JP2002524723A - パラクリンの尿細管レニン−アンジオテンシン系に基づく薬物スクリーニングおよび診断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、本発明によって同定される尿細管のレニン−アンジオテンシノーゲン系を用いて、高血圧症を治療するのに用いる薬物をスクリーニングする方法に関する。さらに、本発明は、尿中のアンジオテンシノーゲンまたはアンジオテンシン−Ｉを測定することによって、個体のナトリウム状態および感受性を診断する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、メリーランド州ベセズダの国立衛生研究所によって授与されたグラ
ント番号ＨＬ４５３２５のもと政府援助でなされた。合衆国政府は、本発明にお
いてある種の権利を有する。

【０００２】発明の背景 本発明は、本発明によって特定される尿細管のレニン−アンジオテンシノーゲ
ン系を用いて、高血圧症を治療するのに用いる薬物をスクリーニングするための
方法に関する。さらに、本発明は、尿中のアンジオテンシノーゲン、アンジオテ
ンシン−Ｉ、デス−ＡＩ−アンジオテンシノーゲンまたはレニンを測定すること
によって、個体のナトリウム状態を診断するための方法に関する。

【０００３】 本発明の背景および特に、実施に関するさらなる詳細を供するような場合を示
すために、本明細書に用いた刊行物および他の資料を出典明示して本明細書の一
部とみなし、便宜上、著者および日付によって下記の本文に引用し、参考文献の
補足リストに著者によりアルファベット順にリストされる。

【０００４】 以下の略語が本明細書で用いられる：Ａ−Ｉ−アンジオテンシン−Ｉ；Ａ−Ｉ
Ｉ−アンジオテンシン−ＩＩ；ＡＣＥ−アンジオテンシン変換酵素；ＡＧＴ−ア
ンジオテンシノーゲン遺伝子；ＡＮＧまたはＡｎｇ−アンジオテンシノーゲン蛋
白質；−６（Ａ）／−６（Ｇ）−６位でのプロモーター多型；ＣＣＤ−皮質集合
管；ＣＮＴ−皮質連結細管；ＤＣＴ−遠位曲尿細管；ＩＣ−介在細胞；ＪＧＡ−
旁糸球体装置；ＰＣＲ−ポリメラーゼ鎖反応；ＲＡＳ−レニン−アンジオテンシ
ン系；ＲＴ−ＰＣＲ−逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応；およびＨＰＬＣ−高圧液
体クロマトグラフィー。

【０００５】 血圧制御は、流体容積バランス（fluid volume balance）および電解質恒常性
と本質的に関連する。食事ナトリウムの変動に応じた血漿量の調節（１）はレニ
ン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）およびその主要なエフェクターであるアンジ
オテンシン−ＩＩ（Ａ−ＩＩ）によってまず制御され；このペプチド・ホルモン
は、レニンおよびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を含めた２つの切断工程
によってアンジオテンシノーゲン（Ａｎｇ）から遊離される（２）。

【０００６】 Ａ−ＩＩの短期効果は、その長期効果より良好に理解されている。体液容量の
急性涸渇は、腎臓内の旁糸球体装置（ＪＧＡ）によって分泌されるレニン、肝臓
からのＡｎｇ、および毛細血管内皮の管腔細胞膜に存在するＡＣＥを含めた、循
環性レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）によって媒介される血管収縮応答を
トリガーする。

【０００７】 Ａ−ＩＩの持続性低用量注入は、直接的な腎臓内Ａ−ＩＩ効果によって主とし
て媒介された累積的なナトリウム保持のために、動脈圧の進行性の長期上昇に導
く^１。Ａ−ＩＩは、高濃度にて近位尿細管管腔液中で検出された（３、４）。血
漿レニン（３６−４０ｋＤａ）とは対照的に、Ａｎｇ（６１−６５ｋＤａ）は糸
球体の基底膜を通して濾過されない。近位尿細管上皮における豊富なアンジオテ
ンシノーゲンｍＲＮＡの検出（５−７）は、依然として特定されない機構によっ
てこの部位でのＡ−ＩＩの局所的生成を強く示唆する。レニンｍＲＮＡは、非常
に感度のよい技術のＲＴ−ＰＣＲ（８）の適用によってのみ近位尿細管中で検出
できる。外来性のＡ−ＩＩは、近位尿細管細胞に存在する管腔のナトリウム水素
交換体を刺激し（９、１０）、ネフロンの遠位セグメントにおいて上皮のナトリ
ウム・チャンネル、および恐らくは他の輸送体をさらに刺激する（１１−１４）
。

【０００８】 しかしながら、基本的な疑問には回答がないままである。腎臓内Ａ−ＩＩがナ
トリウム再吸収に直接的に影響するならば、どこで生成し、如何なる機構による
のか？。この機構は、どのようにナトリウムに応じて調節されるのか？。Ａ−Ｉ
Ｉは、ネフロンに沿ったナトリウム輸送に対してどの部位にて影響を与えるのか
？。ネフロンの近位および遠位のセグメントにおけるナトリウム取り込みの統合
された調節についての機構は何か？。それは遠位尿細管におけるナトリウム再吸
収およびカリウム排泄の分断を可能とするのか？。

【０００９】 こららの疑問に取り組み、また、薬物をスクリーニングし、個体のナトリウム
状態を診断するのに用いることができる解決策を解明することが望ましい。

【００１０】発明の要約 本発明により、分極した単層として培養された近位尿細管細胞がその頂上側に
てＡｎｇを分泌し、Ａｎｇが最終尿中で測定できるように無傷のネフロンを通じ
て通過することが示されている。さらに、濾過されるに加えて、レニンがネフロ
ンの特定のセグメントである連結細管において発現されることが示されている。
さらに、近位尿細管中のアンジオテンシノーゲン発現および連結セグメント（遠
位弓（distal arcade））中のレニン発現は、食事ナトリウムの逆関数である。

【００１１】 本明細書に示されたデータは、遠位尿細管および集合管の管腔液および頂細胞
膜において従前に示されている（１５、１６）、管腔のアンジオテンシン変換酵
素（ＡＣＥ）およびＡ−ＩＩ受容体と一緒に、濾過されたレニン、近位尿細管に
分泌されたＡｎｇおよび連結細管におけるレニンは、ナトリウム再吸収の制御に
関与する尿細管ＲＡＳを食事の塩の関数として規定する。この尿細管ＲＡＳは、
体液制御および血圧調節に寄与し得る。さらに、アンジオテンシノーゲン遺伝子
の遺伝的な差（１７、１８）は、この尿細管系への衝撃を通じて本態性高血圧症
に対する感受性に影響しかねない。

【００１２】 かくして、本発明は、本発明によって同定された尿細管のレニン−アンジオテ
ンシノーゲン系を用いて、高血圧症を治療するのに用いる薬物をスクリーニング
する方法に関する。さらに、本発明は、尿中のアンジオテンシノーゲン、アンジ
オテンシン−Ｉ、デス−ＡＩ−アンジオテンシノーゲンまたはレニンを測定する
ことによって、個体のナトリウム状態を診断する方法に関する。

【００１３】 尿中排泄されたアンジオテンシノーゲン、その酵素触媒された生成物またはレ
ニンが食事ナトリウムの変化と共に変動することが見出された。かくして、個体
のナトリウム状態は、個体の尿中のアンジオテンシノーゲンまたはその酵素触媒
された生成物もしくはレニンの量を測定し、測定量と正常値とを比較することに
よって診断される。これらの化合物のレベルの上昇の発見は、高ナトリウムを示
す。また、個体のナトリウム感受性は、尿中のこれらの化合物の量を測定するこ
とによって決定できる。これらの化合物のレベルは、従来技術を用いて測定でき
、いずれの適当な方法も使用につき適当である。該レベルが参照値に比較して高
塩食下の個体において上昇するならば、その個体は塩に対して感受性である。

【００１４】 また、アンジオテンシノーゲンおよびレニンの発現が腎臓に沿った特定の部位
で調節されるということが判明した。この発見は、血圧制御の新しい治療標的を
同定し、高血圧症を治療するのに用いる薬物をスクリーニングするための方法に
ついて基礎を提供する。本発明によれば、高血圧症を治療するための候補薬物は
、近位および／または遠位の尿細管にて候補薬物の効果を試験することによって
、尿細管のレニン−アンジオテンシン系を用いてスクリーニングされる。

【００１５】発明の詳細な記載 本発明は、本発明によって同定される尿細管のレニン−アンジオテンシノーゲ
ン系を用いて、高血圧症を治療するのに用いる薬物をスクリーニングする方法に
関する。発明は、さらに、尿中のアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン−
Ｉ、デス−ＡＩ−アンジオテンシノーゲンまたはレニンを測定することによって
個体のナトリウム状態を診断するための方法に関する。

【００１６】ナトリウム感受性の定義 疫学、生理学、病理学および薬物応答は、本態性高血圧症が臨床分野で解決で
きない未知の原因の様々な条件を含むことを示す。重要な生理学的な区別は、ナ
トリウム塩が疾病にかなり寄与するか否かである。支配的な仮説は、過剰な食事
ナトリウムに対する個体の応答において先天的な差があるということであり、こ
の因子は本態性高血圧症の場合のかなりの部分を説明するだろう。このクラスは
、高血圧の発生におけるこの寄与因子の役割を単に強調するために「ナトリウム
感受性」高血圧症と定義できる。

