JP2002529050A

JP2002529050A - 弁別的に発現されたｍＲＮＡの同時同定および相対濃度測定のための方法

Info

Publication number: JP2002529050A
Application number: JP2000556999A
Authority: JP
Inventors: ジェイグレゴーサトクリッフ; マークジーエアランダー; カルルヴェーハーゼル
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2002-09-10
Also published as: US6110680A; EP1092045A1; MXPA00012758A; NO20006703L; WO2000000646A9; CA2333254A1; EP1092045A4; AU4852199A; WO2000000646A1; NO20006703D0; US6596484B1

Abstract

(57)【要約】ｍＲＮＡ集団中のｍＲＮＡの配列特異的同時同定のための改良方法によって、組織で発現されるほとんど全てのｍＲＮＡがゲル上の個別のバンドとして可視化され、ゲル上のバンドの濃度はｍＲＮＡの濃度に概ね一致する。一般に、本方法は、３−末端部を固定するためにアンカープライマーを用いるｃＤＮＡの生成、その後のＲＮＡ合成のためにバクテリオファージ特異的プロモーターを含むベクターで前記ｃＤＮＡからクローン化挿入物を生成、前記クローン化挿入物の直線化フラグメントの作製、ｃＲＮＡの調製、プライマーセットを用いて前記ｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写、および３’−プライマーを用いてＰＣＲの実施を含むが、前記３’−ＰＣＲプライマーの配列は前記ベクターおよび５’−ＰＣＲプライマーセットに由来し、５−ＰＣＲプライマーセットはｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写に用いたプライマーに由来する。本方法によって、薬剤の投与に伴うｍＲＮＡ発現の変化、または生理学的もしくは病理学的状態に付随するｍＲＮＡ発現の変化を特定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、弁別的に発現されたｍＲＮＡを同時に同定し、さらにそれらの相濃
度を測定する方法を目的とする。

【０００２】従来技術生化学研究の最終ゴールは、生物体を構成している蛋白質分子の完全な性状決
定であろう。これには、それら蛋白質分子の同定、配列決定、それらの解剖学的
発現部位の開示、それらの生化学的活性の解明、およびこれらの活性が生物体の
生理をどのように決定するかについての理解が含まれる。医療に応用するために
は、各蛋白質の濃度が医薬または毒性物質に反応してどのように変化するかにつ
いての情報も含まれる。

【０００３】問題の範囲を考えてみよう：どれぐらいの数の遺伝子が存在するのか。哺乳類
ではどれぐらいの数の遺伝子が発現されているのかという問題は、少なくとも２
０年間の研究を経て未だに解決されていない。異なる組織での遺伝子発現パター
ンを目的とした直接的な研究はほとんど存在しない。変異負荷実験（J.O. Bisho
p, "The Gene Numbers Game", Cell 2:81-86(1974); T. Ohta & M. Kimura, "Fu
nctional Organization of Genetic Material as a Product of Molecular Evol
ution", Nature 223:118-119(1971)）では、３ｘ１０⁴から１０⁵の必須の遺伝子
が存在すると提唱された。

【０００４】ｃＤＮＡクローニング技術が出現する前には、遺伝子発現に関する情報は、Ｒ
ＮＡコンプレキシティー実験、すなわち、豊富さに関して異なる特性をもつＲＮ
Ａ分子の混合集団の観察を基にしたアナログ測定（仕分けしない集団の測定）か
ら得られた。初期のアナログコンプレキシティー実験は、そのＲＮＡ集団のほと
んどを構成している各組織中の分子はそのコンプレキシティー全体の小さな部分
しか構成していないという事実の隠蔽された複雑さによって予想の程度を越えて
歪められた。後に、ｃＤＮＡクローニングによって、デジタル測定（すなわち個
々の種についての配列特異的測定）が可能になり、したがって、より最近のｍＲ
ＮＡ発現に関する考えは個々のＲＮＡ種の実際の観察を基にしている。

【０００５】脳、肝および腎は、アナログＲＮＡコンプレキシティー測定によって最も広範
囲に調べられた哺乳類組織である。コンプレキシティーの最小概算値はHastie &
Bishop(N.D. Hastie & J.B. Bishop, " The Expression of Three Abundance C
lasses of Messeger RNA in Mouse Tissues", Cell 9:761-774(1976)）のそれで
、彼らは、３ｘ１０⁹塩基対のゲッ歯類ゲノムの２６ｘ１０⁶ヌクレオチドが脳で
、２３ｘ１０⁶が肝で、さらに２２ｘ１０⁶が腎で発現され、ＲＮＡセットはほぼ
完全に重複していると提唱した。これは、組織特異的ｍＲＮＡの数はきわめてわ
ずかであることを示している。しかしながら、これらの値は明らかに過少評価で
あることは経験によって示された。なぜならば、多くのｍＲＮＡ分子（これらは
、おそらく初期のこの実験では検出限界以下の量である）が脳で発現されている
が、肝または腎では検出できないことが示されたからである。他の多くの研究者
（J.A. Bantle & W.E. Hahn, "Complexity and Characterization of Polyadeny
lated RNA in the Mouse Brain", Cell 8:139-150(1976); D.M. Chikaraishi, "
Complexity of Cytoplasmic Polyadenylated and Non-Adenylated Rat Brain Ri
bonucleic Acids", Biochemstry 18:3249-3235(1979)）の測定では、アナログコ
ンプレキシティーは脳で１００−２００ｘ１０⁶ヌクレオチドで、肝および腎の
概算値は２から３倍低かった。脳のｍＲＮＡのうちで５０−６５％は肝でも腎で
も検出されない。これらの数値はデジタルクローニング実験により支持された（
R.J. Milner & J.G. Sutcliffe, "Gene Expression in Rat Brain", Nuc. Acids
Res. 11: 5497-5520(1983))。

【０００６】仕分けされていないｍＲＮＡのアナログ測定で、ｍＲＮＡの平均の長さは１４
００−１９００ヌクレオチドであると提唱された。ノザンブロッティングによっ
てＲＮＡサイズを測定するために、任意に選択した２００の脳のｃＤＮＡを用い
て脳のｍＲＮＡの長さを系統的にデジタル分析したところ（Milner & Sutcliffe
, 上掲書）、ｍＲＮＡサイズデータをＲＮＡの豊富さで調整したとき、平均長は
１７９０ヌクレオチドとなり、アナログ測定で得られたものと同じであった。し
かしながら、脳のｍＲＮＡコンプレキシティーの大半を構成しているｍＲＮＡの
平均長は５０００ヌクレオチドであった。数がより少ない脳のＲＮＡの方が長い
だけでなく、それらは脳に特異的な傾向があり、一方、より豊富な脳のｍＲＮＡ
はより普遍的に発現され、平均して長さはより短かった。

【０００７】ｍＲＮＡの長さについてのこれらの考え方は、配列が決定された脳のｍＲＮＡ
の長さからつい最近確認された（J.G. Sutcliffe, "mRNA in the Mammalian Cen
tral Nervous System", Annu. Rev. Neurosci. 11:157-198(1988))。したがって
、１−２ｘ１０⁸のヌクレオチドコンプレキシティーおよび５０００ヌクレオチ
ドの平均ｍＲＮＡ長では脳で発現されるｍＲＮＡは３００００と概算され、その
約２／３は肝または腎で検出されない。脳は、明らかに哺乳類の組織特異的遺伝
子の大部分の原因である。ほとんどの脳ｍＲＮＡは低濃度で発現される。完全な
哺乳動物ｍＲＮＡコンプレキシティ−の測定は存在しないし、非神経組織の場合
、５０００ヌクレオチドがｍＲＮＡ長の正しい概数であるのかも分からない。全
遺伝子数の合理的な概数は５００００から１０００００の間かもしれない。

【０００８】生理学的機能を化学的に理解することによって前進するために最も必要なこと
は、ゲノムによってコードされる蛋白質およびその各々が発現される細胞タイプ
のメニューである。現在のところ、蛋白質配列の信頼できる推定は、ゲノム配列
中の介在配列（イントロン）の存在のためにｃＤＮＡのみから得られ、遺伝子か
らは得られない。哺乳類ゲノムの完全なヌクレオチド配列でさえ、その発現され
た配列の性状決定の代用にはならないであろう。したがって、転写された配列を
収集し、さらにそれらの発現部位を明らかにするという系統的な戦略が必要とさ
れている。そのような戦略は、脳内で弁別的に発現される配列の決定に極めて有
用であろう。終結に到達すること、すなわち全てのｍＲＮＡを同定することは、
必ずしもそのような研究の最終ゴールということではない。多くの異なる組織で
発現される個々のｍＲＮＡの数が豊富なことおよび種々のｍＲＮＡの量が異なる
ために、終結の達成は困難である。達成しようと努めることによって、遺伝子空
間の大きさについてより信頼できる説明が徐々に得られるであろう。

【０００９】クレーグ＝ベンター(Craig Venter)の研究室で行われた研究によって、ヒトの
脳のｍＲＮＡの任意に選択されたｃＤＮＡクローンの単離、それらの３'末端の
短いシングルパス配列（約３００塩基対）の決定、および"発現配列タグ"のデー
タベースとしてこれらのうちほぼ２５００の編集が達成された(M.D. Adams et a
l., "Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Gen
ome Project", Science 252:1651-1656(1991); M.D. Adams et al., "Sequence
Identification of 2375 Human Brain Genes", Nature 355:632-634(1992))。こ
のデータベースは有用であるが、弁別的な発現については全く情報を提供できな
い。したがって、単一の組織内でのそれらの単純な発現ではなく、脳の領域およ
び他の組織内でのそれらの全体的発現パターン、並びに多様な基準、例えば種々
の生理学的もしくは病理学的状態または薬剤治療の効果に対する全体的な発現パ
ターンに基づいて遺伝子を認識することができるということが重要である。

【００１０】他の研究は、データベース確立のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利
用に集中している。ウィリアムズら（J.G.K. Williamset al., "DNA Polymorphi
sms Amplified by Arbitrary Primers Are Useful as Genetic Markers", Nucl.
Acids Res. 18:6531-6535(1990)）およびウェルシュとマックリーランド(J. We
lsh & McClelland, "Genomic Fingerprinting Using Arbitrary Primed PCR and
a Matrix of Pairwise Combinations of Primers", Nucl. Acids Res. 18:7213
-7218(1990))は、任意に選択した配列の一本鎖１０量体プライマー（すなわちい
つでも入手可能な任意の１０量体プライマー）は、複雑なＤＮＡ鋳型（例えばヒ
ト、植物、酵母、または細菌のゲノムＤＮＡ）とともにＰＣＲに用いた場合、一
連のＰＣＲ生成物を生じることを示した。

【００１１】プライミング事象では、プライマーと鋳型ＤＮＡとの間の不完全な相補性形成
が必要とされることが明らかにされた。おそらく、部分的に適合していないプラ
イマー結合部位がゲノム全体にランダムに分布しているのであろう。稀には、反
対方向にあるこれらの部位の２つが、ＰＣＲ生成物バンドを生じるために十分に
近接していた。平均して８−１０生成物が存在し、これらはサイズが約０．４か
ら約４ｋｂで、各プライマーについて異なる移動度を有していた。一連のＰＣＲ
生成物は、同じ種の中で個々に違いを示していた。前述の著者らは、任意の一本
鎖プライマーを用いて、遺伝子研究のために制限フラグメント長についての多形
性（ＲＦＬＰ）様情報を得ることができると提唱した。他の研究者らはこの技術
を応用した（S.R. Woodward et al., "Random Sequence Pligomucleotide Prime
rs Detect Polymorphic DNA Products Which Segregate in Inbred Strains of
Mice", Mamm. Genome 3:73-78(1992); J.H. Nadeau et al., "Multilocus Marke
rs for Mouse Genom Analysis; PCR Amplification Based on Single Primers o
f Arbitrary Nucleotide Sequence", Mamm. Genome 3:55-64(1992)）。

【００１２】２つのグループ（J. Welsh et al., "Arbitrarily Primed PCR Fingerprintin
g of RNA", NUcl. Acids Res. 20:4965-4970(1992); P. Liang & A.B. Pardee,
"Differential Display of Eukaryotic Messenger RNA by Means of the Polyme
rase Chain Reaction", Science 257:967-971(1992))は、ｍＲＮＡ集団を比較す
る方法を利用した。リアングとパーディー（Liang & Pardee）の実験では、この
方法（ｍＲＮＡ弁別ディスプレーと称される）を用いて、２つの関連する細胞型
（正常および腫瘍形成性マウスＡ３１細胞）によって発現されるｍＲＮＡ集団を
比較した。各実験について、かれらは、５'プライマーとして１つの任意の１０
量体、および３'アンカープライマーとしてポリ（Ａ）テールのサブセットに対
して相補的なオリゴヌクレオチドを用い、これら２つの細胞型から調製したｃＤ
ＮＡを使用して³⁵Ｓ−ｄＮＴＰの存在下でＰＣＲ増幅を実施した。生成物をシー
クェンシングゲルで解析し、１００−５００ヌクレオチドの範囲の５０−１００
バンドを調べた。

【００１３】これらのバンドはおそらく、ゲノムＤＮＡ鋳型で観察されたように３'アンカ
ープライマーの相補物および部分的にミスマッチの５'プライマー部位を含むｍ
ＲＮＡの３'末端に対応するｃＤＮＡの増幅から生成された。各プライマーペア
について、２つのｃＤＮＡから増幅されたバンドのパターンは同様で、区別しえ
ないバンドの約８０％の量を有していた。バンドのいくつかはＰＣＲサンプルの
それぞれでより濃く、いくつかは２つのサンプルの一方でのみ検出された。

【００１４】更なる実験では（P. Liang et al., "Distribution and Cloning of Eukaryot
ic mRNAs by Means of Differential Display: Refinements and Optimization"
, Nucl. Acids Res. 21:3296-3275(1993))、この方法は低い濃度の投入ＲＮＡで
も機能し（ただし稀な種では定量的ではない）、特異性はもっぱら３'アンカー
プライマーの最後のヌクレオチドに存在することが示された。弁別的に同定され
た検出ＰＣＲ生成物の少なくとも１／３は、弁別的に発現されたＲＮＡに対応し
、偽陽性率は少なくとも２５％である。

【００１５】哺乳類の５００００から１０００００のｍＲＮＡの全てがこの任意プライマー
ＰＣＲアプローチでアクセス可能であるとすると、約８０−９５の５'任意プラ
イマーおよび１２の３'アンカープライマーが、ポアソン分布によって計算され
る同様なものを得るために約１０００ＰＣＲパネルおよびゲルで必要とされるで
あろう（これらのｍＲＮＡの約２／３が同定されるであろう）。

【００１６】以下の理由のために全てのｍＲＮＡがこの方法による検出に馴染むとは考えに
くい。そのような調査でｍＲＮＡを明るみに出すためには、そのｍＲＮＡは、オ
ートラジオグラフ上でシグナルを発生させるために十分に大量で、さらにミスマ
ッチのプライマーの結合およびプライミングのための部位として機能することが
できる５００ヌクレオチドをその３'に含んでいなければならない。個々のｍＲ
ＮＡ種が豊富であればあるほど、より多くの生成物を生じるであろう。したがっ
て、豊富な種は多くの異なる任意のプライマーでバンドを生じることができる。
この後者の特性は、任意のプライマーの選択による機会の予想不能の要素を含む
ことになると思われるので、この任意のプライマーによる方法によって答えを得
ることは困難であろう。さらにまた、ある研究室から別の研究室に移すことが可
能で、また信頼に足る情報であるためには、このミスマッチプライミングは、異
なるＰＣＲ機を用いて異なる研究室の条件下で高い再現性を有する必要がある。
ミスマッチプライミングの原理はほとんど判明していないので、これは、リアン
グとパーディー（Liang & Pardee）の弁別的表示法によって得られるデータから
データベースを構築する場合の欠点である。

【００１７】したがって、５'末端の生成における不確かな局面を減少させ、異なる設定で
完全に再現可能な、ｍＲＮＡ種の弁別的ディスプレーの改良方法が必要とされて
いる。好ましくは、そのような方法は、潜在的に再現性を損なうミスマッチプラ
イミングに依存しない。好ましくは、そのような方法は、完璧な調査に必要なＰ
ＣＲパネルとゲル数を少なくし、二本鎖配列データを迅速に蓄積できる。好まし
くは、そのような改良方法はまた、同じｍＲＮＡ種から得られる同時シグナルを
排除できないとしても減少させる。

