ー遺伝子及び植物プラスチドからのａａｄＡ選択可能マーカー遺伝子の組み込み
と発現を導くために予め作製した。

【００６８】 該ＧＦＰ−２は、更に２つの変異（Ｆ６４ＬとＳ６５Ｔ、Ｃｏｒｍａｃｋら、
（１９９６）Ｇｅｎｅ １７３：３３−３８）によってＧＦＰ−１から得た。そ
のような変異は、励起波長を青色光にシフトする。本明細書中ではＧＦＰｕｖｍ
とも称しているＧＦＰ−２遺伝子は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬプロモーター／リボソ
ーム結合部位と、Ｔｒｐｓ１６転写終止配列との間にクローンした。Ｐｒｒｎ／
ｒｂｃＬ配列は、Ｓｖａｂら（１９９３、上掲）中に記載されている。Ｔｒｐｓ
１６フラグメントは、タバコプラスミドＤＮＡ中のヌクレオチド５，０８７から
４，９３９までのｒｐｓ１６遺伝子３’−調節領域を含む。

【００６９】 発現カセットｐＭＯＮ３０１２５は、スペクチノマイシンとストレプトマイシ
ンについて選択用のマーカー遺伝子ａａｄＡ、及びｔｒｎＶ−ｒｐｓ７／１２イ
ンタージェニック領域内へのパッセンジャーＤＮＡの相同組換えによる組み込み
のためのｒｐｓ７／１２を含む。ａａｄＡマーカー遺伝子は、ｐｓｂＡプロモー
ターと転写終止配列から発現される。プラスチドｐｓｂＡプロモーター（Ｐｐｓ
ｂＡ）のプロモーター領域とターミネーター配列（ＴｐｓｂＡ）は、Ｓｔａｕｂ
ら（１９９３， ＥＭＢＯ Ｊ．， １２， ６０１−６０６）中に記載される
。

【００７０】 タバコにおいて、ｔｒｎＶとｒｐｓ１２／７の間のプラスチドゲノムにおける
トランスジーンの相同ターゲティングは、高い効率で安定な形質転換体をもたら
している（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら（１９９４）上掲）。たとえアブラナ属植物のプ
ラスチドゲノムがタバコのそれと共線的であるとしても、この標的領域のシーク
エンシングは幾つかの顕著な相違が明らかとなった。従って、アブラナ属植物特
異的プラスチド形質転換ベクターＰＣＧＮ６４０８は、アブラナ属植物から得た
標的配列のほぼ５．０ｋｂを用いて構築した。ＰＣＧＮ６４０８は、２つのトラ
ンスジーン発現カセット：１）スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性を
与え且つアブラナ属植物１６Ｓｒｒｎプロモーター領域、プラスチドにおいて有
効に機能することが見出されているリボソーム結合部位を含む細菌のＴ７遺伝子
１０リーダー（同時継続米国特許出願０９／１１３，６９０号中に記載される）
及びアブラナ属植物ｒｐｓ１６ターミネーター配列を用いて発現される選択可能
なａａｄＡ遺伝子−Ｐｒｒｎ−ｇ１０Ｌ：ａａｄＡ：Ｔｒｐｓ１６。２）アブラ
ナ属植物ｐｓｂＡプロモーターとターミネーター配列を用いて発現される緑色蛍
光タンパク質（ＧＦＰｕｖｍ）マーカー遺伝子−ＰｐｓｂＡ：ＧＦＰｕｖｍ：Ｔ
ｐｓｂＡ。その２つのトランスジーン発現カセットは、ｐＣＧＮ６４０８中のほ
ぼ２．５ｋｂプラスチドターゲティング配列にはさまれる。