【００１７】 本態性高血圧症の疫学におけるナトリウムの重要性が概して説得力があるが、
ナトリウム消費と血圧との関係は、個体のレベルにて確立するのを困難としてき
た。様々なプロトコ−ルは、ナトリウム消費を過剰とするのに特に弱いであろう
個体を確認するための試みにおいて設計されてきた。典型的な操作には、標準化
されたナトリウム負荷に対する血圧または体重の応答が含まれる。他のアプロー
チは、高ナトリウム食または類似する生理学的操作に曝露された個体におけるア
ンジオテンシン−ＩＩ注入後の腎血流における変化をモニターすることであった
。一般的に、これらのアプローチは、実際にはいくらかの応答または全くないと
いう、かかる操作に対する２つの広範囲なクラスの応答があり、それが「ナトリ
ウム感受性」および「ナトリウム抵抗性」の個体の定義に導くことが確認されて
きた。しかしながら、２群間の重複は非常に大きいままなので、それはいずれか
の群のメンバーとして特定の個体の明白な同定を不可能とする。食事ナトリウム
制限または特定の治療の介在のいずれの効力もこの根本的な因子の同定に非常に
依存するので、この診断の論点は医療実践につき特に悩ませてきた。

【００１８】 次いで、ナトリウム感受性は、血圧または体重のいずれかの増加によって過剰
ナトリウム摂取に応答する個体の傾向を示す。数十年間にわたり知らぬまに進行
し、過剰なナトリウム摂取の有害な結果が最小だが累積的な経時的な摩擦を反映
している本態性高血圧症のごとき慢性疾患の状況において、慢性応答におけるか
かる差が、急性の操作による特徴付けを回避することは全く驚くべきことではな
い。関連する概念は以下に定義されるであろう。

【００１９】 ナトリウム恒常性は、身体が生理的要求の関数としてナトリウムの運命を調節
する全ての機構を包摂する。ナトリウム・バランスは、平均してゼロである、摂
取と排泄との間の正味の差を表す。妊娠またはかなりの血液喪失のごときある種
の状態において、摂取は、容量拡張または再拡張を適応させるために排泄を上回
る。ナトリウム・バランスとほとんど同義であるナトリウム状態を一般的に用い
て、食事ナトリウム状態、いわゆるナトリウム過剰、正常ナトリウムまたは制限
したナトリウムの摂取を特徴付ける。ナトリウム状態のモニタリングは、前記の
臨床的操作を行う前に重要であり、または食事ナトリウムの制限に対するコンプ
ライアンスをモニターすることに依然として関連する。遺伝的な差がナトリウム
感受性に寄与するならば、高血圧を発生させる遺伝的「傾向」または先天的素因
としてナトリウム感受性を特徴付けることは臨床的関連性で明らかであろう。

【００２０】ナトリウム・バランスの調節における腎臓内Ａ−ＩＩの重要性 アンジオテンシノーゲンとナトリウム恒常性との間で推論された関連性は、そ
の公知の生理的機能に起因している。レニンおよびアンジオテンシン変換酵素（
ＡＣＥ）によって触媒された２工程の酵素的切断を通じてアンジオテンシノーゲ
ン蛋白質（ＡＮＧ）から専ら生成されたアンジオテンシン−ＩＩ（Ａ−ＩＩ）は
、血管の緊張および血液量に対する短期および長期の効果を発揮する、結果的に
、それは血圧の主要な要因となる。発明者らが本明細書において論ずるように、
Ａ−ＩＩの短期効果はその長期効果よりも良好に理解されている。 前者は、全身的なレベルにてＡ−ＩＩの血管収縮効果を反映する。特に、輸入
腎動脈（旁糸球体装置またはＪＧＡという）の特定化されたセグメントによって
生成されたレニンは、肝臓により遊離されたアンジオテンシノーゲンに対して全
身循環において作用して、アンジオテンシン−Ｉ（Ａ−Ｉ）を形成し、続いて毛
細血管においてＡＣＥによってＡ−ＩＩに変換される。次いで、循環性Ａ−ＩＩ
の増加は動脈の収縮を誘導し、それは末梢血管抵抗および脈管系の全てのコンプ
ライアンスを調節する。血液量が涸渇する場合、低下したコンプライアンスの正
味の効果は正常血圧の維持である。血液量が正常である場合、血管抵抗の増加は
動脈圧の増加に導く。

【００２１】 Ａ−ＩＩの長期効果の特徴付けは、はるかに分かり難いことが証明されている
。涸渇後の血液量の再増大は、（水がナトリウムに従うので）腎臓内のナトリウ
ム保持を必要とする。正常条件下にて、食事ナトリウム摂取における変動は、狭
い限界内にベースラインの血圧を維持するような、ナトリウム排泄の代償的調節
に導く。Ａ−ＩＩは、間接的および直接的な腎臓効果の双方を介してナトリウム
保持を促進する支配的なホルモンとして認識されてきている。

【００２２】 Ａ−ＩＩの間接的効果は、Ａ−ＩＩ刺激後に副腎によって遊離される鉱質コル
チコイド（ミネラル代謝に影響するステロイド）であるアルドステロンによって
媒介される。このホルモンは、それがナトリウム再吸収およびカリウム排泄を促
進するネフロンの遠位部分において作用する。大部分の教科書には、ナトリウム
保持の促進におけるアルドステロンの推定された支配性を依然として強調されて
いる。

【００２３】 腎臓におけるＡ−ＩＩの直接的なナトリウム保持効果は、腎臓の恒常性、すな
わち、腎臓の様々な部分を通して血流を調節し、および濾過されたナトリウムの
再吸収を媒介するナトリウム輸送の活性の双方に影響して、複合的であり、かつ
変化する。これらの直接的な効果は、実験標本へのＡ−ＩＩの添加によって主と
して実証され、それ自体、これらの実験はかかる効果を説明するＡ−ＩＩの実際
の起源、作用部位および調節を明確としなかった。

【００２４】 最近２０年間にわたり蓄積された膨大な実験的証拠は、正常な生理的状態にお
いて、アルドステロンが摂取を均衡させるためのナトリウム排泄の調節に適度な
役割を演じるにすぎないことが証明された。むしろ、この機能は腎臓内Ａ−ＩＩ
によって主として媒介される。

【００２５】パラクリンの尿細管レニン−アンジオテンシン系 本明細書に記載された発見の本質は以下の通りである： （１）アンジオテンシノーゲンは、近位尿細管の上皮細胞（このネフロン・セ
グメントの管腔側を覆う細胞）によって尿細管の流体へ分泌される。 （２）この部位でのＡＧＴ発現はナトリウム状態の関数である。 （３）アンジオテンシノーゲン蛋白質は、全ネフロンを通過し、尿中で測定で
き、それは近位尿細管分泌に起因する（循環性アンジオテンシノーゲンはレニン
とは対照的に、糸球体膜を介して濾過されない）。 （４）レニンは遠位ネフロンの主要細胞によって発現され、まさしくその細胞
は、（ナトリウム再吸収のための）ナトリウム・チャンネル、および（アルドス
テロン制御下のカリウム分泌のための）カリウム・チャンネルの双方を発現する
。 （５）また、この部位でのレニン発現は、ナトリウム状態の関数として変化す
る。 （６）アミロリドでの主要な細胞のナトリウム・チャンネルのブロックは、遠
位ネフロンにおけるレニン発現の上昇調節に導き、これはこのチャンネルによっ
て移動されたナトリウムが遠位ネフロンでのレニン発現の調節における重要な検
知機構であることを示している。 （７）遠位ネフロンの活性を反映するＡ−Ｉおよび活性レニンは尿中にて測定
できる。

【００２６】このパラクリン系の提唱された機能 大量のナトリウムは毎日濾過され、その９９％、約１００％が腎臓によって再
吸収される（「ナトリウム・バランス」）。異なる輸送体が、ネフロンの種々の
セグメントに関与し（「ナトリウム輸送体」）、各セグメントにおける活性の協
調は、最終尿中に排泄されたナトリウムの最終量を決定する。近位および遠位の
尿細管の機能を、各々、「バルク（bulk）」および「ファイン（fine）」のナト
リウム再吸収として対比するのが通常である。濾過されたナトリウム、水および
種々の溶質の大部分が、ナトリウム移動によって支配された全体的なプロセスに
よって一緒に再吸収されるバルク相の後、ファイン相は、最終尿の各要素の独立
した微妙な調節を可能とする。近位尿細管におけるアンジオテンシノーゲン発現
は、バルク相への関与を示唆するが、尿中ナトリウムの最終調整における非常に
重要な役割についての機構を供しなかった。

【００２７】 本明細書に記載されたパラクリン系は解決策を示す。それは、レニン−アンジ
オテンシン系が２つのこれらの非常に重要な部位にて機能を統合させることによ
ってナトリウム排泄を調節する機構を明らかとした。その概念は新規であり、診
断的治療研究について広範囲な関連を有する。診断上関連は詳述するが、むしろ
略言すると、本明細書に所与の先の特許請求の範囲および背景を与えるであろう
。 以下の実施例によって示されるごとく、近位尿細管の上皮細胞がアンジオテン
シノーゲンを合成し分泌し、アンジオテンシノーゲンが全ネフロンを通じて循環
し尿中に検出でき、レニンが遠位ネフロンの主要細胞によって発現され、これら
の部位での基質および酵素の発現が食事ナトリウムの変動により影響されること
が判明した。この従前の未確認の尿細管レニン−アンジオテンシン系は本発明の
薬物スクリーニング方法についての基礎を供する。

【００２８】 多数の医薬が開発され、抗高血圧剤として用いられている。それらは、それら
が標的とする作用の原理および生化学的機能の関数として広範囲のサブクラスに
分類できる。前記のごとく、レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）は血圧制御
において基本的に重要である。当該分野において開発された最新の薬物は、少な
くとも３つの方法のうちの１つにおいてこの系に干渉する。レニン阻害剤は高親
和性でもってレニンに結合するアンジオテンシノーゲン切断部位のアナログであ
り、それ自体がアンジオテンシノーゲンと競合する。有効ではあるが、これらの
化合物は、薬物送達における問題のために有用性は限られてきた。カプトプリル
またはリシノプリル（lisinopril）のごときＡＣＥ阻害剤が有効であると分かり
、本態性高血圧症の治療における選択薬物のうちの１つとなった。Ａ−ＩＩ型１
受容体阻害剤（Dupont−Merckからのロザルタン（Losartan））は、Ａ−ＩＩの
生理学的効果に対抗するために開発された最新の薬剤を表わす。Ａ−ＩＩの血行
力学的効果を媒介する主要な受容体に対するその高親和性は、その作用を説明す
る。

