JP2002529065A - 染色体１７ｑ連鎖−前立腺癌感受性遺伝子 - Google Patents

染色体１７ｑ連鎖−前立腺癌感受性遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、ヒト前立腺癌に対する病気素因遺伝子(ＨＰＣ２)を単離し、かつ、検出するのに用いる方法および材料に関し、そのＨＰＣ２のある種の突然変異は癌、特に前立腺癌に対する感受性を引き起こす。より詳細には、本発明は、ＨＰＣ２遺伝子中の生殖細胞系突然変異、ならびに前立腺癌に対する病気素因の診断におけるその使用に関する。本発明は、該ＨＰＣ２遺伝子の有害な対立遺伝子を保有する個人の前徴診断（presymptomatic therapy）にも関する。本発明は、さらに、ヒト前立腺癌におけるＨＰＣ２遺伝子中の体細胞突然変異、ならびにヒト前立腺癌の診断および予診におけるその使用に関する。加えて、本発明は、他のヒト癌におけるＨＰＣ２遺伝子中の体細胞突然変異、ならびにヒト癌の診断および予診におけるその使用に関する。本発明は、また、（遺伝子療法、タンパク質置換療法、タンパク質ミメティックスおよびインヒビターを包含する）ＨＰＣ２遺伝子中に突然変異を有するヒト癌の療法に関する。本発明は、さらに、癌療法用の薬剤のスクリーニングに関する。最後に、本発明は、突然変異についてのＨＰＣ２遺伝子のスクリーニングに関し、これは、前立腺癌に対する病気素因を診断するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、そのい
くつかの突然変異対立遺伝子が、癌、特に前立腺癌に感受性を引き起こすヒト前
立腺癌病気素因遺伝子(ＨＰＣ２)を単離し、検出するのに用いる方法および材料
に関する。より詳細には、本発明は、ＨＰＣ２遺伝子における生殖細胞系突然変
異、ならびに前立腺癌に対する病気素因の診断におけるその使用に関する。本発
明は、さらに、ヒト前立腺癌におけるＨＰＣ２遺伝子における体細胞突然変異、
ならびにヒト前立腺癌の診断および予診におけるその使用に関する。本発明は、
該ＨＰＣ２遺伝子における生殖細胞系突然変異、ならびに他のヒト癌の病気素因
の診断におけるその使用にも関する。加えて、本発明は、他のヒト癌におけるＨ
ＰＣ２遺伝子の体細胞突然変異、ならびにヒト癌の診断および予診におけるその
使用に関する。また、本発明は、遺伝子療法、タンパク質置換療法およびタンパ
ク質ミメティックスを包含する、ＨＰＣ２遺伝子中に突然変異を有するヒト癌の
療法にも関する。本発明は、さらに、癌療法用薬剤のスクリーニングにも関する
。最後に、本発明は、前立腺癌の病気素因の診断に有用な、突然変異についての
ＨＰＣ２遺伝子のスクリーニングに関する。
【０００２】 本発明の背景、および特に、実施に関するさらなる詳細を提供する場合を明ら
かにするために本明細書中で用いる刊行物および他の材料は、出典明示して本明
細書の一部とみなし、簡便のために、以下の明細書中の著者および日付けによっ
て示し、添付する参照リスト中に各々グループ化する。
【０００３】 癌の遺伝学は複雑であり、３の厳密に規定されていないクラスの遺伝子の機能
を含む：（１）優性で、正のトランスフォーム状態のレギュレーター（オンコジ
ーン）；（２）劣性で、負のトランスフォーム状態のレギュレーター（腫瘍抑制
遺伝子）；（３）トランスフォーム細胞の生物学において直接的な役割を果たす
ことなく危険性を変調させる遺伝子（危険性変調因子）。
【０００４】 ある種のオンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子の特定の生殖系列対立遺伝子は、
癌に対する素因と病因的に関連付けられる。この遺伝子のセットは、腫瘍素因遺
伝子という。クローン化されて特徴付けられている幾つかの腫瘍素因遺伝子は：
１）網膜芽細胞腫（ＲＢ１）；２）ビルムス病（ＷＴ１）；３）リー・フラウメ
ニ（ＴＰ５３）；４）家族性腺腫様ポリポシス（ＡＰＣ）；５）１型神経繊維腫
症（ＮＦ１）；６）２型神経繊維腫症（ＮＦ２）；７）ヒッペル・リンドウ症候
群（ＶＨＬ）；８）多発性内分泌腺腫２Ａ（ＭＥＮ２Ａ）；９）メラノーマ（Ｃ
ＤＫＮ２およびＣＤＫ４）；１０）乳癌および卵巣癌（ＢＲＣＡ１およびＢＲＣ
Ａ２）；１１）カウデン病（ＭＭＡＣ１）；１２）多発性内分泌腺腫（ＭＥＮ１
）；１３）母斑性基底細胞癌症候群（ＰＴＣ）；１４）結節硬化症２（ＴＳＣ２
）；１５）色素性乾皮症（ヌクレオチド切除修復に関与する遺伝子）；１６）遺
伝性非ポリポシス結腸直腸癌（ミスマッチ修復に関与する遺伝子）に対する感受
性に影響を及ぼす。
【０００５】 ある種の危険性変調因子遺伝子の特定の生殖系列対立遺伝子は癌に対する素因
とも関連付けられるが、危険性の上昇は時としてそれがある種の環境、食事また
は他の因子と組み合わさった場合にのみ明らかに発現される。アルコール・デヒ
ドロゲナーゼ（ＡＤＨ）はエタノールをアセトアルデヒドに酸化し、その化学物
質はラボ動物において変異原性および発癌性の双方である。ＡＤＨ３１対立遺伝
子によってコードされる酵素は比較的迅速にエタノールを酸化する一方で、ＡＤ
Ｈ３２対立遺伝子によってコードされる酵素はエタノールをよりゆっくりと酸化
する。ＡＤＨ３１ホモ接合体はおそらくアセトアルデヒドを合成する高い能力を
有し；多量に飲酒もする人は、等しく多量に飲酒するＡＤＨ３２ホモ接合体に対
して口腔、食道および（女性における）乳癌に対する高い危険性にある（Harty
ら，1997；Horiら，1997；Shields，1997）。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ
１（ＮＡＴ１）およびＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）によって
コードされるアセチルトランスフェラーゼは、タバコ製品を喫煙することから発
生する芳香族アミン発癌性物質を含む多くの生体異物のアセチル化を触媒する。
ヘビースモーカーでもあるＮＡＴ２のゆっくりとしたアセチル化形態につきホモ
接合体である個人は、等しく多量に喫煙するがＮＡＴ２の迅速なアセチル化形態
につきホモ接合体である個人よりも、肺、膀胱および（女性における）乳癌につ
きより大きな危険性にある（Shields，1997；Bouchardyら，1998）。
【０００６】 乳癌および前立腺癌のごときホルモン関連癌の危険性は、エストロゲンまたは
アンドロゲン代謝において役割を果たしている酵素における対立遺伝子変異型、
あるいはエストロゲンまたはアンドロゲンの生物作用を仲介するタンパク質にお
ける変異型によって調節され得る。ヒト・アンドロゲン受容体遺伝子中の多型性
ＣＡＧリピートは、タンパク質のアミノ末端付近の多型性ポリグルタミン域をコ
ードする。ポリグルタミン域の長さは、アンドロゲン受容体の転写活性化活性と
逆の相関関係にあり、従って、アンドロゲンに対する生物応答の１の態様である
。アンドロゲン受容体が比較的短いポリグルタミン域を含む男性は、アンドロゲ
ン受容体が比較的長いポリグルタミン域を含む男性よりも、前立腺癌、特に高ス
テージ／高組織学的等級の前立腺癌につきより高い危険性にある（Giovannucci
ら，1997）。
【０００７】 前立腺癌は多くの西洋諸国の男性において最も一般的な癌であり、男性におけ
る癌死亡の第２の主要な原因である。それは、年間、合衆国において４０,００
０人を超える死亡が概算される。死亡者の数は、今後１０ないし１５年間にわた
り上昇し続けるようである。合衆国においては、直接医学支出で年間１５０憶ド
ルを費やすと見積もられている。苦しむ負担に加えて、それは主要な公衆−健康
問題である。膨大な研究が前立腺癌の家族性集団についての証拠を提供しており
、家族の病歴がこの疾病についての主要な危険性因子であることを示している（
Cannonら，1982；Steinbergら，1990；Carterら，1993）。
【０００８】 前立腺癌は、一部、家族性疾病であると長い間認識されている。膨大な研究者
は、遺伝的な遺伝の証拠を調べ、データが主要感受性遺伝子座または座群につい
ての優性遺伝と最も一致すると結論付けた。Woolf（1960）は、死亡証明書デー
タを用いたユタ州における前立腺癌症例の第一親族の中で前立腺癌を発病する３
.０の相対危険性を記載した。前立腺癌症例の第一親族につき３ないし１１とラ
ンクされる相対危険性が報告されている（Cannonら，1982；Woolf，1960；Finch
amら，1990；Meikleら，1985；Krain，1974；Morgantiら，1956；Goldgarら，19
94）。Carterら（1992）は、単一の前立腺癌プロバンドを通して確かめた家族に
対して分離解析を行った。解析は、８５歳までに８８％のキャリアーにつき前立
腺癌の概算累積危険性を有する稀な（ｑ＝０．００３）、高危険性対立遺伝子の
常染色体優性遺伝を通した家族のサブセットにおけるメンデル遺伝を示唆してい
る。遺伝した前立腺癌感受性は、顕著な比率の早期発病疾病を占め、全体として
８５歳までに９％の前立腺発症に寄与した。最近の結果は、少なくとも４の遺伝
子座が存在し、それらは前立腺癌ならびに他の癌に対する感受性を運んでいるこ
とを示している。これらの遺伝子座は、第１染色体ｑ上のＨＰＣ１（Smithら，1
996）、第１７染色体ｐ上のＨＰＣ２（本特許出願、実施例１）、Ｘ染色体ｐ上
のＨＰＣＸ（Xuら，1998）およびマッピングされていない残りに寄与する１また
はそれを超える遺伝子座である。
【０００９】 染色体の規定セグメントに対する前立腺癌感受性についての遺伝的連鎖の検出
は、その染色体セグメント内のＤＮＡ配列変異型が癌感受性を付与することを必
要とする。これは、通常、原因配列変異型（群）が１もしくはそれを超える連鎖
遺伝子の発現を変化させるか、または１の連鎖遺伝子の機能を変化させるかのい
ずれかであろうことを意味するととられる。しかしながら、遺伝的連鎖の検出は
、必ずしも、どのクラスの遺伝子（すなわち、腫瘍抑制、オンコジーン、または
危険変調因子）が原因配列変異型（群）によって影響されるのかについての証拠
を提供するわけではない。
【００１０】 第１７染色体ｐに対する前立腺癌感受性の遺伝的連鎖から１７ｐ−連鎖前立腺
癌素因遺伝子（ＨＰＣ２）の同定まで進むための大部分のストラテジーは、その
中で原因配列変異型（群）をマッピングしなければならない染色体の分離セグメ
ントを明らかにする正確な遺伝的位置決定研究が要する。正確な遺伝的位置決定
に基づく遺伝子同定プロジェクトは、ポジショナル・クローニング・プロジェク
トと呼ばれる。ポジショナル・クローニングにおける一般的なストラテジーは、
遺伝的に明らかにした間隔内に位置する全ての遺伝子を見出し、これらの遺伝子
の中および付近の配列変異型を同定し、次いでこれらの配列変異型のうちのいず
れが関連遺伝子の１の（またはそれを超える）発現または機能のいずれかを変化
させるかを決定することである。連関した血縁におけるかかる配列変異型と疾病
の分離も示さなければならない。本発明者らは、第１７染色体ｐのＨＰＣ２領域
でポジショナル・クローニング・プロジェクトを実行し、個人を前立腺癌に罹り
やすくする生殖系列突然変異、本明細書中でＨＰＣ２と命名する遺伝子を見出し
た。
【００１１】発明の概要 本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、癌、特
に前立腺癌に対する感受性を生じるある種の対立遺伝子である、ヒト前立腺癌病
気素因遺伝子(ＨＰＣ２)を単離し、かつ検出するのに用いる方法および材料に関
する。より詳細には、本発明は、ＨＰＣ２遺伝子における生殖細胞系突然変異、
ならびに前立腺癌の病気素因の診断におけるその使用に関する。本発明は、該Ｈ
ＰＣ２遺伝子の有害な対立遺伝子を保有する個人の前徴診断（presymptomatic t
herapy）にも関する。本発明は、さらに、ヒト前立腺癌におけるＨＰＣ２遺伝子
の体細胞突然変異、ならびにヒト前立腺癌の診断および予診におけるその使用に
関する。加えて、本発明は、他のヒト癌におけるＨＰＣ２遺伝子の体細胞突然変
異、ならびにヒト癌の診断および予診におけるその使用に関する。本発明は、ま
た、（遺伝子療法、タンパク質置換療法、タンパク質ミメティックスおよびイン
ビターを包含する）ＨＰＣ２遺伝子に突然変異を有するヒト癌の療法に関する。
本発明は、さらに、癌療法用の薬剤のスクリーニングに関する。最後に、本発明
は、突然変異についてのＨＰＣ２遺伝子のスクリーニングに関し、それは前立腺
癌の病気素因を診断するのに有用である。該ＨＰＣ２遺伝子は、該ＨＰＣ２遺伝
子座についてのマーカーとして、および前立腺癌についてのマーカーとして有用
である。
【００１２】 表の簡単な説明 テーブル１は、ＨＰＣ２領域におけるマーカーについての２点ＬＯＤスコアの
編集である。 テーブル２は、ヒトＨＰＣ２遺伝子の仮説、部分ｃＤＮＡ配列をアセンブルす
るために用いたヒトＥＳＴ配列の受入番号のリストである。 テーブル３は、ヒトＨＰＣ２遺伝子の開始コドンおよび５'ＵＴＲの一部を含
む５'ＲＡＣＥ産物を得るために用いたプライマー、完全長ヒトＨＰＣ２発現構
築物を調製するために用いたプライマー、ならびにその構築物の配列をチェック
するために用いたプライマーのリストである。 テーブル４は、マウスＨＰＣ２遺伝子の仮説、部分ｃＤＮＡ配列をアセンブル
するために用いたマウスＥＳＴ配列の受入番号のリストである。 テーブル５は、マウスＨＰＣ２遺伝子の開始コドンおよび５'ＵＴＲの一部を
含む５'ＲＡＣＥ産物を得るために用いたプライマー、完全長マウスＨＰＣ２発
現構築物を調製するために用いたプライマー、ならびにその構築物の配列をチェ
ックするために用いたプライマーのリストである。 テーブル６は、ゲノムＤＮＡからヒトＨＰＣ２遺伝子を突然変異スクリーニン
グするために用いたプライマーのリストである。 テーブル７は、ヒトＨＰＣ２遺伝子の生殖系列配列変異型の一覧である。
【００１３】 配列表の概要 配列番号：１は、開始コドンから終止コドンに至るヒトＨＰＣ２ ｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列である。配列番号：２は、ヒトＨＰＣ２タンパク質のアミノ酸
配列である。配列番号：３は、開始コドンの５０塩基対上流から３'ＵＴＲの末
端に至るヒトＨＰＣ２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。配列番号：４ない
し配列番号：２７は、ヒトＨＰＣ２遺伝子のエキソン１ないしエキソン２４の配
列である。配列番号：２８は、ヒトＨＰＣ２遺伝子のゲノム配列である。配列番
号：２９−１９０は、ヒトおよび／またはマウスＨＰＣ２遺伝子を同定するため
、または突然変異につきスクリーニングするために用いたプライマーのヌクレオ
チド配列である。配列番号：１９１−２０９は、種々の配列変異型の付近および
それを含むＨＰＣ２のヌクレオチド配列である。配列番号：２１０はヒトＨＰＣ
２エキソン１のヌクレオチド配列であって、配列番号：２１１は対応するアミノ
酸配列である。配列番号：２１３はマウスＨＰＣ２エキソン１のヌクレオチド配
列であって、配列番号：２１３は対応するアミノ酸配列である。
【００１４】発明の詳細な説明 本発明は、好ましくは、長さにおいて少なくとも８塩基であって、約２７ｋｂ
を超えないＨＰＣ２遺伝子座または突然変異ＨＰＣ２遺伝子座の全体または一部
分よりなる単離ポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドはアンチ
センス・ポリヌクレオチドとし得る。本発明は、また、かかる単離ポリヌクレオ
チドよりなる組換え構築物、例えば、形質転換宿主細胞における発現に適した組
換え構築物を提供する。
【００１５】 また、本発明により、分析物中のＨＰＣ２遺伝子座またはその発現産物の一部
分を含むポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。かかる方法は、さらに、
ＨＰＣ２遺伝子座の一部分を増幅する工程を含んでよく、さらに、ＨＰＣ２遺伝
子座の該一部分を増幅するためのプライマーである１セットのポリヌクレオチド
を提供する工程を含んでよい。該方法は、癌に対する病気素因の診断、または癌
の診断もしくは予診のいずれかに有用である。該ＨＰＣ２遺伝子は、該ＨＰＣ２
遺伝子座についてのマーカーとして、および前立腺癌についてのマーカーとして
有用である。
【００１６】 本発明は、また、ＨＰＣ２遺伝子座によってコードされる少なくとも５個のア
ミノ酸残基よりなる単離ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体、好ましくは
モノクローナル抗体も提供する。
【００１７】 本発明は、また、ＨＰＣ２遺伝子座の一部分よりなるポリヌクレオチドを分析
物中で検出するためのキットを提供し、該キットは適当な容器中に密閉したＨＰ
Ｃ２遺伝子座の一部分に相補的なポリヌクレオチドおよびそれを使用するための
指示書を含む。
【００１８】 本発明は、さらに、重合性ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを調製し、Ｈ
ＰＣ２遺伝子座の少なくとも８つの隣接したヌクレオチドよりなる配列を得る方
法；ならびに、重合性アミノ酸を含むポリペプチドを調製して、ＨＰＣ２遺伝子
座内にコードされる少なくとも５個のアミノ酸を含む配列を得る方法を提供する
。
【００１９】 本発明は、さらに、突然変異を同定するためにＨＰＣ２遺伝子をスクリーニン
グする方法を提供する。かかる方法は、さらに、ＨＰＣ２遺伝子座の一部分を増
幅する工程をさらに含み得、かつ、ＨＰＣ２遺伝子座の該一部分を増幅するため
のプライマーである１セットのポリヌクレオチドを提供する工程を含み得る。か
かる方法は、ＨＰＣ２配列またはその配列の別個のサブセット、その配列または
その配列の別個のサブセットの全ての１−、２−、３−、または４−塩基欠如、
およびその配列またはその配列の別個のサブセットの全ての１−、２−、３−、
または４−塩基挿入により規定される短いポリヌクレオチドの完全なる組を与え
るステップも含むであろう。該方法は、癌に対する病気素因の診断または癌の診
断もしくは予診のいずれかで使用する突然変異の同定に有用である。 本発明は、さらに、ＨＰＣ２遺伝子中の突然変異を同定するための予想ＨＰＣ
２突然変異対立遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。 加えて、本発明は、抗癌治療として、ＨＰＣ２遺伝子産物機能の阻害または回
復のための薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００２０】 最後に、本発明は、癌細胞に指向する遺伝子-ベースの療法の作成に必要な手
段を提供する。これらの療法剤は、ＨＰＣ２タンパク質の機能が再構成されるよ
うに適当なベクターに設置するか、または、より直接的な方法で標的細胞にデリ
バリーするかのＨＰＣ２遺伝子座の全体または一部分を含むポリヌクレオチドの
形態を採り得る。療法剤は、また、ＨＰＣ２の部分的または全体的なタンパク質
配列のいずれかに基づいたポリペプチドの形態も採り得る。これらは、イン・ビ
ボ(in vivo)でＨＰＣ２の活性を機能的に置換し得る。
【００２１】 個人が前立腺癌に対する病気素因を作るＨＰＣ２遺伝子は、ＨＰＣ２タンパク
質をコードする遺伝子であり、このタンパク質が、公に入手可能なタンパク質ま
たはｃＤＮＡ配列と同一ではないことが判明したことは本発明の知見である。こ
の遺伝子は、本明細書中でＨＰＣ２と命名する。生殖細胞系におけるＨＰＣ２遺
伝子座中の突然変異が、前立腺癌に対する病気素因の指標になるということは本
発明の知見である。最後に、ＨＰＣ２遺伝子座における体細胞突然変異も、前立
腺癌および他の癌と関連していることが本発明の知見である。ＨＰＣ２遺伝子座
の突然変異事象には、コード配列および非-コード配列内における欠失、挿入お
よびヌクレオチド置換が含まれ得る。
【００２２】有用な診断技術 本発明の診断および予診によれば、野生型ＨＰＣ２遺伝子座の変化が検出され
る。加えて、該方法は、野生型ＨＰＣ２遺伝子座を検出し、ＨＰＣ２遺伝子座に
癌の素因の欠失を確認することによって行い得る。「野生型遺伝子の変化」とは
、コード領域および非コード領域における欠失、挿入および点突然変異を含むす
べての形態の突然変異が包含される。欠失は、遺伝子全体のものであるか、また
は遺伝子の一部分のみのものであり得る。点突然変異は終止コドン、フレームシ
フト突然変異またはアミノ酸置換を生じ得る。体細胞突然変異は、特定の組織、
例えば、腫瘍組織でのみ発生するものであり、生殖細胞系において遺伝されない
。生殖細胞系突然変異は体のいずれの組織においても見出すことができ、遺伝さ
れる。単一の対立遺伝子のみが体細胞的に突然変異した場合、初期新生生物状態
が示される。しかしながら、両方の対立遺伝子が体細胞的に突然変異した場合、
後期の新生生物状態が示される。かくして、ＨＰＣ２突然変異の知見は、診断お
よび予診の情報を両方提供する。欠失していないＨＰＣ２対立遺伝子(例えば、
姉妹染色体からＨＰＣ２欠失を運ぶ染色体の姉妹染色体で見出された)は、挿入
、小さな欠失および点突然変異のごとき他の突然変異につきスクリーニングし得
る。腫瘍組織において見出された多くの突然変異はＨＰＣ２遺伝子産物の発現を
低下に通じるものであろうと考えられる。しかしながら、非-機能的遺伝子産物
に通じる突然変異も、癌にかかった状態に通じるであろう。点突然変異事象は、
遺伝子のプロモーターでのごとき、調節領域中で起こり得、ｍＲＮＡの発現の欠
失または減少に通じる。点突然変異も、また、適当なＲＮＡプロセシングを破壊
し得、ＨＰＣ２遺伝子産物の発現の欠失、変化したＨＰＣ２遺伝子の発現、ある
いは、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率の低下に通じる。
【００２３】 有用な診断技術には、限定するものではないが、さらに以下で詳細に論じる蛍
光イン・サイチュ(in situ)ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)、直接ＤＮＡ配
列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、一本鎖構造解析(ＳＳＣＡ)、ＲＮ
アーゼ保護アッセイ、対立遺伝子-特異的オリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)、ドット
ブロット分析、金ナノ粒子で修飾した核酸を用いるハイブリダイゼーションおよ
びＰＣＲ-ＳＳＣＰが包含される。最近開発された技術であるＤＮＡマイクロチ
ップテクノロジーも有用である。
【００２４】 前立腺癌および本明細書で同定した他の癌のごとき癌の素因は、ＨＰＣ２遺伝
子の突然変異についてヒトのいずれかの組織を試験することによって確認し得る
。例えば、生殖細胞系ＨＰＣ２突然変異を遺伝した個人は、癌を発症し易い傾向
であろう。これは、該個人の体のいずれかの組織からのＤＮＡを試験することに
よって決定し得る。最も単純には、採血しその血液の細胞からＤＮＡを抽出する
。加えて、ＨＰＣ２遺伝子の突然変異について、胎児細胞、胎盤細胞または羊膜
細胞を試験することによっても出生前診断を行い得る。点突然変異または欠失の
いずれによるにせよ、野生型ＨＰＣ２対立遺伝子の変化は、本明細書で論じるい
ずれかの手段によって検出し得る。
【００２５】 ＤＮＡ配列変動を検出するのに用い得る幾つかの方法が存在する。手動配列決
定または自動化蛍光配列決定のいずれかの直接ＤＮＡ配列決定は、配列変動を検
出し得る。ＨＰＣ２ほど大きな遺伝子については、非常に激しい労働であるが、
最適条件下では遺伝子のコード配列における突然変異をめったに見失わない。別
のアプローチは、一本鎖構造多形性アッセイ(ＳＳＣＡ)(Ｏritaら，1989)である
。この方法は、特にＤＮＡフラグメントが２００ｂｐよりも大きな場合、すべて
の配列変化を検出しないが、最適化して大部分のＤＮＡ配列変動を検出すること
ができる。検出感度が低下することは不利であるが、ＳＳＣＡで可能な処理量の
増加は、それを、研究ベースの突然変異検出用の直接配列決定の魅力的な、可能
な別法としている。ＳＳＣＡゲル上でシフトした移動度を有するフラグメントを
ついで配列決定して、正確なＤＮＡ配列変動の性質を決定する。２つの相補的Ｄ
ＮＡ鎖の間の誤対合の検出に基づく他のアプローチには、締付変性電気泳動法(c
lamped denaturing denaturing gel elctrophoresis)(ＣＤＧＥ)(Ｓheffieldら
，1991)、ヘテロ二重らせん分析(heteroduplex analysis)(ＨＡ)(Ｗhiteら，199
2)および化学的誤対合切断(chemical mismatch cleavage)(ＣＭＣ)(Ｇrompeら，
1989)が含まれる。前記した方法はいずれも大きな欠失、二本鎖形成または挿入
を検出せず、あるいは、タンパク質の転写または翻訳に影響する調節的突然変異
を検出しないであろう。タンパク質先端切断アッセイまたは非対称アッセイのご
ときこれらのクラスの突然変異を検出し得る他の方法は、特異的な型の突然変異
のみを検出し、ミスセンス突然変異は検出しないであろう。ＤＮＡ配列変動を検
出する最近利用し得る方法の概説は、Ｇrompe(1993)による最近の概説において
見出すことができる。突然変異が判明したら、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チド(ＡＳＯ)ハイブリダイゼーションのごとき対立遺伝子特異的検出アプローチ
を利用して、同突然変異につき、膨大な数の他の試料を迅速にスクリーニングす
ることができる。かかる技術は金ナノ粒子で標識されたプローブを用いて可視的
な色結果を与え得る（Elghanianら、1997）。
【００２６】 組織中の野生型ＨＰＣ２遺伝子の変化を検出するためには、周囲の正常組織か
ら遊離した組織を単離することが有用である。腫瘍細胞の組織調製物を増やす方
法は当該分野で知られている。例えば、該組織は、パラフィンまたはクライオス
タット切片から単離し得る。癌細胞も、フローサイトメトリーによって正常細胞
から分離し得る。これらの技術、ならびに、正常細胞から腫瘍細胞を分離する他
の技術は当該分野でよく知られている。腫瘍組織が正常組織で非常に汚染されて
いる場合、突然変異の検出はより困難である。
【００２７】 点突然変異の検出は、当該分野でよく知られている技術を用いて、ＨＰＣ２対
立遺伝子(群)を分子クローン化し、該対立遺伝子(群)を配列決定することによっ
てなし得る。別法として、該遺伝子配列は、公知技術を用いて、腫瘍組織からの
ゲノムＤＮＡ調製物から直接増幅し得る。ついで、増幅した配列のＤＮＡ配列を
決定し得る。
【００２８】 感受性対立遺伝子の存在を確認するためのより完全で、いまだ間接的である試
験のよく知られた６種の方法が存在する：１）一本鎖形成構造分析(ＳＳＣＡ)(
Ｏritaら，1989)；２）変性勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)(Ｗartellら,1990；Ｓh