【００７１】 該ベクターｐＣＧＮ６４０８は、ｐＣＧＮ６３９９からＡｓｃＩ−ＮｏｔＩフ
ラグメントとしてＧＦＰｕｖｍとａａｄＡ遺伝子カセットをｐＣＧＮ６４０７内
にクローニングすることにより構築される。ｐＣＧＮ６４０７はプラスチドター
ゲティング配列のほぼ５．０ｋｂを含み、ＮｏｔＩ−ＳａｃＩフラグメントとし
てｒｐｓ１２／７領域を含んでいるほぼ２．５ｋｂフランク（ｆｌａｎｋ）配列
のクローニングによって、続いてＡｓｐ７１８−ＸｈｏＩフラグメントとしてほ
ぼ２．５ｋｂフランク配列を含んでいるｔｒｎＶをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｉ
Ｉ ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングすることによって構
築される。ほぼ２．５ｋｂのフランクは、Ａｓｐ７１８−ＸｈｏＩフラグメント
用のプライマー（表１）ＳＣ１７５とＳＣ１７６及びＮｏｔＩ−ＳａｃＩフラグ
メント用のＳＣ１７７とＳＣ１７８によってアブラナ属植物全ＤＮＡを用いてＰ
ＣＲ増幅される。ｐＣＧＮ６３９９は、ａａｄＡ発現カセットを含むｐＣＧＮ６
３９８内に、キメラＧＦＰｕｖｍ遺伝子カセットを含んでいるＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩフラグメントをクローニングすることによって構築した。該キメラ緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰｕｖｍ）遺伝子カセット、ＰｐｓｂＡ：ＧＦＰｕｖｍ
：ＴｐｓｂＡは、アブラナ属植物ｐｓｂＡから得られたプロモーターとターミネ
ーター配列を有する。それはｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位中
にｐＭＯＮ３０１２５からのＧＦＰｕｖｍ発現カセットをクローニングし、プラ
スミドｐＣＧＮ６３８８を生成するＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩフラグメントとしてＰ
ｐｓｂＡ及びＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＴｐｓｂＡで調節部
位を置換することによって構築される。該ＰｐｓｂＡは、適切な制限部位を含ん
でいるプライマーＳＣ１８６とＳＣ１８７でのＰＣＲによって生成される。同様
に、ＴｐｓｂＡは適切な制限部位を含んでいるプライマーＳＣ１８８とＳＣ１８
９によってＰＣＲ増幅される。キメラａａｄＡ遺伝子は、細菌Ｔ７ファージから
の遺伝子−１０リーダー（ｇ１０Ｌ）と融合したｒｒｎプロモーター（Ｐｒｒｎ
）と、ｒｐｓ１６のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）を有する。Ｔｒｐｓ１６は
、適切な制限部位を含んでいるプライマーＳＣ１９３とＳＣ１９４でＰＣＲ増幅
され、ＳａｃＩとＸｂａＩで消化され、且つｐＣＧＮ６３８７を生成するように
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にクロー
ニングされる。Ｐｒｒｎは、Ｐｒｒｎ−ｇ１０Ｌ融合体を生成するようにプライ
マー対ＳＣ１９０とＳＣ１９１，ＳＣ１９０とＳＣ２０３、及びＳｃ１９０とＳ
Ｃ１９２により連続的にＰＣＲ増幅される。ａａｄＡ遺伝子は、プライマーＳＣ
１９８とＳＣ１９２とともにｐＭＯＮ３０１２５からＰＣＲ増幅される。Ｐｒｒ
ｎ−ｇ１０Ｌは、重複プライマーＳＣ１９８とＳＣ１９２を用いてａａｄＡに融
合され、また得られたＰｒｒｎ−ｇ１０Ｌ：ａａｄＡフラグメントは、プライマ
ーＳＣ１９０とＳＣ１９９で増幅される。Ｐｒｒｎ−ｇ１０Ｌ：ａａｄＡフラグ
メントは、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化し、ｐＣＧＮ６３８７内にクローニング
される。得られたＰｒｒｎ−ｇ１０Ｌ：ａａｄＡ：Ｔｒｐｓ１６を含んでいるプ
ラスミドは、ｐＣＧＮ６３９８とした。

【００７２】 フランキング領域用の配列およびマーカー及びリポーター遺伝子用の調節配列
は、他の種からの同じ領域の周知の配列から設計したプライマーでのＰＣＲ増幅
によってブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）から得られる。相
同領域を増幅するためのＰＣＲ反応用の条件は以下の通りとした：９４℃４分間
；９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分４５秒を３０サイクル；７２℃７分
での最終延長。調節領域用の条件は以下の通りとした：９４℃４分；９４℃１５
秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル；７分間の最終延長。プライマ
ー配列は表１中に掲示される。

【００７３】

【表１】 形質転換ベクターは、上述の通り得られたフランキング領域と調節領域を用い
て植物プラスチドからのリポーター及びマーカー遺伝子の組み込みと発現を導く
ように調製される。

