JP2002522015A - カルシニューリン活性付与モジュレータのスクリーニング方法 - Google Patents
カルシニューリン活性付与モジュレータのスクリーニング方法Info
- Publication number
- JP2002522015A JP2002522015A JP2000561309A JP2000561309A JP2002522015A JP 2002522015 A JP2002522015 A JP 2002522015A JP 2000561309 A JP2000561309 A JP 2000561309A JP 2000561309 A JP2000561309 A JP 2000561309A JP 2002522015 A JP2002522015 A JP 2002522015A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- calcineurin
- superoxide dismutase
- cuznsod
- activity
- modulator
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4728—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Interface Circuits In Exchanges (AREA)
- Burglar Alarm Systems (AREA)
- Measuring Fluid Pressure (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
カルシニューリンおよびスーパーオキシドジスムターゼ間の相互作用を利用した、カルシニューリンのモジュレータのスクリーニング方法について述べる。カルシニューリンのモジュレータは、薬剤、例えば免疫抑制薬剤用の潜在的存在と言える。カルシニューリンおよびスーパーオキシドジスムターゼとからなる複合体の形成はカルシニューリンの潜在活性剤または抑制剤の存在下で測定監視可能である。複合体は適合した発現ベクターを用いることにより細胞内で形成される。または実験室内では単離蛋白質を用いて得られる。好ましくは、複合体の形成は蛍光検出により、特にレーザーによる揺らぎ相関分光分析を用いて監視できる。
Description
【０００１】 この発明はカルシニューリン用のモジュレータのスクリーニング方法に関す
る。
る。
【０００２】 カルシニューリン（Ｅ．Ｃ． ３．１．３．１６）は、セリン／スレオニン リ
ン蛋白質のホスファターゼの一種であり、触媒（カルシニューリンＡ）および調
整（カルシニューリンＢ）のサブユニットから成る（それぞれ約６０ｋＤａと約
１８ｋＤａ）。哺乳類にあっては、触媒サブユニットとしては３種の遺伝子（Ａ
−α、Ａ−β、Ａ−γ）が明確に特徴付けられており、そのサブユニットのそれ
ぞれは代替スプライシングを行い、更なる変種を生成している。この３種の遺伝
子全てに対してｍＲＮＡは、大部の組織中に発現するように思われるが、脳中に
支配的に優勢を保つのは二種のアイソフォーム（Ａ−αおよびＡ−β）とされて
いる。
ン蛋白質のホスファターゼの一種であり、触媒（カルシニューリンＡ）および調
整（カルシニューリンＢ）のサブユニットから成る（それぞれ約６０ｋＤａと約
１８ｋＤａ）。哺乳類にあっては、触媒サブユニットとしては３種の遺伝子（Ａ
−α、Ａ−β、Ａ−γ）が明確に特徴付けられており、そのサブユニットのそれ
ぞれは代替スプライシングを行い、更なる変種を生成している。この３種の遺伝
子全てに対してｍＲＮＡは、大部の組織中に発現するように思われるが、脳中に
支配的に優勢を保つのは二種のアイソフォーム（Ａ−αおよびＡ−β）とされて
いる。
【０００３】 カルシニューリンは、人間を含めた種々の有機体からクローンとして作り出さ
れる（Guerini他、１９８９）、（GueriniおよびKlee、１９８９）、（Kincaid
他、１９９１）、（Kuno他、１９８９）、（Ito他、１９８９）、（Muramatsuお
よびKincaid、１９９３発表）。その結晶構造の示す所によればカルシニューリ
ンＡにはその酵素機能が不明とされる二核金属中心部を含んでいると言う（Grif
fith他、１９９５年報告）。微生物やＳＦ９−細胞中でのラット カルシニュー
リンＡ サブユニットの組換え体発現は、効率的なもので無く弱い酵素活性を示
すに過ぎなかったが、その理由としてはカルシニューリンＡが、カルシニューリ
ンＢの非存在下では安定でないことが挙げられる（Perrino他、１９９２）、（P
errino他、１９９５）、（HaddyおよびRunsnack、１９９４発表）。カルシニュ
ーリンＡおよびカルシウム結合サブユニットのカルシニューリンＢの共発現のも
とでは、一層安定で活性を示す酵素が見出されている（Mondragon他、１９９７
年報告）。カルシニューリンは種々の神経細胞の信号通路に関係することが示さ
れているが（Klee他、１９８８年）、（yakel、１９９７）、神経細胞の機能は
僅か理解されているに過ぎない（Guerini、１９９７）。
れる（Guerini他、１９８９）、（GueriniおよびKlee、１９８９）、（Kincaid
他、１９９１）、（Kuno他、１９８９）、（Ito他、１９８９）、（Muramatsuお
よびKincaid、１９９３発表）。その結晶構造の示す所によればカルシニューリ
ンＡにはその酵素機能が不明とされる二核金属中心部を含んでいると言う（Grif
fith他、１９９５年報告）。微生物やＳＦ９−細胞中でのラット カルシニュー
リンＡ サブユニットの組換え体発現は、効率的なもので無く弱い酵素活性を示
すに過ぎなかったが、その理由としてはカルシニューリンＡが、カルシニューリ
ンＢの非存在下では安定でないことが挙げられる（Perrino他、１９９２）、（P
errino他、１９９５）、（HaddyおよびRunsnack、１９９４発表）。カルシニュ
ーリンＡおよびカルシウム結合サブユニットのカルシニューリンＢの共発現のも
とでは、一層安定で活性を示す酵素が見出されている（Mondragon他、１９９７
年報告）。カルシニューリンは種々の神経細胞の信号通路に関係することが示さ
れているが（Klee他、１９８８年）、（yakel、１９９７）、神経細胞の機能は
僅か理解されているに過ぎない（Guerini、１９９７）。
【０００４】 カルシニューリンは、Ｃａ２＋とカルモジュリンのコントロール下にあって知
られる、唯一の蛋白質ホスファターゼである。Ｃａ２＋とカルモジュリンの結合
は、酵素の活性度に欠かせないものとされる。カルモジュリンは触媒サブユニッ
トにより連結される一方、調整サブユニットでは四つのＣａ２＋の結合部位を保
有している。
られる、唯一の蛋白質ホスファターゼである。Ｃａ２＋とカルモジュリンの結合
は、酵素の活性度に欠かせないものとされる。カルモジュリンは触媒サブユニッ
トにより連結される一方、調整サブユニットでは四つのＣａ２＋の結合部位を保
有している。
【０００５】 カルシニューリンは免疫抑制の分野で検討されている。その結果によればカル
シニューリンは、Ｔ細胞応答に従って転写因子ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因
子）を介して働くとされている。ＮＦＡＴ蛋白質の機能は直接、カルシウムとカ
ルモジュリンに影響されるごとくカルシニューリンによりコントロールされる。
このカルシニューリンによるＮＦＡＴの活性化は、細胞質の結合蛋白質ＦＫＢＰ
により仲介される。
シニューリンは、Ｔ細胞応答に従って転写因子ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因
子）を介して働くとされている。ＮＦＡＴ蛋白質の機能は直接、カルシウムとカ
ルモジュリンに影響されるごとくカルシニューリンによりコントロールされる。
このカルシニューリンによるＮＦＡＴの活性化は、細胞質の結合蛋白質ＦＫＢＰ
により仲介される。
【０００６】 カルシニューリンの信号通路をブロックできる物資は、Ｔ細胞の活性化を抑え
る適当な材料物質であり、これにより免疫応答が阻害される。この免疫応答の抑
制は例えば拒絶歴の予防のための移植手術におけるように、重要な臨床関連性を
持っている。従って製薬目標としてのカルシニューリンの重要性は高く、カルシ
ニューリンの信号通路を閉じる製剤の開発のため、幾つかの試みが行われてい
る。この免疫抑制剤の実例としては、ＦＫ５０６（Fujisawa）およびサイクロス
ポリン（Novartis）（Liu他、１９９１年）が挙げられる。この種の抗生物質は
イムノフィリン受容体としての蛋白質（ＦＫＢＰ、サイクロフィリン）の存在下
でカルシニューリンホスファターゼの活性を抑える役割を果たす。なおこれによ
りＴ細胞の転写因子ＮＦＡＴの活性化を殺ぐことにより、免疫応答を抑制する
（Liu他、１９９２）、（Nelson他、１９９３）。ＦＫ５０６（tacrolimus）は
結合蛋白ＦＫＢＰを抑制し、これを使ってカルシニューリンのＦＫＢＰとの結合
を阻害する。従って信号通路は中断される。転写因子ＮＦＡＴは不活性化され、
Ｔ細胞の活性化は乱される。
る適当な材料物質であり、これにより免疫応答が阻害される。この免疫応答の抑
制は例えば拒絶歴の予防のための移植手術におけるように、重要な臨床関連性を
持っている。従って製薬目標としてのカルシニューリンの重要性は高く、カルシ
ニューリンの信号通路を閉じる製剤の開発のため、幾つかの試みが行われてい
る。この免疫抑制剤の実例としては、ＦＫ５０６（Fujisawa）およびサイクロス
ポリン（Novartis）（Liu他、１９９１年）が挙げられる。この種の抗生物質は
イムノフィリン受容体としての蛋白質（ＦＫＢＰ、サイクロフィリン）の存在下
でカルシニューリンホスファターゼの活性を抑える役割を果たす。なおこれによ
りＴ細胞の転写因子ＮＦＡＴの活性化を殺ぐことにより、免疫応答を抑制する
（Liu他、１９９２）、（Nelson他、１９９３）。ＦＫ５０６（tacrolimus）は
結合蛋白ＦＫＢＰを抑制し、これを使ってカルシニューリンのＦＫＢＰとの結合
を阻害する。従って信号通路は中断される。転写因子ＮＦＡＴは不活性化され、
Ｔ細胞の活性化は乱される。
【０００７】 しかし、この場合幾つかの重大な欠陥が認められ、該製剤の副作用が見られ
る。肝臓および尿管の移植用容器に伴う臨床研究において、ＦＫ５０６系の治療
と従来の治療とを比較して毒性の高まりとに関連のあることが分かっている。更
にＦＫ５０６は骨の鉱物生理学にもマイナス効果を与えている。
る。肝臓および尿管の移植用容器に伴う臨床研究において、ＦＫ５０６系の治療
と従来の治療とを比較して毒性の高まりとに関連のあることが分かっている。更
にＦＫ５０６は骨の鉱物生理学にもマイナス効果を与えている。
【０００８】 免疫応答におけるカルシニューリンの信号通路の役割の他に、カルシニューリ
ンは神経細胞内にグルタミン酸塩による毒性促進による、アポトーシス誘導作用
を示すことが知られている（Ankarcrona他、１９９６）。カルシニューリンの酵
素レベルが低いこととアルツハイマー病との間には関連があると言われている
（Ladner他、１９９６）、（Kayyali他、１９９７）。カルシニューリン抑制剤
（ＦＫ５０６、シクロスポリン）は有機体モデルにおけるテンカン発作の予防
に、効果を挙げている（Moriwaki他、１９９６）。心臓と脳において、カルシニ
ューリンはまた低酸素症つまり虚血後のストレス応答の面で主役を果たしている
（Butcher他、１９９７）、（Hashimoto他、１９９８）、（Molkentin他、１９
９８）。
ンは神経細胞内にグルタミン酸塩による毒性促進による、アポトーシス誘導作用
を示すことが知られている（Ankarcrona他、１９９６）。カルシニューリンの酵
素レベルが低いこととアルツハイマー病との間には関連があると言われている
（Ladner他、１９９６）、（Kayyali他、１９９７）。カルシニューリン抑制剤
（ＦＫ５０６、シクロスポリン）は有機体モデルにおけるテンカン発作の予防
に、効果を挙げている（Moriwaki他、１９９６）。心臓と脳において、カルシニ
ューリンはまた低酸素症つまり虚血後のストレス応答の面で主役を果たしている
（Butcher他、１９９７）、（Hashimoto他、１９９８）、（Molkentin他、１９
９８）。
【０００９】 要するに、カルシニューリンは薬剤として、特に免疫抑制剤として好適な新規
物質の開発における決定的な目標となる。前記の精製カルシニューリンと放射性
検定、またはＨＰＬＣ検定等の従来の検定作業を用いる、スクリーニング装置
（Klee、１９９１）、（Enz他、１９９４）では、適正な新規物質の開発には添
っていなかった。従って、本発明の目的はカルシニューリンの信号通路に新しい
目途の利点を備えた、カルシニューリンのモジュレータ向けの新規スクリーニン
グ装置の提供にある。この新規スクリーニング装置を用いることにより、例えば
移植外科、心臓機能検査および卒中、慢性または急性神経変性症および炎症等の
分野に関して、新規薬剤を開発することは可能となる。この目的は請求項１に基
づく方法により達せられる。発明の方法の好ましい実施例は従属クレームの２か
ら１７に示される。装置キット、ベクター、細胞およびペプチド等の発明の方法
の実施に好適な実例は、クレーム１８から２３の項に述べられている。クレーム
の全てに採用される用語は、ここに参考のため明細書の内容に対応して述べられ
ている。
物質の開発における決定的な目標となる。前記の精製カルシニューリンと放射性
検定、またはＨＰＬＣ検定等の従来の検定作業を用いる、スクリーニング装置
（Klee、１９９１）、（Enz他、１９９４）では、適正な新規物質の開発には添
っていなかった。従って、本発明の目的はカルシニューリンの信号通路に新しい
目途の利点を備えた、カルシニューリンのモジュレータ向けの新規スクリーニン
グ装置の提供にある。この新規スクリーニング装置を用いることにより、例えば
移植外科、心臓機能検査および卒中、慢性または急性神経変性症および炎症等の