【００１８】発明が解決しようとする課題我々は、ｍＲＮＡ集団でｍＲＮＡを同時に配列特異的に同定する改良方法を開
発した。一般に、本方法は以下を含む：（１）１２アンカープライマーの混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃＤ
ＮＡを調製する。このアンカープライマーは各々：（ｉ）７から４０のＴ残基列
；（ｉｉ）６つより多い塩基を認識する制限エンドヌクレアーゼによる切断部位
、この切断部位はこのＴ残基列の５'側に位置する；（ｉｉｉ）４から４０ヌク
レオチドの第一の充填セグメント、この第一の充填セグメントは制限エンドヌク
レアーゼ切断部位の５'側に位置する；および（ｉｖ）アンカープライマーの各
々の３'末端に位置する調整用残基、−Ｖ−Ｎ（式中、ＶはＡ、ＣおよびＧから
成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから
成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチド）を含み、前記混合物はＶおよび
Ｎについて全ての可能性を含むアンカープライマーを含む；（２）ベクターによって形質転換された適切なホスト細胞からクローン化挿入
物を作製する。このベクターは、その中に挿入された第一の制限エンドヌクレア
ーゼおよび第二の制限エンドヌクレアーゼで切断されたｃＤＮＡサンプルを有す
る。この切断されたｃＤＮＡサンプルは、ベクター内のバクテリオファージ特異
的プロモーターに対してアンチセンス方向にベクター内に挿入されており、第一
の制限エンドヌクレアーゼは４つのヌクレオチド配列を認識し、第二の制限エン
ドヌクレアーゼはアンカープライマー混合物の各メンバー内のただ１つの部位を
切断する；（３）第一および第二の制限エンドヌクレアーゼとは異なる少なくとも１つの
制限エンドヌクレアーゼの消化によってクローニング挿入物の直線化フラグメン
トを作製する；（４）直線化フラグメントをバクテリオファージ特異的プロモーターから転写
を開始させることができるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼと保温
してアンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物を作製する；（５）ｃＲＮＡ調製物を１６のサブプールに分け、熱耐性逆転写酵素および１
６の５'−ＲＴの１つを用いて、各サブプールから第一鎖ｃＤＮＡを転写する。
５'−ＲＴはその３'末端が−Ｎ−Ｎ（式中Ｎは４つのデオキシヌクレオチド、Ａ
、Ｃ、ＧまたはＴのうちの１つ）で、長さは少なくとも１５ヌクレオチドで、バ
クテリオファージ特異的プロモーターの３'末端に配列が一致し、さらにその配
列は前記ｃＲＮＡの少なくとも最初の２つのヌクレオチドまで伸長しており、前
記混合物は前記３'末端の２つのヌクレオチドについて全ての可能性を含み；（６）ポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として１６のサブプールの各々の転
写生成物を用い以下の３'−ＰＣＲプライマーおよび５'−ＰＣＲプライマーによ
りポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成する。前記３'−ＰＣＲプライ
マーはベクター内のｃＤＮＡサンプル挿入物の部位に隣接するベクター内配列と
配列が一致し、５'−ＰＣＲプライマーは以下の（ｉ）−（ｉｉｉ）から成る群
から選ばれる：（ｉ）そのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた５
'−ＲＴプライマー；（ｉｉ）そのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に
用いた、３'末端がさらに別の１つの残基−Ｎ（ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいず
れか）によって伸長されたれた５'−ＲＴプライマー；および（ｉｉｉ）そのサ
ブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた、その３'末端がさらに別の２
つの残基−Ｎ−Ｎ（ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれか）によって伸長された５
'−ＲＴ；および（７）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動によって解析し、サ
ンプル中に存在するｍＲＮＡの３'末端を表わすバンドを表示する。別の好ましい実施態様では本方法は以下の工程を含む：（ａ）アンカープライマーの混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃＤＮＡ
集団を調製する。前記アンカープライマーは各々、：（ｉ）７から４０のＴ残基
列；（ｉｉ）Ｔ残基列の５'側に位置する、６つより多い塩基を認識する第一の
制限エンドヌクレアーゼによる切断部位；（ｉｉｉ）第一の制限エンドヌクレア
ーゼ切断部位の５'側に位置する、４から４０ヌクレオチドの第一の充填セグメ
ント；および（ｉｖ）−Ｖ及び−Ｖ−Ｎからなる群より選ばれるアンカープライ
マーの各々の３'末端に位置する調整用残基（式中、ＶはＡ、ＣおよびＧから成
る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成
る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチド）を含み、前記混合物はＶおよびＮ
について全ての可能性を含むアンカープライマーを含み、前記混合物内の調整用
残基は−Ｖ又は−Ｖ−Ｎのうちの１つによって定義される；（ｂ）第一の制限エンドヌクレアーゼおよび第二の制限エンドヌクレアーゼ（
第二の制限エンドヌクレアーゼは４ヌクレオチド配列を認識する）で二本鎖ｃＤ
ＮＡ集団を切断し、それぞれ第一および第二の末端を有する二本鎖ｃＤＮＡ分子
を生成する；（ｃ）工程（ｂ）の各々から得た二本鎖ｃＤＮＡ分子をバクテリオファージ特
異的プロモーターに対してアンチセンス方向でベクターに挿入し、挿入ｃＤＮＡ
分子を含むベクター集団を作製する。前記の挿入によって、５'が挿入ｃＤＮＡ
のセンス鎖の上流にあり３'がセンス鎖の下流にあるように、３'および５'フラ
ンキングベクター配列が規定され、さらに前記ベクターは、前記第一の制限エン
ドヌクレアーゼ部位と前記プロモーター内の転写開始を規定する部位との間に長
さが少なくとも１５ヌクレオチドの３'フランキングヌクレオチド配列を有し；（ｄ）工程（ｃ）で生成されたベクターを、挿入ｃＤＮＡ分子内またはバクテ
リオファージ特異的プロモーター内の配列を認識しないが、ベクター内の配列を
認識する少なくとの１つの制限エンドヌクレアーゼで消化して挿入ｃＤＮＡ分子
を含む直線化フラグメントを作製するが、この場合、生じた直線化フラグメント
が、ｃＤＮＡの第二の末端でベクターに挿入されたｃＤＮＡサンプルの挿入部位
に対して５'側に少なくとも１５ヌクレオチドの５'フランキングベクター配列を
もつように消化され；（ｅ）直線化フラグメントをバクテリオファージ特異的プロモーターから転写
を開始させることができるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼと保温
してアンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物を作製し；（ｆ）ｃＲＮＡ調製物をサブプールに分け、逆転写酵素および以下のように規
定される５'−ＲＴプライマーの１つを用いて各サブプールから第一鎖ｃＤＮＡ
を転写する；前記５'−ＲＴプライマーは、Ｎxから成る３'末端を有し（式中"Ｎ
"は４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つで、"ｘ"は１か
ら５の整数）、長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フランキングベ
クター配列と相補的で５'−ＲＴプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入物特異的
ヌクレオチドの中の"ｘ"と同じ数のヌクレオチドまで伸長しており、この転写で
は、前記５'−ＲＴプライマーのうちの異なる１つが異なるサブプールで用いら
れ、"ｘ"＝１の場合はサブプールは４つで、"ｘ"＝２の場合はサブプールは１６
で、"ｘ"＝３の場合はサブプールは６４で、"ｘ"＝４の場合はサブプールは２５
６で、"ｘ"＝５の場合はサブプールは１０２４であり；（ｇ）ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型としてサブプールの各々の第一鎖ｃＤＮＡ
転写生成物を用い、前記第一の制限エンドヌクレアーゼ部位とバクテリオファー
ジ特異的プロモーターによる転写開始部位を規定する部位との間に存在する３'
フランキングベクター配列に相補的で長さが１５から３０ヌクレオチドの３'−
ＰＣＲプライマーおよび、−Ｎ_x−Ｎ_yから成る３'末端を有する５'−ＰＣＲプラ
イマーによりポリメラーゼ連鎖反応増幅生成物を生成する。前記式中、"Ｎ"およ
び"ｘ"は工程（ｆ）で規定したとおりで、−Ｎ_xは、そのサブプールについて第
一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた５'−ＲＴプライマーの場合と同じで、"ｙ"は、ｘ
＋ｙが３、４、５および６から成る群から選ばれる整数と等しい完全な整数で、
前記プライマーは長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フランキング
ベクター配列と相補的で５'−ＰＣＲプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入物特
異的ヌクレオチドの中の"ｘ＋ｙ"と同じ数のヌクレオチドにまで伸長しており；
さらに、（ｈ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを解析して、ｍＲＮＡ集団に存
在する異なるｍＲＮＡの３'末端を表す配列特異的生成物を表示する。

【００１９】典型的には、アンカープライマーは各々、Ｔ残基列中に１８のＴ残基を有し、
さらにアンカープライマーの第一の充填セグメントは長さが１４残基である。第
一の充填セグメントに適した配列は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ
−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ（配列番号：１）である。典型的には、６より大きい塩基を認
識する第一の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位は、ＮｏｔＩ切断部位であ
る。適切なアンカープライマーはまた、６より大きい塩基を認識する第一の制限
エンドヌクレアーゼによる切断部位とＴ残基列との間に挟まれた第二の充填セグ
メントを含むことができる。アンカープライマーの３'末端およびＴ残基列に対
して３'側に存在する調整残基は−Ｖ及び−Ｖ−Ｎからなる群より選ばれ、式中
、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、Ｎ
はＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドである
。

【００２０】好ましい実施態様では、アンカープライマーは、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ
−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）を有し、これは、ＮｏｔＩ部位（Ｇ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ）に対して５'側に存在する第一の充填セグメントＡ−Ａ
−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ、制限エンドヌクレアーゼ
切断部位とＴ残基列との間に挟まれた第二の充填配列Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ、およ
び調整残基−Ｖ−Ｎを含む。その他の好ましい態様において、工程（ａ）におい
て使用するアンカープライマーの調整残基は−Ｖである。

【００２１】典型的には、６より大きい塩基を認識する第一の制限エンドヌクレアーゼは、
ＡｓｃＩ、ＢａｅＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｐｕＭＩ、
ＲｓｒＩＩ、ＳａｐＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＡＩ、Ｓｒｆ
Ｉ、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳｗａＩから成る群から選ばれる。典型的には、４
つのヌクレオチド配列を認識する第二の制限エンドヌクレアーゼは、ＭｂｏＩ、
ＤｐｎＩＩ、Ｓａｙ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＢｆａＩ、Ｃｓｐ６
Ｉ、ＭｓｅＩ、ＨｈａＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＭｓｐＩ、ＭａｅＩＩおよ
びＨｉｎＰ１Ｉから成る群から選ばれる。

【００２２】典型的には、工程（ｆ）における「ｘ」の値は１又は２である。典型的には工
程（ｇ）における「ｙ」の値は３又は４である。１つの態様において、工程（ａ
）における調整残基は−Ｖ−Ｎであり、工程（ｆ）における「ｘ」の値は２であ
り、工程（ｇ）における「ｙ」の値は２である。別の態様において、工程（ａ）
における調整残基は−Ｖ−Ｎであり、工程（ｆ）における「ｘ」の値は１であり
、工程（ｇ）における「ｙ」の値は３である。別の態様において、工程（ａ）に
おける調整残基は−Ｖ−Ｎであり、工程（ｆ）における「ｘ」の値は１であり、
工程（ｇ）における「ｙ」の値は４である。別の態様において、工程（ａ）における調整残基は−Ｖであり、工程（ｆ）に
おける「ｘ」の値は１であり、工程（ｇ）における「ｙ」の値は３である。更な
る態様において、工程（ａ）における調整残基は−Ｖであり、工程（ｆ）におけ
る「ｘ」の値は１であり、工程（ｇ）における「ｙ」の値は４である。典型的には、アンカープライマーの各々は、Ｔ残基列に１８のＴ残基を有し、
アンカープライマーの第一の充填セグメントは長さが１４残基である。

【００２３】適切なベクターはｐＢＣＳＫ⁺およびｐＢＳＳＫ⁺（Stratagene）である。別の
特徴では、本発明は、ｐＢＳＳＫ⁺を基にして改善したベクターを提供し、これ
は本発明の実施のためにデザインされ、例えばｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１、ｐＢＳ
ＳＫ⁺／ＤＧＴ２およびｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ３で、下記で詳細に説明する。その
ような改善ベクターはまたｐＢＣＳＫ⁺または他の当技術分野で周知の適切なベ
クターを基本にすることができる。

【００２４】好ましいベクターは、pBluescript(ｐＢＳまたはｐＢＣ）ＳＫ⁺（Stratagene
）を基本にした改良ベクターで、このベクターでは、６５６から７６４位のヌク
レオチド配列の一部分が除去され、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む
少なくとも１１０ヌクレオチドで置換されていた。この領域（マルチクローニン
グ部位（ＭＣＳ）と呼ぶ）は、ＳａｃＩ部位からＫｐｎＩ部位のヌクレオチド配
列部分に広がっている。

【００２５】ベクターはＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミドｐＢＣＳＫ⁺でよ
いが、この場合は、工程（６）の３'−ＰＣＲプライマーはＧ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ
−Ｃ（配列番号：４）でよい。好ましい実施態様では、ベクターは、ｐＢＣＳＫ ⁺ 、ｐＢＳＳＫ⁺およびｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１から成る群から選ばれ、工程（ｆ
）の３'−ＰＣＲプライマーはＧ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（配列番号：１８）である。

【００２６】典型的には、工程（ｄ）で用いられる制限エンドヌクレアーゼは、工程（ｂ）
で用いられる第二の制限エンドヌクレアーゼの４ヌクレオチド配列を含むヌクレ
オチド配列認識を有する。一般に、そのような制限エンドヌクレアーゼのための
部位は、ＣｌａＩに対して５'側のベクター配列内の他にＣｌａＩ部位とＮｏｔ
Ｉ部位との間のＭＣＳ内に存在する必要がある。ある実施態様では、ベクターはプラスミドｐＢＣＳＫ⁺で、ＭｓｐＩが第二の
制限エンドヌクレアーゼとして、さらに工程（ｄ）で用いられる直線化制限エン
ドヌクレアーゼとして用いられる。別の実施態様では、ベクターはプラスミドｐＢＣＳＫ⁺で、第二の制限エンド
ヌクレアーゼは、ＭｓｐＩ、ＭａｅＩＩ、ＴａｑＩおよびＨｉｎＰ１Ｉから成る
群から選ばれ、さらに工程（ｄ）の直線化はＳｍａＩによる第一の消化、続いて
ＫｐｎＩおよびＡｐａＩの混合物による第二の消化によって達成される。

【００２７】他の実施態様では、ベクターはｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ
２およびｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ３から成る群から選ばれる。そのような実施態様
では、第二の制限エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩで工程（ｄ）用いられる制限エ
ンドヌクレアーゼがＳｍａＩである適切な酵素の組合せが提供される。別の適切
な組合せは、第二の制限エンドヌクレアーゼがＴａｑＩで、工程（ｄ）で用いら
れる制限エンドヌクレアーゼがＸｈｏＩである。さらに適切な組合せは、第二の
制限エンドヌクレアーゼがＨｉｎＰ１Ｉで、工程（ｄ）で用いられる制限エンド
ヌクレアーゼがＮａｒＩである。さらに別の適切な組合せは、第二の制限エンド
ヌクレアーゼがＭａｅＩＩで、工程（ｄ）で用いられる制限エンドヌクレアーゼ
がＡａｔＩＩである。

【００２８】典型的には、バクテリオファージ特異的プロモーターは、Ｔ３プロモーター、
Ｔ７プロモーターおよびＳＰ６プロモーターから成る群から選ばれる。もっとも
典型的にはそれはＴ３プロモーターである。典型的には、ｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写をプライミングするための１６の５
'−ＲＴプライマーは、配列Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ
−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）を有する。別の好ましい実施態様で
は、ｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写をプライミングするための４つの５'−ＲＴプ
ライマーは、配列Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｎ（配列番号：９）を有する。

【００２９】４ヌクレオチド配列を認識する第二の制限エンドヌクレアーゼは典型的にはＭ
ｓｐＩで、また別にはそれはＴａｑＩ、ＭａｗＩＩまたはＩｎＰ１Ｉでもよい。
アンカープライマー混合物の各々でただ１か所で切断する制限エンドヌクレアー
ゼは典型的にはＮｏｔＩである。典型的にはｍＲＮＡ集団ではポリアデニル化ｍＲＮＡ種が濃縮されていた。典型的にはホスト細胞は大腸菌（Escherichia coli）株である。

【００３０】クローン化挿入物の直線化フラグメントを生成する工程は典型的には以下を含
む：（ａ）挿入物を含むプラスミドを２つに分け、第一の部分を制限エンドヌクレ
アーゼＸｈｏＩで切断し、第二の部分を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで切断
する；（ｂ）切断後第一および第二の部分を再び一緒にする；（ｃ）この再度一緒にした部分を三等分し、第一の三等分を制限エンドヌクレ
アーゼＨｉｎｄＩＩＩで、第二の三等分を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで
、さらに第三の三等分を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断し；さらに（ｄ）集団の約１／６が可能な酵素組合せの各々による切断生成物に一致する
直線化フラグメント集団を製造するためにこれら三等分を再度一緒にする。

【００３１】ベクターがｐＢＣＳＫ⁺およびｐＢＳＳＫ⁺から成る群から選ばれ、ＭｓｐＩが
第二の制限エンドヌクレアーゼである別の実施態様では、ＭｓｐＩを工程（ｄ）
で用いられる直線化制限エンドヌクレアーゼとして用いることができる。ベクタ
ーがプラスミドｐＢＣＳＫ⁺であるまた別の場合には、直線化はＳｍａＩによる
第一の消化、続いてＫｐｎＩおよびＡｐａＩの混合物による第二の消化によって
達成することができる。

【００３２】他の実施態様では、ベクターはｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ
２およびｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ３から成る群から選ばれ、工程（ｄ）で用いられ
る直線化制限エンドヌクレアーゼはＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、ＮａｒＩおよびＡａｔ
ＩＩから成る群から選ばれる。典型的には、ポリメラーゼ連鎖増幅フラグメントを電気泳動によって解析する
工程は、少なくとも２つのゲルでのフラグメントの電気泳動を含む。各配列特異的ＰＣＲ生成物、またはポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントは
、配列識別子、ヌクレオチド残基としての長さおよびＰＣＲ生成物の標識の濃度
（そのＰＣＲ生成物に対する検出装置の出力のピーク下の面積と規定される）か
ら成るデジタルアドレスによって特定される。

【００３３】配列識別子は、５'成分および３'成分によって規定される。配列識別子の５'
成分は、最初のｍＲＮＡ集団から調製された二本鎖ｃＤＮＡ集団を切断するため
に用いられた第二の制限ヌクレアーゼの認識部位である。典型的には、制限エン
ドヌクレアーゼはＭｓｐＩで、配列識別子の５'成分は−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇである
。配列識別子の３'成分は５'ＰＣＲプライマーの３'末端配列によって規定され
る配列である。例えば、図２の"１１１"として表示されるＰＣＲ生成物の配列識
別子の３'成分は−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃである。したがって、この事例では、配列識
別子は−Ｃ−Ｃ−Ｇ−ＧＣ−Ｔ−Ｇ−Ｃであろう。