【００７４】 ベクターｐＣＧＮ６４０８は、ｐＣＧＮ６３９９（後述）からのＡｓｃＩ−Ｎ
ｏｔＩフラグメントとしてＧＦＰｕｖｍとａａｄＡ遺伝子カセットをｐＣＧＮ６
４０７（後述）内にクローニングすることによって構築した。プラスミドｐＣＧ
Ｎ６４０７は、アブラナ属プラスチドターゲティング配列のほぼ５．０ｋｂを含
み、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に
ＮｏｔＩ−ＳａｃＩフラグメントとしてｒｐｓ１２／７領域を含むほぼ２．５ｋ
ｂフランキング配列をクローニングすること、続いてＡｓｐ７１８−ＸｈｏＩフ
ラグメントとしてほぼ２．５ｋｂフランク配列を含んでいるｔｒｎＶをクローニ
ングすることによって構築した。ほぼ２．５ｋｂのフランクは、Ａｓｐ７１８−
ＸｈｏＩフラグメント用のプライマーＳＣ１７５とＳＣ１７６及びＮｏｔＩ−Ｓ
ａｃＩフラグメント用のＳＣ１７７とＳＣ１７８による、アブラナ属植物全ＤＮ
Ａを用いてＰＣＲ増幅した。ｐＣＧＮ６３９９は、ａａｄＡ発現カセットを含む
ｐＣＧＮ６３９８内、にキメラＧＦＰｕｖｍ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩフラグメントをクローニングすることによって構築した。キメラ緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰｕｖｍ）遺伝子カセット、ＰｐｓｂＡ：ＧＦＰｕｖｍ：Ｔｐ
ｓｂＡは、アブラナ属植物ｐｓｂＡ由来のプロモーターとターミネーター配列を
有する。それは、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ部位内にｐＭＯＮ３０１
２５からのＧＦＰｕｖｍ発現カセットをクローニングすること、及びプラスミド
ｐＣＧＮ６３８８を生成するＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩフラグメントとしてのＰｐｓ
ｂＡ及びＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてのＴｐｓｂＡによって調
節領域を置換することによって構築される。ＰｐｓｂＡは、適切な制限部位を含
んでいるプライマーＳＣ１８６とＳＣ１８７とのＰＣＲによって生成した。同様
に、ＴｐｓｂＡは、適切な制限部位を含んでいるプライマーＳＣ１８８とＳＣ１
８９とともにＰＣＲ増幅した。キメラａａｄＡ遺伝子は、細菌Ｔ７ファージから
の遺伝子−１０リーダー（ｇ１０Ｌ）とｒｐｓ１６のターミネーター（Ｔｒｐｓ
１６）を融合したｒｒｎプロモーター（Ｐｒｒｎ）を有する。Ｔｒｐｓ１６は、
適切な制限部位を含んでいるプライマーＳＣ１９３とＳＣ１９４でＰＣＲ増幅し
、ＳａｃＩとＸｂａＩによって消化し、ｐＣＧＮ６３８７が生成するようにｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にクローン
した。Ｐｒｒｎは、Ｐｒｒｎ−ｇ１０Ｌ融合体が生成するようにプライマー対Ｓ
Ｃ１９０とＳＣ１９１、ＳＣ１９０とＳＣ２０３、及びＳＣ１９０とＳＣ１９２
によって連続的にＰＣＲ増幅した。ａａｄＡ遺伝子は、プライマーＳＣ１９８と
ＳＣ１９９と共にｐＭＯＮ３０１２５からＰＣＲ増幅した。Ｐｒｒｎ−ｇ１０Ｌ
は、重複プライマーＳＣ１９２とＳＣ１９８を用いてａａｄＡに融合し、Ｐｒｒ
ｎ−ｇ１０Ｌ：ａａｄＡフラグメントはプライマーＳＣ１９０とＳＣ１９９によ
って増幅した。Ｐｒｒｎ−ｇ１０Ｌ：ａａｄＡフラグメントはさらに、ＢａｍＨ
ＩとＸｂａＩで消化し，ｐＣＧＮ６３８７内にクローンした。結果的に得られた
Ｐｒｒｎ−ｇ１０Ｌ：ａａｄＡ：Ｔｒｐｓ１６を含んでいるプラスミドは、ｐＣ
ＧＮ６３９８とした。