effieldら，1989)；３)ＲＡアーゼ保護アッセイ(Ｆinkelsteinら，1990；Ｋinsz
lerら，1991)；４）対立遺伝子-特異的オリゴヌクレオチド(ＡＯＳ)(Ｃonnerら
，1983)；５）イー・コリ(Ｅ.coli)mutＳタンパク質のごときヌクレオチド誤対
合を認識するタンパク質の使用(Ｍodrich，1991)；ならびに６）対立遺伝子-特
異的ＰＣＲ(ＲanoおよびＫidd，1989)。対立遺伝子-特異的ＰＣＲには、その３'
末端で特定のＨＰＣ２突然変異にハイブリダイズするプライマーを使用する。特
定のＨＰＣ２突然変異が存在しない場合、増幅産物は認められない。欧州特許公
開第0332435号およびＮewtonら，1989に開示された増幅耐性突然変異系(Ａmplif
ication Ｒefractory Ｍutation Ｓystem，ＡＲＭＳ)も用い得る。遺伝子の挿入
および欠失は、クローニング、配列決定および増幅によっても検出し得る。加え
て、遺伝子または周辺マーカー遺伝子の制限酵素断片長多形(ＲＦＬＰ)プローブ
を用いても、対立遺伝子の変化または多形フラグメント中の挿入を記録し得る。
かかる方法は、影響された個人において見出されたＨＰＣ２突然変異の存在につ
き、該個人の親類をスクリーニングするのに特に有用である。当該分野で公知で
ある挿入および欠失を検出する他の技術を用い得る。
【００２９】 最初の３種の方法(ＳＳＣＡ、ＤＧＧＥおよびＲＡアーゼ保護アッセイ)におい
ては、新たな電気泳動バンドが出現する。ＳＳＣＡは、異なって移動するバンド
を検出する。なぜならば、配列の変化が一本鎖、すなわち分子内塩基対合におい
て差を生じるからである。ＲＡアーゼ保護には、突然変異ポリヌクレオチドの２
または３以上のより小さなフラグメントへの切断が含まれる。ＤＧＧＥは、変性
勾配ゲルを用いて、野生型配列と比較した突然変異配列の移動速度における差を
検出する。対立遺伝子-特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいては、特異的な
配列を検出するようにオリゴヌクレオチドが設計されており、ハイブリダイゼー
ション信号の存在または不存在を検出することによって該アッセイを行う。ｍｕ
ｔＳアッセイにおいては、突然変異と野生型配列との間のヘテロ二重らせん中に
ヌクレオチド誤対合を含む配列にのみ該タンパク質が結合する。
【００３０】 本発明による誤対合とは、２本の鎖が１００％相補性でない場合のハイブリダ
イズした核酸二重らせんである。全相補性の欠失は、欠失、挿入、逆位または置
換に起因し得る。誤対合検出を用いて、遺伝子中またはそのｍＲＮＡ産物中の点
突然変異を検出し得る。これらの技術は配列決定よりも感度が低いが、それらは
、膨大な数の腫瘍試料で行うのにより単純である。誤対合切断技術の一例は、Ｒ
Ａアーゼ保護法である。本発明の実施においては、該方法は、ヒト野生型ＨＰＣ２
遺伝子コード配列に相補的な標識リボプローブの使用が含まれる。該リボプロー
ブと腫瘍組織から単離したｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとは共にアニーリン
グ(ハイブリダイズ)し、つづいて、二重らせんＲＮＡ構造中のある種の誤対合を
検出し得る酵素ＲＮアーゼＡで消化する。誤対合をＲＡアーゼＡによって検出す
る場合、それは誤対合の部位で切断する。かくして、アニーリングしたＲＮＡ調
製物を電気泳動ゲルマトリックス上で分離する場合に、もし誤対合をＲＮアーゼ
Ａによって検出し切断したら、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡの完全
長二重らせんＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が示されるであろう。該リボプロー
ブは、完全長のＨＰＣ２ ｍＲＮＡまたは遺伝子である必要はないが、そのいず
れかのセグメントとし得る。リボプローブがＨＰＣ２ ｍＲＮＡまたは遺伝子の
セグメントのみを含む場合、多数のこれらのプローブを用いて、誤対合につき全
ｍＲＮＡ配列をスクリーニングすることが望ましいであろう。
【００３１】 同様にして、ＤＮＡプローブを用いて、酵素的または化学的切断を介して、誤
対合を検出し得る(例えば、Ｃottonら，1988；Ｓhenkら，1975；Ｎovackら,1986
参照)。別法として、対合二重らせんに対する誤対合二重らせんの電気泳動移動
度のシフトによって、誤対合を検出し得る(例えば、Ｃariello，1988参照)。リ
ボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれを用いるにせよ、突然変異を含有し得
る細胞性ｍＲＮＡまたはＤＮＡは、ハイブリダイゼーション前にＰＣＲ(後記参
照)を用いて増幅し得る。ＨＰＣ２遺伝子のＤＮＡにおける変化は、特に、欠失
および挿入のごとき、変化が全体の再配列の場合、サザン・ハイブリダイゼーシ
ョンを用いても検出し得る。
【００３２】 ＰＣＲを使用することによって増幅したＨＰＣ２遺伝子のＤＮＡ配列は、対立
遺伝子-特異的プローブを用いてもスクリーニングし得る。これらのプローブは
核酸オリゴマーで、その各々は、公知の突然変異を隠し持つＨＰＣ２遺伝子配列
の領域を含んでいる。例えば、１つのオリゴマーは、ＨＰＣ２遺伝子配列の一部
分に対応する、約３０ヌクレオチド長とし得る。かかる一式の対立遺伝子-特異
的プローブを用いることにより、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングして、ＨＰＣ
２遺伝子中に予め同定した突然変異の存在を同定し得る。増幅したＨＰＣ２配列
と対立遺伝子-特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロ
ンフィルター上で行い得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
の特定のプローブに対するハイブリダイゼーションは、対立遺伝子-特異的プロ
ーブ中のごとく腫瘍組織中に同突然変異が存在することを示している。
【００３３】 マイクロチップ技術を介する核酸分析の新たに開発された技術も、本発明に適
用し得る。この技術においては、事実上数千の異なるオリゴヌクレオチド・プロ
ーブをシリコン・チップ上にアレイで確立する。分析すべき核酸を蛍光標識し、
チップ上のプローブにハイブリダイズさせる。また、これらの核酸マイクロチッ
プを用いて、核酸−タンパク質相互作用を研究することも可能である。この技術
を用いれば、突然変異の存在または分析する配列を配列決定することさえでき、
あるいは、目的の遺伝子の発現レベルを測定し得る。該方法は、一度の多くの、
数千でさえあるプローブの平行プロセシングのうちの１であり、分析速度をおび
ただしく上昇させ得る。この技術を用いた幾つかの論文が発表されている。これ
らのうちの幾つかは、Haciaら，1996；Shoemakerら，1996；Cheeら，1996；Lock
hartら，1996；DeRisiら，1996；Lipshutzら，1995である。この方法は、乳癌遺
伝子ＢＲＣＡ１中の突然変異について人々をスクリーニングするためにすでに用
いられている（Haciaら,1996）。この新たな技術は、Chemical and Engineering
News中のnews articleで概説されており（Borman，1996）、editorialの主題と
なっている（Nature Genetics，1996）。また、Fodor（1997）も参照されたし。
【００３４】 候補遺伝子座中の突然変異についての最も決定的な試験は、癌患者からのゲノ
ムＨＰＣ２配列と対照集団からのものを直接比較することである。別法として、
例えばＰＣＲによって増幅させた後にメッセンジャーＲＮＡを配列決定すること
ができ、それによって、候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要性が排除する
ことができよう。 ＨＰＣ２のコード領域の外側に入る癌患者からの突然変異は、ＨＰＣ２遺伝子
の付近またはその中のイントロンおよび調節配列のごとき非−コード領域を調べ
ることによって検出し得る。非コード領域中の突然変異が重要であるという初期
の徴候は、対照個人と比較して癌患者におけるメッセンジャーＲＮＡ分子の異常
なサイズまたはその量が多いことを明らかにするノザンブロット実験から生じ得
る。
【００３５】 ＨＰＣ２ ｍＲＮＡ発現の変化は、当該技術分野で知られているいずれかの技
術によって検出し得る。これらには、ノザンブロット分析、ＰＣＲ増幅、および
ＲＮアーゼ保護が含まれる。ｍＲＮＡ発現の低下は、野生型ＨＰＣ２遺伝子の変
化を示している。野生型ＨＰＣ２遺伝子の変化は、野生型ＨＰＣ２タンパク質の
変化につきスクリーニングすることによっても検出し得る。例えば、ＨＰＣ２と
免疫反応性のモノクローナル抗体を用いて、組織をスクリーニングし得る。同血
族抗原の欠損は、ＨＰＣ２突然変異を示すであろう。突然変異対立遺伝子の産物
に対して特異的な抗体を用いて、突然変異ＨＰＣ２遺伝子産物を検出することも
できよう。かかる免疫アッセイは、当該技術分野で知られているいずれかの簡便
様式で行い得る。これらには、ウエスタンブロット、免疫組織化学アッセイおよ
びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。変化したＨＰＣ２タンパク質を検出するため
のいずれかの手段を用いて、野生型ＨＰＣ２遺伝子の変化を検出し得る。タンパ
ク質結合性決定のごとき機能性アッセイを用い得る。加えて、ＨＰＣ２生化学機
能を検出するアッセイを用い得る。突然変異ＨＰＣ２遺伝子産物が見出されたこ
とは、野生型ＨＰＣ２遺伝子の変化を示している。
【００３６】 突然変異ＨＰＣ２遺伝子または遺伝子産物は、血清、便、尿および唾液のごと
き他のヒト身体試料においても検出し得る。組織中の突然変異ＨＰＣ２遺伝子ま
たは遺伝子産物の検出について前記に論じた同じ技術を、他の身体試料に適用し
得る。癌細胞は腫瘍から抜けて、かかる身体試料に現れる。加えて、ＨＰＣ２遺
伝子産物それ自体が、細胞外空間に分泌され、癌細胞が存在しない場合でもこれ
らの身体試料中に見出されることもある。かかる身体試料をスクリーニングする
ことによって、単純な迅速診断を多くのタイプの癌について達成し得る。加えて
、突然変異ＨＰＣ２遺伝子または遺伝子産物につきかかる身体試料を試験するこ
とによって、化学療法または放射線療法の進行をより簡単にモニターし得る。 本発明の診断方法は、ＨＰＣ２が腫瘍形成に役割を有するいずれの腫瘍に対し
ても適用可能である。本発明の診断方法は、臨床医が治療の適当な行程を決定し
得るように、彼らに有用である。
【００３７】 本発明のプライマー・ペアは、ＰＣＲを用いる特定のＨＰＣ２対立遺伝子のヌ
クレオチド配列を決定するのに有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーのペアは、
ＨＰＣ２遺伝子それ自体の増幅ＤＮＡ合成を準備するために、第１７染色体上の
ＨＰＣ２遺伝子の中またはそれを囲む配列にアニーリングし得る。これらのプラ
イマーの完全なセットにより、ＨＰＣ２遺伝子コード配列、すなわちエキソンの
全ヌクレオチドの合成が許容される。プライマーのセットは、好ましくは、イン
トロン配列およびエキソン配列の双方の合成を許容する。対立遺伝子−特異的プ
ライマーも用い得る。かかるプライマーは、特定のＨＰＣ２突然変異対立遺伝子
に対してのみアニーリングし、従って鋳型としての突然変異対立遺伝子の存在下
でのみ産物を増幅させるであろう。
【００３８】 増幅した配列のつづくクローニングを促進するために、プライマーは、その５
'末端に付けられた制限酵素部位配列を有し得る。従って、プライマーの全ヌク
レオチドは、制限酵素部位を形成するために必要な幾つかのヌクレオチドを除い
て、ＨＰＣ２配列またはＨＰＣ２に近接した配列由来のものである。かかる酵素
および部位は当該技術分野でよく知られている。プライマーそれ自体は、当該技
術分野でよく知られている技術を用いて合成し得る。一般的に、プライマーは、
市販されているオリゴヌクレオチド合成機を用いて作製し得る。配列番号：１お
よび３に示すＨＰＣ２オープンリーディングフレームの配列が与えられれば、特
定のプライマーのデザインは当業者の十分に範囲内にある。
【００３９】 本発明により提供される核酸プローブは、多くの目的に有用である。それは、
ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション、および前記にすでに論じ
た点突然変異を検出するためのＲＮアーゼ保護法において用い得る。プローブを
用いて、ＰＣＲ増幅産物を検出し得る。それを用いて、ＨＰＣ２遺伝子との誤対
合または他の技術を用いてｍＲＮＡとの誤対合を検出し得る。
【００４０】 野生型ＨＰＣ２遺伝子を有する個人はＨＰＣ２対立遺伝子から生じる癌を有し
ないことを発見した。しかしながら、ＨＰＣ２タンパク質の機能を妨害する突然
変異は癌の病因に関与している。従って、機能の損失または変化した機能を有す
るタンパク質を産生する変化した（または突然変異）ＨＰＣ２遺伝子の存在は、
癌の危険性の上昇に直接的に相関する。ＨＰＣ２遺伝子突然変異を検出するため
に、生物試料を調製し、分析するＨＰＣ２対立遺伝子の配列と野生型ＨＰＣ２対
立遺伝子の配列との間の相異について分析する。突然変異ＨＰＣ２対立遺伝子は
、前記したいずれかの技術によって最初に同定し得る。次いで、突然変異対立遺
伝子を配列決定して、特定の突然変異対立遺伝子の特定の突然変異を同定する。
別法として、突然変異ＨＰＣ２対立遺伝子は、従来技術を用いて、突然変異（変
化した）ＨＰＣ２タンパク質を同定することによって最初に同定し得る。次いで
、突然変異対立遺伝子を配列決定して、各対立遺伝子についての特定の突然変異
を同定する。次いで、突然変異、とりわけＨＰＣ２タンパク質の変化した機能に
通じるものを、本発明の診断および予後方法に用いる。
【００４１】定義 本発明は、以下の定義を用いる： 「ポリヌクレオチドの増幅」には、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、連結増幅
(またはリガーゼ鎖反応(ligase chain reaction，ＬＣＲ))およびＱ-ベータレプ
リカーゼの使用に基づく増幅法のごとき方法を用いる。らせん置換増幅法（ＳＤ
Ａ）、好熱性ＳＤＡ、および核酸配列ベースの増幅法（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ
）も有用である。これらの方法は、よく知られており、当該分野で広く実施され
ている(例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号、ならびに(ＰＣＲ
については)Innisら，1990；および(ＬＣＲについては)ＷuおよびWallace，1989
；（ＳＤＡについては）米国特許第5,270,184号および5,455,166号およびWalker
ら,1992；（好熱性ＳＤＡについては）Spargoら、および３ＳＲおよびＮＡＳＢ
Ａについては米国特許第5,409,818号、Fahyら、1991およびCompton,1991を参照)
。ＰＣＲを行う試薬およびハードウェアは市販されている。ＨＰＣ２領域からの
配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、ＨＰＣ２領域中の配列、
またはその中の標的領域に隣接する領域中の配列に相補的であって、それに特異
的にハイブリダイズする。増幅によって作製したＨＰＣ２配列は直接配列決定し
得る。別法として、あまり望ましくはないが、増幅した配列(群)は配列分析に先
んじてクローン化し得る。酵素的に増幅したゲノムセグメントの直接クローン化
および配列分析は、Ｓcharf，1986によって記載されている。
【００４２】 「分析ポリヌクレオチド」および「分析鎖」とは、標的配列を含むと予想され
、生物試料を包含する種々のタイプの試料中に存在し得る一本鎖または二本鎖ポ
リヌクレオチドをいう。
【００４３】 「抗体」；本発明は、また、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗
体およびその断片、ならびにその免疫学的な結合同等物を提供し、これらは、Ｈ
ＰＣ２ポリペプチドおよびその断片、またはＨＰＣ２領域からの、特にＨＰＣ２
遺伝子座またはその一部分からのポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る。
「抗体」なる語は、均一な分子基、または複数の異なる分子基より構成される血
清産物のごとき混合物をいうのに用法用いる。ポリペプチドは、ペプチド合成器
中で合成的に調製し、(例えば、鍵穴吸着性ヘモシアニンのような)キャリアー分
子にカップリングさせ、ウサギに数カ月にわたって注射し得る。ウサギ血清は、
ＨＰＣ２ポリペプチドまたは断片に対する免疫反応性につき試験する。モノクロ
ーナル抗体は、タンパク質ポリペプチド、融合タンパク質またはそれらの断片で
マウスを注射することにより作製し得る。モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡに
よってスクリーンし、ＨＰＣ２ポリペプチドまたはその断片との特異的免疫反応
性について試験するであろう (ＨarlowおよびＬane，1988参照)。これらの抗体は、アッセイならびに医薬に有
用であろう。
【００４４】 十分な量の所望のポリペプチドを得たら、種々の目的にそれを用いることがで
きる。典型的な用途は、結合について特異的な抗体の産生である。これらの抗体
は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであって、当該分野でよく
知られているイン・ビトロ(in vitro)またはイン・ビボ(in vivo)技術によって
作製し得る。ポリクローナル抗体の作製には、適当な標的免疫系、典型的にはマ
ウスまたはウサギを選択する。実質的に純粋な抗原は、動物に適した方法によっ
てか、または免疫学者によく知られている他の指標によって決定した様式で免疫
系に提示する。注射の典型的な部位は、筋肉内、腹膜内または皮膚内的なフット
パッドである。勿論、他の種をマウスまたはウサギと代替し得る。ついで、当該
分野で公知の技術を用いてポリクローナル抗体を精製し、所望の特異性に調整す
る。
【００４５】 免疫学的応答性は、通常、免疫アッセイでアッセイする。通常、かかる免疫ア
ッセイには、例えば、抗原と同細胞かつ同様式によって作製した抗原源のある種
の精製が含まれる。種々の免疫アッセイ法が当該分野でよく知られている(例え
ば、ＨarlowおよびＬane，1988またはＧoding，1986参照)。
【００４６】 １０−８Ｍ−１、もしくは好ましくは１０−９〜１０−１０Ｍ−１またより強
い親和性を有するモノクローナル抗体は、典型的に、例えば、ＨarlowおよびＬa
ne，1988またはＧoding，1986に記載されている標準的な方法によって作製する
であろう。簡単には、適当な動物を選抜し、所望の免疫化プロトコールに従う。
適当な時間の後に、かかる動物の脾臓を切除し、適当な選抜条件下にて個々の脾
臓細胞を不死化メラノーマ細胞に融合する。その後に、該細胞をクローン化的に
分離し、各クローンの上清を、抗原の所望の領域に特異的な適当な抗体のそれら
の産生について試験する。
【００４７】 他の適当な技術には、抗原ポリペプチドへか、または別法としてファージまた
は同様なベクター中の抗体の選抜したライブラリーへのリンパ球のイン・ビトロ
(in vitro)暴露が含まれる(Ｈuseら，1989参照)。本発明のポリペプチドおよび
抗体は、修飾しても、しないでも用い得る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体
は、共有的または非共有的のいずれかで、検出可能なシグナルを供する物質を結
合することによって標識されるであろう。広範な標識およびコンジュゲート技術
が知られており、科学文献および特許文献の両方において広範に報告されている
。適当な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光剤、
化学発光剤、磁性粒子他が含まれる。かかる標識の使用を教示する特許には、米
国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,27
7,437号；4,275,149号および第4,366,241号が含まれる。また、組換え免疫グロ
ブリンを作製することもできる(米国特許第4,816,567号参照)。
【００４８】 「結合パートナー」とは、例えば、抗原および抗原-特異的抗体または酵素お
よびそのインヒビターのような、高い特異性でリガンド分子と結合する能力を有
する分子をいう。一般的に、該特異的結合パートナーは、単離条件下にて、十分
な親和性で結合して、分析物コピー／(ポリヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ンの場合には)相補鎖二重らせんを固定化しなければならない。特異的結合パー
トナーは当該分野で公知であって、例えば、ビオチンおよびアビジンまたはスト
レプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、膨大な公知の受容体-リガンドカ
ップリング物および相補的ポリヌクレオチド鎖が包含される。相補的ポリヌクレ
オチド結合パートナーの場合においては、該パートナーは、通常、少なくとも約
１５塩基長、少なくとも４０塩基長とし得る。１５（例えば、８塩基）より短い
、１５と４０との間、および４０塩基以上の長さも用いることができることは当
業者によく認識されている。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成
ヌクレオチドアナログから構成され得る。さらなる結合パートナーは、例えば、
本明細書に記載したごとき２−ハイブリッド酵母スクリーニングアッセイ（the
two-hybrid yeast screening assay）を用いて同定し得る。
【００４９】 「生物試料」とは、個人からの分析物ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを
含むと予想される組織または流体の試料をいい、限定するものではないが、例え
ば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸および尿生殖器
、涙、唾液、赤血球、腫瘍、器官、組織およびイン・ビトロ(in vitro)細胞培養
構成物の試料が含まれる。
【００５０】 本明細書で用いるごとき、新生生物の文脈で用いる「診断」または「予診」な
る語は、処理の前、間およびその後の１）新生生物として病巣の分類、２）新生
生物の程度の測定、または３）疾病進展のモニターを示すのに用いる。
【００５１】 「コードする」；ポリペプチドを「コードする」というポリヌクレオチドは、
その天然状態または当業者によく知られている方法によって操作されている場合
、それは、ｍＲＮＡおよび/または該ポリペプチドもしくはその断片に転写および
／または翻訳され得る。アンチセンス鎖は、かかる核酸、および、それから予想
し得る配列コードの相補物である。
【００５２】 「単離した」または「実質的に純粋な」；「単離した」または「実質的に純粋
な」核酸(例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー)とは、天然のヒト配列ま
たはタンパク質(例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒトゲノム配
列およびタンパク質)を自然に付随する他の細胞成分から実質的に単離されたも
のである。該語には、核酸配列およびタンパク質の自然に発生する環境から除去
したそれらを包含し、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物、および化学合成し
たアナログまたは内在系によって生物学的に合成したアナログが含まれる。
【００５３】 「ＨＰＣ２対立遺伝子」とは、ＨＰＣ２遺伝子座の正常対立遺伝子、ならびに
個人に前立腺癌を発症させやすい変形を保有している対立遺伝子をいう。かかる
素因対立遺伝子は、「ＨＰＣ２感受性対立遺伝子」とも呼称する。
【００５４】 「ＨＰＣ２遺伝子座」、「ＨＰＣ２遺伝子」、「ＨＰＣ２核酸」または「ＨＰ
Ｃ２ポリヌクレオチド」とは、各々、ポリヌクレオチドをいい、それら全部はＨ
ＰＣ２領域中に存在し、それらは、個人に前立腺癌を発症させ易い特定の対立遺
伝子を正常組織に発現するようである。ＨＰＣ２における突然変異は、他のタイ
プの腫瘍の発生および／または進行に関与し得る。遺伝子座は、素因個人に癌を
発症させる突然変異によって部分的に示される。これらの突然変異は下記するＨ
ＰＣ２領域内に入る。ＨＰＣ２座は、コード配列、介在配列および転写および／
または翻訳を制御する調節因子を含むよう意図される。ＨＰＣ２座は、該ＤＮＡ
配列の全ての対立遺伝子変形を含むよう意図される。
【００５５】 核酸に適用する場合、これらの語は、ＨＰＣ２ポリペプチド、断片、同等物ま
たは変形をコードする核酸をいい、例えば、タンパク質融合物または欠失物が包
含される。本発明の核酸は、天然ＨＰＣ２-コード遺伝子、または天然ＨＰＣ２-
コード遺伝子またはその一部分と実質的に相同性を有するものに由来するか、ま
たはそれに実質的に同じものかのかのいずれかの配列を有するであろう。
【００５６】 ＨＰＣ２遺伝子または核酸は、ＨＰＣ２ポリペプチドのアミノ酸配列に対して
何ら影響を有しないサイレント対立遺伝子ならびにその機能に対して実質的に影
響を及ぼさないＨＰＣ２ポリペプチドのアミノ酸配列変異型に通じる対立遺伝子
を含む、ＨＰＣ２遺伝子の正常な対立遺伝子を含む。これらの語句は、ＨＰＣ２
ポリペプチドの機能に悪影響を及ぼす１またはそれを超える突然変異を有する対
立遺伝子も含む。突然変異は、ＨＰＣ２ポリペプチドのアミノ酸配列中に有害な
変化を生成し、ＨＰＣ２機能の部分的または完全な欠損を生じる変化、または、
有効なＨＰＣ２発現の欠損を生じるかもしくはＨＰＣポリペプチドの異常な形態
の生成を生じる核酸配列中の変化となり得る。
【００５７】 ＨＰＣ２核酸は、配列番号：１、３または２８に示すものとし得、あるいは、
それは、上記の対立遺伝子、または、示す配列の１もしくはそれを超えるヌクレ
オチドの１もしくはそれを超える付加、挿入、欠失および置換である変化によっ
て示すものとは異なる変異型もしくは誘導体とし得る。ヌクレオチド配列中に対
する変化は、遺伝コードによって決定されるタンパク質レベルのアミノ酸変化を
生じることも、生じないこともあり得る。
【００５８】 従って、本発明による核酸は、配列番号：１、３または２８に示す配列とは異