【００３４】典型的には、配列識別子および配列特異的ＰＣＲ生成物のヌクレオチド残基と
しての長さおよびＰＣＲ生成物の標識の濃度（そのＰＣＲ生成物の検出装置の出
力のピーク下の面積として表される）として上記に規定されるように、デジタル
アドレスを含むデータベースは、適切なコンピュータハードウェアおよびコンピ
ュータソフトウェアを用いて構築され、維持される。好ましくは、そのようなデ
ータベースは、さらに配列の関連性、遺伝子マッピング、細胞における分布、実
験処理条件および遺伝子機能に関連すると考えられる他の一切の情報を含む。

【００３５】本方法はさらに、例えば以下によってｍＲＮＡの少なくとも１つの３'末端の
配列を決定することを含む：（１）サンプル中に存在するｍＲＮＡの３'末端を示すバンドが表出されてい
る電気泳動から１つのｍＲＮＡに対応する少なくとも１つのｃＤＮＡを溶出させ
；（２）前記溶出ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応で増幅し；（３）前記増幅ｃＤＮＡをプラスミドでクローニングし；（４）前記プラスミドでクローニングしたＤＮＡに一致するＤＮＡを生成し；
さらに（５）前記クローン化ＤＮＡの配列を決定する。

【００３６】本発明の別の特徴は、ｍＲＮＡ集団の３'末端を表わすアンチセンスｃＲＮＡ
プールのメンバーに対応するｍＲＮＡを同時に配列特異的に同定する方法で、ア
ンチセンスｃＲＮＡプールのメンバーのアンチセンスｃＲＮＡでは、それらの５
'末端はバクテリオファージ特異的ベクターと一致するプライマー配列で終結し
、それらの３'末端はベクターの配列と一致する配列で終結している。

【００３７】本方法は以下の工程を含む：（１）アンチセンスｃＲＮＡプールのメンバーを１６のサブプールに分け、熱
耐性逆転写酵素および１６の５'−ＲＴプライマーの１つを用いて各サブプール
から第一鎖ｃＤＮＡを転写する。５'−ＲＴプライマーの３'末端は−Ｎ−Ｎ（式
中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つである）で
、５'−ＲＴプライマーは長さが少なくとも１５ヌクレオチドで、配列がバクテ
リオファージ特異的プロモーターの３'末端に一致し、さらにその配列はｃＲＮ
Ａの少なくとも最初の２つのヌクレオチドまで伸長している。この混合物は３'
末端の２つのヌクレオチドについて全ての可能性を含んでいる；（２）ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として１６のサブプールの各々の転写生成
物を用い、ベクター内のｃＤＮＡサンプルの挿入部位に隣接するベクター配列に
配列が一致する３'−ＰＣＲプライマーおよび５'−ＰＣＲプライマーとして、（
ｉ）そのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いられた５'−ＲＴ、（
ｉｉ）その３'末端がさらに別の残基−Ｎ（ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれで
もよい）で伸長されたそのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いられ
た５'−ＲＴおよび（ｉｉｉ）その３'末端がさらに別の２つの残基−Ｎ−Ｎ（Ｎ
はＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい）で伸長されたそのサブプールについて
第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いられた５'−ＲＴから成る群から選ばれる５'−ＰＣ
Ｒプライマーによりポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成する；（３）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動によって解析し、サ
ンプルに存在するｍＲＮＡの３'末端を表すバンドを表示する。

【００３８】別の好ましい実施態様では、本方法は以下の工程を含む：（１）ｃＲＮＡ調製物をサブプールに分け、さらに逆転写酵素および以下の定
義を有する５'−ＲＴプライマーの１つを用いて各プールから第一鎖ｃＤＮＡを
転写するが、この場合、前記５'−ＲＴプライマーのうち異なる１つが異なるサ
ブプールで用いられ、"ｘ"＝１の場合サブプールは４つで、"ｘ"＝２の場合サブ
プールは１６で、"ｘ"＝３の場合サブプールは６４で、"ｘ"＝４の場合サブプー
ルは２５６で、"ｘ"＝５の場合サブプールは１０２４である。前記５'−ＲＴプ
ライマーは、−Ｎ_xから成る３'末端を有し（式中"Ｎ"は４つのデオキシリボヌク
レオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つで、"ｘ"は１から５までの整数）、長さが１
５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フランキングベクター配列と相補的で５'
−ＲＴプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入物特異的ヌクレオチド内の"ｘ"と同
じ数のヌクレオチドまで伸長しており；（２）ポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型としてサブプールの各々の第一鎖ｃ
ＤＮＡ転写生成物を用い、長さが１５から３０ヌクレオチドで、前記第一の制限
エンドヌクレアーゼ部位とバクテリオファージ特異的プロモーターによる転写開
始を規定する部位との間の３'フランキングベクター配列に相補的である３'−Ｐ
ＣＲプライマーおよび以下のように規定される５'−ＰＣＲプライマーによりポ
リメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成する。前記５'−ＰＣＲプライマー
は−Ｎ_x−Ｎ_yから成る３'末端を有し（式中、"Ｎ"および"ｘ"は工程（ｆ）の場
合と同じで、−Ｎ_xは、当該サブプールについてｃＤＮＡの合成に用いられた５'
−ＲＴの場合と同じで、"ｙ"は、ｘ＋ｙが３、４、５および６から成る群から選
ばれる整数と等しい完全な整数）、長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに
５'フランキングベクター配列と相補的で５’−ＰＣＲプライマーの相補性がｃ
ＲＮＡの挿入物特異的ヌクレオチド内の"ｘ＋ｙ"と同じ数のヌクレオチドまで伸
長しており；（３）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動によって解析し、ｍ
ＲＮＡ集団に存在する異なるｍＲＮＡの３'末端を表示する配列特異的生成物デ
ィスプレーを作製する。

【００３９】本発明のさらに別の特徴は、生理学的また病理学的変化に付随する組織内での
ｍＲＮＡ発現パターンの変化を検出する方法である。この方法は以下の工程を含
む：（１）生理学的または病理学的変化を受けていない第一の組織サンプルを入手
し；（２）ｍＲＮＡ集団の３'末端を表示しているアンチセンスｃＲＮＡのメンバ
ーに対応するｍＲＮＡを同時に配列特異的に同定する上記の方法の（１）−（３
）の工程を実施することによって、第一の組織サンプルにおけるｍＲＮＡ発現パ
ターンを決定して、第一のサンプルに存在するｍＲＮＡの３'−末端を表示する
第一のバンドディスプレーを作製し；（３）生理学的または病理学的変化を受けた第二の組織サンプルを入手し；（４）アンチセンスｃＲＮＡのメンバーに対応するｍＲＮＡを同時に配列特異
的に同定する上記の方法の（１）−（３）の工程を実施することによって、第二
の組織サンプルにおけるｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第二のサンプルに存
在するｍＲＮＡの３'−末端を表示する第二のバンドディスプレーを作製し；さ
らに（５）第一および第二のディスプレーを比較して、組織内のｍＲＮＡ発現パタ
ーンにおける生理学的または病理学的変化の影響を決定する。比較は典型的には隣合ったレーンで実施される。組織は中枢神経系または中枢神経系の特定の構造物に由来するであろう。前記
組織は別の器官または器官系に由来するものでもよい。

【００４０】本発明の別の特徴は薬剤の副作用をスクリーニングする方法である。本方法は
以下の工程を含む：（１）既知の生理学的機能をもつ化合物で処理した器官から第一の組織サンプ
ルを入手し；（２）ｍＲＮＡ集団の３'末端を表示しているアンチセンスｃＲＮＡのメンバ
ーに対応するｍＲＮＡを同時に配列特異的に同定する上記の方法の（１）−（３
）の工程を実施することによって、第一の組織サンプルにおけるｍＲＮＡ発現パ
ターンを決定して、第一のサンプルに存在するｍＲＮＡの３'−末端を表示する
第一のバンドディスプレーを作製し；（３）副作用についてスクリーニングするべき薬剤で処理した器官から第二の
組織サンプルを入手し；（４）アンチセンスｃＲＮＡのメンバーに対応するｍＲＮＡを同時に配列特異
的に同定する上記の方法の（１）−（３）の工程を実施することによって、第二
の組織サンプルにおけるｍＲＮＡ発現パターンを決定して、第二のサンプルに存
在するｍＲＮＡの３'−末端を表示する第二のバンドディスプレーを作製し；さ
らに（５）第一および第二のディスプレーを比較して、その発現が既知の化合物に
よって影響されないが、スクリーンニングしている薬剤によって影響を受けるｍ
ＲＮＡ種の存在（したがって副作用）を検出し、それによってスクリーニングし
ている薬剤と既知の化合物の作用の違いを示す。スクリーニングされる薬剤は、中枢神経系に影響を与える薬剤、例えば抗うつ
剤、神経弛緩薬、抗痙攣薬、モノアミンオキシダーゼ抑制物質または刺激物質で
あろう。また別には前記薬剤は別の種類の薬剤、例えば抗パーキンソン症薬、骨
格筋弛緩薬、鎮痛剤、局所麻酔剤、コリン作動薬、鎮痙薬、ステロイド、または
非ステロイド系抗炎症剤でもよい。

【００４１】本発明の別の特徴は、本発明の実施に適したプライマーパネルおよび縮重プラ
イマー混合物である。これらは以下を含む：（１）以下の配列の１６のプライマーを含む５'−ＲＴプライマーパネル：Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配
列番号：３）、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴ
のうちの１つで；（２）以下の配列の６４のプライマーを含む５’−ＲＴプライマーパネル：Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ
（配列番号：５）、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇまた
はＴのうちの１つで；（３）以下の配列の２５６のプライマーを含む５'−ＰＣＲプライマーパネル
：Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ−Ｎ（配列番号：６）、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ
、ＧまたはＴのうちの１つで；（４）以下の配列の１０２４のプライマーを含む５'−ＰＣＲプライマーパネ
ル：Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２４）、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチ
ドＡ、Ｃ、ＧまたはＴのうちの１つで；さらに（５）以下の配列の４０９６のプライマーを含む５'−ＰＣＲプライマーパネ
ル：Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２５）、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレ
オチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴのうちの１つである；（６）以下の配列の１２のプライマーを含むアンカープライマーパネル：Ａ−
Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２８）、式中、Ｖは
Ａ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、
Ｃ、ＧまたはＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで；（７）以下の配列の３つのプライマーを含むアンカープライマーのパネル：A-
A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-
T-T-T-T-T-T-T-T-V(配列番号: 23)、式中、ＶはＡ、Ｃ及びＧからなる群より選
ばれるデオキシリボヌクレオチドである；（８）各々が以下の配列を有する４つの異なるオリゴヌクレオチドを含む５’
−ＲＴプライマーのパネル：G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (配列番号: 9)
、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのうちの１つで
ある；（９）各々が以下の配列を有する１６の異なるオリゴヌクレオチドを含む５’
−ＲＴプライマーのパネル：G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (配列番号: 7)
、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのうちの１つで
ある；（１０）各々が以下の配列を有する６４の異なるオリゴヌクレオチドを含む５
’−ＰＣＲプライマーのパネル：T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (配列番号: 13)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのうちの１
つである；（１１）各々が以下の配列を有する２５６の異なるオリゴヌクレオチドを含む
５’−ＰＣＲプライマーのパネル： C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (配列番
号: 14)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのうち
の１つである；（１２）各々が以下の配列を有する１０２４の異なるオリゴヌクレオチドを含
む５’−ＰＣＲプライマーのパネル：G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (配列
番号: 15)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのう
ちの１つである；（１３）各々が以下の配列を有する４０９６の異なるオリゴヌクレオチドを含
む５’−ＰＣＲプライマーのパネル：A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (配列
番号: 16)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのう
ちの１つである；（１４）各々が以下の配列を有する４つの異なるオリゴヌクレオチドを含む５
’−ＲＴプライマーのパネル：C-T-T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N (配
列番号: 10)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの
うちの１つである；（１５）各々が以下の配列を有する１６の異なるオリゴヌクレオチドを含む５
’−ＲＴプライマーのパネル：T-T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N (配
列番号: 11)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの
うちの１つである；（１６）各々が以下の配列を有する６４の異なるオリゴヌクレオチドを含む５
’−ＲＴプライマーのパネル：T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N (配
列番号: 12)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの
うちの１つである；（１７）各々が以下の配列を有する２５６の異なるオリゴヌクレオチドを含む
５’−ＰＣＲプライマーのパネル：C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N
(配列番号: 17)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴ
のうちの１つである；（１８）各々が以下の配列を有する１０２４の異なるオリゴヌクレオチドを含
む５’−ＰＣＲプライマーのパネル：A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N-
N (配列番号: 26)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又は
Ｔのうちの１つである；（１９）各々が以下の配列を有する４０９６の異なるオリゴヌクレオチドを含
む５’−ＰＣＲプライマーのパネル：G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-
N (配列番号: 27)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又は
Ｔのうちの１つである；（２０）以下の配列の３つのプライマーの混合物を含むアンカープライマーの
縮重混合物：A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-
T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (配列番号: 23)、式中、ＶはＡ、Ｃ及びＧか
らなる群より選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、３つのプライマーの各
々は概ね等モル量で存在する；更に、（２１）以下の配列の１２のプライマーの混合物を含むアンカープライマーの
縮重混合物：A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-
T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (配列番号: 2)、式中、ＶはＡ、Ｃ及びＧ
からなる群より選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ及
びＴからなる群より選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、１２のプライマ
ーの各々は概ね等モル量で存在する。

【００４２】課題を解決するための手段我々は、ｍＲＮＡ集団中のｍＲＮＡを同時に配列特異的に同定し、表示する方
法を開発した。下記で考察するように、この方法は、薬剤のスクリーニング、生理学的および
病理学的状態の研究、並びにゲノムマッピングにおいて数多く応用される。これ
らの応用については下記で考察されるであろう。ｍＲＮＡの配列特異的同時同定ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を基礎にして本発明の方法は、組織で発
現されるほとんど全てのｍＲＮＡの可視化のための手段を提供する。前記ｍＲＮ
Ａは、バンドの濃度が前記ｍＲＮＡの濃度と概ね一致する、ゲル上のそれぞれ別
個のバンドとして表される。本方法は、実際上全てのｍＲＮＡが３'−ポリ（Ａ
）テールで終わるが、プライマーのテールへの結合の特異性に依存しないという
観察を基礎にしている。

【００４３】一般に本方法は以下を含む：（１）１２のアンカープライマーの混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃ
ＤＮＡを調製するが、ここでアンカープライマーの各々は、（ｉ）７から４０の
Ｔ残基の列、（ｉｉ）Ｔ残基列の５'側に位置する、６より多い塩基を認識する
第一の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位、（ｉｉｉ）前記制限エンドヌク
レアーゼによる切断部位の５'側に位置する、４から４０ヌクレオチドの第一の
充填セグメント；および（ｉｖ）アンカープライマーの各々の３'末端に位置す
る調整残基−Ｖ−Ｎ（式中、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキ
シリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキ
シリボヌクレオチドである）を含み、前記混合物はＶおよびＮについて全ての可
能性を含むアンカープライマーを含み；（２）ベクターによって形質転換された適切なホスト細胞からクローン化挿入
物を作製するが、前記ベクターは、その中に挿入された第一の制限エンドヌクレ
アーゼおよび第二の制限エンドヌクレアーゼで切断されたｃＤＮＡサンプルを有
し、前記切断されたｃＤＮＡサンプルは、ベクター内のバクテリオファージ特異
的プロモーターに対してアンチセンス方向でベクター内に挿入されてあり、第二
の制限エンドヌクレアーゼは４つのヌクレオチド配列を認識し、第一の制限エン
ドヌクレアーゼはアンカープライマー混合物の各メンバー内でただ１つの部位を
切断し；（３）第一および第二の制限エンドヌクレアーゼとは異なる少なくとも１つの
制限エンドヌクレアーゼの消化によってクローニング挿入物の直線化フラグメン
トを作製し；（４）直線化フラグメントをバクテリオファージ特異的プロモーターから転写
を開始させることができるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼと保温
してアンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物を作製し；（５）ｃＲＮＡ調製物を１６のサブプールに分け、熱耐性逆転写酵素および１
６の５'−ＲＴの１つを用いて、各サブプールから第一鎖ｃＤＮＡを転写し、こ
こで５'−ＲＴはその３'末端が−Ｎ−Ｎ（式中Ｎは４つのデオキシヌクレオチド
、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴのうちの１つ）で、長さは少なくとも１５ヌクレオチドで
、バクテリオファージ特異的プロモーターの３'末端に配列が一致し、さらにそ
の配列は前記ｃＲＮＡの少なくとも最初の２つのヌクレオチドまで伸長しており
、前記混合物は前記３'末端の２つのヌクレオチドについて全ての可能性を含み
；（６）ポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として１６のサブプールの各々の転
写生成物を用い以下の３'−ＰＣＲプライマーおよび５'−ＰＣＲプライマーによ
りポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成するが、ここで前記３'−ＰＣ
Ｒプライマーはベクター内のｃＤＮＡサンプル挿入物の部位に隣接するベクター
内配列と配列が一致し、５'−ＰＣＲプライマーは、（ｉ）そのサブプールにつ
いて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた５'−ＲＴプライマー；（ｉｉ）そのサブプ
ールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた、３'末端がさらに別の１つの残基
−Ｎ（ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれか）によって伸長されたれた５'−ＲＴ
プライマー；および（ｉｉｉ）そのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に
用いた、その３'末端がさらに別の２つの残基−Ｎ−Ｎ（ＮはＡ、Ｃ、Ｇまたは
Ｔのいずれか）によって伸長された５'−ＲＴの３つから成る群から選ばれ；さ
らに（７）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動によって解析し、サ
ンプル中に存在するｍＲＮＡの３'末端を表わすバンドを表示する。