【００２９】 ＲＡＳと干渉するように設計された薬物の共通の特徴は、それらが包括的で、
全身的および局所的な効果を有するということである。実際には、これらの薬剤
の開発に先行する研究において、循環性ＲＡＳに帰される顕著な役割を仮定すれ
ば、それらは、薬物開発がこれらの方向に開発されていた時点の知識の状態を反
映する。

【００３０】 ナトリウム・バランスの調節におけるパラクリンの尿細管のＲＡＳの存在およ
び役割に関係する本明細書に記載された新しい結果は、治療介入についての新し
い標的、および化合物をスクリーニングするための方法を示唆し、それらの生物
学的な有効性を確認する。

【００３１】 かくして、本発明は、抗高血圧剤の開発のための新規な標的を同定する。新し
い薬剤は、主として発明者らが近位尿細管にて、または遠位ネフロンにおいての
いずれかに記載したパラクリンの尿細管のＲＡＳの正常機能に干渉するであろう
。化合物は、いずれの部位にも送達され、その生物学的活性が各セグメントの効
を奏する環境下にて最適であるように作成できる。正味の効果は、ナトリウム再
吸収を制御することであり、それ自体がナトリウム感受性であると考えられる対
象における本態性高血圧症の発生を防止するであろう。その薬物は、高血圧患者
のサブセットに最も有効であると証明できる。発明者らがＡＧＴで特許請求した
かかる対象を同定する手段と一緒に、かかる薬物の選択性および特異性は、所与
の薬物を選択し、有効量を決定することの困難性を軽減するであろう。いかなる
所与の薬物も一部の患者にだけ有効で、現在、いずれの所与の患者もいずれの特
別の薬剤によく応答するであろうことを予期する単純な方法はないと認識されて
いる。徴候は、冠状動脈心疾患のごとき関連する明示に基づくが、高血圧症を説
明する機構についての実際の知識には基づかないかもしれない。両方の条件が共
通すると、高血圧症が冠状動脈疾患を説明するものとは異なる因子に依存する実
例があるに違いない。

【００３２】 加えて、スクリーニング方法を用いて、近位または遠位の尿細管のいずれかに
てレニン−アンジオテンシン系を干渉するように設計された化合物の効力を決定
する。これらの化合物の効果は３つのレベル：細胞、組織および無傷の生物体に
てモニターできる。近位尿細管において、薬物に対する細胞の反応はアンジオテ
ンシノーゲン発現および分泌に関して、またはナトリウム−水素交換体および他
のナトリウム依存性輸送体によるナトリウム輸送に関してモニターできる。遠位
尿細管において、標的薬物は、ナトリウム・チャンネルの活性、Ａ−Ｉ受容体の
密度、および主要細胞によるレニンの合成および遊離に影響するであろう。組織
レベルでは、アンジオテンシノーゲンおよびレニンの発現は、マイクロ切開され
たネフロン・セグメント、特にＹ−接合部のＲＴ−ＰＣＲであるｉｎ ｓｉｔｕ
ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学を含めた本明細書に記載されたいずれの方法に
よってもモニターできる。全生物体のレベルにて、化合物の効力は、Ａ−Ｉおよ
びＡ−ＩＩの総アンジオテンシノーゲン、デス−ＡＩ−アンジオテンシノーゲン
および切断されていないアンジオテンシノーゲン、総レニンおよびレニン活性を
含めた尿中のパラクリンＲＡＳのパラメーターを測定することによって調べるこ
とができる。さらに、血圧および血漿量に対するかかる薬剤の効果はモニターで
きる。

【００３３】 以下の実施例によって示されるごとく、尿中に排泄されたアンジオテンシノー
ゲン、その酵素触媒された生成物またはレニンは、食事ナトリウムの変化に応じ
て変わることが判明した。かくして、個体のナトリウム状態は、個体の尿中のア
ンジオテンシノーゲン、その酵素触媒された生成物またはレニンの量を測定し、
測定量と正常値とを比較することによって診断される。尿中のアンジオテンシノ
ーゲンまたはアンジオテンシン−Ｉを検出するいずれの方法も本発明に従って用
いることができる。これらの化合物のレベルの上昇の発見は、高ナトリウムを示
す。これらの化合物のレベルは、従来技術を用いて測定され、いずれの適当な方
法も使用につき適当である。また、個体のナトリウム感受性は、尿中のこれらの
化合物の量を測定することによって決定できる。該レベルが参照値に比較して高
塩食下の個体において上昇したならば、その個体は塩に感受性である。

【００３４】 また、アンジオテンシノーゲンおよびレニンの発現が腎臓に沿った特定の部位
で調節されることが判明した。この発見は、血圧制御の新しい治療標的を同定し
、高血圧症を治療するのに用いる薬物をスクリーニングするための方法について
の基礎を提供する。本発明によれば、高血圧症を治療するための候補薬物は、近
位および／または遠位の尿細管にて候補薬物の効果をテストすることにより尿細
管のレニン−アンジオテンシン系を用いてスクリーニングされる。

【００３５】 アンジオテンシノーゲン遺伝子（ＡＧＴ）における分子変異体は、発明者らが
Ｔ２３５およびＡ（−６）の変異体を用い先に特許請求したように、本態性高血
圧症の発生に個体の素因を反映できる。遺伝的傾向の実際的な明示は、高ナトリ
ウム摂取に対する程度および曝露期間、ならびに重量超過および過剰ストレスの
ごとき他の促進因子に明らかに依存する。

【００３６】 アンジオテンシノーゲン、Ａ−Ｉおよび活性レニンは、動物およびヒトの尿中
にて測定できる。さらに、尿中に検出されたアンジオテンシノーゲン量はナトリ
ウム状態を反映した。それは、高ナトリウム食下にて検出限界であったが、ナト
リウム制限下にて高かった。尿中のアンジオテンシノーゲンおよび関連するパラ
メーターを測定することは、このパラクリンの尿細管ＲＡＳの活性の臨床的指標
を供するであろう。これらはナトリウム状態と関連するだけでなく、ナトリウム
感受性のマーカーとしても機能できる。実際には、Ａ（−６）ＡＧＴ突然変異に
対する仕事から誘導された仮説は、この変異体にホモ接合の個体が他の遺伝子型
の個体よりも高ナトリウム食下にて大きなＡＧＴ発現を維持する傾向にあること
である。過剰なナトリウム下のＡＧＴを下降調節する能力におけるこの適度な差
は、血圧に対する長期的な付随的効果で、より多くのナトリウムを保持する相対
的な傾向を説明するであろう。これは、これらの個体におけるナトリウム感受性
を説明するだろう。Ａ（−６）遺伝子型は、先に特許請求したごとく、この傾向
のマーカーとして機能でき、また、この新しく同定されたパラクリンの尿細管の
ＲＡＳの活性を反映する尿中パラメーターが、ナトリウム感受性の個体を同定す
るのに臨床的価値を証明できるようである。これらの個体は、豊かな社会の高ナ
トリウム食特性に直面した場合、本態性高血圧症を発生する高リスクに直面する
であろう。

【００３７】 パラクリンＲＡＳのある種のパラメーター、特に、Ａ−Ｉ、ＡＮＧ、デス−Ａ
Ｉ−ＡＮＧ、および活性レニンを尿中にて測定できる（ＡＮＧは、切断されてい
ない、無傷のアンジオテンシノーゲン蛋白質を表示し、デス−ＡＩ−ＡＮＧは切
断された後のＡＮＧ蛋白質の片割れであり；ペプチドＡＩがほとんど安定ではな
く急速に分解するために、ＡＮＧ＋デス−ＡＩ−ＡＮＧは、近位尿細管中で生成
されたＡＮＧの総量を反映する）。ＡＮＧおよびレニンが高または低ナトリウム
下にてそれぞれ下降調節または上昇調節されるために、これらのパラメーターは
個体のナトリウム状態を反映する。ＡＩ、ＡＮＧまたはデス−ＡＩ−ＡＮＧのレ
ベルが、参照シリーズの個体と比較して高塩食下にて上昇するならば個体はナト
リウム感受性に分類できる。前記のパラメーター名は、ＡＧＴ遺伝子型（Ｍ／Ｔ
２３５またはＡ／Ｇ（−６））によって測定された本態性高血圧症に対する遺伝
的素因と関連付け得る。また、これらのパラメーターは、最小の腎疾患、糖尿病
性腎症、ＩｇＡ腎症、および本出願において記載されたパラクリンの尿細管のＲ
ＡＳ機能に影響するような障害を含めた多数の臨床的な実例において診断的価値
があるかもしれない。

【００３８】 実施例 本発明を以下の実施例を引用して記載するが、それは例示として提供され、本
発明を断じて限定するものではない。当該技術分野においてよく知られた標準的
技術または特に後記の技術を利用した。

【００３９】 実施例１実験手順 １．抗体の生成。 ポリクローナル抗血清は、Misono（５０）およびGeoghe
gan（５１）に従って高度に精製されたマウス顎下腺レニンに対してウサギにお
いて生起させた。１：４００−１：８００の希釈液を免疫組織化学のために用い
た。抗血清は、粗唾液腺抽出物中および精製画分中の顎下腺レニン（ｒｅｎ−２
）ならびに粗腎臓溶解物からのプロレニンを認識し、それは精製したカテプシン
Ｄ、総ＣＯＳ−１溶解物または粗肝臓抽出物とは交差反応しなかった。