分野に関して、新規薬剤を開発することは可能となる。この目的は請求項１に基
づく方法により達せられる。発明の方法の好ましい実施例は従属クレームの２か
ら１７に示される。装置キット、ベクター、細胞およびペプチド等の発明の方法
の実施に好適な実例は、クレーム１８から２３の項に述べられている。クレーム
の全てに採用される用語は、ここに参考のため明細書の内容に対応して述べられ
ている。
【００１０】 発明の方法はカルシニューリンとスーパーオキシドジスムターゼ間の生理的相
互反応が行われ、新規のスクリーニング装置の開発に適した目標が得られること
を示す結果に基づいて決まる。
互反応が行われ、新規のスクリーニング装置の開発に適した目標が得られること
を示す結果に基づいて決まる。
【００１１】 組換え体または精製のカルシニューリンまでも、酵素の二核金属中心部が酸化
還元に感度を示すＦｅ２＋を含むことが検出されるまで、何故脳の粗抽出物の僅
か１から２％の比活性度を示したかが、長い期間分からなかった（Yu他、１９９
７年）。カルシウムが活性化された後、または精製操作の過程でＦｅ２＋が酸素
化学種により酸化され、酵素を不活性化させていたのである（Stemmer他、１９
９５）、（Wang他、１９９６）。
還元に感度を示すＦｅ２＋を含むことが検出されるまで、何故脳の粗抽出物の僅
か１から２％の比活性度を示したかが、長い期間分からなかった（Yu他、１９９
７年）。カルシウムが活性化された後、または精製操作の過程でＦｅ２＋が酸素
化学種により酸化され、酵素を不活性化させていたのである（Stemmer他、１９
９５）、（Wang他、１９９６）。
【００１２】 最近になって、銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎＳＯＤ，Ｅ
Ｃ．１．１５．１．１）が、カルシニューリンを酸化による不活性化から保護す
ることがわかった。カルシニューリンのホスファターゼ活性は、カルシウム、カ
ルモジュリンの存在に強く依存する。カルモジュリンの存在下でＣａ２＋を加え
ると、活性度は飛躍的に増大する。しかし、数分下にこれを放置するとこの活性
度は失われる。なお銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの添加により、この
活性度を維持することができる。
Ｃ．１．１５．１．１）が、カルシニューリンを酸化による不活性化から保護す
ることがわかった。カルシニューリンのホスファターゼ活性は、カルシウム、カ
ルモジュリンの存在に強く依存する。カルモジュリンの存在下でＣａ２＋を加え
ると、活性度は飛躍的に増大する。しかし、数分下にこれを放置するとこの活性
度は失われる。なお銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの添加により、この
活性度を維持することができる。
【００１３】 スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、超酸化物の陰イオン（過酸化
物）をハイドロ過酸化物と分子状酸素にまで不均化させる。この酵素には二つの
形状が考えられる。マンガンを含むミトコンドリア型と銅および亜鉛を含む細胞
質型とがそれである。通常、スーパーオキシドジスムターゼは、ラジカル群の捕
捉役と見做され、活性酸素種の解毒分野で検討される。従ってWang他で見出され
たカルシニューリンの活性度の保護で使われるスーパーオキシドジスムターゼの
役割は、このスーパーオキシドジスムターゼの一般酸化還元機能の結果として考
えられる。ここで発明者の驚くべき結果から、カルシニューリンとスーパーオキ
シドジスムターゼの間に生理学的相互作用が行われるとの考え方が導かれる。酵
素機能を欠く銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの幾つかの突然変異体が、
カルシニューリンの活性度に保護作用を示したことになる。その意味はＣｕＺｎ
ＳＯＤ効果は酸化還元制御に当って、スーパーオキシドジスムターゼの機能によ
るものではないことを指している。この結果の教える所は、スーパーオキシドジ
スムターゼは生理学的にカルシニューリンと相互作用すること、およびＣｕＺｎ
ＳＯＤがカルシニューリン通路の一つの成分要素であり、このことはカルシニュ
ーリンの生理的機能として重要であることを示している。
物）をハイドロ過酸化物と分子状酸素にまで不均化させる。この酵素には二つの
形状が考えられる。マンガンを含むミトコンドリア型と銅および亜鉛を含む細胞
質型とがそれである。通常、スーパーオキシドジスムターゼは、ラジカル群の捕
捉役と見做され、活性酸素種の解毒分野で検討される。従ってWang他で見出され
たカルシニューリンの活性度の保護で使われるスーパーオキシドジスムターゼの
役割は、このスーパーオキシドジスムターゼの一般酸化還元機能の結果として考
えられる。ここで発明者の驚くべき結果から、カルシニューリンとスーパーオキ
シドジスムターゼの間に生理学的相互作用が行われるとの考え方が導かれる。酵
素機能を欠く銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの幾つかの突然変異体が、
カルシニューリンの活性度に保護作用を示したことになる。その意味はＣｕＺｎ
ＳＯＤ効果は酸化還元制御に当って、スーパーオキシドジスムターゼの機能によ
るものではないことを指している。この結果の教える所は、スーパーオキシドジ
スムターゼは生理学的にカルシニューリンと相互作用すること、およびＣｕＺｎ
ＳＯＤがカルシニューリン通路の一つの成分要素であり、このことはカルシニュ
ーリンの生理的機能として重要であることを示している。
【００１４】 上記結果を用いてカルシニューリンのモジュレータ用の新規スクリーニング装
置を開発し、カルシニューリンの抑制剤または活性剤を見出すようにする。発明
の方法は、この生理的相互範囲の見込まれるモジュレータの存在のもとで、カル
シニューリンとスーパーオキシドジスムターゼ間に複合体を形成させることにあ
る。見込まれるモジュレータが複合体の形成を乱すことがあれば、この物質はカ
ルシニューリンの信号通路を抑制する優れた役割を担い、恐らく例えば免疫抑制
剤として使うことができるであろう。これに対して複合体の形成を促進し、これ
によりカルシニューリンの信号通路、例えば結果としてＴ細胞応答を促進させる
物質を識別できれば好都合と考えられるであろう。この種物質を用いて免疫応答
を強めることもできよう。「モジュレータ」と言う言葉の意味は、発明の方法に
関しての複合体の形成に影響を及ぼす何れの物質をも指している。更にはカルシ
ニューリンとその基質、例えばペプチドＲＩＩとの間の相互反応に影響する何れ
の物質であっても良い。更にはまた、スーパーオキシドジスムターゼおよび／ま
たはカルシニューリンが、転写、翻訳および／または翻訳後のレベルに影響を与
える何の物質をも指すものとする。
置を開発し、カルシニューリンの抑制剤または活性剤を見出すようにする。発明
の方法は、この生理的相互範囲の見込まれるモジュレータの存在のもとで、カル
シニューリンとスーパーオキシドジスムターゼ間に複合体を形成させることにあ
る。見込まれるモジュレータが複合体の形成を乱すことがあれば、この物質はカ
ルシニューリンの信号通路を抑制する優れた役割を担い、恐らく例えば免疫抑制
剤として使うことができるであろう。これに対して複合体の形成を促進し、これ
によりカルシニューリンの信号通路、例えば結果としてＴ細胞応答を促進させる
物質を識別できれば好都合と考えられるであろう。この種物質を用いて免疫応答
を強めることもできよう。「モジュレータ」と言う言葉の意味は、発明の方法に
関しての複合体の形成に影響を及ぼす何れの物質をも指している。更にはカルシ
ニューリンとその基質、例えばペプチドＲＩＩとの間の相互反応に影響する何れ
の物質であっても良い。更にはまた、スーパーオキシドジスムターゼおよび／ま
たはカルシニューリンが、転写、翻訳および／または翻訳後のレベルに影響を与
える何の物質をも指すものとする。
【００１５】 発明の方法で使われるカルシニューリンは、調整サブユニットＡおよび触媒サ
ブユニットＢで構成されるものである。カルシニューリンが生理的活性を示すた
めには、両サブユニットの存在は欠かせない。しかし、これらサブユニットの一
つだけを用いて発明の方法を実施することもできる。ここでサブユニットのカル
シニューリンＢ構成のカルシニューリンの幾つかのアイソフォーム、およびサブ
ユニットのカルシニューリンＡ−α、Ａ−β、およびＡ−γから構成されるグル
ープの中からの一つのアイソフォームも存在する。それぞれのアイソフォームは
特殊な細胞および組織に特異的な分布を示している。従ってアイソフォームの選
定はスクリーンされる物質の細胞および組織における特異性が決定的な要件と言
える。スクリーンされる物質の臨床適用については、できれば人体の蛋白質を採
用する。
ブユニットＢで構成されるものである。カルシニューリンが生理的活性を示すた
めには、両サブユニットの存在は欠かせない。しかし、これらサブユニットの一
つだけを用いて発明の方法を実施することもできる。ここでサブユニットのカル
シニューリンＢ構成のカルシニューリンの幾つかのアイソフォーム、およびサブ
ユニットのカルシニューリンＡ−α、Ａ−β、およびＡ−γから構成されるグル
ープの中からの一つのアイソフォームも存在する。それぞれのアイソフォームは
特殊な細胞および組織に特異的な分布を示している。従ってアイソフォームの選
定はスクリーンされる物質の細胞および組織における特異性が決定的な要件と言
える。スクリーンされる物質の臨床適用については、できれば人体の蛋白質を採
用する。
【００１６】 更に好ましいのは、発明の方法をカルモジュリンおよびカルシウムの存在下で
実施することであるが、その理由としてはカルシニューリンの活性が上記要素に
よることが挙げられる。好ましくは銅および亜鉛含有の細胞質型スーパーオキシ
ドジスムターゼを複合体の形成に利用するが、理由としては例えば通常マンガン
含有のミトコンドリア型スーパーオキシドジスムターゼの相互作用は、生理的条
件のもとでは生じないことによる。複合体の形成は少なくとも一つの予期され
る、カルシニューリンのモジュレータまたはカルシニューリンの信号通路のそれ
ぞれの存在下で行われる。カルシニューリンＡ、カルシニューリンＢ、スーパー
オキシドジスムターゼおよび好ましくはカルモジュリンの複合体は、複合体を安
定性を示すかまたは不安定するかする予期されるモジュレータの目標となる。
実施することであるが、その理由としてはカルシニューリンの活性が上記要素に
よることが挙げられる。好ましくは銅および亜鉛含有の細胞質型スーパーオキシ
ドジスムターゼを複合体の形成に利用するが、理由としては例えば通常マンガン
含有のミトコンドリア型スーパーオキシドジスムターゼの相互作用は、生理的条
件のもとでは生じないことによる。複合体の形成は少なくとも一つの予期され
る、カルシニューリンのモジュレータまたはカルシニューリンの信号通路のそれ
ぞれの存在下で行われる。カルシニューリンＡ、カルシニューリンＢ、スーパー
オキシドジスムターゼおよび好ましくはカルモジュリンの複合体は、複合体を安
定性を示すかまたは不安定するかする予期されるモジュレータの目標となる。
【００１７】 できれば複合体の形成を全プロセスの期間中に測定する方が有効である。複合
体の形成が行われる前後にモジュレータを加えても良い。望ましくは複合体の完
成前にモジュレータを加えるが、それは弱いモジュレータの活性は、複合体の形
成が既に終わった時点では恐らく測定できぬことによる。
体の形成が行われる前後にモジュレータを加えても良い。望ましくは複合体の完
成前にモジュレータを加えるが、それは弱いモジュレータの活性は、複合体の形
成が既に終わった時点では恐らく測定できぬことによる。
【００１８】 原則として、複合体の形成の監視には二通り考えられる。その一つは複合体中
の標識物質を使って、好ましくは蛍光検出により直接複合体の形成を測定するこ
とである。もう一方は、複合体の活性度特にカルシニューリンの酵素活性度を使
って、複合体の形成を測ることである。この第二の方法は第一の方法に加えてま
たはその代案として、行って良い。この発明の方法が、複合体の形成に及ぼすモ
ジュレータの影響を検知する方法に限らぬことは勿論である。
の標識物質を使って、好ましくは蛍光検出により直接複合体の形成を測定するこ
とである。もう一方は、複合体の活性度特にカルシニューリンの酵素活性度を使
って、複合体の形成を測ることである。この第二の方法は第一の方法に加えてま
たはその代案として、行って良い。この発明の方法が、複合体の形成に及ぼすモ
ジュレータの影響を検知する方法に限らぬことは勿論である。
【００１９】 発明の好ましい実施例によれば、少なくとも一つの見込まれるモジュレータ構
成の物質混合物を、発明の方式に準じて分析する。相互作用の予想されるモジュ
レータと合わせて複合体を単離することにより、混合物からモジュレータを分離
し、通常の方法を使ってこれを同定することができる。
成の物質混合物を、発明の方式に準じて分析する。相互作用の予想されるモジュ
レータと合わせて複合体を単離することにより、混合物からモジュレータを分離
し、通常の方法を使ってこれを同定することができる。
【００２０】 発明の好ましい一実施例によれば、カルシニューリンおよび／またはスーパー
オキシドジスムターゼを標識化する。特に蛍光標識の利用が好ましいとされる。
できれば標識化蛋白質は蛍光蛋白質、例えば強力な緑蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）構
成の融合蛋白質が望ましい。この種融合蛋白質は遺伝子工学方法で得られる。ま
た該蛋白質は当業者に知られる別方法、例えばこの蛋白質に組み入れた放射性同
位元素を用いて標識できる。
オキシドジスムターゼを標識化する。特に蛍光標識の利用が好ましいとされる。
できれば標識化蛋白質は蛍光蛋白質、例えば強力な緑蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）構
成の融合蛋白質が望ましい。この種融合蛋白質は遺伝子工学方法で得られる。ま