なる配列を含み得、なお、配列番号：１に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードし得る。すなわち、本発明の核酸は、遺伝コー
ドの結果として縮重となる配列を含む。一方、コードされたポリペプチドは、配
列番号：２に示すアミノ酸配列とは１またはそれを超えるアミノ酸残基で異なる
アミノ酸配列を含み得る。配列番号：２に示すアミノ酸配列のアミノ酸配列変異
型、誘導体または対立遺伝子であるポリペプチドをコードする核酸も、本発明に
よって提供される。
【００５９】 ＨＰＣ２遺伝子とは、（ａ）（ｉ）高いストリンジェント条件（Ausubelら，1
992）下で配列番号：２に掲載するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補
体にハイブリダイズし、および、（ｉｉ）ＨＰＣ２に機能的に等価な遺伝子産物
をコードする、いずれかのＤＮＡ配列、あるいは、（ｂ）（ｉ）適度なストリン
ジェント条件（Ausubelら，1992）のごときより低いストリンジェント条件下で
配列番号：２に掲載するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補体にハイブ
リダイズし、および、（ｉｉ）ＨＰＣ２に機能的に等価な遺伝子産物をコードす
る、いずれかのＤＮＡ配列もいう。本発明は、本明細書中に記載する配列の相補
体である核酸分子も含む。
【００６０】 本発明のポリヌクレオチド組成物には、当業者によって容易に理解されるであ
ろう、センス鎖またはアンチセンス鎖の両方の、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、合成形態、および混合ポリマーが含まれ、化学的または生化学的に修飾され
得、あるいは非-天然または誘導化ヌクレオチド塩基を含み得る。かかる修飾物
には、例えば、標識物、メチル化物、１または２以上の天然に発生するヌクレオ
チドのアナログでの置換物、(例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル
、ホスホアミデート、カルバメート他のような)非帯電リンケージのごときヌク
レオチド間修飾物、(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート他の
ような)荷電リンケージ、(例えば、ポリペプチドのような)ペンダント型基、(ア
クリジン、プソラレン他のような)インターカレター、キレート剤、アルキル化
剤および(例えば、アルファアノマー核酸他のような)修飾リンケージが含まれる
。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定した配列に結合する能
力のポリヌクレオチドをミメティックスする合成分子も包含される。かかる分子
は、当該分野で知られており、例えば、その中で分子骨格中のリン酸結合の代わ
りにペプチド結合を用いるものが含まれる。
【００６１】 本発明は、ＨＰＣ２領域の全体または一部分を含む組換え核酸を提供する。該
組換え構築物は、宿主細胞中で自律的に複製し得る。別法として、該組換え構築
物は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに一体化するようになり得る。かかる組換えポリ
ヌクレオチドは、その起源または操作による、１）天然では結合するポリヌクレ
オチドの全体または一部分と結合せず；２）天然では結合するもの以外のポリペ
プチドに結合し；または３）天然には生じない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半-合成ま
たは合成起源のポリヌクレオチドを含む。ここに、本発明の核酸はＲＮＡを含み
、示された配列への言及は、Ｔの代りにＵで置換されたＲＮＡ相当物への言及と
みなされるべきである。
【００６２】 従って、天然には生じない他の配列を含む組換え核酸が本発明によって提供さ
れる。野生型配列を用いることができるが、それは、しばしば、例えば、欠失、
置換または挿入によって改変されているであろう。
【００６３】 種々のタイプのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、本発明の核酸の天然起
源としてスクリーンし得、あるいはかかる核酸は、ゲノムＤＮＡまたは他の天然
起源に存在する配列の増幅によって(例えば、ＰＣＲによって)提供し得る。ｃＤ
ＮＡライブラリーの選択は、通常、所望のタンパク質のｍＲＮＡに富む組織起源
に対応する。ファージライブラリーが通常好ましいが、他のタイプのライブラリ
ーを用いることもできる。ライブラリーのクローンをプレートに拡げ、スクリー
ニング用基質に移し、変性し、所望の配列の存在につき釣上げる。
【００６４】 本発明で用いるＤＮＡ配列は、通常、少なくとも約５コドン(１５ヌクレオチ
ド)、より通常は少なくとも７-１５コドン、最も好ましくは、少なくとも約３５
コドンを含む。また、１または２以上のイントロンが存在し得る。このヌクレオ
チド数は、通常、ＨＰＣ２-コード配列と特異的にハイブリダイズするであろう
首尾よいプローブに要するおよそ最小限の長さである。この文脈において、８ヌ
クレオチド程度の短い、より一般的には８〜１７ヌクレオチドのオリゴマーは、
特に、チップテクノロジーと共に、プローブとして用い得る。
【００６５】 核酸操作用の技術は、一般的に、例えば、Ｓambrookら，1989またはＡusbelら
，1992に記載されている。制限酵素他のごときかかる技術に適用する試薬は当該
分野で広く知られており、Ｎew Ｅngland ＢioＬabs社、Ｂoehringer Ｍannheim
社、Ａmersham社、Ｐromega Ｂiotec社、Ｕ.Ｓ.Ｂiochemicals社、Ｎew Ｅnglan
d Ｎuclear社および他の多くの供給源のごとき業者から市販されている。本発明の
融合タンパク質を作製するのに用いる組換え核酸配列は、天然または合成配列由
来とし得る。適当なプローブを用いて、種々のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリ
ー(ＧenＢank，Ｎational Ｉnstitute of Ｈealth参照)から多くの天然遺伝子配
列を得ることができる。
【００６６】 「ＨＰＣ２領域」とは、マーカーＤ１７Ｓ９４７およびＤ１７Ｓ７９９によっ
て結合されるヒト染色体１７の部分をいう。この領域には、ＨＰＣ２遺伝子を含
むＨＰＣ２座が含まれる。 本明細書で用いるごとく、「ＨＰＣ２座」、「ＢＲＣＡ対立遺伝子」および「
ＢＲＣＡ領域」は、すべて、遺伝子座、対立遺伝子または領域を含む二本鎖ＤＮ
Ａ、ならびに遺伝子座、対立遺伝子または領域を含むいずれかの一本鎖ＤＮＡを
いう。
【００６７】 本明細書で用いるごとく、ＨＰＣ２座または領域もしくは対立遺伝子の「部分
」とは、少なくとも約８ヌクレオチド、または好ましくは約１５ヌクレオチド、
またはより好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小限サイズを有すると
規定され、および少なくとも約４０ヌクレオチドの最小限サイズを有し得る。こ
の定義は、８〜４０ヌクレオチドならびに４０ヌクレオチドより大きな範囲にあ
るすべてのサイズを含む。かくして、この定義は、８、１２、１５、２０、２５
、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドの
核酸、またはこれらの範囲の値以内のいずれかの核酸数（例えば、９、１０、１
１、１６、２３、３０、３８、５０、７２、１２１等のヌクレオチド）を有する
核酸、または５００を超えるヌクレオチドを有する核酸を含む。本発明は、配列
番号：１または３〜２８のいずれかに由来する少なくとも８ヌクレオチドを有す
る全ての新規核酸、その相補体又は機能相当核酸配列を含む。本発明は、先行技
術に存在する核酸は含まない。すなわち、本発明は、配列番号：１または３〜２
８にいずれかに由来する少なくとも８ヌクレオチドの全ての核酸を含むが、ただ
し、先行技術に存在する核酸は含まない。
【００６８】 「ＨＰＣ２タンパク質」または「ＨＰＣ２ポリペプチド」とは、ＨＰＣ２座に
よってコードされるタンパク質またはポリペプチド、その変形または断片をいう
。「ポリペプチド」なる語は、アミノ酸ポリマーまたはその相当物をいい、特異
的な長さの生成物をいうのではなく；したがって、ペプチド、オリゴペプチドお
よびタンパク質がポリペプチドの定義の中に含まれる。この語は、また、例えば
、グルコシル化、アセチル化、リン酸化他のポリペプチドの修飾物をいうのでは
なく、または排除する。該定義の中に含まれるのは、天然および非天然に生じる
(例えば、非天然アミノ酸他を包含する)１または２以上のアナログのアミノ酸を
含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の
他の修飾物が含まれる。通常、かかるポリペプチドは、天然のＨＰＣ２配列に少
なくとも約５０％相同で、好ましくは約９０％を超えて、より好ましくは少なく
とも約９５％相同性である。また、高または低ストリンジェンシー条件下にてＨ
ＰＣ２-コード核酸にハイブリダイズし、ＨＰＣ２タンパク質(群)に対する抗血
清によって回収される酷似したポリペプチドまたはタンパク質も包含される。
【００６９】 ＨＰＣ２ポリペプチドは、それと天然に関連する物質の単離および／もしくは
精製形態、遊離もしくは実質的に遊離の物質で存在し得る本明細書中に記載する
いずれかのエキソンに由来し得る。原核生物細胞中の発現によって産生されたか
もしくは合成的に生成した場合は、ポリペプチドは、グリコシル化のごとき本来
の翻訳後プロセシングを欠き得る。また、本発明は、ＨＰＣ２ポリペプチドの配
列変異型、対立遺伝子または誘導体であるポリペプチドにも指向される。かかる
ポリペプチドは、１またはそれを超えるアミノ酸の１またはそれを超える付加、
置換、欠失または挿入によって本明細書中に記載するいずれかのエキソンに由来
するものとは異なるアミノ酸配列を有し得る。好ましくは、かかるポリペプチド
はＨＰＣ２機能を有する。
【００７０】 実質的な変異型は、典型的に、タンパク質内の１またはそれを超える部位にお
ける１のアミノ酸のもう１のものへの交換を含み、他の機能または特性の欠損な
しに、デザインしてタンパク質加水分解切断に対する安定性のごとき、ポリペプ
チドの１またはそれを超える特性を変調させ得る。アミノ酸置換は、含まれる残
基の極性、電荷、安定性、疎水性、親水性および／または両親媒性性質における
類似性に基づいて作製し得る。好ましい置換は、保存的であるもの、すなわち１
のアミノ酸が同様な形状および電荷のもので置換わったものである。保存的置換
は、当該技術分野でよく知られており、典型的には、以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グル
タミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニ
ン；ならびにチロシン、フェニルアラニン。
【００７１】 ある種のアミノ酸は、例えば、ＨＰＣ２ポリペプチドと相互作用する抗体の抗
原結合領域または基質分子の結合部位もしくはタンパク質の結合部位のごとき構
造との相互作用的結合能力のかなりの欠損なしに、タンパク質構造中の他のアミ
ノ酸に置換し得る。タンパク質の生物機能活性を規定するのはそのタンパク質の
相互作用能力および性質であるため、ある種のアミノ酸置換をタンパク質配列中
、およびその基礎をなすＤＮＡコード配列中に作製しても、同様の特性を有する
タンパク質を得ることができる。かかる変化の作製において、アミノ酸のハイド
ロパシー・インデックスを考慮し得る。タンパク質に対して相互作用的生物機能
を付与することにおける疎水性アミノ酸インデックスの重要性は、一般的に当該
技術分野で理解される（KyteおよびDoolittle，1982）。また、アミノ酸の様な
ものの置換は、親水性に基づいて効果的に作製し得る。タンパク質の相互作用的
生物機能を付与することにおける親水性の重要性は、一般的に当該技術分野で理
解される（米国特許第4,554,101号）。ポリペプチドをデザインすることにおけ
る疎水性インデックスまたは親水性の使用は、米国特許第5,691,198号にさらに
論じられている。
【００７２】 相同性につき比較するポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約１
６アミノ酸、通常、少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基で
、典型的には、少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基を超えるであろう
。
【００７３】 「作動可能に連結した」とは、かく記載した成分が、その意図した様式の機能
を許容する関係にある並列(juxtaposition)をいう。例えば、プロモーターがコ
ード配列の転写または発現に影響する場合には、該プロモーターは該配列に作動
可能に連結されている。
【００７４】 ペプチドミメティックまたはミメティックなる語は、ＨＰＣ２ポリペプチドの
本質的な生物学的活性を有する物質をいう意図である。ペプチドミメティックは
、タンパク質二次構造の要素を模倣する分子を含有する分子であろう（Johnson
ら、1993）。ペプチドミメティクスの裏にある理論的根拠は、タンパク質のペプ
チド骨格は、主に、抗体と抗原、酵素と基質もしくは骨格タンパク質とのものの
ごとき分子相互作用がし易いようにアミノ酸側鎖を配向して存在する。ペプチド
ミメティックは全くペプチドでなくてもよいが、それは天然ＨＰＣ２ポリペプチ
ドの本質的な生物学的活性を保持するであろう。
【００７５】 「プローブ」；適当なストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件
下にて、標的配列のポリペプチドと安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオ
チドプローブとのハイブリダイゼーションによって検出し得る、特定の癌の素因
または大部分の癌に関連するＨＰＣ２対立遺伝子に関連するポリヌクレオチド多
形性をいう。プローブが標的配列に対して完全に相補的であると予想される場合
には、ストリンジェント条件を用いるであろう。例えば、変形が、プローブは完
全に相補的でない結果を有すると予想される場合のような幾つかの誤対合が予想
される場合、ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを低下させ得る。非
特異的／偶然の結合を排除する、すなわち、ノイズを最小限化する条件を選択す
る。（「ストリンジェント」条件を用いると単に言う場合は、「高ストリンジェ
ンシー」条件を用いると解釈する意味であることは、この開示全体を通して注意
すべきである。）かかる示唆は天然ＤＮＡ多形性ならびに突然変異を同定するの
で、これらの示唆をさらに解析して、ＨＰＣ２感受性対立遺伝子の検出を立証す
る必要がある。高ストリンジェンシー条件の例は、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７
％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５℃にてｆｉｌ
ｅｒ結合ＤＮＡにハイブリダイズさせ、０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で
６８℃にて洗浄することである（Ausubelら、1992）。適度なストリンジェント
条件のごとき、より低いストリンジェント条件は洗浄ステップが４２℃にて０．
２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中である以外は上記したものである。
【００７６】 ＨＰＣ２対立遺伝子のプローブは、ＨＰＣ２領域またはそのｃＤＮＡの配列由
来とし得る。該プローブは、ＨＰＣ２領域の全体または一部分に広がり、かつＨ
ＰＣ２領域への特異的なハイブリダイゼーションを許容するいずれの適当な長さ
ともし得る。標的配列が該プローブと同一の配列を含む場合、該プローブは、例
えば、約８〜３０塩基対の範囲に短くし得る。なぜならば、該ハイブリッドは、
ストリンジェント条件下でさえ比較的安定であろうからである。プローブとある
程度の誤対合が予想される場合、すなわち、該プローブが種々の領域にハイブリ
ダイズすることが予想される場合、必要な特異性で標的配列にハイブリダイズす
るより長いプローブを用い得る。
【００７７】 プローブには、標識またはレポーター分子に結合する単離ポリヌクレオチドが
含まれ、それを用いて、標準的な方法によって配列類似を有する他のポリヌクレ
オチド配列を単離し得るであろう。プローブの調製および標識の技術としては、
例えば、Ｓambrookら,1989またはＡusbelら，1992を参照せよ。他の同様なポリ
ヌクレオチドは、相同ポリヌクレオチドを用いることによって選抜し得る。別法
として、これらまたは同様のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺
伝子コード中の重複を用いることによって合成または選抜し得る。例えば、サイ
レント変化(それによって種々の制限部位を作製する)または特定の系を最適化す
ることによって、種々のコドン置換を導入し得る。突然変異を導入して、ポリペ
プチドの特性(恐らくは、リガンド-結合親和性、鎖間親和性の変化またはポリペ
プチド分解または代謝回転速度の変化)を修飾することができる。
【００７８】 本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含むプローブ
は、天然に発生するか、または組換えの一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、
あるいは化学合成由来とし得る。プローブは、ニック・トランスレーション、ク
レノー酵素フィル-イン(fill-in)反応または当該分野で公知の他の方法によって
も標識し得る。
【００７９】 ＨＰＣ２をコードするポリヌクレオチド配列からの、少なくとも約８ヌクレオ
チド、通常少なくとも約１５ヌクレオチドであって、約９ｋｂより短い、通常約
１.０ｋｂより短いヌクレオチドを有するポリヌクレオチド配列の一部分が、プ
ローブとして好ましい。従って、この定義は８ヌクレオチドから９０００ヌクレ
オチドまでのサイズのプローブを含む。かくして、この定義は８、１２、１５、
２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００もしくは５０
０ヌクレオチドまたはこれらの範囲の値以内のいずれかのヌクレオチド数（例え
ば、９、１０、１１、１６、２３、３０、３８、５０、７２、１２１等のヌクレ
オチド）を有する核酸、あるいは５００を超えるヌクレオチドを有する核酸を含
む。また、該プローブを用いて、ＨＰＣ２をコードするｍＲＮＡが細胞または組
織中に存在するか否かを決定することもできる。本発明は、配列番号：１または
３〜２８のいずれかに由来する少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての新規な
プローブ、その相補体または機能的に相当な核酸配列を含む。本発明は、先行技
術に存在するプローブは含まない。すなわち、本発明は、配列番号：１または３
〜２８のいずれかに由来する全てのプローブを含むが、ただし、先行技術に存在
するプローブは含まない。
【００８０】 同様の考慮およびヌクレオチド長は、該ＨＰＣ２遺伝子の全てまたは一部の増
幅について用いられるであろうプライマーにも適用する。かくして、プライマー
についての定義は、８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、
２００、３００、４００、５００ヌクレオチドのプライマー、またはこれらの範
囲の値以内のいずれかのヌクレオチド数（例えば、９、１０、１１、１６、２３
、３０、３８、５０、７２、１２１等のヌクレオチド）を有するプライマー、ま
たは５００を超えるか、あるいは５００および９０００の間のいずれかのヌクレ
オチド数を有するプラマーを含む。該プライマーを用いてＨＰＣ２をコード化す
るｍＲＮＡが細胞または組織内に存在するかどうかを決定することもできる。本
発明は、該ＨＰＣ２遺伝子を増幅するために該ＨＰＣ２遺伝子座に由来する少な
くとも８ヌクレオチドを有する全ての新規なプライマー、その相補体または機能
的に相当な核酸配列を含む。本発明は、先行技術に存在するプライマーは含まな
い。すなわち、本発明は、少なくとも８ヌクレオチドを有する全てのプライマー
を含むが、ただし、先行技術に存在するプライマーは含まない。
【００８１】 ＨＰＣ２ポリペプチドまたはその断片について本発明によって提供される 「タンパク質修飾物または断片」は、一次構造配列に実質的に相同性であるが、
例えば、イン・ビボ(in vivo)またはイン・ビトロ(in vitro)の化学的および生
化学的修飾または異常なアミノ酸を取り込んだものが含まれる。かかる修飾には
、当業者によって容易に理解されるであろう、例えば、アセチル化、カルボキシ
化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、(例えば、放射線核種での)標識、
ならびに種々の酵素的修飾が含まれる。かかる目的に有用なポリペプチドを標識
する種々の方法およびその置換または標識は、当該分野でよく知られており、３
２Ｐのごとき放射性同位体が含まれ、これは、標識リガンドの特異的結合対メン
バーとして作用し得る標識抗リガンド(例えば、抗体)、蛍光団、化学発色剤、酵
素および抗リガンドに結合する。標識の選択は、要する感度、プライマーとコンジ
ュゲート容易性、安定性要件および入手可能な機器に依存する。ポリペプチドを
標識する方法は当該分野でよく知られている(例えば、Ｓambrookら，1989または
Ａusbelら，1992参照)。
【００８２】 実質的に完全長のポリペプチドに加えて、本発明は、偽ポリペプチドの生物学
的に活性な断片を提供する。重要な生物学的活性には、ＨＰＣ２ポリペプチドの
リガンド-結合性、免疫学的活性および他の生物学的活性特性が含まれる。免疫
学的活性には、標的免疫系の免疫源機能、ならびに結合用の免疫学的エピトープ
を分け持っていること、ＨＰＣ２タンパク質のエピトープにつき競合または置換
抗原のいずれかとして作用することの両方が含まれる。本明細書で用いる「エピ
トープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基をいう。エピトープは、エピトープに
ユニークな空間立体配置に３個のアミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは
、少なくとも５個のかかるアミノ酸、およびより通常は少なくとも８-１０個の
かかるアミノ酸よりなる。かかるアミノ酸の空間立体配置を決定する方法は当該
分野で知られている。
【００８３】 免疫学的目的には、直列反復ポリペプチド・セグメントを免疫原として用い、
それによって抗原タンパク質を高度に産生し得る。別法として、かかるポリペプ
チドは、特異的結合につき高効率の競合物としても作用するであろう。ＨＰＣ２
ポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体の作製を以下に記載する。
【００８４】 また、本発明は、ＨＰＣ２ポリペプチドおよび断片を含む、融合ポリペプチド
も提供する。ホモポリペプチドは、２または３以上のＨＰＣ２ポリペプチド配列
の間の、またはＨＰＣ２の配列と関連タンパク質との間の融合とし得る。同様に
、誘導タンパク質の特性または活性の組合せを示すであろうヘテロ融合物を構築
し得る。例えば、リガンド-結合または他のドメインは、異なる新たな融合ポリ
ペプチドまたは断片の間で「交換」し得る。かかるホモまたはヘテロ融合ポリペ
プチドは、例えば、変化した強さまたは特異性の結合を示し得る。融合パートナ
ーには、免疫グロブリン、細菌β-ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ
、β-ラクタマーゼ、α-アミラーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼおよび酵母
アルファ接合因子が含まれる(例えば、Ｇodowskiら，1988参照)。
【００８５】 融合タンパク質は、典型的には、以下に記載するごとき、いずれかの組換え核
酸法によって作製し得、あるいは化学合成法とし得る。ポリペプチドを合成する
技術は、例えば、Ｍerrifield，1963に記載されている。
【００８６】 「タンパク質精製」とは、ＨＰＣ２をコードする組換え核酸で形質転換した細
胞からのごとき、他の生物材料からＨＰＣ２ポリペプチドを単離するための種々
の方法、ならびに当該分野でよく知られている方法をいう。例えば、かかるポリ
ペプチドは、例えば、本発明によって提供される抗体を用いる免疫アフィニティー
・クロマトグラフィーによって精製し得る。タンパク質精製の種々の方法は当該
分野でよく知られており、Ｄeutscher，1990およびＳcopes，1982に記載された
ものが含まれる。
【００８７】 「単離した」、「実質的に純粋な」および「実質的に均一な」なる語は、天然
状態ではタンパク質またはポリペプチドを付随する成分からそれらを分離するこ
とを記載するために相互変換可能に用いる。少なくとも約６０〜７５％の試料が
単一のポリペプチド配列を示す場合、単量体タンパク質は実質的に純粋である。
実質的に純粋なタンパク質は、典型的には、約６０％〜９０％Ｗ／Ｗのタンパク
質試料、より通常には約９５％、好ましくは約９９％純粋を超えるタンパク質試
料を含むであろう。タンパク質純度または均一性は、タンパク質試料のポリアク
リルアミドゲル電気泳動につづく該ゲルの染色の際の単一ポリペプチドバンドの
視覚化のごとき、当該分野でよく知られている多くの手段によって示し得る。特
定の目的には、ＨＰＬＣまたは精製に利用する当該分野でよく知られた他の手段
を用いることによって高解像度を供し得る。
【００８８】 ＨＰＣ２タンパク質は、その天然状態でそれに付随する天然の汚染物からそれ
を分離した場合、天然で関連する成分を実質的に含まない。かくして、化学的に
合成したか、またはそれが天然に起源する細胞とは異なる細胞系で合成したポリ
ペプチドは、その天然に付随する成分を実質的に含まないであろう。タンパク質
は、当該分野でよく知られたタンパク質精製技術を用いて単離することによって
、天然に付随する成分を実質的に含まないものとすることもできる。
【００８９】 単離および操作した遺伝子配列の発現産物として生成するポリペプチドは、ホ
モ細胞型で発現される場合でさえ、本明細書で用いる「単離ポリペプチド」であ
る。ヘテロ細胞によって発現される合成作製形態または分子は、本来、単離分子
である。
【００９０】 「組換え核酸」とは、天然に生じるものではない、または、配列の２の他の分
