MXPA00012758A - Metodo para identificacion simultanea de arnm expresados diferencialmente y medicion de concentraciones relativas. - Google Patents

Abstract

Un metodo mejorado para la identificacion simultanea especifica en secuencia de ARNm's en una poblacion de ARNm permite la visualizacion de casi cada ARNm expresado por un tejido como una banda distinta en un gel cuya intensidad corresponde aproximadamente a la concentracion del ARNm. En general, el metodo comprende la formacion de ADNc usando cebadores de anclaje para fijar un punto de extremo 3, produciendo insertos clonados a partir del ADNc en un vector que contiene un promotor especifico de bacteriofago para sintesis subsecuente de ARN, generando fragmentos linealizados de insertos clonados, preparando ARNc, transcribiendo ADNc a partir del ARNc usando un conjunto de cebadores S-RT, y llevando a cabo PCR usando un cebador 3-PCR cuya secuencia es derivada del vector y un conjunto de cebadores 5-PCR que se deriva de los cebadores 5-RT usados para la transcripcion de ADNc a partir de ARNc. El metodo puede identificar cambios en la expresion de ARNm asociados con la administracion de farmacos o con condiciones fisiologicas o patologicas.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICACIÓN SIMULTÁNEA DE ARNm EXPRESADOS DIFERENCIALMENTE Y MEDICIÓN DE CONCENTRACIONES RELATIVAS Antecedentes de la Invención Esta invención se refiere a métodos para la identificación simultánea de AR ms diferencialmente expresados, así como a las mediciones de sus concentraciones relativas. Una meta final de la investigación bioquímica debería ser una caracterización completa de las moléculas de proteína que forman un organismo. Este incluiría su identificación, determinación de secuencia, demostración de sus sitios anatómicos de expresión, elucidación de sus actividades bioquímicas, y entendimiento de la manera en que estas actividades determinan la fisiología organísmica. Para aplicaciones médicas, la descripción también debería incluir información acerca de la manera en que cambia la concentración de cada proteína en respuesta a los agentes farmacéuticos o tóxicos. Vamos a considerar el alcance del problema: ¿Cuántos genes hay? La cuestión de la manera en que se expresan muchos genes en un mamífero todavía no se ha establecido después de cuando menos dos décadas de estudio. Existen pocos estudios directos que resuelven los patrones de la expresión genética en diferentes tejidos. Los estudios de la carga de mutación (J.O.

Bishop, "The Gene Numbers Game", Cell 2:81-86 (1974); T. Ohta y M. Kimura, "Functional Organization of Genetic Material as a Product of Molecular Evolution, "Nature" 223:118-119 (1971) ha sugerido que existan entre 3xl04 y 105 genes esenciales. Antes de las técnicas de clonación del ADNc, la información sobre la expresión genética venía de los estudios de complejidad del ARN: mediciones análogas (mediciones a granel) basadas en observaciones de poblaciones mixtas de moléculas de ARN con diferentes especificidades en abundancias. Hasta un grado inesperado, los primeros estudios de complejidad análoga eran distorsionados por las complicaciones ocultas del hecho de que las moléculas en cada tejido que forman la mayor parte de su masa de ARNm, comprenden solamente una pequeña fracción de su complejidad total, posteriormente, la clonación del ADNc permitió que se hicieran mediciones digitales (es decir, mediciones específicas de la secuencia sobre especies individuales) ; por consiguiente los conceptos más recientes acerca de la expresión del ARNm se basan en las observaciones reales de las especies de ARN individuales . El cerebro, el hígado y el riñon son tejidos de mamífero que se han estudiado más extensamente mediante mediciones análogas de complejidad del ARN. Las estimaciones más bajas de complejidad son aquéllas de Hastie y Bishop (N.D. Hastie y J.B. Bishop, "The Expression of Three Abundance Classes of Messenger RNA in Mouse Tissues", Cell 9:761-774 (1976))), que sugieren que se expresaban en el cerebro 26xl06 nucleótidos del genoma de roedor de 3x1O9 pares de base, 23x1O6 en el hígado, y 22xi06 en el riñón, con un traslape casi completo en los conjuntos de ARN. Esto indica un número muy mínimo de ARNms específicos del tejido. Sin embargo, la experiencia ha demostrado que estos valores deben ser claramente subestimaciones, debido a que muchas moléculas de ARNm, que probablemente eran de abundancias menores que los límites de detección de este primer estudio, han demostrado que se expresan en el cerebro, pero no son detectables en el hígado ni en el riñón. Muchos otros investigadores (J.A. Bantle y W.E. Hahn, "Complexity and Characterization of Polya-denylated RNA in the Mouse Brain" , Cell 8:139-150 (1976); D.M. Chikaraishi, "Complexity of Cytoplasmic Polyadenylated and Non-Adenylated Rat Brain Ribonucleic Acids", Biochemistry 18:3249-3256 (1979)) han medido las complejidades análogas de entre 100-200xl06 nucleótidos en el cerebro, y estimaciones 2 a 3 veces más bajas en el hígado y en el riñón. De los ARNms del cerebro, no se detectan del 50 al 65 por ciento en el hígado ni el riñón. Estos valores han sido apoyados por los estudios de clonación digital (R.J. Milner y J.G. Sutcliffe, "Gene Expression in Rat Brain", Nucí. Acids Res. 11:5497-5520 (1983)). Las mediciones análogas sobre el ARNm a granel sugirieron que la longitud promedio de ARNm era entre 1400 y 1900 nucleótidos. En un análisis digital sistemático de la longitud del ARNm del cerebro utilizando 200 ADNcs de cerebro aleatoria-mente seleccionados para medir el tamaño del ARN mediante mancha Northern (Milner y Sutcliffe, supra) , se descubrió que, cuando se ponderaban los datos del tamaño del ARNm para determinar la prevalencia del ARN, la longitud promedio era de 1,790 nucleóti-dos, igual que la determinada mediante las mediciones análogas. Sin embargo, los ARNms que formaban la mayor parte de la complejidad del ARNm del cerebro tenían una longitud promedio de 5000 nucleótidos. No solamente los ARNs de cerebro más raros eran más largos, sino que tendían a ser específicos del cerebro, mientras que los ARNms de cerebro más prevalentes se expresaban de una manera ubícuita, y eran muchos más cortos en promedio. Estos conceptos acerca de las longitudes del ARNm se han corroborado más recientemente a partir de la longitud del ARNm del cerebro, cuyas secuencias se han determinado (J.G. Sutcliffe, "mRNA in the Mammalian Central Nervous System", Annu. Rev. Neurosci. 11:157-198 (1988)). Por consiguiente, la complejidad de l-2xl08 nucleótidos y la longitud de la ARNm promedio de 5000 nucleótidos se calcula en 30,000 ARNms estimados expresados en el cerebro, de los cuales aproximadamente 2/3 no son detectados en el hígado o en el riñon. El cerebro aparentemente cuenta por una porción considerable de los genes específicos del tejido de los mamíferos. La mayoría de los ARNms del cerebro se expresan en una baja concentración. No hay mediciones de complejidad de ARNm de mamífero total, ni se sabe todavía si 5,000 nucleótidos es una buena estimación de la longitud del ARNm para los tejidos no neurales. Una estimación razonable del número genético total podría ser entre 50,000 y 100,000. Lo que se necesita más para avanzar mediante un entendimiento químico de la función fisiológica, es un menú de secuencias de proteína codificadas por el genoma más los tipos de células en las que se expresan. En el presente, las secuencias de proteínas se pueden deducir de una manera confiable solamente a partir de los ADNcs, y no de los genes, debido a la presencia de las secuencias que intervienen (intrones) en las secuencias genómicas. Inclusive una secuencia de nucleótidos completa de un genoma de mamífero no sustituirá la caracterización de sus secuencias expresadas. Por consiguiente, se necesita una estrategia sistemática para recopilar las secuencias transcritas y demostrar sus sitios de expresión. Esta estrategia de uso particular en la determinación de secuencias expresadas diferen-cialmente dentro del cerebro. Necesariamente es una meta eventual de este estudio lograr el cierre; es decir, identificar todos los ARNms . El cierre puede ser difícil de obtener debido a la prevalencia diferente de diferentes ARNms, y al gran número de ARNms distintos expresados por muchos tejidos distintos. El esfuerzo por obtenerlo permite obtener una descripción progresivamente más confiable de las dimensiones del espacio genético. Los estudios realizados en el laboratorio de Craig Venter ( .D. Adams y colaboradores, "Complementary DNA Sequen-cing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Proyect", Science 252:1651-1656 (1991); M.D. Adams y colaboradores, "Sequence Identification of 2,375 Human Brain Genes", Nature 355:632-634 (1992) ) han dado como resultado el aislamiento de clonas de ADNc aleatoriamente seleccionados de ARNms de cerebro humano, la determinación de secuencias cortas de un solo paso de sus extremos 3', aproximadamente 300 pares de bases, y una compilación de unos 2,500 de éstos como una base de datos de "marcas de secuencia expresadas". Esta base de datos, aunque es útil, fracasa para proporcionar algún conocimiento de la expresión diferencial. Por consiguiente, es importante poder reconocer los genes basándose en su patrón de expresión global dentro de las regiones del cerebro y otros tejidos, y en respuesta a diferentes paradigmas, tales como diferentes estados fisiológicos o patológicos, o los efectos del tratamiento con fármacos, en lugar de simplemente su expresión en un solo tejido. Otro trabajo se ha enfocado en el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para establecer una base de datos. Williams y colaboradores (J.G.K. Williams y colaboradores, "DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Useful as Genetic Markers", Nucí. Acids Res. 18:6531-6535 (1990)) y Welsh y McClelland (J. Welsh y McClelland, "Genomic Fingerprinting Using Arbitrarily Primed PCR and a Matrix of Pairwise Combina-tions of Primers", Nucí. Acids Res. 18:7213-7218 (1990)) demostraron que los cebadores individuales 10-mer de secuencias arbitrariamente seleccionadas, es decir, cualquier cebador 10-mer del anaquel, cuando se utilizan para reacción en cadena de la polimerasa con plantillas de ADN complejas, tales como ADN genómico humano, de plantas, de levadura o bacteriano, daban lugar a un arreglo de productos de reacción en cadena de la polimerasa. Se demostraron que los eventos cebadores involucran una complementariedad incompleta entre el cebador y el ADN de plantilla. Presumiblemente, los sitios de enlace de cebador parcialmente mal apareados se distribuyen aleatoriamente a través del genoma. Ocasionalmente, dos de estos sitios en orientación opuesta se localizaron suficientemente cerca entre sí, para dar lugar a una banda de producto de reacción en cadena de la polimerasa. Hubo en promedio de 8 a 10 productos, que variaron en tamaño de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 4 kb, y tuvieron diferentes movilidades para cada cebador. El arreglo de productos de reacción en cadena de la polimerasa exhibió diferencias entre los individuos de la misma especie. Estos autores propusieron que los cebadores arbitrarios individuales se podrían utilizar para producir información de tipo de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) para los estudios genéticos. Otros han aplicado esta tecnología (S.R. Woodward y colaboradores, "Random Sequence Oligonucleotide Primers Detect Polymorphic DNA Products Which Segregate in Inbred Strains of Mice" , Mamm. Genome 3:73-78 (1992); J.H. Nadeau y colaboradores, "Multilocus Markers for Mouse Genome Analysis: PCR Amplification Based on Single Primers of Arbitrary Nucleotide Sequence", Mamm. Genome 3 :55-64 (1992) ) . Dos grupos (J. Welsh y colaboradores, "Arbitrarily Primer PCR Fingerprinting of R A" , Nucí. Acids Res. 20:4965-4970 (1992) ; P. Liang y A.B. Pardee, "Differential Display of Eukaryotic Messenger RNA by Means of the Polymerase Chain Reaction" , Science 257:967-971 (1992)) adaptaron el método para comparar las poblaciones de ARNm. En el estudio de Liang y Pardee, este método, denominado exhibición diferencial de ARNm, se utilizó para comparar la población de ARNms expresados por dos tipos de células relacionados, células A31 de ratón normales y tumorigénicas . Para cada experimento, utilizaron un 10-mer arbitrario como el cebador 5', y un oligonucleótido complementario para un subconjunto de colas poli-A como un cebador de ancla 3', realizando la amplificación de reacción en cadena de la polimerasa en la presencia de 35S-dNTPs sobre los ADNcs preparados a partir de los dos tipos de células. Los productos se resolvieron sobre geles de secuenciamiento, y se observaron de 50 a 100 bandas de 100 a 500 nucleótidos. Las bandas presumiblemente resultaron de la amplificación de los ADNcs correspondientes a los extremos 31 de los ARNms que contienen el complemento del cebador de ancla 3' y un sitio cebador 5' parcialmente mal apareado, como se había observado en las plantillas de ADN genómico. Por cada par cebador, el patrón de bandas amplificadas a partir de los dos ADNcs era similar, siendo las intensidades de aproximadamente el 80 por ciento de las bandas indistinguibles.

