JP2002525124A - 代謝性骨疾患の治療におけるｐｅｘの使用 - Google Patents

代謝性骨疾患の治療におけるｐｅｘの使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者の代謝性骨疾患を診断する方法であって、患者の生物学上のサンプル内のＰＴＨｒＰレベルを測定する工程を含み、但し、正常な個体からのＰＴＨｒＰレベルとの違いが代謝性骨疾患および／または代謝性骨疾患の素因の指標である方法に関する。また、本発明は、患者の代謝性骨疾患を診断する方法であって、患者の生物学上のサンプル内のＰＴＨｒＰレベルを測定する工程を含み、但し、正常な個体からのＰＴＨｒＰレベルとの違いが代謝性骨疾患および／または代謝性骨疾患の素因の指標である方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 （ａ）発明の分野 本発明は、代謝性骨疾患、例えば骨軟化症および骨粗鬆症の治療におけるＰＥ
Ｘの使用に関する。
【０００２】 （ｂ）従来技術の記載 ＰＥＸ遺伝子内の変異は、Ｘ−リンクした低リン酸塩血性骨軟化症（ＨＹＰ）
に必須である。正常な生理におけるＰＥＸの役割に対しての洞察を得るため、我
々は、ヒト完全長のｃＤＮＡをクローン化してその組織発現、細胞下の位置測定
、およびペプチダーゼ活性を研究した。我々は、該ｃＤＮＡがネプリリジン（Ｎ
ＥＰ）をプロトタイプとして含む中性のエンドペプチダーゼのファミリーに構造
上関連する７４９アミノ酸の蛋白質をコードすることを示す。ノーザンブロット
分析によれば、完全長のＰＥＸ転写物のサイズは６．５ｋｂである。半定量性Ｐ
ＣＲにより測定されたところによれば、ＰＥＸ発現は、骨において、および腎臓
のリン酸塩浪費の準腫瘍性（paraneoplastic）症候群に関連する腫瘍組織におい
て高い。ＰＥＸは、イヌのミクロソーム膜および隔壁中の存在下で、一時的にト
ランスフェクトされたＣＯＳ細胞のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４抽出物からの界面
活性剤相において限定的にグリコシル化される。ｃ−ｍｙｃエピトープを付随さ
せたＰＥＸを発現するＡ２９３細胞における免疫蛍光の研究は、細胞外区画中の
そのＣ−末端ドメインと共に、該蛋白質に関する支配的な細胞表面局在を示すこ
とから、中性エンドペプチダーゼファミリーの他のメンバーのように、ＰＥＸは
タイプＩＩの細胞膜内の（integral）膜糖蛋白質であることを実証する。一時的
にＰＥＸを発現する培養されたＣＯＳ細胞からの細胞膜は効率よく外から加えた
ＰＴＨ−由来のペプチダーゼを分解することから、初めて、組換えＰＥＸがエン
ドペプチダーゼとして機能できることを証明する。ＰＥＸペプチダーゼ活性は、
変化したリン酸塩ホメオスタシスの状態においておよび代謝性骨疾患において、
薬理学上の干渉に関する便利な標的を提供するかもしれない。
【０００３】 Ｘ−リンクした低リン酸塩血性骨軟化症（ＨＹＰ）は、重度の低リン酸塩血症
、腎臓リン酸塩浪費症、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤレベルの低下した血
清濃度、および欠損性骨鉱化により特徴付けされる腎臓リン酸塩浪費症のもっと
も共通の遺伝性疾患である。最近まで、ＨＹＰの我々の理解のほとんどは、ＨＹ
Ｐの表現型の特徴の多くを提示する２つのマウスホモログＨｙｐおよびＧｙマウ
スの利用可能性により容易にされてきた。位置的なクローニングを通して、しか
しながら、Ｈｙｐ患者において欠損した領域Ｘｐ２２．１をまたぐ遺伝子、また
は該疾患を有する非欠損患者において変異した遺伝子が同定され（PEXと命名さ
れた）、その一部のｃＤＮＡ配列が報告された（The HYP Consortium(1995) Nat
ure Genetics 11，130-136）。予測されたヒトＰＥＸ遺伝子産物、並びにそのマ
ウス相同物（Du，L．et al．(1996) Genomics 36，22-28）は、多くのペプチド
ホルモンの活性化または分解の何れかに関与する中性エンドペプチダーゼのファ
ミリーに対する相同性を呈する。ＰＥＸは腎臓の尿細管のリン酸塩の処理を変調
するペプチドホルモンを代謝すると仮定されてきた。そのような活性は、その活
性形態へのホルモン前駆体のリン酸塩再吸着のプロセシングまたは循環するリン
酸塩尿の因子の不活性化の何れかを含みうる。これらの仮説にも拘わらず、ＰＥ
Ｘ遺伝子産物の生理学上の機能およびＨＹＰの腎臓および骨格の異常性を導く機
構は定義されないままである。
【０００４】 癌原性低リン酸塩血性骨軟化症（ＯＨＯ）は、ＨＹＰに類似した生化学的およ
び生理学的異常性を伴うリン酸塩ホメオスタシスの稀な後天性障害である。この
症候群は、その切り出しが代謝性異常を迅速に回復させ且つ骨の疾患の治療をも
たらす、様々な、組織学上異なる、通常は良性の間充織性腫瘍に関連する。これ
らの腫瘍により生成される因子はリン酸塩尿症を促進し、そして２５−ヒドロキ
シビタミンＤから１，２５−ジヒドロキシビタミンＤへの変換を阻害すると一般
には考えられる。リン酸塩尿の物質の性質は未知のままであり、リン酸塩の腎臓
尿細管再吸着を阻害することが知られている２つのポリペプチドホルモンである
副甲状腺ホルモン８ＰＴＨおよびカルシトニンの両者とは明らかに異なる。ＯＨ
ＯおよびＨＹＰを有する患者の臨床上の提示における著しい類似性のため、ＯＨ
Ｏにおいてリン酸塩尿症を引き起こす因子はＰＥＸ基質の活性形態であることが
予測される。ホスファトニンと呼ぶ仮想ＰＥＸ基質の同定および特徴付けは、し
かしながら、ＰＥＸ機能のいっそうの理解を必要とすることになる。
【０００５】 現在まで、骨において生産される局所性因子が如何にして骨の形成および骨の
再吸収を制御するのかについて理解する必要がまだ存在する。これらの因子の撹
乱は代謝性骨疾患を導く。そのような薬理学上の操作はこれらの疾患の治療への
新規なアプローチとして機能するかもしれない。
【０００６】 代謝性骨疾患、例えば骨軟化症および骨粗鬆症の治療における道具を提供する
ことは大いに望まれるはずである。 発明の概要 本発明の一つの目的は、代謝性骨疾患、例えば骨軟化症および骨粗鬆症の治療
における道具を提供することである。
【０００７】 本発明の別の目的は、代謝性骨疾患、例えば骨軟化症および骨粗鬆症の治療に
おけるＰＥＸの使用法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、代謝性骨疾患、例えば骨軟化症および骨粗鬆症の診
断方法を提供することである。
【０００８】 この目的のため、我々は、完全長のヒトＰＥＸ蛋白質をコードするｃＤＮＡを
クローン化し、そしてＰＥＸ転写物の組織分散を測定した。さらに、我々は、組
換えＰＥＸ蛋白質の細胞下の位置測定を試験し、そしてそのペプチダーゼ活性を
測定した。
【０００９】 本発明によれば、患者の代謝性骨疾患の診断方法が提供され、患者の生物サン
プル内のＰＴＨｒＰのレベルを測定する工程からなるが、その際、正常な個体か
らのＰＴＨｒＰレベルとの違いが代謝性骨疾患および／または代謝性骨疾患の素
因の指標である。
【００１０】 本発明によれば、ＰＥＸ酵素活性を変調する化合物を患者に投与する治療方法
が提供される。 本発明によれば、代謝性骨疾患を治療する医薬の製造のための、ＰＥＸ酵素活
性の変調のための化合物の使用方法が提供される。
【００１１】 本発明によれば、骨の分解および骨の形成を変調するために患者の骨芽細胞活
性を制御するＰＴＨおよびＰＴＨｒＰのレベルを変調することからなる、代謝性
骨疾患の治療方法が提供される。
【００１２】 本発明によれば、代謝性骨疾患の治療のために骨芽細胞活性を制御するＰＴＨ
およびＰＴＨｒＰのレベルの変調の使用方法が提供される。 本発明によれば、骨芽細胞中のＰＥＸの発現のためのＰＥＸ遺伝子構築物をそ
の微生物細胞および体細胞が含む、骨分化およびホスファトニンの両方における
ＰＥＸの役割を研究するための非ヒトトランスジェニック哺乳類が提供され、プ
ロ−ａｌ（Ｉ）コラーゲン遺伝子の近位のプロモーターの制御下の組換えＰＥＸ
遺伝子配列を必須とし、該ＰＥＸ遺伝子構築物は胚のステージにおいて哺乳類、
哺乳類の祖先に導入される。
【００１３】 非ヒト哺乳類は好ましくはマウスであり、そして近位のプロモーターは好まし
くはマウスのプロ−ａｌ（Ｉ）コラーゲン遺伝子であり、より好ましくはその２
．３ｋｂの断片である。
【００１４】 表現「代謝性骨疾患」は、限定ではないが、骨軟化症、骨粗鬆症、大理石骨病
およびパジェット病を含む。
【００１５】 発明の詳細な説明 ＰＥＸは細胞膜結合蛋白質である 以前の研究は、ＮＥＰ，ＥＣＥ−１およびケル式血液型糖蛋白質が細胞膜内の
膜蛋白質であることを証明した。我々は、界面活性剤ＴｒｉｔｏｎTMＸ−１１４
の抽出および免疫化学位置測定を使用することにより、ＰＥＸも膜結合蛋白質で
あるか否かを試験した。ＰＥＸの同定のため、我々は、ＰＥＸのカルボキシル末
端配列がヒトｃ−ｍｙｃタグにより修飾された構築物を生成した。ＰＥＸ蛋白質
のあらゆる脂質修飾が連続して進行してよいように、エピトープタグは有力なプ