【００７５】 アブラナ属植物プラスチド発現カセットの核酸配列は、相同領域の配列と調節
配列を確認するために検査し、配列番号：１９中に提供される。

【００７６】 実施例２ クロロプラスト形質転換 Ａ．ソース植物の確立 ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）品種 ２１２／８６の種
子を９５％エタノールに２分間浸漬し、続いて１００ｍｌ当たり界面活性剤とし
て１滴の食器用洗剤を含む２０％Ｃｌｏｒｏｘ中に３０分間浸漬することによっ
て表面を滅菌する。該種子は滅菌蒸留水中で４回濯ぐ。

【００７７】 滅菌した種子は、アブラナ属植物発芽培地（表２）を含むマジェンタボックス
（Ｍａｇｅｎｔａ社製、シカゴ、ＩＬ）に播種する。そのボックスは、１６時間
の光照射及び５５フォトン／ｍ^２／秒の光強度で２１℃の生長室内に配置する。
子葉は２週齢植物から取り除き、シュート（ｓｈｏｏｔ）の上部を根から切除し
て１箱当たり１本でアブラナ属植物インビトロ培地（表３）上に置く。その植物
は発芽と同じ条件下で培養し、４週間毎に該インビトロ培地を用いて継代培養す
る。

【００７８】

【表２】

【００７９】

【表３】

【００８０】

【表４】

【００８１】

【表５】

【００８２】 Ｂ．ボンバードメント（Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）条件 タングステン又は金粒子は、ボンバードメント実験におけるミクロキャリアと
しての使用のために滅菌する。金粒子（（１．４ｍｇ、５回のボンバードメント
用の充分量）０．６ミクロン金粒子（＃１６５２２６２， Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は１００％エタノールで滅菌した。使用の直前に、粒
子を遠心分離によって沈殿させ、滅菌脱イオン蒸留水で２〜３回洗浄し、このと
き、各洗浄の間に渦動と遠心分離を行った。洗浄した粒子は５０μｌの滅菌水中
に再懸濁する。

【００８３】 滅菌金粒子の５０μＬに、ＴＥ緩衝液中にｐＣＧＮ６４０８ ＤＮＡを含んで
いる１μｇ／μｌ溶液の１０μｌを加える。２．５ＭのＣａＣｌ_２の５０μｌと
０．１Ｍのスペルミジン遊離塩基の２０μｌもまた加える。該粒子を４℃で１０
分間振とうし、遠心分離し、１００％エタノール中で４回洗浄した。純エタノー
ル中の最終懸濁液は３０μｌである。この溶液の５マイクロリットルを粒子ボン
バードメントにおける使用のためのフライングディスク上にロードする。

【００８４】 暗緑色の葉、広がった約３／４、長さほぼ３〜４ｃｍをソース植物からボンバ
ードメント用に選択する。葉は葉柄を含まないように切断し、ペトリ皿中のシュ
ート用培地（ｓｈｏｏｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（表６）に対して背軸側を置く
。出芽直前まで葉は培地に接触させて平面を緩く圧する。

【００８５】

【表６】 粒子ボンバードメントによる形質転換は、製造元によって記載された修正プロ
トコルを用いて、ＰＤＳ １０００ Ｈｅｌｉｕｍ ｇｕｎ（Ｂｉｏ Ｒａｄ，
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）を用いて実行する。

【００８６】 フライングディスクは、発進リングの１ｃｍ下方の保持リング上の金属停止ス
クリーンを伴うスリーブに螺着された発進リングに配置した。該フライングディ
スクは１ｃｍの有効飛行距離を有している。葉は、該停止スクリーンから１２ｃ
ｍ、銃（ｇｕｎ）の底部から第２のプラットフォーム上に配置され、１１００ｐ
．ｓ．ｉ．破裂ディスクを用いてボンバードした。

【００８７】 Ｃ．形質転換シュートの再生 ボンバードメント後、葉はシュート用平板培地上に置き、１／４” Ｍｉｃｒ
ｏｐｏｒｅａ ｔａｐｅ（３Ｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ， Ｓｔ．Ｐａｕｌ，
ＭＮ ５５５１４４）で密封し、９０フォトン／ｍ^２／秒及び１６時間光照射
の光条件で２日間、２１℃で培養室中に置いた。二日後、その葉を培地から取り
だし、ほぼ１ｃｍ角に切断した。その角片は、２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシ
ンを補充したアブラナ属植物再生用培地（表７）に対して背軸側を置いた。アブ
ラナ属植物再生用培地上で７日後、葉片を２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを
補充したシュート発育用培地（表８）に移し、該培地に対して背軸側を置いた。
２週間後、該葉片を２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含有している新鮮なシ
ュート発育用培地に移した。

