JP2002531068A - カンジダ・アルビカンスｔｆＩＩＩＡ遺伝子（ＣａｔｆＩＩＩＡ）及びコードされるＣＡＴＦＩＩＩＡタンパク質 - Google Patents

カンジダ・アルビカンスｔｆＩＩＩＡ遺伝子（ＣａｔｆＩＩＩＡ）及びコードされるＣＡＴＦＩＩＩＡタンパク質

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Abstract

(57)【要約】 この発明は、カンジダ・アルビカンス転写因子(以下、ＣＡＴＦＩＩＩＡという)及びその類似体並びに該タンパク質又は該タンパク質のポリペプチドアナログをコードするポリヌクレオチド(ＲＮＡ、ＤＮＡ)に関するものである。この発明は又、該ポリペプチド及びポリヌクレオチドの製造方法、それらの、抗真菌剤として利用することのできる該転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡの阻害剤の製造のための利用及び該阻害剤を含む医薬組成物にも関係する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、カンジダ・アルビカンス転写因子(以後、ＣＡＴＦＩＩＩＡと呼ぶ)
及びその類似体並びにこのタンパク質又はこのタンパク質のポリペプチド類似体
をコードするポリヌクレオチド(ＲＮＡ、ＤＮＡ)に関するものである。
【０００２】 本発明は、これらのポリペプチド及びポリヌクレオチドの製造方法、カンジダ
・アルビカンスの転写機構の研究のための及び抗真菌剤として利用することので
きるこの転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡの阻害剤の製造のためのそれらの利用、及び
かかる阻害剤を含む医薬組成物にも関係する。
【０００３】 それ故、本発明は、特に、カンジダ・アルビカンスの新規な転写因子及びこの
転写因子をコードするＤＮＡ配列、それらの製造方法及びそれらの利用に関係す
る。
【０００４】 我々は、以後、次の略号をも使用する：アミノ酸にＡＡ、核酸にＮＡ、リボ核
酸にＲＮＡ、リボヌクレアーゼにＲＮアーゼ、デオキシリボ核酸にＤＮＡ、相補
的ＤＮＡにｃＤＮＡ、塩基対にｂｐ、ポリメラーゼ連鎖反応にＰＣＲ、カンジダ
・アルビカンスにＣＡ又はカンジダａ．及びサッカロミセス・セレビシエにＳＣ
又はサッカロミセスｃ．。
【０００５】 特定のスクリーニング技術を指す用語スクリーニング及びプライマーとして用
いられるオリゴヌクレオチドを指す用語プライマーも又用いる。
【０００６】 用語ポリヌクレオチドは、以後、本発明のポリヌクレオチド即ち、本発明のＣ
ＡＴＦＩＩＩＡ因子及び同じ転写因子機能を有するその同族体をコードするＤＮ
Ａ配列を(ＲＮＡも)指す。用語ＣＡｔｆＩＩＩは、上でポリヌクレオチドについ
て与えた意味を有する。
【０００７】 用語ポリペプチドは、以後、本発明のポリペプチド即ち、本発明のＣＡＴＦＩ
ＩＩＡ因子及び以下で規定するその機能的類似体又は同族体(従って、同じ転写
因子機能を有する)を指す。用語ＣＡＴＦＩＩＩは、上でポリペプチドに与えた
意味を有する。
【０００８】 我々は、転写因子ＴＦＩＩＩＡをコードする遺伝子をｔｆＩＩＩＡ(又はｔｆ
Ｃ２)と呼ぶが、ＣＡｔｆＩＩＩＡ(又は、ＣＡｔｆＣ２)は、カンジダ・アルビ
カンスの転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡをコードする遺伝子を指す。
【０００９】 公知の真菌感染症の範囲は、皮膚や爪への真菌の攻撃から一層重い内臓の真菌
症まで及ぶ。かかる感染症及びそれらから生じる病気例えば真菌症は、同定され
ている。静真菌性効果又は殺真菌性効果を有する抗真菌性物質が、これらの真菌
症の治療に用いられている。
【００１０】 従って、本発明は、抗真菌性物質特に抗カンジダ・アルビカンス性物質の同定
に関係する。
【００１１】 従って、本発明は、抗真菌剤として利用することのできる転写因子阻害剤に関
係する。カンジダ・アルビカンスは、人体に感染性疾患を引き起こす病原性酵母
である。病気を治療する手段を見出すことを目的として、細胞内標的を選択する
ことができ、転写因子ＴＦＩＩＩＡは、これらの標的の１つであり得る。
【００１２】 真核生物において、この因子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる５ＳＲＮＡ遺
伝子の転写開始において鍵となる役割を演じている。特に、ＣＡに類似の酵母で
あるＳＣについては、このＳＣは、因子ＴＦＩＩＩＡの染色体遺伝子が破壊され
た場合には、追加の５ＳＲＮＡ源なしでは生存できず、この追加の５ＳＲＮＡは
、因子ＴＦＩＩＩＡの関与なしでプラスミドを用いて合成されるということが示
されている(参考：S.Camier, A.-M. Dechampesme, A.Sentenac.／Proc.Natl.Aca
d.Sci.(1995) 92, 9338-9342)。
【００１３】 ｔｆＩＩＩｎｄ遺伝子及び対応するＴＦＩＩＩＡタンパク質は、以下に示すよ
うに、生物学的な転写機構の調節に関与している。
【００１４】 ＴＦＩＩＩタンパク質が１９８０年に最初にアフリカツメガエル卵母細胞から
転写因子として精製された[Segall等、J.Biol.Chem.,255, 11986-11991(1980)]
ので、ＴＦＩＩＩＡにより行われる転写制御の機構を研究するのに、イン・ビボ
及びイン・ビトロの仕事が、アフリカツメガエルで行われてきた。アフリカツメ
ガエルＴＦＩＩＩＡが、５ＳＲＮＡ遺伝子の転写の開始に必要であること[Sakon
ji等、Cell 19, 13-25(1980)]及び５ＳＲＮＡ遺伝子の内部制御領域への結合に
必要であること[Bogenhagen等、Cell,19,27-35(1980)]が示されている。
【００１５】 アフリカツメガエルのＴｆＩＩＩＡのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び対応す
るアミノ酸配列は、既に公開されている[Ginberg等、Cell 39,479-489(1984)]。
この遺伝子は、９つの亜鉛フィンガーを有するタンパク質をコードしており、１
つの亜鉛フィンガーは、亜鉛原子でリンクされた２つのシステインと２つのヒス
チジン(ＣＹＳ２ＨＩＳ２)(Ｃ２Ｈ２)を含む部分に対応するということは注意す
ることができる。この亜鉛フィンガー構造は、タンパク質のＤＮＡへの結合ドメ
インを構成し、それ故、ＤＮＡに結合するタンパク質のグループ(ＤＮＡ結合タ
ンパク質)に必須のドメインと考えられる。[Miller等、Embo J., 4, 1607-1614(
1985)]
【００１６】 この亜鉛フィンガー構造をやはり有している他のＤＮＡに結合する転写因子、
例えば、ヒトにおける、ヒトウィルムス腫瘍遺伝子のＸＴ１[Gessier等、Nature
, 343, 774-778(1990)]、ヒト転写リプレッサーＹＹ１[Shi等、Cell, 67, 377-3
88(1991)]、プロモーターｃＭＹＣと結合したＭＡＺタンパク質[Bossone等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 89, 7452-7456(1992)]が知られており又はｓｐ１[Kuwahar
a等、J.Biol.Chem, 29, 8627-8631(1990)]も知られているということは注意され
得る。
【００１７】 種々の生物例えば、ヒト(特に)、アフリカツメガエル又はカンジダ・アルビカ
ンスの研究は、ＴＦＩＩＩＡ転写因子のファミリーと呼べるものが存在し、それ
が下記の特徴を有することを示した： − それらは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと結合し − それらは、９つの亜鉛フィンガーを有し − それらは、５ＳＲＮＡをコードする遺伝子の転写に不可欠である。
【００１８】 酵母のｔｆＩＩＩＡ遺伝子(ｔｆＣ２)によりコードされるタンパク質の公知の
必須の機能は、サッカロミセス・セレビシエの５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を開始す
ることである(Camier等、Proc.Natl.Acad.Sci.Sa USA (1995) 92:9338-9342)。
【００１９】 従って、本発明は、カンジダ・アルビカンスの転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡのタ
ンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡポリヌクレオチドを単離すること及びそ
れらのヌクレオチド配列を示すことを可能にした。
【００２０】 それ故、本発明の主題は、下記の群から選択するヌクレオチド配列を含む単離
されたポリヌクレオチドである： ａ）転写因子機能を有し且つ以下に示す配列SEQ ID NO:３と相同なアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも５０％又は少
なくとも６０％の好ましくは少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ド。 ｂ）ポリヌクレオチドａ）の相補的ポリヌクレオチド ｃ）少なくとも１５の連続するａ）及びｂ）で規定したポリヌクレオチドの塩基
を含むポリヌクレオチド。 それ故、本発明の主題は、上で規定したポリヌクレオチドであり、このポリヌク
レオチドは、ＤＮＡである。
【００２１】 それ故、本発明の主題は、上で規定したポリヌクレオチドであり、このポリヌ
クレオチドは、ＲＮＡである。
【００２２】 本発明の一層正確な主題は、上で規定したポリヌクレオチドであり、ヌクレオ
チド配列SEQ ID NO:１を含む。
【００２３】 従って、本発明は、カンジダ・アルビカンスの転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡをコ
ードするＤＮＡ配列を単離することを可能にした。
【００２４】 本発明は又、ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子の核酸配列及びこの遺伝子によりコード
されるＣＡＴＦＩＩＩＡタンパク質のアミノ酸配列を示すことをも可能にした。
【００２５】 それ故、本発明の主題は、上記のポリヌクレオチドにより規定されるＤＮＡ配
列であり、このＤＮＡ配列が、カンジダ・アルビカンスの転写因子ＣＡＴＦＩＩ
ＩＡの生物学的機能を有するタンパク質をコードするＣＡｆｔＩＩＩＡ遺伝子の
ものでありヌクレオチド配列SEQ ID NO:１を含むことを特徴とする。 それ故、本発明のSEQ ID NO:１等の配列は、２０６０ヌクレオチドを含む。
【００２６】 本発明の正確な主題は、SEQ ID NO:１のヌクレオチド７２０で始まり、ヌクレ
オチド１９５５で終わる配列を有する上で規定したＤＮＡ配列である。 従って、かかる配列は、１２３６ヌクレオチドを含む。
【００２７】 本発明の主題は、上で規定したアミノ酸配列SEQ ID NO:３をコードするＣＡｔ
ｆＩＩＩＡ遺伝子のＤＮＡ配列でもある。 従って、配列SEQ ID NO:３は、４１２ＡＡを含む。
【００２８】 本発明の特別の主題は、上で規定した転写因子ＣＡＴＦＩＩＩをコードするＤ
ＮＡ配列並びにそれにハイブリダイズし且つ／又はこの配列若しくはその断片と
有意の相同性を有し且つ同じ機能を有するＤＮＡ配列である。
【００２９】 本発明の主題は又、転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡと同じ生物学的活性を有するタ
ンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチドの抑制、挿入及び／又は置
換により導入された改変を含む上で規定したＤＮＡ配列でもある。
【００３０】 本発明の特定の主題は、上で規定したＤＮＡ配列並びに該ＤＮＡ配列と少なく
とも５０％の又は６０％の、好ましくは少なくとも７０％のヌクレオチド配列相
同性を有するＤＮＡ配列である。
【００３１】 それ故、本発明の主題は又、上で規定したＤＮＡ配列並びにＡＡ配列が該ＤＮ
ＡによりコードされるＡＡ配列と少なくとも４０％の、特に４５％の、又は少な
くとも５０％の、むしろ少なくとも６０％の、好ましくは少なくとも７０％の相
同性を有する類似の機能のタンパク質をコードするＤＮＡ配列でもある。
【００３２】 ハイブリダイズする配列とは、高、中又は低緊縮の標準的条件下で、上記のＤ
ＮＡ配列の１つとハイブリダイズし及び同じ転写因子機能を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列を含む。緊縮条件は、当業者に公知の条件下で実施され
るものである(Sambrook等、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborator
y Press, 1989に記載されたもの等)。かかる緊縮条件は、例えば、５×ＳＳＰＥ
；１０×デンハート；１００μｇ／ｍｌｓｓＤＮＡ；１％ＳＤＳ溶液中での６５
℃で１８時間のハイブリダイゼーションとその後の２×ＳＳＣ；０．０５％ＳＤ
Ｓでの５分ずつ３回の洗浄及びその後の１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳでの１５分
ずつ３回の６５℃での洗浄である。高緊縮条件には、例えば、５×ＳＳＰＥ；１
０×デンハート；１００μｇ／ｍｌｓｓＤＮＡ；１％ＳＤＳ溶液中での６５℃で
１８時間のハイブリダイゼーションとその後の２×ＳＳＣ；０．０５％ＳＤＳ溶
液での２０分ずつ２回の６５℃での洗浄及びその後の０．１％ＳＳＣ；０．１％
ＳＤＳ溶液での６５℃で４５分の最後の洗浄が含まれる。中緊縮条件には、例え
ば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での６５℃で２０分の最後の洗浄が含
まれる。
【００３３】 有意な相同性を有する配列とは、上記のＤＮＡ配列の１つとの中位の又は高度
のヌクレオチド配列類似性を有し且つ同じ転写因子機能を有するタンパク質をコ
ードする配列を包含する。
【００３４】 それ故、類似のＤＮＡ配列とは、カンジダ・アルビカンス以外の真菌特にＳＣ
に属し得て且つカンジダ・アルビカンスＣａｔｆＩＩＩＡ遺伝子のＤＮＡ配列と
類似し又は同一であるＤＮＡ配列を意味する。これらの類似のＤＮＡ配列は、カ
ンジダ・アルビカンスＣａｔｆＩＩＩＡ遺伝子のＤＮＡ配列と必ずしも同一では
ない。ヌクレオチドレベルでの配列相同性は、中位か又は高くてよい。従って、
本発明は、特に、本発明のＣＡｔｆＩＩＩＡ配列と少なくとも５０％の、好まし
くは少なくとも６０％の、一層好ましくは少なくとも７０％のヌクレオチド配列
相同性を有するＤＮＡ配列に関係する。
【００３５】 加えて、これらの類似のＤＮＡ配列は、ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子によりコードさ
れるタンパク質とアミノ酸配列レベルで同じタンパク質を必ずしもコードしない
。それ故、本発明は、特に、本発明のＣＡｔｆＩＩＩＡによりコードされるタン
パク質と少なくとも４０％の、特に４５％の、好ましくは少なくとも５０％の、
一層好ましくは少なくとも６０％の、尚一層好ましくは少なくとも７０％のアミ
ノ酸配列相同性を有し相同であるといわれるタンパク質をコードするＤＮＡ配列
と関係する。
【００３６】 本発明の遺伝子は、SEQ ID NO:１に示したように一本鎖ＤＮＡ配列として表さ
れるが、本発明が、この一本鎖ＤＮＡ配列の相補的ＤＮＡ配列を含むこと及び互
いに相補的なこれらの２つのＤＮＡ配列により構成され二本鎖といわれるＤＮＡ
配列をも包含するということは理解される。
【００３７】 上記のＤＮＡ配列は、アミノ酸配列SEQ ID NO:３に対応するアミノ酸をコード
するコドンの組合せの例であるが、本発明が、この同じアミノ酸配列SEQ ID NO:
３をコードするコドンの任意の他の自由な組合せを包含するということも理解さ
れる。
【００３８】 ポリヌクレオチド特に上で規定したＤＮＡ配列、上記のような改変ＤＮＡ配列
又は上で規定した相同なＤＮＡ配列の調製のために、当業者に公知の技術、特に
、Sambrook, J., Fritsh, E.F. 及びManiatis, T.(1989)の「Molecular cloning
: a laboratory manual」と題する本(Laboratory, Cold Spring Harbor NY)に記
載されたものを用いることができる。
【００３９】 上で規定した相同なＤＮＡ配列は、特に、当業者に公知の方法により、例えば、
縮重ヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ技術によりこれらのＤＮＡを対応す
る真菌の遺伝子バンク又はｃＤＮＡバンクから増幅することよって単離すること