レニル化部分のすぐ上流に挿入した。
【００１６】 ＴＲＩＴＯＮTMＸ−１１４は、４℃において水溶液を形成するが、温度を３０
−３７℃に上昇すると疎水性相と水性相に分離する界面活性剤である。この特性
は蛋白質の疎水性の指標として使用されており、細胞膜内の膜蛋白質は界面活性
剤相に独占的に分配されるが、親水性の高い蛋白質は水性相に結合する。ｃ−ｍ
ｙｃエピトープを付随したＰＥＸを一時的に発現するＣＯＳ−７細胞からのＴＲ
ＩＴＯＮTMＸ−１１４は、ＰＥＸがほとんど独占的に界面活性剤相に分配される
ことを示した。この発見は、ＰＥＸが膜結合蛋白質であり、且つ細胞膜内の膜蛋
白質であるとの配列分析の予測と一致することを示す。
【００１７】 ＰＥＸの細胞下の局在を測定するため、安定にトランスフェクトされたＡ２９
３細胞中で発現された組換え蛋白質の分配を免疫蛍光を使用して試験した。細胞
を固定して透過性にしたとき、ｍｙｃを付随したＰＥＸの免疫染色は主に細胞表
面上に検出されたが、多くの細胞においても染色が細胞内で観察され、但し核内
にシグナルは観察されなかった。透過化を省くと、染色は独占的にプラズマ膜に
局在され、一方、未トランスフェクトの細胞またはベクターのみをトランスフェ
クトした細胞は免疫蛍光染色を示さなかった。ｍｙｃ−タグはＰＥＸのカルボキ
シル末端に挿入されたので、これらの発見はさらに、ＰＥＸが、細胞外区画中に
活性酵素部位を含むその大きなＣ−末端疎水性ドメインを伴うタイプＩＩの細胞
膜内の膜蛋白質であるとの、配列に基づく予測と一致する。
【００１８】 組換えＰＥＸ蛋白質はペプチダーゼ活性を有する 細胞下の局在およびＰＥＸとＮＥＰの間の配列類似性は、ＰＥＸが膜結合メタ
ロペプチダーゼとして機能することを強く示唆する。しかしながら、ペプチダー
ゼ活性がＰＥＸに帰したことはまだない。示されるとおり、ＮＥＰ活性に関する
アッセイに使用される［Ｄ−Ａｌａ2，Ｌｅｕ5］エンケファリンを、ベクターを
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞または等量の組換えヒトＮＥＰまたはＰＥＸ
蛋白質を発現するＣＯＳ細胞からの膜調製物とインキュベートした場合、ウエス
タンブロット分析による測定によれば、基質からのＴｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
の生成がＮＥＰ−発現膜調製物においてのみ明らかであった。ＰＥＸ配列はＮＥ
Ｐの触媒活性に必須の残基の２つを保存するが（Ｅ646およびＨ711と均等）、そ
れはＮＥＰのジペプチジルカルボキシペプチダーゼに必須であることが示された
Ｒ102に均等な残基を欠く。よって、ＮＥＰとは異なり、ＰＥＸはジペプチジル
カルボキシペプチダーゼ活性を有さない。
【００１９】 組換えＰＥＸのペプチダーゼ活性に関して試験するため、ベクター−トランス
フェクトされたＣＯＳ細胞または組換えＰＥＸ蛋白質を発現するＣＯＳ細胞から
の細胞膜調製物を、ヒト副甲状腺ホルモンＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ（１
−３８）とインキュベートした。示されるとおり、ＰＥＸ活性は極めて特徴的な
パターンにて両方のペプチドを分解することができた。よって、ＰＥＸはエンド
ペプチダーゼとして機能するが、より特定すれば、我々はそれがＰＴＨを分解す
ることを初めて示した。ＰＴＨはＰＥＸの第一の且つ唯一の公知の基質である。
これらの観察は、２つの重要なポイントをなす： ＰＥＸは細胞外区画においてその活性な酵素部位を有する膜結合蛋白質である
。もっとも高いレベルのＰＥＸ発現を伴う細胞は骨芽細胞（骨形成細胞）である
。これらの細胞は骨のレベルにおいて循環するＰＴＨの作用部位でもある。ＰＴ
Ｈは、これらの細胞が、他の骨細胞、特定すれば骨芽細胞を今度は刺激すること
により骨を分解する因子（性質は未知）を生成することを刺激する。ＰＥＸは同
様に骨芽細胞と接触してＰＴＨを不活性化するので、骨芽細胞の刺激の低下をも
たらし、よって低下した骨分解をもたらすはずである。
【００２０】 あるいは、骨芽細胞は正常な骨密度の分化において重要な副甲状腺ホルモン関
連ペプチド、ＰＴＨｒＰを生成する。ＰＴＨｒＰはＰＴＨと多くの構造特性を共
有し、よって、ＰＴＨの基質としても作用するかもしれない。遺伝子標的化によ
り生成したＰＴＨｒＰヘテロ接合体ヌルマウスを使用した我々の以前の研究は、
骨格の微小環境におけるＰＴＨｒＰの低下したレベルが骨芽細胞の成熟前の形態
を導くことを示した。骨芽細胞中のＰＥＸは、よって、局所的にＰＴＨｒＰレベ
ルを変調し、即ち、骨形成を変調するかもしれない。ＰＥＸの酵素活性の阻害は
ＰＴＨｒＰの高い局所濃度を可能にし、よって良好な骨形成を可能にするかもし
れない。
【００２１】 ＰＴＨの分解断片を試験することにより、我々は、今、ペプチドおよび非ペプ
チド活性化剤およびＰＴＨ酵素活性の阻害剤をデザインすることができる。 骨芽細胞の活性を制御するＰＴＨおよびＰＴＨｒＰのレベルを変調することに
より、ＰＥＸは骨軟化症および骨粗鬆症の病理において必須の役割を担うかもし
れない。ＰＥＸ活性の薬理学上の変調により、骨分解および骨形成を変調するこ
とが可能になる。これは、これらの代謝性骨疾患の治療に対する全く新規なアプ
ローチである。
【００２２】 実験手法 腫瘍組織 患者Ｉは５５歳の女性であり、骨の痛みが進行性に増加して歩行が困難な２年
の歴史を有する。腰仙のスピンのＸ線はオステオペニアを広がらせることを示し
た。生化学上の調査は、血清のカルシウムレベルが正常であり、一方血清のリン
が低かったこと（０．４１から０．５７ｍｍｏｌ／Ｌ；正常、０．８−１．６ｍ
ｍｏｌ／Ｌ）を示した。アルカリホスファターゼは２３２Ｕ／Ｌであり（正常、
３０−１０５Ｕ／Ｌ）、上記患者が低リン酸塩血であった間のリン酸塩の尿細管
再吸着は６３％に低下した（正常、＞８０％）。腫瘍の調査は陰性であり、そし
て上記患者は１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および経口リン酸塩で治療し
た。５年後、右手の塊が発見されて外科切除した。組織病理学試験によると、そ
れは繊維状血管腫であった。手術後、患者は彼女の低部四肢に増大する抵抗力に
気づき、彼女の痛みの減少に気づいた。血清のリンは正常化し（０．９６ｍｍｏ
ｌ／Ｌ）、そしてリン酸塩の尿細管再吸着は改善されたが、完全には正常化しな
かった（７１−７６％）。
【００２３】 患者ＩＩは２１歳の男性であり、ＯＨＯの古典的な特徴を伴った。足の底の表
面からの良性の骨格外軟骨腫の切除は、上記症候群に関連した生物化学上および
臨床上の異常性の完全な逆転をもたらした。
【００２４】 手術したこれらの２人の患者から得た腫瘍組織は直後に液体窒素中で凍結させ
て−７０℃において保存した。 ＯＨＯ−関連腫瘍中のＰＥＸ発現 ＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡキット（キアゲン、シャッツワース、ＣＡ）を使用して
ＲＮＡを腫瘍組織から抽出し、そしてオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびスーパー
スクリプトＩＩ（ＢＲＬ）逆転写酵素を使用して１時間４２℃において最終反応
体積３０μｌにおいて逆転写した。結果のｃＤＮＡは、次に、公表されたｃＤＮ
Ａ配列（１２９８および１８０７はそれぞれセンスおよびアンチセンスの５‘末
端のヌクレオチド位置である）からデザインしたヒトＰＥＸ−特異的オリゴヌク
レオチドプライマーＰＥＸ−１（５’−GGAGGAATTGGTTGAGGGCG−３‘）およびＰ
ＥＸ−２（５‘−GTAGACCACCAAGGATCCAG−３’）を用いて増幅した（The HYP Co
nsortium(1995) Nature Genetics 11，130-136）。増幅後（３５サイクル）、Ｐ
ＣＲ反応のアリコートを１％アガロースゲル上で分画してエチジウムブロミドに
よる染色で可視化した。
【００２５】 完全長のＰＥＸｃＤＮＡのクローン化 ＰＥＸｃＤＮＡの５‘末端のクローン化をアンカー化ＰＣＲにより達成した。
全細胞ＲＮＡを腫瘍ＩＩから抽出して、ｍＲＮＡを調製した。１．５μｇのｍＲ
ＮＡを１００ｎｇのＰＣＲ−特異的アンチセンスオリゴマー（ＰＥＸ−２）およ
び２００ユニットのスーパースクリプトＩＩ（ＢＲＬ）逆転写転写酵素を用いて
１時間４２℃において最終体積３０μｌ中で逆転写転写した。結果のｃＤＮＡは
１％アガロースゲル上でサイズ分画して、＞６００ｂｐに相当する断片を精製し
てＨ2Ｏに再懸濁した。第１鎖ｃＤＮＡの３’末端は、１μｌのターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用して３７℃において３
０分間５０μｌの体積でテイル化したホモポリマーであった。酵素の熱不活性化
後、ＲＮＡ鋳型をＲＮａｓｅ Ｈとのインキュベートにより除去し、そしてテイ
ル化されたｃＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出、続く酢酸アンモニウム沈
殿により精製した。精製されたテイル化ｃＤＮＡをＨ2Ｏ中に再懸濁し、そして