Algunas de las bandas eran más intensas en una o en la otra de las mezclas de reacción en cadena de la polimerasa; unas cuantas se detectaron solamente en una de las dos muestras . Los estudios adicionales (P. Liang y colaboradores, "Distribution and Cloning of Eukaryotic mRNAs by Means of Differential Display: Refinements and Optimization, "Nucí. Acids Res . 21:3269-3275 (1993)) han demostrado que el procedimiento funciona con bajas concentraciones de ARN de entrada (aunque no es cuantitativo para las especies más raras) , y la especificidad reside primariamente en el último nucleótido del cebador de ancla 31. Cuando menos un tercer producto de los productos de reacción en cadena de la polimerasa diferencialmente detectados identificados, corresponde a ARNs diferencialmente expresados, con un índice positivo falso de cuando menos el 25 por ciento. Si fueran accesibles todos los 50,000 a 100,000 ARNms del mamífero para este planteamiento de reacción en cadena de la polimerasa de cebador arbitrario, entonces se requerirían de aproximadamente 80 a 95 cebadores arbitrarios 5', y 12 cebadores de ancla 3' en aproximadamente 1,000 paneles de reacción en cadena de la polimerasa y geles para dar una posibilidad, calculada por la distribución de Poisson, de que aproximadamente dos terceras partes de estos ARNms serían identificados. Es poco probable que todos los ARNms sean susceptibles a la detección mediante este método por las siguientes razones. Para un ARNm en la superficie en este estudio, debe ser suficien-temente prevalente para producir una señal en el autorradiografo y contener una secuencia en sus 500 nucleótidos 31 capaces de servir como un sitio para el enlace y el cebado del cebador mal apareado. Mientras más prevalente sea una especie de AR m individual, más posiblemente sería generar un producto. Por consiguiente, las especies prevalentes pueden dar banda con muchos cebadores arbitrarios diferentes. Debido a que esta última propiedad contendría un elemento impredecible de oportunidad, basándose en la selección de los cebadores arbitrarios, sería difícil aproximar el cierre mediante el método de cebador arbitrario. También, para que la información sea portátil desde un laboratorio hasta otro, y confiable, el cebado mal apareado debe ser altamente reproducible bajo diferentes condiciones de laboratorio utilizando diferentes máquinas de reacción en cadena de la polimerasa, con la ligera variación resultante en las condiciones de reacción. Debido a que se entiende mal la base para el cebado mal apareado, éste es un inconveniente de la construcción de una base de datos a partir de datos obtenidos mediante el método de exhibición diferencial de Liang y Pardee. Por consiguiente, existe una necesidad de un método mejorado de exhibición diferencial de especies de ARNm que reduzca el aspecto incierto de la generación del extremo 51 , y que permita que los datos sean absolutamente reproducibles en diferentes establecimientos. De preferencia, este método no depende del cebado mal apareado potencialmente irreproducible . De preferencia, este método reduce el número de paneles de reacción en cadena de la polimerasa y geles requeridos para un estudio completo, y permite que se acumulen rápidamente los datos de secuencias de doble cadena. De preferencia, este método mejorado también reduce, si no es que elimina, el número de señales concurrentes obtenidas a partir de la misma especie de ARNm. Compendio Hemos desarrollado un método mejorado para la identificación simultánea específica de la secuencia de ARNms en una población de ARNm. En general, este método comprende: (1) preparar ADNcs de doble cadena a partir de una población de ARNm utilizando una mezcla de 12 cebadores de ancla, incluyendo cada cebador de ancla: (i) un tramo de 7 a 40 residuos T; (ii) un sitio para disociación mediante una endonucleasa de restricción que reconoce más de seis bases, localizándose el sitio para asociación en el lado 5' del tramo de residuos T; (iii) un primer segmento rellenador de 4 a 40 nucleótidos, localizándose el primer segmento rellenador en el lado 5' del sitio para disociación mediante la endonucleasa de restricción, y (iv) residuos de fase -V-N localizados en el extremo 3' de cada uno de los cebadores de ancla, donde V es un desoxirribonucleóti-do seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T, incluyendo la mezcla cebadores de ancla que contienen todas las posibilidades para V y N; (2) producir insertos clonados a partir de una célula anfitriona adecuada que se haya transformado mediante un vector, teniendo el vector la muestra de ADNc que se haya disociado con una primera endonucleasa de restricción y una segunda endonuclea-sa de restricción insertada en el mismo, insertándose la muestra de ADNc disociado en el vector en una orientación que sea anti-sentido con respecto a un promotor específico del bacteriófago adentro del vector, reconociendo la primera endonucleasa de restricción una secuencia de cuatro nucleótidos, y disociándose la segunda endonucleasa de restricción en un solo sitio adentro de cada miembro de la mezcla de cebadores de ancla; (3) generar fragmentos linearizados de los insertos clonados mediante digestión con cuando menos una endonucleasa de restricción que sea diferente de las primera y segunda endonu-cleasas de restricción; (4) generar una preparación de ARNc de transcripciones de ARNc anti-sentido mediante incubación de los fragmentos linearizados con una polimerasa de ARN específica del bacteriófago capaz de iniciar la transcripción desde el promotor específico del bacteriófago; (5) dividir la preparación de ARNc en dieciséis subgrupos, y transcribir el ADNc de la primera cadena de cada subgrupo, utilizando una transcriptasa inversa termoestable y uno de dieciséis cebadores de transcriptasa inversa 5', cuyo término 3 ' sea -N-N, donde N sea uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de cuando menos 15 nucleótidos de longitud, correspondiendo en la secuencia al extremo 3' del promotor específico del bacteriófago, y extendiéndose a través hasta cuando menos los primeros dos nucleótidos del ARNc, incluyendo la mezcla todas las posibilidades para los dos nucleótidos 31 -terminales ; (6) utilizar el producto de la transcripción en cada uno de los dieciséis subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 31 que corresponda en la secuencia a una secuencia en el vector adjunto al sitio de inserción de la muestra de ADNc en el vector y con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 51 seleccionado a partir del grupo que consiste en: (i) el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo; (ii) el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para este subgrupo extendido en su término 31 mediante un residuo adicional -N, donde N puede ser cualquiera de A, C, G o T; y (iii) el cebador de transcriptasa inversa 5' utilizado para la síntesis del ADNc de la primera cadena para ese subgrupo extendido en su término 3 ' por dos residuos adicionales -N-N, donde N puede ser cualquiera de A, C, G o T, para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa; y (7) resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa mediante electroforesis para exhibir las bandas que representen los extremos 3 ' de los ARNms presentes en la muestra . En otra modalidad preferida, el método comprende los pasos de : (a) preparar una población de ADNc de doble cadena a partir de una población de ARNm utilizando una mezcla de cebadores de ancla, incluyendo cada cebador de ancla: (i) un tramo de 7 a 40 residuos T; (ii) un sitio para disociación mediante una endonucleasa de restricción que reconoce más de seis bases, localizándose el sitio para asociación en el lado 5' del tramo de residuos T; (iii) un primer segmento rellenador de 4 a 40 nucleótidos, localizándose el primer segmento rellenador en el lado 51 del sitio para disociación mediante la primera endonucleasa de restricción, y (iv) residuos de fase localizados en el extremo 31 de cada uno de los cebadores de ancla seleccionados a partir del grupo que consiste en -V y -V-N, donde V es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T, incluyendo la mezcla cebadores de ancla que contienen todas las posibilidades para V y N, donde los residuos de fase en la mezcla son definidos por uno de -V o -V-N; (b) disociar la población de ADNc de doble cadena con la primera endonucleasa de restricción y con una segunda endonucleasa de restricción, reconociendo la segunda endonucleasa de restricción una secuencia de cuatro nucleótidos, para formar una población de moléculas de ADNc de doble cadena que tienen primero y segundo términos, respectivamente; (c) insertar las moléculas de ADNc de doble cadena del paso (b) cada una en un vector en una orientación que sea anti-sentido con respecto a un promotor específico del bacteriófago adentro del vector, para formar una población de vectores que contengan las moléculas de ADNc insertadas, definiendo esta inserción las secuencias de vector de flanqueo 3' y 5', de tal manera que 51 esté corriente arriba desde la cadena en sentido del ADNc insertado, y 3' esté corriente abajo de la cadena en sentido, y teniendo este vector una secuencia de nucleótidos de flanqueo 31 de cuando menos 15 nucleótidos de longitud entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y un sitio que defina el iniciador de transcripción en este promotor; (d) generar fragmentos linearizados que contengan las moléculas de ADNc insertadas mediante digestión de los vectores producidos en el paso (c) con cuando menos una endonucleasa de restricción que no reconozca las secuencias en las moléculas de ADNc insertadas o en el promotor específico del bacteriófago, pero que sí reconozca las secuencias en el vector, de tal manera que los fragmentos linearizados resultantes tengan una secuencia de vector de flanqueo 5' de cuando menos 15 nucleótidos 5' para el sitio de inserción de la muestra de ADNc en el vector en el segundo término del ADNc . (e) generar una preparación de ARNc de transcripciones de ARNc anti-sentido mediante incubación de los fragmentos linearizados con una polimerasa de ARN específica del bacteriófago capaz de iniciar la transcripción desde el promotor específico del bacteriófago; (f) dividir la preparación de ARNc en subgrupos, y transcribir el ADNc de la primera cadena de cada subgrupo, utilizando una transcriptasa inversa y uno de los cebadores de transcriptasa inversa 5 ' definidos por tener un término 3 ' consistente en -Nx, donde "N" es uno de los cuatro desoxirribonu-cleótidos A, C, G o T, y "x" es un entero de 1 a 5, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud, y complementario para la secuencia de vector de flanqueo 5 ' , extendiéndose la complementariedad del cebador de transcriptasa inversa 5' a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x", donde se utilice un cebador diferente de los cebadores de transcriptasa inversa 5' en los diferentes subgrupos, y donde haya cuatro subgrupos si "x" =1, 16 subgrupos si "x" =2, 64 subgrupos si "x" = 3, 256 subgrupos si "x" = 4, y 1,024 subgrupos Si "X" = 5; (g) utilizar el producto de la transcripción del ADNc de la primera cadena en cada uno de los subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' de 15 a 30 nucleótidos de longitud que sea complementario para las secuencias del vector de flanqueo 31 entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y el sitio que defina el inicio de la transcripción mediante el promotor específico del bacteriófago, y un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' que tenga un término 31 consistente en -Nx-Ny, donde "N" y "x" son como en el paso (f) , -Nx es la misma secuencia que en el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del que se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo, e "y" es un entero, de tal manera que x + y es igual a un entero seleccionado a partir del grupo que consiste en 3, 4, 5 y 6, siendo el cebador de 15 a 30 nucleótidos de longitud y complementario para la secuencia del vector de flanqueo 5', extendiéndose la complementariedad del cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x + y", para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa, y (h) resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa para generar una exhibición de productos específicos de la secuencia que representen los extremos 31 de diferentes ARNms presentes en la población de ARNm. Normalmente, los cebadores de ancla cada uno tienen 18 residuos T en el tramo de residuos T, y el primer segmento de relleno de los cebadores de ancla es de 14 residuos de longitud. Una secuencia adecuada para el primer segmento de relleno es A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C (SEQ ID N0:1) . Normalmente, el sitio para la disociación mediante una primera endonucleasa de restricción que reconozca más de seis bases es el sitio de disociación Notl . Los cebadores de ancla adecuados también pueden comprender un segundo segmento de relleno interpuesto entre el sitio para la disociación mediante una primera endonucleasa de restricción que reconozca más de seis bases, y el tramo de residuos T. Los residuos de fase que están en el extremo 3 ' del cebador de ancla y 31 para el tramo de residuos T, se seleccionan a partir del grupo que consiste en -V y -V-N, donde V es un desoxirribonucleó-tido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T. En una modalidad preferida, el cebador de ancla tiene la secuencia A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (SEQ ID NO:2), incluyendo un primer segmento de relleno de A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C que está a 5' para el sitio Notl G-C-G-G-C-C-G-C, una segunda secuencia de relleno A-G-G-A-A interpuesta entre el sitio de disociación de endonucleasa de restricción y el tramo de residuos T, y los residuos de fase -V-N. En otras modalidades preferidas, los residuos de fase del cebador de ancla utilizados en el paso (a) son -V.

Normalmente, la primera endonucleasa de restricción que reconoce más de seis bases se selecciona a partir del grupo que consiste en AscI, Bael. Fsel . Notl, Pací , Pmel, PpuMl , RsrII , SapI , SexAI . Sfil, SqfI . S rAI . SrfI . Sse8387I y S aI . Normalmen-te, la segunda endonucleasa de restricción que reconoce una secuencia de cuatro nucleótidos se selecciona a partir del grupo que consiste en Mbol . Dpnll, Sau3AI , Tsp5091. Hpall . Bfal . Csp61 , Msel, Hhal, NlalII. Taal , MspI . MaeII e HinPlI . Normalmente el valor de "x" en el paso (f) es 1 o 2. Normalmente el valor de "y" en el paso (g) es 3 o 4. En una modalidad, los residuos de fase en el paso (a) son -V-N, "x" en el paso (f) es 2, e "y" en el paso (g) es 2. En otra modalidad, los residuos de fase en el paso (a) son -V-N, "x" en el paso (f) es 1, "y" en el paso (g) es 3. En otra modalidad, los residuos de fase en el paso (a) son -V-N, "x" en el paso (f) es 1, e "y" en el paso (g) es 4. En otra modalidad, los residuos de fase en el paso (a) son -V, "x" en el paso (f) es 1, e "y" en el paso (g) es 3. En una modalidad adicional, los residuos de fase en el paso (a) son -V, "x" en el paso (f) es 1, e "y" en el paso (g) es 4. Normalmente, los cebados de ancla cada uno tienen 18 residuos T en el tramo de residuos T, y el primer segmento de relleno de los cebadores de ancla es de 14 residuos de longitud. Los vectores adecuados son pBC S + y pBS SK+ (Stratage-ne) . En otro aspecto, la invención proporciona vectores mejorados basados en pBS SK+ que se diseñan para la práctica de la invención, tales como pBS SK+/DGT1, pBS SK+/DGT2 y pBS SK+/DGT3 , descritos con detalle más adelante. Estos vectores mejorados también se pueden basar en pBC SK+ u otros vectores adecuados bien conocidos por un experto en la materia. Los vectores preferidos son los vectores mejorados basados en el vector del plásmido pBluescript (pBS o PBC) SK+ (Stratagene) , donde se removió una porción de la secuencia de nucleótidos desde las posiciones 656 a 764, y fue reemplazada con una secuencia de cuando menos 110 nucleótidos que incluía un sitio de endonucleasa de restricción Notl . Esta región, designada como el sitio de clonación múltiple (MCS) , se extiende en la porción de la secuencia de nucleótidos desde el sitio SacI hasta el sitio Kpnl . El vector puede ser el plásmido pBC SK+ disociado con Clal y Notl, en cuyo caso, el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' en el paso (6) puede ser G-A-A-C-A-A-A-A-G-C-T-G-G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C (SEQ ID NO:4) . En la modalidad preferida, el vector se selecciona a partir del grupo que consiste en pBC SK\ pBS SK+ y pBS SK+ y pBS SK+/DGT1, y el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' en el paso (f) es G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T (SEQ ID NO:18). Normalmente, la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) tiene un reconocimiento de secuencia de nucleótidos que incluyen la secuencia de cuatro nucleótidos de la segunda endonucleasa de restricción utilizada en el paso (b) . En general, los sitios para estas endonucleasas de restricción deben estar en la secuencia del vector 5' para el sitio Clal . así como en el sitio de clonación múltiple entre el sitio Clal y el sitio Notl . En una modalidad, el vector es el plásmido pBC SK+, y se utiliza MspI , tanto como la segunda endonucleasa de restricción, como la endonucleasa de restricción de linearización utilizada en el paso (d) . En otra modalidad, el vector es el plásmido pBC SK+, la segunda endonucleasa de restricción se selecciona a partir del grupo que consiste en MspI , Maell, Taql y HinPlI y la linearización del paso (d) se realiza mediante una primera digestión con Smal . seguida por una segunda digestión con una mezcla de Kpnl y Apal . En otras modalidades, el vector se selecciona a partir del grupo que consiste en pBS SK+ /DGT1, pBS SK+ /DGT2 y pBS SK+ /DGT3. En estas modalidades, se proporciona una combinación de enzimas adecuada, donde la segunda endonucleasa de restricción es MspI . y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) es Smal . Se proporciona otra combinación adecuada, donde la segunda endonucleasa de restricción es Taql . y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) es Xhol . Se proporciona una combinación adecuada adicional, donde la segunda endonucleasa de restricción es HinPlI, y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) es NarI . Todavía se proporciona otra combinación adecuada, donde la segunda endonucleasa de restricción es Maell, y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) es Aatll. Normalmente, el promotor específico del bacteriófago se selecciona a partir del grupo que consiste en el promotor T3, el promotor T7 y el promotor SP6. Más típicamente, es el promotor T3. Normalmente, los dieciséis cebadores de transcriptasa inversa 5' para cebar la transcripción del ADNc a partir del ARNc tienen la secuencia A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO: 3) . En otra modalidad preferida, los cuatro cebadores de transcriptasa inversa 51 para cebar la transcripción del ADNc a partir del ARNc tienen la secuencia G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO: 9) . La segunda endonucleasa de restricción que reconoce una secuencia de cuatro nucleótidos es normalmente MspI : de una manera alternativa, puede ser Taql . Maell o HinPlI. La endonucleasa de restricción que se disocia en un solo sitio en cada mezcla de cebadores de ancla es típicamente Notl . Normalmente, la población de ARNm se ha enriquecido para las especies de ARNm poliadeniladas . Una célula anfitriona típica es una cepa de Escherichia coli . El paso de generar fragmentos linearizados de los insertos clonados normalmente comprende: (a) dividir el plásmido que contiene el inserto en dos fracciones, una primera fracción disociada con la endonucleasa de restricción Xhol , y una segunda fracción disociada con la endonucleasa de restricción Salí; (b) recombinar las primera y segunda fracciones después de la disociación; (c) dividir las fracciones recombinadas en tercios, y disociar el primer tercio con la endonucleasa de restricción HindIII . el segundo tercio con la endonucleasa de restricción BamHl . y el tercer tercio con la endonucleasa de restricción EcoRI ; y (d) recombinar los tercios después de la digestión con el objeto de producir una población de fragmentos linearizados, de los cuales aproximadamente una sexta parte de la población corresponde al producto de disociación por cada una de las posibles combinaciones de enzimas. En otra modalidad, donde se selecciona el vector a partir del grupo que consiste en pBC SK+ y pBS SK+, y MspI es la segunda endonucleasa de restricción, MspI se puede utilizar como la endonucleasa de restricción de linearización utilizada en el paso (d) . De una manera alternativa, donde el vector sea el plásmido pBC SK+, la linearización se puede realizar mediante una primera digestión con Smal .. seguida por una segunda digestión con una mezcla de Kpnl y Apal . En otras modalidades, el vector se selecciona a partir del grupo que consiste en pBS SK+ /DGTl, pBS SK+ /DGT2 y pBS SIC /DGT3, y la endonucleasa de restricción de linearización utilizada en el paso (d) se selecciona a partir del grupo que consiste en Smal , Xhol . NarI y AatlI . Normalmente, el paso de resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa mediante electroforesis, comprende electroforesis de los fragmentos sobre cuando menos dos geles . Cada producto de reacción en cadena de la polimerasa específico de la secuencia, o fragmento amplificado con reacción en cadena de la polimerasa, se identifica mediante una dirección digital que consiste en un identificador de secuencia, la longitud del producto en residuos de nucleótidos, y la intensidad de la marca del producto de reacción en cadena de la polimerasa, definida como el área debajo del pico de la salida del detector para ese producto de reacción en cadena de la polimerasa. El identificador de secuencia se define por un componente 5 ' y un componente 3'. El componente 5' del identifi-cador de secuencia es el sitio de reconocimiento de la segunda endonucleasa de restricción utilizada para disociar la población de ADNc de doble cadena preparada a partir de la población de ARNm original. Normalmente, la endonucleasa de restricción es MspI , y el componente 5' del identificador de secuencia es -C-C-G-G. El componente 3' del identificador de secuencia es la secuencia definida por la secuencia del término 31 del cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' . Por ejemplo, el componente 3 ' del identificador de secuencia del producto de reacción en cadena de la polimerasa indicado como "111" en la Figura 2 es -C-T-G-C. Por consiguiente, en este caso, el identificador de secuencia sería -C-C-G-G-C-T-G-C . Normalmente, se construye una base de datos que comprende la dirección digital, como se definió anteriormente, como el identificador de secuencia, y la longitud del producto de reacción en cadena de la polimerasa específico de la secuencia en residuos de nucleótidos y la intensidad de la marca del producto de reacción en cadena de la polimerasa, definida como el área debajo del pico de la salida del detector para ese producto de reacción en cadena de la polimerasa, y se mantiene utilizando hardware de computación y software de computación adecuados . De preferencia, esta base de datos comprende además los datos con respecto a las relaciones de secuencias, mapeo genético, distribuciones celulares, condiciones de tratamiento experimental, y cualquier otra información que se considere pertinente para la función genética. El método puede comprender además determinar la secuencia del extremo 3' de cuando menos uno de los ARNms, tal como mediante : (l) eluir cuando menos un ADNc correspondiente a un ARNm a partir de un