ができる。このｃＤＮＡも又、本発明の範囲内の研究される様々な種の真菌例え
ばカンジダ・アルビカンスから単離したｍＲＮＡから調製することができるが、
例えば、カンジダ・ステラトイデア、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラ
プシロシス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・シュードトロピカリス、カンジダ
・キラモンディ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ルシアニアエ又はカンジダ
・ルゴサからも調製することができ、真菌例えば、サッカロミセス・セレビシエ
又はアスペルギルス又はクリプトコッカス及び特にアスペルギルス・フミガーツ
ス、コシディオイデス・イミティス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒ
ストプラスマ・カプスラタム、ブラストミセス・デルマティティディス、パラコ
シディオイデス・ブラジリエンス及びスポロトリックス・シェンキイ型の真菌か
らも調製することができ、藻菌類綱又は真正菌類綱の真菌、詳細には、サブクラ
スの担子菌類、子嚢菌類、特に、半嚢菌類(酵母)及び不整子嚢菌目、裸胞子菌類
(gymnascales)(皮膚及び毛の真菌)、又は糸状不完全菌類のクラス、詳細には、
サブクラスの分生子菌類(conidiosporales)及び葉状体胞子菌目からも調製する
ことができ、これらの内には、次の種がある：ケカビ、クモノスカビ、コクシジ
オイデス、パラコクシジオイデス(ブラストミセス ブラジリエンシス)、エンド
ミセス(ブラストミセス)、アスペルギルス、ペニシリウム(スコプラリオプシス)
、白癬菌(クテノミセス)、表皮糸状菌、小胞子菌、ピエドライア、ルモデンドラ
ム、フィアロフォラ、スポロトリクム、クリプトコッカス、カンジダ、ゲオトリ
クム、トリコスポロン又はトロプスロシス。
【００４０】 従って、本発明のポリヌクレオチドは、通常のクローニング及び配列決定法に
より例えば細胞から抽出した染色体ＤＮＡの断片からのクローニング及び配列決
定法により得ることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを得るために
は、染色体ＤＮＡ断片バンクを利用することができる。好ましくは１７ヌクレオ
チド以上から構成され、部分配列から誘導される放射性エレメントにより標識し
たオリゴヌクレオチドに対応するプローブを調製することができる。従って、こ
のプローブのＤＮＡと同一のＤＮＡを含むクローンを緊縮条件下で同定すること
ができる。こうして同定された個々のクローンのオリジナル配列に由来する配列
決定用プライマーを用いる配列決定により、完全な遺伝子配列を決定するために
両方向に配列を拡張することができる。通常の効率的様式で、かかる配列決定を
、プラスミドから調製した変性した二本鎖ＤＮＡを用いて実施することができる
。かかる技術は、上記のManiatis, T. Fritsch, E.F.及びSambrookに記載されて
いる。(Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York(1989)(特に、ハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニング及び変性した二本鎖ＤＮＡからの配列
決定の章の1.90及び13.70)。
【００４１】 本発明の範囲内で、カンジダ・アルビカンスの染色体ＤＮＡ断片のバンクを、
特に、以下の実験部の実施例１で示すように用いることができる。
【００４２】 本発明を実施した操作条件の詳細な説明を、以下に与える。
【００４３】 本発明の非常に特別の主題は、転写因子機能ＣＡＴＦＩＩＩＡを有し及び上記
のＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列SEQ ID NO:３を有するポリペプチド及
びこのポリペプチドの類似体である。
【００４４】 ポリペプチド類似体とは、アミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸の置換、
抑制又は付加により改変されているが、同じ生物学的機能を保持しているポリペ
プチドと理解される。かかるポリペプチド類似体は、自然に生成され得るし又は
当業者に公知の技術を用いて、翻訳後修飾により生成することができ又は上記の
ように本発明のＤＮＡ配列の改変によっても生成することができる。これらの技
術の内で、当業者に公知の位置指定突然変異誘発(Kramer, W.等、Nucl.Acids Re
s., 12, 9441(1984)；Kramer, W.及びFritz, H.J., Methods in Enzymology, 15 4 , 350(1987)；Zoller, M.J.及びSmith, M. Methods in Enzymology, 100, 468(
1983))を特に挙げることができる。
【００４５】 改変ＤＮＡ合成は、上記のようにして、特に、公知の化学合成技術例えばリン酸
トリエステル法[Letsinger, R.L及びOgilvie, K.K., K.Am.CHEM.Soc., 91, 3350
(1969)；Merrifield, R.B., Science, 150, 178(1968)]又はホスホアミダイト法
[Beaucage, S.L及びCaruthers, M.H., Tetrahedron Lett., 22, 1859(1981)；Mc
BRIDE, L.J.及びCaruthers, M.H. Tetrahedron Lett., 24 245(1983)]を用いて
実施することができ、これらの方法の組合せによっても実施することができる。
【００４６】 それ故、本発明のポリペプチドは、当業者に公知の技術を用いて、特に、部分
的に化学合成によって製造することができ、組換えＤＮＡ技術により、以下に示
す原核又は真核宿主細胞中で発現させることよっても製造することができる。
【００４７】 本発明の特別の主題は、アミノ酸配列SEQ ID NO:３を有する組換えタンパク質
ＣＡＴＦＩＩＩＡの製造方法であって、上記のＤＮＡ配列を適当な宿主中で発現
させ、次いで、該組換えタンパク質を単離精製することをふくむ当該製造方法で
ある。
【００４８】 本発明のポリペプチドを生成するためには、特に、当業者に公知の遺伝子工学
を利用する組換えＤＮＡ技術及び細胞培養法を利用することができる。次いで、
次の段階を実施することができる：先ず適当な遺伝子を用意し、次いで、この遺
伝子をベクターに組み込み、この遺伝子のキャリアーベクターを適当な宿主細胞
にトランスファーし、この遺伝子の発現によりそのポリペプチドを産生させ、そ
のポリペプチドを単離し、こうして生成されたポリペプチドを次いで精製する。
【００４９】 本発明のポリヌクレオチドの発現により得られる本発明のポリペプチドを、当
業者に周知の方法例えば硫安又はエタノール沈殿、酸性条件下での抽出、アニオ
ン又はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ー及び高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)によりトランスフォームした細
胞培養物から精製することができる。タンパク質がその単離精製の間に変性した
場合には、当業者に周知の技術を用いて、そのタンパク質を再生することができ
る。
【００５０】 本発明によるＤＮＡ配列、特に、SEQ ID NO:SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:２を
、当業者に公知の技術により、特に、化学合成により又は遺伝子バンク若しくは
ｃＤＮＡバンクを合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて公知のハイブリダイ
ゼーション技術によってスクリーニングし、そうして、単離した断片からＤＮＡ
を増幅することにより又はメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)から逆転写酵素によ
り調製することができる。
【００５１】 先ずｍＲＮＡを全ＲＮＡの抽出により単離し、次いで、これらのｍＲＮＡから逆
転写酵素によりｃＤＮＡを合成するこの技術の利点は、特に、たとえ非コード配
列がゲノムＤＮＡ中に存在しても、ｍＲＮＡはイントロンを含まないという事実