アリコートをアンカー化ＰＣＲ分析のために２００ｎｇの内部ＰＥＸ特異的アン
チセンスプライマー（ＰＥＸ−３，５‘−CGTGCCCAGAACTAGGGTGCCACC−３’（配
列番号７）；公表されたヒトｃＤＮＡ配列のヌクレオチド９８は該プライマーの
５‘末端である）およびセンスプライマーとしての２００ｎｇのオリゴｄＣと共
に使用した。５０サイクルのＰＣＲを０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（プロメ
ガ、バイオテック、マジソン、ＷＩ）を使用して５０μｌの反応体積にて実施し
た。循環パラメーターは、９４℃における１分間の変性、５５℃における２分間
のアニーリング、および７２℃における２分間の伸長であった。ＰＣＲ産物は１
％アガロースゲル上で分画して７００ｂｐのバンドを単離し、精製し、そしてｐ
ＣＲＩＩベクター（インビトロジェン）に連結した。ＩＮＶαＦ’バクテリアへ
の形質転換後に、適切なサイズの挿入物を含むクローンを配列決定した。
【００２６】 ＰＥＸｃＤＮＡの３‘末端をクローン化するため、腫瘍Ｉから得たｍＲＮＡか
ら生成したｐＣＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン）内の増幅された単方向性
ｃＤＮＡライブラリーのアリコートを一晩ＬＢ培地中で生育させ、そしてプラス
ミドＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ（０．５μｇ）を、ＰＥＸ−特異的センスオリゴ
マー（ＰＥＸ−１）およびｐＣＤＮＡ３ベクター中に存在するＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼ結合部位に対応するアンチセンスオリゴマーを使用してＰＣＲに供した
。３５サイクルの増幅を５０μｌの体積にて、９４℃における１分間の変性、５
５℃における１分間のアニーリング、および７２℃における１分間の伸長からな
る各サイクルにて実施した。増幅産物は１％アガロースゲル上で分画して、ＰＥ
ＸｃＤＮＡの３’末端に相当する１．２ｋｂの断片をサブクローン化して配列決
定した。
【００２７】 発現の研究のため、ＰＥＸｃＤＮＡの５‘末端を含むＥｃｏＲＶ（ｐＰＣＲＩ
Ｉのポリリンカー中）／ＡｃｃＩ（ＰＥＸ配列中）断片を、ＡｃｃＩおよびＥｃ
ｏＲＶによる消化後にＰＥＸｃＤＮＡの３’末端を含むｐＰＣＲＩＩベクターに
連結した。結果のプラスミドを完全長のＰＥＸｃＤＮＡを切り出すＫｐｎＩおよ
びＮｏｔＩにより制限し、次に、ポリリンカー領域中のＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ部位
において消化されたｐＣＤＮＡ３ベクター内に挿入され、プラスミドｐＰＥＸを
もたらした。完全長のＰＥＸｃＤＮＡをアプライドバイオシステムズ３７３Ａ自
動化配列決定機を使用して配列決定した。
【００２８】 ＰＥＸｍＲＮＡの組織の発現 ＰＥＸ発現を正常なヒト組織中およびＳａｏｓ−２ヒト骨芽骨肉腫細胞系中で
、ＲＴ−ＰＣＲによりオリゴヌクレオチドＰＥＸ−４（５‘−CTGGAT-CCTTGGTGG
TCTAC−３’配列番号８）およびＰＥＸ−５（５‘−CACTGTGCAACTGTCTCA−３’
配列番号９）をセンスおよびアンチセンスプライマーとして使用して試験した（
２３９８および２８９５は完全長ヒトＰＥＸｃＤＮＡからデザインされたこれら
のプライマーの５‘末端のヌクレオチド位置である）。ヒト組織中のＰＥＸ発現
に関する半定量性ＰＣＲ分析は、ＰＥＸ転写物を含む全てのサンプル中のＧＡＰ
ＤＨメッセージに関する標準化に従い、以前に記載されたとおりに実施した。
【００２９】 ノーザンブロット分析 全ＲＮＡを腫瘍ＩおよびヒトＳａｏｓ−２骨肉腫細胞からＲＮｅａｓｙ全ＲＮ
Ａキット（キアゲン）を使用して得、そしてオリゴ（ｄＴ）−精製されたポリ（
Ａ）+ＲＮＡをＳａｏｓ−２全ＲＮＡから標準手法を使用して単離した。２０マ
イクログラムの腫瘍Ｉ全ＲＮＡおよび２０μｇのＳａｏｓ−２ポリ（Ａ）+ＲＮ
Ａを１％アガロースゲル上で分画し、そしてナイロン膜（ハイボンドＮ+，アマ
シャム）に転写した。ハイブリダイゼーションは32Ｐ−標識された完全長のヒト
ＰＥＸｃＤＮＡ（３．１ｋｂ）を用いて７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０％ホル
ムアミド、１０％硫酸デキストラン、４Ｘ ＳＳＣ、２ｘデンハルト溶液および
熱変性したサケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）中で実施した。ブロットは０．
１Ｘ ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ内で２０分間５０℃において洗浄し、そしてオー
トラジオグラフィーに４日間供した。
【００３０】 生成物のインビトロ転写、翻訳および分析 プラスミドｐＰＥＸをＮｏｔＩで直鎖状にして、センスＲＮＡ鎖をＴ７ ＲＮ
Ａポリメラーゼを使用して転写した。ウサギ網状赤血球溶解物内の転写反応を［ 3 Ｈ］ロイシン存在したで製造者の推奨に従い（プロメガ）イヌ膵臓ミクロソー
ム膜の存在または不在下で実施した。生成物はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；８％）により分析した。オートラジオグラフィーは以
前に記載されたとおりに、ゲルをＥＮ3ＨＡＮＣＥ（デュポン ＮＥＮ）処理後
に実施した。
【００３１】 ｍｙｃ付随ＰＥＸの生成、ＣＯＳ−７細胞内のトランスフェクション、およびＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４抽出 オリゴヌクレオチドＰＥＸＭｙｃ１をセンスプライマーとして（５‘−TTGGAT
GTCAACGCCTCG−３’配列番号１０、５１９クローン化されたヒトＰＣＲｃＤＮＡ
からデザインされたこのプライマーの５‘末端のヌクレオチド位置である）およ
びオリゴヌクレオチドＰＥＸＭｙｃ２をアンチセンス（５‘−CTACCACAATCTACAG
TTGTTCAGGTCCTCTTCGCTAATCAGCTTTTGTTCCATAGAGTCCATGCCTCTG−３’配列番号１１
）プライマーとして使用して、ＰＥＸｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により、プラスミド
ｐＰＥＸ−ｍｙｃを生成した。後者はヒトｃ−ｍｙｃのタグ配列（下線）および
成熟蛋白質のカルボキシル末端に対応するＰＥＸ配列をコードする（742ＲＧＭ
ＤＳＭＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＮＣＲＬＷ＊）。ＰＣＲ後、増幅された断片を、
ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩによる消化により切り出されてｐＣＤＮＡ３のポリリンカー
領域内の対応する部位に挿入された、ｐＰＣＲＩＩベクターに連結した。インフ
レームの融合蛋白質をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００３２】 １０％胎児子ウシ血清（ＦＣＳ；ギブコ）および抗生物質（ｐｅｎ／ｓｔｒｅ
ｐ）を付加したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｌ−グルタミンと共に
４，５００ｍｇ／Ｌグルコース；ＪＲＨバイオサイエンス、レネクサ、ＫＳ）内
で維持したＣＯＳ−７細胞を３ｘ１０5細胞／ウエルの密度において６−ウエル
のクラスタープレート中でトランスフェクションの２４時間前にプレートした。
細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、そして０．１％ＢＳＡ、およびＤＥＡＥ−デキスト
ラン（ファルマシアＬＫＢ）を含む１ｍｌのＤＭＥＭを含む２μｇのｐＰＥＸ−
ｍｙｃプラスミドＤＮＡと３．５時間３７℃においてインキュベートした。イン
キュベーション後、トランスフェクション培地を吸引し、細胞をＰＢＳ中の１０
％ＤＭＳＯ中で２分間ショックを与え、そして次に１０％子ウシ血清を含むＤＭ
ＥＭ中で３７℃において４８時間培養した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４抽出は記
載されたとおりに、ｍｙｃ−付随ＰＥＸを発現する培養細胞上で実施した。サン
プルを次に９Ｅ１０抗−ｍｙｃモノクローナル抗体を使用した免疫ブロッティン
グにより分析した。
【００３３】 Ａ２９３細胞の安定なトランスフェクションおよび免役蛍光 １０％ＦＣＳを伴うＤＭＥＭ中で保持されたＡ２９３細胞をＧ４１８を用いて
開始したエレクトロポレーションおよび選択によりｐＰＥＸ−ｍｙｃプラスミド
でトランスフェクトした（６００ｍｇ／ｍｌで１４日間、そして次に４００ｍｇ
／ｍｌに低下させた）。安定にトランスフェクトした細胞の集団を選択期間の最
後に回収した。ｍｙｃ―付随ＰＥＸ間接免役蛍光のため、ゼラチンをコートした
カバースリップ上にプレートした安定にトランスフェクトした細胞を２回ＰＢＳ