た該蛋白質は当業者に知られる別方法、例えばこの蛋白質に組み入れた放射性同
位元素を用いて標識できる。
【００２１】 好ましくは複合体の成分、即ちカルシニューリンおよびスーパーオキシドジス
ムターゼを蛍光融合蛋白質として、細胞中特に真核生物細胞に発現させる。レー
ザー彷徨変異相関分光器を使って、標識化蛋白質の複合体形成を直接細胞内で測
定する本発明のこの態様については、実施例で更に詳細を記載している。発明で
は真核生物細胞にカルシニューリンおよび／またはスーパーオキシドジスムター
ゼの発現に有用な幾つかのベクターを含んでいる。このベクターを使って蛋白
質、特にＣｕＺｎＳＯＤおよびカルシニューリンの異なるサブユニットを蛍光蛋
白質ＥＧＦＰ（緑蛍光蛋白質）と共に融合蛋白質として符号化する。ＥＧＦＰは
発明の方法について有用な標識の一例に過ぎない。さらに、発明には細胞、特に
上記のベクターと安定して感染された、真核生物細胞を保有しておりこれにより
スーパーオキシドジスムターゼおよびまたはカルシニューリンが発現されてい
る。好ましくは、この種の蛋白質は共発現されている。即ち同一細胞内に発現さ
れている。
ムターゼを蛍光融合蛋白質として、細胞中特に真核生物細胞に発現させる。レー
ザー彷徨変異相関分光器を使って、標識化蛋白質の複合体形成を直接細胞内で測
定する本発明のこの態様については、実施例で更に詳細を記載している。発明で
は真核生物細胞にカルシニューリンおよび／またはスーパーオキシドジスムター
ゼの発現に有用な幾つかのベクターを含んでいる。このベクターを使って蛋白
質、特にＣｕＺｎＳＯＤおよびカルシニューリンの異なるサブユニットを蛍光蛋
白質ＥＧＦＰ（緑蛍光蛋白質）と共に融合蛋白質として符号化する。ＥＧＦＰは
発明の方法について有用な標識の一例に過ぎない。さらに、発明には細胞、特に
上記のベクターと安定して感染された、真核生物細胞を保有しておりこれにより
スーパーオキシドジスムターゼおよびまたはカルシニューリンが発現されてい
る。好ましくは、この種の蛋白質は共発現されている。即ち同一細胞内に発現さ
れている。
【００２２】 特に好ましい実施例においては、融合蛋白質に関連の遺伝情報は相同組換えに
より細胞中に組み込まれている。このことは組換え蛋白質特に蛍光融合蛋白質を
符号化した遺伝子を、自然発生の遺伝子に替えて細胞のゲノム中に組み込むこと
を意味するものである。このことにより本質的に自然の蛋白質を欠く細胞が得ら
れる。この細胞を使うことにより、発明の方法によるモジュレータを確認するこ
とができ、この方法によればカルシニューリンおよび／またはスーパーオキシド
ジスムターゼ発現の転写、翻訳または翻訳後レベルに影響を与えることができ
る。
より細胞中に組み込まれている。このことは組換え蛋白質特に蛍光融合蛋白質を
符号化した遺伝子を、自然発生の遺伝子に替えて細胞のゲノム中に組み込むこと
を意味するものである。このことにより本質的に自然の蛋白質を欠く細胞が得ら
れる。この細胞を使うことにより、発明の方法によるモジュレータを確認するこ
とができ、この方法によればカルシニューリンおよび／またはスーパーオキシド
ジスムターゼ発現の転写、翻訳または翻訳後レベルに影響を与えることができ
る。
【００２３】 発明の方法の別実施例によれば、錯複合体の成分は実験室中で複合体の形成に
先立ち分離され、好ましくは精製される。好都合な場合には蛋白質はタグを付け
て提供し、精製し易くする。例えばヒスチジン（ｈｉｓ）タグは幾つかの一連ヒ
スチジンの配列から成り、この場合既知の手順を使ってアフィニティ精製を行う
ことができる。これらのベクターは原核生物の発現ベクターとして特に有用であ
る。なお、発明にはこの種ベクターを伴う細胞構成としている。
先立ち分離され、好ましくは精製される。好都合な場合には蛋白質はタグを付け
て提供し、精製し易くする。例えばヒスチジン（ｈｉｓ）タグは幾つかの一連ヒ
スチジンの配列から成り、この場合既知の手順を使ってアフィニティ精製を行う
ことができる。これらのベクターは原核生物の発現ベクターとして特に有用であ
る。なお、発明にはこの種ベクターを伴う細胞構成としている。
【００２４】 効果的と見られるものの内、ヒスチジンタグ付き蛋白質の精製によれば、タグ
は適当な酵素消化により取り除かれる。例えばそれにはカルボキシペプチダーゼ
−Ａのカテプシン−Ｃを使って行われる。特に望まれるのは鉄−ニトリロトリア
セタート−金属（Ｆｅ−ＮＴＡ）によるアフィニティクロマトグラフィーによる
カルシニューリンの精製、および銅／−亜鉛−ニトリロトリアセタート−金属
（ＣｕＺｎ−ＮＴＡ）によるアフィニティクロマトグラフィーを使ったスーパー
オキシドジスムターゼの精製である。しかし、当業者に知られる別の精製手順も
採用可能である。自然発生と目される蛋白質も発明方式に用いられる。
は適当な酵素消化により取り除かれる。例えばそれにはカルボキシペプチダーゼ
−Ａのカテプシン−Ｃを使って行われる。特に望まれるのは鉄−ニトリロトリア
セタート−金属（Ｆｅ−ＮＴＡ）によるアフィニティクロマトグラフィーによる
カルシニューリンの精製、および銅／−亜鉛−ニトリロトリアセタート−金属
（ＣｕＺｎ−ＮＴＡ）によるアフィニティクロマトグラフィーを使ったスーパー
オキシドジスムターゼの精製である。しかし、当業者に知られる別の精製手順も
採用可能である。自然発生と目される蛋白質も発明方式に用いられる。
【００２５】 カルシニューリンおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼＮｉ（ニッケ
ル）−ＮＴＡの精製に使用する以外に、Ｆｅ−ＮＴＡおよび／またはＣｕ／Ｚｎ
−ＮＴＡを用いて、ヒスチジンタグのカルシニューリンおよび／またはスーパー
オキシドジスムターゼを固定化させ、この発明によるマトリックスを使ってこれ
ら蛋白質の自然派生のリガンドを単離する。「リガンド」の用語を用いて低分子
量または高分子量の内在性、外因性または該蛋白質と反応する合成物質を意味付
けている。このリガンドはペプチド、蛋白質、カルボヒドラート、脂質、核酸ま
たは例えば合成ポリマーであっても良い。このように識別された配位子はカルシ
ニューリンの信号通路のモジュレータ用の候補物質と成り得る。
ル）−ＮＴＡの精製に使用する以外に、Ｆｅ−ＮＴＡおよび／またはＣｕ／Ｚｎ
−ＮＴＡを用いて、ヒスチジンタグのカルシニューリンおよび／またはスーパー
オキシドジスムターゼを固定化させ、この発明によるマトリックスを使ってこれ
ら蛋白質の自然派生のリガンドを単離する。「リガンド」の用語を用いて低分子
量または高分子量の内在性、外因性または該蛋白質と反応する合成物質を意味付
けている。このリガンドはペプチド、蛋白質、カルボヒドラート、脂質、核酸ま
たは例えば合成ポリマーであっても良い。このように識別された配位子はカルシ
ニューリンの信号通路のモジュレータ用の候補物質と成り得る。
【００２６】 実験室で複合体を形成させる場合、反応用としてカルモジュリンおよび／また
はカルシウムを添加すると好都合であるが、その理由としてはカルシニューリン
の酵素活性を高めるのに、これらの要因が必要となるためである。
はカルシウムを添加すると好都合であるが、その理由としてはカルシニューリン
の酵素活性を高めるのに、これらの要因が必要となるためである。
【００２７】 発明の別途好ましい実施例としては、カルシニューリンの酵素活性を測ること
により、複合体の形成の間接的な監視が挙げられる。先に概要説明したごとく、
カルシニューリンのホスファターゼ活性度は、厳密にスーパーオキシドジスムタ
ーゼとの相互作用により影響される。従って標準手順に基づきホスファターゼ活
性度を測定することにより、複合体の形成を間接的に監視できる。前記に準じた
蛍光測定の実験装置が利用できない場合は、上記条件は特に好都合とされる。さ
らに、蛍光検出方式に加えてレーザー彷徨変異相関分光器を例えば対照用とし
て、酵素分析操作を用いることができる。
により、複合体の形成の間接的な監視が挙げられる。先に概要説明したごとく、
カルシニューリンのホスファターゼ活性度は、厳密にスーパーオキシドジスムタ
ーゼとの相互作用により影響される。従って標準手順に基づきホスファターゼ活
性度を測定することにより、複合体の形成を間接的に監視できる。前記に準じた
蛍光測定の実験装置が利用できない場合は、上記条件は特に好都合とされる。さ
らに、蛍光検出方式に加えてレーザー彷徨変異相関分光器を例えば対照用とし
て、酵素分析操作を用いることができる。
【００２８】 好ましいこととして、カルシニューリンの標識基質を用いて酵素活性度が測れ
る。この基質は蛍光を使って標識するのが良い。特に望ましい基質の一つとして
次のシーケンス特徴を示す、ペプチドＲＩＩが挙げられる： Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ 好ましい実施態様としては、このペプチドに１５番目のセリンで、蛍光標識を
持たせる。このアミノ酸はペプチドをフルオレセン−ホスホアミデイトを使って
培養することにより、フルオレセンで標識し、これにより標識化基質（ＲＩＩ−
フルオホス）が得られる。ＲＩＩはカルシニューリンの活性中心と相互作用する
が、このものはホスファターゼで転移されない。この結果、活性状態でカルシニ
ューリンを標識することができる。なお、ＲＩＩ−フルオホスをフルオレセンの
半量について下図のチロシン残基部分でリン酸化することができる。このリン酸
化により、ＲＩＩ−フルオホスはその蛍光を失い、ホスファターゼ基質がこれに
より得られ、この基質は脱リン酸化に引き続き蛍光態となる。
る。この基質は蛍光を使って標識するのが良い。特に望ましい基質の一つとして
次のシーケンス特徴を示す、ペプチドＲＩＩが挙げられる： Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ 好ましい実施態様としては、このペプチドに１５番目のセリンで、蛍光標識を
持たせる。このアミノ酸はペプチドをフルオレセン−ホスホアミデイトを使って
培養することにより、フルオレセンで標識し、これにより標識化基質（ＲＩＩ−
フルオホス）が得られる。ＲＩＩはカルシニューリンの活性中心と相互作用する
が、このものはホスファターゼで転移されない。この結果、活性状態でカルシニ
ューリンを標識することができる。なお、ＲＩＩ−フルオホスをフルオレセンの
半量について下図のチロシン残基部分でリン酸化することができる。このリン酸
化により、ＲＩＩ−フルオホスはその蛍光を失い、ホスファターゼ基質がこれに
より得られ、この基質は脱リン酸化に引き続き蛍光態となる。
【００２９】
【数１】 このペプチドは合成方式で得られるか、または細胞−特に真核生物細胞により
発現され、この細胞は該ペプチドまたはホスファターゼ基質として有用な別のペ
プチドを符号化する、適当なベクターを使って移植される。発明の一実施例のも
とでは、蛍光ペプチドは蛍光顕微鏡分析では、ペプチド標識として使用される。
カルシニューリン／過酸化物複合体の活性状態を分析するには、別の方法が用い
られる。
発現され、この細胞は該ペプチドまたはホスファターゼ基質として有用な別のペ
プチドを符号化する、適当なベクターを使って移植される。発明の一実施例のも
とでは、蛍光ペプチドは蛍光顕微鏡分析では、ペプチド標識として使用される。
カルシニューリン／過酸化物複合体の活性状態を分析するには、別の方法が用い
られる。
【００３０】 上記した発明の方法はカルシニューリンの信号通路の抑制剤および／または活
性剤を確認する、高容量の生物検定開発用として好適である。その詳細は実施例
で記載する。
性剤を確認する、高容量の生物検定開発用として好適である。その詳細は実施例
で記載する。
【００３１】 発明には急性および／または慢性のアルツハイマー、パーキンソン、てんかん
（顛癇）、虚血および心筋不全等の神経性および心臓脈管性病気の治療用とし
て、カルシニューリン信号通路の抑制剤または活性剤の使用が含まれている。さ
らに免疫抑制剤としての使用、例えば移植外科および炎症等の分野におけるその
利用も含まれている。
（顛癇）、虚血および心筋不全等の神経性および心臓脈管性病気の治療用とし
て、カルシニューリン信号通路の抑制剤または活性剤の使用が含まれている。さ
らに免疫抑制剤としての使用、例えば移植外科および炎症等の分野におけるその
利用も含まれている。
【００３２】 最後に発明にはカルシニューリン向けのモジュレータのスクリーニングキット
についても包含されている。このキットにはカルシニューリンおよびスーパーオ
キシドジスムターゼのごとき、上記のカルシニューリン向けモジュレータのスク
リーニング用として錯複合体の形成を可能とする、物質を備えている。このキッ
トの第一実施例ではこの複合体の成分が蛋白質として提供されている。このキッ
ト装置は実験室用として発明の方法の実施に適している。キットの第二実施例と
しては、蛋白質がベクター形状で提供されている。このベクターは細胞中で形質
転換／感染されるべきもので、発現蛋白質を与える。これらベクターは原核また
は真核生物発現ベクターをそれぞれ形成し、実験室での検定用としてまたは上記
の完全細胞を用いる検定用としての蛋白質の製造に用いることができる。該ベク
ターを使って変形させ、感染させた発明のキット細胞の第三の実施例において
は、ユーザに対しての形質転換／感染段階の節減が示されている。この発明のキ
ットの詳細については、上記内容を参照されたい。
についても包含されている。このキットにはカルシニューリンおよびスーパーオ
キシドジスムターゼのごとき、上記のカルシニューリン向けモジュレータのスク
リーニング用として錯複合体の形成を可能とする、物質を備えている。このキッ
トの第一実施例ではこの複合体の成分が蛋白質として提供されている。このキッ
ト装置は実験室用として発明の方法の実施に適している。キットの第二実施例と
しては、蛋白質がベクター形状で提供されている。このベクターは細胞中で形質
転換／感染されるべきもので、発現蛋白質を与える。これらベクターは原核また
は真核生物発現ベクターをそれぞれ形成し、実験室での検定用としてまたは上記
の完全細胞を用いる検定用としての蛋白質の製造に用いることができる。該ベク
ターを使って変形させ、感染させた発明のキット細胞の第三の実施例において