に基づく。
【００５２】 次いで、当業者に公知の通常のクローニング技術(特に、Sambrook, J. Friths
, E.F.及びManiatis, T.(1989)による「Molecular cloning: a laboratory manu
al」と題する本(Laboratory, Cold Spring Harbor NY)に記載されたもの)を行う
ことができる。
【００５３】 これらの技術においては、断片を適当な市販のキットのプラスミドに挿入し、次
いで、こうして得られたプラスミドによって細菌株をトランスフォームすること
によりクローニングを行うことができる。特に、ＸＬ１Ｂｌｕｅ又はＤＨ５ａｌ
ｐｈａ大腸菌株を用いることができる。これらのクローンを、次いで、プラスミ
ドＤＮＡを抽出するために、上記の当業者に公知の標準的技術(Sambrook, Frith
s及びManiatis)によって培養することができる。次いで、このプラスミドＤＮＡ
に含まれる増幅断片のＤＮＡ配列決定を行うことができる。
【００５４】 本発明のポリペプチドを、本発明のポリヌクレオチド特に適当なプロモーター
配列が先行する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞で
の発現により得ることができる。宿主細胞は、原核細胞例えば大腸菌であっても
真核細胞例えば酵母(例えば、子嚢菌、その中にサッカロミセスがある)又は哺乳
動物細胞(例えば、Ｃｏｓ細胞)であってもよい。
【００５５】 本発明の特別の主題は、上記のＤＮＡ配列を含む発現ベクターである。この発
現ベクターにおいて、かかるＤＮＡ配列は、それ故、特に、カンジダ・アルビカ
ンスの転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡの生物学的機能を有するタンパク質をコードす
るＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子の、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:１を含むＤＮＡ配列
である。
【００５６】 この発現ベクターにおいて、かかるＤＮＡ配列は、従って、一層特に、SEQ ID N
O:１のヌクレオチド７２０で始まり、ヌクレオチド１９５５で終わるＤＮＡ配列
である。
【００５７】 この発現ベクターにおいて、かかるＤＮＡ配列は、従って、一層特に、上記のア
ミノ酸配列SEQ ID NO:３をコードするＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子のそれでもある。
【００５８】 この発現ベクターにおいて、かかるＤＮＡ配列は、従って、上記の転写因子ＣＡ
ＴＦＩＩＩＡをコードするＤＮＡ配列並びにそれとハイブリダイズし且つ／又は
この配列若しくはその断片と有意の相同性を有するＤＮＡ配列であり、又は、転
写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡと同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードする少
なくとも１つのヌクレオチドの抑制、挿入及び／若しくは置換により導入された
改変を含むＤＮＡ配列でもある。
【００５９】 この発現ベクターにおいて、かかるＤＮＡ配列は、特に、上記のＤＮＡ配列並び
に、該ＤＮＡ配列との少なくとも５０％若しくは少なくとも６０％の、好ましく
は少なくとも７０％のヌクレオチド配列相同性を有する類似のＤＮＡ配列であり
、又はＡＡ配列が該ＤＮＡ配列によりコードされるＡＡ配列との少なくとも４０
％の、特に４５％の、又は少なくとも５０％の、むしろ少なくとも６０％の、好
ましくは少なくとも７０％の相同性を有するタンパク質をコードする類似のＤＮ
Ａ配列でもある。
【００６０】 これらの発現ベクターは、適当なプロモーターの制御下でのタンパク質の発現を
可能にするベクターである。かかるベクターは、プラスミド、コスミド又はウイ
ルスＤＮＡであってよい。原核細胞のためには、プロモーターは、例えば、ｌａ
ｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、β−ラクタマーゼ
プロモーター又はＰＬプロモーターであってよい。酵母細胞用には、プロモータ
ーは、例えば、ＰＧＫプロモーター又はＧＡＬプロモーターであってよい。哺乳
動物細胞用には、プロモーターは、例えば、ＳＶ４０プロモーター又はアデノウ
イルスプロモーターであってよい。
【００６１】 バキュウロウイルス型のベクターも又、昆虫細胞における発現用に用いること
ができる。
【００６２】 宿主細胞は、例えば、原核細胞又は真核細胞である。原核細胞は、例えば、大腸
菌、バチルス又はストレプトミセスである。真核宿主細胞は、酵母並びに高等生
物の細胞例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞を包含する。哺乳動物細胞は、例えば
、繊維芽細胞例えばＣＨＯ又はＢＨＫハムスター細胞及びＣｏｓサル細胞である
。これらの昆虫細胞は、例えば、ＳＦ９細胞である。
【００６３】 それ故、本発明は、本発明のポリヌクレオチド特にアミノ酸配列３をコードす
るＤＮＡ配列によりトランスフォームされた宿主細胞におけるＣＡＴＦＩＩＩＡ
をコードする本発明のポリヌクレオチドの発現を含む方法と関係する。かかる方
法の実施において、宿主細胞は、特に、真核細胞である。
【００６４】 本発明の実施のために、用いるベクターは、例えば、ｐＧＥＸ又はｐＢＡＤであ
ってよく、宿主細胞は、大腸菌であってよく(又は、例えばベクターｐＹＸ)、そ
して、宿主細胞は、特に、サッカロミセス・セレビシエであってよい。
【００６５】 本発明の特別の主題は、上記のベクターでトランスフォームされた、本発明の
ＤＮＡ配列を含む宿主細胞である。
【００６６】 本発明の主題は、それ故、上記の本発明の組換えタンパク質の製造方法であり
、該方法においては、宿主細胞は、ＤＨ５ａｌｐｈａ大腸菌若しくはＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ大腸菌であり、又は特に、サッカロミセス・セレビシエである。
【００６７】 上記の操作を実施する条件の詳細な説明は、以下の実験部において与えられる。
本発明の遺伝子が挿入されたプラスミドが、こうして得られ、次いで、宿主細胞
に導入されたこのプラスミドが、当業者に公知の通常の技術により得られる。
【００６８】 本発明の非常に正確な主題は、番号Ｉ−２０７２でＣＮＣＭに寄託されたプラ
スミドである。
【００６９】 それ故、それは、特に、本発明のＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子を含むＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅ／Ｙｅｐ２４−Ｃａｔｆｃ２株に関係する。
【００７０】 それ故、この遺伝子は、SEQ ID NO:１の配列７２０〜１９５５に対応する。
【００７１】 本発明を実施する操作条件は、以下に、実験部で説明する。
【００７２】 ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子によりコードされるＴＦＩＩＩＡタンパク質は、それ
故、転写因子である。実際、本発明の遺伝子によりコードされるＴＦＩＩＩＡタ
ンパク質は、ＤＮＡに結合するタンパク質としての生物学的役割を有しており、
転写因子として有用であろう。
【００７３】 特に、本発明の遺伝子は、種々の組織で発現され、５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子
の転写開始において重要な役割を演じている。これらの因子の研究は、転写調節
機構の分析においても有用であり得る。
【００７４】 本発明の主題は、それ故、抗真菌性生成物をスクリーニングする方法であって
、上記の転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡの活性を、抗真菌特性を測定する必要のある
各生成物の存在下で測定する段階を含み、この活性に対する阻害効果を有する生
成物を選択することを特徴とする当該方法である。
【００７５】 以下の実験部で示すカンジダ・アルビカンス及びサッカロミセス・セレビシエ
の転写因子の機能的同族体の本発明の範囲内の例証は、本発明の転写因子ＣＡＴ