【００８８】 脱色した（紫／白）シュートと緑色シュートは、ボンバードメント後約６乃至
８週で再生した。高さが約０．２５乃至０．５ｃｍの緑色シュート、及びその外
植体の小部分は、２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを補充した新鮮なシュート
発育用培地に移した。高さがほぼ１ｃｍに伸びた緑色シュート（９９−Ａ）は、
外植体から取り出し、シュート伸長用培地（表９）プラス２０ｍｇ／ｌのスペク
チノマイシン上に置いた。高さが２ｃｍとなった時点で、そのシュートを２０ｍ
ｇ／ｌのスペクチノマイシンを補充した発根用培地上に置いた。

【００８９】

【表７】

【００９０】

【表８】

【００９１】

【表９】

【００９２】

【表１０】

【００９３】 Ｄ．ホモプラスミックシュートの再生 葉は、シュート９９からのヘテロプラスミックシュートから取り出し、０．５
ｃｍ片に切断し、２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを補充した再生用培地上に
該培地に対して背軸側を置く。アブラナ属植物再生用培地上で７日後、葉片を２
０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを補充したシュート発育用培地に移し、該培地
に対して背軸側を置く。２週間後、該葉片を２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシン
をプラスした新鮮なシュート発育用培地に移した。約２〜３週間後に再生した緑
色シュートを裁断した。緑色シュートと外植体の小部分は、高さほぼ０．２５乃
至０．５ｃｍの時点で２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンをプラスした新鮮なシ
ュート発育用培地に移した。高さがほぼ１ｃｍの時点でシュートを外植体から切
断し、２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンをプラスしたシュート伸長用培地に移
した。高さ２ｃｍの時点でシュートを２０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含ん
でいる発根用培地（表１０）上に置いた。

【００９４】 実施例３ トランスプラストミック植物の分析 マーカーａａｄＡマーカー遺伝子発現用に選択した形質転換植物は、該植物の
全体のプラスチド含量が形質転換されているかどうか調べるために分析する（ホ
モプラスチック形質転換）。典型的には、シュート形成とスペクチノマイシン選
択の２ラウンド行った後、分析されるトランスジェニック植物のほぼ５０％が、
プラスチドＤＮＡのサザンブロット分析によって決定されたように、ホモプラス
チックである。ヘテロプラスミック植物は、ホモプラスミック系を得るための更
なる継代培養で選択される。

【００９５】 ゲノムＤＮＡを、Ｓｖａｂら（（１９９３）， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａ
ｄ Ｓｃｉ， ９０：９１３−９１７）によって概略的に記載された通りに電気
泳動し、及びフィルターに転移して形質転換アブラナ属植物から単離することが
できる。プラスチド形質転換体は、ＳｔｕＩ制限酵素での全ＤＮＡの消化後のサ
ザン分析によって同定される。

【００９６】 全ＤＮＡを、ｐｌａｎｔ ＤＮＡｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ社製）を用いて葉から抽出し、ＳｔｕＩで消化し、０．７％アガロースゲルで
電気泳動し、さらに標準技法を用いてナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に移
す。ブロットを、ｐＣＧＮ６４０８からのプライマーＳＣ１７７とＳＣ１７８に
よって得られた^３２Ｐ−標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡプローブを用いＲａｐｉｄ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてプロ
ーブ検索する。該プローブ領域は、アブラナ属植物プラスチドベクターｐＣＧＮ
６４０８の全部のＮｏｔＩ−ＳａｃＩフランク配列を含む（図１）。このプロー
ブは、野生型ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）２１２／８６
ＤＮＡ中の４．５０ｋｂフラグメントとＢｎ−ｐＣＧＮ６４０８−１系中の７．
０２ｋｂフラグメント及びその二次再生物Ｂｎ−ｐＣＧＮ６４０８−１−１、Ｂ
ｎ−ｐＣＧＮ６４０８−１−２、Ｂｎ−ｐＣＧＮ６４０８−１−３及びＢｎ−ｐ
ＣＧＮ６４０８−１−４を検出する。野生型サイズとトランスジェニック系中の
トランスジェニックフラグメントの両方の存在は、それらが形質転換プラスチド
ＤＮＡにヘテロプラスミックであることを示す（図２）。