は、ユーザに対しての形質転換／感染段階の節減が示されている。この発明のキ
ットの詳細については、上記内容を参照されたい。
【００３３】 カルシニューリン／ＣｕＺｎＳＯＤ抑制剤の新規物質クラスを確認するための
新規アプローチには特に以下の項目が含まれる： −薬剤のスクリーニングに適当な酸化安定酵素を得るためのＣｕＺｎＳＯＤ／カ
ルシニューリンＡおよびカルシニューリンＢの共発現、 −酵素の活性度を保有するためＣｕＺｎ−ニトリロトリアセタート−金属アフィ
ニティクロマトグラフィーに関する、ＣｕＺｎＳＯＤの効果的な精製法、 −酵素活性を維持し、Ｆｅ２＋の酸化を抑制するための、Ｆｅ−ニトリロトリア
セタート−金属アフィニティクロマトグラフィーに関する、カルシニューリンの
効果的な精製法、 −神経性疾患（筋萎縮性側索硬化症）に関連したＣｕＺｎＳＯＤ中の突然変異
が、同じくカルシニューリン−ＣｕＺｎＳＯＤの相互反応にとって極めて重要な
ことの確認、 −ＣｕＺｎＳＯＤ／カルシニューリン活性剤または抑制剤用としてスクリーンす
るための、蛍光標識化組換えＣｕＺｎＳＯＤと、カルシニューリンの蛍光標識化
物質の使用、 −カルシニューリン活性剤または抑制剤用にスクリーンするための蛍光標識化Ｒ
ＩＩ−ペプチドおよびカルシニューリンの使用、 −アフィニティリガンドとして組換え酵素を用い、天然源からの新規薬剤を精製
するため、カルシニューリン／ＣｕＺｎＳＯＤ抑制剤または活性剤の確認、 −あらゆるアイソフォーム、あらゆる既知のおよび二つの新規同定されたスクリ
ーニング操作中のスプライシング変異体の包含、この操作手順により比較的低毒
性の特殊組織薬剤を認定することができ、この薬剤は各種の臨床前兆の治療用と
して一層適当したものである。
新規アプローチには特に以下の項目が含まれる： −薬剤のスクリーニングに適当な酸化安定酵素を得るためのＣｕＺｎＳＯＤ／カ
ルシニューリンＡおよびカルシニューリンＢの共発現、 −酵素の活性度を保有するためＣｕＺｎ−ニトリロトリアセタート−金属アフィ
ニティクロマトグラフィーに関する、ＣｕＺｎＳＯＤの効果的な精製法、 −酵素活性を維持し、Ｆｅ２＋の酸化を抑制するための、Ｆｅ−ニトリロトリア
セタート−金属アフィニティクロマトグラフィーに関する、カルシニューリンの
効果的な精製法、 −神経性疾患（筋萎縮性側索硬化症）に関連したＣｕＺｎＳＯＤ中の突然変異
が、同じくカルシニューリン−ＣｕＺｎＳＯＤの相互反応にとって極めて重要な
ことの確認、 −ＣｕＺｎＳＯＤ／カルシニューリン活性剤または抑制剤用としてスクリーンす
るための、蛍光標識化組換えＣｕＺｎＳＯＤと、カルシニューリンの蛍光標識化
物質の使用、 −カルシニューリン活性剤または抑制剤用にスクリーンするための蛍光標識化Ｒ
ＩＩ−ペプチドおよびカルシニューリンの使用、 −アフィニティリガンドとして組換え酵素を用い、天然源からの新規薬剤を精製
するため、カルシニューリン／ＣｕＺｎＳＯＤ抑制剤または活性剤の確認、 −あらゆるアイソフォーム、あらゆる既知のおよび二つの新規同定されたスクリ
ーニング操作中のスプライシング変異体の包含、この操作手順により比較的低毒
性の特殊組織薬剤を認定することができ、この薬剤は各種の臨床前兆の治療用と
して一層適当したものである。
【００３４】 記載した発明の特長およびその他特長は、サブクレームと組み合わせた実施例
から可成り詳細に得られる。その特長は相互に組合せるか、または単独に実現す
ることができる。
から可成り詳細に得られる。その特長は相互に組合せるか、または単独に実現す
ることができる。
【００３５】 実施例 １．ヒトの脳のポリ−Ａ−ＲＮＡから転写されたＣｕＺｎＳＯＤのクローニン
グ ヒトＣｕＺｎＳＯＤのクローニングをテンプレートとしてヒトの脳のポリ−Ａ
−ＲＮＡを使って逆転写ＰＣＲにより行った（Clontech, Palo Alto, CA, US
A）。オリゴヌクレオチドＳＯＤｓ１ ５’−ｔｔｃ ｃｇｔ ｔｇｃ ａｇｔ ｃｃ
ｔ ｃｇｇ ａａｃ−３’、ＳＯＤａｓ１ ５’−ｔａａ ｇｇｇ ｇｃｃ ｔｃａ
ｇａｃ ｔａｃ ａｔｃ−３’、ＳＯＤ−ＰＱＥ６０ｓ２ ５’−ｃａａ ｇｃｃ
ａｔｇ ｇｃｇ ａｃｇ ａａｇ ｇｃｃ ｇｔｇ ｔｇｃ ｇｔｇ ｃｔｇ−３’、Ｓ
ＯＤ−ＰＱＥ６０ａｓ２ ５’−ｇａａ ｇａｔ ｃｔｔ ｔｇｇ ｇｃｇ ａｔｃ
ｃｃａ ａｔｔ ａｃａ ｃｃａ ｃ−３’、ＳＯＤ−ＰＱＥ３０−Ｓ２ ５’−ｃ
ｇｃ ｇｇａ ｔｃｃ ｇｃｇ ａｃｇ ａａｇ ｇｃｃ ｇｔｇ ｔｇｃ ｇｔｇ−
３’、およびＳＯＤ−ＰＱＥ３０−ａｓ２ ５’−ｇｇｇ ｔｔｃ ｇａａ ｔｔａ
ｔｔｇ ｇｇｃ ｇａｔ ｃｃｃ ａａｔ ｔａｃ−３’はInteractiva社（Ulm、
独）の提供による。逆転写はＳＯＤａｓ１プライマーおよび１００ｎｇのポリ−
Ａ−ＲＮＡを用い製造メーカーの原案に添って行った（逆転写の拡大、Boehrrin
ger Mannheim、独）。ヒトＣｕＺｎＳＯＤ ｃＤＮＡをネストＰＣＲを使って増
幅した。第一のＰＣＲは２０μｌ中で行った。逆転写精製物の０．５μｌを使
用、ＳＯＤｓｌおよびＳＯＤａｓ１プライマーを１０μＭ使用、ｄＮＴＰｓ ３
００μＭ使用、製造メーカーの１０×ＰＣＲバッファーの内２μｌ使用、および
９５℃で１分間でＴａｑ−ポリメラーゼ２．５Ｕ使用３０サイクル、更に４５℃
１分間、７２℃で１分間、更に第二のＰＣＲ（５０μｌ）および第一ＰＣＲ製品
精製物５μｌ使用、ＳＯＤ−ＰＱＥ６０ａｓ２ｋプライマー１０μＭ使用、３０
０μＭ ｄＮＴＰｓ、５μｌのＰＣＲバッファー５μｌおよび２．５ＵのＴａｑ
−ポリメラーゼ、３０サイクル １分９５℃、１分６０℃、１分７２℃採用（Ｔ
ａｑ−ポリメラーゼ、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）。ｐＱＥ３０発現
ベクター中に分散、プライマーＳＯＤ−ＰＱＥ３０−ｓ２およびＳＯＤ−ＰＱＥ
３０−ａｓ２をＳＯＤ−ＰＱＥ６０ｓ２／ＳＯＤ−ＰＱＥ６０ａｓ２に替えて使
用。
グ ヒトＣｕＺｎＳＯＤのクローニングをテンプレートとしてヒトの脳のポリ−Ａ
−ＲＮＡを使って逆転写ＰＣＲにより行った（Clontech, Palo Alto, CA, US
A）。オリゴヌクレオチドＳＯＤｓ１ ５’−ｔｔｃ ｃｇｔ ｔｇｃ ａｇｔ ｃｃ
ｔ ｃｇｇ ａａｃ−３’、ＳＯＤａｓ１ ５’−ｔａａ ｇｇｇ ｇｃｃ ｔｃａ
ｇａｃ ｔａｃ ａｔｃ−３’、ＳＯＤ−ＰＱＥ６０ｓ２ ５’−ｃａａ ｇｃｃ
ａｔｇ ｇｃｇ ａｃｇ ａａｇ ｇｃｃ ｇｔｇ ｔｇｃ ｇｔｇ ｃｔｇ−３’、Ｓ
ＯＤ−ＰＱＥ６０ａｓ２ ５’−ｇａａ ｇａｔ ｃｔｔ ｔｇｇ ｇｃｇ ａｔｃ
ｃｃａ ａｔｔ ａｃａ ｃｃａ ｃ−３’、ＳＯＤ−ＰＱＥ３０−Ｓ２ ５’−ｃ
ｇｃ ｇｇａ ｔｃｃ ｇｃｇ ａｃｇ ａａｇ ｇｃｃ ｇｔｇ ｔｇｃ ｇｔｇ−
３’、およびＳＯＤ−ＰＱＥ３０−ａｓ２ ５’−ｇｇｇ ｔｔｃ ｇａａ ｔｔａ
ｔｔｇ ｇｇｃ ｇａｔ ｃｃｃ ａａｔ ｔａｃ−３’はInteractiva社（Ulm、
独）の提供による。逆転写はＳＯＤａｓ１プライマーおよび１００ｎｇのポリ−
Ａ−ＲＮＡを用い製造メーカーの原案に添って行った（逆転写の拡大、Boehrrin
ger Mannheim、独）。ヒトＣｕＺｎＳＯＤ ｃＤＮＡをネストＰＣＲを使って増
幅した。第一のＰＣＲは２０μｌ中で行った。逆転写精製物の０．５μｌを使
用、ＳＯＤｓｌおよびＳＯＤａｓ１プライマーを１０μＭ使用、ｄＮＴＰｓ ３
００μＭ使用、製造メーカーの１０×ＰＣＲバッファーの内２μｌ使用、および
９５℃で１分間でＴａｑ−ポリメラーゼ２．５Ｕ使用３０サイクル、更に４５℃
１分間、７２℃で１分間、更に第二のＰＣＲ（５０μｌ）および第一ＰＣＲ製品
精製物５μｌ使用、ＳＯＤ−ＰＱＥ６０ａｓ２ｋプライマー１０μＭ使用、３０
０μＭ ｄＮＴＰｓ、５μｌのＰＣＲバッファー５μｌおよび２．５ＵのＴａｑ
−ポリメラーゼ、３０サイクル １分９５℃、１分６０℃、１分７２℃採用（Ｔ
ａｑ−ポリメラーゼ、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）。ｐＱＥ３０発現
ベクター中に分散、プライマーＳＯＤ−ＰＱＥ３０−ｓ２およびＳＯＤ−ＰＱＥ
３０−ａｓ２をＳＯＤ−ＰＱＥ６０ｓ２／ＳＯＤ−ＰＱＥ６０ａｓ２に替えて使
用。
【００３６】 ２．ｐＱＥ６０の発現ベクター（Ｃ末端融合蛋白質）中でヒトＣｕＺｎＳＯＤ
のサブクローンニング ＳＯＤ−ｐＱＥ６０ ＰＣＲ製品をＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ切断に先立ち、ゲル
抽出操作により精製した（New England Biolabs）。Ｃ末端ヒスチジンタグ融合
蛋白質を得るため、ＣｕＺｎＳＯＤ転写をＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩによる処理済み
の原核生物発現ベクターｐＱＥ６０中でライゲーション処理した（QIAexpress発
現キットタイプＩＶおよびタイプＡＴＧを使用、Qiagen, Hilden、独）。選定用
としてＣｕＺｎＳＯＤベクター構成体（ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ６０）を増幅、
シーケンス後、１０μｌのライゲーション生成物をＥ．ＣＯｌｉ Ｍ１５〔ｐＲ
ＥＰ４〕細胞中で形質転換させた（QIAexpress発現キットタイプＡＴＧ、Qiage
n, Hilden、独）。正しい読み取りフレームおよびミスマッチの除外について、
放射線テストおよび両鎖について自動シーケンス操作により確かめた（Ｔ７−シ
ーケンスキット、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden；ＡＢＩ３７７シーケン
サー、Applied Biosystems, USA）。
のサブクローンニング ＳＯＤ−ｐＱＥ６０ ＰＣＲ製品をＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ切断に先立ち、ゲル
抽出操作により精製した（New England Biolabs）。Ｃ末端ヒスチジンタグ融合
蛋白質を得るため、ＣｕＺｎＳＯＤ転写をＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩによる処理済み
の原核生物発現ベクターｐＱＥ６０中でライゲーション処理した（QIAexpress発
現キットタイプＩＶおよびタイプＡＴＧを使用、Qiagen, Hilden、独）。選定用
としてＣｕＺｎＳＯＤベクター構成体（ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ６０）を増幅、
シーケンス後、１０μｌのライゲーション生成物をＥ．ＣＯｌｉ Ｍ１５〔ｐＲ
ＥＰ４〕細胞中で形質転換させた（QIAexpress発現キットタイプＡＴＧ、Qiage
n, Hilden、独）。正しい読み取りフレームおよびミスマッチの除外について、
放射線テストおよび両鎖について自動シーケンス操作により確かめた（Ｔ７−シ
ーケンスキット、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden；ＡＢＩ３７７シーケン
サー、Applied Biosystems, USA）。
【００３７】 ３．ｐＱＥ３０の発現ベクター（Ｎ末端融合蛋白質）中でヒトＣｕＺｎＳＯＤ
のサブクローンニング ＳＯＤ−ｐＱＥ３０ ＰＣＲ製品を製造者側の原案に準じてｐＣＲ２．１ベク
ター中で直接ライゲーション操作に先立ち、ゲル抽出を使って精製した（ＴＡ−
クローンニングキット、Invitrogen, De Schelp、オランダ）。増幅の後プラズ
ミド精製後に、ｐＣＲ２．１−ＣｕＺｎＳＯＤベクター構成体をＢａｍＨＩを使
って切断し、ＰＣＲ２．１ベクター由来であり、ＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＸ−Ｉ／Ｓ
ｐｅＩ／ＢａＭＨＩ制限酵素部位を有する配列である、５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡ
ＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣ−３’の３’末
端が伸長した、ＣｕＺｎＳＯＤ転写物を製作した。Ｎ末端ヒスチジンタグ融合蛋
白質を構成するためには、伸長転写はＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理した原核
生物発現ベクターｐＱＥ３０中にライゲートされ（QIAexpress発現キットタイプ
ＩＶ、Qiagen, Hilden、独）、Klenow−ＤＮＡ−ポリメラーゼによる培養で平滑
化され、次いでＴ４−ＤＮＡ−ライゲースの第二処理操作（Boehringer Mannhei
m、独）で環化処理される。ＣｕＺｎＳＯＤベクター構成体（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ
−ｐＱＥ３０）での選定、増幅およびシーケンス処理のために、１０μｌのライ
ゲーション製品はＥ．Ｃｏｌｉ Ｍ１５〔ｐＲＥＰ４〕細胞中で形質転換を受け
た（QIAexpress発現キットタイプＩＶおよびタイプＡＴＧ、Qiagen, Hilden、
独）。正しい読み取りフレームおよびミスマッチの除外については放射線検査お
よび両鎖製品について、自動シーケンス処理される（Ｔ７−シーケンスキット、
Pharmacia Biotech, Upsalla, Sweden；ＡＢＩ３７７シーケンサー、Applied Bi
osystems, USA）。
のサブクローンニング ＳＯＤ−ｐＱＥ３０ ＰＣＲ製品を製造者側の原案に準じてｐＣＲ２．１ベク
ター中で直接ライゲーション操作に先立ち、ゲル抽出を使って精製した（ＴＡ−
クローンニングキット、Invitrogen, De Schelp、オランダ）。増幅の後プラズ
ミド精製後に、ｐＣＲ２．１−ＣｕＺｎＳＯＤベクター構成体をＢａｍＨＩを使
って切断し、ＰＣＲ２．１ベクター由来であり、ＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＸ−Ｉ／Ｓ