離したセグメントの人工的組合せによって作製した核酸である。この人工的な組
合せは、しばしば、いずれかの化学合成手段によってか、または核酸の単離セグ
メントの人工操作によって、例えば、遺伝子工学技術によってなされる。かかる
ものは、通常、同一または保存アミノ酸をコードする余分なコドンでコドンを置
換して行うが、典型的には、配列認識部位を導入するか、または除去する。別法
として、それを行って、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合し、所望の組
合せの機能を生成する。
【００９１】 「調節配列」とは、通常、遺伝子座のコード領域の１００ｋｂ以内の配列をい
うが、それはコード領域からさらに離れていることもあり、それは、(遺伝子の
転写、およびｍＲＮＡの翻訳、スプライシング、安定性などを含む)遺伝子の発
現に影響する。
【００９２】 「実質的に相同または同様な」；他の核酸(またはその相補鎖)と(適当なヌク
レオチド挿入または欠失を有して)最適に並べた場合に、ヌクレオチド塩基の少
なくとも約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、
好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５〜９８％のヌ
クレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性が存在する場合、核酸またはその断片
はもう１つのものに「実質的に相同性である」(「または実質的に同様である」)
。
【００９３】 同一性は、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の間の配列
関連性の度合であって、それはかかる配列の２つのヒモの適合の同一性によって
決定される。同一性は容易に計算し得る。２つのポリヌクレオチドまたはプリペ
プチド配列の間の同一性を測定する数多くの方法が存在するので、「同一性」な
る語は当業者によく知られている（Computational Molecular Biology, Lesk, A
. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Inform
atics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York,
1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Gr
iffin, H. G., eds., Human Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press. 1987; and Sequence An
alysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Ne
w York, 1991）。２つの配列間の同一性を決定するために普通に用いられる方法
は、限定されないが、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Acad
emic Press, San Diego, 1994、およびCarillo, H., and Lipman, D.(1988)を含
む。同一性を決定する好ましい方法は、試験される２つの配列間の最大適合を与
えるようにデザインされる。かかる方法はコンピュータプログラムに集成される
。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプラグラム方法
は、限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al., (1984)
）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＮＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al. (1990); Al
tschul et al. (1997)）を含む。
【００９４】 別法として、鎖またはその相補鎖に対して選択的なハイブリダイゼーション条
件下で、他の核酸（またはその相補鎖）に、核酸またはその断片がハイブリダイ
ズする場合、実質的な相補性または類似性が存在する。特異性の全体的な欠乏よ
りも実質的により選択的なハイブリダイゼーションが起こる場合に、ハイブリダ
イゼーションの選択性が存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーション
は、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６５％、より好まし
くは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％のストレッチにわ
たって少なくとも約５５％相同性が存在する場合に生じるであろう(Ｋanehisa，
1984参照)。記載した相同性比較の長さは、より長いストレッチとすることもで
き、特定の具体例においては、しばしば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は
少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典
型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌク
レオチド、好ましくは少なくとも約３６またはそれを超えるヌクレオチドのスト
レッチにわたるであろう。
【００９５】 核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるであろう、
塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩
基誤対合の数に加えて、塩濃度、温度、または有機溶媒のごとき条件によって影
響されるでろう。ストリンジェントな温度条件には、一般的に、３０℃を超える
、典型的には３７℃を超える、好ましくは４５℃を超える温度が含まれるであろ
う。ストインジェントな塩条件には、通常、１０００ｍＭ未満、典型的には５００
ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満であろう。しかしながら、指標の組合せは
いずれの単一の指標の測定よりも遥かにより重要である(例えば、Ｗetmurおよび
Ｄavidson，1968参照)。
【００９６】 プローブ配列は、また、特定の条件下にて二重らせんＤＮＡに特異的にハイブ
リダイズして、三重らせんまたは他のより高次のＤＮＡ複合体を形成し得る。か
かるプローブの調製および適当なハイブリダイゼーション条件は当該分野でよく
知られている。
【００９７】 「実質的相同性」または「実質的同一性」なる語は、ポリペプチドをいう場合
、問題のポリペプチドまたはタンパク質が自然に発生する全体タンパク質または
その一部分と少なくとも約３０％同一性、通常は少なくとも約７０％同一性、よ
り通常は少なくとも約８０％同一性、好ましくは少なくとも約９０％同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９５％同一性を表すことを示す。
【００９８】 ポリペプチドの相同性は、典型的に、配列分析ソフトウェアを用いて測定する
(例えば、Ｓequence Ａnalysis Ｓoftware Ｐackage of the Ｇenetics Ｃomput
er Ｇroup，Ｕniversity of Ｗisconsin Ｂiotechnology Ｃenter，910 Ｕniver
sity Ａvenue，Ｍadison，Ｗisconsin 53705参照)。タンパク質分析ソフトウェ
アは、種々の置換、欠失および他の修飾を指定した相同性の測定を用いて、同様
配列を対合する。保存性置換には、典型的に、以下の群の中の置換が含まれる：
グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グル
タミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニ
ン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００９９】 「実質的に同一の機能」とは、野生型ＨＰＣ２核酸または野生型ＨＰＣ２ポリ
ペプチドに関しての、修飾核酸または修飾タンパク質の機能をいう。修飾ポリペ
プチドは野生型ＨＰＣ２ポリペプチドに実質的に相同性であって、同一の機能を
実質的に有するであろう。修飾ポリペプチドは、変化したアミノ酸配列を有し、
および／または修飾アミノ酸を含み得る。機能の同一性に加えて、修飾ポリペプ
チドは、より長い半減期のごとき他の有用な特性を有し得る。修飾ポリペプチド
の機能(活性)の同一性は、実質的に野生型ＨＰＣ２ポリペプチドの活性と同一と
し得る。別法として、修飾ポリペプチドの機能(活性)の同一性は、野生型ＨＰＣ
２ポリペプチドの活性よりも高いものとし得る。修飾ポリペプチドは、慣用的な
技術を用いて合成し、あるいは、修飾した核酸によってコードされ、慣用的な技
術を用いて作製される。修飾核酸は慣用的な技術によって調製する。野生型ＨＰ
Ｃ２遺伝子機能と実質的に同様の機能を有する核酸は、前記した修飾タンパク質
を産生する。
【０１００】 ポリペプチド「断片」、「一部分」または「セグメント」とは、少なくとも約
５〜７個の隣接したアミノ酸、しばしば、少なくとも約７〜９個の隣接したアミ
ノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３の隣接したアミノ酸、最も好ましくは少
なくとも約２０〜３０またはそれを超えて隣接したアミノ酸のアミノ酸残基のス
トレッチである。
【０１０１】 本発明のポリペプチドは、可溶性である場合、例えば、ニトロセルロース、ナ
イロン、カラム充填材(例えば、Ｓepharose beads)、磁性ビーズ、ガラスウール
、プラスチック、金属、ポリマーゲル、細胞または他の基体のような固相支持体
にカップリングし得る。かかる支持体は、例えば、ビーズ、ウェル、計深棒また
は膜のような形態を採り得る。
【０１０２】 「標的領域」とは、増幅および／または検出する核酸の領域をいう。「標的配
列」なる語は、所望の条件下にて、それとプローブまたはプライマーとが安定な
ハイブリッドを形成するであろう配列をいう。
【０１０３】 本発明の実施は、特に指摘しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換え
ＤＮＡ、遺伝学および免疫学の慣用的な技術を用いる(例えば、Ｍaniatisら，19
82；Ｓambrookら，1989；Ａusubelら，1992；Ｇlover，1985；Ａnand，1992；Ｇ
uthrieおよびＦink，1991参照)。ヒト染色体１のマッピングを含むヒト遺伝子マ
ッピングの技術および材料の一般的な議論は、例えば、ＷhiteおよびＬalouel，
1988に記載されている。
【０１０４】組換えまたは化学的に合成した核酸；ベクター、形質転換、宿主細胞の調製 本発明の大量のポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞中の複製によって産生し
得る。所望の断片をコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片は、原核生
物または真核生物細胞に導入し、複製する能力を有する、組換えポリヌクレオチ
ド構築物、通常ＤＮＡ構築物に導入する。通常、ポリヌクレオチド構築物は、酵
母または細菌のごとき単細胞宿主における複製に適しているであろうが、(ゲノ
ム内に一体化されるか、またはされないで)培養した哺乳動物または植物あるい
は他の真核生物細胞系統への導入を意図することもできる。本発明の方法によっ
て作製した核酸の精製は、例えば、Ｓambrookら，1989またはＡusubelら，1992
に記載されている。
【０１０５】 本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＢeaucageおよびＣarruthers，1981によ
って記載されているホスホルアミダイト法、またはＭatteucciおよびＣaruthers
， 1981によるトリエステル法による化学合成によって作製し得、市販の自動化オリ
ゴヌクレオチド合成器で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適
当な条件下にてそれらの鎖を一緒にアニーリングさせることによって、あるいは
、適当なプライマー配列と一緒にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加する
ことによって、化学合成の一本鎖から得ることができる。
【０１０６】 原核生物または真核生物宿主へ導入するために調製するポリヌクレオチド構築
物は、所望のポリヌクレオチドをコードする目的のポリヌクレオチド断片を包 含する宿主によって認識される複製系を含み得、好ましくは該ポリヌクレオチド
コードセグメントに作動可能に連結した転写および翻訳の開始の調節配列も含む
であろう。発現ベクターには、例えば、複製開始点または自律複製配列(ＡＲＳ)
、ならびに、リボソーム-結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル
化部位、転写ターミネーター配列およびｍＲＮＡ安定化配列のごとき、発現制御
配列、プロモーター、エンハンサーおよび必須のプロセシング情報部位が含まれ
得る。分泌シグナルには、適当には、天然ＨＰＣ２タンパク質からか、または他
の受容体、あるいは同一または関連する種の分泌ポリペプチドからかのいずれか
からのもので、タンパク質を細胞膜貫通および／または緊提させるもので、従っ
て、その機能トポロジーを達成する、あるいは細胞から分泌されるものが含まれ
得る。かかるベクターは、当該分野でよく知られ、例えば、Ｓambrookら，1989
またはＡusbelら，1992中で論じられている標準的な組換え技術によって調製し
得る。
【０１０７】 適当なプロモーターおよび他の必須のベクター配列は、宿主で機能するように
選択され、適当には、ＨＰＣ２遺伝子と天然で関連するものが含まれ得る。細胞
系統および発現ベクターの作動し得る組合せの例は、Ｓambrookら，1989または
Ａusubelら，1992に記載されており；また、例えば、Ｍetzgerら，1988を参照せ
よ。多くの有用なベクターが当該分野で公知であり、Ｓtratagene社、Ｎew Ｅng
land Ｂiolabs社、Ｐromega Ｂiotech社他のごとき業者から入手し得る。ｔｒｐ
、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖酵素プ
ロモーターのごときプロモーターを原核生物宿主に用い得る。有用な酵母プロモ
ーターには、メタロチオネイン、３-ホスホグリセレート・キナーゼ、または、エ
ノラーゼもしくはグリセルアルデヒド-３-ホスフェート・デヒドロゲナーゼのご
とき他の解糖酵素、マルトースおよびガラクトース利用に寄与する酵素他のプロ
モーター領域が含まれる。酵母発現の使用に適したベクターおよびプロモーター
は、さらに、Ｈitzemanら，EP 73,675A号に記載されている。適当な非天然哺乳
動物プロモーターには、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター(Ｆiersら
，1978)またはマウスモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、ニワトリ
肉腫ウイルス、II型アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスまたはポリオーマ由来の
プロモーターが含まれ得る。加えて、該構築物は、複数コピーの遺伝子を作製し
得るように、増幅性遺伝子(例えば、ＤＨＦＲ)に連結し得る。適当なエンハンサ
ーおよび他の発現制御配列に関しては、例えば、Ｅnhancers and Ｅukaryotic
Ｇene Ｅxpression，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor
，Ｎew Ｙork(1983)も参照せよ。例えば、米国特許第5,691,198; 5,735,500; 5,
747,469および5,436,146号も参照せよ。 かかる発現ベクターは自律的に複製し得るが、それらは、当該分野でよく知ら
れている方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入することによって複製すること
もできる。
【０１０８】 発現およびクローニングベクターは、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存
または増殖に必須なタンパク質をコードする遺伝子である選択マーカーを含むよ
うである。この遺伝子が存在することにより、該インサートを発現する宿主細胞
のみの増殖が保証される。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒性
物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート他への抵抗性を
付与する；ｂ）栄養要求性欠損を補う、またはｃ）複合培地から入手できない重
要な栄養を供給する(例えば、悍菌(Ｂacilli)にはＤ-アラニン・ラセマーゼをコ
ードする遺伝子)タンパク質をコードしている。適当な選択マーカーの選択は宿
主細胞に依存し、種々の宿主に対する適当なマーカーは当該分野でよく知られて
いる。
【０１０９】 目的の核酸を含むベクターはイン・ビトロ(in vitro)で転写し得、よく知られ
た方法(例えば、インジェクション(Ｋuboら，1988))によって、得られたＲＮＡ
を宿主細胞に導入し得、あるいは、該ベクターは細胞宿主のタイプに依存して変
動する当該分野でよく知られている方法(エレクトロポレーション；塩化カルシ
ウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ-デキストランまたは他の
物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル衝撃；リポフェ
クション感染(ベクターがレトロウイルスゲノムのごとき感染性因子である)；な
らびに他の方法)によって宿主細胞に直接導入し得る(一般的に、Ｓambrookら，1
989およびＡusubelら，1992参照)。とりわけ前記したものを包含する当該分野で
公知のいずれかの方法による宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、本明細書
中で「形質転換」という。前記の核酸を導入した細胞は、かかる細胞の子孫も含
むことを意味する。
【０１１０】 本発明の大量の核酸およびポリヌクレオチドは、ＨＰＣ２核酸またはその一部
分を原核生物または真核生物宿主細胞に和合性のベクターまたは他の発現ビヒク
ルで発現させることによって調製し得る。最も通常用いる原核生物宿主はエシェ
リキア・コリ(Ｅscherichia coli)であるが、バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis )またはシュードモナス(Ｐseudomonas)のごとき他の原核生物も用い得
る。
【０１１１】 哺乳類宿主細胞、あるいは、酵母、糸状菌、植物、昆虫、または両生類もしく
は鳥類のごとき他の真核生物宿主細胞も、また、本発明のタンパク質の産生に有
用となり得る。培養における哺乳動物細胞の増殖は、それ自体よく知られている
(ＪakobyおよびＰastan，1979参照)。通常用いられる哺乳動物宿主細胞系統の例
はＶＥＲＯおよびＨeＬa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、なら
びにＷＩ３８、ＢＨＫおよびＣＯＳ細胞系統であるが、他の細胞系統も、例えば
、より高い発現、望ましいグリコシル化パターン、または他の特徴を供するに適
当となり得ることは当業者によって理解されるであろう。
【０１１２】 ベクター構築物の様式に依存するマーカーを用いることによって、クローンを
選抜し得る。マーカーは、同一または異なるＤＮＡ分子上とし得るが、好ましく
は同一ＤＮＡ分子上である。原核生物宿主においては、例えば、アンピシリン、
テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する抵抗性によって、形質転換体を選
抜し得る。温度感受性に基づく特定の産物の産生も、適当なマーカーとして作用
し得る。
【０１１３】 本発明のポリヌクレオチドで形質転換した原核生物または真核生物細胞は、本
発明の核酸およびポリペプチドの産生のみならず、例えば、ＨＰＣ２ポリペプチ
ドの特性の研究においても有用であろう。
【０１１４】 該ＨＰＣ２遺伝子産物もトランスジェニック動物において発現し得る。限定さ
れないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミクロピッグ（micro-
pig）、ヤギおよび、例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長
類を含むいずれの種の動物を用いてＨＰＣ２トランスジェニック動物を作製する
ことができる。
【０１１５】 当業者に知られているいずれの技術を用いても、トランスジェニック動物の創
始者系列（the founder line）を産生するために、該ＨＰＣ２遺伝子形質転換遺
伝子を動物に導入することができる。かかる技術は、限定されないが、プロヌク
レア・マイクロインジェクション（pronuclear microinjection）（米国特許第4
,873,191号）；生殖細胞系へのレトロウィルス介在遺伝子転換（Van der Putter
n et al., 1985）；胚幹細胞における遺伝子標的（Thompson et al., 1989）；
胚のエレクトロポレーション（Lo, 1983）；および精子介在遺伝子転換（Lavitr
ano et al., 1989）；等を含む。かかる技術のレビューについては、出典明示し
てその全体が本明細書の一部とみなされるGordon（１９８９）を参照せよ。
【０１１６】 本発明は、それら全ての細胞に該ＨＰＣ２形質転換遺伝子を保有するトランス
ジェニック動物、ならびにそれらの細胞の全てではないが、ある程度に該形質転
換遺伝子を保有する動物、すなわち、モザイク動物を提供する。該形質転換遺伝
子は、単一の形質転換遺伝子またはコンカテマー、例えば、頭−頭タンデムもし
くは頭−尾タンデムとして合体させることができる。該形質転換遺伝子は、例え
ば、Ｌａｓｋｏらの教示（１９９２）に準じて特定の細胞タイプに選択的に導入
するか、あるいは、その中で活性化させることができる。かかる細胞タイプ特異
的活性化に必要とされる調節配列は、対象の特定の細胞タイプに依存し、当業者
に明白であろう。該ＨＰＣ２遺伝子形質転換遺伝子を該内在性ＨＰＣ２遺伝子の
染色体サイトに合体させることが所望される場合、遺伝子標的が好ましい。簡単
には、かかる技術を用いるべき場合、該内在性ＨＰＣ２遺伝子に相同ないくつか
のヌクレオチド配列を含有するベクターが、染色体配列での相同組換えにより、
該内在性ＨＰＣ２遺伝子ヌクレオチド配列に合体させ、かつ、該配列の機能を推
定する目的のため、デザインされる。該形質転換遺伝子は、例えば、Ｇｕらの教
示（１９９４）に準じて、特定の細胞タイプに選択的に導入し、かくして、その
細胞タイプのみにおいて該内在性ＨＰＣ２遺伝子を活性化することもできる。か
かる細胞タイプ特異的活性化に必要とされる調節配列は、対象の特定の細胞タイ
プに依存し、当業者に明白であろう。
【０１１７】 一旦、トランスジェニック動物が作製されたなら、該組換えＨＰＣ２遺伝子の
発現を標準技術を用いてアッセイすることができる。初期スクリーニングをサザ
ーンブロット分析またはＰＣＲ技術により達成して、該形質転換遺伝子の合体が
起ったかどうかをアッセイするために動物組織を分析することができる。該トラ
ンスジェニック動物の組織における該形質転換遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルは
、限定されないが、該動物から採取された組織試料のノーザンブロット分析、イ
ン・サイチュハイブリダイゼーション分析、およびＲＴ−ＰＣＲを含む技術を用
いて算定することもできる。ＨＰＣ２遺伝子発現組織の試料は、該ＨＰＣ２形質
転換遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することもできる
。
【０１１８】 アンチセンス・ポリヌクレオチド配列は、当業者によって理解されるであろう
ごとく、ＨＰＣ２座の発現を防ぐか、または減じるのに有用である。例えば、Ｈ
ＰＣ２座またはＨＰＣ２領域からの他の配列(特に、ＨＰＣ２座に隣接するもの)
の全体もしくは一部分を含有するポリヌクレオシドベクターは、アンチセンス方
向でプロモーターの制御下に置き、細胞に導入することができる。細胞内におけ
るかかるアンチセンス構築物の発現は、ＨＰＣ２転写および／または翻訳および
／または複製を妨害するであろう。
【０１１９】 本明細書で開示したＨＰＣ２遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを
用いて、他の種における相同性ＨＰＣ２遺伝子配列およびタンパク質を同定する
。これらのＨＰＣ２遺伝子配列およびタンパク質は、それを単離した種について
の、本明細書に記載した診断／予測、治療および薬剤スクリーニング方法に用い
る。
【０１２０】使用方法：核酸診断および診断キット 個人が癌になる素因であるＨＰＣ２対立遺伝子の存在を検出するためには、血
液のごとき生物試料を調製し、ＨＰＣ２の感受性対立遺伝子の存在または不存在
について分析する。新生生物の存在を検出するためには、前駆体病斑の悪性腫瘍
に向けての進展、または、予測指標として、病斑の生物試料を調製し、ＨＰＣ２
の突然変異対立遺伝子の存在または不存在について分析する。これらの試験の結
果および解釈情報は、試験した個人に対するコミュニケーションのためにヘルス
ケア・プロバイダーに戻す。かかる診断は、診断研究所によって行うか、別法と
して、診断キットを製造し、ヘルスケア・プロバイダーまたは自己-診断用にプ
ライベートな個人に対して販売し得る。
【０１２１】 最初に、スクリーニング法は適当なＨＰＣ２配列の増幅が含まれる。本発明の
もう１つの好ましい具体例において、該スクリーニング方法は、非-ＰＣＲベー
スの戦略を含む。かかるスクリーニング法には、当該分野でよく知られている２
-段階標識増幅方法論が含まれる。ＰＣＲおよび非-ＰＣＲの両方のベースのスク