【００４０】 マウスＡｎｇに対するポリクローナル抗血清は、グルタチオン−Ｓ−転移酵素
（ＧＳＴ）融合蛋白質（ｐＧＸ−２Ｔ発現系、Pharmacia、New Jersy、NY）とし
て精製した、高度に精製されたマウスＡｎｇに対して、ウサギにおいて生起させ
た。Ａｎｇは、グルタチオンアフィニティークロマトグラフィー、ＧＳＴ−タグ
除去、陰イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーによって精製した。１：
４００ないし１：１２００の希釈液を免疫組織化学のために用いた。

【００４１】 ２．ｉｎ ｖｉｔｒｏにてのＡｎｇ分泌試験。 ｔｓＭＰＴを従前に記載さ
れたごとく培養した（１９）。ｔｓＭＰＴ細胞は、半多孔性膜上で増殖させ、培
地をスピン透析によって濃縮した。細胞培養液または尿試料中のＡｎｇは、レニ
ン切断反応におけるＡ−Ｉの放出として測定した（ｐＨ ６.５の２５ｍＭ Ｎａ
ＯＡｃ、０.５ｍＭ ＡＥＢＳＦ、０.５ｍＭ ８−ヒドロキシキノリン、５ｍＭ
ＥＤＴＡ中の２.５ｎＭレニン）。生成されたＡ−Ｉは、競合的ＲＩＡ（NEN DuP
ont、Boston、MA）で測定した。細胞単層を横切った上皮貫通抵抗は微小電極を
用いてアッセイした。頂上から基底外側チャンバーへのトリチウム化マンニトー
ルの拡散を用いて、細胞単層の完全性を測定した。ブランク・フィルターおよび
非連続細胞単層を含むフィルターを対照として供した。ブランク・フィルターの
電気抵抗を差し引いた後、上皮貫通抵抗値は無傷の完全な単層について７０Ω／
ｃｍ^２であり、非連続的な単層については３０Ω／ｃｍ^２であった。

【００４２】 ３．動物実験および測定。 ＩＲＢに認可されたプロトコールに従いＣ５７
ＢＬ６マウスを用いた。食事ナトリウム操作の２４時間前に全動物を絶食させ、
２％グルコースおよび０.１％ ＫＣｌを補足した水には自由に接近させた。１ｍ
ｇ／ｋｇのアミロリドおよび２ｍｇ／ｋｇのフロセミド（５２）のいずれか、ま
たは対照担体を皮下注射によって適用した。低ナトリウム（０.３％ナトリウム
）食および高ナトリウム（６％）食は、Purina Mills（Purina Mills社、St. Lo
uis、MO）から購入した。血液は心臓穿刺によって採取した。スポット尿は膀胱
穿刺によって集めた。半切開した腎臓をホルマリン固定し、または液体窒素にス
ナップ凍結（snap frozen）した。尿採取では、マウスを代謝ケージ（Nalgene、
Nalge Nunc International、Rochester、NY）に入れた。尿標本は、ＡＥＢＳＦ
および８−ヒドロキシキノリン（NEN−DuPont、Boston、MA）を含有する試験管
に１２時間間隔で採取した。体重および尿量を毎日記録した。尿中Ａｎｇおよび
Ａ−Ｉの測定は、クレアチニンにつき補正し、総尿中Ａｎｇとして表した。ＲＮ
Ａ単離およびＲＴ−ＰＣＲは、標準プロトコール（QIAGEN、Valencia、CA）に従
い行った。ＲＴ−ＰＣＲ実験はAccess ＲＴ−ＰＣＲシステム（Promega、Madiso
n、WI）を用いて行った。

【００４３】 ４．ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ。 ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲは、Erts
eyおよびScavo（５３）によって記載されたごとく行った。ジゴキシゲニン標識
したＰＣＲ産物は、アルカリ性フォスファターゼと結合した抗−ジゴキシゲニン
抗体（Roche、Indianapolis、IN）を用いてｉｎ ｓｉｔｕにて検出し、基質のニ
トロブルー−テトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−
ホスフェート（NBT／BCIP； Sigma、St. Louis、MO）を添加することによって視
覚化した。切片はＰＡＳで対比染色し、写真撮影した。

【００４４】 ５．免疫組織化学。 免疫染色は、標準プロトコール（DAKO Co.、Carpinat
eria、ＣＡ）に従い行った。ビオチン化した二次抗体をホースラディッシュ・ペ
ルオキシダーゼまたはアルカリ性フォスファターゼと結合したストレプトアビジ
ンを用いて検出し、各々、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ； Sig
ma）またはＮＢＴ／ＢＣＩＰのいずれかで視覚化した。ＡＥＣで視覚化した切片
は、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。

【００４５】 ６．定量的組織学。 ナトリウム食または利尿剤の関数としての腎臓尿細管
細胞におけるレニン発現を、ペルオキシダーゼ・レポーター酵素およびＡＥＣ色
原体を用いて遠位ネフロンのセグメントにおけるレニン免疫染色の頻度を定量す
ることによってアッセイした。２名の独立した内容を知らされていない研究者は
、主観的な０−４の尺度：０は尿細管のレニン染色がないに等しく；１は、レニ
ンにつき染色された尿細管セグメント当たり少なくとも１個の陽性細胞に等しく
；２は、尿細管セグメント当たり２５−５０％の細胞に等しく；３は、尿細管セ
グメント当り５０％を超える細胞に等しく；４は、＞７５％に等しい、を用いて
レニンにつき矢状腎臓をスコアした。一致は９０％を超え、再現性があった。別
々の４つの実験を行った。結果は、不対ｔ−検定を用いて、群間の平均±標準誤
差の比較によって分析した。ｐ＜０.０５は、有意と考えられた。

【００４６】 ７．細胞免疫ブロット法。 連結細管弓は、限定的コラゲナーゼ消化に続い
てマイクロ切開し単離した。単離した結合部の純度は、顕微鏡により調べた。さ
らに、単離した結合部は、コラゲナーゼ消化して単一細胞を得た（３７℃にて１
０分間にて５％）。細胞を洗浄し、３０μｌの低ナトリウム含有の組織培養液（
無血清ＤＭＥＭ）に再懸濁させ、ＰＶＤＦ膜（MultiScreen-IP, ０.４５μｍ Hy
drophobic, High Protein Binding Immobilon-P membrane Millipore Brdford,
MA）上に落とし、一晩インキュベートした。マウス・レニンおよびヒトＡｎｇで
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、陽性および陰性の対照として供した。免疫
ブロッティングは、従前に記載のごとく行った（２２−２４）。一晩のインキュ
ベーションの後、細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて、細胞膜に固定した
。抗−マウスレニン抗体、ビオチン化した抗マウスＩｇＧ（DAKO株式会社、Carp
enteria、ＣＡ）およびストレプトアビジン・アルカリ性フォスファターゼ（DAK
O）を１：５００の希釈にて用いた。アルカリ性フォスファターゼはＮＢＴ／Ｂ
ＣＩＰ（Sigma）色原体を用いて検出した。膜を装着し写真撮影した。

【００４７】 実施例２近位尿細管上皮はその頂上側にてＡｎｇを分泌する。 全腎臓組織におけるアンジオテンシノーゲン発現は、ナトリウム制限した動物
における免疫組織化学によって調べた。染色は、近位尿細管にだけ観察され、該
蛋白質の顆粒出現は、それらのＰＡＳ対比染色した刷子縁豊富な漿膜付近にあり
、分泌プロセスを示した（図１Ａ）。この仮説を検定するために、ネズミの近位
尿細管（１９）の暫定的に不滅化した細胞の密集単層を、頂上および基底外側区
画を隔てる半透膜上で増殖させた。単層の完全性は、視覚的な検査によって、重
要な上皮貫通抵抗の証明によって、および頂上のチャンバーに位置したトリチウ
ム化マンニトールの拡散をモニターすることによって確立した。無傷な単層を用
い、Ａｎｇは頂上の区画において再現性よく検出されたが、基底外側の区画では
検出されなかった（図１Ｂ）。発明者らの有力な実験条件下にて、ＡＧＴ ｍＲ
ＮＡが総ＲＮＡのノーザンブロット法によって検出された（１９）が、レニン
ｍＲＮＡは決定的であるべきＲＴ−ＰＣＲの検出限界にあまりにも接近していた
。

【００４８】 Ａｎｇが尿細管の管腔に分泌される場合、それは最終尿中に存在するのか？。
実際には、該蛋白質は特異的なポリクローナル抗血清でのウエスタン・ブロット
分析によってマウスおよびヒトの尿中で検出された。ナイーブＡｎｇは、食物お
よび水への無制限のアクセス、体重、従って総体内水にかなりには影響しない条
件での代謝ゲージに維持した雄性マウスの１２時間尿中で測定された。尿中Ａｎ
ｇは、食事ナトリウムと逆関係にあった（図１Ｃ）。また、ナイーブＡｎｇは６
６±７ないし５２３±３３ｐＭの濃度範囲にて健康ヒト志願者の尿標本中に観察
された（図１Ｄ）。

【００４９】 実施例３レニンは連結細管の主要細胞によって合成される 全ネフロンを通っての通過は、排泄、レニン発現の下流部位への送達のいずれ
か、またはその両者を反映する。この問題に取り組むために、腎臓内のレニン分
布を精製した顎下腺レニン（ｒｅｎ−２）に対して生起させた抗血清での免疫組
織化学によって調べた。期待されたごとく、強度の染色がＪＧＡにおいて観察さ
れた（図２Ｂ、矢印）。また、ナトリウム制限した動物において、染色は、中間
皮質および深部ネフロンの連結セグメントによって形成された中間皮質弓中で明
らかに観察されたが、他のセグメントにおいては観察されなかった（図２Ａ、Ｂ
）。レニン染色の特異性は、いくつかの観察によって確認された。染色は、予め
免疫したウサギ血清で処理した切片または抗原とで予めインキュベートした後の
切片中で存在しなかった（図２Ｄ）。さらに、発明者らの観察は、従前に確立さ
れたポリクローナルレニン抗血清（２０）を用いて確認された。各抗血清では、
レニン免疫反応性は、テストされた全希釈シリーズにわたり遠位ネフロンのＪＧ
Ａおよび皮質セグメント中に共通して観察された。また、免疫反応性のレニンは
、抗−ヒトレニン抗血清を用いてヒト腎臓の同様のセグメントにおいて検出され
た（図２Ｅ）（２０）。