ｐｅＩ／ＢａＭＨＩ制限酵素部位を有する配列である、５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡ
ＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣ−３’の３’末
端が伸長した、ＣｕＺｎＳＯＤ転写物を製作した。Ｎ末端ヒスチジンタグ融合蛋
白質を構成するためには、伸長転写はＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理した原核
生物発現ベクターｐＱＥ３０中にライゲートされ（QIAexpress発現キットタイプ
ＩＶ、Qiagen, Hilden、独）、Klenow−ＤＮＡ−ポリメラーゼによる培養で平滑
化され、次いでＴ４−ＤＮＡ−ライゲースの第二処理操作（Boehringer Mannhei
m、独）で環化処理される。ＣｕＺｎＳＯＤベクター構成体（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ
−ｐＱＥ３０）での選定、増幅およびシーケンス処理のために、１０μｌのライ
ゲーション製品はＥ．Ｃｏｌｉ Ｍ１５〔ｐＲＥＰ４〕細胞中で形質転換を受け
た（QIAexpress発現キットタイプＩＶおよびタイプＡＴＧ、Qiagen, Hilden、
独）。正しい読み取りフレームおよびミスマッチの除外については放射線検査お
よび両鎖製品について、自動シーケンス処理される（Ｔ７−シーケンスキット、
Pharmacia Biotech, Upsalla, Sweden；ＡＢＩ３７７シーケンサー、Applied Bi
osystems, USA）。
【００３８】 ４．部位特異的突然変異（神経病変、筋萎縮性側索硬化症を伴いカルシニュー
リン／ＣｕＺｎＳＯＤ蛋白質の相互作用にとって重要と見られる点突然変異） アミノ酸置換は以下のプライマーを使って製造側の原案に基づき行われた。即
ちＳＯＤ−ＰＱＥ６０−Ａ４Ｖ（５’−ｃａａ ｇｃｃ ａｔｇ ｇｃｇ ａｃｇ
ａａｇ ｇｔｃ ｇｔｇ−３’）、ＳＯＤ−Ａ４Ｖ（５’−ｔｃｃ ｇｃｇ ａｃｇ
ａａｇ ｇｔｃ ｇｔｇ ｔｇｃ ｇｔｇ ｃｔｇ−３’）、ＳＯＤ−Ｇ３７Ｒ
（５’−ｇｇ ａａｇ ｃａｔｔ ａａａ ａｇａ ｃｔｇ ａｃｔ ｇａａ ｇｇｃ−
３’）、ＳＯＤ−Ｄ９０Ａ（５’ａａｔ ｇｔｇ ａｃｔ ｇｃｔ ｇｃｃ ａａａ
ｇａｔ ｇｇｔ ｇｔｇ−３’）、ＳＯＤ−Ｇ９３Ａ（５’−ｇｃｔ ｇａｃ ａａ
ａ ｇａｔ ｇｃｔ ｇｔｇ ｇｃｃ ｇａｔ ｇｔｇ−３’）、ＳＯＤ−ＡｆｌＩＩ
Ｉ（５’−ａｃｇ ｃａｇ ｇａａ ａｇａ ａｃａ ｔｇｔ ｇａｇ ｃａａ ａａｇ
−３’）、ＳＯＤ−ＢｇｌＩＩ（５’−ａｃｇ ｃａｇ ｇａａ ａｇａ ｔｃｔ
ｇａｇ ｃａａ ａａｇ−３’）および発現ベクターＣｕＺｎＳＯＤはそれぞれＣ
ｕＺｎ−ＳＯＤ−ｐＱＥ３０およびＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ６０を構築している
（Chameleon Site directed mutagenesis Kit, Stratagene, San Diego, CA, US
A）。部位特異的突然変異は、発現ベクターのＤＮＡシーケンス状態により確か
められる。部位特異的突然変異によって８組の追加ベクターシーケンスを生じ、
これらのベクターは、臨床関連のアミノ酸置換を備えた８種の蛋白質に対応す
る。
リン／ＣｕＺｎＳＯＤ蛋白質の相互作用にとって重要と見られる点突然変異） アミノ酸置換は以下のプライマーを使って製造側の原案に基づき行われた。即
ちＳＯＤ−ＰＱＥ６０−Ａ４Ｖ（５’−ｃａａ ｇｃｃ ａｔｇ ｇｃｇ ａｃｇ
ａａｇ ｇｔｃ ｇｔｇ−３’）、ＳＯＤ−Ａ４Ｖ（５’−ｔｃｃ ｇｃｇ ａｃｇ
ａａｇ ｇｔｃ ｇｔｇ ｔｇｃ ｇｔｇ ｃｔｇ−３’）、ＳＯＤ−Ｇ３７Ｒ
（５’−ｇｇ ａａｇ ｃａｔｔ ａａａ ａｇａ ｃｔｇ ａｃｔ ｇａａ ｇｇｃ−
３’）、ＳＯＤ−Ｄ９０Ａ（５’ａａｔ ｇｔｇ ａｃｔ ｇｃｔ ｇｃｃ ａａａ
ｇａｔ ｇｇｔ ｇｔｇ−３’）、ＳＯＤ−Ｇ９３Ａ（５’−ｇｃｔ ｇａｃ ａａ
ａ ｇａｔ ｇｃｔ ｇｔｇ ｇｃｃ ｇａｔ ｇｔｇ−３’）、ＳＯＤ−ＡｆｌＩＩ
Ｉ（５’−ａｃｇ ｃａｇ ｇａａ ａｇａ ａｃａ ｔｇｔ ｇａｇ ｃａａ ａａｇ
−３’）、ＳＯＤ−ＢｇｌＩＩ（５’−ａｃｇ ｃａｇ ｇａａ ａｇａ ｔｃｔ
ｇａｇ ｃａａ ａａｇ−３’）および発現ベクターＣｕＺｎＳＯＤはそれぞれＣ
ｕＺｎ−ＳＯＤ−ｐＱＥ３０およびＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ６０を構築している
（Chameleon Site directed mutagenesis Kit, Stratagene, San Diego, CA, US
A）。部位特異的突然変異は、発現ベクターのＤＮＡシーケンス状態により確か
められる。部位特異的突然変異によって８組の追加ベクターシーケンスを生じ、
これらのベクターは、臨床関連のアミノ酸置換を備えた８種の蛋白質に対応す
る。
【００３９】
【表１】 ５．野生型および突然変異型ＣＵＺｎＳＯＤの組換え体発現および精製 ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ６０またはＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ３０ベクターによ
る形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５〔ｐＲＥＰ４〕細胞をＬＢ／アンピシリ
ン（１００μ／ｍｌ）／カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を寒天上に据えた。発
現培地は、ＯＤ６００が０．６を示すまでに２５０ｍｌＬＢ／アンピシリン（１
００μｇ／ｍｌ／カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）中で増殖した。ヒトＣｕＺｎ
ＳＯＤの構造性漏洩発現は、完全にレプレッサープラスミド ｐＲＥＰ４−ｌａ
ｃＩにより阻害された。ヒトＣｕＺｎＳＯＤ融合蛋白質の生産はＩＰＴＧ（１ｍ
Ｍ）の添加により促進された。２時間後には、微生物細胞を遠心分離（４０００
ｇ、２０分）で採取し、８ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐ
Ｈ７．９；５ｍＭのイミダゾール；５００ｍＭのＮａＣＬ構成）中に再懸濁さ
せ、３回凍結融解を繰り返してホモジナイズし、氷上で超音波処理（Bandelin s
onoplus ＧＭ７０、３００Ｗ、３×１０秒）を行い、試料を均質化させた。この
溶解分離物を遠心分離（１０，０００ｇ、２０分）し、７５０μｌのＣｕＺｎ−
ＮＴＡ（ニトリロトリアセテート）−アガロースを用いてインキュベートし、４
℃の下で１時間バッチ操作による親和性試験に掛けた（Qiagen表現主義式キッ
ト、Qiagen, Hilden、独）。ＣｕＺｎ−ＮＴＡ−アガロースはＮｉ−ＮＴＡ−ア
ガロースから以下の一連の洗浄により調製した（Qiagen発現車用キット、Qiage
n, Hilden、独）。
る形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５〔ｐＲＥＰ４〕細胞をＬＢ／アンピシリ
ン（１００μ／ｍｌ）／カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を寒天上に据えた。発
現培地は、ＯＤ６００が０．６を示すまでに２５０ｍｌＬＢ／アンピシリン（１
００μｇ／ｍｌ／カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）中で増殖した。ヒトＣｕＺｎ
ＳＯＤの構造性漏洩発現は、完全にレプレッサープラスミド ｐＲＥＰ４−ｌａ
ｃＩにより阻害された。ヒトＣｕＺｎＳＯＤ融合蛋白質の生産はＩＰＴＧ（１ｍ
Ｍ）の添加により促進された。２時間後には、微生物細胞を遠心分離（４０００
ｇ、２０分）で採取し、８ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐ
Ｈ７．９；５ｍＭのイミダゾール；５００ｍＭのＮａＣＬ構成）中に再懸濁さ
せ、３回凍結融解を繰り返してホモジナイズし、氷上で超音波処理（Bandelin s
onoplus ＧＭ７０、３００Ｗ、３×１０秒）を行い、試料を均質化させた。この
溶解分離物を遠心分離（１０，０００ｇ、２０分）し、７５０μｌのＣｕＺｎ−
ＮＴＡ（ニトリロトリアセテート）−アガロースを用いてインキュベートし、４
℃の下で１時間バッチ操作による親和性試験に掛けた（Qiagen表現主義式キッ
ト、Qiagen, Hilden、独）。ＣｕＺｎ−ＮＴＡ−アガロースはＮｉ−ＮＴＡ−ア
ガロースから以下の一連の洗浄により調製した（Qiagen発現車用キット、Qiage
n, Hilden、独）。
【００４０】 １）２容の再蒸留水使用 ２）３容の再生バッファー（６Ｍ 塩酸グアニジン、０．２Ｍ 酢酸） ３）５容の再蒸留水 ４）３容の２％ ＳＤＳ ５）１容の２５％エタノール ６）１容の５０％エタノール ７）１容の７５％エタノール ８）５容の１００％エタノール ９）１容の７５％エタノール １０）１容の５０％エタノール １１）１容の２５％エタノール １２）１容の再蒸留水 １３）５容の１００ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ液 ｐＨ８．０ １４）５容の再蒸留水 １５）２容の１００ｍＭＣｕＳＯ４／１００ｍＭ ＺｎＳＯ４／１ｍＭ 還元グ
ルタチオン／１ｍＭ ジチオトレイトール １６）２容の再蒸留水 １７）２容の再生バッファー（６Ｍ 塩酸グアニジン、０．２Ｍ 酢酸） １８）２容のバッファーＡ２（２０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．９；５ｍＭ イ
ミダゾール；５００ｍＭ ＮａＣＬ；２００μＭ ＣｕＳＯ４／２００μＭ Ｚｎ
ＳＯ４／１ｍＭ 還元グルタチオン／１ｍＭ ジチオトレイトール バッチ試料を３０ｍｌのクロマト管に充填し、１５ｍｌのバッファーＡ（２０
ｍＭのトリス−ＨＣＬ ｐＨ７．９＋５ｍＭのイミダゾール；５００ｍＭのＮａ
ＣＬ構成）で洗浄し、引き続き８ｍｌのバッファーＢ（２０ｍｌ トリス−ＨＣ
Ｌ ｐＨ７．９；６０ｍＭ イミダゾール；５００ｍＭのＮａＣＬ構成）で濯ぐ。
Ｃ末端またはＮ末端ヒスチジンタグのＣｕＺｎＳＯＤを３回、１，２ｍｌのバッ
ファーＣ（１０ｍＭのトリス−塩酸；５００ｍＭのイミダゾール；２５０ｍＭの
ＮａＣＬ構成）で溶出する。純度および正確な発現生成物を免疫ブロッティング
操作またはＮ末端蛋白質シーケンス操作を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ中２０μｌ溶
出液（不連続の１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を分離した後チェックする。微
生物培養物の蛋白質レベルを調べるため、ＣｕＺｎＳＯＤの変異物の全てを１ｍ
ＭのＩＰＴＧを使ってＯＤ６００＝０．６のもとで同調誘導した。１ｈ、２ｈ、
３ｈ、４ｈ、および２０ｈ後に分けて、大腸菌培養物のアリコート（１ｍｌ）を
取り出し、遠心分離を行い、記載に準じてバッファーＡ中で均質化させた。ペレ
ット物質は１ｍｌの水中で再懸濁させた。引き続き２０μｌの上澄（水溶性部
分）または２０μｌの音波処理したペレット懸濁液（不溶性部分）を７μｌの変
性サンプルのバッファー（１０％ＳＤＳ；１０％メルカプトエタノール；２０％
のグリセロール；１３０ｍＭのトリス−ＨＣＬ ｐＨ６．８；０．０３％のブロ
モフェノール構成）と混合した。試料を８０℃で２分間加熱し、１２％のＳＤＳ
−ＰＡＧＥを使って分析した。クマシンによる染色後、電気泳動物をＣＣＤカメ
ラ（ゲルDoc1000, BioRAD製）を使ってデジタル表示化し、ＮＩＨ−イメージソ
フトウェア（１．６１）を活用して濃度計による濃度分析を行った。
ルタチオン／１ｍＭ ジチオトレイトール １６）２容の再蒸留水 １７）２容の再生バッファー（６Ｍ 塩酸グアニジン、０．２Ｍ 酢酸） １８）２容のバッファーＡ２（２０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．９；５ｍＭ イ
ミダゾール；５００ｍＭ ＮａＣＬ；２００μＭ ＣｕＳＯ４／２００μＭ Ｚｎ
ＳＯ４／１ｍＭ 還元グルタチオン／１ｍＭ ジチオトレイトール バッチ試料を３０ｍｌのクロマト管に充填し、１５ｍｌのバッファーＡ（２０
ｍＭのトリス−ＨＣＬ ｐＨ７．９＋５ｍＭのイミダゾール；５００ｍＭのＮａ
ＣＬ構成）で洗浄し、引き続き８ｍｌのバッファーＢ（２０ｍｌ トリス−ＨＣ
Ｌ ｐＨ７．９；６０ｍＭ イミダゾール；５００ｍＭのＮａＣＬ構成）で濯ぐ。
Ｃ末端またはＮ末端ヒスチジンタグのＣｕＺｎＳＯＤを３回、１，２ｍｌのバッ
ファーＣ（１０ｍＭのトリス−塩酸；５００ｍＭのイミダゾール；２５０ｍＭの
ＮａＣＬ構成）で溶出する。純度および正確な発現生成物を免疫ブロッティング
操作またはＮ末端蛋白質シーケンス操作を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ中２０μｌ溶
出液（不連続の１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を分離した後チェックする。微
生物培養物の蛋白質レベルを調べるため、ＣｕＺｎＳＯＤの変異物の全てを１ｍ
ＭのＩＰＴＧを使ってＯＤ６００＝０．６のもとで同調誘導した。１ｈ、２ｈ、
３ｈ、４ｈ、および２０ｈ後に分けて、大腸菌培養物のアリコート（１ｍｌ）を
取り出し、遠心分離を行い、記載に準じてバッファーＡ中で均質化させた。ペレ
ット物質は１ｍｌの水中で再懸濁させた。引き続き２０μｌの上澄（水溶性部
分）または２０μｌの音波処理したペレット懸濁液（不溶性部分）を７μｌの変
性サンプルのバッファー（１０％ＳＤＳ；１０％メルカプトエタノール；２０％
のグリセロール；１３０ｍＭのトリス−ＨＣＬ ｐＨ６．８；０．０３％のブロ