【００９７】 ホモプラスミック植物は、実施例２Ｃに記載した再生方法を用いて植物の再生
用の削り取った葉組織を用いてさらに継代培養することを経て得られた。ホモプ
ラスミックアブラナ属植物は、上述したサザンブロットハイブリダイゼーション
を用いて且つトランスプラストームに一致する７．０２ｋｂの単独ハイブリダイ
ジングフラグメントを示している系を選択することで同定される。図３は次の系
のためのサザンハイブリダイゼーション結果を提供する。系６４０８ ９９−１
Ｙ、ｃｃ，及びｄｄは約８０％ホモプラスミックである。

【００９８】 実施例４ ＧＦＰ発現の分析 ヘテロプラスミックシュート（Ｂｎ−６４０８−９９−１）及び非形質転換コ
ントロールシュートからの葉を取り出し、接線方向にスライスした。調製した葉
は、ニコン社製，Ｌａｂｏｐｈｏｔ 蛍光顕微鏡で観測し、ニコン ＵＦＸ−Ｉ
Ｉ顕微鏡撮影ユニットで撮影した。

【００９９】 調製した組織の視覚観測は、青色光下で気孔の保護細胞中のクロロプラストか
ら蛍光が見られた。このように、アブラナ属植物細胞プラスチドからのＧＦＰ発
現が実証される。

【０１００】 ＧＦＰ発現の定量分析は、ウエスタンイムノブロット分析を用いて調べること
ができる。例えば、全可溶性タンパク質は、凍結した又はプロテアーゼインヒビ
ターを含むＰＢＳ緩衝液（１ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４，Ｎａ_２ＨＰＯ_４，０．１３７
ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ ｐＨ７．０）の２５０μｌ中で２５０ｍｇ
の組織を磨砕することによって凍結葉組織から抽出することができる。このホモ
ジネートは、５分間遠心分離し、その上清を新しい試験管に移す。その上清中の
タンパク質の濃度はタンパク質濃度アッセイ（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ， ＣＡ）を用いて測定する。

【０１０１】 抽出した全タンパク質は、４−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｓｉｇｍａ，
ＳｔＬｏｕｉｓ， ＭＯ）で電気泳動し、１ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中でＰ
ＶＤＦ膜に移す（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。定量した精製ＧＦＰタンパク質の標準品を用い、
植物プラスチド中で発現したとしてＧＦＰの発現を定量する。

【０１０２】 ウエスタンハイブリダイゼーションは、ＧＦＰに対する抗体を用いた以外は、
ＳｔａｕｂとＭａｌｉｇａ （１９９３）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １２（
２）６０１−６０６中に記載された通りに実行する。電気泳動後、移動させたタ
ンパク質を含むＰＶＤＦ膜は、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）と
５％ミルクを含むＰＢＳ緩衝液のブロッキング溶液中、４℃で一晩インキュベー
トする。次いでその膜を１％ミルクとＧＦＰに対してヤギ中で産生された一次抗
体を含有するＰＢＳ−Ｔの溶液中、室温で２時間インキュベートする。その膜は
１％ミルクを含むＰＢＳ−Ｔの溶液中で３回洗浄し、それぞれの洗浄は室温で５
分間とする。次いでその膜を１％ミルクとヒツジ抗−ヤギ抗体を含むＰＢＳ−Ｔ
の溶液中、室温で１時間インキュベートし、室温で１０分間、３回、０．１％ミ
ルク含有ＰＢＳ−Ｔの溶液中で再度洗浄した。ＰＢＳ−Ｔのみを用いた最後の洗
浄を、例えば非放射活性検出キット（ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いる膜の現像の前に
実行する。

【０１０３】 このように、前記の結果は、本発明で提供した方法がアブラナ属植物細胞プラ
スチドの形質転換を可能にすることを示す。

【０１０４】 本明細書中に記載した全ての公知文献及び特許出願は、本発明に関連する当業
者のレベルを示している。全ての公知文献及び特許出願は、もしそれぞれの公知
文献又は特許出願が参考により本明細書に組み込まれることが特異的に且つ個別
的に示されるのと同じ程度に参考により本明細書に組み込まれる。