electroferograma, donde se exhiban las bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la muestra; (2) amplificar el ADNc eluido en una reacción en cadena de la polimerasa; (3) clonar el ADNc amplificado en un plásmido; (4) producir ADN correspondiente al ADN clonado a partir del plásmido; y (5) secuenciar el ADNc clonado. Otro aspecto de la invención es un método para la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti -sentido que represente los extremos 3' de una población de ARNms, siendo los ARNcs anti-sentido que sean miembros del grupo de ARNc antisentido terminados en su extremo 5' con una secuencia cebadora correspondiente a un vector específico del bacteriófago, y su extremo 31 con una secuencia correspondiente en su secuencia a una secuencia del vector. El método comprende: (1) dividir los miembros del grupo de ARNc anti-sentido en dieciséis subgrupos, y transcribir el ADNc de la primera cadena de cada subgrupo utilizando una transcriptasa inversa termoestable y uno de dieciséis cebadores de transcriptasa inversa 5', cuyo término 3' sea -N-N, donde N sea uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de cuando menos 15 nucleótidos de longitud, correspondiendo en su secuencia al extremo 3 ' del promotor específico del bacteriófago, y extendiéndose a través de cuando menos los primeros dos nucleótidos del ARNc, incluyendo la mezcla todas las posibilidades para los dos nucleótidos 3'-terminales ; (2) utilizar el producto de la transcripción en cada uno de los dieciséis subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' que corresponde en su secuencia a un vector de secuencia unido al sitio de inserción de la muestra de ADNc en el vector, y un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' seleccionado a partir del grupo que consiste en: (i) el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo; (ii) el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo extendido en su término 31 por un residuo adicional -N, donde N puede ser cualquiera de A, C, G o T; y (iii) el cebador de transcriptasa inversa 5' utilizado para la síntesis del ADNc de la primera cadena para ese subgrupo extendido en su término 31 por dos residuos adicionales -N-N, donde N puede ser cualquiera de A, C, G o T, para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa; (3) resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa mediante electroforesis, para exhibir las bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la muestra. En otra modalidad preferida, el método comprende: (1) dividir la preparación de AR c en subgrupos, y transcribir el ADNc de la primera cadena de cada subgrupo, utilizando una transcriptasa inversa y uno de los cebadores de transcriptasa inversa 5' definidos por tener un término 3' consistente en -Nx, donde "N" es uno de los cuatro desoxirribonu-cleótidos A, C, G o T, y "x" es un entero de 1 a 5, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de 15 a 30 nucleotidos de longitud, y complementario para la secuencia de vector de flanqueo 51 , extendiéndose la complementariedad del cebador de transcriptasa inversa 5' a través de los nucleotidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleotidos igual a "x" , donde se utilice un cebador diferente de los cebadores de transcriptasa inversa 5' en los diferentes subgrupos, y donde haya cuatro subgrupos si "x" =1, 16 subgrupos si "x" =2, 64 subgrupos si "x" = 3, 256 subgrupos si "x" = 4, y 1,024 subgrupos si "x" = 5; (2) utilizar el producto de la transcripción del ADNc de la primera cadena en cada uno de los subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' de 15 a 30 nucleotidos de longitud que sea complementario para las secuencias del vector de flanqueo 3 ' entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y el sitio que defina el inicio de la transcripción mediante el promotor específico del bacteriófago, y un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' que tenga un término 31 consistente en -Nx-Ny, donde "N" y "x" son como en el paso (f) , -Nx es la misma secuencia que en el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del que se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo, e "y" es un entero, de tal manera que x + y es igual a un entero seleccionado a partir del grupo que consiste en 3, 4, 5 y 6, siendo el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud y complementario para la secuencia del vector de flanqueo 5 ' , extendiéndose la complementariedad del cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x + y", para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa, y (3) resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa para generar una exhibición de productos específicos de la secuencia que representen los extremos 31 de diferentes ARNms presentes en la población de ARNm. Todavía otro aspecto de la presente invención es un método para detectar un cambio en el patrón de expresión del ARNm en un tejido asociado con un cambio fisiológico o patológico. Este método comprende los pasos de: (1) obtener una primera muestra de un tejido que no sea objeto del cambio fisiológico o patológico; (2) determinar el patrón de expresión del ARNm en la primera muestra del tejido, realizando los pasos (l)-(3) del método descrito anteriormente, para la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido que representen los extremos 3' de una población de ARNms, para generar una primera exhibición de bandas que representen los extremos 3 ' de los ARNms presentes en la primera muestra; (3) obtener una segunda muestra del tejido que haya sido el objeto de un cambio fisiológico o patológico; (4) determinar el patrón de expresión del ARNm en la segunda muestra del tejido, realizando los pasos (l)-(3) del método descrito anteriormente, para la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido, para generar una segunda exhibición de bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la segunda muestra; y (5) comparar las primera y segunda exhibiciones para determinar el efecto del cambio fisiológico o patológico sobre el patrón de expresión del ARNm en el tejido. La comparación normalmente se hace en pistas adyacentes . El tejido se puede derivar a partir del sistema nervioso central, o a partir de estructuras particulares dentro del sistema nervioso central. El tejido alternativamente se puede derivar a partir de otro órgano o sistema de órganos. Otro aspecto de la presente invención es un método para rastrear un efecto secundario de un fármaco. El método comprende los pasos de: (1) obtener una primera muestra de tejido a partir de un organismo tratado con un compuesto de una función fisiológica conocida; (2) determinar el patrón de expresión de ARNm en la primera muestra del tejido, realizando los pasos (l)-(3) del método descritos anteriormente, para la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido, para generar una primera exhibición de bandas que representen los extremos 31 del ARNms presentes en la primera muestra; (3) obtener una segunda muestra de tejido a partir de un organismo tratado con un fármaco que se vaya a rastrear para determinar un efecto secundario; (4) determinar el patrón de expresión del ARNm en la segunda muestra del tejido, realizando los pasos (l)-(3) del método descrito anteriormente, para la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido, para generar una segunda exhibición de bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la segunda muestra; y (5) comparar las primera y segunda exhibiciones, con el objeto de detectar la presencia de las especies de ARNm cuya expresión no sea afectada por el compuesto conocido, pero sea afectada por el fármaco que se vaya a rastrear, indicando de esta manera una diferencia en la acción del fármaco que se vaya a rastrear y el compuesto conocido, y por lo tanto, un efecto secundario . El fármaco que se va a rastrear puede ser un fármaco que afecte el sistema nervioso central, tal como un antidepresivo, un neuroléptico, un tranquilizante, un anticonvulsionante, un inhibidor de oxidasa de monoamina, o un estimulante. De una manera alternativa, el fármaco puede ser otra clase de fármaco, tal como un agente anti-parkinsonismo, un relajante del músculo esquelético, un analgésico, un anestésico local, un colinérgico, un antiespasmódico, un esteroide, o un fármaco anti- inflamatorio no esteroidal . Otro aspecto de la presente invención es de paneles de cebadores y mezclas degeneradas de cebadores adecuadas para la práctica de la presente invención. Estos incluyen: (1) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden 16 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID N0:3), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T. (2) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden 64 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID N0:5), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; (3) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 256 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 6) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; (4) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 1,024 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO:24), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; y (5) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 4,096 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 25) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; y (6) un panel de cebadores de ancla que comprenden 12 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T (SEQ ID NO: 2) , donde V es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T; (7) un panel de cebadores de ancla que comprenden 3 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T (SEQ ID NO: 23) , donde V es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; (8) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden cuatro diferentes oligonucleótidos , cada uno teniendo la secuencia G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO: 9) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G O T; (9) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden 16 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID N0:7), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (10) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 64 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID NO: 13) ,· donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (11) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 256 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 14) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (12) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 1,024 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 15) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (13) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 4,096 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 16) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleóti-dos A, C, G o T; (14) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden cuatro diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia C-T-T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO: 10) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleóti-dos A, C, G o T; (15) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden 16 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia T-T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO: 11) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; (16) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 64 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID NO: 12) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; (17) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 256 diferentes oligonucleó idos, cada uno teniendo la secuencia C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 17) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; (18) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 1,024 diferentes oligonucleó idos , cada uno teniendo la secuencia A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 26) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonu-cleótidos A, C, G o T; (19) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 4,096 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 27, donde N es uno de los cuatro desoxirribonu-cleótidos A, C, G o T; (20) una mezcla degenerada de cebadores de ancla que comprenden una mezcla de 3 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (SEQ ID NO:23), donde V es un desoxirribonu-cleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G, estando cada uno de los 3 cebadores presentes en aproximadamente una cantidad equimolar; y (21) una mezcla degenerada de cebadores de ancla que comprenden una mezcla de 12 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (SEQ ID NO: 2) , donde V es un desoxirribonu-cleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que cosiste en A, C, G y T, estando cada uno de los 12 cebadores presentes en aproximadamente una cantidad equimolar.

Breve Descripción de los Dibujos Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención llegarán a entenderse mejor con referencia a la siguiente descripción, a las reivindicaciones adjuntas, y a los dibujos acompañantes, donde: La Figura 1 es una ilustración diagramática del método de la presente invención, que muestra las diferentes etapas de cebado, disociación, clonación y amplificación. La Figura 2 es un autorradiograma de un gel que muestra el resultado de realizar el método de la presente invención, utilizando varios cebadores 5' en el paso de reacción en cadena de la polimerasa, que corresponden a las secuencias conocidas de los ARNms del cerebro, y que utilizan el ARNm del hígado y del cerebro como material de partida. La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótido de los sitios de clonación múltiple de los plásmidos pBS SK+/DGT1, pBS SK+/DGT2 y pBS SK+/DGT3. Descripción Hemos desarrollado un método para la identificación simultánea específica de la secuencia y la exhibición de ARNms en una población de ARNm. Como se describe más adelante, este método tiene un número de aplicaciones en el rastreo de fármacos, en el estudio de condiciones fisiológicas y patológicas, y en el mapeo genómico. Estas aplicaciones se describirán enseguida.

Identificación Simultánea Específica de la Secuencia de ARNms Un método de conformidad con la presente invención, basado en la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , proporciona un medio para la visualización de casi todo ARNm expresado por un tejido como una banda distinta sobre un gel cuya intensidad corresponde regularmente a la concentración del ARNm. El método se basa en la observación de que virtualmente todos los ARNms concluyen con una cola poli- (A) 3', pero no se apoya en la especificidad del enlace del cebador a la cola. En general , el método comprende : Bloque A - página 6 (1) preparar ADNcs de doble cadena a partir de una población de ARNm utilizando una mezcla de 12 cebadores de ancla, incluyendo cada cebador de ancla: (i) un tramo de 7 a 40 residuos T; (ii) un sitio para disociación mediante una primera endonu-cleasa de restricción que reconoce más de seis bases, localizándose el sitio para asociación en el lado 5' del tramo de residuos T; (iii) un primer segmento rellenador de 4 a 40 nucleótidos, localizándose el primer segmento rellenador en el lado 5' del sitio para disociación mediante la endonucleasa de restricción, y (iv) residuos de fase -V-N localizados en el extremo 3' de cada uno de los cebadores de ancla, donde V es un desoxirribonucleóti-do seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T, incluyendo la mezcla cebadores de ancla que contienen todas las posibilidades para V y N; (2) producir insertos clonados a partir de una célula anfitriona adecuada que se haya transformado mediante un vector, teniendo el vector la muestra de ADNc que se haya disociado con una primera endonucleasa de restricción y una segunda endonuclea-sa de restricción insertada en el mismo, insertándose la muestra de ADNc disociado en el vector en una orientación que sea anti-sentido con respecto a un promotor específico del bacteriófago adentro del vector, reconociendo la segunda endonucleasa de restricción una secuencia de cuatro nucleótidos, y disociándose la primera endonucleasa de restricción en un solo sitio adentro de cada miembro de la mezcla de cebadores de ancla; (3) generar fragmentos linearizados de los insertos clonados mediante digestión con cuando menos una endonucleasa de restricción que sea diferente de las primera y segunda endonu-cleasas de restricción; (4) generar una preparación de ARNc de transcripciones de ARNc anti-sentido mediante incubación de los fragmentos linearizados con una polimerasa de ARN específica del bacteriófago capaz de iniciar la transcripción desde el promotor específico del bacteriófago; (5) dividir la preparación de ARNc en dieciséis subgrupos, y transcribir el ADNc de la primera cadena de cada subgrupo, utilizando una transcriptasa inversa termoestable y uno de dieciséis cebadores de transcriptasa inversa 5', cuyo término 3' sea -?-?, donde ? sea uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de cuando menos 15 nucleótidos de longitud, correspondiendo en la secuencia al extremo 3' del promotor especifico del bacteriófago, y extendiéndose a través hasta cuando menos los primeros dos nucleótidos del ARNc, incluyendo la mezcla todas las posibilidades para los dos nucleótidos 31 -terminales ; (6) utilizar el producto de la transcripción en cada uno de los dieciséis subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' que corresponda en la secuencia a una secuencia en el vector adjunto al sitio de inserción de la muestra de ADNc en el vector y con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' seleccionado a partir del grupo que consiste en.- (i) el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo; (ii) el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para este subgrupo extendido en su término 31 mediante un residuo adicional -N, donde N puede ser cualquiera de A, C, G o T; y (iii) el cebador de transcriptasa inversa 5' utilizado para la síntesis del ADNc de la primera cadena para ese subgrupo extendido en su término 31 por dos residuos adicionales -N-N, donde N puede ser cualquiera de A, C, G o T, para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa; y (7) resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa mediante electroforesis para exhibir las bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la muestra. En la Figura 1 se muestra una ilustración de este Esquema . En otra modalidad, el método comprende los pasos de: (a) preparar una población de ADNc de doble cadena a partir de una población de ARNm utilizando una mezcla de cebadores de ancla, incluyendo cada cebador de ancla: (i) un tramo de 7 a 40 residuos T; (ii) un sitio para disociación mediante una endonucleasa de restricción que reconoce más de seis bases, localizándose el sitio para asociación en el lado 5' del tramo de residuos T; (iii) un primer segmento rellenador de 4 a 40 nucleótidos, localizándose el primer segmento rellenador en el lado 51 del sitio para disociación mediante la primera endonucleasa de restricción, y (iv) residuos de fase localizados en el extremo 31 de cada uno de los cebadores de ancla seleccionados a partir del grupo que consiste en -V y -V-N, donde V es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T, incluyendo la mezcla cebadores de ancla que contienen todas las posibilidades para V y N, donde los residuos de fase en la mezcla son definidos por uno de -V o -V-N; (b) disociar la población de ADNc de doble cadena con la primera endonucleasa de restricción y con una segunda endonucleasa de restricción, reconociendo la segunda endonucleasa de restricción una secuencia de cuatro nucleótidos, para formar una población de moléculas de ADNc de doble cadena que tienen primero y segundo términos, respectivamente; (c) insertar las moléculas de ADNc de doble cadena del paso (b) cada una en un vector en una orientación que sea anti-sentido con respecto a un promotor específico del bacteriófago adentro del vector, para formar una población de vectores que contengan las moléculas de ADNc insertadas, definiendo esta inserción las secuencias de vector de flanqueo 3' y 5", de tal manera que 5' esté corriente arriba desde la cadena en sentido del ADNc insertado, y 3' esté corriente abajo de la cadena en sentido, y teniendo este vector una secuencia de nucleótidos de flanqueo 31 de cuando menos 15 nucleótidos de longitud entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y un sitio que defina el iniciador de transcripción en este promotor; (d) generar fragmentos linearizados que contengan las moléculas de ADNc insertadas mediante digestión de los vectores producidos en el paso (c) con cuando menos una endonucleasa de restricción que no reconozca las secuencias en las moléculas de ADNc insertadas o en el promotor específico del bacteriófago, pero que sí reconozca las secuencias en el vector, de tal manera que los fragmentos linearizados resultantes tengan una secuencia de vector de flanqueo 5' de cuando menos 15 nucleótidos 5' para el sitio de inserción de la muestra de ADNc en el vector en el segundo término del ADNc . (e) generar una preparación de AR c de transcripciones de ARNc anti- sentido mediante incubación de los fragmentos linearizados con una polimerasa de ARN específica del bacteriófago capaz de iniciar la transcripción desde el promotor específico del bacteriófago; (f) dividir la preparación de ARNc en subgrupos, y transcribir el ADNc de la primera cadena de cada subgrupo, utilizando una transcriptasa inversa y uno de los cebadores de transcriptasa inversa 5' definidos por tener un término 3' consistente en -Nx, donde "N" es uno de los cuatro desoxirribonu-cleótidos A, C, G o T, y "x" es un entero de 1 a 5, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud, y complementario para la secuencia de vector de flanqueo 5' , extendiéndose la complementariedad del cebador de transcriptasa inversa 51 a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x" , donde se utilice un cebador diferente de los cebadores de transcriptasa inversa 5' en los diferentes subgrupos, y donde haya cuatro subgrupos si "x" =1, 16 subgrupos si "x" =2, 64 subgrupos si "x" = 3, 256 subgrupos si "x" = 4, y 1,024 subgrupos si "x" = 5; (g) utilizar el producto de la transcripción del ADNc de la primera cadena en cada uno de los subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' de 15 a 30 nucleótidos de longitud que sea complementario para las secuencias del vector de flanqueo 31 entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y el sitio que defina el inicio de la transcripción mediante el promotor específico del bacteriófago, y un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' que tenga un término 3 ' consistente en -Nx-Ny, donde "N" y "x" son como en el paso (f) , -Nx es la misma secuencia que en el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del que se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo, e "y" es un entero, de tal manera que x + y es igual a un entero seleccionado a partir del grupo que consiste en 3, 4, 5 y 6, siendo el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud y complementario para la secuencia del vector de flanqueo 5', extendiéndose la complementariedad del cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' a través de los nucleótidos específicos del inserto del AR c en un número de nucleótidos igual a "x + y", para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa, y (h) resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa para generar una exhibición de productos específicos de la secuencia que representen los extremos 31 de diferentes ARNms presentes en la población de ARNm.