モフェノール構成）と混合した。試料を８０℃で２分間加熱し、１２％のＳＤＳ
−ＰＡＧＥを使って分析した。クマシンによる染色後、電気泳動物をＣＣＤカメ
ラ（ゲルDoc1000, BioRAD製）を使ってデジタル表示化し、ＮＩＨ−イメージソ
フトウェア（１．６１）を活用して濃度計による濃度分析を行った。
【００４１】 ６．ＣｕＺｎＳＯＤのプロセシング 非活性ヒスチジンタグを取外し、ＣｕＺｎＳＯＤを臨床応用に適合させるた
め、Ｎ末端ヒスチジンのタグ付けをしたＣｕＺｎＳＯＤを、蛋白分解に適するご
とくカテプシン−Ｃでデータプロセシングするか、またはＣ末端変種を製造メー
カー側のマニュアルに準じて（Boehringer-Mannheim, Mannheim, 独）カルボキ
シペプチダーゼ−Ａで処理した。カテプシン−Ｃでの処理ではアミノ酸ＮＨ２−
ＧＳＡＴ ＫＡＶＣＶＬＫＧＤＧＰ（シーケンステキストＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱ
Ｅ３０ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３中に示す）から出発したプロセシング済みＣｕＺ
ｎＳＯＤが得られた。Ｃ末端融合蛋白質ではＣ末端アミノ酸シーケンスＶＩＧＩ
ＡＱＲ−ＣＯＯＨ（シーケンステキストＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ３０ ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ１３中に示す）が得られている。その証明はペプチドシーケンスに基づ
いてなされた。
め、Ｎ末端ヒスチジンのタグ付けをしたＣｕＺｎＳＯＤを、蛋白分解に適するご
とくカテプシン−Ｃでデータプロセシングするか、またはＣ末端変種を製造メー
カー側のマニュアルに準じて（Boehringer-Mannheim, Mannheim, 独）カルボキ
シペプチダーゼ−Ａで処理した。カテプシン−Ｃでの処理ではアミノ酸ＮＨ２−
ＧＳＡＴ ＫＡＶＣＶＬＫＧＤＧＰ（シーケンステキストＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱ
Ｅ３０ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １３中に示す）から出発したプロセシング済みＣｕＺ
ｎＳＯＤが得られた。Ｃ末端融合蛋白質ではＣ末端アミノ酸シーケンスＶＩＧＩ
ＡＱＲ−ＣＯＯＨ（シーケンステキストＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ３０ ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ１３中に示す）が得られている。その証明はペプチドシーケンスに基づ
いてなされた。
【００４２】 ７．ＣｕＺｎＳＯＤの再活性化 生理学的に関連のある活性のホモダイマー性のＣｕＺｎＳＯＤを得るためには
ＣｕＺｎ−ＮＴＡの溶出液を５ｋＤ膜（Omegacell, Filtron, Northborough, M
A, USA製）を介して限外濾過を行った。バッファーの交換には、再生用のバッフ
ァー中で（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５，１ｍＭ ＤＴＴ）サンプ
ル試料を３回洗浄するようにした。蛋白質溶液は８℃のもとで（２５０μｇ／ｍ
ｌ蛋白質溶液を）７日間培養した。正確に時間間隔を設定した後、再折り畳み混
合物のアリコートを、変性してないゲルを使って電気泳動および活性染色分析に
掛けるか、または分光分析に掛けた（０．５−１μ ＣｕＺｎＳＯＤ、スーパー
オキシドジスムターゼ定量キット、Calbiochem, San Diego, CA, USA）。蛋白質
の周波帯域の肉眼試験用として、未変性ゲルをクマシンブルーで染色した。さら
に大量のＣｕＺｎＳＯＤを得るには、大腸菌細胞を引き続き１５ｍｌ、２００ｍ
ｌ、２５００ｍｌおよび２０Ｌのフラスコ中で育成した。再折り畳みＣｕＺｎＳ
ＯＤ蛋白質は１００容のバッファーＤを対象に透析に掛け（１０ｍＭトリス−塩
酸 ０．１％サッカローズ該当）さらにこれを凍結乾燥させた。
ＣｕＺｎ−ＮＴＡの溶出液を５ｋＤ膜（Omegacell, Filtron, Northborough, M
A, USA製）を介して限外濾過を行った。バッファーの交換には、再生用のバッフ
ァー中で（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５，１ｍＭ ＤＴＴ）サンプ
ル試料を３回洗浄するようにした。蛋白質溶液は８℃のもとで（２５０μｇ／ｍ
ｌ蛋白質溶液を）７日間培養した。正確に時間間隔を設定した後、再折り畳み混
合物のアリコートを、変性してないゲルを使って電気泳動および活性染色分析に
掛けるか、または分光分析に掛けた（０．５−１μ ＣｕＺｎＳＯＤ、スーパー
オキシドジスムターゼ定量キット、Calbiochem, San Diego, CA, USA）。蛋白質
の周波帯域の肉眼試験用として、未変性ゲルをクマシンブルーで染色した。さら
に大量のＣｕＺｎＳＯＤを得るには、大腸菌細胞を引き続き１５ｍｌ、２００ｍ
ｌ、２５００ｍｌおよび２０Ｌのフラスコ中で育成した。再折り畳みＣｕＺｎＳ
ＯＤ蛋白質は１００容のバッファーＤを対象に透析に掛け（１０ｍＭトリス−塩
酸 ０．１％サッカローズ該当）さらにこれを凍結乾燥させた。
【００４３】 ８．ＳＯＤ検定と活性染色 ＣｕＺｎＳＯＤ蛋白質の酵素活性度は１０％の未変性ゲルによる電気泳動，お
よびニトロテトラゾリウム青を使った活性染色を分析するか、または定量的に分
光光度検定により測定した。その操作基準は製造社側の発行テキストによってい
る（Beau-champ and Fridovich、１９７１；Nebot他、１９９３）。蛋白質の収
量はBradford法（蛋白質定量キット、BioRAD, Hercules, CA, USA）により求め
た。精製ＣｕＺｎＳＯＤの濃度は吸光係数＝１．８４×１０４／Ｍ・ｃｍを用い
て分光光度的に測定した。
よびニトロテトラゾリウム青を使った活性染色を分析するか、または定量的に分
光光度検定により測定した。その操作基準は製造社側の発行テキストによってい
る（Beau-champ and Fridovich、１９７１；Nebot他、１９９３）。蛋白質の収
量はBradford法（蛋白質定量キット、BioRAD, Hercules, CA, USA）により求め
た。精製ＣｕＺｎＳＯＤの濃度は吸光係数＝１．８４×１０４／Ｍ・ｃｍを用い
て分光光度的に測定した。
【００４４】 ９．ヒトＣｕＺｎＳＯＤｋｐＥＧＦＰ真核生物発現ベクター中へのサブクロー
ニング、および安定性感染ＰＣＩ２細胞の生成（Ｃ末端融合蛋白質と、蛍光マー
カー／標識としての緑蛍光蛋白質） ＳＯＤ−ｐＥＧＦＰ−ｓ ５’−ｃｃｇ ｃｇｇ ｇｃｃ ｃｇｃ ｃａｔ ｇｇｃ
ｇａｃ ｇａａ ｇｇｃ ｃｇｔ ｇｔｇ ｃｇｔ ｇｃ−３’およびＳＯＤ−ｐＥ
ＧＦＰ−ａｓ５’−ｇｃｔ ｃａｃ ｃａｔ ｇｇｔ ｇｇｔ ｔｔｇ ｇｇｃ ｇａ
ｔ ｃｃｃ ａａｔ ｔａｃ ａｃｃ ａｃ−３’等のプライマーの１０μＭ、Ｃｕ
ＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ６０ベクターの１０ｎｇ、ｄＮＴＰｓｋ３００μＭ、製造メ
ーカーのＰＣＲバッファーの５μｌおよびＴａｑ−ポリメラーゼ（９５℃１分、
６０℃１分、７２℃１分で２５サイクルの２．５Ｕ（全容積５０μｌ、Ｔａｇ−
ポリメラーゼ、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使って、ＡｐａＩ／Ｎ
ｃｏＩの消化により開裂することによってＰＣＲ製品が得られた。精製ＰＣＲ製
品はＡｐａＩ／ＮｃｏＩ処理によるｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクター（Clontech Lab,
Palo Alto, CA, USA）にライゲートされた。ＸＬ２−ブルー細胞（２５μｇ／ｍ
ｌカナマイシン）内での増殖、プラスミド精製の後、ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＥＧＦ
Ｐベクター構成体は、製造側のテキストに従って（Clontech Lab, Palo Alto, C
A, USA）CalPhos（商標）の感染キットを使って、ＰＣ１２ラットの副腎の褐色
細胞腫に感染された。安定性の感染されたＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＥＧＦＰクローン
は蛍光顕微鏡を使って選定された（励起４８８ｎｍ／放射５２０ｎｍ、ＭＲＣ
１０２４、焦点共有顕微鏡、BioRAD LAB, Hercules, CA, USA）。
ニング、および安定性感染ＰＣＩ２細胞の生成（Ｃ末端融合蛋白質と、蛍光マー
カー／標識としての緑蛍光蛋白質） ＳＯＤ−ｐＥＧＦＰ−ｓ ５’−ｃｃｇ ｃｇｇ ｇｃｃ ｃｇｃ ｃａｔ ｇｇｃ
ｇａｃ ｇａａ ｇｇｃ ｃｇｔ ｇｔｇ ｃｇｔ ｇｃ−３’およびＳＯＤ−ｐＥ
ＧＦＰ−ａｓ５’−ｇｃｔ ｃａｃ ｃａｔ ｇｇｔ ｇｇｔ ｔｔｇ ｇｇｃ ｇａ
ｔ ｃｃｃ ａａｔ ｔａｃ ａｃｃ ａｃ−３’等のプライマーの１０μＭ、Ｃｕ
ＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ６０ベクターの１０ｎｇ、ｄＮＴＰｓｋ３００μＭ、製造メ
ーカーのＰＣＲバッファーの５μｌおよびＴａｑ−ポリメラーゼ（９５℃１分、
６０℃１分、７２℃１分で２５サイクルの２．５Ｕ（全容積５０μｌ、Ｔａｇ−
ポリメラーゼ、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使って、ＡｐａＩ／Ｎ
ｃｏＩの消化により開裂することによってＰＣＲ製品が得られた。精製ＰＣＲ製
品はＡｐａＩ／ＮｃｏＩ処理によるｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクター（Clontech Lab,
Palo Alto, CA, USA）にライゲートされた。ＸＬ２−ブルー細胞（２５μｇ／ｍ
ｌカナマイシン）内での増殖、プラスミド精製の後、ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＥＧＦ
Ｐベクター構成体は、製造側のテキストに従って（Clontech Lab, Palo Alto, C
A, USA）CalPhos（商標）の感染キットを使って、ＰＣ１２ラットの副腎の褐色
細胞腫に感染された。安定性の感染されたＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＥＧＦＰクローン
は蛍光顕微鏡を使って選定された（励起４８８ｎｍ／放射５２０ｎｍ、ＭＲＣ
１０２４、焦点共有顕微鏡、BioRAD LAB, Hercules, CA, USA）。
【００４５】 １０．調節サブユニット構成のヒトカルシニューリン−Ｂのクローニング ヒトカルシニューリン−Ｂのクローニングは、テンプレートとしてヒトの脳の
ポリ−Ａ−ＲＮＡを使って逆転写ＰＣＲにより行った（Clontech, Palo Alto,C
A, USA）。オリゴヌクレオチドＣＮＢａ−ｓｌ ５’−ｃｃｇ ｃｃｇ ａｃｃ ｃ
ｇｃ ｃｇａ ｇｃａ−３’、ＣＮＢａ−ａｓｌ ５’−ｇｇｔ ａｃｔ ｃｔｃ ｔ
ｇａ ｔａａ ｇａｇ−３’、ＣＮＢａ−ｓ３ ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｃｃｃ ｃｇ
ｇ ｇｇａ ａａｇ ａｇｇ ａｇａ ａａｔ ｔａａ ｃｔａ ｔｇｇ ｇａａ ａｔｇ
ａｇｇ ｃａａ ｇｔｔ ａｔｃ−３’、ＣＮＢａ−ａｓ２ ５’−ｔｔｃ ｃｇｇ
ｇｃｃ ｃａａ ｇｃｔ ｔｃｔ ａａｔ ｔａａ ｔｃａ ｃａｃ ａｔｃ ｔａｃ
ｃａｃ ｃａｔ ｃ−３’以上の材料はInteractiva社（Ulm、独）から提供された
ものである。逆転写は製造側の原案に基づきＣＮＢａ−ａｓｌおよび１００ｎｇ
のポリ−Ａ−ＲＮＡを用いて行った。（逆転写酵素の拡張、Boehringer Mannhei
m、独）。ヒトカルシニューリン−ＢのｃＤＮＡはネストＰＣＲにより増幅し
た。最初のＰＣＲは０．５μｌの逆転写製品、１０μＭＣＮＢａ−ｓおよびＣＮ
Ｂａ−ａｓ１プライマー、３００μＭのｄＮＴＰＳ、２μｌの製造メーカー側提
供の１０×ＰＣＲバッファーおよび２．５ＵのＰｆｕ−ポリメラーゼ、但し条件
としては２０サイクル、１分、９５℃、同じく１分５５℃、２分７２℃、これに
続いて第二のＰＣＲ（５０μｌ）、これに付随して５μｌの精製第一ＰＣＲ製
品、１０μＭのＣＮＢａ−ｓ３およびＣＮＢａ−ａｓ２プライマー、３００μＭ
のｄＮＴＰｓ、５μｌのメーカー供給ＰＣＲバッファーと２．５ＵのＰｆｕ−ポ
リメラーゼを用い、付随条件として１分９５℃、１分５５℃、１分７２℃での２
０サイクル操作とする（この使用条件は、Ｐｆｕ−ポリメラーゼ、Stratagene,
San Diego, CA, USA）。
ポリ−Ａ−ＲＮＡを使って逆転写ＰＣＲにより行った（Clontech, Palo Alto,C
A, USA）。オリゴヌクレオチドＣＮＢａ−ｓｌ ５’−ｃｃｇ ｃｃｇ ａｃｃ ｃ
ｇｃ ｃｇａ ｇｃａ−３’、ＣＮＢａ−ａｓｌ ５’−ｇｇｔ ａｃｔ ｃｔｃ ｔ
ｇａ ｔａａ ｇａｇ−３’、ＣＮＢａ−ｓ３ ５’−ｇｇａ ａｔｔ ｃｃｃ ｃｇ
ｇ ｇｇａ ａａｇ ａｇｇ ａｇａ ａａｔ ｔａａ ｃｔａ ｔｇｇ ｇａａ ａｔｇ
ａｇｇ ｃａａ ｇｔｔ ａｔｃ−３’、ＣＮＢａ−ａｓ２ ５’−ｔｔｃ ｃｇｇ
ｇｃｃ ｃａａ ｇｃｔ ｔｃｔ ａａｔ ｔａａ ｔｃａ ｃａｃ ａｔｃ ｔａｃ
ｃａｃ ｃａｔ ｃ−３’以上の材料はInteractiva社（Ulm、独）から提供された
ものである。逆転写は製造側の原案に基づきＣＮＢａ−ａｓｌおよび１００ｎｇ
のポリ−Ａ−ＲＮＡを用いて行った。（逆転写酵素の拡張、Boehringer Mannhei
m、独）。ヒトカルシニューリン−ＢのｃＤＮＡはネストＰＣＲにより増幅し