【００５０】 緻密斑に対して遠位のネフロンのセグメントは、解剖学的および機能的な特徴
に基づき区別される存在物に細分化できる。近位セグメントとは対照的に、遠位
セグメントはかなりの細胞不均一性を示す。挿入細胞に加えて、遠位セグメント
は、セグメント間で異なる特徴および機能を持つ可変数の主要細胞を有する。皮
質の遠位セグメントには、遠位曲尿細管（ＤＣＴ）、連結細管（ＣＮＴ）および
皮質集合細管（ＣＣＤ）が含まれる。尿細管のレニン免疫染色の局所解剖学的分
布は、以下の主張に基づき、それがＣＮＴセグメント中に主として存在するとい
う結論を支持する：（１）染色は大きな皮質の集合管において観察されず；（２
）細胞染色は、皮質の放射状静脈のすぐ付近に局在した皮質迷路の尿細管の横断
面および縦断面において観察され（図１ Ａ、Ｂ）；（３）これらのクラスタは
、髄質放線によって区別される中間皮質の迷路において観察されるのみである。
この局所解剖学的配置は、中間皮質および深部ネフロンの連結細管の合併により
形成された弓に特有である（２１）。

【００５１】 連結細管の上皮は、２つの主要細胞タイプから構成されている。挿入細胞（Ｉ
Ｃ）は、２つのサブタイプ、αおよびβに細分され；両者は、Ｈ^＋−ＡＴＰアー
ゼを発現するが、βサブタイプだけが落花生レクチンを染色する。レニン、Ｈ^＋ −ＡＴＰアーゼ（図２Ｆ、Ｇ）または落花生レクチンについての一連の切片の染
色は、レニンにつき染色する細胞が、Ｈ^＋−ＡＴＰアーゼまたは落花生レクチン
につき染色しないことを明らかとし、これらはそれらがＩＣではないことを示唆
する。レニン−陽性細胞の形態は、特有の多角形の外観を持つ、刷子縁を欠く凸
状頂上側および豊富な透明の細胞質内の中心に位置した核（２１）を持つ皮質連
結細管（ＣＮＴ）細胞について報告されたものと一致する。注目すべきは、レニ
ン染色は、細胞質の頂上セグメント中、および核付近において優勢である。

【００５２】 全身的または近位尿細管の起源のレニンの取り込みに対立する局所的なレニン
合成の仮説を、連結細管弓のマイクロ切開およびＲＴ−ＰＣＲの組合せによって
試験した。マイクロ切開の間、糸球体（図３Ａ、Ｃ）、近位曲尿細管（図３Ａ、
Ｂ）、ヘンレ係蹄および血管は容易に同定でき、連結細管と、連結細管または皮
質集合細管のいずれかとの間の弓結合から分離した（図３Ａ、Ｄ）。期待された
サイズおよび配列のレニン増幅産物は、食事ナトリウムとは独立して糸球体から
のＲＮＡ調製物において明らかに観察された（図３Ｅ）。また、明らかなシグナ
ルが、特にナトリウム制限した動物における単離した連結細管弓において観察さ
れた。最小シグナルだけがナトリウム制限下にて近位尿細管において認められた
。これらの観察は、４つの独立したシリーズのマイクロ切開実験において再現さ
れた。対照には、ＪＧＡコンポーネントを含む尿細管セグメントの汚染を排除す
るために、ＲＮＡ質およびα平滑筋アクチンについてのＧＡＰＤＨの増幅が含ま
れた。全増幅産物の特異性はＤＮＡ配列決定によって確認した。

【００５３】 独立した方法によってネフロンの連結細管におけるレニン合成を確認するため
に、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲを１６時間のナトリウム制限に付したマウスか
らの腎臓切片に適用した（図３Ｆ−Ｋ）。レニンｍＲＮＡは、遠位ネフロンの皮
質セグメントの細胞において、および輸入動脈の細胞において明らかに同定され
た（図３Ｉ−Ｋ）。レニンｍＲＮＡは、近位尿細管（図３Ｉ、Ｊ 矢の先）にお
いて検出されなかった。また、それは内部または外部の髄質中にも検出されなか
った。ＤＮａｓｅで予め処理されない対照切片は、全ネフロン・セグメントにお
ける全細胞の均一染色を示し（図３Ｆ、Ｇ）；ＤＮａｓｅで処理するが逆転写し
なかった対照切片は、染色を示さなかった（図３Ｈ）。さらに、特異性の証拠は
、プライマーを逆転写されなかった試料に適用した場合のシグナルの不在によっ
て供した。増幅に用いたプライマーの特異性は、対照ＲＴ−ＰＣＲ実験における
ＤＮＡ配列決定によって確認した。増幅が特異的で、断片化したゲノムＤＮＡの
プライマー伸長の結果ではないということをさらに保証するために、対照増幅を
反応上清から行った。

【００５４】 実施例４ＣＮＴ細胞はレニンを分泌する ＣＮＴ細胞によるレニン分泌は、細胞免疫ブロッティング（２２−２４）を用
いて証明した。連結細管のマイクロ切開した弓から単離した細胞はレニンを分泌
した（図３Ｌ）。マウスレニン（図３；Ｍ）およびヒトアンジオテンシノーゲン
（図３；Ｎ）を発現するＣＨＯ細胞を、各々、陽性および陰性対照として供した
。レニン分泌は、免疫反応性レニンの細胞周囲のハローによって明らかにされた
。

【００５５】 実施例５ＣＮＴにおけるレニン発現は食事ナトリウムに応じて変化する 免疫染色および発現試験に基づいて、発明者らは、ＪＧＡにおける発現のその
主要部位に加えて、レニンが連結細管においても発現されると結論する。ひき続
いての試験において、発明者らは、レニン免疫染色を用いて、利尿剤を介して総
ナトリウム摂取および／または特定の部位のナトリウム再吸収を変更することに
よって尿細管ナトリウム送達の一晩の操作後の食事ナトリウムおよびＣＮＴレニ
ンとの間の関係を調べた。フロセミドは、遠位尿細管の上流のＮａ^＋／Ｋ^＋２Ｃ
ｌ⁻輸送体を阻害し、一方、ナトリウム・チャンネル遮断剤のアミロリドは、ネ
フロンの遠位セグメントにおけるナトリウム再吸収に影響した。ＪＧＡにおける
レニン免疫染色のシグナル飽和のために、この部位でのレニン発現は、総腎臓Ｒ
ＮＡの半定量的なＲＴ−ＰＣＲ（２５）によって見積った。ＣＮＴ細胞のレニン
発現は、定量的組織学（レニンにつき染色するＣＮＴ細胞の頻度）によって評価
した。スコアリングは、４つの独立した組の複連実験において２名の独立した内
容を知らされていない観察者によって行った。高ナトリウム下にて、動物はＣＮ
Ｔにおける最小のレニン染色および中程度のＪＧＡレニン発現を示した（図４Ａ
；図４Ｄ、Ｅ群１Ａ）。対照的に、高ナトリウムおよびアミロリド投与の組合せ
は、ＣＮＴ免疫反応性レニンの顕著な増加に導き（図４Ｂ； 図４Ｄ、Ｅ群１Ｂ
）；ＪＧＡレニンは有意に低下した（ｐ＜０.０５）。一晩のナトリウム制限は
、ＣＮＴ免疫反応性レニンの著しい増加に導いたが（図４Ｃ、図４Ｄ、Ｅ群２Ａ
）、ＪＧＡレニンにおいて有意な変化はなかった。しかしながら、長期間のナト
リウム制限は、ＪＧＡにおけるレニン発現を刺激した。ナトリウム制限とフロセ
ミドとの組合せは、ＪＧＡレニンに対するさらなる効果なくして、ＣＮＴにおけ
るレニン発現の低下を生じさせた（図４Ｄ、Ｅ群２Ｂ）。食事ナトリウムの操作
は、総ナトリウム排泄の測定によってモニターした。これらの実験的条件下にて
、その処置は、体重に対する効果がなく、従って総体内水において有意な変動を
除外した。

【００５６】 本発明の観察は以下の結論を支持する：（１）アンジオテンシノーゲンは近位
尿細管によって合成され、尿細管流体へ分泌され；（２）切断していないＡｎｇ
は、全ネフロンを介して通過し、最終尿に見出すことができ；（３）レニンは
、ＣＮＴ細胞によって合成され分泌されて、（４）近位のアンジオテンシノーゲ
ンおよび遠位のレニン発現の双方は、食事ナトリウムの関数として変化する。濾
過されたレニンと一緒に、尿細管ＲＡＳのこれらの要素の空間分布、および食事
の塩とのそれらの相関性は、ネフロン内の様々な部位でナトリウム再吸収の統合
調節にそれらが重要な役割を果たすことを示唆する。

【００５７】 近位尿細管におけるＡＧＴ ｍＲＮＡの存在、およびナトリウム摂取でのその
変化は、全腎臓切片において従前に観察されている（５）。これらの発見の確認
に加えて、本明細書に示したデータは、ネフロンの遠位セグメントにおけるレニ
ンのもの、ならびにＡｎｇおよびＡ−Ｉの尿中排泄と平行して、経時的ＡＧＴ発
現を特徴付ける。さらに、それらは、分極した上皮によるＡｎｇの管腔分泌を実
証し；腎皮質からの異種細胞集団の初期培養での従前の実験は、蛋白質の分泌を
示唆したが、このプロセスの方向性を解決できなかった（２６）。尿中Ａｎｇに
関する観察は実験動物を用いて、従前の報告を確認する（２７−２９）。過去に
おいて、Ａｎｇが通常濾過されないので、尿中アンジオテンシノーゲンは糸球体
膜に対する損傷の臨床的指標であると思われた（３０、３１）。