リーニング戦略は、高レベルの感度で標的配列を検出し得る。
【０１２２】 今日用いられている最もポピュラーな方法は、標的増幅である。ここにおいて
は、標的核酸配列をポリメラーゼで増幅する。ポリメラーゼ作動増幅を用いる１
つの特に好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)である。ポリメラーゼ
連鎖反応および他のポリメラーゼ-作動増幅アッセイにより、ポリメラーゼ-作動
増幅サイクルの使用を通して、コピー数にして百万倍を超える増加を達成し得る
。増幅したら、得られた核酸は配列決定し得るか、またはＤＮＡプローブ用の基
質として用い得る。
【０１２３】 プローブを用いて標的配列の存在を検出する(例えば、癌感受性についてのス
クリーニングにおいて)場合、所望により、血液または血清のごとき分析すべき
生物試料を処理して核酸を抽出し得る。試料核酸を種々の方法で調製して、標的
配列の検出；例えば、変性、制限消化、電気泳動またはドット・ブロットを容易
ならしめることができる。分析核酸の標的化領域は、通常、少なくとも部分的に
一本鎖であって、プローブの標的配列とハイブリッドを形成しなければならない
。配列が天然に一本鎖である場合、変性は必要ないであろう。しかしながら、配
列が二本鎖である場合、該配列は恐らく変性させる必要がある。変性は、当該分
野で公知の種々の技術によって行い得る。
【０１２４】 分析核酸およびプローブは、分析物中の予想標的化配列とプローブ中の標的配
列との安定なハイブリッド形成を促進する条件下にてインキュベートする。分析
物に結合させるのに用いるプローブの領域は、ヒト染色体１７の標的化領域に完
全に相補的とし得る。したがって、誤った陽性を防ぐためには、高ストリンジェ
ンシー条件が望ましい。しかしながら、高ストリンジェンシー条件は、ゲノム中
にユニークである染色体領域にプローブが相補的である場合にのみ使用する。ハ
イブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの間お
よび洗浄工程の間の多数の因子によって決定され、これには、温度、イオン強度
、塩基組成、プローブ長およびホルムアミド濃度が含まれる。これらの因子は、
例えば、Ｍaniatisら，1982およびＳambrookら，1989に概説されている。特定の
環境下においては、三重らせん、四重らせん他のごときより高次のハイブリッド
を形成させて、標的配列を検出する手段を提供することが望ましいこともあり得
る。
【０１２５】 いずれにせよ、得られたハイブリッドの検出は、通常、標的プローブを用いる
ことによってなされる。別法として、該プローブは非標識であってもよいが直接
または間接的に標識したリガンドとの特異的な結合によって検出し得る。適当な
標識、ならびにプローブおよびリガンドを標識する方法は当該分野で公知であっ
て、これには、例えば、公知の方法(例えば、ニック・トランスレーション、ラ
ンダム・プライミングまたはキナージング(kinasing))、ビオチン、蛍光基、化
学発光基(例えば、ジオキセタン、特に励起(triggered)ジオキセタン)、酵素、
抗体他によって取り込み得る放射能標識が含まれる。この基本スキームの変形は
当該分野で公知であって、外来物質から検出すべきハイブリッドの分離を容易な
らしめる変形、および／または標識基からの信号を増幅する変形が含まれる。多
くのこれらの変形は、例えば、ＭatthewsおよびＫricka，1988；Ｌandegrenら，
1988；Ｍittlin，1989；米国特許第4,868,105号およびＥＰＯ公開第225,807号に
概説されている。
【０１２６】 前記したごとく、非-ＰＣＲ-ベースのスクリーニングアッセイも本発明で意図
される。この方法は、核酸プローブ(または、ホスホン酸メチル骨格を正常なホ
スホジエステルと置換えたごときアナログ)を低レベルのＤＮＡ標的にハイブリ
ダイズする。このプローブは、共有結合がハイブリダイゼーションの特異性を妨
害しないように、当該プローブに共有結合した酵素を有し得る。この酵素-プロ
ーブ-コンジュゲート-標的核酸複合体は、ついで、遊離プローブ酵素コンジュゲ
ートから単離し得、酵素検出用に基質を添加する。酵素活性は、感度にして１０ ３ 〜１０６の増加が得られる発色または発光出力における変化で観察認される。
オリゴデオキシヌクレオチド-アルカリホスファターゼ・コンジュゲートの調製
およびハイブリダイゼーション・プローブとしてのそれらの使用に関する一例と
しては、Ｊablonskiら，1986を参照せよ。
【０１２７】 二段階標識増幅方法論は、当該分野で公知である。これらのアッセイは、(ジ
ゴキシゲニン、ビオチン他のごとき)小リガンドが、ＨＰＣ２に特異的に結合し
得る核酸プローブに結合するという原理で行う。例示的なプローブを本明細書の
テーブル９に供し、これにはさらに、配列番号：１のヌクレオチド位３６３１〜
３９３０に対応する核酸プローブが含まれる。対立遺伝子特異的プローブもまた
、この例の範囲内にあることが意図されており、例示的な対立遺伝子特異的プロ
ーブには、本願明細書のテーブル８中に要約した素因突然変異を包含するプロー
ブが含まれる。
【０１２８】 一例において、核酸プローブに結合する小プローブは、抗体-酵素コンジュゲ
ートによって特異的に認識される。この例の１つの具体例において、ジゴキシゲ
ニンが核酸プローブに結合する。ハイブリダイゼーションは、化学発光基質にな
る抗体-アルカリホスファターゼ・コンジュゲートによって検出する。この具体
例による核酸プローブを標識する方法については、Ｍartinら，1990を参照せよ
。第二の実施例においては、第一リガンドに特異的にコンプレックスを形成し得
る第二リガンド-酵素コンジュゲートによって小リガンドを認識する。この例の
よく知られた具体例は、ビオチン-アビジン型の相互作用である。核酸プローブ
を標識する方法およびビオチン-アビジンに基づくアッセイにおけるそれらの使
用については、Ｒigbyら，1977およびＮguyenら，1992を参照せよ。
【０１２９】 本発明の核酸プローブアッセイがＨＰＣ２を検出し得る核酸プローブのカクテ
ルを用いるであろうことも、本発明の範囲内で意図されている。かくして、細胞
試料中のＨＰＣ２の存在を検出する一例において、ＨＰＣ２に相補的な２以上の
プローブを用い、特に、多くの異なるプローブを、別法として、２、３または５
この異なる核酸プローブ配列を用いる。もう１つの例において、患者におけるＨ
ＰＣ２遺伝子配列中の突然変異の存在を検出するためには、ＨＰＣ２に相補的な
２以上のプローブを用い、ここに、カクテルは、ＨＰＣ２中に変化を有する患者
の集団において同定された対立遺伝子-特異的突然変異に結合し得るプローブを
含む。この具体例においては、いずれの数のプローブを用いることができるが、
好ましくは、個人が前立腺癌になる素因として同定された主遺伝子突然変異に対
応するプローブを含むであろう。
【０１３０】使用方法：ペプチド診断および診断キット 病斑の新生生物状態は、野生型ＢＣＡ１ポリペプチドの変化に基づいても検出
し得る。かかる変化は、慣用的な技術による配列分析によって決定し得る。より
好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、ＨＰＣ
２ペプチド中の相違、または不存在を検出する。該抗体は、「抗体」なる標題下
で前に論じ、実施例９および１０にさらに示すごとく調製し得る。抗体を生起さ
せて精製する他の技術は当該分野でよく知られており、いずれのかかる技術を用
いても、本発明に請求する調製物をなし得る。本発明の好ましい具体例において
、抗体は、溶液からＨＰＣ２タンパク質を免疫沈降し、かつ、ポリアクリルアミ
ドゲルのウェスタンまたはイムノブロット上でＨＰＣ２タンパク質と反応するで
あろう。もう１つの好ましい具体例において、抗体は、免疫細胞化学的技術を用
いて、パラフィンまたは凍結組織切片中のＨＰＣ２タンパク質を検出するであろ
う。
【０１３１】 ＨＰＣ２またはその突然変異を検出する方法に関する好ましい具体例には、モ
ノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いたサンドウィッチア
ッセイを含む、酵素結合免疫ソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノア
ッセイ(ＲＩＡ)、イムノラジオ分析アッセイ(ＩＲＭＡ)およびイムノ酵素アッセ
イ(ＩＥＭＡ)が含まれる。例示的なサンドウィッチアッセイは、(出典明示して
本明細書の一部とみなし、実施例１２で例示する)米国特許第4,376,110号および
第4,486,530号においてＤavidらによって記載されている。
【０１３２】使用方法：薬剤スクリーニング 本発明は、いずれかの種々の薬剤スクリーニング技術においてＨＰＣ２ポリペ
プチドまたはその結合フラグメントを使用することによって、化合物をスクリー
ニングするのに特に有用である。
【０１３３】 かかる試験において使用するＨＰＣ２ポリペプチドまたはフラグメントは、溶
液中で遊離させ得、固体支持体に固定化し得、あるいは細胞表面上に支持し得る
。薬剤スクリーニングの１つの方法は、好ましくは競合結合アッセイにおいて、
ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換えポリヌクレオチドで安定して
形質転換した真核生物または原核宿主生物細胞を使用する。生存能力を有するか
、または固定形態のいずれかのかかる細胞は、標準結合アッセイに用いることが
できる。例えば、ＨＰＣ２ポリペプチドまたはフラグメントと試験すべき剤との
間の複合体の形成について測定し得、または、ＨＰＣ２ポリペプチドまたはフラ
グメントと既知リガンドとの間の複合体の形成が試験すべき剤によって妨害され
る程度を検査し得る。
【０１３４】 かくして、本発明は、薬剤とＨＰＣ２ポリペプチドまたはフラグメントとを接
触させ、当該分野でよく知られている方法によって、(ｉ)該剤とＨＰＣ２ポリペ
プチドまたはフラグメントとの間の複合体の存在につき、または(ｉｉ)ＨＰＣ２
ポリペプチドまたはそのフラグメントとリガンドとの間の複合体の存在につきア
ッセイすることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供する。かかる競合
結合アッセイにおいて、ＨＰＣ２ポリペプチドまたはフラグメントは、典型的に
標識されている。遊離ＨＰＣ２ポリペプチドまたはフラグメントは、タンパク質
：タンパク質複合体に存在するものから単離し、遊離(すなわち、非コンプレッ
クス形成)標識の量は、各々、ＨＰＣ２に対して試験すべき剤の結合の測定値、
またはＨＰＣ２：リガンド結合で妨害された値である。遊離したものではなくて
、結合したＨＰＣ２の量を測定することもできる。該ＨＰＣ２ではなくて、該リ
ガンドに標識し、試験される薬剤の存在下または不存在下でＨＰＣ２に結合する
リガンドの量を測定することも可能である。
【０１３５】 薬剤スクリーニングのもう１つの技術は、ＨＰＣ２ポリペプチドに対して適当
な結合アフィニティーを有する化合物の高処理量スクリーニングを提供し、これ
は、Ｇeysen（公開されたＰＣＴ ＷＯ84/03564号）に詳記されている。簡単に
説明すると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたはあ
る種の他の表面のごとき固体支持体上で合成する。ペプチド試験化合物をＨＰＣ
２ポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したＨＰＣ２ポリペプチドを、つい
で、当該分野でよく知られている方法によって検出する。
【０１３６】 精製したＨＰＣ２は、前記した薬剤スクリーニング技術において使用するため
に、プレート上に直接コートし得る。しかしながら、該ポリペプチドに対する非
-中和抗体を用いて抗体を捕捉し、該固相上にＨＰＣ２ポリペプチドを固定化し
得る。 また、本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も意図しており、そ
の中では、ＨＰＣ２ポリペプチドに特異的に結合し得る中和抗体を、ＢＲＣＡポ
リペプチドまたはそのフラグメントに対する結合について、試験化合物と競合さ
せる。このようにして、抗体を用いて、１または２以上のＨＰＣ２ポリペプチド
の抗原決定基を有するいずれのペプチドの存在も検出し得る。
【０１３７】 薬剤スクリーニングのさらなる技術には、非機能性ＨＰＣ２遺伝子を有する(
前記したごとき)宿主真核生物細胞系統または細胞の使用が含まれる。これらの
宿主細胞系統または細胞は、ＨＰＣ２ポリペプチドレベルで欠失している。宿主
細胞系統または細胞は、薬剤化合物存在下で増殖する。宿主細胞の増殖速度を測
定して、該化合物がＨＰＣ２欠失細胞の増殖を調節し得るか否かを判断する。
【０１３８】 簡単には、ポリペプチドの活性を調整する物質についてスクリーニングする方
法は、１以上の試験物質を適当な反応媒体中で該ポリペプチドに接触させ、該処
理されたポリペプチドの活性を試験し、次いで、その活性を該試験物質もしくは
複数の試験物質で処理されていない比較できる反応媒体中での該ポリペプチドの
活性と比較することを含むことができる。該処理されたおよび処理されていない
ポリペプチド間の活性の差異は、関連する試験物質もしくは複数の試験物質の調
整効果を示している。
【０１３９】 活性の調整につきスクリーンするのに先立って、あるいは同時に、試験物質は
、例えば、酵母２−ハイブリッド系（例えば、Bartel et al., 1993; Fields an
d Song, 1989; Chevray and Nathans, 1992; Lee et al., 1995）において、該
ポリペプチドと相互作用する能力につきスクリーンすることができる。この系は
、該ポリペプチドの活性を調整する実際の能力につき物質を試験するのに先立つ
粗スクリーンとして用いることができる。あるいは、該スクリーンを用いて、Ｈ
ＰＣ２特異的結合パートナーに結合することにつき試験物質をスクリーンするか
、または、ＨＰＣ２のミメティックスを見つけ得る。
【０１４０】使用方法：合理的薬剤デザイン 合理的薬剤デザインの目標は、例えば、より活性な、または安定な形態のポリ
ペプチド、またはイン・ビボ(in vivo)でポリペプチドの機能を向上する、また
は妨害する薬剤を製造するために、目的の生物学的に活性なポリペプチド、また
は、当該薬剤が相互作用する小分子(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、イ
ンヒビター)の構造アナログを設計することである(例えば、Ｈodgson，1991参照
)。１つのアプローチにおいて、最初に目的のタンパク質(例えば、ＨＰＣ２ポリ
ペプチド)または、例えば、ＨＰＣ２-受容体もしくはリガンドコンプレックスの
三次元構造を、ｘ-線結晶学、コンピュータ・モデリング、または最も典型的に
は、組合せたアプローチによって決定する。あまり頻繁ではないが、相同タンパ
ク質の構造に基づくモデリングによって、ポリペプチドの構造に関する有用な情
報を得ることができる。合理的薬剤デザインの一例は、ＨＩＶプロテアーゼ・イ
ンヒビターの開発である(Ｅricksonら，1990)。加えて、ペプチド(例えば、ＨＰ
Ｃ２ポリペプチド)をアラニン・スキャンによって分析する(Ｗells，1991)。こ
の技術においては、アミノ酸残基をＡlaに置換し、ペプチド活性に対するその影
響を測定する。ペプチドの各アミノ酸残基をこのようにして分析して、ペプチド
の重要な領域を決定する。
【０１４１】 また、機能アッセイによって選抜した標的-特異的抗体を単離し、ついで、そ
の結晶構造を解明することもできる。原則として、このアプローチにより、続く
薬剤デザインに基づき得るファーマコア(pharmacore)が得られる。機能的な薬理
学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ｉｄｓ)を生起することに
よって、タンパク質結晶学を全く回避することができる。鏡像の鏡像のごとく、
抗-ｉｄｓの結合サイトは、元の受容体のアナログであると予想される。ついで
、抗-ｉｄｓを用いて、ペプチドの化学的または生物学的に作成したバンクのバ
ンクからペプチドを同定し、単離し得る。ついで、選抜したペプチドは、ファー
マコアとして作用するであろう。
【０１４２】 かくして、例えば、改善されたＨＰＣ２ポリペプチド活性または安定性を有す
るか、または、例えば、ＨＰＣ２ポリペプチド活性のインヒビター、アゴニスト
、アンタゴニスト他として作用する薬剤をデザインすることができる。クローン
化ＨＰＣ２配列の有効性によって、十分な量のＨＰＣ２ポリペプチドを利用して
、ｘ線結晶学のごとき分析実験を行い得る。加えて、本明細書に供するＨＰＣ２
タンパク質配列の知見は、ｘ-線結晶学の代わりに、またはそれに加えて、コン
ピュータモデリング技術を利用するものに導くであろう。
【０１４３】 ポリペプチド活性を調節するか、またはそれに影響する物質の同定後に、該物
質をさらに調べた。さらに、それは製造され、および／または調製、すなわち、
製造もしくは製剤、または医薬、医薬組成物もしくは薬物のごとき組成物に用い
ることができる。これらは、個人に投与できる。
【０１４４】 かくして、本発明は、本明細書に開示されたものに従い、ポリペプチド活性の
モジュレーターとして核酸分子を用いて同定された物質だけではなく、医薬組成
物、医薬、薬物またはかかる物質を含む他の組成物、かかる物質を含むかかる組
成物を投与することを特徴とする方法、例えば、前立腺癌の治療のためのかかる
組成物を患者に投与することを特徴とする方法、例えば、前立腺癌を治療するた
めの投与用の組成物の製造におけるかかる物質の使用、およびかかる物質と、医
薬上の許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体と、所望により他の成分とを混ぜ
ることを特徴とする医薬組成物の製造方法にも種々の態様において拡大される。
【０１４５】 ポリペプチド機能のモジュレーターとして同定された物質は、天然におけるペ
プチドまたは非ペプチドであり得る。非ペプチドの「小分子」は、しばしば、多
くのｉｎ ｖｉｖｏの医薬上の使用に好ましい。従って、（特に、ペプチドなら
ば）該物質のミメティクおよび模擬物は、医薬上の使用のために設計できる。 公知の医薬上の活性化合物に対するミメティクスの設計は、「リード」化合物
に基づく医薬品の開発に対する公知のアプローチである。これは、活性化合物が
合成するのに困難か、または高価である場合、または投与の特定の方法に適当で
ない場合、例えば、純粋なペプチドが、消化管におけるプロテアーゼによる急速
に分解される傾向にあるような、経口用組成物につき適当でない活性薬剤である
場合に望ましいであろう。ミメティクの設計、合成および試験を一般的に用いて
、標的特性につき多数の分子を無作為にスクリーニングするのを防止する。
【０１４６】 所与の標的特性を有する化合物からのミメティクの設計において通常取られる
いくつかの工程がある。第一に、標的特性を決定するのに非常に重要であり、お
よび／または重要である化合物の特定の部分が決定される。ペプチドの場合には
、これは、該ペプチドのアミノ酸残基を系統的に変更し、例えば、今度は各残基
を置換することによって行うことができる。ペプチドのアラニン走査を通常用い
て、かかるペプチドモチーフは精製される。該化合物の活性領域を構成するこれ
らの部分または残基は、その「ファルマコフォア（pharmacophore）」として知
られる。
【０１４７】 一旦、ファルマコフォアが見出されたならば、その構造は、ある範囲の源から
のデータ、例えば、分光光度技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲを用いて、その
物理的特性、例えば、立体化学、結合、サイズおよび／または電荷により設計さ
れる。コンピューター分析、（原子間の結合よりむしろファルマコフォアの電荷
および／または体積を設計する）類似マッピングおよび他の技術をこの設計プロ
セスに用いることができる。
【０１４８】 このアプローチの変形において、リガンドおよびその結合パートナーの三次元
構造は設計される。これは、該モデルがミメティクの設計においてこれを考慮に
入れるのを可能としつつ、リガンドおよび／または結合パートナーが結合に対す
る立体配置を変化させるのに特に有用である。
【０１４９】 次いで、鋳型分子を選択し、ファルマコフォアを模倣する化学基を融合できる
。それに融合した鋳型分子および化学基をリード化合物の生物学的活性を保持し
つつ、ミメティクを合成するのを容易し、薬理学的に許容されるようであり、ｉ
ｎ ｖｉｖｏにて分解しないように都合よく選択する。あるいは、ミメティクを
ペプチドベースである場合、さらに安定性をペプチドを環化させ、その剛直性を
増大させることによって達成できる。次いで、このアプローチによって見出され
たミメティクおよび複数のミメティクをスクリーニングして、それらが標的特性
を有するか、またはそれらがそれをいかなる大きさで示すかを知る。さらに、次
いで、最適化または修飾を行い、ｉｎ ｖｉｖｏまたは臨床試験のための１以上
のミメティクに達することができる。
【０１５０】使用方法：遺伝子療法 本発明により、野生型ＨＰＣ２機能を突然変異ＢＲＣＡ対立遺伝子を運ぶ細胞
に供する方法が提供される。かかる機能の提供は、受容細胞の新生生物増殖を抑
制するにちがいない。野生型ＨＰＣ２遺伝子またはその遺伝子の一部分は、遺伝
子が染色体外に残るようベクターで細胞に導入し得る。かかる状態においては、
遺伝子は、染色体外位置から細胞によって発現されるであろう。遺伝子フラグメ
ントを突然変異ＨＰＣ２対立遺伝子を運ぶ細胞に導入し発現させた場合、該遺伝
子フラグメントは、細胞の非-新生生物増殖に要するＨＰＣ２タンパク質の一部
分をコードしているにちがいない。
【０１５１】 より好ましくは、野生型ＨＰＣ２遺伝子またはその一部分を、細胞に存在する
内因性突然変異ＨＰＣ２遺伝子とそれが組換わるように、突然変異細胞に導入す
る状況である。かかる組換えには、二重組換え事象が必要であり、これはＨＰＣ
２遺伝子突然変異の訂正を生じる。組換えおよび染色体外維持の両方の遺伝子を
導入するベクターは当該分野で公知であり、いずれかの適当なベクターを用い得
る。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈およびウイルス形質導入の
ごとき細胞にＤＮＡを導入する方法は当該分野で公知であり、方法の選択は日常
従事者の能力の範囲内にある。野生型ＨＰＣ２遺伝子で形質転換した細胞をモデ
ル系として使用し、癌の緩解およびかかる緩解を促進する薬剤処理を研究し得る
。
【０１５２】 一般的に前に論じたごとく、ＨＰＣ２遺伝子またはフラグメントは、適用し得
る場合には、癌細胞中のかかる遺伝子の発現産物の量を増加させるために、遺伝
子療法に用いることができる。かかる遺伝子療法は、癌性および前-癌性細胞の
両方における使用に特に適しており、この療法においては、正常細胞に比して、
ＨＰＣ２ポリペプチドのレベルがなくなるかまたは減じられる。また、「正常」
レベルで突然変異遺伝子が発現しているが、該遺伝子産物は完全に機能的でない
腫瘍細胞中でさえ、所与のＨＰＣ２遺伝子の発現レベルを増加させるにも有用と
なり得る。
【０１５３】 遺伝子療法は、例えば、Ｆriedman(1991）またはCulver（1996）によって記載
されたごとき一般的に許容された方法によって行われるであろう。患者の腫瘍か
らの細胞は、まず、前記した診断方法によって分析して、腫瘍細胞におけるＨＰ
Ｃ２ポリペプチドの産生を確認するであろう。発現制御因子につなげたＨＰＣ２
遺伝子のコピーを含み、腫瘍細胞の内側で複製能力を有するウイルスまたはプラ
スミドベクター(以下のさらなる詳細参照)を調製する。別法として、該ベクター
は複製欠陥であり、遺伝子療法に使用するためにヘルパー細胞中で複製する。米
国特許第5,252,479号およびＰＣＴ国際公開ＷＯ93/07282号および米国特許第5,6
91,198; 5,747,469; 5,436,146および5,753,500号に開示するごとき、適当なベ
クターは公知である。ついで、腫瘍部位に局所的にか、または(他のサイトに転
移し得るいずれかの腫瘍細胞に達するために)全身的にかのいずれかでベクター
を患者に注射する。トランスフェクト遺伝子が各標的化腫瘍細胞のゲノムに恒久
的に取り込まれた場合、該処理を定期的に反復し得る。
【０１５４】 当該分野で公知である遺伝子移入系は、本発明の遺伝子療法の実施に有用とな
り得る。これらには、ウイルスおよび非ウイルス移入法が含まれる。ＳＶ４０(
Ｍadzakら，1992)、アデノウイルス(Ｂerkner，1992；Ｂerknerら，1988；Ｇorzi
gliaおよびＫapikian，1992；Ｑuantinら，1992；Ｒosenfeldら，1992；Ｗilkin
sonおよびAkrigg，1992；Ｓtratford-Ｐerricaudetら，1990；Schneiderら，199
8)、ワクシニアウイルス(Ｍoss，1992；Moss, 1996)、アデノ関連ウイルス(Ｍuz
yczka，1992；Ｏhiら，1990; RussellおよびHirata, 1998)を含むパポーバウイ
ルス科、ＨＳＶおよびＥＢＶ(Ｍargolskee，1992；Ｊohnsonら，1992；Ｆinkら
，1992；ＢreakfieldおよびＧeller，1987；Ｆreeseら，1990；Ｆinkら，1996)
を含むヘルペスウイルス科、レンチウイルス（Naldiniら，1996）、Sindbisおよ
びSemlikiフォレストウイルス（Forest Virus）（Berglundら，1993）ならびに
ニワトリ(ＢrandyopadhyayおよびＴemin，1984；Ｐetropoulosら，1992)、ネズ
ミ(Ｍiller，1992；Ｍilerら，1985；Ｓorgeら，1984；ＭannおよびＢaltimore
，1985；Ｍillerら，1988)およびヒト起源(Ｓhimadaら，1991；Ｈelsethら，199
0；Ｐageら，1990；ＢuchschacherおよびＰanganiban，1992)のレトロウイルス
を包含する、多数のウイルスが遺伝子移入ベクターとして用いられている。大部
分のヒト遺伝子療法プロトコールは、不活化ネズミレトロウイルスに基づいてい
るが、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスも用られる。
【０１５５】 当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈(Ｇrah
amおよびvan der Ｅb，1973；Ｐellicerら，1980)のごとき化学的技術；例えば、
マイクロインジェクション(Ａndersonら，1980；Ｇodonら，1980；Ｂrinsterら
，1981；ＣonstantiniおよびＬacy，1981)のごとき機械的方法；リポソームを介