【００４４】別の好ましい実施態様では本方法は以下の工程を含む：（ａ）アンカープライマーの混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃＤＮＡ
集団を調製し、前記アンカープライマーは各々、（ｉ）７から４０のＴ残基の列
；（ｉｉ）Ｔ残基列の５'側に位置する、６つより多い塩基を認識する第一の制
限エンドヌクレアーゼによる切断部位；（ｉｉｉ）第一の制限エンドヌクレアー
ゼ切断部位の５'側に位置する、４から４０ヌクレオチドの第一の充填セグメン
ト；および（ｉｖ）−Ｖ及び−Ｖ−Ｎからなる群より選ばれるアンカープライマ
ー各々の３'末端に位置する調整用残基（式中、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群
から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群
から選ばれるデオキシリボヌクレオチド）を含み、前記混合物はＶおよびＮにつ
いて全ての可能性を含有するアンカープライマーを含み、前記混合物内の調整用
残基は−Ｖ又は−Ｖ−Ｎのうちの１つによって定義される；（ｂ）第一の制限エンドヌクレアーゼおよび第二の制限エンドヌクレアーゼ（
第二の制限エンドヌクレアーゼは４ヌクレオチド配列を認識する）で二本鎖ｃＤ
ＮＡ集団を切断し、それぞれ第一および第二の末端を有する二本鎖ｃＤＮＡ分子
を生成し；（ｃ）工程（ｂ）の各々から得た二本鎖ｃＤＮＡ分子をバクテリオファージ特
異的プロモーターに対してアンチセンス方向でベクターに挿入し、挿入ｃＤＮＡ
分子を含むベクター集団を作製するが、前記の挿入によって、５'が挿入ｃＤＮ
Ａのセンス鎖の上流にあり３'がセンス鎖の下流にあるように、３'および５'フ
ランキングベクター配列が規定され、さらに前記ベクターは、前記第一の制限エ
ンドヌクレアーゼ部位と前記プロモーター内の転写開始を規定する部位との間に
長さが少なくとも１５ヌクレオチドの３'フランキングヌクレオチド配列を有し
；（ｄ）工程（ｃ）で生成されたベクターを、挿入ｃＤＮＡ分子内またはバクテ
リオファージ特異的プロモーター内の配列を認識しないが、ベクター内の配列を
認識する少なくとの１つの制限エンドヌクレアーゼで消化して挿入ｃＤＮＡ分子
を含む直線化フラグメントを作製するが、この場合、生じた直線化フラグメント
が、ｃＤＮＡの第二の末端でベクターに挿入されたｃＤＮＡサンプルの挿入部位
に対して５'側に少なくとも１５ヌクレオチドの５'フランキングベクター配列を
もつように消化され；（ｅ）直線化フラグメントをバクテリオファージ特異的プロモーターから転写
を開始させることができるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼと保温
してアンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物を作製し；（ｆ）ｃＲＮＡ調製物をサブプールに分け、逆転写酵素および以下のように規
定される５'−ＲＴプライマーの１つを用いて各サブプールから第一鎖ｃＤＮＡ
を転写するが、ここで前記５'−ＲＴプライマーは、Ｎxから成る３'末端を有し
（式中"Ｎ"は４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つで、"
ｘ"は１から５の整数）、長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フラン
キングベクター配列と相補的で５'−ＲＴプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入
物特異的ヌクレオチドの中の"ｘ"と同じ数のヌクレオチドまで伸長しており、こ
の転写では、前記５'−ＲＴプライマーのうちの異なる１つが異なるサブプール
で用いられ、"ｘ"＝１の場合はサブプールは４つで、"ｘ"＝２の場合はサブプー
ルは１６で、"ｘ"＝３の場合はサブプールは６４で、"ｘ"＝４の場合はサブプー
ルは２５６で、"ｘ"＝５の場合はサブプールは１０２４であり；（ｇ）ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型としてサブプールの各々の第一鎖ｃＤＮＡ
転写生成物を用い、３'−ＰＣＲおよび５'−ＰＣＲによりポリメラーゼ連鎖反応
増幅生成物を生成するが、ここで前記３'−ＰＣＲプライマーは長さが１５から
３０ヌクレオチドで、第一の制限エンドヌクレアーゼ部位とバクテリオファージ
特異的プロモーターによる転写開始部位を規定する部位との間に存在する３'フ
ランキングベクター配列に相補的であり、前記５'−ＰＣＲプライマーは−Ｎ_x−
Ｎ_yから成る３'末端を有し（前記式中、"Ｎ"および"ｘ"は工程（ｆ）で規定した
とおりで、−Ｎ_xは、そのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた５'
−ＲＴプライマーの場合と同じで、"ｙ"は、ｘ＋ｙが３、４、５および６から成
る群から選ばれる整数と等しい完全な整数）、長さが１５から３０ヌクレオチド
で、さらに５'フランキングベクター配列と相補的で５'−ＰＣＲプライマーの相
補性がｃＲＮＡの挿入物特異的ヌクレオチドの中の"ｘ＋ｙ"と同じ数のヌクレオ
チドにまで伸長しており；さらに、（ｈ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを解析して、ｍＲＮＡ集団に存
在する異なるｍＲＮＡの３'末端を表す配列特異的生成物のディスプレーを作製
する。

【００４５】Ａ．ｍＲＮＡの単離本方法の第一の工程はｍＲＮＡ集団の単離または提供である。ＲＮＡの抽出方
法は当技術分野で周知で、例えば以下の文献に記載されている：J. Sambrook et
al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989), vol.1, Ch.7, "Extractio
n, Purification, and Analysis of Messenger RNA from Eukaryotic Cells"(こ
の文献は参照により本明細書に含まれる）。また別の単離および抽出方法もまた
周知である。典型的には、単離は、カオトロピズム薬剤（例えば塩化グアニジニ
ウムまたはグアニジニウムチオシアネート）の存在下で実施されるが、他の洗浄
剤および抽出剤もまた用いることができる。典型的には、ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）−セルロース、またはｍＲＮＡ分子
のポリアデニル化３'−部分と結合する能力を有する他のクロマトグラフィー媒
体上でのクロマトグラフィーによって、全抽出ＲＮＡから単離される。しかしな
がら、また別の選択肢として、好ましさは低下するが全ＲＮＡを使用することも
できる。しかしながら一般にはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを単離するのが好ましい。

【００４６】Ｂ．二本鎖ｃＤＮＡの調製続いて、逆転写を開始させるアンカープライマーの混合物を用いて二本鎖ｃＤ
ＮＡを調製する。アンカープライマーは各々、（ｉ）７から４０のＴ残基の列；
（ｉｉ）Ｔ残基列の５'側に位置する、６つより多い塩基を認識する制限エンド
ヌクレアーゼによる切断部位；（ｉｉｉ）制限エンドヌクレアーゼ切断部位の５
'側に位置する、４から４０ヌクレオチドの第一の充填セグメント；および（ｉ
ｖ）６つより多い塩基を認識する制限エンドヌクレアーゼの切断部位とＴ残基列
との間に挟まれた０から８残基の第二の充填セグメント；（ｖ）アンカープライ
マーの各々の３'末端に位置する、−Ｖ及び−Ｖ−Ｎからなる群より選ばれる調
整残基（式中、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレ
オチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレ
オチド）を含み、さらに、前記混合物はＶおよびＮについて全ての可能性を含む
アンカープライマーを含む。アンカープライマーが−Ｖの調整残基を有する場合
は、前記混合物は３種のアンカープライマーの混合物を含み、アンカープライマ
ーが−Ｖ−Ｎの調整残基を有する場合は、前記混合物は１２種のアンカープライ
マーの混合物を含む。

【００４７】典型的には、アンカープライマーは各々Ｔ残基列に１８のＴ残基を有し、アン
カープライマーの第一の充填セグメントは長さが１４残基である。第一の充填セ
グメントの適切な配列は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−
Ｔ−Ｃ（配列番号：１）である。典型的には、６より多い塩基を認識する制限エ
ンドヌクレアーゼによる切断部位はＮｏｔＩ切断部位である。３つのアンカープ
ライマーの好ましいセットは、配列：A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-
C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (配列番号: 23)を有
している。１２のアンカープライマーの別の好ましいセットは、配列：A-A-C-T-
G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-
T-T-T-T-T-V-N (配列番号: 2)を有している。

【００４８】このアンカープライマー混合物の１つのプライマーが、サンプル中の各ｍＲＮ
Ａ種の全コピーの３'末端の固定部位から合成を開始し、それによって各ｍＲＮ
Ａ種の３'末端を明らかにする。この反応は、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するために当技術分野で周知
の条件下で実施される。そのような技術は以下の文献に記載されている：Sambro
ok et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Vol.2,(表題："Const
ruction and Analysis of cDNA Libraries")。適切な逆転写酵素にはニワトリ骨
髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）およびマロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）
に由来するものが含まれる。好ましい逆転写酵素はＭＭＬＶ逆転写酵素である。

【００４９】Ｃ．制限エンドヌクレアーゼによるｃＤＮＡサンプルの切断ｃＤＮＡサンプルは２つの制限エンドヌクレアーゼで切断する。第一の制限エ
ンドヌクレアーゼは６塩基より長い部位を認識し、アンカープライマー混合物の
各アンカープライマー内のただ１つの部位を切断する。第二の制限エンドヌクレ
アーゼは４ヌクレオチド配列を認識するエンドヌクレアーゼである。そのような
エンドヌクレアーゼは典型的にはほとんどのｃＤＮＡで多数の部位を切断する。
典型的には、第一の制限エンドヌクレアーゼはＮｏｔＩで、第二のエンドヌクレ
アーゼはＭｓｐＩである。酵素ＮｏｔＩは、ほとんどのｃＤＮＡを内部で切断し
ない。これは、アンカー部位以外の場所でｃＤＮＡを切断することによって生じ
るクローン化挿入物の損失を最小限に留めるために望ましいことである。

【００５０】また別には、第二の制限エンドヌクレアーゼはＴａｑＩ、ＭａｅＩＩまたはＨ
ｉｎＰ１Ｉであろう。後者の２つの制限エンドヌクレアーゼの使用によって、Ｍ
ｓｐＩによって切断されないｍＲＮＡを検出できる。第二の制限エンドヌクレア
ーゼは、下記で考察するように、所望のベクターでクローニングするために適合
する５'−突出部を生じる。ｐＢＣＳＫ⁺、ｐＢＳＳＫ⁺、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１
、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ２およびｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ３から成る群から選ばれる
ベクターの場合、このクローニングは下記で考察するようにＣｌａＩ部位で実施
される。

【００５１】また別には、他の適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、上記の制限エンド
ヌクレアーゼによって切断されないｃＤＮＡを検出することができる。そのよう
な実施態様では、６塩基よりも大きいものを認識する適切な第一の制限エンドヌ
クレアーゼは、ＡｓｃＩ、ＢａｅＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ
、ＰｐｕＭＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｐＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、Ｓｇ
ｒＡＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳｗａＩである。４ヌクレオチド配
列を認識する適切な第二の制限エンドヌクレアーゼは、ＭｂｏＩ、ＤｐｎＩＩ、
Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＢｆａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＭｓｅＩ
、ＨｈａＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＭｓｐＩ、ＭａｅＩＩおよびＨｉｎＰ１
Ｉである。ｃＤＮＡの消化の条件は当技術分野で周知で、例えば以下の文献に記載されて
いる：Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Vol.1,
Ch.5,("Enzymes Used in Molecular Cloning")。

【００５２】Ｄ．切断ｃＤＮＡのベクターへの挿入第一および第二の制限エンドヌクレアーゼで切断したｃＤＮＡサンプルを続い
てベクターに挿入する。一般に、適切なベクターは、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレ
アーゼ部位を有するマルチクローニング部位を含む。適切なベクターは、制限エ
ンドヌクレアーゼＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミドｐＢＣＳＫ⁺
である。ベクターはバクテリオファージ特異的プロモーターを含む。典型的には
、プロモーターはＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、またはＴ７プロモー
ターである。好ましいプロモーターはバクテリオファージＴ３プロモーターであ
る。切断したｃＤＮＡは、バクテリオファージ特異的プロモーターに対してアン
チセンス方向でベクターに挿入される。

【００５３】別の好ましい態様では、ベクターは、ＴＳプロモーター、Ｔ７プロモーターお
よびＳＰ６プロモーターから成る群から選ばれる少なくとも１つのバクテリオフ
ァージプロモーターを含む。好ましい実施態様では、ベクターは、配列番号：２
０、配列番号：２１および配列番号：２２から成る群から選ばれるヌクレオチド
配列を有するマルチクローニング部位を含む。好ましいベクターはプラスミドベクターpBluescript(ｐＢＳまたはｐＢＣ）Ｓ
Ｋ⁺（Stratagene）を基礎にするが、これは６５６位から７６４位のヌクレオチ
ド配列の一部分が除去され、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む少なく
とも１１０ヌクレオチド配列で置換されている。この領域（マルチクローニング
部位（ＭＣＳ）と称される）は、ＳａｃＩ部位からＫｐｎＩ部位のヌクレオチド
配列部分に広がっている。

【００５４】適切なプラスミドベクター、例えばｐＢＣＳＫ⁺またはｐＢＳＳＫ⁺（Stratage
ne）を適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、マルチクローニング部位の少な
くとも１００ヌクレオチドを除去した。ｐＢＳＳＫ⁺の場合には、マルチクロー
ニング部位を除去するために適切な制限エンドヌクレアーゼはＳａｃＩおよびＫ
ｐｎＩである。新しいマルチクローニング部位を含む、第一および第二の制限エ
ンドヌクレアーゼによる消化後ＮｏｔＩおよびＣｌａＩに適合する末端を有する
ｃＤＮＡ部分をベクターでクローニングし、適切なプラスミドベクターを生成し
た。新しいマルチクローニング部位を含む好ましいｃＤＮＡ部分は、配列番号：
２０、配列番号：２１および配列番号：２２に示すヌクレオチド配列を有するも
のを含む。ｃＤＮＡクローンは、第二の制限エンドヌクレアーゼ部位の４ヌクレ
オチド配列を認識するただ１つの制限エンドヌクレアーゼで消化して直線化する
。

【００５５】好ましいプラスミドベクター（ここではｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１と称する）は
、配列番号：２０のＭＣＳを含む。第二の制限エンドヌクレアーゼと直線化制限
エンドヌクレアーゼのペアはそれぞれ、ＭｓｐＩとＳｍａＩ；ＨｉｎＰ１ＩとＮ
ａｒＩ；ＴａｑＩとＸｈｏＩ；ＭａｅＩＩとＡａｔＩＩである。別の好ましいプラスミドベクター（ここではｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ２と称され
る）は配列番号：２１のＮＣＳを含み、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１について上記で
述べたように調製した。ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ２の場合、第二の制限エンドヌク
レアーゼと直線化制限エンドヌクレアーゼのペアはそれぞれ、ＭｓｐＩとＳｍａ
Ｉ；ＨｉｎＰ１ＩとＮａｒＩ；およびＴａｑとＸｈｏＩである。別の好ましいプラスミドベクター（ここではｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ３と称され
る）は配列番号：２２のＮＣＳを含む。第二の制限エンドヌクレアーゼと直線化
制限エンドヌクレアーゼのペアはそれぞれ、ＭｓｐＩとＳｍａＩ；ＨｉｎＰ１Ｉ
とＮａｒＩ；ＴａｑとＸｈｏＩ；ＭａｅＩＩとＡａｔＩＩである。

【００５６】好ましい実施態様では、ベクターは、第一と第二のベクター制限エンドヌクレ
アーゼ部位との間に内部ベクター充填配列制限エンドヌクレアーゼ部位を含むベ
クター充填配列を含む。そのような実施態様の１つでは、直線化工程は、ベクタ
ーを内部ベクター充填配列制限エンドヌクレアーゼ部位で切断する制限エンドヌ
クレアーゼでベクターを消化することを含む。そのような実施態様の別の態様で
は、直線化工程で用いられる制限エンドヌクレアーゼはまた、内部ベクター充填
配列制限エンドヌクレアーゼ部位でベクターを切断する。Ｅ．適切なホスト細胞の形質転換続いて、切断ＤＮＡを挿入したベクターを用い、挿入物含有ベクターで効率的
に形質転換またはトランスフェクトできる適切なホスト細胞を形質転換する。ク
ローニングに適したホスト細胞は、例えば以下の文献に記載されている：Sambro
ok et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(上掲書）。典型的には
ホスト細胞は原核細胞である。特に適切なホスト細胞は大腸菌株である。適切な
大腸菌株はＭＣ１０６１である。好ましくは、挿入物を含むクローンの割合をＸ
−ｇａｌプレートで青色クローンと白色クローンの相対百分率から求めることが
できるように、少量の部分標本を用いて大腸菌株XL1-Blueもまた形質転換する。
典型的には５ｘ１０⁵リコンビナントを越えるライブラリーのみが許容される。