ＦＩＩＩＡの多くの応用を構想することを可能にする。
【００７６】 特に、ＳＣＴＦＩＩＩＡが細胞の生存に必須であるらしいという事実の故に、
この活性を阻害する物質は、抗真菌剤として(医薬として又は産業レベルで)利用
することができる。
【００７７】 例えば、抗真菌性物質例えばカンジダ・アルビカンスに対して活性な物質をスク
リーニングするために、ＣＡＴＦＩＩＩＡの活性又はＴＦＩＩＩＡ転写因子によ
り構成されるその機能的同族体の活性を、抗真菌特性を測定する必要のある各生
成物の存在下で測定し、この活性に対する阻害効果を有する生成物を選択する。
【００７８】 かかるスクリーニングは、試験すべきアクチベーター又は潜在的阻害剤の存在
下で、ＴＦＩＩＩＡの転写活性を測定することにより実施することができる。５
ＳＲＮＡの転写は、例えば、適当な反応媒質中で５ＳＲＮＡの合成を検出するこ
とによりイン・ビトロで直接測定することができる。
【００７９】 この転写活性は又、細胞生存力試験により、イン・ビボでも測定することができ
る。例えば、転写活性を、ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子によりトランスフォームされ
たＳＣＴＦＩＩＩＡを発現しない変異型サッカロミセス・セレビシエ細胞におい
て、有利に測定することができる。
【００８０】 この発明は又、ＴＦＩＩＩＡ転写因子を阻害する特性について上記のように選
択した生成物の、抗真菌剤の獲得のための利用をも包含する。
【００８１】 本発明は、以下の本発明のＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子のクローニングを記載した
実験部を参照することにより一層理解されよう。
【００８２】 本発明の主題は、従って、上記の抗真菌性生成物をスクリーニングする方法に
より選択した生成物の、抗真菌剤を得るための利用である。
【００８３】 本発明の主題は、カンジダ・アルビカンスの転写因子ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子
又はこの遺伝子によりコードされる転写因子の、上で規定したカンジダ・アルビ
カンスの転写因子の阻害剤として利用される抗真菌特性を有する生成物の選択の
ための利用でもある。
【００８４】 本発明の主題は又、少なくとも一の上記のカンジダ・アルビカンスの転写因子
の阻害剤を活性成分として含む医薬組成物でもある。
【００８５】 かかる組成物は、特に、局所的及び全身性の真菌感染症の治療に有用である。 上記の医薬組成物は、経口、直腸、非経口経路で投与することができ、又は皮膚
又は粘膜への局所的適用のように局所的経路により投与することができ、又は注
射(静脈注射又は筋肉注射)により投与することができる。これらの組成物は、固
体でも液体でもよく、現在ヒトの医療で用いられているすべての医薬形態例えば
錠剤又は糖衣錠、ゼラチンカプセル、顆粒、坐薬、注射薬、軟膏、クリーム、ゲ
ル及びエアゾール製剤(これらは、通常の方法により製造される)において存在し
得る。活性成分は、これらの医薬組成物中で通常使用されている賦形剤例えばタ
ルク、アラビアゴム、ラクトース、澱粉、マグネシウムステアレート、ココアバ
ター、水性又は非水性ビヒクル、動植物起源の脂肪物質、パラフィン誘導体、グ
リコール、様々な湿潤剤、分散剤又は乳化剤及び防腐剤に組み込むことができる
。
【００８６】 投与量は、使用する生成物、治療される患者及び問題の病気によって、変化し
得る。
【００８７】 本発明の特別の主題は、従って、上記の組成物例えば抗真菌剤の利用である。
【００８８】 本発明の主題は、動物に免疫応答を誘導する方法であって、この動物に、上記
の本発明のポリペプチド又は同じ機能を有するこのポリペプチドの断片を、この
動物を病気から保護する抗体を生成するために接種することを含む当該方法でも
ある。
【００８９】 本発明の主題は、それ故、転写因子機能ＣＡＴＦＩＩＩＡを有する上記の本発
明のポリペプチド又は同じ機能を有し、本発明のポリヌクレオチドにより特に上
記のＤＮＡ配列によりコードされるこれらのポリペプチドの断片に対する抗体で
ある。
【００９０】 本発明のポリペプチドは、従って、これらのポリペプチドに対する免疫特異的な
抗体を生成するための免役原として用いることができる。用語抗体は、等しく、
モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖、非ヒト抗体及びヒト抗体で
ある抗体並びに、Ｆab免疫グロブリンバンクの生成物を含むＦab断片を指す。本
発明のポリペプチドに対して生成される抗体は、本発明のポリペプチド又はエピ
トープを有する断片、それらの類似体又は動物細胞(好ましくは、非ヒト動物細
胞)の投与により得られる(モノクローナル抗体の製造のための日常的プロトコー
ルを使用)。かかる抗体は、この分野で周知の方法(例えば、Antibodies, Labora
tory manual HarborDavid Larre編、Cold Spring Harbor laboratory編、1988な
る本に記載された方法)により製造することができる。
【００９１】 本発明の非常に特別の主題は、従って、本発明のＣＡＴＦＩＩＩＡタンパク質
又は同じ機能を有するこのタンパク質の断片に対する抗体である。
【００９２】 本発明の主題は、ＣＡｔｆＩＩＩＡ転写因子遺伝子又は上記のこの遺伝子によ
りコードされる転写因子の、病原性酵母カンジダ・アルビカンスにより引き起こ
された病気の診断又は治療に用いることのできる組成物の製造ための利用でもあ
る。
【００９３】 本発明は又、本発明のポリヌクレオチドの診断用試薬としての利用にも関係す
る。カンジダ・アルビカンスのＴＦＩＩＩＡタンパク質をコードする本発明のポ
リヌクレオチド又はその類似体の真核細胞特に哺乳動物細胞特にヒト細胞内での
検出は、病気を診断する手段を構成することができ：従って、本発明のかかるポ
リヌクレオチド、特に、ＤＮＡ配列は、広範囲の技術によって、本発明のポリヌ
クレオチドの少なくとも一つを含む生物体が感染した真核細胞特に哺乳動物細胞
(一層特に、ヒト細胞)において検出することができる。診断手段としてのかかる
利用のための核酸は、感染細胞又は組織例えば骨、血液、筋肉、軟骨又は皮膚に
おいて検出することができる。この検出のために、ゲノムＤＮＡを直接利用する
ことができ、又はＰＣＲその他の増幅技術によって増幅することもできる。ＲＮ
Ａ又はＤＮＡ及びｃＤＮＡも、同じ目的で利用することができる。増幅技術によ
り、真核生物特に哺乳動物一層特にヒトに存在する真菌の系統を、遺伝子型の分
析により特性決定することができる。欠失又は挿入を、増幅生成物の大きさの標
準配列の遺伝子型と比較しての変化により検出することができる。変異点を、増
幅したＤＮＡと、放射性エレメントで標識した本発明のポリヌクレオチドの配列
とのハイブリダイゼーションにより同定することができる。それ故、好ましくは
、相補的配列を、二重鎖から区別することができる(ヌクレアーゼ消化に対する
抵抗性が低い)。これらのＤＮＡ配列の差異も又、ゲル中でのＤＮＡ断片の電気
泳動(変性剤を伴うか又は伴わない)における移動度の変化により、又は直接的Ｄ
ＮＡ配列決定により検出することができる(参考：Myers等、Science, 230:1242(
1985))。
【００９４】 特定の位置での配列の変化は、ＲＮアーゼＩ及びＳ１等のヌクレアーゼに対する
保護実験により又は化学的開裂法よっても示すことができる(参考：Cotton等、P
roc.Natl.Acad.Sci. USA, 85:4397-4401(1985))。
【００９５】 変異又は多形を有する本発明のポリヌクレオチドの１つを含む細胞も又、特に、
セロタイプを測定することを可能にする多くの技術により検出することができる
。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、突然変異を検出することができる。ＲＴ
−ＰＣＲ技術を自動検出システム(例えば、ＧｅｎｅＳｃａｎ技術)と共に用いる
ことは、特に好ましい。ＲＮＡ及びｃＤＮＡは、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ技術で
用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドの粗補的プライマーを用いて、突然変異を同定して分析することができる。
【００９６】 それ故、プライマーを用いて、感染した個体から単離したＤＮＡを増幅すること