【００５８】 培養した単層の頂上側へのＡｎｇの分泌は、それ自体ではｉｎ ｖｉｖｏにての
近位尿細管による蛋白質の管腔分泌につき決定的な証拠を提供しない。近位尿細
管におけるＡｎｇ分泌顆粒の頂上分布（図１Ａ）は、かかるプロセスを示唆する
。また、近位尿細管におけるＡＧＴ発現と直接的に相関性し、食事ナトリウムと
の逆関係の最終尿中のＡｎｇの存在もそうである。一緒にすれば、これらの観察
は、Ａｎｇがこの初期のネフロン・セグメントにおける尿細管流体中に実際に分
泌されることを強く示唆する。そうならば、全身的な起源の濾過されたレニンは
管腔のＡｎｇに作用してＡ−ＩＩを生成できる。ナトリウム水素交換体ＮＨＥ−
３（９、１０、３２）のその刺激を部分的に介する、このセグメントにおけるナ
トリウム輸送の主要調節体としてのＡ−ＩＩの機能的な重要性は、よく記載され
ている（４）。この仮説では、全身的なレニンの限外濾過は、酵素についての排
泄経路のみとしてみなされないであろう。というのは、それは近位尿細管におけ
る大量のナトリウム再吸収の調節においてやはり重要な機能を発揮するであろう
からである。

【００５９】 先の報告は、主として選択された細胞集団からまたは近位尿細管のマイクロ切開
されたセグメントからの総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによるレニンｍＲＮＡの検出に
基づいて、近位尿細管における自己分泌ＲＡＳの存在を示唆した（８、３３−３
５）。ナトリウム制限した動物における近位尿細管のマイクロ切開されたセグメ
ント中のｔｓＭＰＴにおける細胞内Ａ−lおよびＡ−ＩＩの形成およびかすかな
レニン増幅産物のこの観察は、このモデルと一致している。しかしながら、近位
尿細管におけるレニンおよびアンジオテンシノーゲンの発現レベルは著しく異な
る。アンジオテンシノーゲン蛋白質は近位尿細管の上皮に豊富のようだが、抗体
が特異性を保証する希釈にて用いられる場合、レニンは免疫組織化学の検出レベ
ル未満である。同様に、ＡＧＴ ｍＲＮＡは、総ＲＮＡのノーザンブロットによ
って検出する。対照的に、この部位でのレニン転写体についての証拠は、ＲＴ−
ＰＣＲ後のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでさえ回避し、弱いシグナル
が液相ＲＴ−ＰＣＲにだけ出現する。弱いＲＴ−ＰＣＲシグナルが正当か正当で
ない転写のいずれも反映できるので、後者の観察の機能的な重要性は不明瞭なま
まである。濾過されたレニンと分泌されたＡｎｇとの反応は、近位尿細管の管腔
液におけるＡ−ＩＩ形成の支配的な機序であり得るが、非常に低レベルにて発現
された自己分泌またはイントラクリンの局所ＲＡＳは依然としてこのネフロンセ
グメントの恒常性において区別される目的を発揮できる。

【００６０】 場合によっては、レニン免疫反応性は、マウス腎臓の管腔セグメントにおいて認
められた（３６−３９）。調査の焦点がＪＧＡレニンに対してである１つの場合
には、それは実験的人工産物として斥けられた（３８）。他の実例において、そ
の著者らはそれが濾過されたレニンの非特異的取り込みを表わすということを示
唆するために間接的主張に依拠した。この仕事において、局所合成の仮説を２つ
の区別される実験アプローチに従って直接的に調べた。２つの異なる方法の各々
につき繰り返しシリーズの４つの独立した実験において得た合致した結果は、局
所レニン合成の仮説を支持する。組織切片におけるレニン免疫染色の支配的な頂
上分布（図２Ｃ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏにての単離されたＣＮＴ細胞によるレ
ニン分泌の証明は、レニンが管腔内腔に分泌されることを示唆する。しかしなが
ら、全身的な起源の濾過されたレニンのいくらかは近位尿細管における分解を回
避するということを排除できないので、最終尿中レニンの観察は単独ではこの問
題を解決しない。

【００６１】 一緒にすれば、これらのデータは、連結細管によって分泌されたレニンが近位
尿細管にて発生した管腔アンジオテンシノーゲンに対して作用して、管腔液中に
Ａ−Ｉを遊離できることを示唆する。集合細管におけるＡＣＥおよびＡ−ＩＩ受
容体の双方の存在が文書で記載されていること（１５、１６）は、ネフロンの遠
位セグメントにおけるＡ−ＩＩの形成および作用を可能とする。直接的実験的調
査に対する貧弱な接近性のために、連結細管および集合細管におけるＡ−ＩＩの
効果についてはほとんど知られていない。１つの報告は、管腔A−ＩＩが皮質ネ
フロンの初期集合細管におけるアミロリド感受性ナトリウム輸送を刺激すること
を示唆する（１１）。

【００６２】 連結細管弓におけるレニン免疫染色の分布は、腎臓における組織カリクレイン
の発現部位に著しく類似している。レニンおよびカリクレインの共局在化は確立
されたままであるが、遠位尿細管に分泌された組織カリクレイン（４０）は、Ｃ
ＮＴ（４１）に由来し、レニンにつき本明細書中で観察されたものと全く同様の
パターンでＣＮＴ細胞の頂上側にて、優勢に免疫染色されることが実際に示され
た（４２、４３）。

【００６３】 また、キニノーゲンが集合細管の主要細胞によって合成され、尿細管腔に分泌
されることが知られ、ブラジキニンＢ２受容体がこのネフロンセグメントの管腔
側にて報告されている（４４）。連結細管および集合細管の管腔区画におけるレ
ニン−アンジオテンシンおよびカリクレイン−キニン系双方の成分の存在は、そ
の２つの系が最終尿中のナトリウムおよびカリウムの濃度の微妙な調節における
調整されバランスのとれた役割を演じることができることを示唆する。これらの
系は、これらのエフェクターであるＡ−ＩＩおよびブラジキニンのしばしば記載
される反対作用を介してだけでなく、アルドステロン応答、ナトリウムおよびカ
リウムのバランス、レニン活性化およびＡＣＥの作用を介するペプチド変換のご
とき潜在的な重複の複数領域を通しても相互に関係する。連結細管はこの調整さ
れた調節において非常に戦略的な部位であろう。

【００６４】 Ｇｕｔｏｎおよび彼の共同研究者らの実験上の仕事は、ベースラインの血圧の
調節における圧力−ナトリウム排泄増加関係の重要性、および食事ナトリウムの
変動に応じたナトリウムバランスの調節における腎臓内Ａ−ＩＩの支配的な役割
を長期間確証してきている（４５、４６）。Ｌｉｄｄｌｅ症候群（４７）および
鉱質コルチコイド過剰症候群（４８、４９）のごとき稀なメンデル性高血圧症の
遺伝学は、血圧調節において、ネフロンの遠位セグメントにおけるナトリウム再
吸収の重要性を強調することによって、実験的生理学を確認する。近位尿細管起
源のアンジオテンシノーゲンおよび連結細管によって発現したレニンは、ナトリ
ウムバランスおよび血液量恒常性の調節における近位および遠位のセグメントの
機能を協調する機序を提供できる。ＡＧＴ遺伝子座（１８）での分子変動が本態
性高血圧症を発生する個体の傾向に影響するのはこの系を介してであろう。

【００６５】 本発明の方法および構成を種々の具体例の形態で本明細書の一部とみなすこと
ができ、それらの一部だけを本明細書に開示すると認識されるであろう。当業者
には、他の具体例が存在し、それが本発明の精神から逸脱しないことは明らかで
あろう。かくして、記載された具体例は例示であり、限定的なものとして解釈さ
れるべきではない。

【００６６】参考文献リスト 1. Hall, J.B., MW. Intrarenal and circulating angiotensin II and renal function. in The Renin-Angiotensin System Vol. 1 (Robertson, J., Nicholls, MG編) 26.1-26.43 (Gower Medical Publishing, New York, 1993). 2. Corvol, P., Soubrier, F.およびJeunemaitre, X. Molecular genetics of the renin-angiotensin-aldosterone system in human hypertension. Pathol Biol (Paris) 45, 229-39 (1997). 3. Seikaly, M.G., Arant, B.S., Jr.およびSeney, F.D., Jr. Endogenous angiotensin concentrations in specific Intrarenal fluid compartments of the rat. J Clin Invest 86, 1352-7 (1990). 4. Navar, L.G., Imig, J.D., Zou, L.およびWang, C.T. Intrarenal production of angiotensin II. Semin Nephrol 17, 412-22 (1997). 5. Ingelfinger, J.R., Pratt, R.E., Ellison, K.E.およびDzau, V.J. Sodium regulation of angiotensinogen mRNA expression in rat kidney cortex and medulla. J Clin Invest 78, 1311-5 (1986). 6. Ingelfinger, J.R.ら. Intrarenal angiotensinogen: localization and regulation. Pediatr Nephrol 4, 424-8 (1990). 7. Ingelfinger, J.R., Zuo, W.M., Fon, E.A., Ellison, K.E.および Dzau, V.J. In situ hybridization evidence for angiotensinogen messenger RNA in the rat proximal tubule. An hypothesis for the Intrarenal renin-angiotensin system. J Clin Invest 85, 417-23 (1990). 8. Tank, J.E., Henrich, W.L.およびMoe, O.W. Regulation of glomerular and proximal tubule renin mRNA by chronic changes in dietary NaCl. Am J Physiol 273, F892-8 (1997). 9. Liu, F.Y.およびCogan, M.G. Angiotensin II stimulation of hydrogen ion secretion in the rat early proximal tubule. Modes of action, mechanism, and kinetics. J Clin Invest 82, 601-7 (1988). 10. Cogan, M.G. Angiotensin II: a powerful controller of sodium transport in the early proximal tubule. Hypertension 15, 451-8 (1990).