【００５７】Ｆ．直線化フラグメントの生成続いて、プラスミド調製物（典型的にはミニプレップとして）をｃＤＮＡライ
ブラリーの各々から作製する。その後、直線化フラグメントを少なくとも１つの
制限エンドヌクレアーゼによる消化により作製する。ある実施態様では、ベクターはプラスミドｐＢＣＳＫ⁺で、ＭｓｐＩが第二の
制限エンドヌクレアーゼとして、さらに直線化制限エンドヌクレアーゼとして用
いられる。別の実施態様では、ベクターはプラスミドｐＢＣＳＫ⁺で、第二の制限エンド
ヌクレアーゼは、ＭｓｐＩ、ＭａｅＩＩ、ＴａｑＩおよびＨｉｎＰ１Ｉから成る
群から選ばれ、さらに直線化は、ＳｍａＩによる第一の消化、続いてＫｐｎＩお
よびＡｐａＩの混合物による第二の消化によって達成される。他の実施態様では、ベクターは、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧ
Ｔ２およびｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ３から成る群から選ばれる。そのような実施態
様では、適切な酵素の組合せは、第二の制限エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩで、
直線化工程で用いられる制限エンドヌクレアーゼがＳｍａＩで提供される。別の
適切な組合せは、第二の制限エンドヌクレアーゼがＴａｑＩで、直線化工程で用
いられる制限エンドヌクレアーゼがＸｈｏＩで提供される。さらに適切な組合せ
は、第二の制限エンドヌクレアーゼがＨｉｎＰ１Ｉで、直線化工程で用いられる
制限エンドヌクレアーゼがＮａｒＩで提供される。さらに別の適切な組合せは、
第二の制限エンドヌクレアーゼがＭａｅＩＩで、直線化工程で用いられる制限エ
ンドヌクレアーゼがＡａｔＩＩで提供される。一般に、直線化工程では、下記の
項Ｆで詳細に説明するように、ｃＤＮＡ挿入物を欠くいずれのプラスミドベクタ
ーも、ＮｏｔＩ部位とＣｌａＩ部位との間のＳｍａＩ、ＮａｒＩ、ＸｈｏＩまた
はＡａｔＩＩの６ヌクレオチド認識部位（図３Ａの下線部）で切断された。対照
的に、挿入物を含むプラスミドは、ＣｌａＩ部位の３'側で見いだされるＳｍａ
Ｉ、ＮａｒＩ、ＸｈｏＩまたはＡａｔＩＩの６ヌクレオチド認識部位で切断され
るであろう。

【００５８】別の実施態様では、クローン化挿入物の各々の部分標本を２つのプールに分け
、そのうちの一方をＸｈｏＩで他方をＳａｌＩで切断する。直線化したプラスミ
ドプールを一緒にし混合してから三等分する。この三等分をＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂ
ａｍＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。この工程は注意して見守る必要がある。な
ぜならば、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにより挿入物のアンチセンス転写物を生成す
るためには、フランキング配列内で切断するが挿入物自体を切断しない制限エン
ドヌクレアーゼで先ず初めに鋳型を切断しなければならないからである。３'−
末端のＭｓｐＩフラグメントの平均の長さが２５６塩基対であるとすると、挿入
物の約６％が６ヌクレオチド配列を認識する任意の酵素に対する部位を含む。た
だ１つの酵素が用いられるならば、そのような挿入物は更なる解析で失われるで
あろう。したがって、２つの酵素のいずれか一方のみが半分の反応物の各々の直
線化に用いられるように前記反応物を分割することが好ましい。

【００５９】両方の酵素のための部位を含む挿入物（約０．４％）のみがサンプルの両半分
から失われる。同様に、各ｃＲＮＡサンプルには様々な程度で挿入物非含有プラ
スミドが夾雑している。これは、プライマーに対する弁別的な競合のために、そ
の後のポリメラーゼ連鎖反応効率に変動をもたらすであろう。ｐＢＣＳＫ⁺のＣ
ｌａＩとＮｏｔＩ部位との間にただ１つの標的部位をもつ３つの酵素のうちの１
つで三等分サンプルを切断することによって、ＰＣＲ工程で究極の５'プライマ
ーのための結合部位を含む転写物が挿入物非含有プラスミドから生じることが排
除される。三等分の反応物に３つの酵素を使用することによって、挿入物非含有
配列が夾雑する可能性の問題が解決され、一方、当該酵素のための部位をも含む
挿入物含有配列の使用も減らすことができる。ただ１つの酵素だけを使用すると
した場合、挿入物含有配列の約１０％が失われるであろうが、この可能性は約０
．１％まで減少する。なぜならば、３つの全ての酵素によって切断されない配列
のみが失われることになるからである。

【００６０】Ｇ．ｃＲＮＡの作製次の工程は、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物の作製である。こ
れは、バクテリオファージ特異的プロモーターから転写を開始することができる
ＲＮＡポリメラーゼとともに直線化フラグメントを保温することによって実施さ
れる。典型的には、上記で考察したように、プロモーターはＴ３プロモーターで
、ポリメラーゼはしたがってＴ３ＲＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは、
前記直線化フラグメントおよび４種のリボヌクレオシド三燐酸とともに合成に適
した条件下で保温される。

【００６１】Ｈ．第一鎖ｃＤＮＡの転写好ましい実施態様では、ｃＲＮＡ調製物は多くのサブプールに分割されるが、
分割数は５’−ＲＴプライマーの調整残基の数に左右される。続いて、マロニー
ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（Life Technologies)を用いて、
第一鎖ｃＤＮＡを各サブプールから転写する。この逆転写酵素では、アニーリン
グは４２℃で実施され、転写反応は４２℃で実施される。各サブプールの反応は
、以下のように規定される５'−ＲＴプライマーの１つを使用する：前記５'−Ｒ
Ｔプライマーは、−Ｎ_xから成る３'−末端をもち（式中"Ｎ"は４種のデオキシリ
ボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つで、"ｘ"は１から５の整数）、長さが
１５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フランキングベクター配列と相補的で
５'−ＲＴプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入物特異的ヌクレオチドの中の"ｘ
"と同じ数のヌクレオチドまで伸長しており、ここで、前記５'−ＲＴプライマー
のうちの異なる１つが異なるサブプールで用いられ、"ｘ"＝１の場合はサブプー
ルは４つで、"ｘ"＝２の場合はサブプールは１６で、"ｘ"＝３の場合はサブプー
ルは６４で、"ｘ"＝４の場合はサブプールは２５６で、"ｘ"＝５の場合はサブプ
ールは１０２４である。

【００６２】別の実施態様では、ｃＲＮＡ調製物は１６のサブプールに分割される。続いて
、各サブプールから熱耐性逆転写酵素および下記のような５'−ＲＴプライマー
を用いて第一鎖ｃＤＮＡを転写する。好ましい転写酵素は、ｒＴｔｈとして知ら
れているテルムス＝テルモフィルス（Thermus thermophilus）由来のリコンビナ
ント逆転写酵素（Perkin-Elmer社（Norwalk, CT)から入手可能）である。本酵素
はＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとしても知られている。この逆転写酵素を用い
、アニーリングは６０℃で転写反応は７０℃で実施される。これは、５'−ＲＴ
プライマーとｃＲＮＡとの間の高フィデリティー相補性を促進する。使用される
５'−ＲＴプライマーは１６のプライマーの１つで、その末端は−Ｎ−Ｎ（式中
Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つ）で、この５'
−ＲＴプライマーは長さが少なくとも１５ヌクレオチドで、バクテリオファージ
特異的プロモーターの３'−末端と配列が一致し、ｃＲＮＡの少なくとも最初の
２つのヌクレオチドにまで伸長している。

【００６３】バクテリオファージ特異的プロモーターがＴ３プロモーターの場合は、５'−
ＲＴプライマーは、典型的には以下の配列を有する：Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）、Ａ−Ｇ−
Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列
番号：５）、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：６）、Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ（配列番号：９）、Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：７）、Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１３）、Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１４
）、Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列
番号：１５）またはＡ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ
−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２４）。

【００６４】Ｉ．ＰＣＲ反応次の工程は、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型としてサブプールの各々の転写生成
物を下記のようなプライマーとともに使用して、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラ
グメントを生成することである。一般に、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型としてサブプールの各々の第一鎖ｃＤＮ
Ａ転写生成物が、３'−ＰＣＲプライマーおよび５'−ＰＣＲプライマーとともに
用いられ、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを生成する。３'−ＰＣＲプ
ライマーは、典型的には長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに、第一の制
限エンドヌクレアーゼ部位とバクテリオファージ特異的プロモーターによる転写
開始部位を規定する部位との間の３'フランキングベクター配列に相補的である
。５'−ＰＣＲプライマーは、−Ｎ_x−Ｎ_yから成る３'末端を有し（式中、"Ｎ"お
よび"ｘ"は上記の逆転写工程の場合と同じで、−Ｎ_xは、そのサブプールについ
て第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた５'−ＲＴプライマーの場合と同じ配列で、"ｙ
"は、ｘ＋ｙが３、４、５および６から成る群から選ばれる整数と等しい完全な
整数）、長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フランキングベクター
配列と相補的で５'−ＰＣＲプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入物特異的ヌク
レオチドの中の"ｘ＋ｙ"と同じ数のヌクレオチドにまで伸長している。

【００６５】別の実施態様では、用いられるプライマーは以下のとおりである：（ａ）ベク
ター中のｃＤＮＡサンプルの挿入部位に隣接するベクター内の配列とその配列が
一致する３'−ＰＣＲプライマー；および（ｂ）以下から成る群から選ばれる５'
−ＰＣＲプライマー：（ｉ）そのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用
いられた５'−ＲＴプライマー；（ｉｉ）その３'末端でさらに別の１つの残基−
Ｎが伸長されている、そのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いられ
た５'−ＲＴプライマー（ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい）；
（ｉｉｉ）その３'末端でさらに別の２つの残基−Ｎ−Ｎが伸長されている、そ
のサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いられた５'−ＲＴプライマー
（ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれでもよい）。

【００６６】ベクターがＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミドｐＢＣＳＫ-の場
合は、適切な３'−ＰＣＲプライマーは、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−（配列番号
：４）である。別の実施態様では、ベクターがＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断さ
れたプラスミドｐＢＣＳＫ⁺の場合は、適切な３'−ＰＣＲプライマーは、Ａ−Ａ
−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ（配列番号：８）
である。別の実施態様では、適切な３'−ＰＣＲプライマーは、Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（配列番号：１８）およびＧ−
Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ（配列番号：１
９）である。バクテリオファージ特異的プロモーターがＴ３プロモーターの場合
は、適切な５'−ＰＣＲプライマーは、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：５）、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号
：６）、Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（
配列番号：１３）、Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ−Ｎ（配列番号：１４）、Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１５）、またはＡ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１６）。

【００６７】典型的にはＰＣＲは、９４℃１５秒の変性、５０℃−６２℃１５秒のアニーリ
ング、および７２℃３０秒の合成によるＰＣＲプログラムを用い、パーキン＝エ
ルマー（Perkin-Elmer）９６００装置（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)で³⁵ Ｓ−ｄＡＴＰの存在下で実施する。アニーリングの温度は、当技術分野で周知の
原理を用い個々のプライマーのヌクレオチド配列について最適化される。高温の
アニーリング工程は、その３'末端における５'プライマーによる偶発的な誤作動
プライミングを最小限にし、高フィデリティー複製を促進する。

【００６８】また別にはＰＣＲ増幅は、³²Ｐ−標識または³³Ｐ−標識デオキシリボヌクレオ
シド三燐酸（例えば〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰまたは〔³³Ｐ〕ｄＣＴＰ）の存在下で実施
できる。しかしながら、一般には最高の解析のためには³⁵Ｓ−標識デオキシリボ
ヌクレシド三燐酸を用いるのが好ましい。非放射性標識を含む他の検出方法もま
た用いることができる。

【００６９】選択した５'−ＰＣＲに応じて一連の反応で多数の生成物プールが生じる。上
記で考察したように、５'−ＰＣＲプライマーは、−Ｎ_x−Ｎ_yから成る３'末端を
有し（式中、"Ｎ"および"ｘ"は上記の逆転写工程の場合と同じで、−Ｎ_xは、そ
のサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いられた５'−ＲＴプライマー
と同じ配列で、"ｙ"は、ｘ＋ｙが３、４、５および６から成る群から選ばれる整
数と等しい完全な整数）、長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フラ
ンキングベクター配列と相補的で５'−ＰＣＲプライマーの相補性がｃＲＮＡの
挿入物特異的ヌクレオチドの中の"ｘ＋ｙ"と同じ数のヌクレオチドにまで伸長し
ている。サブプールの数はｘ＋ｙによって決定される。すなわち、ｘ＋ｙ＝３の
場合はサブプールは６４で、ｘ＋ｙ＝４の場合はサブプールは２５６で、ｘ＋ｙ
＝５の場合はサブプールは１０２４で、ｘ＋ｙ＝６の場合はサブプールは４０９
６である。本発明の工程は、さらに別のヌクレオチドをその３'末端に付加した、より長
いＰＣＲプライマーセットを用いることによって延長することができる。例えば
、−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎの３'−末端をもつ５'−ＰＣＲプライマーは１０２４の
生成物を生じ、−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎの３'−末端をもつプライマーは４０
９６の生成物を生じるであろう。

【００７０】Ｊ．電気泳動続いて、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを電気泳動によって分離し、
サンプル中に存在するｍＲＮＡの３'−末端を表すバンドを表示する。ＰＣＲ増幅フラグメントを分離するための電気泳動技術は周知で、ここでさら
に詳しく述べる必要はないであろう。対応する生成物は、変性ＤＮＡシークェン
シングゲルで分離し、オートラジオグラフィーによって可視化する。本明細書で
述べた特定のベクター系の場合、最初の９０塩基対が底から流れ出るようにゲル
を泳動させる。なぜならば、ベクター由来配列は５５塩基対だけ長さが増加して
いるからである。この数は他のベクター系が用いられる場合には変動し、したが
って、ベクター由来配列がゲルの底から流出するように、用いられるベクターの
配列を考慮しながら適切な電気泳動条件を決定することができる。典型的には、
各反応物を別々の変性ゲル上で泳動させ少なくとも２つのゲルを用いる。好まし
くは、一連の反応を平行して（例えば異なる組織から得て）実施し、同じプライ
マーを用いた全ての反応を同じゲルで解析できる。相当な数の反応を同じゲル上
で解析できる。典型的には、３０反応を同じゲルで解析し比較できる。下記で考
察するように、これは組織特異的ｍＲＮＡの決定方法を提供する。

【００７１】典型的には、オートラジオグラフィーを使用して、分解したｃＤＮＡ種を検出
する。しかしながら、その他の検出方法、例えばホスホイメージング（phosphor
imaging）又は蛍光等を使用することができ、特定の用途において高感度を提供
してもよい。

【００７２】模式図に従えば、ｍＲＮＡサンプルの各々から生成されたｃＤＮＡライブラリ
ーは、出発材料のｍＲＮＡ中の全ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡの最も遠位部位のＭｓｐ
Ｉ切断部位からポリ（Ａ）テールの開始部までの３'−末端最端部のコピーを、
当該ｍＲＮＡの最初の相対濃度にほぼ一致して含む。各々のｍＲＮＡ種について
挿入物の両端は配列によって正確に表されているので、それらの長さは各々の種
について均一で、ｍＲＮＡの供給組織に関係なく、後でそれらをゲル上で個々の
バンドとして可視化することを可能にする。

【００７３】ｃＤＮＡを精査するために延長プライマーによる連続工程を使用することは、
本質的に重複ＰＣＲ（nested PCR）と同様に機能する。これらの工程は品質制御
を促進し、標的以外のｃＤＮＡの増幅から生じえるバックグラウンドを減少させ
る。好ましい実施態様では、第二の逆転写工程では各ｃＲＮＡサンプルが４つの
サブプールにさらに分割され、ｐＢＣＳＫ⁺由来の配列とアニールするが非再生
ＭｓｐＩ部位のＣＧＧを越えて伸長し、かつ挿入物の１つのヌクレオチド（−Ｎ
）を含むプライマーが用いられる。この工程によって、潜在的に５００００から
１０００００ｍＲＮＡを有する出発集団は各々が約１２５００から２５０００の
ｍＲＮＡを含む４つのサブプールに分断される。後続のＰＣＲ工程の連続的な繰
り返しに際して（この工程で放射能標識が生成物のオートラジオグラフによる可
視化のためにそれらに取り込まれる）、前記プールは、挿入物の２−６ヌクレオ
チドを含む徐々に長くなる５'−ＰＣＲプライマーを用いて４つまたは１６のサ
ブプールに分割されることによってさらに分断される。

【００７４】高温アニーリングによる第一の強力な要求によって、逆転写工程で高フィデリ
ティーをもつ３'−末端が当該Ｎ位でマッチし、さらに、その後続いてそのよう
な高フィデリティーマッチングを−Ｎ−Ｎ、−Ｎ−Ｎ−Ｎ、−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ、
−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ、または−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎという繰り返しで再び
強力に要求して、−Ｎ位のミスマッチプライミングから生じるブリードスルーを
劇的に減少させる。ｃＲＮＡ調製物を４つのサブプールに分割し、さらに各サブプールから第一鎖
ｃＤＮＡを転写することで開始する方法に含まれる工程は、ｍＲＮＡ集団の３'
−末端を表すアンチセンスｃＲＮＡプールの各々のｃＲＮＡに一致するｍＲＮＡ
の配列特異的同時同定の方法として別々に実施することができる。

【００７５】ＩＩ．ｍＲＮＡパターン表示方法の応用組織内でのｍＲＮＡ発現パターンの検出およびゲル電気泳動によるそれらパタ
ーンの解析のために上記で述べた方法は様々に応用される。これらの応用の１つ
は、生理学的または病理学的変化に付随する、組織内ｍＲＮＡ発現パターンの変
化を検出する場合の応用である。この方法は一般に以下の工程を含む：（１）生理学的または病理学的変化を受けていない第一の組織サンプルを入手
し；（２）第一のサンプル中に存在するｍＲＮＡの３'−末端を表わすバンドの第
一のディスプレーを作製するために、上記のようにｍＲＮＡ集団の３'−末端を
表すアンチセンスｃＲＮＡプールのメンバーに一致するｍＲＮＡの配列特異的同
時同定の方法を実施して、第一の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定し
；（３）生理学的または病理学的変化を受けた第二の組織サンプルを入手し；（４）第二のサンプル中に存在するｍＲＮＡの３'−末端を表わすバンドの第
二のディスプレーを作製するために、上記のようにｍＲＮＡ集団の３'−末端を
表すアンチセンスｃＲＮＡプールのメンバーに一致するｍＲＮＡの配列特異的同
時同定の方法を実施して、第二の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定し
；（５）第一および第二のディスプレーを比較して、組織中のｍＲＮＡ発現パタ
ーンに対する生理学的または病理学的変化の影響を決定する。