A. Aislamiento del ARNm El' primer paso en el método es el aislamiento o la provisión de una población de ARNm. Los métodos de extracción del ARN son bien conocidos en este campo, y se describe, por ejemplo, en J. Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), Volumen 1, Capítulo 7, "Extraction, Purifica-tion, and Analysis of Messenger RNA from Eukaryotic Cells", incorporado a la presente como referencia. Otros métodos de aislamiento y extracción también son bien conocidos. Normalmente, el aislamiento se realiza en la presencia de agentes caotrópicos, tales como cloruro de guanidinio o tiocianato de guanidinio, aunque alternativamente se pueden utilizar otros detergentes y agentes de extracción. Normalmente, el ARNm se aisla a partir del ARN extraído total mediante cromatografía sobre oligo (dT) -celulosa u otro medio cromatográfico que tenga la capacidad para fijar la porción 3' poliadenilada de las moléculas de ARNm. De una manera alternativa, pero menos preferiblemente, se puede utilizar el ARN total. Sin embargo, en general se prefiere aislar el ARN poli (A) + . B . Preparación del ADNc de Doble Cadena Luego se preparan los ADNcs de doble cadena a partir de la población de ARNm utilizando una mezcla de cebadores de ancla para iniciar la transcripción inversa. Los cebadores de ancla incluyen cada uno: (i) un trato de 7 a 40 residuos T; (ii) un sitio para disociación mediante una endonucleasa de restricción que reconozca más de seis bases, localizándose el sitio para disociación en el lado 5" del tramo de residuos T; (iii) un primer segmento de relleno de 4 a 40 nucleótidos, localizándose el primer segmento de relleno en el lado 5' del sitio para disociación mediante la endonucleasa de restricción; (iv) un segundo segmento de relleno de cero a ocho residuos interpuesto entre el sitio para disociación mediante una endonucleasa de restricción que reconozca más de seis bases, y el tramo de residuos T; y (v) residuos de fase seleccionados a partir del grupo que consiste en -V y -V-N localizados en el extremo 3 ' de cada uno de los cebadores de ancla, donde V es un desoxirribonu-cleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T. La mezcla incluye cebadores de ancla que contienen todas las posibilidades para V y N. Donde los cebadores de ancla tengan residuos de fase de -V, la mezcla comprende una mezcla de tres cebadores de ancla. Donde los cebadores de ancla tengan residuos de fase de -V-N, la mezcla comprende una mezcla de doce cebadores de ancla. Normalmente, los cebadores de ancla cada uno tienen 18 residuos T en el tramo de residuos T, y el primer segmento de relleno de los cebadores de ancla es de 14 residuos de longitud. Una secuencia adecuada del primer segmento de relleno es A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C (SEQ ID N0:1). Normalmente, el sitio para disociación mediante una endonucleasa de restricción que reconozca más de seis bases es el sitio de disociación Notl . Un conjunto preferido de tres cebadores de ancla tiene la secuencia A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (SEQ ID NO:23) . Otro conjunto preferido de doce cebadores de ancla tiene la secuencia A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (SEQ ID N0:2) . Un miembro de esta mezcla de cebadores de ancla inicia la síntesis en una posición fija en el extremo 3' de todas las copias de cada especie de ARNm en la muestra, definiendo de esta manera el punto del extremo 3' para cada especie. Esta reacción se realiza bajo condiciones para la preparación de ADNc de doble cadena a partir del ARNm, que son bien conocidas en la técnica. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en el Volumen 2 de J. Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", titulado "Construction and Analysis of cDNA Librarles". Las transcriptasas inversas adecuadas incluyen aquéllas de virus de mieloblastosis de ave (AMV) , y virus de leucemia de murino de Maloney (MMLV) . Una transcriptasa inversa preferida es la transcriptasa inversa de MMLV. C. Disociación de la Muestra de ADNc con Endonucleasas de Restricción.

La muestra de ADNc se disocia con dos endonucleasas de restricción. La primera endonucleasa de restricción reconoce un sitio más largo que seis bases, y se disocia en un solo sitio dentro de cada miembro de la mezcla de cebadores de ancla. La segunda endonucleasa de restricción es una endonucleasa que reconoce una secuencia de 4 nucleótidos . Estas endonucleasas normalmente se disocian en múltiples sitios en la mayoría de los ADNcs. Normalmente, la primera endonucleasa de restricción es Notl, y la segunda endonucleasa de restricción es MspI . La enzima Notl no se disocia dentro de la mayoría de los ADNcs. Esto es deseable para minimizar la pérdida de insertos clonados, que resultaría de la disociación de los ADNcs en localizaciones diferentes del sitio de ancla. De una manera alternativa, la segunda endonucleasa de restricción puede ser Taql, MaeII o HinPlI . El uso de las dos últimas endonucleasas de restricción puede detectar los ARNms que no sean disociados por MspI . La segunda endonucleasa de restricción genera una colgadura 5' compatible para la clonación en el vector deseado, como se describe más adelante. Esta clonación, por el vector seleccionado a partir del grupo que consiste en pBC SK\ pBC SK\ pBS SK+/DGT1, pBS SK+/DGT2 y pBS SK+/DGT3, está en el sitio Clal, como se describe más adelante. De una manera alternativa, se pueden utilizar otras endonucleasas de restricción adecuadas para determinar los ADNcs no disociados por las endonucleasas de restricción anteriores. En estas modalidades, las primeras endonucleasas de restricción adecuadas que reconocen más de seis bases son AscI , Bael, Fsel . Notl. Pací. Pmel, P^uMI, RsrII. Sapl. Se AI, Sfil. SgfI. SgrAI , SrfI . Sse8387I y SwaI . Las segundas endonucleasas de restricción adecuadas que reconocen una secuencia de cuatro nucleótidos son Mbol. Dpnll. Sau3AI . TSP509I ¦ Hpall. Bfal. CSP6I. Msel. Hhal, Nl_¾III, Taal. MSPI. MaeII y HinPII . Las condiciones para la digestión del ADNc son bien conocidas en la materia, y se describen, por ejemplo, en J. Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Volumen 1, Capítulo 5, "Enzymes Used in Molecular Cloning" . Inserción del ADNc Disociado en un Vector La muestra de ADNc disociada con las primera y segunda endonucleasas de restricción, se inserta entonces en un vector.

En general, un vector adecuado incluye un sitio de clonación múltiple que tenga un sitio de endonucleasa de restricción Notl . Un vector adecuado es el plásmido pBC SK+ que se haya disociado con las endonucleasas de restricción Clal y Notl . El vector contiene un promotor específico del bacteriófago. Normalmente, el promotor es un promotor T3 , un promotor SP6 , o un promotor T7. Un promotor preferido es el promotor T3 del bacteriófago. El ADNc disociado se inserta en el promotor en una orientación que es anti-sentido con respecto al promotor específico del bacteriófa-go.

En otra modalidad preferida, el vector contiene cuando menos un promotor de bacteriófago seleccionado a partir del grupo que consiste en el promotor T3, el promotor T7 y el promotor SP6. en una modalidad especialmente preferida, el vector contiene un promotor T3. En una modalidad preferida, el vector incluye un sitio de clonación múltiple que tiene una secuencia de nucleóti-dos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. Los vectores preferidos se basan en el vector de plásmido pBluescript (pBS o pBC) SK+ (Stratagene) , donde se removió una porción de la secuencia de nucleótidos desde las posiciones 656 a 764, y fue reemplazada con una secuencia de cuando menos 110 nucleótidos, incluyendo un sitio de endonucleasa de restricción Notl . Esta región, designada como el sitio de clonación múltiple (MCS) , se extiende en la porción de la secuencia de nucleótidos desde el sitio SacI hasta el sitio Kpnl . Un vector de plásmido adecuado, tal como pBC SK* o pBS SK+ (Stratagene) , se digirió con la endonucleasa de restricción adecuada para remover cuando menos 100 nucleótidos del sitio de clonación múltiple. En el caso de pBS SK+, LAS endonucleasa de restricción adecuadas para remover el sitio de clonación múltiple son SacI y Kpnl . Se clonó una porción de ADNc que comprendía un nuevo sitio de clonación múltiple, que tenía extremos que eran compatibles con Notl y Clal después de la digestión con las primera y segunda endonucleasas de restricción, en el vector, para formar un vector de plásmido adecuado. Las porciones de ADNc preferidas que comprenden nuevos sitios de clonación múltiple incluyen aquéllas que tienen las secuencias de nucleótidos descritas en las SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21 y SEQ ID NO:22. Las clonas de ADNc se linearizan mediante digestión con una sola endonucleasa de restricción que reconoce la secuencia de 4 nucleótidos del sitio de la segunda endonucleasa de restricción. Un vector de plásmido preferido, referido en la presente como pBS SK+/DGT1, comprende el sitio de clonación múltiple de la SEQ ID NO: 20. Los pares para la segunda endonucleasa de restricción y la endonucleasa de restricción de linearización son, respectivamente: MspI y Smal ; HinPlI y NarI ; Taql y Xhol ; MaeII y AatlI. Otro vector de plásmido preferido, referido en la presente como pBS S +/DGT2, comprende el sitio de clonación múltiple de la SEQ ID NO: 21, y se preparó como se describió anteriormente para pBS SK+/DGT1. Para pBS SK+/DGT2, los pares para la segunda endonucleasa de restricción y la endonucleasa de restricción de linearización son, respectivamente: MspI y Smal ; HinPlI y NarI ; Taql y Xhol . Otro vector de plásmido preferido, referido en la presente como pBS SK+/DGT3, comprende el sitio de clonación múltiple de la SEQ ID NO:22. Los pares para la segunda endonucleasa de restricción y la endonucleasa de restricción de linearización son, respectivamente: MspI y Smal ; HinPlI y NarI; Taql y xhol MaeII y Aatll . En una modalidad preferida, el vector incluye una secuencia de relleno de vector que comprende un sitio de endonucleasa de restricción de relleno de vector interno entre los sitios de las primera y segunda endonucleasas de restricción del vector. En esta modalidad, el paso de linearización incluye la digestión del vector con una endonucleasa de restricción que disocia el vector en el sitio de la endonucleasa de restricción de relleno del vector interno. En otra modalidad, la endonucleasa de restricción utilizada en el paso de linearización también disocia el vector en el sitio de la endonucleasa de restricción de relleno del vector interno. E . Transformación de una Célula Anfitriona Adecuada El vector en el que se ha insertado el ADN disociado, se utiliza entonces para transformar una célula anfitriona adecuada, la cual se puede transformar o transfectar eficientemente mediante el vector que contenga el inserto. Las células anfitrionas adecuadas para la clonación se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Laboratoy Manual", supra . Normalmente, la célula anfitriona es procariótica . Una célula anfitriona particularmente adecuada es una cepa de E. coli. Una cepa de E. coli adecuada es MC1061. De preferencia, también se utiliza una pequeña alícuota para transformar la cepa de E. coli XLl-Azul, de tal manera que se determine el porcentaje de clonas con insertos a partir de los porcentajes relativos de las colonias azul y blanca en las placas de X-gal. Normalmente sólo son aceptables las bibliotecas con un exceso de 5x10s recombinantes . F . Generación de Fragmentos Linearizados Luego se hacen preparaciones de plásmidos, normalmente como minipreparaciones , a partir de cada una de las bibliotecas de ADNc. Entonces se generan los fragmentos linearizados mediante digestión con cuando menos una endonucleasa de restricción. En una modalidad, el vector es el plásmido pBC SK+, y se utiliza Mspl . tanto como la segunda endonucleasa de restricción como la endonucleasa de restricción de linearización. En otra modalidad, el vector es el plásmido pBC SK+, la segunda endonucleasa de restricción se selecciona a partir del grupo que consiste en Mspl, Maell, Taql e HinPlI, y la linearización se realiza mediante una primera digestión con Smal . seguida por una segunda digestión con una mezcla de Kpnl y Apal . En otras modalidades, el vector se selecciona a partir del grupo que consiste en pBS SK+/DGT1, pBS SIO/DGT2 y pBS SK+/DGT3. En estas modalidades, se proporciona una combinación de enzimas adecuada, donde la segunda endonucleasa de restricción es Mspl , y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso de linearización es Smal . Se proporciona otra combinación adecuada donde la segunda endonucleasa de restricción es Taql , y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso de linearización es Xhol . Se proporciona una combinación adecuada adicional, donde la segunda endonucleasa de restricción es HinPll , y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso de linearización es NarI . Todavía se proporciona otra combinación adecuada, donde la segunda endonucleasa de restricción es MaeII y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso de linearización es AatlI. En general, en el paso de linearización, descrito con detalla en la Sección F, más adelante, cualquier vector de plásmido que carecía del inserto de ADNc se disoció en el sitio de reconocimiento de 6 nucleótidos (subrayados en la Figura 3A) para Smal , NarI . Xhol o AatlI encontrados entre el sitio Notl y el sitio Clal . En contraste, los vectores de plásmido que contenían insertos se disociarían en el sitio de reconocimiento de 6 nucleótidos para los sitios Smal , NarI, Xhol o AatlI encontrados a 3' para el sitio Clal . En otra modalidad, una alícuota de cada uno de los insertos clonados se dividió en dos grupos, uno de los cuales se disocia con Xhol . y el segundo con Salí . Los grupos de plásmidos linearizados se combinan, se mezclan, y luego se dividen en tercios. Los tercios se digieren con HindIII . BamHI y EcoRI . Este procedimiento es seguido debido a que, con el objeto de generar transcripciones anti-sentido de los insertos con polimerasa de ARN T3 , la plantilla se debe disociar primero con una endonucleasa de restricción, y corta dentro de las secuencias de flanqueo, pero no dentro de los insertos mismos. Dado que la longitud promedio de los fragmentos MspI 31 terminales es de 256 pares de bases, aproximadamente el 6 por ciento de los insertos contienen sitios para cualquier enzima con una secuencia de reconocimiento de hexámero. Estos insertos se perderían para un análisis adicional donde solamente se utilizara una enzima. Por consiguiente, es preferible dividir la reacción, de tal manera que solamente se utilice una de cualquiera de dos enzimas para la linearización de cada media reacción. Solamente se pierden los insertos que contengan sitios para ambas enzimas (aproximadamente el 0.4 por ciento) de ambas mitades de las muestras. De una manera similar, cada muestra de ARNc se contamina hasta un grado diferente con las transcripciones de los plásmidos sin inserto, lo cual podría conducir a una variabilidad en la eficiencia de las reacciones en cadena de la polimerasa posteriores para diferentes muestras, debido a la competencia diferencial para los cebadores . La disociación de tercios de las muestras con una de tres enzimas que tengan