【０１０５】 前述の発明は説明のための幾つかの詳細及び理解の明確化の目的のための実施
例を記載しているが、一定の変更及び修正は添付した特許請求の範囲の範囲内で
実践できることは自明であろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はＧＦＰ発現マーカーを含んでいるトランスプラストミックアブラナ属植
物系の調製のための構築物を提供する。ｐＣＧＮ６４０８構築物の概略とタバコ
プラスチドゲノムへの組み込みの描写が上部に示される。ａａｄＡとＧＦＰボッ
クス上のラインは、転写の方向を示す。ＳｔｕＩフラグメントの予想したサイズ
は入来ＤＮＡ、同じく野生型ＤＮＡ（ｐｔＤＮＡ）用に提供される。

【図２】 図２は非形質転換（野生型、Ｂｎ）及びトランスプラストミックアブラナ属植
物系のサザンハイブリダイゼーションの結果を提供する。

【図３】 図３は生長の連続ラウンドについてのサザンハイブリダイゼーション結果を提
供し、ライン６４０８ ９９−１Ｙ、ｃｃ、及びｄｄは約８０％ホモプラスミッ
クである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA38 BA79 CA01 DA01 GA11 GA17 4B065 AA88X AB01 AC14 BA02 CA47 CA48 CA53

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物細胞の形質転換方法で
   あって、目的のＤＮＡ配列と機能的に結合した植物プラスチド中で機能的なプロ
   モーターを有する構築物を前記細胞のプラスチド中に導入することを含む形質転
   換方法。
2. 【請求項２】 前記構築物を含むプラスチドを有する細胞を選択することを
   さらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記構築物が前記プラスチドのゲノムに相同な領域を含み、
   それにより前記構築物が植物細胞プラスチドゲノム中に組み込まれることを特徴
   とする、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記相同な領域がアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物のプ
   ラスチドゲノムに由来することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記植物細胞からの形質転換プラスチドを含む成熟植物を再
   生することをさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記植物細胞がブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａ
   ｐｕｓ）細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記植物細胞が葉細胞を含むことを特徴とする、請求項１に
   記載の方法。
8. 【請求項８】 前記ＤＮＡ配列が前記植物細胞のプラスチド中に転写される
   際、前記目的のＤＮＡ配列が少なくとも１つの除草剤化合物に対する植物細胞の
   耐性を付与することができるＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項１に記
   載の方法。
9. 【請求項９】 前記目的のＤＮＡ配列が、昆虫に対する抵抗性を提供するバ
   シラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ）
   からの遺伝子をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記目的のＤＮＡ配列が、ヒト生物学的タンパク質の産生
    を導くことができる遺伝子をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の方
    法。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法によって得られた植物細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の植物細胞を含んでいる植物、植物種子
    又は植物部分又はその子孫。
13. 【請求項１３】 異種構築物を含むプラスチドを有するアブラナ属（Ｂｒａ
    ｓｓｉｃａ）植物細胞であり、前記構築物は、転写の５’から３’方向に機能的
    に結合した構成要素として、植物細胞プラスチド中で機能的なプロモーター、目
    的のＤＮＡ配列及び植物細胞プラスチド中で機能的な転写ターミネーターを含む
    ことを特徴とする、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物細胞。
14. 【請求項１４】 前記構築物が、前記プラスチドのゲノムに相同な領域をさ
    らに含み、それにより、前記構築物が植物細胞プラスチドゲノム中に組み込まれ
    ることを特徴とする、請求項１３に記載の植物細胞。
15. 【請求項１５】 前記相同な領域がアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の
    プラスチドゲノムに由来することを特徴とする、請求項１３に記載の植物細胞。
16. 【請求項１６】 前記植物細胞がブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎ
    ａｐｕｓ）細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の植物細胞。
17. 【請求項１７】 前記植物細胞が葉細胞を含むことを特徴とする、請求項１
    ３に記載の植物細胞。
18. 【請求項１８】 請求項１３に記載の植物細胞を含む植物、植物種子又は植
    物部分又はその子孫。
19. 【請求項１９】 植物細胞プラスチド中で機能的なプロモーター、目的の核
    酸配列、及びアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物プラスチドゲノムに由来する
    相同な領域を含む組換え核酸構築物。
20. 【請求項２０】 前記相同な領域がアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕ
    ｓ）から得られることを特徴とする、請求項１９に記載の構築物。