【００７６】典型的にはこの比較は１枚のゲルの隣合うレーンで実施される。典型的には、配列特異的生成物の表示の定量化により生成したデータを含むデ
ータベースを、適切なコンピュータハードウェア及びコンピュータソフトウェア
を使用して構築し、維持する。好ましくは、そのようなデータベースは、配列の
関連性、遺伝子地図、細胞における分布及び遺伝子機能に関連すると考えられる
その他全ての情報を更に含んでいる。前記組織は中枢神経系に由来するであろう。特にそれは、網膜、大脳皮質、嗅
球、視床、視床下部、下垂体前葉、下垂体後葉、海馬、側坐核、扁桃、線条、小
脳、脳幹、交叉上核、または脊髄である中枢神経系内の構造物に由来するであろ
う。前記組織が中枢神経系に由来する場合、前記の生理学的または病理学的変化
は、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血、アルコール中毒、薬物中毒、精
神分裂病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、うつ病、および双極性躁うつ病
のいずれでもよい。また別には、本発明の方法は、日周期の変動、加齢または長
期の相乗作用（後者は海馬に影響を与える）の研究に用いることができる。さら
にまた、中枢神経系内の特定の構造物で生成されるｍＲＮＡ種については、本方
法は、複雑な行動、例えば学習および記憶、感情、薬物中毒、グルタメート神経
毒性、飼育行動、嗅覚、ウイルス感染、視覚、および運動異常に関与することが
知られている脳領域の研究に用いることができる。

【００７７】本方法はまた、個体に薬物および／または毒素を投与した結果を、薬物または
毒素の投与前後のｍＲＮＡパターンを比較することによって調べるために用いる
ことができる。電気ショック療法の結果もまた研究できる。また別に、前記組織は、心脈管系、肺系、消化系、末梢神経系、肝、腎、骨格
筋および生殖系を含む器官もしくは器官系から、または身体の他の任意の器官ま
たは器官系から得ることができる。例えば、肝、心、腎または骨格筋のｍＲＮＡ
パターンを調べることができる。さらにまた、いずれの組織についてもサンプル
を多様な時間に採取し、ｍＲＮＡ発現に対する日周期の影響を見つけることがで
きる。したがって、この方法は、具体的な機能パターンまたは機能不全パターン
における個々のｍＲＮＡの関与を明らかにすることができる。

【００７８】ｍＲＮＡの３'−末端を表すアンチセンスｃＲＮＡプールは上記セクションＩ
で述べた（１）−（４）の工程によって作製することができる。同様に、本発明のｍＲＮＡ解析方法は、薬剤の副作用をスクリーニングする方
法の一部分として用いることができる。一般にそのような方法は以下を含む：（１）既知の生理学的機能をもつ化合物で処理した器官から第一の組織サンプ
ルを入手し；（２）第一のサンプル中に存在するｍＲＮＡの３'−末端を表わすバンドの第
一のディスプレーを作製するために、上記のように、ｍＲＮＡ集団の３'−末端
を表すアンチセンスｃＲＮＡプールのメンバーに一致するｍＲＮＡの配列特異的
同時同定の方法を実施して、第一の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定
し；（３）副作用についてスクリーニングするべき化合物で処理した器官から第二
の組織サンプルを入手し；（４）第二のサンプル中に存在するｍＲＮＡの３'−末端を表わすバンドの第
二のディスプレーを作製するために、上記のように、ｍＲＮＡ集団の３'−末端
を表すアンチセンスｃＲＮＡプールのメンバーに一致するｍＲＮＡの配列特異的
同時同定の方法を実施して、第二の組織サンプルのｍＲＮＡ発現パターンを決定
し；（５）第一および第二のディスプレーを比較して、その発現が既知の化合物に
よって影響されないが、スクリーニングしている薬剤の作用と既知化合物の作用
との間で相違を示すｍＲＮＡ、したがって副作用を示すｍＲＮＡの存在を検出す
る。

【００７９】特にこの方法は、中枢神経系に影響を与える薬剤、例えば抗うつ剤、神経弛緩
剤、精神安定剤、抗痙攣薬、モノアミンオキシダーゼ抑制物質および刺激物質に
ついて用いることができる。しかしながらこの方法は、実際のところ、特定の組
織でのｍＲＮＡ発現に影響を与える可能性があるいずれの薬剤についても用いる
ことができる。例えば、抗パーキンソン病薬、骨格筋弛緩薬、鎮痛剤、局所麻酔
剤、コリン作動薬、抗痙攣薬、ステロイド、非ステロイド系抗炎症剤、抗ウイル
ス剤、またはｍＲＮＡ発現に影響を与える能力をもつ他の任意の薬剤のｍＲＮＡ
発現に対する影響を研究でき、さらに個々の組織または構造物における影響を決
定することができる。

【００８０】さらにまた、本発明の方法は、表示されるｍＲＮＡ種の３'−末端の配列を入
手しようとする場合に応用される。一般にそのような配列を得る方法は以下を含
む：（１）サンプル中に存在するｍＲＮＡの３'−末端を表すバンドが表示されて
いる電気泳動物からｍＲＮＡに一致する少なくとも１つのｃＤＮＡを溶出させ；（２）ポリメラーゼ連鎖反応で溶出ｃＤＮＡを増幅し；（３）前記増幅ｃＤＮＡをプラスミドでクローニングし；（４）前記プラスミドからクローン化ＤＮＡに一致するＤＮＡを生成し；さら
に（５）クローン化ｃＤＮＡの配列を決定する。

【００８１】切り出したｃＤＮＡは先にＰＣＲ工程で用いたプライマーで増幅することがで
きる。続いて、ｃＤＮＡをｐＣＲＩＩ（Invitorogen, San Diego, CA）でＴＡク
ローニングおよびベクターへの連結によってクローニングすることができる。さ
らに、ＤＮＡのミニプレップを標準的な技術によってサブクローンから作製し、
一部分を変性させ、さらにサンガー（Sanger）のジデオキシチェーンターミネー
ター法による自動化配列決定のために２つの部分標本に分割する。市販の配列決
定装置、例えばＡＢＩシーケンサーを自動化配列決定のために用いることができ
る。これによって、長さが５０−５００ｂｐの研究されているほとんどのｃＤＮ
Ａのフラグメントの全長にわたってその相補配列の決定が可能である。

【００８２】続いてこれらの部分配列を用いて、例えばＧｅｎＢａｎｋのようなゲノムデー
タベースをＢＬＡＳＴＩＮおよびＢＬＡＳＴＸのようなソフトを使って調べ、配
列同一性および類似性を見つけることができる。本方法はｍＲＮＡの３'−末端
のみから配列を作製するので、開放読み枠（ＯＲＦ）は時折見いだされるだけで
あろう（脳ｍＲＮＡの３'−非翻訳領域の平均的な長さは１３００ヌクレオチド
より長い（J.G. Sutcliffe, 上掲書))。潜在的なＯＲＦはシグナチャー蛋白質モ
チーフについて調べることができる。

【００８３】続いて得られたｃＤＮＡ配列を用いて半定量ＰＣＲのためのプライマー対をデ
ザインし、組織での発現パターンを確認することができる。更なる分析のために
、選択した生成物を用いて完全長のｃＤＮＡクローンを単離してもよい。プライ
マー対をゲノムＤＮＡのＳＳＣＲ−ＰＣＲ（一本鎖構造多形性−ＰＣＲ（single
strand conformation polymorphism-PCR)の頭文字を取って）に用いてもよい。
例えば、既に連関が決定されているマーカーとの各ＰＣＲ生成物の連結を決定す
るために種間戻し交配マウス系統からそのような増幅を実施できる。これによっ
て新しい遺伝子がマッピングされ、マッピングされたマウスの変異体遺伝子座と
相同なヒト疾患の遺伝子についての候補遺伝子の供給源として役立つであろう。
ＳＳＣＰ−ＰＣＲは、ＰＣＲを介して小さな（１００−２００ｂｐ）セグメント
を増幅させる合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いる（M. Orita et al., "
Detection of Polymorphism of Human DNA by Gel Electrophoresis as Single-
Strand Conformation Polymorphisms", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2766-
2770(1989); M. Orita et al., "Rapid and Sensitive Detection of Point Mut
ations in DNA polymorphisms Using the Polymerase Chain Reaction", Genomi
cs 5:874-879(1989)）。

【００８４】ノザンブロットまたはin situハイブリダイゼーションをプローブで精査する
ために、切り出したｃＤＮＡフラグメントを当技術分野で周知の技術によって放
射能標識し、ｍＲＮＡの分布を実証し、対応する完全長のｍＲＮＡのサイズおよ
び量を知ることができる。このプローブを用いて、より信頼できる完全な配列を
決定するためのクローンを単離するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グすることができる。この標識プローブはまた他のいずれの目的、例えばin vit
roでの発現の研究にも用いることができる。

【００８５】ＩＩＩ．プライマーの縮重混合物パネル本発明の別の特徴は、本発明の実施に適したプライマーパネルおよび縮重プラ
イマー混合物である。これらは以下を含む：（１）以下の配列の１６のプライマーを含む５’−ＲＴプライマーパネル：Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配
列番号：３）、式中、Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴ
のうちの１つで；（２）以下の配列の６４のプライマーを含む５’−ＰＣＲプライマーパネル：
Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−
Ｎ（配列番号：５）、式中、Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇま
たはＴのうちの１つで；（３）以下の配列の２５６のプライマーを含む５’−ＰＣＲプライマーパネル
：Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ−Ｎ（配列番号：６）、式中、Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ
、ＧまたはＴのうちの１つで；（４）以下の配列の１０２４のプライマーを含む５’−ＰＣＲプライマーパネ
ル：Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２４）、式中、Ｎは４種のデオキシリボヌクレオチ
ドＡ、Ｃ、ＧまたはＴのうちの１つで；さらに（５）以下の配列の４０９６のプライマーを含む５’−ＰＣＲプライマーパネ
ル：Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２５）、式中、Ｎは４種のデオキシリボヌクレ
オチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴのうちの１つである；（６）以下の配列の１２のプライマーを含むアンカープライマーパネル：Ａ−
Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）、式中、ＶはＡ、Ｃ
およびＧから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ
またはＴから成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで；（７）以下の配列の３つのプライマーを含むアンカープライマーのパネル：A-
A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-
T-T-T-T-T-T-T-T-V(配列番号: 23)、式中、ＶはＡ、Ｃ及びＧからなる群より選
ばれるデオキシリボヌクレオチドである；（８）各々が以下の配列を有する４つの異なるオリゴヌクレオチドを含む５’
−ＲＴプライマーのパネル：G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (配列番号: 9)
、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのうちの１つで
ある；（９）各々が以下の配列を有する１６の異なるオリゴヌクレオチドを含む５’
−ＲＴプライマーのパネル：G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (配列番号: 7)
、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのうちの１つで
ある；（１０）各々が以下の配列を有する６４の異なるオリゴヌクレオチドを含む５
’−ＰＣＲプライマーのパネル：T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (配列番号: 13)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのうちの１
つである；（１１）各々が以下の配列を有する２５６の異なるオリゴヌクレオチドを含む
５’−ＰＣＲプライマーのパネル： C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (配列番
号: 14)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのうち
の１つである；（１２）各々が以下の配列を有する１０２４の異なるオリゴヌクレオチドを含
む５’−ＰＣＲプライマーのパネル：G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (配列
番号: 15)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのう
ちの１つである；（１３）各々が以下の配列を有する４０９６の異なるオリゴヌクレオチドを含
む５’−ＰＣＲプライマーのパネル：A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (配列
番号: 16)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴのう
ちの１つである；（１４）各々が以下の配列を有する４つの異なるオリゴヌクレオチドを含む５
’−ＲＴプライマーのパネル：C-T-T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N (配
列番号: 10)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの
うちの１つである；（１５）各々が以下の配列を有する１６の異なるオリゴヌクレオチドを含む５
’−ＲＴプライマーのパネル：T-T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N (配
列番号: 11)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの
うちの１つである；（１６）各々が以下の配列を有する６４の異なるオリゴヌクレオチドを含む５
’−ＲＴプライマーのパネル：T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N (配
列番号: 12)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの
うちの１つである；（１７）各々が以下の配列を有する２５６の異なるオリゴヌクレオチドを含む
５’−ＰＣＲプライマーのパネル：C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N
(配列番号: 17)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又はＴ
のうちの１つである；（１８）各々が以下の配列を有する１０２４の異なるオリゴヌクレオチドを含
む５’−ＰＣＲプライマーのパネル：A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N-
N (配列番号: 26)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又は
Ｔのうちの１つである；（１９）各々が以下の配列を有する４０９６の異なるオリゴヌクレオチドを含
む５’−ＰＣＲプライマーのパネル：G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-
N (配列番号: 27)、式中、Ｎは４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ又は
Ｔのうちの１つである；（２０）以下の配列の３つのプライマーの混合物を含むアンカープライマーの
縮重混合物：A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-
T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (配列番号: 23)、式中、ＶはＡ、Ｃ及びＧか
らなる群より選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、３つのプライマーの各
々は概ね等モル量で存在する；更に、（２１）以下の配列の１２のプライマーの混合物を含むアンカープライマーの
縮重混合物：A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-
T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (配列番号: 2)、式中、ＶはＡ、Ｃ及びＧ
からなる群より選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ及
びＴからなる群より選ばれるデオキシリボヌクレオチドであり、１２のプライマ
ーの各々は概ね等モル量で存在する。

【００８６】実施例本発明は以下の実施例によって詳述するが、これらの実施例は説明を目的とし
ており、本発明を限定しようとするものではない。実施例異なる濃度の脳の既知ｍＲＮＡの配列に一致するプライマーを用いる脳ｍＲＮ
Ａの解析本発明の方法の有効性を証明するために、例えば以下の異なる濃度の既知脳ｍ
ＲＮＡの配列と一致する５'プライマーで、さらにそれらの３'−末端から２ヌク
レオチドが伸長している５'−ＲＴプライマーを用いて本方法を適用し、上記の
ようにして得た大脳皮質、線条、小脳および肝ＲＮＡから構築したライブラリー
から生成したｃＤＮＡを比較した：約０．５％の濃度のニューロン特異的エノラ
ーゼ（ＮＳＥ）（S. Forss-Peter et al., "Neuron-Specific Enolase: Complet
e Structure of Rat mRNA, Multiple Transcriptional Start Sites and Eviden
ce for Translational Control", J. Neurosci. Res. 16:141-156(1986))、約０
．０１％のＲＣ３および０．００１％のソマトスタチン（G.H. Travis & J.G. S
utcliffe, "Phenol Emulsion-Enhanced DNA-Driven Subtractive cDNA Cloning:
Isolation of Low-Abundance Monkey Cortex-Specific mRNAs", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 85:1696-1700(1988)）。

【００８７】個々の任意のＲＮＡサンプルのオートラジオグラフィーでの短時間露光で、５
０−１００バンドが得られた。二重に作製したサンプルでバンドは完全に再現性
を示した。バンドの約２／３が脳と肝のサンプルで異なっていた。このサンプル
は既知の脳特異的ｍＲＮＡに一致する正確な長さのバンドを含んでおり、これは
、ゲルからバンドを切り出して増幅し、配列決定を実施して確認された。いずれ
の５’−ＲＴプライマーを用いた場合にも、種々の脳領域のサンプル間で異なる
数バンドが存在した。ただしいくつかのバンドでは濃度が異なっていた。

【００８８】ＮＳＥ（比較的豊富なｍＲＮＡ種）に一致するバンドは、肝サンプルには出現
しなかったが脳サンプルの全てに出現した。しかしながら、合成５'−プライマ
ーで３'−末端の４塩基配列−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ内の最後の３つの１ヌクレオチド
のいずれかが変更されたときは観察されなかった。最初のＮが変更されたとき、
少量のブリードスルーが検出される。既知の種については、オートラジオグラフ
ィーのシグナル濃度はｍＲＮＡ量に対してほぼ比例しており、１０5以上のポリ
（Ａ）⁺ＲＮＡで１割の濃度のｍＲＮＡは常に目で見ることが可能であるが、よ
り濃度の高いバンドの近くに泳動したｃＤＮＡは曖昧になるという問題が時に存
在する。

【００８９】これらのデータのサンプルは図２に示されている。左の５ゲルレーンでは、皮
質ｃＲＮＡが以下の５'−ＲＴプライマーによる逆転写のための基質であった：
Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（
配列番号：３）、式中−Ｎ−Ｎは−Ｃ−Ｔ（プライマー１１８）、−Ｇ−Ｔ（プ
ライマー１１６）または−Ｃ−Ｇ（プライマー１０６）。ＰＣＲ増幅には、図２
で示したように以下の５'−ＰＣＲプライマーが用いられた：Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号
：６）、式中、Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎは−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−（プライマー１２８）、−
Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ（プライマー１２７）、−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ（プライマー１１１）
、−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ（プライマー１３４）、および−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ（プライマ
ー１３０）。プライマー１１８および１１１は、ＮＳＥｍＲＮＡ配列の３'−末
端の最も近くに位置するＭｓｐＩ部位の下流の２ヌクレオチドおよび４ヌクレオ
チド配列とそれぞれマッチする。プライマー１２７は、ＮＳＥ配列と最後（−１
）の位置で、プライマー１２８は最後の次（−２）の位置で、プライマー１０６
および１３０は−３位で、さらにプライマー１１６および１３４は−４位でミス
マッチを示す。プライマー１３４は、ここに示したその他のものよりさらに上流
に２ヌクレオチド伸長していた。したがってそのＰＣＲ生成物は、他のレーンの
生成物に対して２ヌクレオチドだけ長い。