objetivos individuales en PBC SK+ entre sus sitios Clal y Notl . elimina la producción de transcripciones que contengan sitios de fijación para los cebadores 5' eventuales en el proceso de reacción en cadena de la polimerasa a partir de plásmidos sin inserto. El uso de tres enzimas sobre tercios de la reacción reduce el uso de secuencias que contengan insertos que también contengan sitios para la enzima, mientras que se resuelve el problema de la posible contaminación de secuencias sin inserto. Si solamente se utilizara una enzima, se perdería aproximadamente el 10 por ciento de las secuencias que contengan inserto, pero esto se reduce a aproximadamente el 0.1 por ciento, debido a que solamente se pierden las secuencias que no se disocien mediante las tres enzimas en total. G . Generación del ARNc El siguiente paso es una generación de una preparación de ARNc de transcripciones de ARNc anti-sentido . Esto se realiza mediante incubación de los fragmentos linearizados con una polimerasa de ARN capaz de iniciar la transcripción a partir del promotor específico del bacteriófago. Normalmente, como se discutió anteriormente, el promotor es un promotor T3 , y la polimerasa, por consiguiente, es una polimerasa de ARN T3. La polimerasa se incuba con los fragmentos linearizados, y con los cuatro trifosfatos de ribonucleósido bajo condiciones adecuadas para la síntesis. H. Transcripción del ADNc de la Primera Cadena En una modalidad preferida, la preparación de ARNc se divide en un número de subgrupos, dependiendo el número del número de residuos de fase del cebador de transcriptasa inversa 51. Luego se transcribe el ADNc de la primera cadena a partir de cada subgrupo, utilizando transcriptasa inversa de virus de leucemia de murino de Maloney ( LV) (Life Technologies) . Con esta transcriptasa inversa, el templado se realiza a 42 °C, y la reacción de transcripción a 42°C. La reacción en cada subgrupo utiliza uno de los cebadores de transcriptasa inversa 5' definidos por tener un término 3' consistente en -Nx, donde "N" es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T, y "x" es un entero de 1 a 5, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud y complementario para la secuencia del vector de flanqueo 5', extendiéndose la complementariedad del cebador de transcriptasa inversa 51 a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x" , donde se utiliza un cebador diferente de los cebadores de transcriptasa inversa 5' en diferentes subgru-pos, y donde hay 4 subgrupos si "x" = 1, 16 subgrupos si "x" = 2, 64 subgrupos si "x" = 3, 256 subgrupos si "x" = 4, y 1,024 subgrupos si "x" = 5. En otra modalidad, la preparación del ARNc se divide en dieciséis subgrupos. Luego se transcribe el ADNc de la primera cadena a partir de cada subgrupo, utilizando una transcriptasa inversa termoestable, y un cebador de transcriptasa inversa 5', como se describe más adelante. Una transcriptasa preferida es la transcriptasa inversa recombinante a partir de Thermus thermophi-lus . conocida como rTth. disponible en Perkin-Elmer (Norwalk, CT) . Esta enzima también se conoce como una polimerasa de ADN dependiente del ARN. Con esta transcriptasa inversa, el templado se realiza a 60°C, y la reacción de transcripción a 70°C. Esto promueve una complementariedad de alta fidelidad entre el cebador de transcriptasa inversa 51 y el ARNc. El cebador de transcriptasa inversa 51 utilizado es uno de los dieciséis cebadores de transcriptasa inversa 5' cuyo término 3' es -N-N, donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de cuando menos 15 nucleóti-dos de longitud, correspondiendo en su secuencia al extremo 3' del promotor específico del bacteriófago, y extendiéndose a través de cuando menos los dos primeros nucleótidos del AR c . Donde el promotor específico del bacteriófago sea el promotor T-, los cebadores de transcriptasa inversa 5' normalmente tienen la secuencia A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID N0:3), A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID NO: 5), A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 6) G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ IDN0:9), G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID N0:7), T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID N0:13), C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 14) , G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 15) , o A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO:24). I . Reacción en Cadena de la Polimerasa El siguiente paso es el uso del producto de la transcripción en cada uno de los subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con cebadores como se describen más adelante, para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa. En general, el producto de la transcripción del ADNc de la primera cadena en cada uno de los subgrupos, se utiliza como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 31 y un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa. El cebador de reacción en cadena de la polimerasa 31 normalmente es de 15 a 30 nucleótidos de longitud, y es complementario para las secuencias del vector de flanqueo 3' entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y el sitio que define el inicio de la transcripción mediante el promotor específico del bacteriófago. Los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' tienen un término 3' que consiste en -Nx-Ny, donde "N" y "x" son como en el paso de transcriptasa inversa anterior, -Nx es la misma secuencia que en el cebador de transcriptasa inversa 51 , a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo, e "y" es un entero, de tal manera que x + y es igual a un entero seleccionado a partir del grupo que consiste en 3, 4, 5 y 6, siendo el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 51 de 15 a 30 nucleótidos de longitud, y complementario para la secuencia del vector de flanqueo 51 , extendiéndose la complemen-tariedad del cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5 ' a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x" + y" . En otra modalidad, los cebadores utilizados son: (a) un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 31 que corresponde en su secuencia a una secuencia en el vector adjunto al sitio de inserción de la muestra de ADNc en el vector; y (b) un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' seleccionado a partir del grupo que consiste en: (i) el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo; (ii) el cebador de transcriptasa inversa 5' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo extendido en su término 31 por un residuo adicional -N, donde N puede ser cualquiera de A, C, G o T; y (iii) el cebador de transcriptasa inversa 5' utilizado para la síntesis del ADNc de la primera cadena para ese subgrupo extendido en su término 31 por dos residuos adicionales -N-N, donde N puede ser cualquiera de A, C, G o T. Cuando el vector es el plásmido pBC SK+ disociado con Clal y Notl, un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' adecuado es G-A-A-C-A-A-A-A-G-C-T-G-G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C (SEQ ID NO:4) . En otra modalidad, cuando el vector es el plásmido pBC SK+ disociado con Clal y Notl, un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' es A-A-G-C-T-G-G-A-G-C-T-C-C-A-C-C- (SEQ ID NO: 8) . En otras modalidades, los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 3' son G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T (SEQ ID NO.-18) y G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-A-G (SEQ ID O:19). Cuando el promotor específico del bacteriófago es el promotor T3 , un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' adecuado puede tener las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ IDN0.-5), A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ IDNO.-6), T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID NO : 13 ) , C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID N0:14), G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID N0:15) , O A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 16) . Normalmente, la reacción en cadena de la polimerasa se realiza en la presencia de 35S-dATP utilizando un programa de reacción en cadena de la polimerasa de 15 segundos a 94°C para la desnaturalización, 15 segundos a 50°C - 62°C para el templado, y 30 segundos a 72°C para la síntesis en un aparato Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) . La temperatura de templado se optimiza para la secuencia de nucleótidos específica del cebador, utilizando los principios bien conocidos en este campo. El paso de templado a alta temperatura minimiza el mal cebado artificial por parte del cebador 51 en su extremo 3 ' , y promueve un copiado de alta fidelidad. De una manera alternativa, la amplificación con reacción en cadena de la polimerasa se puede realizar en la presencia de un trifosfato de desoxirribonucleósido marcado con 32P o con 33P, tal como [32P] dCTP o [33P]dCTP. Sin embargo, en general se prefiere utilizar un trifosfato de desoxirribonucleósido marcado con 3SS para una máxima resolución, también se pueden utilizar otros métodos de detección, incluyendo marcas no radioactivas . Las serie de reacciones produce un número de grupos de productos, dependiendo de los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' seleccionados. Como se mencionó anteriormente, los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' tienen un término 31 que consiste en -Nx-Ny, donde "N" y "x" son como en el paso de transcriptasa inversa anterior, -Nx es la misma secuencia que en el cebador de transcriptasa inversa 5 ' a partir del cual se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo, e "y" es un entero, de tal manera que x+y es igual a un entero seleccionado a partir del grupo que consiste en 3 , 4, 5 y 6, siendo el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud y complementario para la secuencia del vector de flanqueo 5 ' , extendiéndose la complementariedad del cebador de reacción en cadena de la polimerasa 51 a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x+y" . El número de subgrupos se determina por x+y: hay 64 subgrupos si "x+y" = 3, 256 subgrupos y x+y = 4, 1,024 subgrupos si x+y = 5, y 4,096 subgrupos si x+y = 6. El proceso de la presente invención se puede extender utilizando conjuntos más largos de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' en su extremo 3' por nucleótidos adicionales. Por ejemplo, un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 51 con el término 3' -N, -N-N-N daría 1,024 productos, y un cebador con el término 3' -N-N-N-N-N-N daría 4,096 productos . J. Electroforesis Luego se resuelven los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa mediante electroforesis, para exhibir las bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la muestra.

Las técnicas electroforáticas para resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa son bien entendidas en la técnica, y no se necesitan mencionar adicionalmente en la presente. Los productos correspondientes se resuelven en geles de secuenciamiento de ADN desnaturalizantes, y se visualizan mediante autorradiografía. Para el sistema de vector particular descrito en la presente, los geles se prueban de tal manera que los primeros 90 pares de bases se salgan del fondo, debido a que las secuencias relacionadas con el vector incrementan la longitud de los ADNcs por 55 pares de bases . Este número puede variar si se emplean otros sistemas de vector, y se pueden determinar las condiciones de electroforesis apropiadas, de tal manera que las secuencias relacionadas con el vector se salgan del fondo de los geles, a partir de una consideración de las secuencias del vector involucrado. Normalmente, cada reacción se ejecuta sobre un gel desnaturalizante separado, de tal manera que se utilicen cuando menos dos geles. Se prefiere realizar una serie de reacciones en paralelo, tal como a partir de diferentes tejidos, y resolver todas las reacciones utilizando el mismo cebador sobre el mismo gel. Se puede resolver un número sustancial de reacciones sobre el mismo gel. Normalmente, se pueden resolver tantas como treinta reacciones sobre el mismo gel, y se pueden comparar. Como se describe más adelante, esto proporciona una manera de determinar los ARNms específicos del tejido. Normalmente se utiliza autorradiografía para detectar las especies de ADNc resueltas. Sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos de detección, tales como formación de imágenes de fósforo o fluorescencia, y pueden proporcionar una sensibilidad más alta en ciertas aplicaciones. De conformidad con el esquema, las bibliotecas de ADNc producidas a partir de cada una de las muestras de ARNm contienen copias de los extremos 3 ' a partir del sitio más distal para MspI hasta el principio de la cola poli (A) de todos los ARNms poli (A) + en la muestra de ARN de partida, aproximadamente de acuerdo con las concentraciones relativas iniciales de los ARNms. Debido a que ambos extremos de los insertos para cada especie son exactamente definidos por la secuencia, sus longitudes son uniformes para cada especie, permitiendo su visualización posterior como bandas separadas sobre un gel, independientemente de la fuente de tejido del ARNm. El uso de pasos sucesivos con cebadores alargadores para estudiar los ADNcs actúa esencialmente como una reacción en cadena de la polimerasa anidada. Estos pasos mejoran el control de calidad, y reducen el fondo que podría resultar potencialmente por la amplificación de los ADNcs no dirigidos. En una modalidad preferida, el segundo paso de transcripción inversa subdivide cada muestra de ARNc en cuatro subgrupos, utilizando un cebador que se templa con las secuencias derivadas a partir de pBC SK*, pero se extiende a través de CGG del sitio MspI no regenerado, e incluyendo un nucleótido (-N) del inserto. Este paso segrega la población de partida de potencialmente 50,000 a 100,000 ARNms en cuatro subgrupos de aproximadamente 12,500 a 25,000 miembros cada uno. En las iteraciones en serie del paso de reacción en cadena de la polimerasa subsecuente, donde se incorpora la marca radioactiva en los productos para su visualización autorradiográ-fica, estos grupos se segregan adicionalmente mediante división en cuatro o dieciséis subsubgrupos, mediante la utilización de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' progresivamente más largos que contengan de 2 a 6 nucleótidos del inserto. Al demandar primeramente, mediante un templado a alta temperatura, un apareamiento del extremo 3' de alta fidelidad en el paso de transcripción inversa en las posiciones -N, y subsecuentemente demandar de nuevo este apareamiento de alta fidelidad en las iteraciones -N-N, -N-N-N, -N-N-N-N, -N-N-N-N-N o -N-N-N-N-N-N, se minimiza drásticamente el sangrado por el cebado mal apareado en las posiciones -N. Los pasos del proceso que empiezan con la división de la preparación del ARNc en cuatro subgrupos, y la transcripción del ADNc de la primera cadena desde cada subgrupo, se puede realizar por separado como un método para la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNc, correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido, que representan los extremos 31 de una población de ARNms . II . Aplicaciones del Método para la Exhibición de los Patrones de ARNm.