で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そしていくつかの実験におい
ては０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過性にした。細胞をＤＭＥＭ中の１
０％ＦＣＳで３０分間ブロックし、洗浄しそして１時間３７℃において９Ｅ１０
抗−ｍｙｃモノクローナル抗体（１：５００希釈）とインキュベートした。次に
、細胞を洗浄し、そして今度はフルオレセインコンジュゲートヒツジ抗−マウス
二次抗体（１：２５０希釈）とインキュベートした。カバースリップをＰＢＳで
大規模に洗浄し、２．５％の１，４−ジアザバイシクロ−（２，２，２）オクタ
ン（シグマ）を含む培地（グリセロール：Ｔｒｉｓ；１：１）内に固定して、適
切なフィルターを用いて蛍光顕微鏡により試験した。
【００３４】 膜結合エンドペプチダーゼ活性に関するアッセイ ｐＣＤＮＡ３ベクターのみ、ヒトＮＥＰのｃＤＮＡ（P．Crine、モントリオー
ル大学の寛大な贈与）を含むベクター、またはｐＰＥＸプラスミドで一時的にト
ランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を洗浄して、ＰＢＳ中で破壊した。簡単な遠
心分離後に、細胞沈殿物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４中に再懸濁
して、音波処理により破壊した。ホモジェネートを１，０００ｘｇ１０分間およ
び次の１００，０００ｘｇ６０分間の連続遠心分離により分画した。最終沈殿物
を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で洗浄し、そしてエンドペプチダー
ゼ活性に関してアッセイした。膜画分中の蛋白質の濃度はウシ血清アルブミンを
標準物として用いるブラッドフォードの方法により測定した。
【００３５】 ［Ｄ−Ａｌａ2，Ｌｅｕ5］エンケファリン（５００μＭ）をＣＯＳ細胞膜調製
物（〜６０μｇの蛋白質）と共に１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０中
で３７℃において３０分間インキュベートした（最終体積３０μｌ）。反応は１
００μｌの０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）の添加により停止した。Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙの生成は２１４ｎｍにおいて紫外線検出器セットを用いて逆相ＨＰＬ
Ｃ（ボンドパックＣ−１８逆相カラム、ウオーターズ）を使用して監視した。６
０分の０％Ｂから４０％Ｂへの直線溶剤勾配を流速１．５ｍｌ／分にて用いた（
移動相Ａ＝０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．
１％ＴＦＡ）。Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙをマーカー合成ペプチドを使用した
同時クロマトグラフィーにより同定した。ＰＥＸエンドペプチダーゼ活性を評価
するため、１０μｇのＰＴＨ［１−３８］およびＰＴＨ［１−３４］ペプチド（
ペンシルバニアラボラトリーズ；ベルモント、ＣＡ）を膜調製物に加えた。加水
分解産物のＨＰＬＣ分析のため、０％から５０％の直線溶剤勾配を速度１．５ｍ
ｌ／分において使用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計を特定のペプチド断片
上に実施した。
【００３６】 結果 ヒトＰＥＸｃＤＮＡのクローン化 これらの研究の開始に際して、白血球および胎児脳においてのみわずかな量の
ＰＥＸ発現が報告された。我々は、低リン酸塩血症の状態において、ＰＥＸ発現
が増加し、よって顕著に多くのＰＥＸを発現するかもしれない組織源としてＯＨ
Ｏ腫瘍を使用するために選択されるかもしれないことを予測した。ＯＨＯに関連
した２つの腫瘍から得られた組織を使用して全ＲＮＡを得て、そしてＰＥＸｍＲ
ＮＡ発現に関する分析をＲＴ−ＰＣＲにより評価した。図１に示すとおり、ＰＥ
Ｘ転写物を両腫瘍サンプルから素早く増幅したところ、公表された（The HYP Co
nsortium（1995）Nature Genetics 11，130-136）一部のヒトＰＥＸ配列から予
測された、期待された５０９ｂｐの断片を示した。ＯＨＯに関連した２つの腫瘍
から抽出された全ＲＮＡを逆転写し、そして公表されたヒト配列からデザインさ
れたヒトＰＥＸ−特異的プライマー、ＰＥＸ−１およびＰＥＸ−２を使用して増
幅した。期待された５０９ｂｐの増幅断片が両腫瘍サンプルから得られた。対照
、ｃＤＮＡを増幅反応物に加えなかった、即ち陰性対照；マーカー、ＨａｅＩＩ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼにより消化したФ１７４ＤＮＡ。
【００３７】 ＰＥＸ転写物の３‘末端のクローン化はｃＤＮＡの３’末端の迅速な増幅によ
り実施し（３‘ＲＡＣＥ）、一方ｃＤＮＡの５’末端は実験手法において記載さ
れたとおりにアンカー化ＰＣＲにより増幅した。図２Ａは、腫瘍組織からクロー
ン化した完全長のヒトＰＥＸｃＤＮＡのヌクレオチドおよび予測されたアミノ酸
配列を示す。腫瘍由来のヒトＰＥＸｃＤＮＡのヌクレオチドおよび演繹されたア
ミノ酸配列（図２Ａ）。ナンバリングはアンカー化ＰＣＲにより決定された５‘
末端ヌクレオチドから始まる。アミノ酸は一文字コードを使用して各コドンの下
に示される。仮想開始コドン／１として演繹されたアミノ酸翻訳と共に示す。予
測された開始ＡＴＧの前の２つの停止コドンは太字タイプである。星印（*）は
インフレームの停止コドンであり、大きな星印（＊）は仮想プレニル化部位を示
す。３’の非翻訳領域内の有力なポリアデニル化シグナルは下線を付す。９つの
有力なＮ−グリコシレーション部位をボックスに入れる。配列はジェンバンク加
盟番号（Ｕ８２９７０）を割り当てられた。
【００３８】 合成ｃＤＮＡはヒトネプリリジン（ＮＥＰ；ＥＣ３．４．２４．１１）との相
同性（３４．２％同一性、７０％類似性）、およびエンドセリン−変換酵素−１
（ＥＣＥ−１；６６％類似性）およびケル抗原（６０％類似性）を含む膜結合性
メタロエンドペプチダーゼファミリーの他のメンバーとの相同性を示す７４９ア
ミノ酸の蛋白質をコードする一つの解読枠を明らかにすることから、ＰＥＸは以
前に示唆されたとおり、中性エンドヌクレアーゼのこのファミリーの新規なメン
バーであることが示唆される（The HYP Consortium（1995）Nature Genetics 11
，130-136）。他のメンバーのように、ＰＥＸは８つの有力なＮ−グリコシレー
ション部位と、正確なフォールディング即ち蛋白質の天然のコンフォメーション
に重要かもしれない１０のシステイン残基を有する糖蛋白質であるらしい。
【００３９】 ６０４位のＡＴＧコドンが開始メチオニンとして割り当てられたが、それが３
６および６３塩基対上流の２つのインフレームのＴＧＡ停止コドンが前にあり、
そして脊椎動物の翻訳開始のためのコザックコンセンサス配列に好都合に順応す
るからである。クローン化されたｃＤＮＡは公表された部分配列に加えて予測さ
れたＰＥＸ遺伝子産物の最初の３つおよび最後の１０８のアミノ酸を同定する。
これらの追加のアミノ酸はＮＥＰと共通のＥ642およびＨ710のような残基を含み
、そして蛋白質の活性部位、即ち酵素活性の形成のために必須であるかもしれな
い。我々のｃＤＮＡクローンから予測された３つのアミノ酸残基は公表された部
分的なヒトＰＥＸ配列、Ｄ３６３Ａ（ＧＡＣからＧＣＣに），Ｒ４０３（ＡＧＧ
からＴＧＧに），およびＡ６４１Ｇ（ＧＣＧからＧＧＡに）と異なる。これらの
変化がＰＣＲのエラーにより生じたのではないことを確認するため、ＰＥＸ配列
をＳａｏｓ−２ヒト骨肉腫細胞から増幅し（以下を参照）、そして配列決定した
。さらに、同じ変化がのちにマウスＰＥＸｃＤＮＡにおいて記載されたことから
、公表された部分的なヒトＰＥＸ配列における可能性のあるクローニング人工物
が示唆される。我々のクローン化配列は６０３ヌクレオチドの５‘非翻訳領域お
よび２７６ヌクレオチドの３’非翻訳領域も含み、正規のポリアデニル化シグナ
ルＡＡＴＡＡＡ、ポリ（Ａ）地域の１９ｎｔ上流を含む。ヒトＰＥＸｃＤＮＡと
公表されたマウスのＰＥＸｃＤＮＡ配列は、蛋白質コード領域内（９６％同一）
並びに５‘および３’非コード領域において大きな相同性を共にする。
【００４０】 ヒトＰＥＸ配列のＴＭｐｒｅｄ分析は、該蛋白質が見かけ上のＮ−末端シグナ
ルを有さないが、アミノ酸２１−３９を含む一つの、膜をまたぐらせんドメイン
を有することを予測させる（図２Ｃ）。ＰＥＸ配列のＴＭｐｒｅｄ分析は、アミ
ノ酸２１−３９を包含する一つの、膜をまたぐらせんドメインを有することを示
す（矢じり）。水平軸上の数字はアミノ酸配列を意味する。ＰＥＸとヒトＮＥＰ
ｃＤＮＡの間のアミノ酸相同性（図２Ｂ）。配列比較をＬＡＬＩＧＮプログラム
を使用して実施した。
【００４１】 これは、その膜貫通のトポロジーが２０残基のＮ−末端のサイトプラズムテイ