た。最初のＰＣＲは０．５μｌの逆転写製品、１０μＭＣＮＢａ−ｓおよびＣＮ
Ｂａ−ａｓ１プライマー、３００μＭのｄＮＴＰＳ、２μｌの製造メーカー側提
供の１０×ＰＣＲバッファーおよび２．５ＵのＰｆｕ−ポリメラーゼ、但し条件
としては２０サイクル、１分、９５℃、同じく１分５５℃、２分７２℃、これに
続いて第二のＰＣＲ（５０μｌ）、これに付随して５μｌの精製第一ＰＣＲ製
品、１０μＭのＣＮＢａ−ｓ３およびＣＮＢａ−ａｓ２プライマー、３００μＭ
のｄＮＴＰｓ、５μｌのメーカー供給ＰＣＲバッファーと２．５ＵのＰｆｕ−ポ
リメラーゼを用い、付随条件として１分９５℃、１分５５℃、１分７２℃での２
０サイクル操作とする（この使用条件は、Ｐｆｕ−ポリメラーゼ、Stratagene,
San Diego, CA, USA）。
【００４６】 １１．触媒サブユニットのヒトカルシニューリン−Ａ−αおよびスプライシン
グ変異体のクローニング ヒトカルシニューリン−Ａ−αのクローニングは、テンプレートとしてヒトの
脳のポリ−Ａ−ＲＮＡを使って逆転写により行った。（Clontech, Palo Alto, C
A, USA）。オリゴヌクレオチドのＣＮＡａ−ｓ１ ５’−ｇｃｇ ｔｃｇ ｃｔｇ
ｔｃｃ ｔｃｃ ｇｇｃ ａｇｃ−３’、ＣＮＡａ−ａｓ１ ５’−ｇｔｇ ａａｃ
ａｇｇ ａａｇ ｔｇｇ ｔｃａ ｃｔｇ−３’、ＣＮＡａ−ｓ２ ５’−ｃａｔ ｇ
ｃｃ ａｔｇ ｇａｔｃ ｃａｔ ｇｔｃ ｃｇａ ｇｃｃ ｃａａ ｇｇｃ−３’、Ｃ
ＮＡａ−ａｓ４ ５’−ｔｃｃ ｃｃｃ ｃｇｇ ｇｇｔａ ｃｃｃ ｔａｇ ｔｔａ
ａｔｃ ａｃｔ ｇａａ ｔａｔ ｔｇｃ ｔｇｃ ｔａｔ ｔａｃ−３’は何れもInt
eractiva（Ulm、独）から供給された。逆転写ＣＮＡａ−ａｓ１のプライマーお
よび１００ｎｇのポリ−Ａ−ＲＮＡを用いて行ったが、操作は製造社側のテキス
ト原案に従った（逆転写酵素の拡張、Boehringer Mannheim、独）。ヒトカルシ
ニューリン−Ａ−α ｃＤＮＡの増幅には、ネストＰＣＲを使った。最初のＰＣ
Ｒは０．５μｌの逆転写品、１０μＭのＣＮＡａ−ｓ１およびＣＮＡａ−ａｓ１
プライマー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、２．５μｌの製造社提供の１０×ＰＣＲ
のバッファーおよび１．２５ＵのＰｆｕ−ポリメラーゼ、を使って２５μｌのも
とで行ったが、その付随条件は９５℃で４０秒、５５℃で４０秒、７２℃で３分
の３０サイクルとし、これに続き第二のＰＣＲを２５μｌのもとで行ったが、こ
れには精製の第一ＰＣＲの２．５μｌ、ＣＮＡａ−ｓ２およびＣＮＡａ−ａｓ２
プライマーの１０μＭ、ｄＮＴＰｓの２００μＭ、製造社側からのＰＣＲ用バッ
ファー２．５μｌ、およびＰｆｕ−ポリメラーゼの２．５Ｕを用い、付随条件と
して９５℃で４０秒、５５℃で４０秒、７２℃で３分の２５サイクルとした（Ｐ
ｆｕ−ポリメラーゼ、Stratagene, San Diego, CA, USA）とした。
グ変異体のクローニング ヒトカルシニューリン−Ａ−αのクローニングは、テンプレートとしてヒトの
脳のポリ−Ａ−ＲＮＡを使って逆転写により行った。（Clontech, Palo Alto, C
A, USA）。オリゴヌクレオチドのＣＮＡａ−ｓ１ ５’−ｇｃｇ ｔｃｇ ｃｔｇ
ｔｃｃ ｔｃｃ ｇｇｃ ａｇｃ−３’、ＣＮＡａ−ａｓ１ ５’−ｇｔｇ ａａｃ
ａｇｇ ａａｇ ｔｇｇ ｔｃａ ｃｔｇ−３’、ＣＮＡａ−ｓ２ ５’−ｃａｔ ｇ
ｃｃ ａｔｇ ｇａｔｃ ｃａｔ ｇｔｃ ｃｇａ ｇｃｃ ｃａａ ｇｇｃ−３’、Ｃ
ＮＡａ−ａｓ４ ５’−ｔｃｃ ｃｃｃ ｃｇｇ ｇｇｔａ ｃｃｃ ｔａｇ ｔｔａ
ａｔｃ ａｃｔ ｇａａ ｔａｔ ｔｇｃ ｔｇｃ ｔａｔ ｔａｃ−３’は何れもInt
eractiva（Ulm、独）から供給された。逆転写ＣＮＡａ−ａｓ１のプライマーお
よび１００ｎｇのポリ−Ａ−ＲＮＡを用いて行ったが、操作は製造社側のテキス
ト原案に従った（逆転写酵素の拡張、Boehringer Mannheim、独）。ヒトカルシ
ニューリン−Ａ−α ｃＤＮＡの増幅には、ネストＰＣＲを使った。最初のＰＣ
Ｒは０．５μｌの逆転写品、１０μＭのＣＮＡａ−ｓ１およびＣＮＡａ−ａｓ１
プライマー、２００μＭのｄＮＴＰｓ、２．５μｌの製造社提供の１０×ＰＣＲ
のバッファーおよび１．２５ＵのＰｆｕ−ポリメラーゼ、を使って２５μｌのも
とで行ったが、その付随条件は９５℃で４０秒、５５℃で４０秒、７２℃で３分
の３０サイクルとし、これに続き第二のＰＣＲを２５μｌのもとで行ったが、こ
れには精製の第一ＰＣＲの２．５μｌ、ＣＮＡａ−ｓ２およびＣＮＡａ−ａｓ２
プライマーの１０μＭ、ｄＮＴＰｓの２００μＭ、製造社側からのＰＣＲ用バッ
ファー２．５μｌ、およびＰｆｕ−ポリメラーゼの２．５Ｕを用い、付随条件と
して９５℃で４０秒、５５℃で４０秒、７２℃で３分の２５サイクルとした（Ｐ
ｆｕ−ポリメラーゼ、Stratagene, San Diego, CA, USA）とした。
【００４７】 ここで新規にスプライシング変異体が確認されたが、このものはカルシニュー
リン−Ａのカルシウムの調節および蛋白質分解の調節に重要とされる。この挿入
異型物質にはホスファターゼ触媒ドメインでの孔と、カルシニューリンの結合部
位の一部に欠ける点がある。（シーケンステキスト中のＣＮＡａ１−ｐＱＥ３０
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７の核ベースの除去）対応ベクターはＣＮＡａ３−ｐＱＥ
３０と呼ばれる。
リン−Ａのカルシウムの調節および蛋白質分解の調節に重要とされる。この挿入
異型物質にはホスファターゼ触媒ドメインでの孔と、カルシニューリンの結合部
位の一部に欠ける点がある。（シーケンステキスト中のＣＮＡａ１−ｐＱＥ３０
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７の核ベースの除去）対応ベクターはＣＮＡａ３−ｐＱＥ
３０と呼ばれる。
【００４８】 位置／限定項目 １５１…６０６／注＝「スプライシング変異体：カルシニューリンＡα１にはホ
スファターゼドメインが欠ける。新規に形成されるＮ端末は蛋白質分解酵素の活
性を示している」 １１５…１５０／注＝「ヒスチジンタグ」 ６４９…１１６１／注＝「カルシニューリンＢ；カルシニューリンＢ α Ｃａ２
＋結合剤」 １２．ヒトカルシニューリン−Ａ−βおよびスプライシング変異体における触
媒サブユニットのクローニング ＰＣＲの実施は１１項の内容に準ずるが、異なる点はプライマーであるＣＮＡ
ｂ−ｓ１ ５’−ｇａｇ ｃｃｔ ａｇｃ ｃｇａ ｇｃｃ ｃｃｇ ｇｇ−３’およ
びＣＮＡｂ−ａｓ１ ５’−ｃｔｇ ｇｇａ ａｇｔ ａｇｔ ｇｇｇ ｔｃａ ｃｔ
ｇ−３’を第一ＰＣＲ用に用い、プライマーのＣＮＡｂ−ｓ２ ５’−ｃａｔ ｇ
ｃｃ ａｔｇ ｇａｔ ｃｃａ ｔｇｇ ｃｃｇ ｃｃｃ ｃｇｇ ａｇｃ ｃ−３’お
よびＣＮＡｂ−ａｓ４ ５’−ｔｃｃ ｃｃｃ ｃｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｃｔａ ｇ
ｔｔ ａａｔ ｃａｃ ｔｇｇ ｇｃａ ｇｔａ ｔｇｇ ｔｔｇ ｃｃａ ｇ−３’を
第二のＰＣＲに用いている点である。
スファターゼドメインが欠ける。新規に形成されるＮ端末は蛋白質分解酵素の活
性を示している」 １１５…１５０／注＝「ヒスチジンタグ」 ６４９…１１６１／注＝「カルシニューリンＢ；カルシニューリンＢ α Ｃａ２
＋結合剤」 １２．ヒトカルシニューリン−Ａ−βおよびスプライシング変異体における触
媒サブユニットのクローニング ＰＣＲの実施は１１項の内容に準ずるが、異なる点はプライマーであるＣＮＡ
ｂ−ｓ１ ５’−ｇａｇ ｃｃｔ ａｇｃ ｃｇａ ｇｃｃ ｃｃｇ ｇｇ−３’およ
びＣＮＡｂ−ａｓ１ ５’−ｃｔｇ ｇｇａ ａｇｔ ａｇｔ ｇｇｇ ｔｃａ ｃｔ
ｇ−３’を第一ＰＣＲ用に用い、プライマーのＣＮＡｂ−ｓ２ ５’−ｃａｔ ｇ
ｃｃ ａｔｇ ｇａｔ ｃｃａ ｔｇｇ ｃｃｇ ｃｃｃ ｃｇｇ ａｇｃ ｃ−３’お
よびＣＮＡｂ−ａｓ４ ５’−ｔｃｃ ｃｃｃ ｃｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｃｔａ ｇ
ｔｔ ａａｔ ｃａｃ ｔｇｇ ｇｃａ ｇｔａ ｔｇｇ ｔｔｇ ｃｃａ ｇ−３’を
第二のＰＣＲに用いている点である。
【００４９】 １３．ヒトカルシニューリン−Ａ−γおよびスプライシング変異体における触
媒サブユニットのクローニング ＰＣＲの実施は１１項の内容に準ずるが、異なる点はプライマーＣＮＡｇ−ｓ
１ ５’−ｇｇａ ｇｃｃ ｔｇｇ ａｇｇ ａｇｇ ｃｃｇ ａｇ−３’およびＣＮ
Ａｇ−ａｓ１ ５’−ｃｇｇ ｃａｇ ｇａｃ ｔｃｔ ａａｇ ｔｃａ ｔｇａ−
３’を第一ＰＣＲ用に使い、またＣＮＡｇ−ｓ２ ５’−ｃａｔ ｇｃｃ ａｔｇ
ｇａｔ ｃｃａ ｔｇｔ ｃｃｇ ｇｇａ ｇｇｃ ｇｃｔ ｔｃ−３’およびＣＮＡ
ｇ−ａｓ４ ５’−ｔｃｃ ｃｃｃ ｃｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｃｔａ ｇｔｔ ａａｔ
ｃａｔ ｇａａ ｔｇｇ ｇｃｔ ｔｔｃ ｔｔｃ ｃｃｔ ｔ−３’を第二ＰＣＲ向
けに用いた点である。
媒サブユニットのクローニング ＰＣＲの実施は１１項の内容に準ずるが、異なる点はプライマーＣＮＡｇ−ｓ
１ ５’−ｇｇａ ｇｃｃ ｔｇｇ ａｇｇ ａｇｇ ｃｃｇ ａｇ−３’およびＣＮ
Ａｇ−ａｓ１ ５’−ｃｇｇ ｃａｇ ｇａｃ ｔｃｔ ａａｇ ｔｃａ ｔｇａ−
３’を第一ＰＣＲ用に使い、またＣＮＡｇ−ｓ２ ５’−ｃａｔ ｇｃｃ ａｔｇ
ｇａｔ ｃｃａ ｔｇｔ ｃｃｇ ｇｇａ ｇｇｃ ｇｃｔ ｔｃ−３’およびＣＮＡ
ｇ−ａｓ４ ５’−ｔｃｃ ｃｃｃ ｃｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｃｔａ ｇｔｔ ａａｔ
ｃａｔ ｇａａ ｔｇｇ ｇｃｔ ｔｔｃ ｔｔｃ ｃｃｔ ｔ−３’を第二ＰＣＲ向
けに用いた点である。
【００５０】 ここで新規にスプライシング変異体が同定されたが、この物質はカルシニュー
リン−Ａのカルシウム調節および蛋白質分解調節用として重要とされる。ヒトエ
クソンに関わるスプライシング変異体の役割は、遺伝子データベースでは未だ知
られていない。（シーケンステキストＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ ３２にあっての核ベース１４７４−１５０３との置き換えに於いて）５’−
ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＣＧ ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ−
３’については（対応するペプチド：ＮＨ２−ＴＶＥＡＶＥＡＲＥＡ−ＣＯＯ
Ｈ）相補的ベクターはＣＮＡｇ３−ｐＱＥ３０と呼ばれる。
リン−Ａのカルシウム調節および蛋白質分解調節用として重要とされる。ヒトエ
クソンに関わるスプライシング変異体の役割は、遺伝子データベースでは未だ知
られていない。（シーケンステキストＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ ３２にあっての核ベース１４７４−１５０３との置き換えに於いて）５’−
ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＣＧ ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ−
３’については（対応するペプチド：ＮＨ２−ＴＶＥＡＶＥＡＲＥＡ−ＣＯＯ
Ｈ）相補的ベクターはＣＮＡｇ３−ｐＱＥ３０と呼ばれる。
【００５１】 位置／限定項目 １１５…１５０／注＝「ヒスチジンタグ」 １５１…１６８９／注＝「カルシニューリン−Ａ−γ−２」 １４７４…１５０３／注＝「ヒトの脳のカルシニューリン−Ａ−γ代替エクソン
＝細胞骨格との相互作用ドメイン、デス−ドメインホモログ、ストマチンホモロ
グ」 １６９０…１７３１／注＝「ＲＢＳ ＆ ＭＣＳ２」 １７３２…２２４４／注＝「カルシニューリン−Ｂ」 １４．カルシニューリン−Ｂおよびカルシニューリン−Ａ変異型のｐＱＥ３０
中へのサブクローニング 原核生物細胞中の組換え発現にあっては、カルシニューリン−Ｂはカルシニュ
ーリン−Ａ−α１、カルシニューリンＡ−α２、カルシニューリン−Ａ−β１、
カルシニューリン−Ａ−β２、カルシニューリン−Ａγ１またはカルシニューリ
ン−Ａ−γ２の何れかとサブクローン化されていた。精製カルシニューリン−Ａ
−α、カルシニューリン−Ｂ−αまたはカルシニューリン−Ａ＝γＰＣＲ製品
（１１から１３例に記載）は、ＢａｍＨＩ／ＸｍａＩに限定されていた。精製カ
ルシニューリン−Ｂ製品（１０実施例に記載）は、ＸｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに
よって切断され、それぞれのカルシニューリン−Ａ−断片をＢａｍＨ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩに処理されたベクターｐＱＥ３０とライゲートされ、最終の原核生物発現
ベクター構成体ＣＮＡａ１−ｐＱＥ３０、ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０、ＣＮＡａ３
−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｂ１−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｂ２−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｇ１
−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０、およびＣＮＡｇ３−ｐＱＥ３０を生成
する。
＝細胞骨格との相互作用ドメイン、デス−ドメインホモログ、ストマチンホモロ