El método descrito anteriormente para la detección de patrones de expresión del ARNm en un tejido, y la resolución de estos patrones mediante electroforesis de gel, tiene un número de aplicaciones. Una de estas aplicaciones es su uso para la detección de un cambio en el patrón de expresión del ARNm en un tejido asociado con un cambio fisiológico o patológico. En general, este método comprende: (1) obtener una primera muestra de un tejido que no sea objeto del cambio fisiológico o patológico; (2) determinar el patrón de expresión del ARNm en la primera muestra del tejido, mediante la realización del método de la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido que representen los extremos 31 de una población de ARNms, como se describe anteriormente, para generar una primera exhibición de bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la primera muestra; (3) obtener una segunda muestra del tejido que haya sido el objeto de un cambio fisiológico o patológico; (4) determinar el patrón de expresión del ARNm en la segunda muestra del tejido, mediante la realización del método de la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido, que representan los extremos 3' de una población de ARNms como se describe anteriormente, para generar una segunda exhibición de bandas que representen los extremos 3 ' de los ARNms presentes en la segunda muestra; y (5) comparar las primera y segunda exhibiciones para determinar el efecto del cambio fisiológico o patológico sobre el patrón de expresión del ARNm en el tejido. Normalmente, la comparación se hace en las pistas adyacentes de un solo gel . Normalmente, se construye una base de datos que comprenda los datos producidos mediante la cuantificación de la exhibición de los productos específicos de la secuencia, y se mantiene utilizando hardware de computación y software de computación adecuados. De preferencia, esta base de datos comprende además los datos con respecto a las relaciones de secuencias, el mapeo genético, distribuciones celulares, y cualquier otra información que se considere pertinente para la función genética. El tejido se puede derivar a partir del sistema nervioso central. En particular, se puede derivar a partir de una estructura dentro del sistema nervioso central, es decir, la retina, la corteza cerebral, el bulbo olfatorio, el tálamo, el hipotálamo, pituitaria anterior, pituitaria posterior, hipocampo, nucleus accumbens, amígdala, estriato, cerebelo, tallo cerebral, núcleo supraquiasmático o médula espinal. Cuando el tejido se deriva a partir del sistema nervioso central, el cambio fisiológico o patológico puede ser cualquiera de enfermedad de Alzhei-mer, parkinsonismo, isquemia, adicción al alcohol, adicción a drogas, esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, depresión y desorden maniaco-depresivo bipolar. De una manera alternativa, el método de la presente invención se puede utilizar para estudiar la variación circadiana, el envejecimiento, o la potenciación a largo plazo, afectando esta última al hipocampo. Adicionalmente, en particular con referencia a la especie de ARNm que se presente en estructuras particulares dentro del sistema nervioso central, el método se puede utilizar para estudiar regiones del cerebro que se sepa que están involucradas en comportamientos complejos, tales como aprendizaje y memoria, emociones, adicción a drogas, neurotoxicidad por glutamato, comportamiento de alimentación, olfato, infección viral, visión y desórdenes del movimiento. Este método también se puede utilizar para estudiar los resultados de la administración de fármacos y/ó toxinas a un individuo, comparando el patrón de ARNm de un tejido antes y después de la administración del fármaco o toxina. También se pueden estudiar los resultados de la terapia con electrochoques . De una manera alternativa, el tejido puede ser a partir de un órgano o sistema de órganos que incluya al sistema cardiovascular, al sistema pulmonar, al sistema digestivo, al sistema nervioso periférico, al hígado, al riñon, al músculo esquelético y al sistema reproductor, o a partir de cualquier otro órgano o sistema de órganos del cuerpo. Por ejemplo, se pueden estudiar los patrones de A Nm a partir de hígado, corazón, riñon o músculo esquelético. Adicionalmente, para cualquier tejido, se pueden tomar muestras en diferentes tiempos para descubrir un efecto circadiano de la expresión del ARNm. Por consiguiente, este método puede adscribir una especie de ARNm particular al involucramiento en patrones particulares de función o mal funcionamiento. El grupo de ARNc anti-sentido que representa los extremos 3' de los ARNms se puede generar mediante los pasos (1)- (4) del método, como se describen anteriormente en la Sección I. De una manera similar, el método de resolución del ARNm de la presente invención se puede utilizar como parte de un método para rastrear un efecto secundario de un fármaco. En general, este método comprende: (1) obtener una primera muestra de tejido a partir de un organismo tratado con un compuesto de una función fisiológica conocida ; (2) determinar el patrón de expresión de ARNm en la primera muestra del tejido, mediante la realización del método de la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido que representan los extremos 31 de una población de ARNms, como se describió anteriormente, para generar una primera exhibición de bandas que representen los extremos 3 ' del ARNms presentes en la primera muestra; (3) obtener una segunda muestra de tejido a partir de un organismo tratado con un fármaco que se vaya a rastrear para determinar un efecto secundario; (4) determinar el patrón de expresión del ARNm en la segunda muestra del tejido, mediante la realización del método de la identificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms correspondientes a los miembros de un grupo de ARNc anti-sentido que representan los extremos 31 de una población de ARNms, como se describió anteriormente, para generar una segunda exhibición de bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la segunda muestra; y (5) comparar las primera y segunda exhibiciones, con el objeto de detectar la presencia de las especies de ARNm cuya expresión no sea afectada por el compuesto conocido, pero sea afectada por el fármaco que se vaya a rastrear, indicando de esta manera una diferencia en la acción del fármaco que se vaya a rastrear y el compuesto conocido, y por lo tanto, un efecto secundario . En particular, este método se puede utilizar para fármacos que afecten al sistema nervioso central, tales como antidepresivos, neurolépticos, tranquilizantes, anticonvulsionantes, inhibidores de oxidasa de monoamina, y estimulantes. Sin embargo, este método, de hecho, se puede utilizar para cualquier fármaco que pueda afectar la expresión del ARNm en un tejido particular. Por ejemplo, se puede estudiar el efecto sobre la expresión del ARNm de los agentes anti-parkinsonismo, de los relajantes del músculo esquelético, analgésicos, anestésicos locales, colinérgicos , anti-espasmódicos , esteroides, fármacos anti- inflamatorios no esteroidales, agentes anti-virales o cualquier otro fármaco capaz de afectar la expresión del ARNm, y se puede determinar el efecto en un tejido o estructura particular. Una aplicación adicional del método de la presente invención está en la obtención de la secuencia de los extremos 3 ' de las especies de ARNm que se exhiban. En general, un método para obtener la secuencia comprende : (1) eluir cuando menos un ADNc correspondiente a un ARNm a partir de un electroferograma, donde se exhiban las bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la muestra; (2) amplificar el ADNc eluido en una reacción en cadena de la polimerasa; (3) clonar el ADNc amplificado en un plásmido; (4) producir ADN correspondiente al ADN clonado a partir del plásmido; y (5) secuenciar el ADNc clonado. El ADNc que se ha separado, se puede amplificar con los cebadores previamente utilizados en el paso de reacción en cadena de la polimerasa. Luego se puede clonar el ADNc en pCR II (Invitrogen, San Diego, CA) mediante clonación y ligamiento de TA en el vector. Luego se pueden producir miniprepaaciones del ADN mediante técnicas convencionales, a partir de las subclonas, y se desnaturaliza una porción y se divide en dos alícuotas para el secuenciamiento automatizado mediante el método de terminación de cadena de didesoxi de Sanger. Se puede utilizar un secuenciador comercialmente disponible, tal como un secuenciador ABI, para el secuenciamiento automatizado. Esto permitirá la determinación de secuencias complementarias para la mayoría de los ADNcs estudiados, en el rango de longitud de 50 a 500 pares de bases, a través de toda la longitud del fragmento. Luego se pueden utilizar esas secuencias parciales para rastrear las bases de datos genómicos, tales como GenBank, para reconocer las identidades y similitudes de secuencias, utilizando programas tales como BLASTN y BLASTX. Debido a que este método genera secuencias solamente a partir de los extremos 3 ' de los AR ms, se espera que se encontrarían marcos de lectura abierta (ORFs) sólo ocasionalmente, debido a que las regiones no traducidas 3 ' de los ARNms del cerebro son en promedio más largas que 1,300 nucleótidos (J.G. Sutcliffe, supra) . Los marcos de lectura abierta potenciales se pueden examinar para determinar los motivos de proteína de firma. Las secuencias de ADNc obtenidas se pueden utilizar entonces para designar pares de cebadores para que la reacción en cadena de la polimerasa semicuantitativa confirme los patrones de expresión del tejido. También se pueden utilizar productos seleccionados para aislar clonas de ADNc de longitud completa para un análisis adicional. Se pueden utilizar pares de cebadores para amplificación con SSCP-reacción en cadena de la polimerasa (polimorfismo de conformación de una sola cadena-reacción en cadena de la polimerasa) del ADN genómico. Por ejemplo, esta amplificación se puede realizar a partir de un panel de ratones retrocruzados interespecíficos, para determinar el enlace de cada producto de reacción en cadena de la polimerasa con los marcadores ya enlazados. Esto puede dar como resultado el mapeo de nuevos genes, y puede servir como un recurso para identificar los candidatos para los lugares mutantes de ratón mapeados y los genes de enfermedad humana homólogos. El polimorfismo de conformación de una sola cadena-reacción en cadena de la polimerasa, utiliza cebadores de oligonucleótidos sintéticos que amplifican, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa, un segmento pequeño (de 10 a 200 pares de bases) . (M. Orita y colaboradores, "Detection of Polymorphisms of Human DNA by Gel Electrophoresis as Single-Strand Conformation Polymorphisms", Proc. Nati. Acad. Sei. EUA 86:2766-2770 (1989); . Orita y colaboradores, "Rapid and Sensitive Detection of Point Mutations in DNA Polymorphisms Using the Polymerase Chain Reaction", Genomics 5:874-879 (1989)). Los fragmentos separados del ADNc se pueden radiomarcar mediante técnicas bien conocidas en este campo, para utilizarse en el sondeo de una mancha Northern, o para la hibridación en el sitio, con el fin de verificar la distribución del ARNm, y para conocer el tamaño y la prevalencia del ARNm de la longitud completa correspondiente. La sonda también se puede utilizar para rastrear una biblioteca de ADNc, con el fin de aislar las clonas, para una determinación de secuencia más confiable y completa. Las sondas marcadas también se pueden utilizar para cualquier otro propósito, tal como estudiar la expresión in vitro. III . Paneles v Mezclas Degeneradas de Cebadores Otro aspecto de la presente invención es de los paneles de cebadores y mezclas degeneradas de cebadores adecuados para la práctica de la presente invención. Estos incluyen: (1) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden 16 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID N0:3), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T. (2) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden 64 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID N0:5), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (3) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 256 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 6) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (4) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 1,024 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO:24), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; y (5) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 4,096 cebadores de las secuencias A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO:25), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; y (6) un panel de cebadores de ancla que comprenden 12 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T (SEQ ID NO: 2) , donde V es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T; (7) un panel de cebadores de ancla que comprenden 3 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T (SEQ ID NO: 23), donde V es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; (8) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden cuatro diferentes oligonucleótidos , cada uno teniendo la secuencia G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO: 9) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (9.) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden 16 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO: 7) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (10) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 64 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID NO: 13) ; donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (11) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 256 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 14) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (12) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 1,024 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 15) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (13) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 4,096 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 16) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucléotidos A, C, G o T; (14) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden cuatro diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia C-T-T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO: 10) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleóti -dos A, C, G o T; (15) un panel de cebadores de transcriptasa inversa 5' que comprenden 16 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia T-T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO: 11) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleó idos A, C, G O T; (16) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5" que comprenden 64 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia T-C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID NO: 12) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; (17) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 256 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia C-A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 17) , donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; (18) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 1,024 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia A-G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO.-26), donde N es uno de los cuatro desoxirribonucleótidos A, C, G o T; (19) un panel de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa 5' que comprenden 4,096 diferentes oligonucleótidos, cada uno teniendo la secuencia G-T-C-A-G-G-C-T-A-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 27, donde N es uno de los cuatro desoxirribonu-cleótidos A, C, G o T; (20) una mezcla degenerada de cebadores de ancla que comprenden una mezcla de 3 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (SEQ ID NO:23), donde V es un desoxirribonu-cleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G, estando cada uno de los 3 cebadores presentes en aproximadamente una cantidad equimolar; y (21) una mezcla degenerada de cebadores de ancla que comprenden una mezcla de 12 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (SEQ ID N0:2) , donde V es un desoxirribonu-cleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que cosiste en A, C, G y T, estando cada uno de los 12 cebadores presentes en aproximadamente una cantidad equimolar. La invención se ilustra mediante el siguiente Ejemplo. El Ejemplo es para propósitos ilustrativos solamente, y no pretende limitar la invención. Ejemplo Resolución de ARNms de Cerebro Utilizando Cebadores Correspondientes a las Secuencias de los ARNms de Cerebro Conocidos de Diferentes Concentraciones Para demostrar la efectividad del método de la presente invención, se aplicó utilizando cebadores de transcriptasa inversa 5' extendidos en sus extremos 5' por dos nucleótidos, y correspondientes a la secuencia de los ARNms de cerebro conocidos de diferentes concentraciones, tales como enolasa específica de neuronas (NSE) en una concentración aproximada del 0.5 por ciento (S. Forss-Petter y colaboradores, "Neuron-Specific Enolase: Complete Structure of Rat mRNA, Múltiple Transcriptional Start Sites and Evidencia for Translational Control", J. Neurosci . Res. 16: 141-156 (1986)), RC3 en aproximadamente el 0.01 por ciento, y somatostatina en el 0.001 por ciento (G.H. Travis y J.G. Sutcliffe, "Phenol Emulsion-Enhanced DNA-Driven Subtractive cDNA Cloning: Isolation of Low-Abundance Monkey Cortex-Specific mRNAs" , Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 85: 1696-1700 (1988) para comparar los ADNcs hechos a partir de bibliotecas construidas a partir de ARNs de corteza cerebral, estriato, cerebelo e hígado, hechos como se describió anteriormente. En exposiciones autorra-diográficas cortas a partir de cualquier muestra de ARN particular, se obtuvieron de 50 a 100 bandas. Las bandas fueron absolutamente reproducibles en muestras duplicadas. Aproximadamente dos terceras partes de las bandas difirieron entre las muestras de cerebro e hígado, incluyendo las bandas de las longitudes rectas correspondientes a los ARNms específicos del cerebro conocidos. Esto se confirmó mediante la separación de las bandas de los geles, amplificación y secuenciamiento. Solamente unas cuantas bandas difirieron entre las muestras para diferentes regiones del cerebro para cualquier cebador de transcriptasa inversa 5' particular, aunque algunas intensidades de las bandas fueron diferentes . La banda correspondiente a enolasa específica de neuronas, una especie de AR m rela ivamente prevalente, apareció en todas las muestras de cerebro, pero no en las muestras de hígado, pero no se observó cuando se cambió cualquiera de los últimos tres nucleótidos individuales dentro de la secuencia 3'-terminal de cuatro bases -N-N-N-N en el cebador 5' sintético. Cuando se cambió el primer N, se detectó una pequeña cantidad de sangrado. Para las especies conocidas, la intensidad de la señal autorradiográfica fue aproximadamente proporcional a la prevalen-cia del ARNm, y los ARNms con concentraciones de una parte en 10d o más del AR Poli (A) + fueron rutinariamente visibles, con el problema ocasional de que se oscurecían los ADNcs que migraban cerca de las bandas más intensas . En la Figura 2 se ilustra una muestra de los datos. En las pistas de gel 5 sobre la izquierda, el sustrato fue ARNc de corteza para la transcripción inversa con el cebador de trans-criptasa inversa 5' A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO:3), donde -N-N es -C-T (cebador 118), -G-T (cebador 116), o -C-G- (cebador 106) . La amplificación con reacción en cadena de la polimerasa utilizó los cebadores de reacción de cadena de la polimerasa 5' A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO.-6), donde -N-N-N-N es -C-T-A-C (cebador 128), -C-T-G-A (cebador 127), -C-T-G-C (cebador 111), -G-T-G-C (cebador 134), y -C-G-G-C (cebador 130), como se indica en la Figura 2. Los cebadores 118 y 111 aparean la secuencia de los dos y cuatro nucleotidos, respectivamente, corriente abajo desde el sitio MspI localizado más cercano al extremo 3' de la secuencia de ARNm de enolasa específica de las neuronas. El cebador 127 se aparea mal con la secuencia de enolasa específica de las neuronas en la última posición (-1) , el cebador 128 en la penúltima posición (-2), los cebadores 106 y 130 en la posición -3, y los cebadores 116 y 134 en la posición -4. El cebador 134 extendió dos nucleotidos más adicionalmente corriente arriba que los otros mostrados en la presente y, por lo tanto, sus productos de reacción en cadena de la polimersa son dos nucleotidos más largos en relación con los productos de otras pistas. En cada pista, fueron visibles de 50 a 100 bandas en las exposiciones de 15 minutos utilizando 32P-dCTP para radiomar-car los productos. Estas bandas fueron aparentemente distintas para cada par cebador, con la excepción de que un subconjunto de las bandas 118-111 apareció más débilmente en la pista 116-134, seguida por dos nucleotidos, indicando un sangrado en la posición cuatro . El cebador 118-111 se utilizó nuevamente en ARNcs separados de corteza (CX) y de hígado (LV) . El patrón de la corteza idéntico al de la pista 118-111, demostrando la reprodu-cibilidad. El patrón del hígado difirió de CX en la mayoría de las especies. El asterisco indica la posición del producto de enolasa específica de neuronas. Los conjuntos cebadores análogos detectaron los productos RC3 y u somatostatina (somat) (asteriscos) en CX, pero no en las pistas LV. Las intensidades de banda relativas de un producto de reacción en cadena de la polimerasa dado se pueden comparar dentro de las pistas utilizando el mismo conjunto cebador, pero no diferentes conjuntos. Este ejemplo demuestra la factibilidad y la reproduci-bilidad del método de la presente invención, y su capacidad para resolver diferentes AR ms. Además demuestra que se puede estimar la prevalencia de una especie particular de ARNm a partir de la intensidad de la señal autorradiográfica . El ensayo permite que se detecten simultáneamente los ARNms presentes tanto en alta como en baja prevalencia. Ventajas de la Presente Invención El presente método se puede utilizar para identificar genes cuya expresión sea alterada durante el desarrollo neuronal, en modelos de plasticidad y regeneración, en respuesta a los estímulos químicos o electrofisiológicos , tales como neurotoxici-dad y potenciamiento a largo plazo, y en respuesta a paradigmas de comportamiento, virales, por fármacos/alcohol, la presentación de muerte celular o apoptosis, envejecimiento, condiciones patológicas, y otras condiciones que afecten la expresión de la ARNm. Aunque el método es particularmente útil para estudiar la expresión genética en el sistema nervioso, no está limitado al sistema nervioso, y se puede utilizar para estudiar la expresión del ARNm en cualquier tejido. El método permite la visualización de casi todo ARNm expresado por un tejido como una banda distinta en un gel cuya intensidad corresponde, aproximadamente a la concentración del ARNm. El método tiene la ventaja de que no depende un cebado aleatorio mal apareado potencialmente irreproducible , de modo que proporciona un alto grado de precisión y reproducibilidad . Más aún, reduce las complicaciones y la imprecisión generadas por la presencia de bandas concurrentes de diferente longitud resultantes de las mismas especies de ARNm como el resultado de diferentes eventos de cebado. En los métodos que utilizan cebado aleatorio, estas bandas concurrentes pueden presentarse, y tienen más posibilidades de presentarse para las especies de ARNm de alta prevalencia. En el presente método, se eliminan estas bandas concurrentes . El método proporciona información específica de la secuencia acerca de la especie de ARNm, y se puede utilizar para generar cebadores, sondas y otras secuencias específicas. Aunque la presente invención se ha descrito con un detalle considerable, con referencia a ciertas versiones preferidas de la misma, son posibles otras versiones. Por consiguiente, el espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas no deben limitarse a la descripción de las versiones preferidas contenidas en la presente.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) NÚMERO DE SECUENCIAS: 27 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCUL : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:l: AACTGGAAGA ATTC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL : (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : AACTGGAAGA ATTCGCGGCC GCAGGAATTT TTTTTTTTTT TTTTTVN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO : cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: AGGTCGACGG TATCGGNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 GAACAAAAGC TGGAGCTCCA CCGC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO : cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5 AGGTCGACGG TATCGGNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6 AGGTCGACGG TATCGGNNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7 GTCGACGGTA TCGGNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8 AAGCTGGAGC TCCACC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9 GGTCGACGGT ATCGGN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (Üi) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10 CTTCAGTCAG GCTAATCGGN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11 TTCAGTCAGG CTAATCGGNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12 TCAGTCAGGC TAATCGGNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13 TCGACGGTAT CGGNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO : NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14 CGACGGTATC GGNNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 GACGGTATCG GNNNNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO ( i) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16 ACGGTATCGG NNNNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGA ISMO : cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17 CAGTCAGGCT AATCGGNNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18 GAGCTCCACC GCGGT (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19 GAGCTCGTTT TCCCAG 16 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 116 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: GAGCTCCACC GCGGTGTCAC GACTATCTGC GGCCGCATGC CCGGGAATGG CGCCTCGAGA 60 CGTCTTTATC GATACCGTCG ACCTCGAACT CGAGACGTCC CGGGCGCCTA GGTACC 116 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 113 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: GAGCTCGTTT TCCCAGTCAC GACTATCTGC GGCCGCATGC CCGGGAATGG CGCCTCGAGA 60 CGTTATCGAT TAGCCTGACT GAAGACTCGA GACGTCCCGG GCGCCTAGGT ACC 113 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 113 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (Üi) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22: GAGCTCGTTT TCCCAGTCAC GACTATCTGC GGCCGCATGC CCGGGAATGG CGCCTCGAGA 60 CGTCTATATC GATTAGCCTG ACTGAAGACT CGAGACGTCC CGGGCTAGGT ACC 113 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO : NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23: AACTGGAAGA ATTCGCGGCC GCAGGAATTT TTTTTTTTTT TTTTTV 46 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24: AGGTCGACGG TATCGGNNNN N 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: AGGTCGACGG TATCGGNNNN NN 22 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI -SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26 AGTCAGGCTA ATCGGNNNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: cebador sintético (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27 GTCAGGCTAA TCGGNNNNNN

Claims (80)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para la identificación simultánea específica de la secuencia de AR ms en una población de AR m, el cual comprende los pasos de : (a) preparar una población de ADNc de doble cadena a partir de una población de ARNm utilizando una mezcla de cebadores de ancla, incluyendo cada cebador de ancla: (i) un tramo de 7 a 40 residuos T; (ii) un sitio para disociación mediante una primera endonucleasa de restricción que reconoce más de seis bases, localizándose el sitio para asociación en el lado 5' del tramo de residuos T; (iii) un primer segmento rellenador de 4 a 40 nucleótidos, localizándose el primer segmento rellenador en el lado 5' del sitio para disociación mediante la primera endonucleasa de restricción, y (iv) residuos de fase localizados en el extremo 31 de cada uno de los cebadores de ancla seleccionados a partir del grupo que consiste en -V y -V-N, donde V es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T, incluyendo la mezcla cebadores de ancla que contienen todas las posibilidades para V y N, donde los residuos de fase en la mezcla son definidos por uno de -V o -V-N; (b) disociar la población de ADNc de doble cadena con la primera endonucleasa de restricción y con una segunda endonucleasa de restricción, reconociendo la segunda endonucleasa de restricción una secuencia de cuatro nucleótidos, para formar una población de moléculas de ADNc de doble cadena que tienen primero y segundo términos, respectivamente; (c) insertar las moléculas de ADNc de doble cadena del paso (b) cada una en un vector en una orientación que sea anti-sentido con respecto a un promotor específico del bacteriófago adentro del vector, para formar una población de vectores que contengan las moléculas de ADNc insertadas, definiendo esta inserción las secuencias de vector de flanqueo 3 ' y 5 ' , de tal manera que 5' esté corriente arriba desde la cadena en sentido del ADNc insertado, y 3' esté corriente abajo de la cadena en sentido, y teniendo este vector una secuencia de nucleótidos de flanqueo 31 de cuando menos 15 nucleótidos de longitud entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y un sitio que defina el iniciador de transcripción en este promotor; (d) generar fragmentos linearizados que contengan las moléculas de ADNc insertadas mediante digestión de los vectores producidos en el paso (c) con cuando menos una endonucleasa de restricción que no reconozca las secuencias en las moléculas de ADNc insertadas o en el promotor específico del bacteriófago, pero que sí reconozca las secuencias en el vector, de tal manera que los fragmentos linearizados resultantes tengan una secuencia de vector de flanqueo 5' de cuando menos 15 nucleótidos 5' para el sitio de inserción de la muestra de ADNc en el vector en el segundo término del ADNc . (e) generar una preparación de ARNc de transcripciones de ARNc anti-sentido mediante incubación de los fragmentos linearizados con una polimerasa de ARN específica del bacteriófago capaz de iniciar la transcripción desde el promotor específico del bacteriófago,- (f) dividir la preparación de ARNc en subgrupos, y transcribir el ADNc de la primera cadena de cada subgrupo, utilizando una transcriptasa inversa y uno de los cebadores de transcriptasa inversa 51 definidos por tener un término 31 consistente en -NxJ donde "N" es uno de los cuatro desoxirribonu-cleótidos A, C, G o T, y "x" es un entero de 1 a 5, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud, y complementario para la secuencia de vector de flanqueo 5', extendiéndose la complementariedad del cebador 5' a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x", donde se utilice un cebador diferente de los cebadores de transcriptasa inversa 5' en los diferentes subgrupos, y donde haya cuatro subgrupos si "x" = 1, 16 subgrupos si "x" = 2, 64 subgrupos si "x" = 3, 256 subgrupos si "x" = 4, y 1,024 subgrupos si "x" = 5; (g) utilizar el producto de la transcripción del ADNc de la primera cadena en cada uno de los subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' de 15 a 30 nucleótidos de longitud que sea complementario para las secuen- cias del vector de flanqueo 31 entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y el sitio que defina el inicio de la transcripción mediante el promotor específico del bacteriófago, y un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 51 que tenga un término 3 ' consistente en -Nx-Ny, donde "N" y "x" son como en el paso (f ) , -Nx es la misma secuencia que en el cebador de transcriptasa inversa 51 a partir del que se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo, e "y" es un entero, de tal manera que x+y es igual a un entero seleccionado a partir del grupo que consiste en 3, 4, 5 y 6, siendo el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud y complementario para la secuencia del vector de flanqueo 5', extendiéndose la complementariedad del cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x + y", para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa, y (h) resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa para generar una exhibición de productos específicos de la secuencia que representen los extremos 31 de diferentes ARNms presentes en la población de ARNm.
2. 2. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de fase en el paso (a) son -v-N.
3. 3. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de fase en el paso (a) son -V.
4. 4. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque "x" en el paso (f) es 2.
5. 5. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque "x" en el paso (f) es 1.
6. 6. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 5, caracterizado porque "y" en el paso (g) es 3.
7. 7. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 5, caracterizado porque "y" en el paso (g) es 4.
8. 8. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de fase en el paso (a) son -V-N, "x" en el paso (f) es 2, e "y" en el paso (g) es 2.
9. 9. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de fase en el paso (a) son -V-N, "x" en el paso (f) es 1, e "y" en el paso (g) es 3.
10. 10. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de fase en el paso (a) son -V-N, "x" en el paso (f) es 1, e "y" en el paso (g) es 4.
11. 11. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de fase en el paso (a) son -V, "x" en el paso (f) es 1, e "y" en el paso (g) es 3.
12. 12. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de fase en el paso (a) son -V, "x" en el paso (f) es 1, e "y" en el paso (g) es 4.
13. 13. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los cebadores de ancla cada uno tienen 18 residuos T en el tramo de residuos T.
14. 14. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el primer segmento de relleno de los cebadores de ancla es de 14 residuos de longitud.
15. 15. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia del primer segmento de relleno es A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C (SEQ ID NO:l) .
16. 16. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque se interpone un segundo segmento de relleno entre el sitio para la disociación mediante una endonucleasa de restricción que reconoce más de seis bases y el tramo de residuos T.
17. 17. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los cebadores de ancla tienen la secuencia A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (SEQ ID O:2) .
18. 18. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los cebadores de ancla tienen la secuencia A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (SEQ ID NO: 23) .
19. 19. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor específico del bacteriófago se selecciona a partir del grupo que consiste en el promotor T3, el promotor T7 y el promotor SP6.
20. 20. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor específico del bacteriófago es el promotor T3.
21. 21. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los dieciséis cebadores de transcriptasa inversa 51 para cebar la transcripción del ADNc a partir del ARNc tienen la secuencia A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO:3).
22. 22. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los dieciséis cebadores de transcriptasa inversa 5' para cebar la transcripción del ADNc a partir del ARNc tienen la secuencia G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO: 7) .
23. 23. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el vector se selecciona a partir del grupo que consiste en pBC SK+, pBS SK+, pBS SK+/DGT1, pBS SK7DGT2 y pBS SK+/DGT3.
24. 24. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el vector es el plásmido pBC S + asociado con Clal y Notl , y el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 31 en el paso (g) es G-A-A-C-A-A-A-A-G-C-T-G-G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C (SEQ ID NO : 4 ) .
25. 25. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación l, caracterizado porque el vector es el plásmido pBC S + disociado con Clal y Notl, y el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 31 en el paso (g) es A-A-G-C-T-G-G-A-G-C-T-C-C-A-C-C (SEQ ID NO:8).
26. 26. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda endonucleasa de restricción que reconoce una secuencia de cuatro nucleótidos en MspI .
27. 27. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda endonucleasa de restricción que reconoce una secuencia de cuatro nucleótidos, se selecciona a partir del grupo que consiste en bol . Dpnll , Sau3AI , Tsp.5091, Hjoall , Bfal , CSO6I . Msel . Hhal . NlalII . Taal , MspI . MaeII y HinPlI .
28. 28. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la primera endonucleasa de restricción que reconoce más de seis bases, se selecciona a partir del grupo que consiste en AscI , Bael . Fsel . Notl , Pací, Pmel , Ppu I . RsrII, SapI . SexAI , Sfil, SqfI . SgrAI , SrfI . Sse837I y SwaI .
29. 29. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la primera endonucleasa de restricción que reconoce más de seis bases es Notl .
30. 30. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) tiene un reconocimiento de secuencia de nucleótidos que incluye la secuencia de cuatro nucleótidos de la segunda endonucleasa de restricción utilizada en el paso (b) .
31. 31. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la segunda endonucleasa de restricción es MspI , y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) es SiriaI .
32. 32. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la segunda endonucleasa de restricción es Taql . y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) es Xhol .
33. 33. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la segunda endonucleasa de restricción es HinPII , y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) es NarI .
34. 34. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la segunda endonucleasa de restricción es Maell , y la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) es AatlI .
35. 35. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el vector del paso (c) está en la forma de una molécula de ADN circular que tiene primero y segundo sitios de endonucleasa de restricción del vector flanqueando una secuencia de relleno del vector, y porque además comprende el paso de digerir el vector con endonucleasas de restricción que disocian el vector en los sitios de las primera y segunda endonucleasas de restricción del vector.
36. 36. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 35, caracterizado porque la secuencia de relleno del vector incluye un sitio interno de endonucleasa de restricción de relleno del vector entre los sitios de las primera y segunda endonucleasas de restricción del vector.
37. 37. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 36, caracterizado porque el paso (d) incluye la digestión del vector con una endonucleasa de restricción que disocia el vector en el sitio interno de la endonucleasa de restricción de relleno del vector.
38. 38. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 37, caracterizado porque la endonucleasa de restricción utilizada en el paso (d) , también disocia el vector en el sitio interno de la endonucleasa de restricción de relleno del vector.
39. 39. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de generar fragmentos linearizados de los insertos clonados comprende: (i) dividir el plásmido que contiene el inserto en dos fracciones, una primera fracción disociada con la endonucleasa de restricción Xhol , y una segunda fracción disociada con la endonucleasa de restricción Salí ; (ii) recombinar las primera y segunda fracciones después de la disociación; (iii) dividir las fracciones recombinadas en tercios, y disociar el primer tercio con la endonucleasa de restricción Hindill , el segundo tercio con la endonucleasa de restricción BamHI, y el tercer tercio con la endonucleasa de restricción EcoRI : y (iv) recombinar los tercios después de la digestión con el objeto de producir una población de fragmentos linearizados, de los cuales aproximadamente una sexta parte de la población corresponde al producto de disociación por cada una de las posibles combinaciones de enzimas .
40. 40. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la población de ARNm se ha enriquecido para las especies de ARNm poliadeniladas .
41. 41. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la resolución de los fragmentos amplificados en el paso (h) se conduce mediante electroforesis , para exhibir los productos.
42. 42. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque la intensidad de los productos exhibidos después de la electroforesis es aproximada-mente proporcional a las abundancias de los ARNms correspondientes a los productos en la mezcla original.
43. 43. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque además comprende un paso de determinar la abundancia relativa de cada ARNm en la mezcla original a partir de la intensidad del producto correspondiente a la ARNm después de la electroforesis .
44. 44. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque el paso de resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa mediante electroforesis, comprende la electroforesis de los fragmentos sobre cuando menos dos geles .
45. 45. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque la célula anfitriona adecuada es Escherichia coli.
46. 46. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 41, caracterizado porque además comprende los pasos de: (i) eluir cuando menos un ADNc correspondiente a un ARNm a partir de un electroferograma, donde se exhiban las bandas que representen los extremos 3 ' de los ARNms presentes en la muestra; (j) amplificar el ADNc eluido en una reacción en cadena de la polimerasa; (k) clonar el ADNc amplificado en un plásmido; (1) producir ADN correspondiente al ADN clonado a partir del plásmido; y (m) secuenciar el ADN.c clonado.