ルおよび細胞外区画中の触媒ドメインを含むＣ−末端の７００アミノ酸残基を有
するタイプＩＩの細胞膜内の膜蛋白質のものであることを予測する。予期せぬこ
とに、アミノ酸残基746ＣＲＬＷを含むＣＸＸＸボックスモチーフもＰＥＸのカ
ルボキシル末端において同定された。このモチーフは、プレニル化、即ち膜結合
を促進すること、特定の細胞下の膜区画への蛋白質の標的化、蛋白質−蛋白質の
相互作用の促進すること、および蛋白質の機能を制御することを含む、翻訳後の
脂質修飾のための部位として機能するのかもしれない。
【００４２】 ＰＥＸｍＲＮＡの組織発現 我々は、次に、多数の胎児および成人の組織中のＰＥＸ発現を試験し、そして
半定量性ＲＴ−ＰＣＲを使用してＯＨＯ腫瘍ＲＮＡに対して発現レベルを比較し
た（図３）。ヒト組織およびＯＨＯ−関連腫瘍から調製した全ＲＮＡからのＰＥ
Ｘ転写物の定量性ＲＴ−ＰＣＲ増幅。ＧＡＰＤＨレベルに関して前に標準化され
た逆転写されたＲＮＡサンプル内でＰＥＸ産物を定量することにより、ＰＥＸ転
写物に関する相対的な発現レベルを測定した。使用した特異的プライマーは以下
のとおりであった：ＰＥＸに関してはフォワードプライマーはＰＥＸ−４であり
、リバースプライマーはＰＥＸ−５であった；ＧＡＰＤＨに関しては、プライマ
ーは以前に記載されたとおりであった。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上
で電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色した。対照、陰性対照；マーカ
ー、ＨａｅＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化したФ１７４ＤＮＡ。下に
示すのは腫瘍内の物と比較した様々なヒト組織内のＰＣＲ転写物の相対レベルで
ある。
【００４３】 ＰＥＸ転写物は、ヒト胎児頭蓋冠中、および低度に胎児腎臓中および骨格筋に
おいて発現したが、胎児肝臓中には見かけ上発現はなかった。ＰＥＸ発現はヒト
骨芽細胞の骨肉腫細胞系Ｓａｏｓ−２においても観察された。成人組織中におい
てＰＥＸｍＲＮＡは腎臓に観察されたが、肝臓または心内膜心筋には観察されな
かった。最近の研究は、ヒト胎児の骨、骨格筋、および肝臓並びに胎児および成
人の卵巣および肺におけるＰＥＸ発現も報告した（Beck，L．et al．（1997） J
．Clin．Invest．99，1200-1209；Grieff，M．et al．（1997） Biochem．Bioph
ys．Res．Commun．231，635-639）。ＰＥＸ転写物を発現する全ての組織中のＧ
ＡＰＤＨのメッセージに関する標準化後の分析は、骨のＰＥＸ発現が試験された
他の正常な組織におけるよりも２−１０倍高いことを明らかにした。比較におい
て、ＯＨＯ腫瘍ＰＥＸは胎児の頭蓋冠内で観察されたレベルの２倍であったが、
これらの組織中のその相対的な「富裕さ」と一致した。
【００４４】 ノーザンブロット分析 完全長のＰＥＸ転写物のサイズを測定するため、我々は、全ＲＮＡ（利用可能
な組織の定量はポリ（Ａ）+ＲＮＡ抽出物に関して不十分であった）およびポリ
（Ａ）+ＲＮＡをヒトＳａｏｓ−２骨肉腫細胞から単離した。この細胞系を使用
したのは、容易に入手可能であり、且つＰＥＸ配列の好結果の増幅がＲＴ−ＰＣ
Ｒにより達成されたからである（上記）。アリコート（各々２０μｇ）について
、クローン化されたヒトＰＥＸｃＤＮＡをプローブとして使用することによりノ
ーザンブロット分析により試験した。約６．５ｋｂの一つの転写物が、Ｓａｏｓ
−２由来のポリ（Ａ）+サンプルにおいてのみ、３．１ｋｂのクローン化配列の
予測されたサイズに反して、容易に検出された（図４）。Ｓａｏｓ−２細胞から
調製された約２０μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡおよび腫瘍Ｉの組織から調製された
２０μｇの全ＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル上で解析し
、次にナイロン膜上に転写した。放射性標識されたＰＥＸｃＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションの後、ブロットを洗浄して、シグナルをオートラジオグラフィー
により検出した。〜６．５ｋｂの転写物がＳａｏｓ−２のポリ（Ａ）+ＲＮＡを
含むレーンにおいてのみ観察された。〜３．８ｋｂの転写物に相当する追加のバ
ンドの暗示もある。矢印は、２８Ｓ（約４．８ｋｂ）および１８Ｓ（約１．８ｋ
ｂ）の位置を示す。
【００４５】 この発見は、よって、ＰＥＸｃＤＮＡに関する〜４ｋｂの５‘非翻訳領域を予
測し、マウス頭蓋冠内のＰＥＸ発現のノーザンブロット分析からの公表されたデ
ータと一致する（Du，L．et al．（1996） Genomics 36，22-28）。〜３．８ｋ
ｂの可能性のある転写物に相当するあまり輪郭のはっきりしないバンドもＳａｏ
ｓ−２サンプル内で検出されたが、この転写物の性質は不明なままである。腫瘍
ＩおよびＳａｏｓ−２細胞からの全ＲＮＡサンプルのノーザン分析（結果は示さ
ず）はＰＥＸに関する何のシグナルも明らかにしなかったが、以前に記載された
ＰＥＸ転写物の相対的に低い発現レベルに一致する（The HYP Consortium（1995
）Nature Genetics 11，130-136；Beck，L．et al．（1997）J．Clin．Invest．
99，1200-1209；Grieff，M．et al.．（1997）Biochem．Biophys．Res．Commun
．231，635-639）。この発見は、マウス頭蓋冠および培養された骨芽細胞におい
て示されたＰＥＸ発現レベルとは、はっきりと対照をなし（Du，L．et al．（19
96）Genomics 36，22-28）そして組織および種の差異を反映するのかもしれない
。
【００４６】 ＰＥＸｃＤＮＡのインビトロ翻訳 完全長のＰＥＸｃＤＮＡを使用したインビトロ翻訳の研究をウサギ網状赤血球
溶解物細胞不含系において実施した。ミクロソーム膜の不在下で、ＰＥＸｃＤＮ
Ａは〜８６ｋＤの蛋白質に翻訳されたが、クローン化されたｃＤＮＡ配列から予
測されたとおりであった（図５）。プラスミドｐＰＥＸを直鎖状化してセンスＲ
ＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。ＰＥＸｃＤＮＡの翻訳はウサ
ギ網状赤血球溶解物を使用してイヌの膵臓の粗いミクロソームの不在（マイナス
）および存在（プラス）下で実施した。生成物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（１０％）中で電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した
。レーン２の矢じりは完全長のヒトＰＥＸ蛋白質を示す。ミクロソーム膜の添加
は、グリコシル化された生成物を示すらしい高分子量形態の出現をもたらす。
【００４７】 翻訳混合物へのイヌのミクロソーム膜の添加後に、高分子量生成物（〜１００
Ｋｄ）が明らかとなり、予測された配列から演繹された８つの有力なグリコシレ
ーション部位におけるＰＥＸのＮ−グリコシル化と一致する。 ＰＥＸは細胞膜関連蛋白質である 以前の研究は、ＮＥＰ，ＥＣＥ−１およびケル血液型糖蛋白質が細胞膜内の膜
蛋白質であることを確証した。我々は、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４を
用いた抽出および免役蛍光位置測定を使用することにより、ＰＥＸも膜結合蛋白
質であるか否かを試験した。ＰＥＸの同定のため、我々は、ＰＥＸのカルボキシ
ル末端配列をヒトｃ−ｍｙｃタグで修飾した構築物を生成した。ＰＥＸ蛋白質の
あらゆる有力な脂質修飾がとぎれずに前進してよいように、エピトープタグは仮
想ポリアデニル化モチーフのすぐ上流に挿入した。
【００４８】 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４は４℃において水溶液を形成するが、温度を３０−
３７℃に上昇すると疎水性相と水性相に分離する界面活性剤である。この特性は
蛋白質の疎水性の指標として使用されており、細胞膜内の膜蛋白質は界面活性剤
相に独占的に分配されるが、親水性の高い蛋白質は水性相に結合する。ｃ−ｍｙ
ｃエピトープを付加したＰＥＸを一時的に発現するＣＯＳ−７細胞からのＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１１４は、ＰＥＸがほとんど独占的に界面活性剤相に分配されるこ
とを示した（図６Ａ）。プラスミドｐＰＥＸ−ｍｙｃを一時的にＣＯＳ−７細胞
にトランスフェクトし、そして４８時間後に細胞をＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４に
より抽出した。全部細胞抽出物、並びに界面活性剤相および水相をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分析して、抗ｍｙｃ−モノクローナル抗体で免役ブロットした。右マ