ができる。この方法で、ＤＮＡ配列中の変異を検出して、感染を診断し、感染性
因子のセロタイプ又は分類を決定するために利用することができる。かかる技術
は、当業者には標準的なものであり、特に、マニュアル「Current Protocols in
Molecular Biology」(Ausubel等編、John Wiley & Sons, Inc, 1995)に記載さ
れている。
【００９７】 本発明は、それ故、病気好ましくは特にカンジダ・アルビカンスにより引き起
こされる真菌感染症例えば上記の真菌症を診断する方法に関係し、この方法は、
感染した個体から採取した試料から本発明のポリヌクレオチドの量の増加を測定
することを含む。かかるポリヌクレオチドは、特に、上記の本発明のＤＮＡ配列
を有する。
【００９８】 ポリヌクレオチドの量の増加又は減少は、当業者に周知の技術例えば、特に、増
幅、ＰＣＲ、ＲＴ ＰＣＲ、ノーザンブロッティング又は他のハイブリダイゼー
ション技術により測定することができる。
【００９９】 加えて、本発明による診断方法は、本発明のポリペプチドの、感染の存在を検出
するために用いる正常の非感染組織により構成される対照試料と比較して大きす
ぎる発現の検出よりなる。
【０１００】 それ故、宿主細胞試料中で発現されたタンパク質の量を検出するために用いるこ
とのできる技術は、当業者に周知である。従って、例えば、放射免疫アッセイ又
は競争的結合技術、ウエスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡ試験(上記のAusubel
参考)を挙げることができる。
【０１０１】 本発明の主題は又、真菌感染症の診断のためのキットであって、上記の本発明
によるＤＮＡ配列又は類似の機能を有する配列又はこの配列の機能的断片、この
配列によりコードされるポリペプチド又は同じ機能を有するポリペプチド断片又
はこのＤＮＡ配列によりコードされたかかるポリペプチド若しくはこのポリペプ
チドの断片に向けられた抗体を含む当該真菌感染症の診断のためのキットでもあ
る。
【０１０２】 従って、このキットは、上記の本発明によるＤＮＡ配列及び例えばＤＮＡ配列SE
Q ID NO:１若しくはこの配列の断片を含むことができ、SEQ ID NO:の配列７２０
〜１９５５を含むこともできる。
【０１０３】 かかるキットは又、本発明によるポリペプチド又はこのポリペプチドの断片、特
に、ＡＡ配列SEQ ID NO:３を有するタンパク質をも含むことができ、上記の抗体
をも含むことができる。
【０１０４】 かかるキットは、当業者に周知の方法により製造することができる。 本発明において示された配列SEQ ID NO:１〜９は、以下に記載する。 以下の実験部は、本発明を説明することを可能にするが、それを制限はしない。
【０１０５】実験部 実施例１ ：ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子のクローニング及び配列決定 ａ）培養条件： 細菌のＤＨ５ａｌｐｈａ(Gibco BRL)又はＸＬ１−Ｂｌｕｅ型Ｋ１２(Stratage
ne)大腸菌株を、本発明のプラスミドの調製に使用した。この細菌の増殖を、通
常の条件に従って、水１リットル当たり１０ｇのバクトリプトン、５ｇの酵母エ
キス及び１０ｇのＮａＣｌを含み且つ１００μｇ／ｍｌのアンピシリン(SIGMA)
を含む液体ＬＢ培地中で実施した。
【０１０６】 コロニーを、固体ＬＢ＋寒天＋アンピシリン培地上に取り出してから、１００ｍ
ｌのＬＢ培地中で培養し、ＯＤ(６００ｎｍ)＝０．８までインキュベートした。
インキュベーションを、３７℃、常圧で、２２５ｒｐｍで撹拌しながら行った。
この株の生存力は、ＬＢ＋アンピシリン(１００μｇ／ｍｌ)培地で増殖した場合
に確認された。
【０１０７】 Ｂｌａアンピシリンに対する耐性の遺伝子は、ＣＡｔｆＩＩＩＡの断片がクロー
ン化されるベクターの部分を形成するということに注意することができる。それ
故に、本発明のカンジダ・アルビカンスのｔｆＩＩＩＡ遺伝子を含むプラスミド
を含む株の選択を、これらの株をアンピシリン(１００μｇ／ｍｌ)を含むこの培
地で培養することにより行うことができる(かかる培地は、アンピシリン耐性遺
伝子を含む株の生存のみを許し、それ故、本発明のカンジダａ．のｔｆＩＩＩＡ
遺伝子を含む株のみ生存させる)。
【０１０８】 得られた株の保存のためには、１５％のグリセロールを培地に加え：それ故、こ
れらの培養物は、懸濁培地ＬＢ＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン＋１５％のグ
リセロール中で、ＯＤ(６６０ｎｍ＝０．８)の細菌濃度でクリオチューブ中のア
リコートの形態で保存される(チューブ当たり１ｍｌ)。
【０１０９】 配列決定のために、以下に示すクローニング操作の各々に由来する幾つかの細菌
のプラスミドＤＮＡを市販のキット(Ｑｉａｇｅｎプラスミドキット)を用いて調
製する。ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子の配列に対応する断片を、その二本鎖について
、当業者に公知の標準的技術によって配列決定を行う(ＡＢＩ３７７ＸＬシーケ
ンサー、Perkin Elmer社製、使用)。
【０１１０】 ｂ）ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子のクローニング及び配列決定： 本発明の範囲内で、図１に示した転写因子ＣＡをコードする遺伝子(即ち、SEQ I
D NO:１)は、カンジダ・アルビカンスの遺伝子断片バンクから単離された(Sangl
ard等、Antimicrobial agents and chemotherapy 39, 2378-2386,(1995))。
【０１１１】 この遺伝子の構造を、配列決定により同定した。 用いたストラテジーは、ＳＣとＣＡは、類似した酵母であり、それらの遺伝子構
造は、相同であり得るという仮説に基づく。
【０１１２】 次いで、下記のプロセスを実施する： 本発明の範囲内で、カンジダ・アルビカンスゲノムの予備配列にアクセスするこ
とを可能にするスタンフォードインターネットサイトを用いることにより、Ｓ．
セレビシエｔｆＩＩＩＡと相同な配列の画分が同定された。この断片は、タンパ
ク質をコードするオープンリーディングフレーム(２５８ｂｐ)を含み、該タンパ
ク質について、２つの亜鉛フィンガー及びＳＣのＴＦＩＩＩＡ因子に特徴的なセ
リン残基に富む領域を同定することができる。このオープンリーディングフレー
ムは、実際は、２５９ヌクレオチドを含む。カンジダ・アルビカンスに対応する
断片を増幅するために、２つのオリゴヌクレオチドをこの配列から選択した。こ
れらのオリゴヌクレオチドは、下記の通りである： ＩＮＴ ＣＡＮＤ(SEQ ID NO:１の７２０〜７４０位に位置し、SEQ ID NO:４と
呼ばれる)及び ３’ＣＡＮＤ(SEQ ID NO:１の９５５〜９７８位に位置し、SEQ ID NO:５と呼ば
れる)。 ２５９塩基対の断片が、こうして得られる。
【０１１３】 ＣＡ細胞から当業者に公知の通常の方法により調製したＣＡゲノムＤＮＡの断片
及び他方ＣＡ遺伝子バンクにて調製したＣＡゲノムＤＮＡの断片を増幅すること
が可能であるということが最初にＰＣＲにより確認された。これらのオリゴヌク
レオチドは、カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡから、キット(Ｍｅｇａ
Ｐｒｉｍｅ、Amersham)を用いて３２Ｐ(リン３２)で標識されたプローブを調製
するために、ＤＮＡ断片を合成することをも可能にした。
【０１１４】 この断片を、ベクターＹＥｐ２４(マルチコピー−Ｕｒａ３)のＢａｍＨＩ部位に
クローン化したカンジダ・アルビカンスのゲノムのＳａｕ３Ａ断片のバンクのス
クリーニングに用いた[Botstein等、Gene, 8, 17-24,(1979)]。
【０１１５】 上記の断片を含むベクターＹＥｐ２４(選択遺伝子ＵＲＡ３を有するマルチコピ
ーベクター)でトランスフォームしたＤＨ５ａｌｐｈａ大腸菌を、ＬＢ＋アンピ
シリン培地を含むディッシュ上に置いて３７℃で培養した。次いで、ニトロセル
ロースフィルター上のレプリカを当業者に公知の技術により処理する[例えば、
０．５Ｍ ＮａＯＨで５分間；１Ｍ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ＝７．５)で５分間；