【００６７】 11. Wang, T.およびGiebisch, G. Effects of angiotensin II on electro- lyte transport in the early and late distal tubule in rat kidney. Am J Physiol 271, F143-9 (1996). 12. Vos, P.F., Boer, P.およびKoomans, H.A. Effects of enalapril on renal sodium handling in healthy subjects on low, intermediate, and high sodium intake. J Cardiovasc Pharmacol 22, 27-32 (1993). 13. Vos, P.F., Boer, P., Braam, B.およびKoomans, H.A. The origin of urinary angiotensins in humans. J Am Soc Nephrol 5, 215-23 (1994). 14. Tojo, A., Tisher, C.C.およびMadsen, K.M. Angiotensin II regulates H(+)-ATPase activity in rat cortical collecting duct. Am J Physiol 267,F1045-51 (1994). 15. Casarini, D.E.ら. Angiotensin I-converting enzyme activity in tubular fluid along the rat nephron. Am J Physiol 272, F405-9 (1997). 16. Harrison-Bernard, L.M., Navar, L.G., Ho, M.M., Vinson, G.P.および el-Dahr, S.S. Immunohistochemical localization of ANG II AT1 receptor in adult rat kidney using a monoclonal antibody. Am J Physiol 273,F170-7 (1997). 17. Jeunemaitre, X.ら. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen. Cell 71, 169-80 (1992). 18. Inoue, I.ら. A nucleotide substitution in the promoter of human angiotensinogen is associated with essential hypertension and affects basal transcription in vitro. J Clin Invest 99, 1786-97 (1997). 19. Loghman-Adham, M.ら. A conditionally immortalized cell line from murine proximal tubule. Kidney Int 52, 229-39 (1997). 20. Yokosawa, H., Yokosawa, N.およびInagami, T. Specific antibody to human renal renin and its cross-reactivity with inactive human plasma prorenin. Proc Soc Exp Biol Med 164, 466-70 (1980).

【００６８】 21. Kaissling, B.およびKriz, W. Morphology of the loop of Henle, distal tubule, and collecting duct. in Handbook of Physiology, Section 8: Renal Physiology Vol. 8 (Winhager, E.編) 109-167 (Oxford University Press, Oxford, 1992). 22. Chiou, C.Y., Williams, G.H.およびKifor, I. Study of the rat adrenal renin-angiotensin system at a cellular level. J Clin 1nvest 96, 1375-81 (1995). 23. Kendall, M.E.およびHymer, W.C. Cell blotting: a new approach to quantify hormone secretion from individual rat pituitary cells. Endocrinology 121, 2260-2 (1987). 24. Kendall, M.E.およびHymer, W.C. Measurement of hormone secretion from individual cells by cell blot assay. Methods Enzymol 168, 327-38 (1989). 25. Rupp, R.A.およびWeintraub, H. Ubiquitous MyoD transcription at the midblastula transition precedes induction-dependent MyoD expression in presumptive mesoderm of X. laevis. Cell 65, 927-37 (1991). 26. Yanagawa, N.ら. Production of angiotensinogen and renin-like activity by rabbit proximal tubular cells in culture. Kidney Int 39, 938-41 (1991). 27. Wang, T.T.ら. Isoproterenol and 8-bromo-cyclic adenosine monophosphate stimulate the expression of the angiotensinogen gene in opossum kidney cells. Kidney Int 46, 703-10 (1994). 28. Yoshiya, M., Tsutsui, Y., Itoh, N.およびOkamoto, H. Angio- tensinogen excretion in rat urine: effects of lipopolysaccharide treatment and sodium balance. Jpn J Pharmacol 57, 37-44 (1991). 29. Yang, G., Merrill, D.C., Thompson, M.W., Robillard, J.E.および Sigmund, C.D. Functional expression of the human angiotensinogen gene in transgenic mice. J Biol Chem 269, 32497-502 (1994). 30. Favaro, S.ら. Urinary angiotensinogen loss in chronic proteinuric glomerulonephritis. Int Urol Nephrol 4, 195-8 (1972).

【００６９】 31. Tewksbury, D. Angiotensinogen: Biochemistry and Molecular Biology. in Hypertension: Pathophysiology, Diagnosis, amd Management Vol. 1 (Laragh, J., Brenner, BM編) 1197-1216 (Raven Press, New York, 1990). 32. Moe, O.W. Sodium-hydrogen exchange in renal epithelia: mechanisms of acute regulation. Curr Opin Nephrol Hypertens 6, 440-6 (1997). 33. Moe, O.W.ら. Renin expression in renal proximal tubule. J Clin Invest 91, 774-9 (1993). 34. Henrich, W.L., McAllister, E.A., Eskue, A., Miller, T.およびMoe, O.W. Renin regulation in cultured proximal tubular cells. Hypertension 27, 1337-40 (1996). 35. Tank, J.E., Moe, O.W., Star, R.A.およびHenrich, W.L. Differential regulation of rat glomerular and proximal tubular renin mRNA following uninephrectomy [published errata appear in Am J Physiol 1996 Ju1; 271(1 Pt 2): section F following table of contents and 1996 Dec; 271(6 Pt 3):section F following table of contents]. Am J Physiol 270, F776-83 (1996). 36. Taugner, R., Hackenthal, E., Inagarni, T., Nobiling, R.および Poulsen, K. Vascular and tubular renin in the kidneys of mice. Histochemistry 75, 473-84 (1982). 37. Taugner, R.ら. The inkarenal renin-angiotensin-system. An immunocytochemical study on the localization of renin- angiotensinogen, converting enzyme and the angiotensins in the kidney of mouse and rat. Klin Wochenschr 60, 1218-22 (1982). 38. Celio, M.R.およびInagami, T. Renin in the human kidney. Immuno- histochemical localization. Histochemistry 72, 1-10 (1981). 39. Taugner, R.ら. Coexistence of renin and angiotensin II in epitheloid cell secretory granules of rat kidney. Histochemistry 81, 39-45 (1984). 40. Scicli, A.G., Carretero, O.A., Hampton, A., Cortes, P.およびOza, N.B. Site of kininogenase secretion in the dog nephron. Am J physiol 230, 533-6 (1976).

【００７０】 41. Omata, K., Carretero, O.A., Scicli, A.G.およびJackson, B.A. Localization of active and inactive kallikrein (kininogenase activity) in the microdissected rabbit nephron. Kidney Int 22, 602-7 (1982). 42. Figueroa, C.D., Caorsi, I., Subiabre, J.およびVio, C.P. Immuno- reactive kallikrein localization in the rat kidney: an immuno- electron-microscopic study. J Histochem Cytochem 32, 117-21 (1984). 43. Vio, C.P.およびFigueroa, C.D. Evidence for a stimulatory effect of high potassium diet on renal kallikrein. Kidney Int 31, 1327-34 (1987). 44. Tomita, K.およびPisano, J.J. Binding of [3H]bradykinin in isolated nephron segments of the rabbit. Am J Physiol 246, F732-7 (1984). 45. Guyton, A.C. Blood pressure control--special role of the kidneys and body fluids. Science 252, 1813-6 (1991). 46. Guyton, A.C. Kidneys and fluids in pressure regulation. Small volume but large pressure changes. Hypertension 19, 12-8 (1992). 47. Shimkets, R.A.ら. Liddle's syndrome: heritable human hypertension caused by mutations in the beta subunit of the epithelial sodium channel. Cell 79, 407-14 (1994). 48. Mune, T., Rogerson, F.M., Nikkila, H., Agarwal, A.K.およびWhite, P.C. Human hypertension caused by mutations in the kidney isozyme of 11 beta- hydroxysteroid dehydrogenase. Nat Genet 10, 394-9 (1995). 49. White, P.C., Mune, T., Rogerson, F.M., Kayes, K.M.およびAgarwal, A.K. 11 beta Hydroxysteroid dehydrogenase and its role in the syndrome of apparent mineralocorticoid excess. Pediatr Res 41, 25-9 (1997). 50. Misono, K.S., Holladay, L.A., Murakami, K., Kuromizu, K.および Inagami, T. Rapid and large scale purification and character- ization of renin from mouse submaxillary gland. Arch Biochem Biophys 217, 574-81 (1982).

【００７１】 51. Geoghegan, K.F.ら. Simple procedure for recovery of crystallizable human recombinant renin from mammalian cell-conditioned medium. Adv Exp Med Biol 306, 379-81 (1991). 52. Ingelfinger, J.R.ら. Intrarenal angiotensinogen: localization and regulation. Pediatr Nephrol 4, 424-8. 53. Ertsey, R.およびScavo, L.M. Coverslip mounted-immersion cycled in situ RT-PCR for the localization of mRNA in tissue sections. Biotechniques 24, 92, 94, 96, 98-100 (1998).