ージンはＭｒ ｘ １０-3を示す。
【００４９】 この発見は、ＰＥＸが膜結合蛋白質であり、且つ細胞膜内の膜蛋白質であると
の配列分析の予測と一致することを示す。 ＰＥＸの細胞下の局在を決定するため、安定にトランスフェクトされたＡ２９
３細胞中で発現された組換え蛋白質の分配を免疫蛍光を使用して試験した。細胞
を固定して透過性にしたとき、ｍｙｃ付随ＰＥＸの免疫染色は主に細胞表面上に
検出されたが、多くの細胞においても染色が細胞内で観察され、但し核内にシグ
ナルは観察されなかった（図６Ｂ）。透過化を省くと、染色は独占的にプラズマ
膜に局在され（図６Ｃ）、一方、未トランスフェクトの細胞またはベクターのみ
をトランスフェクトした細胞は免疫蛍光染色を示さなかった。それぞれＴｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００による透過化をした場合（図６Ｂ）としない場合（図６Ｃ）の
安定に一時的にトランスフェクトしたＡ２９３細胞内の間接免役蛍光を使用した
ＰＥＸの位置測定。染色は９Ｅ１０抗−ｍｙｃモノクローナル抗体、次にフルオ
レセイン−標識された二次（ヒツジ抗−マウス）抗体を使用して実施した。矢じ
りは細胞内（Ｂ）およびプラズマ膜染色（Ｃ）を示す。
【００５０】 ｍｙｃ−タグはＰＥＸのカルボキシル末端に挿入されたので、これらの発見は
さらに、ＰＥＸが、細胞外区画中に活性酵素部位を含むその大きなＣ−末端疎水
性ドメインを伴うタイプＩＩの必細胞膜内の膜蛋白質であるとの、配列に基づく
予測と一致する。
【００５１】 組換えＰＥＸ蛋白質はエンドペプチダーゼ活性を有する ＰＥＸとＮＥＰの間の細胞下の局在および配列類似性は、ＰＥＸが膜結合メタ
ロペプチダーゼとして機能することを強く示唆する。しかしながら、ペプチダー
ゼ活性がＰＥＸに帰したことはまだない。図７Ａに示されるとおり、ＮＥＰ活性
に関するアッセイに使用される［Ｄ−Ａｌａ2，Ｌｅｕ5］エンケファリンを、ベ
クターをトランスフェクトされたＣＯＳ細胞または等量の組換えヒトＮＥＰまた
はＰＥＸ蛋白質を発現するＣＯＳ細胞からの膜調製物とインキュベートした場合
、ウエスタンブロット分析による測定によれば、基質からのＴｙｒ−Ｄ−Ａｌａ
−Ｇｌｙの生成はＮＥＰ−発現膜調製物においてのみ明らかであった。ベクター
をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞（図７Ａ）またはヒトＮＥＰを一時的に
発現する細胞（図７Ｂ）、またはヒトＰＥＸｃＤＮＡ（図７Ｃ）からの細胞膜調
製物を［Ｄ−Ａｌａ2，Ｌｅｕ5］エンケファリン（５００μＭ）存在下でインキ
ュベートし、そして加水分解生成物を実験手法のセクションにおいて記載したと
おりに解析した。Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙは合成マーカーペプチドのクロマ
トグラフィーにより同定した。
【００５２】 ＰＥＸ配列はＮＥＰの触媒活性に必須の残基の２つを保存するが（Ｅ646およ
びＨ711と均等）、それはＮＥＰのジペプチジルカルボキシペプチダーゼに必須
であることが示されたＲ102に均等な残基を欠く。よって、ＮＥＰとは異なり、
ＰＥＸはジペプチジルカルボキシペプチダーゼ活性を有さない。
【００５３】 組換えヒトＰＥＸのエンドペプチダーゼ活性に関して試験するため、該蛋白質
を一時的に発現するＣＯＳ細胞からの細胞膜調製物を、ヒト副甲状腺ホルモンＰ
ＴＨ［１−３４］およびＰＴＨ［１−３８］とインキュベートし、そして図８に
示されるとおり、分解産物を逆相高圧力液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
より分析した。ヒトＰＴＨ［１−３８］をベクターでトランスフェクトしたＣＯ
Ｓ−７細胞（図８Ａ）またはヒトＰＥＸを一時的に発現する細胞からの細胞膜調
製物とインキュベートし、そして加水分解生成物をＨＰＬＣにより解析した（図
８Ｂ）。ヒトＰＥＸを一時的に発現する細胞からの細胞膜とインキュベートした
場合のＰＴＨ［１−３４］の加水分解により生じた生成物のクロマトグラフィー
プロフィール（図８Ｃ）。６３０の分子量を有する新規な生成物はヒトＰＴＨ［
１−３４］の末端のペンタペプチドＤＶＨＮＦに相当するらしい。
【００５４】 ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞からの平行調製物は認め得るほど
ＰＴＨ［１−３８］を分解しなかった。しかしながら、ＰＥＸの存在下では、両
ペプチドは、２１４ｎｍにおいて吸収するいくつかのピークの形成をもたらす高
い再現パターンにて加水分解された。２つの生成物のピークから回収されたペプ
チド物質の質量分光測定は、それぞれ８６１および６３０のｍ／ｚ値を与えた。
前者の生成物はＰＴＨ［１−３８］およびＰＴＨ［１−３４］両方の加水分解物
の中に存在したが、後者の生成物はＰＴＨ［１−３４］加水分解物中においての
み同定され、ヒトＰＴＨ［１−３４］のカルボキシル末端ペンタペプチドＤＶＨ
ＮＦに相当するらしい。これらの発見は、組換えＰＥＸがエンドペプチダーゼ活
性をもつことの最初の直接の証拠を提供し、そしてその基質特異性が仮想ホスフ
ァトニンに限定されないかもしれないが、他の循環ホルモンまたはおそらく腎臓
のリン酸塩処理を制御する骨由来の自己伸縮性（autocrine）／両伸縮性（parac
rine）制御因子を含むかもしれないことを示唆する。
【００５５】 考察 正常な生理におけるＰＥＸの役割に対しての洞察を得るため、我々は、ヒト完
全長のｃＤＮＡをクローン化してその組織発現、細胞下の位置測定、およびペプ
チダーゼ活性を研究した。その演繹されたアミノ酸配列が公表された一部（The
HYP Consortium(1995) Nature Genetics 11，130-136）およびより最近報告され
た完全長の配列（Beck，L．et al．（1997） J．Clin．Invest．99，1200-1209
；Grieff，M．et al．（1997） Biochem．Biophys．Res．Commun．231，635-639
；Guo，R．and Qurrles，L．D．（1997） J．Bone Miner．Res．12，1009-1017
）と同一である蛋白質を、クローン化されたヒトＰＥＸｃＤＮＡはコードする。
その膜貫通のトポロジーは、タイプＩＩの細胞膜内の膜蛋白質のものであり、そ
して本研究において、我々はこの予測を支持する実験的な証拠を提供した。我々
は、イヌのミクロソーム膜の存在下においてＰＥＸがグリコシル化され、そして
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４による抽出後の界面活性剤相において独占的に分配さ
れることを示したが、それが細胞膜内の膜糖蛋白質であるとの配列分析からの予
測と一致する。にも拘らず、ＰＥＸの観察された疎水性の性質はそれを単独で細
胞膜内の膜蛋白質とすることを要求しない。親油性修飾は細胞膜結合を引き起こ
すことが知られているが、おそらくは修飾基と脂質二重層との疎水性相互作用に
よる。Ｃ−末端テトラペプチドＣＲＬＷモチーフによるシグナル化により、シス
テイン残基へのチオエーテル結合を通したイソプレノイド類の翻訳後の結合は効
果的な膜結合を促進するのに十分なはずである。ＰＥＸのそのような脂質修飾が
実際に起こることを決定するためにはさらなる研究が必要になる。興味を引くの
は、しかしながら、このモチーフ内のナンセンスの変異（Ｒ７４７停止）がＨＹ
Ｐと共に分離し、そして不活性なＰＥＸ遺伝子産物に結合するかもしれないと報
告されたことである。最後に、Ａ２９３細胞中で発現されるＰＥＸの位置決定も
、該蛋白質が膜結合性であることと一致し、そしてＰＥＸが細胞外区画中にその
大きなＣ−末端親水性ドメインを有するタイプＩＩの細胞膜内の膜蛋白質である
ことを確証する。蛋白質のに発現はほとんど細胞表面上に検出されるが、いくつ
かの細胞においては、シグナルも細胞内に局在する。発現された蛋白質のこの局
在は、ＰＥＸ活性の一部が膜結合区画、おそらくはゴルジ体膜に局在することを
示すはずである。培養された内皮細胞中のＥＣＥ−１活性に関して記載されたゴ
ルジ体局在は、大きなエンドセリン−１の効果的な変換を促進することを提案す
るが、構成的な分泌経路を通した酵素および基質の同時局在および濃度のためで
ある。平行様式において、ＰＥＸ酵素はその仮想基質の細胞内および細胞表面の
変換の両方を媒介することが可能である。
【００５６】 野生型ＰＥＸ転写物がＯＨＯ腫瘍内において相対的に過剰な富裕さで発現され
るとの発見は、これらの疾患の病理生理学を理解するための試みにおいて疑問を
提出する。即ち、ＯＨＯにおけるＰＥＸの過剰発現およびＨＹＰ患者における機
能の損失が共にリン酸塩のホメオスタシスにおいて類似の撹乱を導くとの見かけ
上全く比較できない観察を我々が如何に承諾させるのであろうか？ＰＥＸの生理
学上の機能の一つは、腎臓のリン酸塩排泄を通常は促進する因子の不活性化であ
るかもしれない（図９）。ダイアグラムは、近位の腎臓尿細管のレベルにおいて
起こることが提案された事象を示す。仮想上の循環するリン酸塩尿症ホルモン（