した膜融合-介在移入(Ｆelgnerら，1987；ＷangおよびＨaung，1989；Ｋanedaら
，1989；Ｓtewartら，1992；Ｎabelら，1990；Ｌimら，1991);ならびに直接ＤＮ
Ａ取り込みおよび受容体-媒介ＤＮＡ移入(Ｗolffら，1990；Ｗuら，1991；Ｚenk
eら，1990；Ｗuら，1989b；Ｗolffら，1991；Ｗagnerら，1990；Ｗagnerら，199
1；Ｃottenら，1990；Ｃurielら，1991；Ｃurielら，1992)が含まれる。ウイル
ス-媒介遺伝子移入は、リポソームデリバリーを用いる直接イン・ビボ(in vivo)
遺伝子移入と組み合わせることにより、周囲の非分割細胞にではなく、腫瘍細胞
にウイルスベクターを指向することができる。別法として、レトロウイルスベク
ター産生細胞系統を腫瘍に注射し得る(Ｃulverら，1992)。ついで、産生細胞の
注射は、ベクター粒子の連続供給源を提供する。この技術は、手術不可能な脳腫
瘍を有するヒトにおいて使用することが認可されている。
【０１５６】 生物および物理学的遺伝子移入法を組み合わせたアプローチにおいては、いず
れかのサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソンタンパク質に特
異的なポリリジン-コンジュゲート抗体と組み合わせ、得られたコンプレックス
をアデノウイルスベクターに結合する。ついで、三分子コンプレックスを用いて
細胞を感染する。アデノウイルスベクターは、カップル化ＤＮＡが損傷される前
に、エンドソームの効率的な結合、内在化および消化を許容する。アデノウイル
スベースのベクターの運搬に関する他の技術については、Schneiderら（１９９
８）および米国特許第5,691,198; 5,747,469: 5,436,146および5,753,500号を参
照せよ。
【０１５７】 リポソーム／ＤＮＡコンプレックスは、直接イン・ビボ遺伝子移入を媒介し得
ることが示された。標準的なリポソーム調製物において遺伝子移入プロセスは非
特異的であるが、例えば、直接イン・サイチュ(in situ)投与後に、局在化イン
・ビボ(in vivo)取り込みおよび発現が腫瘍沈着において報告されている(Ｎabel
，1992)。
【０１５８】 遺伝子療法の文脈において発現ベクターとは、その中でクローン化されている
ポリヌクレオチドを発現するのに充分な配列を含有するその構築体を含むことを
意味する。ウイルス発現ベクターにおいて、該構築体は、該構築体のパッケージ
ングを支持するのに充分なウイルス配列を含有する。該ポリヌクレオチドがＨＰ
Ｃ２をコード化するならば、発現はＨＰＣ２を産生するであろう。該ポリヌクレ
オチドがアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボチームをコード化するならば
、発現は該アンチセンスポリヌクレオチドまたはリボチームを産生するであろう
。かくして、この文脈において、発現は、タンパク質産物が合成されることを要
しない。該発現ベクター内にクローン化されたポリヌクレオチドに加えて、該ベ
クターは真核細胞におけるプロモータ機能も含有する。該クローン化ポリヌクレ
オチド配列はこのプロモータの制御下にある。適当な真核細胞プロモータは上記
したものを含む。該発現ベクターは、選択可能なマーカーおよび本明細書に記載
した他の配列のごとき配列も含む。
【０１５９】 ＤＮＡを、前立腺組織、例えば、前立腺の上皮細胞にＤＮＡを直接標的化する
遺伝子移入技術が好ましい。受容体-媒介遺伝子移入は、例えば、ポリリジンを
介して、タンパク質リガンドにＤＮＡ(通常、共有的に閉環したスーパーコイル
化プラスミドの形態)をコンジュゲートすることによってなす。リガンドは、標
的細胞／組織型の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択す
る。１つの適当な受容体／リガンド対には、エストロゲン受容体およびそのリガ
ンド、エストロゲン(およびエストロゲン・アナログ)が含まれ得る。これらのリ
ガンド-ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血液に直接注射することができ
、受容体結合およびＤＮＡ-タンパク質コンプレックスの内在化が起こる標的組
織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服するため、アデノウイルスと
の同時感染を関与させて、エンドソーム機能を崩壊し得る。
【０１６０】 該療法には、単独または結合して行い得る二工程が含まれる。第一工程におい
ては、ＨＰＣ２感受性対立遺伝子を運ぶ思春期前女性を、彼女達の乳管上皮前駆
細胞の幾つかまたは全部が機能正常ＨＰＣ２対立遺伝子の少なくとも１つのさら
なるコピーを受けるように、遺伝子デリバリービヒクルで処理する。この工程に
おいては、処理した個人は、正常な対立遺伝子が存在することによって感受性対
立遺伝子の作用を押しとどめる程度まで低下した前立腺乳癌の危険性を有する。
予防的な療法の第二工程においては、予め処理した若年女性、特に、提起した遺
伝子療法治療を受けた女性をホルモン療法に付して、全期間妊娠の前立腺に対す
る影響を模倣する。
【０１６１】使用方法：ペプチド療法 ＨＰＣ２活性を有するペプチドを、突然変異または欠失したＨＰＣ２対立遺伝
子を運ぶ細胞に提供し得る。ＨＰＣ２タンパク質の配列を開示する(配列番号：
２)。タンパク質は、例えば、公知の発現ベクターを用いて、細菌中でｃＤＮＡ
配列を発現させることによって産生し得る。別法として、ＨＰＣ２ポリペプチド
は、ＨＰＣ２産生-哺乳動物細胞から抽出することもできる。加えて、合成化学
の技術を用いて、ＨＰＣ２タンパク質を合成することもできる。いずれのかかる
技術も、ＨＰＣ２タンパク質を含む本発明の調製物を提供し得る。該調製物は、
実質的に他のヒトタンパク質を含んでいない。このことは、微生物またはイン・
ビトロ(in vitro)の合成によって最も容易になされる。
【０１６２】 活性ＨＰＣ２分子は、マイクロインジェクションによってか、または例えば、
リポソームを使用することによって細胞に導入し得る。別法として、能動的また
は拡散によって、ある種の活性分子が細胞によって取り込まれ得る。ＨＰＣ２遺
伝子産物の細胞外適用は、腫瘍増殖に十分に影響し得る。ＨＰＣ２活性を有する
分子の適用は、新生生物状態の部分的逆転に通じるにちがいばい。ＨＰＣ２活性
を有する他の分子(例えば、ペプチド、薬剤または有機化合物)を用いてもかかる
逆転に影響し得る。実質的に同様の機能を有する修飾ペプチドも、ペプチド療法
に用いられる。
【０１６３】使用方法：形質転換宿主 同様にして、突然変異ＨＰＣ２対立遺伝子を運ぶ細胞および動物をモデル系と
して用いて、治療剤としての潜在性を有する物質について実験および試験し得る
。細胞は、典型的には、培養上皮細胞である。これらは、体細胞または生殖系列
のいずれかのＨＰＣ２突然変異を有する個人から単離し得る。別法として、該細
胞系統を設計して、前記したごとく、ＨＰＣ２対立遺伝子中に突然変異を運ばせ
得る。試験物質を該細胞に適用した後、該細胞の新生生物的に形質転換した表現
型を測定する。アンカレッジ・インディペンデント増殖、ヌードマウスにおける
腫瘍形成性、細胞の非侵入性、および増殖因子依存性を包含する、新生生物的に
形質転換した細胞のいずれの特色も評価し得る。これらの各特色のアッセイは、
当該分野で知られている。
【０１６４】 治療剤を試験する動物は、全体動物の突然変異誘発後または生殖系統細胞また
は接合体の処理後に選択し得る。かかる処理には、通常は、第二動物種からの突
然変異ＨＰＣ２対立遺伝子の挿入、ならびに、破壊した相同遺伝子の挿入が含ま
れる。別法として、動物の内在性ＨＰＣ２遺伝子(群)は、挿入または欠失突然変
異または従来技術を用いた他の遺伝的変化によって破壊して (Ｃapecchi，1989
；ＶalanciusおよびＳmithies，1991；Ｈastyら，1991；Ｓhinkaiら，1992；Ｍo
mbaertsら，1992；Ｐhilpottら，1992；Ｓnouwaertら，1992；Ｄonehowerら，19
92)、ノックアウト（knockout）またはトランスプレスメント(transplacement）
動物を作製し得る。トランスプレスメントは、ノックアウトに類似する。何故な
らば、該内在性遺伝子は置換されるが、トランスプレスメントの場合には、該置
換は、同一遺伝子のもう一つのバージョンによりからである。試験物質を動物に
投与した後に、腫瘍の増殖を評価しなければならない。試験物質が腫瘍の増殖を
防ぐか、または抑制した場合には、該試験物質は、本明細書にて同定した癌の治
療の候補治療剤である。これらの動物モデルは、潜在的な治療製品に極めて重要
な試験ビヒクルを提供する。
【０１６５】 本発明の１つの具体例において、機能的ＨＰＣ２ポリペプチドまたはその変異
体をコードする機能的導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を作成される。
ＨＰＣ２導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物、かかる動物から由来す
る組換え細胞系および導入遺伝子胚は、ＨＰＣ２の機能を誘導するまたは抑制す
る薬剤をスクリーニングするまたは同定する方法に有用であり得る。また、本発
明のトランスジェニック動物は、疾患のごとき指標を研究するためのモデルとし
て用いることもできる。
【０１６６】 本発明の１つの具体例において、ＨＰＣ２導入遺伝子を非ヒト宿主に導入して
、ヒトまたはネズミのＨＰＣ２遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作成
する。トランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能とする方法において
ゲノムへの導入遺伝子の組込みによって作成される。トランスジェニック動物の
作成方法は、一般的に、WagnerおよびHoppe（米国特許第４,８７３,１９１号：
ここに、出典明示して本明細書の一部とみなす）、Brinsterら、１９８５；ここ
に、出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす）によって、および「Mani
pulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual」第２版（Hogan, Beddingto
n, CostantimiおよびLong編, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1994；こ
こに、出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす）に記載されている。
【０１６７】 導入遺伝子および内因性遺伝子間の相同的組換えによって内因性ＨＰＣ２を置
換するのが望ましく；またはその内因性遺伝子を「ノックアウト」動物の調製に
おける欠失によって消失できる。典型的には、ゲノム配列によって隣接するＨＰ
Ｃ２遺伝子を受精卵にマイクロインジェクションによって移す。マイクロインジ
ェクトされた卵を雌の宿主に埋込み、導入遺伝子の発現につき仔をスクリーニン
グする。トランスジェニック動物は、限定されるものではないが、爬虫類、両性
類、鳥類、哺乳動物および魚類を含めた多数の動物からの受精卵から作成できる
。特に好ましい具体例には、トランスジェニック・マウスを作成し、それはＨＰ
Ｃ２を過剰発現するか、または該ポリペプチドの変異体形態を発現する。別法と
して、「ノックアウト」マウスにおけるＨＰＣ２の不存在は、ＨＰＣ２タンパク
質の喪失がｉｎ ｖｉｖｏにて細胞に対して有する効果の研究を可能とする。ま
た、ノックアウト・マウスは、ＨＰＣ２に関連する癌の発生についてのモデルを
供する。
【０１６８】 ノックアウト動物を作成する方法は、一般的に、Shastry（１９９５、１９９
８）ならびにOsrerriederおよびWolf（１９９８）によって記載されている。遺
伝子が、所望の時点にてノックアウトされるまで活性である条件付きのノックア
ウト動物の作成は、一般的に、Feilら（１９９６）、Gagnetenら（１９９７）な
らびにLobeおよびNagy（１９９８）によって記載されている。これらの参考文献
の各々を出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０１６９】 前記に記述されるごとく、トランスジェニック動物およびかかる動物から由来
する細胞系は、ある種の試験用実験における使用を見出すことができる。この点
に関して、野生型または変異体のＨＰＣ２を発現できるトランスジェニック動物
および細胞系を試験物質に曝露できる。これらの試験物質は、野生型ＨＰＣ２の
過剰発現を低下させるか、または変異体ＨＰＣ２の発現または機能を障害する能
力につきスクリーニングできる。
【０１７０】医薬組成物および投与経路 本発明のＨＰＣ２のポリペプチド、抗体、ペプチドおよび核酸は、医薬組成物
中に処方でき、それは通常の医薬混合技術により調製される。例えば、Remingto n's Pharmaceutical Science 、１８版（１９９０、Mack Publishing Co., Easto
n, PA）参照。該組成物は、活性薬剤またはその活性薬剤の医薬上許容される塩
を含有できる。これらの組成物は、活性物質のうちの１つに加えて、医薬上許容
される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当該技術においてよく知られた他の
物質を含むことができる。かかる材料は、非毒性であるべきであり、有効成分の
効力と干渉しないであろう。担体は、例えば、静脈内、経口的、髄腔内、神経弓
上または非経口的な投与が望ましい製剤の形態に依存して非常に広範囲な形態を
取り得る。
【０１７１】 経口投与では、該化合物は、カプセル剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ、メルト、散
剤、懸濁剤または乳剤のごとき固体または液体の製剤に処方できる。経口投与形
態におけ組成物の調製において、（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤の
ごとき）経口液体製剤の場合に、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香
味剤、保存剤、着色剤、懸濁化剤等のごとき通常の医薬媒体；（例えば、散剤、
カプセル剤および錠剤のごとき）経口固体製剤の場合には、デンプン、糖、希釈
剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のごとき担体のいずれかを用いること
ができる。投与におけるそれらの容易さのために、錠剤およびカプセル剤は、最
も有利な経口投与単位形態を表し、この場合、固体医薬担体は明らかに使用され
る。所望ならば、錠剤は、標準的技術によって糖コートまたは腸溶性コートでき
る。活性薬剤をカプセル化して、同時に血液脳関門を横切って通過するのを可能
としつつ、胃腸管を通過するのを安定化できる。例えば、ＷＯ９６／１１６９８
参照。
【０１７２】 非経口投与では、該化合物は、医薬担体に溶解し、液剤または懸濁剤のいずれ
かとして投与できる。適当な担体の例示は、水、生理食塩水、デキストロース溶
液、フルクトース溶液、エタノール、または動物、植物または合成起源の油であ
る。また、担体は、他の成分、例えば、保存剤、懸濁化剤、可溶化剤、緩衝剤等
を含有できる。該化合物が髄腔内投与される場合、それらは脳脊髄液に溶解して
もよい。
【０１７３】 活性薬剤は、治療上有効量にて好ましくは投与される。投与される実際の量お
よび投与の速度および時間経過は、治療されるべき疾患の性質および重篤度に依
存するであろう。治療の処方、例えば、投与、時期等の決定は、一般医または専
門医の責任の範囲内にあり、典型的には、治療されるべき疾患、個々の患者の状
態、送達部位、投与方法および開業医に知られた他の因子が考慮される。手法お
よびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Scienceに見出すことが
できる。
【０１７４】 あるいは、ターゲティング治療を用いて、抗体または細胞特異的リガンドのご
ときターゲティング・システムの使用によって、活性薬剤をより詳細にはある種
の型の細胞に送達できる。ターゲティングは、例えば、薬剤が許容できない毒性
がある、またはあまりにも高用量を必要とする、または標的細胞に入ることがで
きないならば、様々な理由のために望ましいであろう。
【０１７５】 これらの薬剤を直接的に投与する代わりに、それらは、標的細胞中、例えば、
前記のごときウイルスベクター中、または患者における埋込みのために設計され
た、米国特許第５,５５０,０５０号および公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／
１９１９５、ＷＯ９４／２５５０３、ＷＯ９５／０１２０３、ＷＯ９５／０５４
５２、ＷＯ９６／０２２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、
ＷＯ９６／４０９５９およびＷＯ９７／１２６３５に記載のごとき細胞ベースの
送達システムにおいて生成できる。ベクターは、治療されるべき特定の細胞を標
的とでき、またはそれは標的細胞により組織特異的である調節要素を含むことが
できる。細胞ベースの送達システムは、所望の標的部位にて患者の体に埋込むよ
うに設計され、活性薬剤についてのコード配列を含む。あるいは、薬剤は、処置
されるべき細胞において産生されるか、それを標的にした活性薬剤によって活性
形態に変換する前駆体形態にて投与できる。例えば、ＥＰ４２５,７３１Ａおよ
びＷＯ９０／０７９３６参照。
【０１７６】 ＨＰＣ２遺伝子突然変異と前立腺癌との間の関連の同定は、個人の早期の前症
候的スクリーニングが、前立腺癌を発生するリスクのあるものを同定するのを可
能とする。かかる個人を同定するために、ＨＰＣ２対立遺伝子は、直接的に、ま
たは対立遺伝子をクローニングした後のいずれかの突然変異につきスクリーニン
グされる。対立遺伝子は、限定されるものではないが、以下の方法：蛍光in sit
uハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接的ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析
、サザーンブロット分析、一本鎖立体配置分析（ＳＳＣＰ）、連鎖分析、ＲＮａ
ｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブ
ロット分析およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析のうち１つを含めたいずれかの適当な手
法を用いて、通常の対立遺伝子からの核酸配列の差の存在につき試験される。ま
た、最近開発された手法のＤＮＡマイクロチップ技術が有用である。例えば、（
１）クローン化された対立遺伝子および通常のＨＰＣ２遺伝子または適当なフラ
グメント（コード配列またはゲノム配列）の双方のヌクレオチド配列を決定し比
較し、次いで、または（２）ＨＰＣ２遺伝子または遺伝子フラグメントのＲＮＡ
転写体を、試験されるべき個人からの一本鎖全ゲノムＤＮＡとハイブリダイズし
、得られたヘテロデュプレックスをリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ Ａ）で処
理し、変性ゲル上で泳動して、いずれかのミスマッチの位置を検出する。これら
の方法のうち２つは、以下の手順により行うことができる。
【０１７７】 試験されるべき個人におけるＨＰＣ２遺伝子の対立遺伝子は、通常の手法を用
いてクローニングされる。例えば、血液試料は、個人から得られる。この試料中
の細胞から単離されたゲノムＤＮＡは、約２０キロベースの平均フラグメントサ
イズに部分的に消化される。１８〜２１の範囲のフラグメントを単離する。得ら
れたフラグメントを適当なベクターに連結する。次いで、クローンの配列を決定
し、通常のＨＰＣ２遺伝子と比較する。
【０１７８】 あるいは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）をＨＰＣ２遺伝子の５領域またはエ
キソンについてのプライマー対を用いて行う。また、ＰＣＲは、通常のＨＰＣ２
遺伝子のいずれかの配列に基づきプライマー対を用いて行うことができる。例え
ば、イントロンの１つについてのプライマー対を調製でき、利用できる。また、
最後に、ＲＴ−ＰＣＲをｍＲＮＡに行うこともできる。次いで、増幅産物は、通
常の手法を用いて一本鎖配置多形（ＳＳＣＰ）によって分析して、いずれかの差
を同定し、次いで、配列決定し、通常の遺伝子配列と比較する。
【０１７９】 個人は、適当なプラマー対を用いて個人のＤＮＡを増幅し、次いで、例えば、
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プローブを用いるドットブロット・ハイ
ブリダイゼーションによって、増幅産物を分析することによって、共通のＨＰＣ
２遺伝子変異体につき迅速にスクリーニングできる。
【０１８０】 第二の方法は、ＲＮａｓｅ Ａを使用して、通常のＨＰＣ２遺伝子と欠損遺伝
子との間の差の検出において援助する。この比較は、プローブとしてＨＰＣ２遺
伝子の小さな（約５００塩基対）制限フラグメントを用いる工程において行う。
まず、ＨＰＣ２遺伝子を約５００塩基対のフラグメントに遺伝子配列を切断する
（複数の）制限酵素で消化する。これらのフラグメントを電気泳動ゲル上で分離
し、ゲルから精製し、ＳＰ６ベクター（例えば、ｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５）
に両方向において、個々にクローニングする。ＨＰＣ２遺伝子フラグメントのイ
ンサートを含有するＳＰ６ベースのプラスミドを［α−３２Ｐ］ＧＴＰの存在下
にて当該分野においてよく知られたＳＰ６転写系を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにて
転写し、該遺伝子の両鎖の放射標識ＲＮＡ転写体を生成する。
【０１８１】 個々には、これらのＲＮＡ転写体を用いて、通常の手法を用いる対立遺伝子Ｄ
ＮＡとヘテロデュプレックスを形成する。個人からのＨＰＣ２フラグメントとＨ
ＰＣ２対立遺伝子サブクローンとの間の差を配列決定するために、ＲＮＡ：ＤＮ
Ａヘテロデュプレックスにおいて生じたミスマッチの結果、ＲＮＡａｓｅ Ａで
処置した場合にＲＮＡ鎖を切断する。かかるミスマッチは、個人の対立遺伝子に
おける点突然変異または小さな欠失の結果であり得る。ＲＮＡ鎖の切断は、２以
上の小さなＲＮＡフラグメントを与え、それはＲＮＡプローブ自体より、変性ゲ
ル上で速く泳動される。
【０１８２】 見出されたいずれかの差は、ＨＰＣ２の分子変異体を有すると個人を同定する
であろう。これらの変異体は、多数の形態を取ることができる。最も重篤な形態
は、フレームシフト突然変異または大きな欠失であり、それは遺伝子に異常なタ
ンパク質またはタンパク質発現をかなり変更するであろうものをコードさせるで
あろう。ほとんど重篤でない破壊的な突然変異には、小さなインフレーム欠失お
よび非保存的な塩基対置換が含まれ、それはシステイン残基に対するまたはそれ
からの変化、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への、もしくはその逆、親油性ア
ミノ酸から親水性アミノ酸への、もしくはその逆、または二次または三次のタン
パク質構造に影響するであろう他の突然変異のごとき産生されるタンパク質に対
してかなりの効果を有するであろう。サイレント突然変異または保存的アミノ酸
置換において生じたものは、一般的には、タンパク質機能を破壊するとは期待さ
れないであろう。
【０１８３】 一般的な試験は、誕生にて、または以前でさえも開業医が前立腺癌のリスクの
ある個人を同定するのを可能とするであろう。これらの癲癇の前症候性の診断は
、これらの疾患の予防を可能とするであろう。
【０１８４】
【実施例】
以下の実施例において本発明をさらに詳細に記載する。例示のためにこの実施
例を提供するが、この実施例により本発明が制限されることはいかなる点におい
ても意図しない。当該分野において周知の標準的な技術または以下に詳細に記載
する技術を利用する。
【０１８５】 実施例１ HPC2の遺伝子上での位置決定 前立腺癌感受性遺伝子座の位置を決定するために、前立腺癌を発症する危険性
の高い血縁群を1990年からユタ州で収集してきた。1996年２月に、家系の一部（
サブセット）で行ったゲノムスキャンからのデータでの連鎖分析は、17ｐ染色体
上のマーカーとの連鎖の証拠を示した。より多くの家系群で17p染色体のこの領
域内のさらなるマーカーを引き続いて分析すると、感受性遺伝子に対する強力な
連鎖の証拠が導き出された。
【０１８６】
【表１】
【０１８７】 17p染色体に対する連鎖の強力な証拠を有する特定の血縁の研究により、血縁
中の前立腺癌症例に共通の17p染色体の最も小さい遺伝断片を同定して感受性遺
伝子座の可能性が最も高い領域を規定することができた。遺伝子学的に定義した
最小領域は、血縁4325でのテロメア組換え（telomeric recombinant）および血
縁4320でのセントロメア組換え（centromeric recombinant）に基づく。血縁432
5は、初期発症型前立腺癌症例の氏族であることを確認した。この家系には６人
の罹患した兄弟がおり、彼らのうちの一人は息子もまた罹患していた。 ６人の罹患した兄弟のうちの５人、およびその罹患した息子は、全員、 マーカーmyr0065より下流でマーカーD17S805を含みマーカーD17S57までの個所に
由来する染色体17pの同一部分を有する。血縁4320もまた、初期発症型前立腺癌
症例の氏族であることを確認した。この血縁では、３人の罹患した兄弟および１
人の罹患した甥は、17p染色体の断片のD17S786の下流からmyr0084を含むところ
までが共通している。血縁4325の組換え断片と血縁4320の組換え断片はともに、
約１メガ塩基対の最小領域を規定している（図２Ａを参照のこと）；この位置は
、長い組換えセットが両方向に存在することにより非常によく裏付けられている
。
【０１８８】 実施例２遺伝子的に規定した最小HPC2領域におけるコンティグアセンブリおよびゲノム配 列決定 コンティグアセンブリ．遺伝的に規定した区間が減数組換えにより隣接してい
ると仮定すると、この区間に亘るゲノムクローンのコンティグを作製する必要が
ある。公に利用可能である供給源（例えば、WICGR Chr 17マップのようなヒトゲ
ノムのWhitehead統合マップ）から、遺伝マーカー、他の配列タグ化部位（STS）
、放射能ハイブリッドマップおよびCEPH酵母人工染色体（YAC）クローンの整列
染色体マップを得る。