【００９０】各レーンでは、生成物の標識に³²Ｐ−ｄＣＴＰを用い１５分露光で５０−１０
０バンドを見ることができた。これらのバンドは各プライマーペアについて明ら
かに異なっているが、例外は、１１８−１１１バンドのサブセットは、２ヌクレ
オチドのトレーリングで１１６−１３４レーンでより薄く見えるということで、
これは、４つの位置でのブリードスルーを示唆している。１１８−１１１プライマーセットは、別個の皮質（ＣＸ）および肝（ＬＶ）ｃ
ＲＮＡで再度用いられた。皮質のパターンはレーン１１８−１１１のパターンと
同一で、再現性を示した。肝のパターンは大半の種でＣＸと異なっていた。星印
はＮＳＥ生成物の位置を示している。類似のプライマーセットによって、ＲＣ３
およびソマトスタチン（ｓｏｍａｔ）生成物（星印）がＣＸで検出されたが、Ｌ
Ｖレーンでは認められなかった。あるＰＣＲ生成物の相対的なバンドの濃度は同
じプライマーセットを用いたレーン内で比較できるが異なるセットの場合は比較
できない。本実施例は、本発明の方法の利用可能性および再現性、並びに異なるｍＲＮＡ
を解析する能力を示している。さらに、本実施例は、個々のｍＲＮＡの量はオー
トラジオグラフィーシグナルの濃度から概算できることを示している。本アッセ
イは、高濃度および低濃度の両方のｍＲＮＡの同時検出を可能にする。

【００９１】本発明の利点本方法は、以下の場合でその発現が変化する遺伝子の同定に用いることができ
る：神経発生時、形成および再生モデルで、化学的または電気生理学的攻撃（例
えば神経毒性および長期の相乗作用）に対する反応で、さらに行動、ウイルス感
染、薬剤／アルコールに対する反応で、細胞死またはアポプトシスの出現、加齢
、病的状態および他のｍＲＮＡ発現に影響を与える状態。本方法は、神経系での
遺伝子発現の研究について特に有用であるが、本方法は神経系に限定されず、任
意の組織でのｍＲＮＡ発現の研究に用いることができる。本方法は、組織で発現
されるほぼ全てのｍＲＮＡを個別のバンドとしてゲル上に可視化させることがで
き、バンドの濃度は概ね当該ｍＲＮＡの濃度に一致する。

【００９２】本方法は、潜在的に再現性を欠くミスマッチのランダムプライミングに依存せ
ず、したがって高い正確性および再現性を提供するという利点を有する。さらに
また、異なるプライミング事象の結果として、同じｍＲＮＡから生じるが長さが
異なる共存バンドの存在によって発生する複雑性および不正確さを減少させる。
ランダムプライミングを用いる方法では、そのような共存バンドは、豊富なｍＲ
ＮＡ種で発生し、また発生の可能性が高い。本発明ではそのような共存バンドが
回避される。本方法はｍＲＮＡ種について配列特異的情報を提供し、プライマー、プローブ
および他の固有配列の作製に用いることができる。本発明をある種の好ましい実施態様を参考に極めて詳細に開示してきたが、そ
の他の変型も可能である。したがって、添付の請求の範囲は本明細書に含まれる
好ましい実施態様の記載によって制限されない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

本発明の特徴および利点は以下の添付図面を参考に一層理解が容易となろう。

【図１】図１は、プライミング、切断、クローニングおよび増幅の種々のステージを示
す本発明の方法の模式図である。

【図２】図２は、出発材料として肝および脳のｍＲＮＡを用い、脳ｍＲＮＡの既知配列
と一致するいくつかの５'−プライマーをＰＣＲ工程で使用して本発明を実施し
た結果を示しているゲルのオートラジオグラフィーである。