【図面の簡単な説明】

【図１Ａないし１Ｄ】 図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、ネフロンにおけるアンジオテンシノーゲン
（Ａｎｇ）の合成および分泌を示す。 図１Ａは、ナトリウム制限したマウスのネフロンにおけるアンジオテンシノー
ゲンの局在化を示す。アンジオテンシノーゲンについての免疫染色は、ＰＡＳ対
比染色によって同定された近位尿細管細胞においてのみ観察される。高拡大図は
、刷子縁膜下のＡｎｇの頂上胞状染色を明らかとし、分泌プロセスを示唆する。 図１Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにての近位尿細管上皮によるＡｎｇの方向性分泌
を示す。ポリクローナルＡｎｇ抗体を用いるウエスタン・ブロット分析は、近位
尿細管細胞が専らそれらの頂上側にてアンジオテンシノーゲンを分泌することを
示す。 図１Ｃは、尿中Ａｎｇ（黒色棒）としておよび尿中アンジオテンシン−Ｉ（Ａ
−Ｉ；白色棒）として測定されたアンジオテンシノーゲン分泌が、ナトリウム状
態の逆関数であることを示す。Ａｎｇは、レニンによる切断反応における遊離Ａ
−Ｉ量として測定され；Ａ−Ｉは、ＲＩＡによって測定された（３回の実験の平
均±標準誤差）。 また、図１Ｄは、切断されていない本来のアンジオテンシノーゲンを６名の健
康男性ヒト対象の尿中に検出したことを示す。

【図２Ａないし２Ｇ】 図２Ａないし２Ｇは、連結細管（ＣＮＴ）細胞におけるレニンの免疫的局在化
を示す。 図２Ａおよび２Ｂにおいて、尿細管のレニン染色（矢の先）は、中間皮質およ
び深部ネフロンの連結尿細管弓に局在化する。弓は、中間皮質レイ（ＭＲ）間お
よび放射状の静脈（*）の近辺において中間皮質迷路（Ｌ）に位置する。また、
レニン染色は、ＪＧＡ（矢印）において観察される。 図２Ｃは、頂上レニン染色を示すＣＮＴ細胞の拡大図である。 図２Ｄにおいて、レニン染色の特異性は、全てのレニン免疫染色を消失させる
精製したマウス・レニンでのレニン抗体の吸着によって実証される。 図２Ｅは、ヒトにおいて、免疫反応性のレニンが初期の皮質集合管の細胞にも
存在することを示す。 図２Ｆおよび２Ｇにおいて、レニン免疫染色は主要なＣＮＴ細胞に制限される
。連続切片は、レニン（図２Ｆ）につき、または介在細胞のマーカーであるH'Ａ
ＴＰａｓｅ（図２Ｇ）につき、染色された。レニン（矢印）はＨ−ＡＴＰａｓｅ
ポジティブな細胞（矢の先）において発現されず；染色は相互に排他的であった
（スケールバーＡ、Ｃ=１２８μｍ；Ｂ、Ｄ−Ｆ=２０μｍ）。

【図３Ａないし３Ｎ】 図３Ａ−３Ｅは、連結細管（ＣＮＴ）における新規なレニン合成を実証する。
マイクロ切開したネフロンのグラフィックな再構築を、近位曲尿細管（図３Ｂ）
、糸球体および緻密斑（図３Ｃ）ならびに中間皮質ＣＮＴ弓（図３Ｄ）を拡大し
て、図３Ａに示す。 図３Ｅは、マイクロ切開したＣＮＴ弓におけるＲＴ−ＰＣＲによって検出され
たレニン転写を示す。正常なナトリウム食下にて、レニン増幅産物は、総腎臓Ｒ
ＮＡ、糸球体（グロマー（glomer））からのＲＮＡおよびＣＮＴ弓からのＲＮＡ
に明らかに観察された。ナトリウム制限した動物において、特定のシグナルが糸
球体およびＣＮＴ弓において強く、近位尿細管（ＰＣＴ）において弱かった。Ｇ
ＡＰＤＨは内部対照として機能した。 図３Ｆ−３Ｋは、連結細管（ＣＮＴ）における新規なレニン合成を実証し、こ
れはｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲにおいてＣＮＴ細胞におけるレニン発現の局在
化を示す。これらの図は、４回の独立した実験の例示である。 図３Ｆは、ＤＮａｓｅ処置なくしてのポジティブ対照切片を示し、これは均質
な核周囲染色を示す。 図３Ｇにおいて、ゲノムの増幅産物は、糸球体（*）、近位尿細管（矢の先）
および遠位ネフロン・セグメント（矢印）を含めた全ての腎臓セグメントの細胞
において検出された。 図３Ｈにおいて、ＤＮａｓｅで処理され、特異的プライマーを持つが、逆転写
のないネガティブな対照切片は、レニン増幅産物を示さない。 図３Ｉ−３Ｋは、ＤＮａｓｅ処理され、逆転写された切片を示し、ＣＮＴ細胞
（矢印）における特異的レニン染色を明らかとするが、遠位尿細管（矢の先）ま
たは他の尿細管セグメントにおいては明らかとしない。 図３Ｊにおいて、高拡大図は、ＣＮＴ細胞（矢印）のサブセットにおけるポジ
ティブな染色を明らかとするが、近位尿細管（矢の先）においては明らかとしな
い。 また、図３Ｋにおいて、レニンｍＲＮＡは、旁糸球体平滑筋細胞（矢印）にお
いて検出された。全切片はＰＡＳで対比染色された（Ａ−Ｃ、スケールバー＝６
４μｍ；Ｄ−Ｆ、バー=２０μｍ；Ｆ−Ｈ、スケールバー＝６４μｍ；Ｉ−Ｋ、
バー=２０μｍ）。 図３Ｌ−３Ｍは、連結細管（ＣＮＴ）における新規なレニン合成を示し、それ
はＣＮＴ細胞によるレニン分泌を示す。 図３Ｌにおいて、マイクロ切開されたＣＮＴ弓（矢の先）からのＣＮＴ細胞の
サブ集団は、免疫反応性レニンの細胞周囲ハロスを示し；非レニン産生細胞は星
印で示される。 図３Ｍにおいて、レニンを発現するＣＨＯ細胞は、ポジティブ対照として機能
した。 図３Ｎにおいて、アンジオテンシノーゲンを発現するＣＨＯ細胞は、ネガティ
ブ対照として機能した。

【図４Ａないし４Ｅ】 図４Ａ−４Ｅは、ナトリウム負荷および遠位ナトリウム送達の関数として中間
皮質および深部のネフロンのＣＮＴ細胞のレニン発現における変形を示す。 図４Ａにおいて、輸入動脈およびＣＮＴのレニン染色（矢印）はナトリウム負
荷に続いて最小である。 図４Ｂにおいて、ＣＮＴレニン染色だけが、アミロリド投与と組み合せたナト
リウム負荷に続いて増加した。 図４Ｃは、ナトリウム制限がＣＮＴ鎖におけるレニン染色もかなり増加させる
ことを示す（スケールバー＝６４μｍ）。さらに、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる
ＣＮＴ細胞におけるレニン発現（図４Ｄ）およびＪＧＡ細胞におけるレニン発現
（図４Ｅ）の定量的免疫組織化学はこれらの観察を確かにする（４回の独立した
組の実験の平均±標準誤差）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 テリー・ケイ・モーガン アメリカ合衆国84106ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、サウス・1000・イースト2141 番 (72)発明者 ジャン−マルク・ラルール アメリカ合衆国84103ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、ノース・ヒルズ・ドライブ 495番 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA35 BA14 BB14 BB20 BB24 BB41 CB01 DB09 FA16 FA19 4C084 AA17 MA01 NA14 ZA422

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ナトリウムに対する個体の感受性を決定する方法であって、
   高塩食中の個体の尿中にてアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン−Ｉ、お
   よびデス−アンジオテンシン−Ｉ−アンジオテンシノーゲンよりなる群から選択
   される物質量を測定し、該量と参照標準とを比較することを含み、ここに、該物
   質量の上昇がナトリウム感受性を示すことを特徴とする該方法。
2. 【請求項２】 個体のナトリウム状態を決定する方法であって、高塩食中で
   はない個体の尿中にてアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン−Ｉ、および
   デス−アンジオテンシン−Ｉ−アンジオテンシノーゲンならびにレニンよりなる
   群から選択される物質量を測定し、該量と参照標準とを比較することを含み、こ
   こに、該物質量の上昇がナトリウム制限を示すことを特徴とする該方法。
3. 【請求項３】 高血圧症の治療用薬物をスクリーニングする方法であって、
   候補薬物をマウス近位尿細管の特徴を有する不滅化した腎細胞系に添加し、アン
   ジオテンシノーゲンの発現もしくは分泌またはナトリウム輸送に対する該薬物の
   効果を測定し、該候補薬物の効果を薬物を有しない対照と比較することを含み、
   ここに、アンジオテンシノーゲンの発現もしくは分泌の低下またはナトリウム輸
   送の低下が該候補薬物が高血圧症を治療するのに有用であることを示すことを特
   徴とする該方法。
4. 【請求項４】 高血圧症の治療用薬物をスクリーニングするための方法であ
   って、候補薬物を動物に投与し、パラクリンの尿細管腎臓−アンジオテンシン系
   に対する該薬物の効果を測定し、該候補薬物の効果を薬物を有しない対照と比較
   することを含み、ここに、該候補薬物によって示された効果が、該候補薬物が高
   血圧症を治療するのに有用であることを示すことを特徴とする該方法。
5. 【請求項５】 アンジオテンシノーゲンの発現または分泌のレベルが近位尿
   細管においてモニターされ、対照を超える該レベルの低下が高血圧症を治療する
   のに有用な薬物を示す請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 レニンの発現または分泌のレベルが遠位ネフロンにおいてモ
   ニターされる請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 近位尿細管におけるナトリウム輸送のレベルが測定され、対
   照を超える該レベルの低下が高血圧症を治療するのに有用な薬物を示す請求項４
   記載の方法。
8. 【請求項８】 遠位ネフロンにおけるナトリウムチャンネルの活性が測定さ
   れ、対照を超える該レベルの低下が高血圧症を治療するのに有用な薬物を示す請
   求項４記載の方法。
9. 【請求項９】 遠位ネフロンにおけるアンジオテンシン−Ｉ受容体の密度が
   測定される請求項４記載の方法。
10. 【請求項１０】 さらに、該候補薬物が、該動物の（ａ）血圧、（ｂ）血漿
    容量または（ｃ）尿中のアンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン−Ｉ、アン
    ジオテンシン−ＩＩ、デス−アンジオテンシン−Ｉ−アンジオテンシノーゲンま
    たはレニンの量を測定することによって、無傷の動物レベルにて試験される請求
    項３ないし９のいずれか１記載の方法。