【０１８９】 この区間内に位置するマーカーに対するオリゴヌクレオチドプライマー対を合
成し、細菌人工染色体（BAC）のライブラリーをスクリーニングして領域内のBAC
を同定するために使用した。用いたマーカーの最初のセットは、D17S969、WI-24
37、WI-2335、D17S947およびD17S799である（図２Ａ）。これらのマーカーを用
いて同定したBACを末端配列決定した。それらの末端配列から設計したPCRプライ
マーをマーカーとして用いて初期(initial)BACをコンティグ中に配置した。各コ
ンティグ由来の最も外側のマーカーを、BACライブラリーのスクリーニングの連
続した回で使用し、最終的には遺伝的に規定した区間に亘るBACクローンコンテ
ィグを完成することができた。次いで、続いてのゲノム配列決定のような分子ク
ローニングプロトコルで使用するため、この区間に亘る、部分的に重なっている
が、重複しているわけではないBACクローンのセット（図２Ａ）を選択した。
【０１９０】 ゲノム配列決定．BACクローンのタイリング経路（tiling path）が規定区間に
またがると仮定すると、有用な遺伝子を見出すストラテジーの１つはこの区間の
ほぼ完璧なゲノム配列を作製することである。２つのタイプのランダムゲノムク
ローンサブライブラリーをタイリング経路上で各BACから製造した；これらは、
５ないし８kbに亘るサイズのインサートを有するSau 3A部分消化ライブラリーお
よび1.0〜1.5kbに亘るサイズのインサートを有するランダム剪断ライブラリーで
ある。各BACの、平均１×重複配列を作製するために十分な数のSau 3Aサブライ
ブラリーから、個々のクローン由来のプラスミドDNAを、Autogen自動プラスミド
製造機（Integrated Separation Systems）を用いて製造した。各BACの、平均５
×重複配列を作製するために十分な数のランダム剪断サブライブラリーからの個
々のクローン由来のインサートDNAを、各クローンからの個別の細菌培養物のア
リコートからベクタープライマーを用いて直接、PCRにより製造した。得られたD
NAテンプレートを、M13正方向または逆方向の蛍光色素標識プライマーで、ABI 3
77シークエンサーで両側からDNA配列決定を行った。
【０１９１】 これらの配列を、プログラム、Acem.bly (Thierry-Miegら、1995; Durbinおよ
びThierry-Mieg、1991）を用いて配列コンティグにアセンブリした。ゲノム配列
コンティグを、続いての類似性研究のためにジェネティックデータエンバイロメ
ント（Genetic Data Environment）(GDE) (Smithら、1994) 位置データベースに
配置した。ゲノムＤＮＡ配列とGenBank登録物の中での類似性（DNAおよびタンパ
ク質の両方）を、BLAST (Altschulら、1990）を用いて決定した。また、DNA配列
を、短期反復（short period repeats）、CpG含量および長オープンリーディン
グフレームに関して特徴付けを行った。
【０１９２】 実施例３ ヒトHPC2遺伝子の配列アセンブリ BAC 31k12由来のゲノム配列をdbESTに対してBLASTサーチを行うことにより、
２個の独立したヒトESTのセットを同定した。これをBAC 31k12ゲノム配列に亘っ
て解析すると２個の独立した多重エキソン候補遺伝子である04CG09遺伝子および
HPC2遺伝子の存在が示された（図２Ａ）。HPC2と命名したEST配列のサブセット
（テーブル２）を、遺伝子の仮の部分cDNA配列を作製するためにアセンブリした
。
【０１９３】
【表２】
【０１９４】 ヒトHPC2遺伝子の個々のエキソンを、BAC 31k12ゲノム配列に亘る仮のcDNA配
列を解析することにより同定した（図2Dおよび2Eの模式図を参照のこと）。本発
明者らがHPC2遺伝子を同定した後に、MITゲノムシークエンシングが別のBAC（59
7m12）を完全に配列決定したが、これもまたHPC2 (Genbank登録番号AC005277）
のエキソンの全てを含んでいる。仮のcDNAアセンブリ由来の個々のエキソンの配
列を、BAC 31k12および597m12の対応するゲノム配列と比較すること、ならびに
ヒトゲノムDNAのセット由来の遺伝子を変異スクリーニングすることの両方によ
り、ヒトHPC2遺伝子の配列を校正した（実施例５を参照のこと）。
【０１９５】 本来の仮のヒトHPC2 cDNA配列は、開始コドンも、5' UTRも、いずれも含んで
いない。これらは、5' RACEから入手した。簡単に述べると、ビオチン化逆方向
プライマーであるCA4cg07.BR2を、ヒトHPC2遺伝子の第３のエキソンの配列から
設計し、そしてヒト胎児肝臓cDNAでの１回目のPCR増幅で、配列5tag1でcDNA分子
の５’末端に固定されるように製造したアンカープライマー、5ampAとともに使
用した。得られたPCR産物をストレプトアビジン常磁性粒子（Dynal）で捕獲、洗
浄し、２回目のPCR増幅でテンプレートとして使用した。リン酸化逆方向プライ
マーであるCA4cg07.PR2をヒトHPC2配列の第２のエキソンの配列から設計し、そ
して２回目のPCR増幅でネスト型リン酸化アンカープライマーである5ampBととも
に使用した。得られた5' RACE産物をゲル精製し、色素ターミネーター化学法お
よびABI 377シークエンサーを用いてプライマーCA4cg07.PR2を用いて配列決定し
た。これらの5' RACE産物の配列分析により、開始コドンと、インフレームの停
止コドンを含む5' UTRの部分の両方を得た（図３）。5' RACEに使用したプライ
マーの配列をテーブル4に示す。
【０１９６】 プライマーCA4cg7.ATGおよびCA4cg7.TGAを用いて、完全長ヒトHPC2 cDNAをヒ
トの頭部と頸部とのcDNAから増幅した。cDNAをベクターpGEM-T Easy (Promega)
に連結し、E. coliに形質転換した。cDNAクローンの配列を色素ターミネーター
配列決定によりABI 377シークエンサーで確認した。また、cDNA構築物を増幅し
、cDNAクローンの配列を確認するために用いたプライマーの配列をテーブル３に
示す。
【０１９７】
【表３】
【０１９８】 実施例４ マウスHPC2遺伝子の配列アセンブリ dbESTに対してアセンブリしたHPC2 cDNA配列のBLASTサーチにより、５個のマ
ウスESTを同定した。これらは非常に類似する遺伝子、HPC2のマウスオルトログ
（ortholog）である、Mm.HPC2由来である；これらの登録番号をテーブル４に示
す。
【０１９９】
【表４】
【０２００】 本来の部分Mm.HPC2 cDNA配列は開始コドンを含んでいたが、5' UTRはほとんど
含んでいなかった。より長い5' UTR配列を5' RACEにより得た。簡単に述べると
、ビオチン化した逆方向プライマーm04cg07BR1をマウスHPC2遺伝子の第４のエキ
ソンの配列から設計し、そしてcDNA分子の５’末端を配列5tag1で捕捉するよう
に製造したアンカープライマー5ampAとともにマウス胎児cDNAからの１回目のPCR
増幅で用いた。得られたPCR産物をストレプトアビジン常磁性粒子（Dynal）で捕
捉し、洗浄し、そして２回目のPCR増幅にテンプレートとして使用した。リン酸
化逆方向プライマーm04cg07PR1をマウスHPC2配列の第３のエキソンの配列から設
計し、そしてネスト型リン酸化アンカープライマー5ampBと共に２回目のPCRで使
用した。得られた5' RACE産物をゲル精製し、そしてプライマーm04cg07PR1およ
びm04cg07 exon2 revを用いて、色素ターミネーター化学法およびABI 377シーク
エンサーを用いて配列決定した。これらの5' RACE産物の配列を分析することに
より、開始コドンと、インフレームの停止コドンを含む5' UTRの部分の両方を得
た（図３）。5' RACEに用いたプライマーの配列をテーブル５に示す。
【０２０１】 より長い5' UTR配列と、プロモーターに由来するであろう配列と、マウスHPC2
遺伝子のイントロン１およびイントロン２の配列とを、ゲノム配列決定により得
た。マウスゲノムライブラリーをマウスHPC2 cDNA配列のエキソン11由来のプラ
イマー対（04CG7.m11f1および04CG7.m11r1、テーブル５）を用いてPCRでライブ
ラリーをスクリーニングすることによりBAC 428n12を得た。BAC 428n12のSP6末
端配列由来のプライマー対（428n12.S6.F1および428n12.S6.F1、テーブル５）を
用いてマウスBACライブラリーをPCRでスクリーニングした；いくつかのオーバー
ラップするBAC（BAC 199n11を含む）を同定した。BACs 428n12および199n11を、
マウスHPC2 cDNA由来の13個の配列決定プライマーのシリーズを用いて、色素タ
ーミネーター化学法およびABI 377シークエンサーを用いて配列決定した（mcg7f
1〜mcg7r7、テーブル５）。これらの配列のサブセットをエキソン１のATG開始コ
ドンの280bp上流からエキソン３に亘るゲノム配列コンティグへとアセンブリし
た。
【０２０２】 全長マウスHPC2 cDNAをマウス胚cDNA、マウス胎盤cDNAまたはマウス胎児脳cDN
Aから、プライマーmsCA4cg7.f outおよびmsCA4cg7.r outを用いて増幅した。プ
ライマーmsCA4cg7.ATGおよびmsCA4cg7.TGAを用いてcDNAを再増幅した。得られた
PCR産物をゲル精製し、ベクターpGEM-T Easy (Promega)にライゲートし、E. col
iに形質転換した。cDNAクローンの配列を、ABI 377シークエンサーで色素ターミ
ネーター配列決定法で確認した。また、cDNA構築物を増幅するために使用するプ
ライマーの配列をテーブル５に示す。
【０２０３】
【表５】
【０２０４】 実施例５ ヒトHPC2遺伝子の変異スクリーニング 前立腺癌血縁メンバー由来、前立腺癌罹患者由来、および腫瘍細胞系統由来の
ゲノムDNAをテンプレートとして用いて、ネスト型PCR増幅を行い、PCR産物を作
製してHPC2遺伝子中の変異をスクリーニングした。テーブル６に列挙したプライ
マーを用いてHPC2遺伝子のセグメントを増幅した。各アンプリコンに対して外側
のプライマー（1A-1P、すなわち、アンプリコン１の正方向Aおよび逆方向P）を
使用して、ゲノムDNA、10-20 ngを25サイクルの初期増幅にかけ、その後にPCR産
物を45倍に希釈してネスト型M13テイルプライマー（1B-1Q、1C-1R、すなわち、
アンプリコン１のネスト型正方向Bおよびネスト型逆方向Q、またはアンプリコン
１のネスト型正方向Cおよびネスト型逆方向R）を使用して、さらに23サイクルで
再増幅した。一般的には、サンプルをTaq Platinum (Life Technologies) DNAポ
リメラーゼを用いて増幅した［サイクルパラメーター：初期変性工程95℃で３分
間、続いて96℃での変性サイクル（12秒）、55℃でのアニーリング（15秒）およ
び72℃で伸長（30〜60秒）］。PCR反応の後、過剰のプライマーとデオキシヌク
レオチドトリホスフェートとをエキソヌクレアーゼＩ（United States Biochemi
cals）およびエビアルカリホスファターゼ（Amersham）で消化した。M13正方向
および逆方向蛍光色素標識プライマー（Big Dye, ABI）で、ABI 377シークエン
サーを用いてPCR産物を配列決定した。多形性または配列異常が存在するかどう
かについてクロマトグラム（chromatogram）により、Macintosh program Sequen
cher (Gene Codes)またはJava program Mutscreenのいずれかで分析した。
【０２０５】
【表６】
【０２０６】
【表７】
【０２０７】
【表８】
【０２０８】
【表９】
【０２０９】
【表１０】
【０２１０】 連鎖家系における前立腺癌罹患者から回収した白血球DNA由来のHPC2の変異ス
クリーニングの経過において、血縁4102の２人の罹患した兄弟でフレームシフト
変異（1641insG）を検出した。個体4102.001（51歳で前立腺癌と診断）およびそ
の個体の兄弟4102.013（46歳で前立腺癌と診断）は、二人ともフレームシフトを
有していた。この血縁でさらに変異スクリーニングを行ったところ、彼らの母親
である4102.002がフレームシフトを保有していることが明らかとなった。さらに
、彼女の母方のおじである4102.053（75歳で前立腺癌と診断、そして76歳で死亡
）もまた、フレームシフトを有していた。
【０２１１】 フレームシフト1641insGは、547番目のアミノ酸のロイシンの後のHPC2の翻訳
をだめにする。HPC2タンパク質は、E. coliのelaCタンパク質と同じくらい進化
的に遠く離れた相同タンパク質と顕著な配列類似性を有し、そしてこの共通配列
類似領域はロイシン547の下流の180個より多くのアミノ酸のセグメントに亘るの
で、確かにフレームシフト1641insGはHPC2タンパク質の機能に対して有害なこと
であるかもしれない。
【０２１２】 フレームシフトHPC2 1641insGは血縁4102で３世代にわたり前立腺癌と共に分
離されているという知見、およびフレームシフトHPC2 1641insGがHPC2タンパク
質の機能に有害であるに違いないという共通配列類似性からの推論を共に考慮す
ると、HPC2遺伝子内の有害な生殖細胞系突然変異は前立腺癌に対する感受性の原
因であることを確証する。
【０２１３】 実施例６ ２ハイブリッド分析によるHPC2-相互作用タンパク質の同定 HPC2の全てまたは一部をコードするDNAフラグメントをpGBT.Cのごとき２ハイ
ブリッドDNA結合ドメインベクターに、HPC2のコード配列がGal4p DNA結合ドメイ
ンをコードする配列とインフレームにあるように連結する。HPC2のフラグメント
へのDNA結合ドメイン融合体をコードするプラスミドをJ692のごとき酵母レポー
ター株に、活性化ドメインに融合したcDNAのライブラリーとともに導入した。形
質転換体は、ロイシン、トリプトファンおよびヒスチジンを欠くが、25mM 3-ア
ミノ-1,2,4-トリアゾールを含有する酵母最終培地のごとき選択培地の20〜150mm
プレート上に広げた。１週間、30℃でインキュベートした後、β-ガラクトシダ
ーゼフィルターアッセイによりlacZレポーター遺伝子の発現について酵母コロニ
ーをアッセイした。ヒスチジン欠損下で増殖すること、そしてβ-ガラクトシダ
ーゼの産生に関して陽性であることの両方を満たすコロニーを、さらなる特徴付
けのために選択した。
【０２１４】 スマッシュアンドグラブ（smash-and-grab）法により活性化ドメインプラスミ
ドを陽性コロニーから精製した。これらのプラスミドをエレクトロポレーション
によりE. coli［例えば、DH10B (Gibco BRL)］に導入し、そしてアルカリ溶解法
によりE. coliから精製した。相互作用の特異性について試験するため、特定の
活性化ドメインプラスミドを種々のDNA結合ドメイン融合タンパク質（HPC2およ
びヒトラミンＣのセグメントに対する融合体を含む）をコードするプラスミドを
用いてJ692株に共トランスフェクトした。これらの実験からの形質転換体をHIS3
およびlacZレポーター遺伝子の発現についてアッセイする。Hs.HPC2構築物と共
にレポーター遺伝子を発現するが、ラミンＣ構築物と共には発現しない陽性体は
、正にHPC2相互作用タンパク質をコードする。これらのタンパク質を同定し、適
切な活性化ドメインプラスミドのインサートの配列分析により特徴付けを行った
。
【０２１５】 実施例７ヒトＨＰＣ２遺伝子オーソログの同定 現在地球上に生存している全ての種は、およそ３５億年から４０億年前に生存
していた単一の共通する祖先から進化したと考えられる。このことは、どの種と
どの種の一組を考えても、過去のある期間に生存していた共通する祖先となる種
を分かち合っていることを意味する。正直なところ、この見解は少しばかり単純
化されすぎている。なぜならば、たとえば、真核生物の核ゲノムとミトコンドリ
アゲノムは、独立した原核生物の祖先をもつと考えられるからである。ひとつの
祖先種から２つまたはそれ以上の現存する娘種への進化の過程において、祖先種
のゲノムに存在する遺伝子は、娘種のゲノムに存在する遺伝子へと進化する。独
立した個々の遺伝子は、ヌクレオチド置換、挿入、欠失、遺伝子重複、遺伝子変
換、側方伝達といったような異なる種々の組合せのプロセスを経て進化しうるの
で、娘種のゲノムに存在する遺伝子の進化の歴史は、とても複雑である。たとえ
そうでも、特に、種の対／組が、比較的新しい共通の祖先を共有する場合、また
は分析されている遺伝子が、最初に、遺伝子重複または遺伝子変換ではなくて、
核置換および／または小挿入および／または小欠失を経て進化した場合、関連す
る生物体内の関連する遺伝子の進化の歴史は、整理することができる場合が多い
。１つの種の１つの遺伝子ともう１つの種の１つの遺伝子が共通する祖先種の１
つの遺伝子から進化していることが分析上明らかである場合、これらの遺伝子を
オーソログと呼ぶ。 疾患関連ヒト遺伝子にオーソロガスな遺伝子の同一性に関する理解は、とても
有用であることが多い。
【０２１６】 実施例８ＨＰＣ２遺伝子の分析 以下の方法によって、ＨＰＣ２遺伝子の構造および機能を決定する。 生物学的実験 ＨＰＣ２ｃ ＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクターを構築し、遺
伝子に損傷をもつ適当な前立腺癌細胞にトランスフェクトさせる。野生型ＨＰＣ
２ ｃＤＮＡならびに変化したＨＰＣ２ ｃＤＮＡを利用する。変化したＨＰＣ２
ｃＤＮＡは、変化したＨＰＣ２対立遺伝子から得るか、または下記のようにして
も作製し得る。培養物（細胞形態、倍加時間、足場非依存性増殖など）および動
物（腫瘍形成性）における表現型の復帰変異を審査する。実験には、野生型と突
然変異型の遺伝子を用いる。
【０２１７】 分子遺伝学的実験 インビトロ突然変異誘発を行って、欠失突然変異体および
ミスセンス突然変異体を構築する（独立コドンにおける単一塩基対置換およびア
ラニン走査突然変異誘発による）。突然変異体を用いて生物学的、生化学的およ
び生物物理学的実験を行う。
【０２１８】 メカニズム実験 既知または未知のＤＮＡ配列に対するＨＰＣ２タンパク質の
結合能力を審査する。哺乳動物細胞における一過性リポーター発現システムによ
って、プロモーターをトランス活性化するその能力を分析する。粒子補足および
酵母２ハイブリッドシステムなどの慣例の手法を用いて、機能的パートナーを発
見および同定する。パートナーの性質および機能を特徴付けする。これらのパー
トナーが、次には、医薬発見のためのターゲットとなる。
【０２１９】 構造実験 大腸菌、酵母、昆虫および／または哺乳動物細胞において組換えタ
ンパク質を作成し、結晶学的およびＮＭＲ実験に用いる。該タンパク質の分子モ
デリングも利用する。これらの実験によって構造駆動医薬設計が促進される。
【０２２０】 実施例９ＨＰＣ２に対するポリクローナル抗体の生成 ＨＰＣ２をコーディング配列の断片を、大腸菌内で融合タンパク質として発現
させる。過剰発現したタンパク質をゲル溶離にて精製し、これを用いて、Harlow
およびLane（１９８８）に記載の手順と同様にして、ウサギおよびマウスを免疫
感作する。この手順によって、種々の他のタンパク質に対する抗体が生成される
ことがわかっている（Kraemerら（１９９３）などを参照）。 簡単に言えば、ＨＰＣ２コーディング配列のストレッチを、プラスミドＰＥＴ
５Ａ（Novagen，Inc.、マジソン、ＷＩ）において融合タンパク質としてクロー
ニングする。ＨＰＣ２が組込まれた配列は、配列番号１、３または２８またはそ
の一部を含むことができる。ＩＰＴＧで誘発した後、予測分子量をもつ融合タン
パク質の過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって確認する。電気溶離によって融合
タンパク質をゲルから精製する。Ｎ−末端におけるタンパク質の配列決定によっ
て、該タンパク質がＨＰＣ２融合産物であるという確認を行う。次に、ウサギに
おける免疫原として精製タンパク質を用いる。完全フロイントアジュバント中１
００μｇのタンパク質にて、ウサギを免疫感作し、完全フロイントアジュバント
中１００μｇの免疫原、次いで、ＰＢＳ中１００μｇの免疫原にて、３週間の間
隔で２回ブースター処置する。その２週間後に、抗体を含む血清を採集する。 この手順を繰り返して、ＨＰＣ２タンパク質の突然変異体に対する抗体を生成
することができる。これらの抗体は、野生型ＨＰＣ２に対すＲ抗体とともに、種
々の組織および生物学的流体における突然変異体の存在および相対濃度を検出す
るのに用いられる。
【０２２１】 実施例１０ＨＰＣ２に特異的なモノクローナル抗体の生成 以下のプロトコルに従って、モノクローナル抗体を生成する。グルタルアルデ
ヒドまたはＥＤＣを用い、常套の方法で、キーホールリンペットヘモシアニンに
コンジュゲートした完全なＨＰＣ２またはＨＰＣ２ペプチド（野生型または突然
変異体）を含む免疫原でマウスを免疫感作する。 免疫原をアジュバントと混合する。各マウスに、１０〜１００μｇの免疫原を
４回注射し、４回目の注射の後に、血液試料をマウスから採取し、血清が免疫原
に対する抗体を含んでいるかどうかを決定する。ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによっ
て血清力価を測定する。免疫原に対する抗体の存在を示す血清をもつマウスを選
び、ハイブリドーマ生成に用いる。
【０２２２】 免疫マウスから脾臓を取り出し、単細胞懸濁液を調製する（HarlowおよびLane
（１９８８）を参照）。本質的に、KohlerおよびMilstein（１９７５）の記載に
従って、細胞融合を行う。簡単に述べると、HarlowおよびLane（１９８８）の記
載に従って、ポリエチレングリコールを用い、Ｐ３．６５．３骨髄腫細胞（アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ）を免疫脾臓細
胞と融合させる。細胞を２×１０５個／ウエルの密度で９６ウエル組織培養プレ
ートに植える。個々のウエルについて増殖を審査し、増殖したウエルの上清にお
いて、野生型または突然変異ＨＰＣ２標的タンパク質を用いるＥＬＩＳＡまたは
ＲＩＡによって、ＨＰＣ２特異的抗体の存在をテストする。陽性のウエルをエキ
スパンジョンし、サブクローニングを行ってモノクローナル性を確立し、確認す
る。
【０２２３】 実施例１１ＨＰＣ２結合ペプチドの単離 化学薬品およびファージ提示ランダムペプチドライブラリーの両者から、以下
のようにして、ＨＰＣ２遺伝子に結合するペプチドを単離する。 大腸菌およびＳＦ９細胞において、ＨＰＣ２遺伝子産物のフラグメントを、Ｇ
ＳＴおよびＨｉｓ−タグ融合タンパク質として発現させる。グルタチオンマトリ
ックス（ＧＳＴ融合タンパク質に対する）またはニッケルキレートマトリックス
（Ｈｉｓ−タグ融合タンパク質に対する）のいずれかを用いて、融合タンパク質
を単離する。このターゲット融合タンパク質を、下記のように直接スクリーニン
グするか、またはグルタチオンもしくはイミジゾールで溶離する。グルタルアル
デヒドなどの共有結合試薬またはビオチン−アビジンなどの結合試薬を用い、タ
ーゲットタンパク質をポリスチレンなどの表面またはアガロースなどの樹脂また
は固相担体のいずれかに固定する。
【０２２４】 ２つのタイプの種々の長さのランダムペプチドライブラリーができる：誘導体
化された（リン酸化またはミリスチル化などによる）残基を含む合成ペプチドラ
イブラリーおよびリン酸化しうるファージ提示ペプチドライブラリー。種々の生
理学的緩衝液中、これらのライブラリーを、固定したＨＰＣ１遺伝子産物ととも
にインキュベートする。次に、繰り返し洗浄を行って、未結合のペプチドを除去
し、低または高ｐＨ、強変性剤、グルタチオンまたはイミジゾールなどの種々の
溶離試薬によって結合ペプチドを回収する。回収した合成ペプチド混合物を商業
的ペプチドマイクロ配列決定サービスに送り、エンリッチされた残基を同定する
。回収したファージを増幅し、再スクリーニングし、プラーク精製し、次いで配
列決定して、提示ペプチドの同一性を決定する。
【０２２５】 ＨＰＣ１結合ペプチドの使用： 上記スクリーニングから同定されたペプチド
を、商業的サービスにより、ビオチン複合体として大量に合成する。これらのペ
プチドを、ＨＰＣ１および酵母ツーハイブリッドスクリーンで同定されたその相
互作用パートナーとの固相および液相競合アッセイに用いる。膜透過性モチーフ
（Linら（１９９５）；Rojiasら（１９９６））に融合するこれらのペプチドの
バージョンを、化学的に合成し、培養細胞に加え、増殖、アポトーシス、分化、
コファクター応答および内部変化のアッセイに用いる。
【０２２６】 実施例１２ＨＰＣ２のサンドイッチアッセイ プレート、チューブ、ビーズまたは粒子などの固体表面にモノクローナル抗体
を結合させる。抗体が９６ウエルＥＬＩＳＡプレートのウエル表面に結合するの
が好ましい。ＨＰＣ２ペプチド／タンパク質（野生型または突然変異体）を含む
サンプル（血清、尿、組織細胞質など）１００μｌを固相抗体に加える。試料を
２時間室温にてインキュベートする。次に、試料流体をデカントし、固相を緩衝
液で洗浄して、未結合の物質を除去する。第２のモノクローナル抗体１００μｌ
（ＨＰＣ２／タンパク質上の異なる決定基のための）を固相に加える。抗体をデ
ィテクター分子（１２５−Ｉ、酵素、蛍光団または発色団など）で標識し、第２
抗体を含む固相を室温で２時間インキュベートする。第２抗体をデカントし、固
相を緩衝液で洗浄して、未結合物質を除去する。 サンプル中に存在するＨＰＣ２／タンパク質の量に比例する、結合した標識の
量を定量する。野生型ＨＰＣ２に特異的なモノクローナル抗体ならびにＨＰＣ２
において同定された突然変異体それぞれに特異的なモノクローナル抗体を用いて
別にアッセイを行う。
【０２２７】 実施例１３ＨＰＣ２と相互作用するタンパク質を同定するための２ハイブリッドアッセイ ＨＰＣ２のコーディング配列がＧＡＬ４ｐＤＮＡ結合ドメインとともにフレー
ム内になるように、全または部分ＨＰＣ２をコードする配列をｐＡＳ２−１にラ
イゲートする。このプラスミド構築物を酵母リポーター菌株Ｙ１９０に、形質転
換によって導入する。次いで、ヒト前立腺ｃＤＮＡ（Clontech）から調製した活
性化ドメイン融合プラスミドのライブラリーを、ｐＡＳ２−１−ベース融合構築
物をもつ菌株Ｙ１９０に導入する。ロイシン、トリプトファンおよびヒスチジン
欠乏、ならびに２５ｍＭの３−アミノ−１，２，４−トリアゾール含有酵母最小
培地の２０〜１５０ｍｍのプレートに形質転換物を蒔く。３０℃にて１週間イン
キュベートした後、lacＺリポーター遺伝子の発現について、β−ガラクトシダ
ーゼフィルターアッセイにより、酵母コロニーをアッセイする。ヒスチジン欠乏