【図３】図３は、プラスミドｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ１、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ２およびｐ
ＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ３のマルチクローニング部位のヌクレオチド配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者エアランダーマークジーアメリカ合衆国カリフォルニア州 92024 エンシニタスヒルクレストドライヴ 442 (72)発明者ハーゼルカルルヴェーアメリカ合衆国カリフォルニア州 92075 ソラナビーチサウスナードアベニュー 247 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BB60 DA14 FB01 FB02 FB05 JA01 4B024 AA11 CA04 CA12 DA06 FA02 GA11 HA09 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ53 QR14 QR55 QR62 QS16 QS25 QS34 QX07 5B075 ND02 ND20 NK37 PR06 QM08 UU19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程を含むｍＲＮＡ集団中のｍＲＮＡを同時に配列特
異的に同定する方法：（ａ）アンカープライマーの混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖のｃＤＮ
Ａ集団を調製し、ここで前記アンカープライマーは各々、（ｉ）７から４０のＴ
残基の列；（ｉｉ）前記Ｔ残基列の５'側に位置する６より多い塩基を認識する
第一の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位；（ｉｉｉ）第一の制限エンドヌ
クレアーゼ切断部位の５'側に位置する４から４０ヌクレオチドの第一の充填セ
グメント；および（ｉｖ）−Ｖおよび−Ｖ−Ｎから成る群から選ばれるアンカー
プライマーの各々の３'末端に位置する調整残基（式中、ＶはＡ、ＣおよびＧか
ら成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴか
ら成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチド）を含み、さらに前記混合物は
、その中の前記調整残基が−Ｖまたは−Ｖ−Ｎと定義されるＶおよびＮについて
全ての可能性を含むアンカープライマーを含有し；（ｂ）第一の制限エンドヌクレアーゼおよび第二の制限エンドヌクレアーゼで
前記二本鎖ｃＤＮＡを切断し、それぞれ第一および第二の末端を有する二本鎖ｃ
ＤＮＡ分子集団を生成し、ここで前記第二の制限エンドヌクレアーゼは４つのヌ
クレオチド配列を認識し；（ｃ）工程（ｂ）の二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々をベクター内のバクテリオファ
ージ特異的プロモーターに対してアンチセンス方向で前記ベクターに挿入し、挿
入ｃＤＮＡ分子を含むベクター集団を生成し、ここで前記挿入は、５'が挿入ｃ
ＤＮＡのセンス鎖の上流に存在し、３'がセンス鎖の下流に存在するように３'お
よび５'フランキングベクター配列の位置を規定し、さらに前記ベクターは、前
記第一の制限エンドヌクレアーゼと前記プロモーター内の転写開始を規定する部
位との間に長さが少なくとも１５ヌクレオチドの３'フランキングヌクレオチド
配列を有し；（ｄ）挿入ｃＤＮＡ分子内またはバクテリオファージ特異的プロモーター内の
配列は認識しないが、ベクター内の配列は認識する少なくとも１つの制限エンド
ヌクレアーゼで工程（ｃ）で生成されたベクターを消化して挿入ｃＤＮＡ分子を
含む直線化フラグメントを生成するが、この場合、生じた直線化フラグメントが
、ｃＤＮＡの第二の末端でベクターに挿入されたｃＤＮＡサンプルの挿入部位の
５'側に少なくとも長さが１５ヌクレオチドの５'フランキングベクター配列を有
するように消化し；（ｅ）バクテリオファージ特異的プロモーターから転写を開始することができ
るバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼと前記直線化フラグメントを保
温して、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製物を生成し；（ｆ）ｃＲＮＡ調製物をサブプールに分け、逆転写酵素および以下のように規
定される５'−ＲＴプライマーを用いて各サブプールから第一鎖ｃＤＮＡを転写
するが、前記５'−ＲＴプライマーは−Ｎ_xから成る３'末端を有し（式中、"Ｎ"
は４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つで、"ｘ"は１から
５の整数）、長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フランキングベク
ター配列と相補的でプライマーの相補性はｃＲＮＡの挿入物特異的ヌクレオチド
の中の"ｘ"と同じ数のヌクレオチドにまで伸長しており、ここで前記プライマー
のうち異なる１つが異なるサブプールで用いられ、"ｘ"＝１ならばサブプールは
４つで、"ｘ"＝２ならばサブプールは１６で、"ｘ"＝３ならばサブプールは６４
で、"ｘ"＝４ならばサブプールは２５６で、"ｘ"＝５ならばサブプールは１０２
４であり；（ｇ）ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型としてサブプールの各々の第一鎖ｃＤＮＡ
転写生成物を用い、長さが１５から３０ヌクレオチドで前記第一の制限エンドヌ
クレアーゼ部位とバクテリオファージ特異的プロモーターによる転写開始部位を
規定する部位との間の３'フランキングベクター配列に相補的な３'−ＰＣＲプラ
イマーおよび以下のような５'−ＰＣＲプライマーによりポリメラーゼ連鎖反応
増幅フラグメントを生成し、ここで５'−ＰＣＲプライマーは、−Ｎ_x−Ｎ_yから
成る３'末端を有し（式中、"Ｎ"および"ｘ"は工程（ｆ）で規定したとおりで、
−Ｎ_xは、そのサブプールについて第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた５'−ＲＴプラ
イマーの場合と同じで、"ｙ"は、ｘ＋ｙが３、４、５および６から成る群から選
ばれる整数と等しい完全な整数）、長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに
５'フランキングベクター配列と相補的でプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入
物特異的ヌクレオチドの中の"ｘ＋ｙ"と同じ数のヌクレオチドにまで伸長してお
り；さらに（ｈ）ｍＲＮＡ集団に存在する異なるｍＲＮＡの３'末端を表す配列特異的生
成物を表示するために、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを解析する。
【請求項２】工程（ａ）の前記調整残基が、−Ｖ−Ｎである請求項１の方
法。
【請求項３】工程（ａ）の前記調整残基が−Ｖである請求項１の方法。
【請求項４】工程（ｆ）の前記"ｘ"が２である請求項１の方法。
【請求項５】工程（ｆ）の前記"ｘ"が１である請求項１の方法。
【請求項６】工程（ｇ）の前記"ｙ"が３である請求項５の方法。
【請求項７】工程（ｇ）の前記"ｙ"が４である請求項５の方法。
【請求項８】工程（ａ）の前記調整残基が−Ｖ−Ｎで、工程（ｆ）の"ｘ"
が２で、工程（ｇ）の"ｙ"が２である請求項１の方法。
【請求項９】工程（ａ）の前記調整残基が−Ｖ−Ｎで、工程（ｆ）の"ｘ"
が１で、工程（ｇ）の"ｙ"が３である請求項１の方法。
【請求項１０】工程（ａ）の前記調整残基が−Ｖ−Ｎで、工程（ｆ）の"
ｘ"が１で、工程（ｇ）の"ｙ"が４である請求項１の方法。
【請求項１１】工程（ａ）の前記調整残基が−Ｖで、工程（ｆ）の"ｘ"が
１で、工程（ｇ）の"ｙ"が３である請求項１の方法。
【請求項１２】工程（ａ）の前記調整残基が−Ｖで、工程（ｆ）の"ｘ"が
１で、工程（ｇ）の"ｙ"が４である請求項１の方法。
【請求項１３】前記アンカープライマーの各々がＴ残基列に１８のＴ残基
を有する請求項１の方法。
【請求項１４】前記アンカープライマーの第一の充填セグメントの長さが
１４残基である請求項１の方法。
【請求項１５】前記第一の充填セグメントの配列が、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ（配列番号：１）である請求項１の方法
。
【請求項１６】第二の充填セグメントが、６より多い塩基を認識する制限
エンドヌクレアーゼによって切断される部位とＴ残基列との間に挟まれている請
求項１の方法。
【請求項１７】前記アンカープライマーが、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ
−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）なる配列を有する請求項１の方法。
【請求項１８】前記アンカープライマーが、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ
−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｖ（配列番号：２３）なる配列を有する請求項１の方法。
【請求項１９】前記バクテリオファージ特異的プロモーターが、Ｔ３プロ
モーター、Ｔ７プロモーターおよびＳＰ６プローモーターから成る群から選ばれ
る請求項１の方法。
【請求項２０】前記バクテリオファージ特異的プロモーターがＴ３プロモ
ーターである請求項１６の方法。
【請求項２１】ｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写プライミングに用いる前記１
６の５'−ＲＴプライマーが、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−
Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：３）なる配列を有する請求項１の方法
。
【請求項２２】ｃＲＮＡからｃＤＮＡの転写プライミングに用いる前記１
６の５'−ＲＴプライマーが、Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：７）なる配列を有する請求項１の方法。
【請求項２３】前記ベクターが、ｐＢＣＳＫ⁺、ｐＢＳＳＫ⁺、ｐＢＳＳＫ ⁺ ／ＤＧＴ１、ｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ２およびｐＢＳＳＫ⁺／ＤＧＴ３から成る群
から選ばれる請求項１の方法。
【請求項２４】前記ベクターが、ＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプ
ラスミドｐＢＣＳＫ⁺で、工程（ｇ）の３'−ＰＣＲプライマーがＧ−Ａ−Ａ−Ｃ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ
−Ｇ−Ｃ（配列番号：４）である請求項１の方法。
【請求項２５】前記ベクターが、ＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプ
ラスミドｐＢＣＳＫ⁺で、工程（ｇ）の３'−ＰＣＲプライマーがＡ−Ａ−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ（配列番号：８）である請
求項１の方法。
【請求項２６】４ヌクレオチド配列を認識する第二の制限エンドヌクレア
ーゼがＭｓｐＩである請求項１の方法。
【請求項２７】４ヌクレオチド配列を認識する第二の制限エンドヌクレア
ーゼが、ＭｂｏＩ、ＤｐｎＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＨｐａＩＩ、
ＢｆａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＭｓｅＩ、ＨｈａＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＴａｑＩ、Ｍｓｐ
Ｉ、ＭａｅＩＩおよびＨｉｎＰ１Ｉから成る群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項２８】６より多い塩基を認識する第一の制限エンドヌクレアーゼ
が、ＡｓｃＩ、ＢａｅＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｐｕＭ
Ｉ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｐＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＡＩ、Ｓ
ｒｆＩ、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳｗａＩから成る群から選ばれる請求項１の方
法。
【請求項２９】６より多い塩基を認識する第一の制限エンドヌクレアーゼ
がＮｏｔＩである請求項１の方法。
【請求項３０】工程（ｄ）で用いられる制限エンドヌクレアーゼが、工程
（ｂ）で用いられる第二の制限エンドヌクレアーゼの４ヌクレオチド配列を含む
ヌクレオチド配列認識を有する請求項１の方法。
【請求項３１】第二の制限エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩで、工程（ｄ）
で用いられる制限エンドヌクレアーゼがＳｍａＩである請求項３０の方法。
【請求項３２】第二の制限エンドヌクレアーゼがＴａｑＩで、工程（ｄ）
で用いられる制限エンドヌクレアーゼがＸｈｏＩである請求項３０の方法。
【請求項３３】第二の制限エンドヌクレアーゼがＨｉｎＰ１Ｉで、工程（
ｄ）で用いられる制限エンドヌクレアーゼがＮａｒＩである請求項３０の方法。
【請求項３４】第二の制限エンドヌクレアーゼがＭａｅＩＩで、工程（ｄ
）で用いられる制限エンドヌクレアーゼがＡａｔＩＩである請求項３０の方法。
【請求項３５】工程（ｃ）のベクターが、ベクターの充填配列に接する第
一および第二のベクター制限エンドヌクレアーゼ部位を有する環状ＤＮＡ分子の
形態を有し、さらに、第一および第二の制限エンドヌクレアーゼ部位で前記ベク
ターを切断する制限エンドヌクレアーゼで前記ベクターを消化する工程を含む請
求項１の方法。
【請求項３６】前記ベクター充填配列が、第一のベクター制限エンドヌク
レアーゼ部位と第二のベクター制限エンドヌクレアーゼ部位との間に内部ベクタ
ー充填配列制限エンドヌクレアーゼ部位を含む請求項３５の方法。
【請求項３７】工程（ｄ）が、内部ベクター充填配列制限エンドヌクレア
ーゼ部位で前記ベクターを切断する制限エンドヌクレアーゼによるベクターの消
化を含む請求項３６の方法。
【請求項３８】工程（ｄ）で用いられる制限エンドヌクレアーゼがまた、
内部ベクター充填配列制限エンドヌクレアーゼ部位で前記ベクターを切断する請
求項３７の方法。
【請求項３９】前記クローン化挿入物の直線化フラグメントを生成する工
程が以下の（ｉ）−（ｉｖ）を含む請求項１の方法：（ｉ）挿入物を含むプラス
ミドを２つの部分に分け、第一の部分を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩで切断
し、第二の部分を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで切断し；（ｉｉ）切断後第
一および第二の部分を再結合させ；（ｉｉｉ）再結合させた部分を三等分し、第
一の三等分を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで、第二の三等分を制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで、さらに第三の部分を制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩで切断し；さらに（ｉｖ）集団の約１／６が可能な酵素の組合せの各々
によって切断された生成物に一致する直線化フラグメント集団を作製するために
消化後に前記三等分を再結合させる。
【請求項４０】前記ｍＲＮＡ集団がポリアデニル化ｍＲＮＡ種について濃
縮されている請求項１の方法。
【請求項４１】生成物を表示するために工程（ｈ）の増幅フラグメントの
解析が電気泳動によって行われる請求項１の方法。
【請求項４２】電気泳動後に表示される生成物の量が、最初の混合物中の
生成物に対応するｍＲＮＡの豊富さとほぼ比例する請求項４１の方法。
【請求項４３】さらに、電気泳動後の該当するｍＲＮＡに対応する生成物
の量から最初の混合物中の各ｍＲＮＡの相対的な量を決定する工程を含む請求項
４１の方法。
【請求項４４】電気泳動によってポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメント
を解析する工程が、少なくとも２つのゲルで前記フラグメントの電気泳動を実施
することを含む請求項４１の方法。
【請求項４５】適切なホスト細胞が大腸菌（Escherichia coli）である請
求項１の方法。
【請求項４６】さらに以下の工程を含む請求項４１の方法：（ｉ）サンプル中に存在するｍＲＮＡの３'−末端を表わすバンドが表示され
ている電気泳動から１つのｍＲＮＡに対応する少なくとも１つのｃＤＮＡを溶出
させ；（ｊ）ポリメラーゼ連鎖反応で溶出ｃＤＮＡを増幅させ；（ｋ）前記増幅ｃＤＮＡをプラスミドでクローニングし；（ｌ）前記クローン化ＤＮＡに対応するＤＮＡをプラスミドから産生させ；さ
らに（ｍ）前記クローン化ｃＤＮＡの配列を決定する。
【請求項４７】以下の工程を含むｍＲＮＡ集団中のｍＲＮＡを同時に配列
特異的に同定する方法：（ａ）ｍＲＮＡ集団を単離し；（ｂ）アンカープライマーの混合物を用いてｍＲＮＡ集団から二本鎖ｃＤＮＡ
集団を調製するが、前記アンカープライマーの各々は、（ｉ）７から４０のＴ残
基の列；（ｉｉ）前記Ｔ残基列の５'側に位置する８より多い塩基を認識する第
一の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位；（ｉｉｉ）第一の制限エンドヌク
レアーゼ切断部位の５'側に位置する４から４０ヌクレオチドの第一の充填セグ
メント；および（ｉｖ）−Ｖおよび−Ｖ−Ｎから成る群から選ばれる、アンカー
プライマーの各々の３'末端に位置する調整残基（式中、ＶはＡ、ＣおよびＧか
ら成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴか
ら成る群から選ばれるデオキシリボヌクレオチド）を含み、さらに前記混合物は
ＶおよびＮについて全ての可能性を含むアンカープライマーを含有し；（ｃ）二本鎖ｃＤＮＡ集団を第一の制限エンドヌクレアーゼおよび４ヌクレオ
チドを認識する第二の制限エンドヌクレアーゼで切断し、それぞれ第一および第
二の末端を有する二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を生成し；（ｄ）工程（ｂ）の二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々を、ベクター内のＴ３プロモー
ターに対してアンチセンス方向でベクターに挿入し、挿入ｃＤＮＡ分子を含むベ
クター集団を生成し、前記挿入は、５'が挿入ｃＤＮＡのセンス鎖の上流に存在
し、３'がセンス鎖の下流に存在するように３'および５'フランキングベクター
配列の位置を規定し、さらに前記ベクターは、前記第一の制限エンドヌクレアー
ゼと前記プロモーター内の転写開始を規定する部位との間に長さが少なくとも１
５ヌクレオチドの３'フランキングヌクレオチド配列を有し；（ｅ）前記切断ｃＤＮＡが挿入された前記ベクターで大腸菌を形質転換して、
クローン化挿入物を含むベクターを生成し；（ｆ）前記挿入ｃＤＮＡ分子またはＴ３プロモータ内の配列を認識しない少な
くとも１つの制限エンドヌクレアーゼで工程（ｅ）で生成したベクターを消化し
、挿入ｃＤＮＡ分子を含む直線化フラグメントを生成し；（ｇ）Ｔ３プロモーターから転写を開始することができるＴ３ＲＮＡポリメラ
ーゼと前記直線化フラグメントを保温して、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲ
ＮＡ調製物を生成し；（ｈ）ｃＲＮＡ調製物をサブプールに分け、逆転写酵素および以下のように規
定される５'−ＲＴプライマーの１つを用いて各サブプールから第一鎖ｃＤＮＡ
を転写し、ここで前記プライマーは−Ｎ_xから成る３'末端を有し（式中、"Ｎ"は
４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つで、"ｘ"は１から２
の整数）、長さが１５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フランキングベクタ
ー配列と相補的で５'−ＲＴプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入物特異的ヌク
レオチドの中の"ｘ"と同じ数のヌクレオチドにまで伸長しており、ここで前記プ
ライマーのうち異なる１つが異なるサブプールで用いられ、"ｘ"＝１ならばサブ
プールは４つで、"ｘ"＝２ならばサブプールは１６で；（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型としてサブプールの各々の第一鎖ｃＤＮＡ
転写生成物を用い、長さが１５から３０ヌクレオチドで前記第一の制限エンドヌ
クレアーゼ部位とＴ３プロモーターによる転写開始部位を規定する部位との間の
３'フランキングベクター配列に相補的な３'−ＰＣＲプライマーおよび、以下の
ような５'−ＰＣＲプライマーによりポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを
生成し、ここで５'−ＰＣＲは−Ｎ_x−Ｎ_yから成る３'末端を有し（式中、"Ｎ"お
よび"ｘ"は工程（ｈ）で規定したとおりで、−Ｎ_xは、そのサブプールについて
第一鎖ｃＤＮＡの合成に用いた５'−ＲＴプライマーと同じ配列で、"ｙ"は、ｘ
＋ｙが４および５から成る群から選ばれる整数と等しい完全な整数）、長さが１
５から３０ヌクレオチドで、さらに５'フランキングベクター配列と相補的で５'
−ＰＣＲプライマーの相補性がｃＲＮＡの挿入物特異的ヌクレオチドの中の"ｘ
＋ｙ"と等しい数のヌクレオチドにまで伸長しており；さらに（ｊ）ｍＲＮＡ集団に存在する異なるｍＲＮＡの３'末端を表示する生成物デ
ィスプレーを作製するために、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを解析す
る。
【請求項４８】前記アンカープライマー混合物中のプライマーの各々が、
Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：２）なる配列を有す
る請求項４７の方法。
【請求項４９】前記アンカープライマー混合物中のプライマーの各々が、
Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ（配列番号：２３）なる配列を有する
請求項４７の方法。
【請求項５０】前記第一の制限エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩで、第二の
制限エンドヌクレアーゼがＮｏｔＩである請求項４７の方法。
【請求項５１】前記工程（ｈ）の５'−ＲＴプライマーが、Ｇ−Ｇ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ（配列番号：９）である
請求項４７の方法。
【請求項５２】前記３'−ＰＣＲプライマーが、Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ（配列番号：８）である請求項４７
の方法。
【請求項５３】前記工程（ｉ）の"ｙ"が３である請求項４７の方法。
【請求項５４】前記工程（ｉ）の"ｙ"が４である請求項４７の方法。
【請求項５５】以下の工程を含む生理学的または病理学的な変化に付随す
る組織中のｍＲＮＡ発現パターンの変化を検出する方法：（ａ）生理学的または病理学的変化を受けていない第一の組織サンプルを入手
し；（ｂ）第一のサンプルからｍＲＮＡ集団を単離し；（ｃ）請求項１の（ａ）−（ｈ）の工程を実施して第一の組織サンプルのｍＲ
ＮＡ発現パターンを決定し、第一のサンプル中に存在するｍＲＮＡの３'末端を
表示する配列特異的生成物の第一のディスプレーを作製し；（ｄ）生理学的または病理学的変化を受けた第二の組織サンプルを入手し；（ｅ）第二のサンプルからｍＲＮＡ集団を単離し；（ｆ）請求項１の（ａ）−（ｈ）の工程を実施して第二の組織サンプルのｍＲ
ＮＡ発現パターンを決定し、第二のサンプル中に存在するｍＲＮＡの３'末端を
表示する配列特異的生成物の第二のディスプレーを作製し；さらに（ｇ）第一および第二のディスプレーを比較して、組織中のｍＲＮＡ発現パタ
ーンに対する生理学的または病理学的変化の影響を決定する。
【請求項５６】前記組織が中枢神経系に由来する請求項５５の方法。
【請求項５７】前記生理学的または病理学的変化が、アルツハイマー病、
パーキンソン病、虚血、アルコール中毒、薬物中毒、精神分裂病、筋萎縮性側索
硬化症、多発性硬化症、双極性躁うつ病から成る群から選ばれる請求項５６の方
法。
【請求項５８】前記生理学的または病理学的変化が、学習もしくは記憶、
感情、グルタメート神経毒性、飼育行動、嗅覚、視覚、運動異常、ウイルス感染
、電気ショック療法または薬剤もしくは毒素の投与に付随する請求項５６の方法
。
【請求項５９】前記生理学的または病理学的変化が、日周期による変動、
加齢および長期の相乗作用から成る群から選ばれる請求項５６の方法。
【請求項６０】前記組織が、網膜、大脳皮質、嗅球、視床、視床下部、下
垂体前葉、下垂体後葉、海馬、側坐核、扁桃、線条、小脳、脳幹、交叉上核、お
よび脊髄から成る群から選ばれる中枢神経系内の構造物に由来する請求項５６の
方法。
【請求項６１】前記組織が、心脈管系、肺系、消化系、末梢神経系、肝、
腎、骨格筋および生殖系から成る群から選ばれる器官または器官系に由来する請
求項５５の方法。
【請求項６２】以下の工程を含むスクリーニングされるべき薬剤と既知化
合物の作用の相違を検出する方法：（ａ）既知の生理学的機能をもつ化合物で処理した器官から第一の組織サンプ
ルを入手し；（ｂ）前記第一のサンプルからｍＲＮＡ集団を単離し；（ｃ）請求項１の（ａ）−（ｈ）の工程を実施して第一の組織サンプルのｍＲ
ＮＡ発現パターンを決定し、第一のサンプル中に存在するｍＲＮＡの３'末端を
表示する配列特異的生成物の第一のディスプレーを作製し；（ｄ）薬剤と既知化合物の作用の相違についてスクリーニングされるべき薬剤
で処理した器官から第二の組織サンプルを入手し；（ｅ）第二のサンプルからｍＲＮＡ集団を単離し；（ｆ）請求項１の（ａ）−（ｈ）の工程を実施して第二の組織サンプルのｍＲ
ＮＡ発現パターンを決定し、第二のサンプル中に存在するｍＲＮＡの３'末端を
表示する配列特異的生成物の第二のディスプレーを作製し；さらに（ｇ）第一および第二のディスプレーを比較して、既知の化合物ではその発現
が影響を受けないが、スクリーニングしている薬剤によって影響を受ける、した
がってスクリーニングしている薬剤と既知の化合物の作用の相違を示唆するｍＲ
ＮＡ種の存在を検出する。
【請求項６３】前記被験薬剤が、抗うつ剤、神経弛緩薬、精神安定剤、抗
痙攣薬、モノアミンオキシダーゼ抑制物質および刺激物質から成る群から選ばれ
る請求項６２の方法。
【請求項６４】前記被験薬が、抗パーキンソン病薬、骨格筋弛緩薬、鎮痛
剤、局所麻酔剤、コリン作動薬、抗ウイルス剤、抗痙攣薬、ステロイド、および
非ステロイド性抗炎症剤から成る群から選ばれる請求項６２の方法。
【請求項６５】以下の配列を有する１２のプライマー混合物を含むアンカ
ープライマーの縮重混合物：Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ
−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配
列番号：２）、式中、ＶはＡ、ＣおよびＧから成る群から選ばれるデオキシリボ
ヌクレオチドで、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴから成る群から選ばれるデオキシリボ
ヌクレオチドで、１２のプライマーの各々はほぼ等モル量で存在する。
【請求項６６】デジタルアドレスを得るために請求項１の配列特異的生成
物のディスプレーを定量することによって作製されたデータを含むデータベース
であって、前記デジタルアドレスが、配列識別子、配列特異的ＰＣＲ生成物のヌ
クレオチド残基としての長さおよびＰＣＲ生成物の標識量（そのＰＣＲ生成物に
ついての検出器の出力ピーク下の面積と定義される）と定義される前記データベ
ス。
【請求項６７】さらに、配列の関連性、遺伝子マッピングおよび細胞にお
ける分布から成る群から選ばれるデータを含む請求項６６のデータベース。
【請求項６８】さらに以下の工程を含む請求項１の方法：（ｉ）サンプル中に存在するｍＲＮＡの３'−末端を表わすバンドが表示され
ている電気泳動から１つのｍＲＮＡに対応する少なくとも１つのｃＤＮＡを溶出
させ；（ｊ）ポリメラーゼ連鎖反応で溶出ｃＤＮＡを増幅させ；（ｋ）前記増幅ｃＤＮＡをプラスミドでクローニングし；（ｌ）前記クローン化ＤＮＡに対応するＤＮＡをプラスミドから産生させ；（ｍ）前記クローン化ｃＤＮＡの配列を決定し；さらに、（ｎ）ヌクレオチド配列のデーターベースから、第二のエンドヌクレアーゼに
対する最も遠位部の認識配列およびポリ（Ａ）テールの開始部によってその境界
が限定される対応するヌクレオチド配列を決定する。
【請求項６９】さらに、（ｐ）二次元グラフディスプレーでＰＣＲ生成物
の長さおよび量を比較する工程を含む請求項６８の方法。
【請求項７０】さらに以下の工程を含む請求項６９の方法：（ｑ）前記対応するヌクレオチド配列の予想される長さを決定し、ここで前記
予想される長さは、前記データベースから決定された対応するヌクレオチド配列
の長さ、ベクター配列とハイブリダイズすることができる５'ＰＣＲ配列の長さ
、残存アンカープライマー配列の長さ、ベクター配列の介在セグメントおよびベ
クター配列とハイブリダイズすることができる３'ＰＣＲ配列の長さの合計で；
さらに（ｒ）ＰＣＲ生成物の長さを前記対応するヌクレオチド配列の決定された予想
の長さと比較するが、ここで、前記対応するヌクレオチド配列の予想の長さが、
前記二次元グラフディスプレーでグラフ記号またはテキストキャラクターを用い
ることによって示される。
【請求項７１】以下の工程を含む、サンプル中に存在するｍＲＮＡ分子に
一致するｃＤＮＡフラグメントの配列と配列データベースとの間で配列同一性お
よび類似性を認知する方法：サンプル中に存在するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡフラグメントを溶出させ；ポリメラーゼ連鎖反応で溶出ｃＤＮＡを増幅させて増幅ｃＤＮＡフラグメント
を生成し；前記増幅ｃＤＮＡをプラスミドでクローニングし；前記クローン化ＤＮＡに一致するＤＮＡを製造し；前記製造ＤＮＡ分子の配列を決定し、それによって前記溶出ｃＤＮＡフラグメ
ントの配列を決定し；さらに前記溶出ｃＤＮＡフラグメントの配列をデーターベースの配列と比較し、それ
によって配列同一性および類似性を認知する。
【請求項７２】前記溶出ｃＤＮＡフラグメントの配列をデーターベースの
配列と比較する工程がコンピューターを用いて実施される請求項７１の方法。
【請求項７３】前記比較の結果をグラフによって表示する追加工程をさら
に含む請求項７２の方法。
【請求項７４】以下の工程を含む、サンプル中に存在するｍＲＮＡ分子に
一致するｃＤＮＡフラグメントの配列と配列データベースとの間で配列同一性お
よび類似性を認知する方法：サンプル中に存在するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡフラグメントを溶出させ、
ここで、前記ｃＤＮＡフラグメントは制限エンドヌクレアーゼ認識部位の位置と
ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テールによって決定される長さを有し；制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列と一致する５'ＰＣＲプライマーを用
いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することによって、ｃＤＮＡフラグメントの部
分配列を決定し；さらに、前記溶出ｃＤＮＡフラグメントの決定部分配列および前記ｃＤＮＡフラグメン
トの長さを配列データーベースの配列と比較し、それによって配列同一性および
類似性を認知する。
【請求項７５】以下の工程を含む、変換ポリヌクレオチド配列データーベ
ースエントリーを作製する方法：ポリヌクレオチド配列データベースエントリーから根源配列を選択し；前記根源配列内でポリ（Ａ）テール配列の位置を決定し；前記根源配列内で第一の認識部位に最も近いエンドヌクレアーゼ認識部位配列
の位置を決定し；前記エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する約２から約６ヌクレオチドから成
るインデックス配列を決定し；前記根源配列内の相関配列を決定するが、ここで前記相関配列は、ポリ（Ａ）
テールとエンドヌクレアーゼ認識部位による境界を有する配列を含み、さらに前
記エンドヌクレアーゼ認識部位の少なくとも一部分を含んでおり；前記相関配列の長さを決定し；さらにポリ（Ａ）テールの位置および配列、前記エンドヌクレアーゼ認識部位の位置
および配列、並びに前記根源配列に対する前記相関配列の長さに関する情報を保
存し、それによって変換データベースエントリーを作製する。
【請求項７６】前記インデックス配列に対して前記相関配列の長さをグラ
フにより表示する工程をさらに含む請求項７５の方法。
【請求項７７】前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭｓｐＩ、ＴａｑＩおよ
びＨｉｎＰ１Ｉから選ばれる請求項７６の方法。
【請求項７８】以下の工程を含む、標的以外のｃＤＮＡの増幅に起因する
バックグラウンドを減少させることによって改善されたＰＣＲ生成物の長さおよ
び量の解析方法：その各々が挿入配列およびベクター由来配列を含むｃＲＮＡ集団のサンプルを
選択し；前記ベクター由来配列とハイブリダイズし、さらに約５ヌクレオチドから６ヌ
クレオチドが前記挿入配列に伸長している逆転写プライマーを用いて逆転写を実
施し、ｃＤＮＡ逆転写生成物を製造し；前記ｃＤＮＡ逆転写生成物をさらに分割し；前記亜分割ｃＤＮＡ逆転写生成物、３'ＰＣＲプライマーおよび５'ＰＣＲプラ
イマーを用いて少なくとも１回ポリメラーゼ連鎖反応を実施してＰＣＲ生成物を
製造し、それによって標的以外のｃＤＮＡの増幅に起因するバックグラウンドを
減少させるが、ここで前記５'ＰＣＲプライマーはベクター由来配列とハイブリ
ダイズし、さらに前記挿入配列内に約７ヌクレオチドから９ヌクレオチド伸長し
ている。
【請求項７９】１６プールの逆転写反応物が存在し、さらに１６の異なる
逆転写プライマーが存在する請求項７８の方法。
【請求項８０】ポリメラーゼ連鎖反応で４Xのサブプールが存在し、ここ
でＸは、５'ＰＣＲプライマーが前記挿入配列内に伸長している数と逆転写プラ
イマーが前記挿入配列内に伸長している数との違いである請求項７９の方法。