ＰＨａ）は、その腎臓の受容体（ＰＲ）と相互作用し、そして腎臓刷子縁膜（−
｜）を越えてＮａＰｉ活性を低下させることによりリン酸塩再吸着を阻害する。
下向きの矢印はリン酸塩排泄の程度を示す。腎臓外の組織において支配的に発現
されるＰＥＸはそれをその不活性形態（ＰＨｉ）に変換することによりＰＨａを
循環させるレベルを変調する。
【００５７】 ＯＨＯの患者においては、この症候群を特徴付ける過リン酸塩尿症は腫瘍によ
るリン酸塩尿因子の制御されない過剰な合成の結果である。我々がこれらの腫瘍
において証明した適度に上昇したＰＥＸレベルは重度の低リン酸塩血に対する応
答または活性なリン酸塩尿因子の異常な高いレベルに対する応答のいずれかによ
り上昇するかもしれない。さらに、増加したＰＥＸ発現は増加した基質負荷に合
わせるのに十分ではないかもしれず、活性なリン酸塩尿ホルモンの異常に高い循
環レベルをもたらす。ＨＹＰ患者において観察されたＰＥＸの不活性化はこの体
液性リン酸塩尿因子の低下した代謝回転を同様に引き起こすはずであり、そして
それにより腎臓のリン酸塩浪費を導く。
【００５８】 このモデルは、Ｈｙｐ表現型が正常マウスおよびＨｙｐマウスの腎臓の交雑移
植後に訂正も移動もされなかったとの観察とも一致する。即ち、Ｈｙｐマウスを
正常な腎臓にグラフトすると、リン酸塩尿が結果として起こるが、リン酸塩尿因
子の循環レベルが過剰だからである。一方、正常マウス内の変異体腎臓のグラフ
トはレシピエントの腎臓尿細管のリン酸塩処理に影響しないが、リン酸塩尿物質
の循環レベルが腎臓外の野生型ＰＥＸの酵素活性により正常に制御されることに
なるからである。事実、ＲＴ−ＰＣＲによるＰＥＸｍＲＮＡの組織の分配の分析
は腎臓外組織内、特に骨での発現を確認した。骨芽細胞の系列の細胞において高
いレベルのＰＥＸ発現を示す我々の現在の発見および他の発見（Du，L．et al．
（1996）Genomics 36，22*-28；Beck，L．et al．（1997） J．Clin．Invest．9
9，1200-1209；Grieff，M．et al.．（1997）Biochem．Biophys．Res．Commun．
231，635-639；Guo，R．and Quarles，L．D．（1997）J．Bone Miner．Res．12
，1009-1017）は、ＨＹＰ患者およびＨｙｐマウス中に存在することが提案され
た本質的な骨芽細胞の欠損と一致するはずである。
【００５９】 最後に、ＰＥＸの予測された構造はそれがメタロプロテアーゼであることを明
確に示唆するが、ペプチダーゼ活性は該蛋白質に帰さなかった。触媒性グルタミ
ン酸およびヒスチジン残基の保存（ＮＥＰのＥ646およびＨ711と均等；図２Ｂ）
がそのような活性に関して立証するはずである。さらに、ＮＥＰにおいてプロテ
アーゼ活性に必要な領域と一直線に並べたＨＹＰ患者における広範囲のＰＥＸ変
異は、ＰＥＸもプロテアーゼとして機能するこを示唆する。ここで、初めて、我
々は組換えＰＥＸが事実エンドペプチダーゼとして機能するとの実験的証拠を提
供する。ＮＥＰとは異なり、しかしながら、該蛋白質はジペプチジルカルボキシ
ペプチダーゼ活性をもたないが、ＮＥＰのＲ102と均等な残基を欠くからである
。ＰＥＸが効果的にＰＴＨを分解するとの我々の予測されなかった観察は、循環
するＰＴＨが仮想ホスファトニンであるか否かの疑問を生じさせる。いくつかの
ＯＨＯ腫瘍からの抽出物が腎臓のアデニレートシクラーゼを刺激することが報告
され、そしてこの活性はがＰＴＨアンタゴニストにより阻害されたが、ほとんど
の研究は、ＯＨＯ−関連腫瘍中のＰＴＨおよびＰＴＨ−関連ペプチダーゼ（ＰＴ
ＨｒＰ）の活性を除外してきた。さらに、カルシウムのホメオスタシスはＨＹＰ
の患者において通常は保存されている。よって、該酵素はその基質特異性におい
てより不規則であるらしい。ＰＥＸは、事実、ＰＴＨの生物学上の利用可能性お
よび生物活性を、特に骨芽細胞レベルにおいて、並びにリン酸塩再吸着および骨
芽成熟および鉱化を制御することに関与する骨芽細胞により生産される因子のホ
ルモン性および／または自己伸縮性（autocrine）／両伸縮性（paracrine）作用
を変調するかもしれない。これらの問題の多くを明らかにするためにはさらなる
研究が必要であるが、完全長のヒトＰＥＸｃＤＮＡの利用可能性は、今、ＰＥＸ
に生物学を研究し、その基質を同定し、制御異常になったリン酸塩ホメオスタシ
スにより特徴付けされる病理状態におけるその役割を解明し、そして代謝性骨疾
患の治療における治療上の介入のための標的としてのその適合性を決定する機会
を我々に提供する。
【００６０】 本発明はその特定の態様に関連して記載されたきたが、さらなる修飾が可能で
あり、そして本出願が一般に以下、本発明の原理であって発明が属する技術分野
内での公知または慣習上の実行の範囲内に相当し、そして前記の本質的な特徴に
適合させてよいものとして、および請求の範囲の範囲に従うものとして、本開示
からのそのような逸脱を含む原理に従いあらゆる変更、使用、または適合を包含
するように意図されることは理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＯＨＯ腫瘍内のＰＥＸのｍＲＮＡ発現を示す。
【図２】 図２Ａは、ＯＨＯ腫瘍からクローン化されたヒトＰＥＸのｃＤＮＡを示す（配
列番号１−２）。図２Ｂは、ヒトＰＥＸとヒトＮＥＰ蛋白質のアラインメントを
示す（配列番号３−４）。
【図３】 図３は、ヒト組織中のＰＥＸ発現を示す。
【図４】 図４は、ＰＥＸのｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。
【図５】 図５は、ヒトＰＥＸのｃＤＮＡのインビトロ転写を示す。
【図６】 図６Ａ−６Ｂは、ＰＥＸのＴＲＩＴＯＮTMＸ−１１４抽出および免疫蛍光位置
測定を示す。
【図７】 図７Ａ−７Ｃは、［Ａ−Ａｌａ2，Ｌｅｕ5］エンケファリンの加水分解のＨＰ
ＬＣ分析を示す。
【図８】 図８Ａ−８Ｃは、ＰＥＸエンドペプチダーゼ活性によるＰＴＨ−由来のペプチ
ドの加水分解を示す。
【図９】 図９は、正常、ＯＨＯ、およびＨＹＰ状態の近位の腎臓尿細管で処理されるリ
ン酸塩の概略描写を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リップマン，マーク・エル カナダ国ケベック エイチ３アール ２エ ル４，タウン・オブ・マウント・ローヤ ル，フルトン・ロード 2258 (72)発明者 ヘンダーソン，ジャネット・イー カナダ国ケベック エイチ４エックス １ ヴイ７，モントリオール・ウエスト，ウー スリー 70 Ｆターム(参考） 2G045 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA56 FA16 FB02 FB03 FB06 FB07 GC15 JA20 4B024 AA01 BA14 CA04 CA12 DA02 EA04 FA02 GA11 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ08 QQ36 QR48 QR51 QX01 4B065 AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA03 CA33 CA44 4C084 AA17 NA14 ZA96 ZA97

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者の代謝性骨疾患を診断する方法であって、患者の生物学上の
    サンプル内のＰＴＨｒＰレベルを測定する工程を含み、但し、正常な個体からの
    ＰＴＨｒＰレベルとの違いが代謝性骨疾患および／または代謝性骨疾患の素因の
    指標である、上記方法。
  2. 【請求項２】 代謝性骨疾患が骨軟化症、骨粗鬆症、大理石骨病またはパジェッ
    ト病である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ＰＥＸ酵素活性の変調のための化合物を患者に投与することを含
    む、代謝性骨疾患の治療方法。
  4. 【請求項４】 代謝性骨疾患が骨軟化症、骨粗鬆症、大理石骨病またはパジェッ
    ト病である、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 代謝性骨疾患の治療用薬剤の製造のための、ＰＥＸ酵素活性の変
    調のための化合物の使用。
  6. 【請求項６】 代謝性骨疾患が骨軟化症、骨粗鬆症、大理石骨病またはパジェッ
    ト病である、請求項５記載の使用。
  7. 【請求項７】 患者の骨芽細胞活性を変調するＰＴＨおよびＰＴＨｒＰレベルを
    変調して骨の分解および骨の形成を変調することからなる、代謝性骨疾患の治療
    方法。
  8. 【請求項８】 代謝性骨疾患が骨軟化症、骨粗鬆症、大理石骨病またはパジェッ
    ト病である、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 代謝性骨疾患の治療のための骨芽細胞の活性を制御するＰＴＨお
    よびＰＴＨｒＰのレベルを変調する使用。