下で成長し、β−ガラクトシダーゼの産生に対して陽性のコロニーを選び、次な
る特徴付けに用いる。
【０２２８】 スマッシュ−アンド−グラブ法によって、活性化ドメインプラスミドを陽性コ
ロニーから精製する。エレクトロポレーションによって、これらのプラスミドを
大腸菌ＤＨ５αに導入し、アルカリ溶菌法によって大腸菌から精製する。相互作
用の特異性をテストするために、特異的活性化ドメインプラスミドを、ＨＰＣ２
およびヒトラミンＣに対する融合タンパク質といったような種々のＤＮＡ結合ド
メイン融合タンパク質をコードするプラスミドとともに菌株Ｙ１９０に同時形質
転換する。これらの実験からの形質転換物を、ＨＩＳ３およびlacＺリポーター
遺伝子の発現について、アッセイする。ラミンＣ構築物ではなくてＨＰＣ２構築
物で遺伝子を発現するポジティブが、ＨＰＣ２相互作用タンパク質をコードする
ことは信頼に値することである。適当な活性化ドメインプラスミドの挿入物の配
列分析によって、これらのタンパク質を同定し、特徴付ける。 突然変異タンパク質のみと相互作用するタンパク質を同定するため、およびＨ
ＰＣ２タンパク質の突然変異体が、野生型ＨＰＣ２と相互作用することがわかっ
ているタンパク質と相互作用しうるか否かどうかを決定するために、ＨＰＣ２遺
伝子の突然変異体でこの手順を繰り返す。
【０２２９】 本発明の好ましい具体例を詳細に説明することによって本特許出願における本
発明を開示したが、本発明の請求の範囲および本発明の本質内における変更が、
当業者にとって容易に行い得るものであることを企図するものであるから、該開
示は、限定のためのものではなくむしろ説明のためのものであると意図すること
を理解すべきである。
【０２３０】文献のリスト Altschul SF, et al. (1990). J. Mol. Biol. 215: 403-410. Altschul SF, et al. (1997). Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Anand R (1992). Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academ
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【図面の間単な説明】
【図１】 図１は、第１７染色体ｐマーカーに対するＨＰＣ２前立腺癌感受性遺伝子座に
対する連鎖の示唆的証拠を示す４の血縁の多点連鎖解析である。
【図２Ａ−Ｂ】 図２Ａ−Ｂは、ＨＰＣ２付近の遺伝マーカーおよび組換え境界、ＨＰＣ２領域
にひろがるＢＡＣの概略マップ、ＨＰＣ２領域内の転写ユニットの概略マップ、
および、それに対してそれをマッピングするＢＡＣおよびお互いに対するＨＰＣ
２のエキソンの位置を示すＨＰＣ２転写ユニットの２の図の順序を示す図である
。
【図３】 図３は、ヒトＨＰＣ２遺伝子のエキソン１とマウスＨＰＣ２遺伝子のエキソン
１の配列のアライメントである。図は、ヒトＨＰＣ２遺伝子のエキソン１によっ
てコードされるペプチド配列とマウスＨＰＣ２遺伝子のエキソン１によってコー
ドされるペプチド配列のアライメントも示す。ヒトＤＮＡ配列は配列番号：２１
０であり；ヒト・アミノ酸配列は配列番号：２１１であり；マウスＤＮＡ配列は
配列番号：２１２であり；マウス・アミノ酸配列は配列番号：２３である。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１３年８月３０日（２００１．８．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 染色体１７ｑ連鎖−前立腺癌感受性遺伝子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 35/00 16/18 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 14/47 16/44 ４Ｃ０８６ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/44 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/577 Ａ 33/53 37/00 １０２ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ショーン・ブイ・タブティジアン アメリカ合衆国84103ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、イースト・ファースト・アベ ニュー557番 (72)発明者 デイビッド・エイチ・エフ・テン アメリカ合衆国84105ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、ブレーン・アベニュー1147番 (72)発明者 ジャック・シマール カナダ、ジー３エイ・１ゼット９、ケベッ ク、サン・オーギュスタン・ドゥ・デ・モ ール、デュ・ピレ4808番 (72)発明者 ジョハンナ・エム・ロメンズ カナダ、エム５ジー・２ジェイ９、オンタ リオ、トロント、ベイ・ストリート1501− 717番 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 BB20 CA02 CB01 CB07 CB09 CB11 CB21 CB26 CB30 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB04 FB07 JA20 4B024 AA01 AA12 BA36 CA03 CA09 FA10 HA14 HA17 4B063 QA01 QA08 QA18 QA19 QQ43 QQ58 QQ60 QR32 QR56 QR62 QR72 QS25 QS34 QX02 QX07 4B064 AG31 CA10 CA19 CA20 DA14 4B065 AA93Y AB01 BA01 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA13 AA17 BA01 CA53 CA56 CA59 MA52 MA66 NA14 ZB26 ZC78 4C085 AA13 AA14 AA26 BB11 CC04 CC13 DD22 EE01 4C086 AA01 AA04 EA16 MA52 MA66 NA14 ZB26 ZC78 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA41 CA44 DA76 DA86 EA51 EA54 FA74

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＰＣ２ポリペプチドをコードする単離された核酸であって
    、該ポリペプチドは配列番号：２に記載されたアミノ酸配列または機能的に同等
    である修飾された形態を含む該単離された核酸。
  2. 【請求項２】 該ＤＮＡが（ａ）配列番号：１に記載されたヌクレオチド配
    列、（ｂ）その相補体、（ｃ）対応するＲＮＡまたは（ｄ）ストリンジェント条
    件下で、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする
    ヌクレオチド配列を有する請求項１記載の単離された核酸。
  3. 【請求項３】 該ＤＮＡが配列番号：３に記載されたヌクレオチド配列、配
    列番号：２８に記載されたヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を有する請
    求項１記載の単離された核酸。
  4. 【請求項４】 配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列の対立遺伝子変
    種を含むＤＮＡ、その相補体または対応するＲＮＡである請求項１記載の単離さ
    れた核酸。
  5. 【請求項５】 配列番号：２に記載されたＨＰＣ２ポリペプチドの突然変異
    形態をコードする請求項１記載の単離された核酸。
  6. 【請求項６】 配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列の突然変異形態
    を含むＤＮＡ、その相補体または対応するＲＮＡである請求項５記載の単離され
    た核酸。
  7. 【請求項７】 該突然変異が欠失突然変異、ナンセンス突然変異、挿入突然
    変異、フレームシフト突然変異およびミスセンス突然変異よりなる群から選択さ
    れる請求項６記載の単離された核酸。
  8. 【請求項８】 （ａ）配列番号：４−２７、（ｂ）その相補体、（ｃ）それ
    に対応するＲＮＡおよび（ｄ）ストリンジェント条件下で（ａ）、（ｂ）または
    （ｃ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸よりなる群から選択される
    ヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
  9. 【請求項９】 核酸配列が試料中の（ｉ）配列番号：１に記載されたヌクレ
    オチド配列、その対立遺伝子変種およびその突然変異形態から選択されるヌクレ
    オチド配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）該ＤＮＡに対応するＲＮＡまたは（ｉｉｉ
    ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列にハイ
    ブリダイズするヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーションプロ
    ーブとして使用するのに適した請求項１ないし８いずれか１記載の核酸の少なく
    とも１５の隣接ヌクレオチドを有する単離された核酸。
  10. 【請求項１０】 当該核酸プローブの各々が請求項１ないし８いずれか１記
    載の核酸の少なくとも８つの隣接ヌクレオチドを含み、当該組が該核酸の一部ま
    たは全てを含むことを特徴とするマイクロチップアッセイで使用される核酸プロ
    ーブの組。
  11. 【請求項１１】 請求項１ないし１０いずれか１記載の単離された核酸を含
    むベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１ないし１０いずれか１記載の単離された核酸を含
    む発現ベクターであって、ここにＨＰＣ２ポリペプチドまたはその修飾形態につ
    いてのコーディング配列が、該ベクターに対する宿主細胞における該コーディン
    グ配列の発現を指令できる適当な制御配列に作動可能に連結していることを特徴
    とする該発現ベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項１１または１２記載のベクターで形質転換された宿
    主細胞。
  14. 【請求項１４】 （ｉ）ＨＰＣ２ポリペプチドの生産に適した条件下で該ポ
    リペプチドをコードする発現ベクターを含有する請求項１３記載の宿主細胞を培
    養し、次いで、（ｉｉ）該ポリペプチドを回収することを特徴とする、請求項１
    記載の配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有するＨＰＣ２ポリペプチドま
    たは該ポリペプチドの修飾形態であるポリペプチドの生産方法。
  15. 【請求項１５】 さらに、回収されたポリペプチドを標識することを特徴と
    する請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 他のヒトタンパク質を実質的に含まないヒトＨＰＣ２ポリ
    ペプチドの調製物であって、該ポリペプチドが配列番号：２に記載されたアミノ
    酸配列を有する該調製物。
  17. 【請求項１７】 他のヒトタンパク質を実質的に含まないヒトＨＰＣ２の調
    製物であって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号：２に記載されたアミ
    ノ酸配列を有する野生型ＨＰＣ２ポリペプチドと実質的配列相同性を有し，該ポ
    リペプチドが野生型ＨＰＣ２ポリペプチドと実質的に同様の機能を有する該調製
    物。
  18. 【請求項１８】 他のタンパク質を実質的に含まないポリペプチドの調製物
    であって、該ポリペプチドが配列番号：２に記載された核酸配列の突然変異形態
    の発言によって得ることができる突然変異ヒトＨＰＣ２ポリペプチドである該調
    製物。
  19. 【請求項１９】 該ポリペプチドが標識されている請求項１６ないし１８い
    ずれか１記載の調製物。
  20. 【請求項２０】 請求項１６ないし１８いずれか１記載の１以上のポリペプ
    チドに特異的に結合できる抗体。
  21. 【請求項２１】 請求項２０記載の抗体を得るために免疫原として使用する
    のに適した請求項１６ないし１８いずれか１記載のポリペプチドの抗原性断片。
  22. 【請求項２２】 融合タンパク質の形態である請求項１６ないし１８および
    ２１いずれか１記載のポリペプチド。
  23. 【請求項２３】 請求項１６ないし１８、２１および２２いずれか１記載の
    ポリペプチドの、抗体生産用の免疫原としての使用。
  24. 【請求項２４】 １以上の抗体産物が引き続いて標識されるか、あるいは固
    体支持体に結合される請求項２３記載の使用。
  25. 【請求項２５】 核酸増幅反応によるＨＰＣ２遺伝子のヌクレオチド配列の
    決定用の一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、該プライマーの配
    列がＨＰＣ２についてのゲノミッククローンに由来し、核酸増幅反応における該
    プライマーの使用の結果、ＨＰＣ２遺伝子の配列の全てまたは一部に対応するＤ
    ＮＡまたはＲＮＡが合成されることを特徴とする該対。
  26. 【請求項２６】 配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列を有するＨＰ
    Ｃ２遺伝子、その対立遺伝子変種または突然変異形態の配列の全てまたは一部を
    決定するための請求項２５記載のプライマーの対。
  27. 【請求項２７】 疑われる突然変異体ＨＰＣ２対立遺伝子のヌクレオチド配
    列を野生型ＨＰＣ２ヌクレオチド配列と比較することを含み、ここに、疑われる
    突然変異体および野生型配列の間の差異が突然変異体ＨＰＣ２ヌクレオチド配列
    を同定することを特徴とする疑われる突然変異体ＨＰＣ２対立遺伝子中の突然変
    異体ＨＰＣ２ヌクレオチド配列を同定する方法。
  28. 【請求項２８】 当該変化がヒトにおける癌と関連し、ここに、もし該変化
    が生殖系におけるものであれば、それは該癌に対する素因と関連付けられ、もし
    該変化が体細胞組織におけるものであれば、それは該体細胞組織が癌性であるこ
    とを示すＨＰＣ２における変化を検出する方法であって、該方法が該ヒトの組織
    からのＨＰＣ２遺伝子またはＨＰＣ２遺伝子発現産物を分析することを特徴とす
    る該方法。
  29. 【請求項２９】 該試料中のＨＰＣ２遺伝子の配列が、配列番号：１に記載
    された配列およびその野生型対立遺伝子変種から選択される１以上の野生型ＨＣ
    Ｐ２遺伝子配列の配列と比較される請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 該発現産物がＨＰＣ２遺伝子のｍＲＮＡおよびＨＰＣ２遺
    伝子によってコードされるＨＰＣ２ポリペプチドよりなる群から選択される請求
    項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 以下の手順： （ａ）非変性ポリアクリルアミドゲル上での該試料からの一本鎖ＤＮＡの電気
    泳動移動度のシフトを観察すること； （ｂ）当該プローブの当該遺伝子へのハイブリダイゼーションに適した条件下
    で、ＨＰＣ２遺伝子プローブを該試料から単離されたゲノムＤＮＡにハイブリダ
    イズさせること； （ｃ）対立遺伝子−特異的プローブの該試料からのゲノムＤＮＡのハイブリダ
    イゼーションを測定すること； （ｄ）該試料からのＨＰＣ２遺伝子の全てまたは一部を増幅して増幅された配
    列が得られ、該増幅された配列を配列決定すること； （ｅ）該試料中の特異的ＨＰＣ２突然変異体対立遺伝子の存在を核酸増幅によ
    って測定すること； （ｆ）該試料からのＨＰＣ２遺伝子の全てまたは一部を分子クローニングして
    クローン化された配列が得られ、該クローン化配列を配列決定すること； （ｇ）分子（１）該試料から単離されたＨＰＣ２遺伝子ゲノムＤＮＡまたはＨ
    ＰＣ２ ｍＲＮＡおよび（２）ヒト野生型ＨＰＣ２遺伝子ＤＮＡに相補的な核酸
    プローブを相互にハイブリダイズさせてデュプレックスが形成される場合に、分
    子（１）および（２）の間にミスマッチがあるか否かを測定すること； （ｈ）該試料中のＨＰＣ２遺伝子配列を増幅し、次いで、野生型ＨＰＣ２遺伝
    子配列を含む核酸プローブに該増幅された配列をハイブリダイズさせること； （ｉ）該組織中のＨＰＣ２遺伝子配列を増幅し、次いで、突然変異体ＨＰＣ２
    遺伝子配列を含む核酸プローブに該増幅された配列をハイブリダイスさせること
    ； （ｊ）欠失突然変異につきスクリーニングすること； （ｋ）点突然変異につきスクリーニングすること； （ｌ）挿入突然変異につきスクリーニングすること； （ｍ）該試料中のＨＰＣ２遺伝子と、ＨＰＣ２遺伝子配列または突然変異体Ｈ
    ＰＣ２遺伝子配列を含む１以上の核酸プローブとのイン・サイチュハイブリダイ
    ゼーションを測定すること； （ｎ）イムノブロッティングすること； （ｏ）免疫細胞化学を行うこと； （ｐ）該組織から単離されたＨＰＣ２タンパク質と、ＨＰＣ２突然変異体対立
    遺伝子のポリペプチド発現産物と特異的に結合できる結合パートナーおよび／ま
    たは配列番号：３に記載されたアミノ酸配列を有するＨＰＣ２ポリペプチドに対
    する結合パートナーとの間の結合相互作用をアッセイすること；および （ｑ）該結合パートナーの生化学活性の阻害につきアッセイすること； のうちの１以上を行う請求項２８ないし３０いずれか１記載の方法。
  32. 【請求項３２】 そのゲノム中に変化したＨＰＣ２対立遺伝子を運ぶ非ヒト
    動物。
  33. 【請求項３３】 その天然ＨＰＣ２対立遺伝子が第２の動物からのＨＰＣ２
    対立遺伝子によって置き換えられている非ヒト動物。
  34. 【請求項３４】 その天然ＨＰＣ２対立遺伝子が破壊されているかまたは欠
    失されている非ヒト動物。
  35. 【請求項３５】 その天然ＨＰＣ２対立遺伝子の一方または双方が（ａ)該
    対立遺伝子を条件によってはノックアウトするＤＮＡ系を含有するように修飾さ
    れているか、あるいは（ｂ）該対立遺伝子を条件によってはノックアウトするＤ
    ＮＡ系を含有するように修飾された第２の動物からのＨＰＣ２対立遺伝子によっ
    て置き換えられている非ヒト動物。
  36. 【請求項３６】 請求項３２ないし３５いずれか１記載の非ヒト動物から単
    離された細胞系。
  37. 【請求項３７】 野生型ＨＰＣ２がそれとで複合体を形成する野生型結合パ
    ートナーとで複合体を形成できない単離された突然変異体ＨＰＣ２。
  38. 【請求項３８】 ＨＰＣ２およびその結合パートナーを含む単離されたタン
    パク質複合体。
  39. 【請求項３９】 ＨＰＣ２の断片およびその結合パートナーの断片を含むタ
    ンパク質複合体。
  40. 【請求項４０】 請求項３８または３９記載のタンパク質複合体と免疫反応
    性である単離された抗体。
  41. 【請求項４１】 該抗体が純粋なＨＰＣ２または純粋なＨＰＣ２−結合パー
    トナーと免疫反応性でない請求項４０記載の抗体。
  42. 【請求項４２】 該抗体がモノクローナル抗体である請求項４０または４１
    記載の抗体。
  43. 【請求項４３】 野生型ＨＰＣ２遺伝子機能または該野生型機能と実質的に
    同様のＨＰＣ２機能を、該遺伝子機能を喪失しているかあるいは該ＨＰＣ２遺伝
    子中の突然変異により変化した遺伝子機能を有する細胞に供給する方法であって
    、該細胞中にＨＰＣ２機能を回復する核酸を該細胞に導入することを含み、該核
    酸が該細胞中で発現されるように、該核酸が野生型ＨＰＣ２遺伝子核酸または該
    野生型ＨＰＣ２遺伝子核酸と実質的に相同な核酸よりなる群から選択されること
    を特徴とする該方法。
  44. 【請求項４４】 該核酸が野生型ＨＰＣ２遺伝子の一部であり、該一部が、
    生物学的に機能性である該野生型遺伝子ポリペプチドの一部をコードする請求項
    ４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 野生型ＨＰＣ２遺伝子機能または野生型と実質的に同様の
    ＨＰＣ２機能を、該遺伝子機能を喪失しているかあるいは該ＨＰＣ２遺伝子中の
    突然変異により変化した遺伝子機能を有する細胞に供給する方法であって、該細
    胞中にＨＰＣ２機能を回復する分子を該細胞に導入することを含み、該分子が生
    物学的に機能性である野生型ＨＰＣ２ポリペプチドの全てまたは一部、該野生型
    ＨＰＣ２ポリペプチドに実質的に相同なポリペプチドおよび該野生型ＨＰＣ２ポ
    リペプチドの機能を模倣する分子よりなる群から選択される該方法。
  46. 【請求項４６】 野生型ＨＰＣ２が結合する結合パートナーとで複合体を形
    成する該ヒトからのＨＰＣ２またはＨＰＣ２の断片の能力につきアッセイするこ
    とを含み、ここに、該複合体を形成できないことは癌に対する素因の指標である
    ことを特徴とするヒトにおいて癌に対する素因を診断する方法。
  47. 【請求項４７】 該アッセイが酵母２−ハイブリッドアッセイを含む請求項
    ４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 該アッセイが、該結合パートナーおよび該ヒトから精製さ
    れたＨＰＣ２を混合することによって形成された複合体をイン・ビトロで測定す
    ることを含む請求項４６記載の方法。
  49. 【請求項４９】 該アッセイが、ＨＰＣ２および該ヒトから精製された該結
    合パートナーを混合することによって形成された複合体をイン・ビトロで測定す
    ることを含む請求項４６記載の方法。
  50. 【請求項５０】 該複合体が、ＨＰＣ２−該結合パートナーの複合体に特異
    的な抗体との結合によって測定される請求項４６記載の方法。
  51. 【請求項５１】 該アッセイが、ＨＰＣ２−該結合パートナーの複合体に特
    異的な抗体を、該個人からの組織抽出物と混合することを含み、ここに、該抗体
    および該組織抽出物の間のＨＰＣ２−該結合パートナー−抗体の複合体の形成の
    欠如が癌に対する素因の指標である請求項４６記載の方法。
  52. 【請求項５２】 ＨＰＣ２中の突然変異が癌に対する素因であるか否かを測
    定する方法であって、野生型ＨＰＣ２が結合する結合パートナーに、該突然変異
    を持つＨＰＣ２を結合させ、次いで、複合体が形成されるか否かを測定すること
    を含み、ここに、複合体の欠如が該突然変異が素因であることを示すことを特徴
    とする該方法。
  53. 【請求項５３】 ＨＰＣ２中の突然変異に由来する癌を治療するのに有用な
    薬物候補をスクリーニングする方法であって、薬物の存在下および該薬物の不存
    在下の双方において、野生型ＨＰＣ２が結合する野生型結合パートナーと突然変
    異体ＨＰＣ２とを混合し、次いで、該突然変異体ＨＰＣ２と該野生型結合パート
    ナーとの結合の量を測定することを含み、ここに、もし該結合の量が該薬物の不
    存在下におけるよりも該薬剤の存在下でより大きければ、該薬物は該癌の治療用
    の薬物候補であることを特徴とする該方法。
  54. 【請求項５４】 該突然変異体ＨＰＣ２が融合タンパク質であり、および／
    または該野生型タンパク質が融合タンパク質である請求項５３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 ＨＰＣ２中の突然変異に由来する癌を治療するのに有用な
    薬物候補をスクリーニングする方法であって、薬物の存在下および該薬物の不存
    在下双方において、野生型ＨＰＣ２が結合する野生型結合パートナーと突然変異
    体ＨＰＣ２とを混合し、次いで、該突然変異体ＨＰＣ２と該野生型結合パートナ
    ーとの結合の量を測定することを含み、ここに、もし該結合の量が該薬物の不存
    在下におけるよりも該薬物の存在下において小さいならば、該薬物は該癌を治療
    するための薬物候補であることを特徴とする該方法。
  56. 【請求項５６】 該野生型ＨＰＣ２が融合タンパク質であり、および／また
    は該野生型結合パートナーが融合タンパク質である請求項５５記載の方法。
  57. 【請求項５７】 ＨＰＣ２中の突然変異に由来する癌を治療するのに有用な
    薬物候補をスクリーニングする方法であって、該突然変異を含むＨＰＣ２につき
    ホモ接合である動物を薬物で治療することを含み、もし該動物が癌を発生しなけ
    れば、該薬物は該癌を治療するための薬物候補であることを特徴とする該方法。
  58. 【請求項５８】 ＨＰＣ２中の突然変異に由来する癌を治療するのに有用な
    薬物候補をスクリーニングする方法であって、腫瘍を有し、かつ該突然変異を含
    むＨＰＣ２につきホモ接合である動物を薬物で治療することを含み、ここにもし
    該腫瘍が退行すれば、該薬物は該癌を治療するための薬物候補であることを特徴
    とする該方法。
  59. 【請求項５９】 該動物が該突然変異にてＨＰＣ２につきトランスジェニッ
    クである請求項５７または５８記載の方法。
  60. 【請求項６０】 （ａ）薬物の存在下で、突然変異を含むＨＰＣ２につきホ
    モ接合である細胞の細胞培養を増殖させ、 （ｂ）野生型ＨＰＣ２遺伝子を含有する細胞の細胞培養を増殖させ、次いで、 （ｃ）薬物の不存在下で、突然変異を含有するＨＰＣ２につきホモ接合である
    細胞の細胞培養を増殖させる； 工程を含み、 ここに、もし工程（ａ）における細胞が工程（ｃ）における細胞よりも工程（
    ｂ）における細胞により似た挙動をすれば、該薬物は該癌を治療するための薬物
    候補であることを特徴とする該方法。
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