１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)で]。
【０１１６】 乾燥に関しては、これらのフィルターを、１０分間８０℃においてから、ＵＶ(S
tratalinker)で固定する。予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーシ
ョンを、０．５Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液(ｐＨ７．２)；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；７％
ＳＤＳにて行う(参考：Church及びGilbert, PNAS 81:1991(1984))。
【０１１７】 プローブを、ＭｅｇａＰｒｉｍｅ及び(α３２Ｐ)ｄＣＴＰキット(Amersham UK)
を用いて３２Ｐで標識する。ハイブリダイゼーションを一晩６５℃で行う。次い
で、これらのフィルターを、１％ＳＤＳ、４０ｍＭ ＮａＰＯ４(ｐＨ７．２)中
で各５分ずつ６回、６５℃で洗浄し、次いで、それらを一晩オートラジオグラフ
ィーにかける。フィルター上での３２Ｐで標識したプローブとのハイブリダイゼ
ーションは、ディッシュ中で再培養された幾つかの陽性クローンを、それらを単
離するために選択することを可能にした。個々のクローンが、こうして得られる
。
【０１１８】 本発明のＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子の異なるインサートを含む９、１８及び４７と
呼ばれる３つのタイプのクローンが、こうして得られ、ＰＣＲ分析は、２５９ｂ
ｐの断片の存在を確認した。
【０１１９】 カンジダ・アルビカンスのインサートを含むＹＥｐ２４プラスミドを、これらの
コロニーから集めた。これらのプラスミドの各々の制限地図を確立し、これは、
すべてのインサートが、カンジダ・アルビカンスゲノムの同じ領域に由来するこ
とに注意することを可能にした。この領域の配列決定のために、下記のオリゴヌ
クレオチドを用いた： ＩＮＴ−Ｃａｎｄ(SEQ ID NO:１の７２０〜７４０位に位置し、SEQ ID NO:４と
呼ばれる) ３’−Ｃａｎｄ(SEQ ID NO:１の９５５〜９７８位に位置し、SEQ ID NO:５と呼
ばれる) Ｃｏｎｔ−Ｉｎｔ(SEQ ID NO:１の７１９〜７４１位に位置し、SEQ ID NO:６と
呼ばれる) Ｃａｎ−Ｋｏｒ１(SEQ ID NO:１の１３６５〜１３８９位に位置し、SEQ ID NO:
７と呼ばれる) 及び、配列ＡＢＩ３７７ＸＬ(Perkin Elmer)。この領域の配列決定は、下記の点
を明らかにすることを可能にした： １）これらの３つのクローンは、すべて、唯一つのオープンリーディングフレー
ム(一つのタンパク質をコードする同じ配列を有する１２３６ｂｐにわたって連
続している)を含む。 ２）このオープンリーディングフレームは、サッカロミセス・セレビシエのＴＦ
ＩＩＩＡ因子と有意の相同性を示す４１２ＡＡのタンパク質をコードする。この
タンパク質の分析は、転写因子ＴＦＩＩＩＡの特徴である９つの亜鉛フィンガー
部分を見出すことを可能にする、ＳＣＣＡＴＩＩＩＡとＴＦＩＩＩＡのタンパク
質配列の比較は、５０％の相同性と４５％の同一性を示すことを可能にする。ア
ミノ酸翻訳に関しては、カンジダ・アルビカンスでは、ＣＴＧコドンがセリンに
翻訳されるという事実とカンジダ・アルビカンスのＴＦＩＩＩＡ中には、２つの
ＣＴＧコドンがあるという事実を考慮した。
【０１２０】 下記に注意すべきである： − Ｎ末端部分のセリンリッチ領域の保存。 − ＳＣに特徴的な８及び９亜鉛フィンガー間の非常に長い中間領域の存在。
【０１２１】 ＳＣのＴＦＩＩＩＡタンパク質とカンジダ・アルビカンスのＴＦＩＩＩＡとの間
の配列の差異は、亜鉛フィンガー部分の外側のＣ末端部分に位置している。
【０１２２】 プロモーター領域とＣＡＴＦＩＩＩをコードする配列とを含むＹＥｐ２４プラス
ミドを、大腸菌株ＸＬ１Ｂｌｕｅにトランスフォームしてから、番号Ｉ−２０７
２でＣＮＣＭ(Institut Pasteur 25 rue of Docteur ROUX 75015 Paris)に１９
９８年９月１５日に寄託した。
【０１２３】実施例２ ：ｔｆＩＩＩＡ遺伝子の発現 クローン９に含まれる断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより認識され
る配列を含み、ｔｆＣ２遺伝子とハイブリダイズするプライマーを用いるＰＣＲ
により増幅した。
【０１２４】 これらのプライマーは、下記の通りである： ５−ＥｃｏＴＦ(SEQ ID NO:１の７２０〜７３２位に位置し、SEQ ID NO:８と呼
ばれる)及び ３’−ＸｈｏＩ(SEQ ID NO:１の１９４６〜１９６０位に位置し、SEQ ID NO:９
と呼ばれる)。
【０１２５】 次いで、ゲノムＤＮＡのＰＣＲによる増幅を、下記の様式で行った： ０．５μｇのクローン９のＤＮＡを、２００ｎｇ／ｍｌの各ｄＮＴＰ、各２５μ
モル／ｌの割合の上記のプライマー、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×Ｐｆｕ緩衝液、
５Ｕ Ｐｆｕポリメラーゼ(Perkin Elmer)を含む５０μｌの反応溶液に加える。
【０１２６】 この反応媒質を、３０サイクルのＰＣＲサイクル(各々は、９４℃で３０秒、次
いで、６０℃で４５秒、次いで、７２℃で１分である)にかける。
【０１２７】 ＣＡＴＦＩＩＩのコード配列を含む断片を、ベクターｐＹＸ１２２(ＣＥＮ、Ｈ
ＩＳ３)及びｐＹＸ２２２(２ミクロン、ＨＩＳ３)(R and D System)中にサブク
ローン化した。このプラスミドを用いて、サッカロミセス・セレビシエｃ．細胞
をトランスフォームした。ＹＷＲＩ(Ｍａｔ ａｌｐｈａ、ｃａｎ １−１００
、ｈｉｓ ３−１１、ｌｅｕ ２−３、１１２ ｔｒｐ １−１、ｕｒａ ３−
１、ａｄｅ ２−１、ｔｆＣ２：ｌｅｕ２＋ｐＪＡ２３０)、(Camier等、Proc.N
atl.Acad.Sci. 92.9338-9342, 1995)。
【０１２８】 上記と同じ方法によりトランスフォームした株は、ＨＡタグを含むカンジダ・ア
ルビカンスの転写因子ＴＦＩＩＩＡの発現を与える。
【０１２９】 それ故、上記の実験の実施は、下記の点を示す： １）カンジダ・アルビカンスのＴＦＩＩＩＡ因子の遺伝子が、実施例１で示した
ようにして得たクローン９、１８及び４７において単離された(ハイブリダイゼ
ーション技術を用いて、カンジダ・アルビカンスの遺伝子バンクから)。この遺
伝子の構造を、配列決定により同定した。 ２）実施例１で得られたＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子のＣＡＴＦＩＩＩＡタンパク質
は、４１２ＡＡにより構成され、ＳＣＴＦＩＩＩＡ因子との高い相同性を示す。
このタンパク質は、Ｎ末端のＳＥＲ残基に富む領域及び９つの亜鉛フィンガー部
分を含み、その配置は、ＳＣのＴＦＩＩＩＡタンパク質のそれと同じである。 ３）カンジダ・アルビカンスのＴＦＩＩＩＡ因子の遺伝子のサブクローニングを
行い、この遺伝子は、ＳＣプロモーターの制御下にあった。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/40 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４ 16/14 1/21 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/566 33/53 33/569 Ａ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:725） 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:725） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 アンドレ サントナク フランス国 エフ91191 ジフ スール イヴェット、バティマン 142 セア／サ クレイ、セルヴィス ド ビオシミ エ ジェネティク モレキュレル Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA28 AA40 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB04 4B024 AA01 AA13 BA49 BA80 CA04 CA11 DA06 DA12 EA04 GA11 HA01 HA03 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ07 QQ20 QR33 QR59 QR75 QR76 QR80 QS05 QS36 QX01 QX02 4B064 AG01 CA02 CA06 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA73Y AA80X AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA17 NA14 ZB351 ZC202 ZC412 4C085 AA02 AA13 BA49 CC07 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA15 DA76 EA29 EA52 FA72 FA74