  10. 【請求項１０】 代謝性骨疾患が骨軟化症、骨粗鬆症、大理石骨病またはパジェ
    ット病である、請求項９記載の使用。
  11. 【請求項１１】 その微生物細胞および体細胞がプロ−ａｌ（Ｉ）コラーゲン遺
    伝子の近位プロモーターの制御下の組換えＰＥＸ遺伝子配列から本質的になるＰ
    ＥＸ遺伝子構築物を含み、但し、該ＰＥＸ遺伝子構築物は哺乳類、または哺乳類
    の先祖に対してまたは胚のステージにおいて導入される、骨の分化およびホメオ
    スタシスにおけるＰＥＸの役割を研究するための非ヒトトランスジェニック哺乳
    類。
  12. 【請求項１２】 マウスであって、近位のプロモーターがマウスのプロ−ａｌ（
    Ｉ）コラーゲン遺伝子である、請求項１１記載の非ヒト哺乳類。
  13. 【請求項１３】 マウスのプロ−ａｌ（Ｉ）コラーゲン遺伝子がその２．３ｋｂ
    の断片である、請求項１２記載の非ヒト哺乳類。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007533669A (ja) * 2004-04-21 2007-11-22 エノビア ファーマ インコーポレイティド 骨送達複合体ならびにタンパク質に骨を標的化させるためのその使用方法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1293568A4 (en) * 2000-06-21 2005-10-26 Takeda Pharmaceutical PROTEIN AND ITS DNA
EP1531855A4 (en) 2002-01-10 2009-07-22 Osteotrophin Llc TREATMENT OF BONE DISEASES WITH SKELETTAL ANABOLIKA
EP1511857B1 (en) * 2002-05-31 2007-12-12 McGill University Pthrp-based prediction and diagnosis of bone disease
AU2005244734A1 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Alza Corporation Apparatus and method for transdermal delivery of parathyroid hormone agents
US20070081984A1 (en) 2005-10-11 2007-04-12 Shunji Tomatsu Compositions and methods for treating hypophosphatasia
US20080171319A1 (en) * 2006-02-06 2008-07-17 Mickey Urdea Osteoporosis associated markers and methods of use thereof
JP2010540534A (ja) 2007-09-28 2010-12-24 イントレキソン コーポレーション 生体治療分子の発現のための治療遺伝子スイッチ構築物およびバイオリアクター、ならびにその使用
JP5986986B2 (ja) 2010-04-30 2016-09-06 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 基質石灰化障害を治療する方法、組成物、およびキット
EP2658979B1 (en) 2010-12-27 2018-02-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
US10449236B2 (en) 2014-12-05 2019-10-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
US10603361B2 (en) 2015-01-28 2020-03-31 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
RU2745528C2 (ru) 2015-08-17 2021-03-26 Алексион Фармасьютикалз, Инк. Производство щелочных фосфатаз
WO2017058822A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Identifying effective dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (tnsalp)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
EP3368062A4 (en) 2015-10-30 2019-07-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING CRANIOSYNOSTOSIS IN A PATIENT
WO2017155569A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
EP3436020A4 (en) 2016-04-01 2019-12-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING HYPOPHOSPHATASIE IN TEENS AND ADULTS
KR20220162816A (ko) 2016-04-01 2022-12-08 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 알칼리성 포스파타아제로 근육 약화의 치료
WO2017214130A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases
JP7018933B2 (ja) 2016-08-18 2022-02-14 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 気管気管支軟化症の治療方法
MX2019011508A (es) 2017-03-31 2019-11-01 Alexion Pharma Inc Metodos para tratar la hipofosfatasia (hpp) en adultos y adolescentes.
US11913039B2 (en) 2018-03-30 2024-02-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for producing recombinant alkaline phosphatase

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996019246A1 (en) 1994-12-19 1996-06-27 Beth Israel Hospital Association Continuous low-dose administration of parathyroid hormone or its agonist
AU726659B2 (en) 1996-04-09 2000-11-16 Nps Pharmaceuticals, Inc. Calcilytic compounds
NL1003941C2 (nl) 1996-09-02 1998-03-11 Vialle Bv Brandstofinspuitinrichting voor een inwendige verbrandingsmotor.
AU4107397A (en) * 1996-09-05 1998-03-26 David Goltzman Cloning of full-length human pex cdna
RU2224539C2 (ru) * 1997-09-09 2004-02-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Заживление переломов с помощью аналогов пептида, подобного паратироидному гормону (ртнrр)
JP2005505351A (ja) * 2001-10-12 2005-02-24 オステオテック インコーポレーテッド 改善された骨移植片

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007533669A (ja) * 2004-04-21 2007-11-22 エノビア ファーマ インコーポレイティド 骨送達複合体ならびにタンパク質に骨を標的化させるためのその使用方法
JP4874954B2 (ja) * 2004-04-21 2012-02-15 エノビア ファーマ インコーポレイティド 骨送達複合体ならびにタンパク質に骨を標的化させるためのその使用方法

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