47. 47. Un método para la iden ificación simultánea específica de la secuencia de los ARNms en una población de ARNm, el cual comprende los pasos de : (a) aislar una población de ARNm; (b) preparar una población de ADNc de doble cadena a partir de una población de ARNm utilizando una mezcla de cebadores de ancla, incluyendo cada cebador de ancla: (i) un tramo de 7 a 40 residuos T; (ii) un sitio para disociación mediante una primera endonucleasa de restricción que reconoce ocho bases, localizándose el sitio para asociación en el lado 5' del tramo de residuos T; (iii) un primer segmento rellenador de 4 a 40 nucleótidos, localizándose el segmento rellenador en el lado 51 del sitio para disociación mediante la primera endonucleasa de restricción, y (iv) los residuos de fase seleccionados a partir del grupo que consiste en -V y -V-N localizados en el extremo 3 ' de cada uno de los cebadores de ancla, donde V es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T, incluyendo la mezcla cebadores de ancla que contienen todas las posibilidades para V y N; (c) disociar la población de ADNc de doble cadena con la primera endonucleasa de restricción y con una segunda endonucleasa de restricción que reconoce una secuencia de cuatro nucleótidos, para formar una población de moléculas de ADNc de doble cadena que tienen primero y segundo términos, respectivamente; (d) insertar las moléculas de ADNc de doble cadena del paso (b) cada una en un vector en una orientación que sea anti-sentido con respecto a un promotor T3 adentro del vector, para formar una población de vectores que contengan las moléculas de ADNc insertadas, definiendo esta inserción las secuencias de vector de flanqueo 31 y 51 , de tal manera que 51 esté corriente arriba desde la cadena en sentido del ADNc insertado, y 31 esté corriente abajo de la cadena en sentido, y teniendo este vector una secuencia de nucleótidos de flanqueo 3 ' de cuando menos 15 nucleótidos de longitud entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y un sitio que defina el iniciador de transcripción en este promotor; (e) transformar Escherichia coli con el vector en el que se haya insertado el ADNc disociado, para producir vectores que contengan insertos clonados; (f) generar fragmentos linearizados que contengan las moléculas de ADNc insertadas mediante digestión de los vectores producidos en el paso (e) con cuando menos una endonucleasa de restricción que no reconozca las secuencias en las moléculas de ADNc insertadas o en el promotor T3 ; (g) generar una preparación de AR c de transcripciones de ARNc anti-sentido mediante incubación de los fragmentos linearizados con una polimerasa de ARN T3 capaz de iniciar la transcripción desde el promotor T3 ; (h) dividir la preparación de ARNc en subgrupos, y transcribir el ADNc de la primera cadena de cada subgrupo, utilizando una transcriptasa inversa y uno de los cebadores de transcriptasa inversa 5 ' definidos por tener un término 3 ' consistente en -Nx, donde "N" es uno de los cuatro desoxirribonu-cleótidos A, C, G o T, y "x" es un entero de 1 a 5, siendo el cebador de transcriptasa inversa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud, y complementario para la secuencia de vector de flanqueo 5', extendiéndose la complementariedad del cebador de transcriptasa inversa 5' a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x" , donde se utiliza un cebador diferente de los cebadores en diferentes subgrupos, y donde hay cuatro subgrupos si "x" = 1, y 16 subgrupos si "x" =2; (i) utilizar el producto de la transcripción del ADNc de la primera cadena en cada uno de los subgrupos como una plantilla para una reacción en cadena de la polimerasa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' de 15 a 30 nucleótidos de longitud que sea complementario para las secuencias del vector de flanqueo 3' entre el sitio de la primera endonucleasa de restricción y el sitio que defina el inicio de la transcripción mediante el promotor T3 , y un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' que tenga un término 3' consistente en -Nx-Ny) donde "N" y "x" son como en el paso (h) , -Nx es la misma secuencia que en el cebador de transcriptasa inversa 51 a partir del que se hizo el ADNc de la primera cadena para ese subgrupo, e "y" es un entero, de tal manera que x + y es igual a un entero seleccionado a partir del grupo que consiste en 4 y 5, siendo el cebador de cadena de la polimerasa 5' de 15 a 30 nucleótidos de longitud y complementario para la secuencia del vector de flanqueo 51 , extendiéndose la complementariedad del cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' a través de los nucleótidos específicos del inserto del ARNc en un número de nucleótidos igual a "x + y", para producir los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa, y (j) resolver los fragmentos amplificados con reacción en cadena de la polimerasa para generar una exhibición de productos que representen los extremos 31 de diferentes ARNms presentes en la población de ARNm.
48. 48. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizado porque cada uno de los cebadores en la mezcla de cebadores de ancla, tienen la secuencia A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (SEQ ID NO : 2 ) .
49. 49. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizado porque cada uno de los cebadores en la mezcla de cebadores de ancla, tienen la secuencia A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (SEQ ID NO:23) .
50. 50. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizado porque la primera endonucleasa de restricción es MspI , y la segunda endonucleasa de restricción es Noti .
51. 51. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizado porque el cebador de transcrip-tasa inversa 5' en el paso (h) es G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO: 9) .
52. 52. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizado porque el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3· es A-A-G-C-T-G-G-A-G-C-T-C-C-A-C-C (SEQ ID NO:8) .
53. 53. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizado porque "y" en el paso (i) es 3.
54. 54. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 47, caracterizado porque "y" en el paso (i) es 4.
55. 55. Un método para detectar un cambio en el patrón de la expresión del ARNm en un tejido asociado con un cambio fisiológico o patológico, el cual comprende los pasos de: (a) obtener una primera muestra de un tejido que no sea objeto del cambio fisiológico o patológico; (b) aislar una población de ARNm a partir de la primera muestra; (c) determinar el patrón de expresión del AR m en la primera muestra del tejido, realizando los pasos (a) - (h) de la reivindicación 1, para generar una primera exhibición de productos específicos de la secuencia que representan los extremos 3' de los AR ms presentes en la primera muestra; (d) obtener una segunda muestra del tejido que haya sido el objeto de un cambio fisiológico o patológico; (e) aislar una población de ARNm a partir de la segunda muestra; (f) determinar el patrón de expresión del ARNm en la segunda muestra del tejido, realizando los pasos (a) - (h) de la reivindicación 1, para generar una segunda exhibición de productos específicos de la secuencia que representan los extremos 3' de los ARNms presentes en la segunda muestra; y (g) comparar las primera y segunda exhibiciones para determinar el efecto del cambio fisiológico o patológico sobre el patrón de expresión del ARNm en el tejido.
56. 56. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 55, caracterizado porque el tejido se deriva a partir del sistema nervioso central .
57. 57. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 56, caracterizado porque el cambio fisiológico o patológico se selecciona a partir del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, parkinsonismo, isquemia, adicción al alcohol, adicción a las drogas, esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiples, depresión, y desorden maniaco-depresivo bipolar.
58. 58. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 56, caracterizado porque el cambio fisiológico o patológico está asociado con aprendizaje o memoria, emociones, neurotoxicidad por glutamato, comportamiento de alimentación, olfato, visión, desórdenes del movimiento, infección viral, terapia por electrochoque , o la administración de un fármaco o toxina .
59. 59. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 56, caracterizado porque el cambio fisiológico o patológico se selecciona a partir del grupo que consiste en variación circadiana, envejecimiento, y potenciamiento a largo plazo.
60. 60. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 56, caracterizado porque el tejido se deriva a partir de una estructura dentro del sistema nervioso central, seleccionada a partir del grupo que consiste en retina, corteza cerebral, bulbo olfatorio, tálamo, hipotálamo, pituitaria anterior, pituitaria posterior, hipocampo, nucleus accumbens, amígdala, estriato, cerebelo, tallo cerebral, núcleo supraquias-mático, y médula espinal.
61. 61. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 55, caracterizado porque el tejido es a partir de un órgano o sistema de órgano seleccionado a partir del grupo que consiste en el sistema cardiovascular, el sistema pulmonar, el sistema digestivo, el sistema nervioso periférico, el hígado, el riñon, el músculo esquelético, y el sistema reproductor.
62. 62. Un método para detectar una diferencia en la acción de un fármaco que se vaya a rastrear y un compuesto conocido, el cual comprende los pasos de: (a) obtener una primera muestra de tejido a partir de un organismo tratado con un compuesto de una función fisiológica conocida ,- (b) aislar una población de ARNm a partir de la primera muestra; (c) determinar el patrón de expresión del ARNm en la primera muestra del tejido, realizando los pasos (a) - (h) de la reivindicación 1, para generar una primera exhibición de productos específicos de la secuencia que representan los extremos 3' de los ARNms presentes en la primera muestra ,- (d) obtener una segunda muestra de tejido a partir de un organismo tratado con un fármaco que se vaya a rastrear, para determinar una diferencia en la acción del fármaco y el compuesto conocido ; (e) aislar una población de ARNm a partir de la primera muestra; (f) determinar el patrón de expresión de ARNm en la segunda muestra del tejido realizado los pasos (a) - (h) de la reivindicación 1, para generar una segunda exhibición de productos específicos de la secuencia que representan los extremos 3' de los AR ms presentes en la segunda muestra; y (g) comparar las primera y segunda exhibiciones, con el objeto de detectar la presencia de las especies de ARNm, cuya expresión no sea afectada por el compuesto conocido, pero que sea afectada por el fármaco que se vaya a rastrear, indicando de esta manera una diferencia en la acción del fármaco que se vaya a rastrear y el compuesto conocido.
63. 63. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 62, caracterizado porque el fármaco que se va a probar se selecciona a partir del grupo que consiste en antidepresivos, neurolépticos, tranquilizantes, anticonvolusio-nantes, inhibidores de oxidasa de monoamina, y estimulantes.
64. 64. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 62, caracterizado porque el fármaco que se va a probar, se selecciona a partir del grupo que consiste en agentes anti-parkinsonismo, relajantes del músculo esquelético, analgésicos, anestésicos locales, colinérgicos , agentes antivirales, antiespasmódicos , esteroides, y fármacos anti-inflamatorios no esteroidales .
65. 65. Una mezcla degenerada de cebadores de ancla, que comprende una mezcla de 12 cebadores de las secuencias A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (SEQ ID NO: 2) , donde V es un desoxirribonucleó- tido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C y G; y N es un desoxirribonucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en A, C, G y T, estando cada uno de los 12 cebadores presentes en aproximadamente una cantidad equimolar.
66. 66. Una base de datos que comprende los datos producidos mediante la cuantificación de la exhibición de los productos específicos de la secuencia de la reivindicación 1, para producir una dirección digital, siendo esta dirección digital definida como un identificador de secuencia, la longitud del producto de reacción en cadena de la polimerasa específico de la secuencia en los residuos de nucleótidos, y la intensidad de la marca del producto de reacción en cadena de la polimerasa, definida como el área debajo del pico de la salida del detector para ese producto en reacción en cadena de la polimerasa.
67. 67. La base de datos de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 66, caracterizada porque además comprende datos seleccionados a partir del grupo que consiste en relaciones de secuencias, mapeo genético, y distribuciones celulares.
68. 68. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende los pasos de: (i) eluir cuando menos un ADNc correspondiente a un ARNm a partir de un electroferograma, donde se exhiban las bandas que representen los extremos 31 de los ARNms presentes en la muestra; (j) amplificar el ADNc eluido en una reacción en cadena de la polimerasa; (k) clonar el ADNc amplificado en un plásmido; (1) producir ADN correspondiente al ADN clonado a partir del plásmido; (m) determinar la secuencia del ADNc clonado; (n) determinar las secuencias de nucleótidos correspondientes a partir de una base de datos de las secuencias de nucleótidos, estando estas secuencias de nucleótidos correspondientes delimitadas por el sitio de reconocimiento más distal para la segunda endonucleasa y el principio de la cola poli (A) ; y (o) comparar la secuencia de ADNc clonado con las secuencias de nucleótidos correspondientes, reconociendo de esta manera las identidades y similitudes de secuencias entre la secuencia de los extremos 3 ' de las moléculas de ARNm presentes en una muestra, y una base de datos de secuencias.
69. 69. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 68, caracterizado porque además comprende el paso de: (p) comparar la longitud y la cantidad de los productos de reacción en cadena de la polimerasa en una exhibición gráfica bidimensional .
70. 70. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 69, caracterizado porque además comprende los pasos de : (q) determinar la longitud esperada de la secuencia de nucleótidos correspondiente, que es igual a la suma de las longitudes de la secuencia de nucleótidos correspondiente determinada a partir de la base de datos, la longitud de la secuencia de reacción en cadena de la polimerasa 5' hibridizable en la secuencia del vector, la longitud de la secuencia cebadora del cebador de ancla restante, un segmento que intervenga de la secuencia del vector, y la longitud de la secuencia de reacción en cadena de la polimerasa 3 ' hibridizable en la secuencia del vector; y (r) comparar la longitud del producto de reacción en cadena de la polimerasa con la longitud esperada determinada de la secuencia de nucleótidos correspondiente, donde la longitud esperada de la secuencia de nucleótidos correspondiente se indica en la exhibición gráfica bidimensional , mediante la utilización de un símbolo gráfico o un carácter de texto.
71. 71. Un método para reconocer identidades y similitudes de secuencias entre la secuencia de un fragmento de ADNc correspondiente a una molécula de ARNm presente en una muestra y una base de datos de secuencias, el cual comprende los pasos de: eluir un fragmento de ADNc correspondiente a una molécula de ARNm presente en una muestra; amplificar el fragmento de ADNc eluido en una reacción en cadena de la polimerasa, para producir el fragmento de ADNc amplificado; clonar el fragmento de ADNc amplificado en un plásmido; producir una molécula de ADN correspondiente al fragmento de ADNc clonado; secuenciar la molécula de ADN producida, determinando de esta manera la secuencia del fragmento de ADNc eluido; y comparar la secuencia del fragmento de ADNc eluido con las secuencias en una base de datos, reconociendo de esta manera las identidades y similitudes de secuencias.
72. 72. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 71, caracterizado porque el paso de comparar la secuencia del fragmento de ADNc eluido con las secuencias en la base de datos, se realiza utilizando una computadora.
73. 73. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 72, caracterizado porque comprende el paso adicional de exhibir los resultados de la comparación gráficamente .
74. 74. Un método para reconocer las identidades y similitudes de secuencias entre la secuencia de un fragmento de ADNc correspondiente a una molécula de ARNm presente en una muestra y en una base de datos de secuencias, el cual comprende los pasos de: eluir un fragmento de ADNc correspondiente a una molécula de ARNm presente en una muestra, donde el fragmento de ADNc tiene una longitud determinada por la posición de un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción y una cola poli (A) de la molécula de A Nm; determinar una secuencia parcial del fragmento de ADNc, mediante la realización de una reacción en cadena de la polimera-sa con un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 51 correspondiente a la secuencia del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción; y comparar la secuencia parcial determinada del fragmento de ADNc eluido y la longitud del fragmento de ADNc con las secuencias en una base de datos, reconociendo de esta manera las identidades y similitudes de secuencias.
75. 75. Un método para producir una entrada de base de datos de secuencia de polinucleótido transformada, el cual comprende los pasos de : seleccionar una secuencia fuente a partir de una entrada de base de datos de secuencia de polinucleótidos ; localizar una secuencia de cola poli (A) dentro de la secuencia fuente; localizar una secuencia de sitio de reconocimiento de endonucleasa dentro de la secuencia fuente que esté más cercana al primer sitio de reconocimiento; determinar una secuencia índice consistente en aproximadamente dos a aproximadamente seis nucleótidos adyacentes al sitio de reconocimiento de endonucleasa; determinar una secuencia correlacionada dentro de la secuencia fuente, incluyendo esta secuencia correlacionada, la secuencia fijada por la cola poli (A) y el sitio de reconocimiento v de endonucleasa, e incluyendo cuando menos parte del sitio de reconocimiento de endonucleasa; 5 determinar la longitud de la secuencia correlacionada; y almacenar la información con respecto a la localización y secuencia de la cola poli (A) , la localización y secuencia del sitio de reconocimiento de endonucleasa, y la longitud de la 0 secuencia correlacionada en relación con la secuencia fuente, produciendo de esta manera una entrada de base de datos transformada .
76. 76. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 75, caracterizado porque además comprende el paso 5 de: exhibir gráficamente la longitud de la secuencia correlacionada en relación con la secuencia índice.
77. 77. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 76, caracterizado porque la endonucleasa de 0 restricción se selecciona a partir del grupo que consiste en MspI , Taal y HinPlI .
78. 78. Un método para mejorar la resolución de la longitud y cantidad de productos de reacción en cadena de la polimerasa, mediante la reducción del fondo que se debe a la 5 amplificación de ADNcs no dirigidos, el cual comprende los pasos de: seleccionar una muestra de una población de ARNc, donde cada molécula de ARNc comprende la secuencia de inserto y la secuencia derivada del vector; realizar transcripción inversa utilizando un cebador de transcripción inversa que se hibride en la secuencia derivada del vector, y que extienda de aproximadamente 5 nucleótidos a aproximadamente 6 nucleótidos a través de la secuencia de inserto, para producir un producto de transcripción inversa de ADNc; subdividir el producto de transcripción inversa de ADNc; realizar cuando menos una reacción en cadena de la polimerasa utilizando el producto de transcripción inversa de ADNc subdividido, un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 3' , y un cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' que se hibride en la secuencia derivada del vector, y que extienda de aproximadamente 7 nucleótidos a aproximadamente 9 nucleótidos a través de la secuencia de inserto, para producir un producto de reacción en cadena de la polimerasa, reduciendo de esta manera el fondo que se debe a la amplificación de los ADNcs no dirigidos.
79. 79. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 78, caracterizado porque hay dieciséis grupos de reacciones de transcripción inversa, y hay 16 cebadores de transcripción inversa diferentes.
80. 80. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 79, caracterizado porque hay 4* subgrupos de reacciones en cadena de la polimerasa, donde X es la diferencia entre el número de nucleotidos que se extiende el cebador de reacción en cadena de la polimerasa 5' a través de la secuencia de inserto, y el número de nucleotidos que se extiende el cebador de transcripción inversa a través de la secuencia de inserto.