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の群から選択するヌクレオチド配列を含む単離されたポ
    リヌクレオチド： ａ）転写因子機能を有し且つ配列SEQ ID NO:３と相同なアミノ酸配列を有するポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも５０％の又は少なくとも
    ６０％の、好ましくは少なくとも７０％の類似性を有するポリヌクレオチド ｂ）ポリヌクレオチドａ）の相補的ポリヌクレオチド ｃ）ａ）及びｂ）に規定したポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続する塩基
    を含むポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列SEQ ID NO:１を含む、請求項２で規定した
    ポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 ヌクレオチド配列SEQ ID NO:１を含むカンジダ・アルビカン
    スＣＡＴＦＩＩＩＡの転写因子の生物学的機能を有するタンパク質をコードする
    ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子のＤＮＡ配列である、請求項１、２及び４で規定したＤ
    ＮＡ配列。
  6. 【請求項６】 SEQ ID NO:１のヌクレオチド７２０で始まり、ヌクレオチド
    １９５５で終わる配列を有する、請求項５に記載のＤＮＡ配列。
  7. 【請求項７】 アミノ酸配列SEQ ID NO:３(４１２ＡＡ)をコードする、請求
    項５又は６に記載のＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子のＤＮＡ配列。
  8. 【請求項８】 請求項５〜７に記載の転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡをコードす
    るＤＮＡ配列並びにそれとハイブリダイズし且つ／又はこの配列若しくはその断
    片と有意の相同性を有し且つ同じ機能を有するＤＮＡ配列。
  9. 【請求項９】 転写因子ＣＡＴＦＩＩＩＡと同じ生物学的活性を有するタン
    パク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチドの抑制、挿入及び／又は置換
    により導入された改変を含む、請求項５〜８に記載のＤＮＡ配列。
  10. 【請求項１０】 請求項５〜９の１つに記載のＤＮＡ配列並びに該ＤＮＡ配
    列と少なくとも５０％の又は少なくとも６０％の、好ましくは少なくとも７０％
    のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡ配列
  11. 【請求項１１】 請求項５〜１０の１つに記載のＤＮＡ配列並びに該ＤＮＡ
    配列によりコードされるＡＡ配列とＡＡ配列が少なくとも４０％の、特に４５％
    の、又は少なくとも５０％の、むしろ少なくとも６０％の、好ましくは少なくと
    も７０％の相同性を有する類似の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配
    列。
  12. 【請求項１２】 転写因子機能ＣＡＦＴＩＩＩＡを有し且つ請求項５〜１１
    の１つに記載のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列SEQ ID NO:３を有す
    るポリペプチド及びこのポリペプチドの類似体。
  13. 【請求項１３】 アミノ酸配列SEQ ID NO:３を有する組換えタンパク質ＣＡ
    ＴＦＩＩＩの製造方法であって、請求項５〜１１の１つに記載のＤＮＡ配列を適
    当な宿主中で発現させ、次いで、該組換えタンパク質を単離精製することを含む
    当該製造方法。
  14. 【請求項１４】 請求項５〜１１の１つに記載のＤＮＡ配列を含む発現ベク
    ター。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のベクターでトランスフォームした宿主
    細胞。
  16. 【請求項１６】 宿主細胞がＤＨ５ａｌｐｈａ大腸菌又はＸＬ１−Ｂｌｕｅ
    大腸菌である、請求項１３に規定した方法。
  17. 【請求項１７】 宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエである、請求項１
    ３に規定した方法。
  18. 【請求項１８】 ＣＮＣＭに、番号Ｉ−２０７２で寄託されたプラスミド。
  19. 【請求項１９】 抗真菌性生成物をスクリーニングする方法であって、請求
    項１２に規定したＣＡＴＦＩＩＩＡの転写活性因子を、抗真菌特性を測定する必
    要のある各生成物の存在下で測定する段階を含み、この活性に対する阻害効果を
    有する生成物を選択することを特徴とする当該方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法により選択した生成物の、抗真菌
    剤を得るための利用。
  21. 【請求項２１】 カンジダ・アルビカンスの転写因子ＣＡｔｆＩＩＩＡの遺
    伝子の、又は請求項５〜１２の１つに記載のこの遺伝子によりコードされる転写
    因子の、請求項１９に記載の抗真菌特性を有する生成物の、カンジダ・アルビカ
    ンスの転写因子の阻害剤としての選択のための利用。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に規定したカンジダ・アルビカンスの転写因子
    の少なくとも一の阻害剤を活性成分として含む医薬組成物。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に規定した組成物の抗真菌剤としての利用。
  24. 【請求項２４】 哺乳動物において免疫学的応答を誘導する方法であって、
    この哺乳動物に、請求項１２に規定したポリペプチド又は同じ機能を有するこの
    ポリペプチドの断片を、この動物を病気に対して保護することを可能にする抗体
    の産生ために接種することを含む当該方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１２に規定したポリペプチド又は同じ機能を有する
    このポリペプチドの断片に対する抗体。
  26. 【請求項２６】 ＣＡｔｆＩＩＩＡ遺伝子の又は請求項５〜１２の１つに記
    載のこの遺伝子によりコードされる転写因子の、病原性酵母カンジダ・アルビカ
    ンスにより引き起こされる病気の診断又は治療において用いることのできる組成
    物の製造のための利用。
  27. 【請求項２７】 真菌感染症の診断用のキットであって、請求項５〜１１の
    １つに規定したＤＮＡ配列又は類似の機能を有する配列又はこの配列の機能的断
    片、この配列によりコードされるポリペプチド又は同じ機能を有するポリペプチ
    ド断片又はこのＤＮＡ配列によりコードされるかかるポリペプチドに対する又は
    このポリペプチドの断片に対する抗体を含む当該キット。
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