グ」 １６９０…１７３１／注＝「ＲＢＳ ＆ ＭＣＳ２」 １７３２…２２４４／注＝「カルシニューリン−Ｂ」 １４．カルシニューリン−Ｂおよびカルシニューリン−Ａ変異型のｐＱＥ３０
中へのサブクローニング 原核生物細胞中の組換え発現にあっては、カルシニューリン−Ｂはカルシニュ
ーリン−Ａ−α１、カルシニューリンＡ−α２、カルシニューリン−Ａ−β１、
カルシニューリン−Ａ−β２、カルシニューリン−Ａγ１またはカルシニューリ
ン−Ａ−γ２の何れかとサブクローン化されていた。精製カルシニューリン−Ａ
−α、カルシニューリン−Ｂ−αまたはカルシニューリン−Ａ＝γＰＣＲ製品
（１１から１３例に記載）は、ＢａｍＨＩ／ＸｍａＩに限定されていた。精製カ
ルシニューリン−Ｂ製品（１０実施例に記載）は、ＸｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに
よって切断され、それぞれのカルシニューリン−Ａ−断片をＢａｍＨ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩに処理されたベクターｐＱＥ３０とライゲートされ、最終の原核生物発現
ベクター構成体ＣＮＡａ１−ｐＱＥ３０、ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０、ＣＮＡａ３
−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｂ１−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｂ２−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｇ１
−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０、およびＣＮＡｇ３−ｐＱＥ３０を生成
する。
【００５２】 １５．組換え共発現とＣｕＺｎＳＯＤとヘテロダイマーを構成する、カルシニ
ューリン−Ｂ／カルシニューリン−Ａの精製 ＣＮＡａ１−ｐＱＥ３０、ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０、ＣＮＡａ３−ｐＱＥ３
０、ＣＮＡｂ１−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｂ２−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｇ１−ｐＱＥ３
０、ＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０、またはＣＮＡｇ３−ｐＱＥ３０はＥ．ｃｏｌｉ
Ｍ１５〔ｐＲＥＰ４〕〔ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ３０〕に形質転換されてカルシ
ニューリン−Ａ、カルシニューリン−ＢおよびＣｕＺｎＳＯＤと共発現できる細
胞を作り出し、この細胞はＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／カナマイ
シン（２５μｇ／ｍｌ）寒天で培養された。発現培地は２５０ｍｌＬＢ／アンピ
シリン（１００μｇ／ｍｌ）／カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）中で増殖され、
最終的にはＯＤ６００は０．６を占めるに至った。構造性の漏洩発現は、リプレ
ッサープラスミドｐＲＥＰ４−１ａｃＩにより阻害された。ヒトカルシニューリ
ン−Ａ／カルシニューリン−Ｂヒスチジンタグのヘテロダイマーの生産は、ＩＰ
ＴＧ（１ｍの添加）により誘導された。４時間後には微生物細胞は遠心分離によ
り集められ（４０００ｇ、２０分）、８ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭのトリス
−塩酸、ｐＨは７．９、５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸
濁され、３回の凍結融解によるホモジナイズと氷上の音波処理に依り均質化され
た（Bandelin sonoplus製ＧＭ７０、３００ｗ、３×１０秒）。溶離物は遠心分
離し（１０，０００ｇ、２０分）、７５０μｌｋＦｅ−ＮＴＡ−アガロースを用
いて培養し、４℃で１時間バッチ操作を行った。（Qiagen expキット、Qiagen,
Hilden、独）。Ｆｅ−ＮＴＡ−アガロースはＮｉ−ＮＴＡ−アガロース（Qiagen
expキット、Qiagen, Hilden、独）からのものを転用した。その洗浄要領は次の
通り： １）２容の再蒸留水 ２）３容の再生バッファー（６Ｍ 塩酸グアニジン、０．２Ｍ 酢酸） ３）５容の再蒸留水 ４）３容の２％ＳＤＳ ５）１容の２５％エタノール ６）１容の５０％エタノール ７）１容の７５％エタノール ８）５容の１００％エタノール ９）１容の７５％エタノール １０）１容の５０％エタノール １１）１容の２５％エタノール １２）１容の再蒸留水 １３）５容の１００ｍＭＮａ−ＥＤＴＡ液 ｐＨ ８．０ １４）５容の再蒸留水 １５）２容の１００ｍＭのＦｅＳＯ４／１ｍＭｋ 還元グルタチオン／１ｍＭ
ジチオトレイトール／１００ｍＭ アスコルビン酸 １６）２容の再蒸留水 １７）２容の再生バッファー（６Ｍの塩酸グアニジン，０．２Ｍの酢酸） １８）２容のバッファーＡ３（２０ｍＭのトリス−塩酸 ｐＨ ７．９，５ｍＭ
イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２００μＭ ＦｅＳＯ４／１ｍＭ 還元グ
ルタチオン／１ｍＭ ジチオトレイトール／１ｍＭ アスコルビン酸 バッチ試料を３０ｍｌのクロマトグラフィー管に加え、１５ｍｌのバッファー
Ａ４（２０ｍＭのトリス−塩酸 ｐＨ ７．９、５ｍＭ イミダゾール、５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ 還元グルタチオン／１ｍＭ ジチオトレイトール／１ｍＭ
酢酸）で洗浄し、引き続き８ｍＬのバッファーＢ（２０ｍＭ 塩酸トリス ｐＨ
７．９、６０ｍＭ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ 還元グルタチ
オン／１ｍＭ ジチオトレイトール／１ｍＭ アスコルビン酸）で洗浄した。ここ
でＮ末端のヒスチジンタグ付きカルシニューリンーＡ／カルシニューリンＢのヘ
テロダイマーを、１．２ｍｌのバッファーＣ（１０ｍＭ 塩酸トリス，５００ｍ
Ｍ イミダゾール、２５０ｍＭｋ ＮａＣＬ／１ｍＭ 還元グルタチオン／１ｍＭ
ジチオトレイトール／１ｍＭ アスコルビン酸）構成のもので３回溶離を行い、
バッファーはガス抜きをした後引き続き窒素を飽和させた。カルシニューリンの
酸化を防止するため溶出液は窒素含有の酸素を含まぬガラス容器中に、−８０℃
で貯蔵した。純度並びに正しい発現製品は２０μｌの溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（不連続な１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、免疫ブロッティング
またはＮ末端蛋白質シーケンスを使って検査することとした。
ューリン−Ｂ／カルシニューリン−Ａの精製 ＣＮＡａ１−ｐＱＥ３０、ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０、ＣＮＡａ３−ｐＱＥ３
０、ＣＮＡｂ１−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｂ２−ｐＱＥ３０、ＣＮＡｇ１−ｐＱＥ３
０、ＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０、またはＣＮＡｇ３−ｐＱＥ３０はＥ．ｃｏｌｉ
Ｍ１５〔ｐＲＥＰ４〕〔ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱＥ３０〕に形質転換されてカルシ
ニューリン−Ａ、カルシニューリン−ＢおよびＣｕＺｎＳＯＤと共発現できる細
胞を作り出し、この細胞はＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／カナマイ
シン（２５μｇ／ｍｌ）寒天で培養された。発現培地は２５０ｍｌＬＢ／アンピ
シリン（１００μｇ／ｍｌ）／カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）中で増殖され、
最終的にはＯＤ６００は０．６を占めるに至った。構造性の漏洩発現は、リプレ
ッサープラスミドｐＲＥＰ４−１ａｃＩにより阻害された。ヒトカルシニューリ
ン−Ａ／カルシニューリン−Ｂヒスチジンタグのヘテロダイマーの生産は、ＩＰ
ＴＧ（１ｍの添加）により誘導された。４時間後には微生物細胞は遠心分離によ
り集められ（４０００ｇ、２０分）、８ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭのトリス
−塩酸、ｐＨは７．９、５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸
濁され、３回の凍結融解によるホモジナイズと氷上の音波処理に依り均質化され
た（Bandelin sonoplus製ＧＭ７０、３００ｗ、３×１０秒）。溶離物は遠心分
離し（１０，０００ｇ、２０分）、７５０μｌｋＦｅ−ＮＴＡ−アガロースを用
いて培養し、４℃で１時間バッチ操作を行った。（Qiagen expキット、Qiagen,
Hilden、独）。Ｆｅ−ＮＴＡ−アガロースはＮｉ−ＮＴＡ−アガロース（Qiagen
expキット、Qiagen, Hilden、独）からのものを転用した。その洗浄要領は次の
通り： １）２容の再蒸留水 ２）３容の再生バッファー（６Ｍ 塩酸グアニジン、０．２Ｍ 酢酸） ３）５容の再蒸留水 ４）３容の２％ＳＤＳ ５）１容の２５％エタノール ６）１容の５０％エタノール ７）１容の７５％エタノール ８）５容の１００％エタノール ９）１容の７５％エタノール １０）１容の５０％エタノール １１）１容の２５％エタノール １２）１容の再蒸留水 １３）５容の１００ｍＭＮａ−ＥＤＴＡ液 ｐＨ ８．０ １４）５容の再蒸留水 １５）２容の１００ｍＭのＦｅＳＯ４／１ｍＭｋ 還元グルタチオン／１ｍＭ
ジチオトレイトール／１００ｍＭ アスコルビン酸 １６）２容の再蒸留水 １７）２容の再生バッファー（６Ｍの塩酸グアニジン，０．２Ｍの酢酸） １８）２容のバッファーＡ３（２０ｍＭのトリス−塩酸 ｐＨ ７．９，５ｍＭ
イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２００μＭ ＦｅＳＯ４／１ｍＭ 還元グ
ルタチオン／１ｍＭ ジチオトレイトール／１ｍＭ アスコルビン酸 バッチ試料を３０ｍｌのクロマトグラフィー管に加え、１５ｍｌのバッファー
Ａ４（２０ｍＭのトリス−塩酸 ｐＨ ７．９、５ｍＭ イミダゾール、５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ 還元グルタチオン／１ｍＭ ジチオトレイトール／１ｍＭ
酢酸）で洗浄し、引き続き８ｍＬのバッファーＢ（２０ｍＭ 塩酸トリス ｐＨ
７．９、６０ｍＭ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ 還元グルタチ
オン／１ｍＭ ジチオトレイトール／１ｍＭ アスコルビン酸）で洗浄した。ここ
でＮ末端のヒスチジンタグ付きカルシニューリンーＡ／カルシニューリンＢのヘ
テロダイマーを、１．２ｍｌのバッファーＣ（１０ｍＭ 塩酸トリス，５００ｍ
Ｍ イミダゾール、２５０ｍＭｋ ＮａＣＬ／１ｍＭ 還元グルタチオン／１ｍＭ
ジチオトレイトール／１ｍＭ アスコルビン酸）構成のもので３回溶離を行い、
バッファーはガス抜きをした後引き続き窒素を飽和させた。カルシニューリンの
酸化を防止するため溶出液は窒素含有の酸素を含まぬガラス容器中に、−８０℃
で貯蔵した。純度並びに正しい発現製品は２０μｌの溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（不連続な１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、免疫ブロッティング
またはＮ末端蛋白質シーケンスを使って検査することとした。
【００５３】 １６．ヒトカルシニューリン−Ａ−αのｐＥＧＦＰの真核生物発現ベクター中
にサブクローニングして、安定した感染ＰＣ１２胞の形成（蛍光標識としての緑
蛍光蛋白質を備えたＣ末端融合蛋白質） ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０ベクターをＢａｍＨＩ／ＸｍａＩを使って消化し、粘
着端を持つＣＮＡａ２小片を作った。この精製断片をＢｇＩ−ＩＩ／ＸｍａＩで
処理したｐＥＧＦＰ−ＣＩベクター（Clontech Lab, Palo Alto, CA, USA）中に
ライゲートした。ＸＬ２−ブルー細胞（２５μｇ／ｍｌカナマイシン）中の増殖
およびプラスミドの精製後、ＣＮＡａ−ｐＥＧＦＰベクター構成体をＣａｌＰＨ
ｏｓ（ＴＭ）感染キットを使ってＰＣ１２のラットの副腎褐色細胞腫中に、製造
メーカーのテキスト（Clontech Lab, Palo Alto, CA, USA）に従って感染させて
見た。安定した感染のＣＮＡｓ−ｐＥＧＦＰクローンは３ヶ月の普及期間中、蛍
光顕微鏡を活用して選定を行った（Biorad Lab, Hercules, CA, USA製の共焦点
のＭＲＣ １０２４顕微鏡は４８８ｎｍ励起、５２０ｎｍ放射である）。
にサブクローニングして、安定した感染ＰＣ１２胞の形成（蛍光標識としての緑
蛍光蛋白質を備えたＣ末端融合蛋白質） ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０ベクターをＢａｍＨＩ／ＸｍａＩを使って消化し、粘
着端を持つＣＮＡａ２小片を作った。この精製断片をＢｇＩ−ＩＩ／ＸｍａＩで
処理したｐＥＧＦＰ−ＣＩベクター（Clontech Lab, Palo Alto, CA, USA）中に
ライゲートした。ＸＬ２−ブルー細胞（２５μｇ／ｍｌカナマイシン）中の増殖
およびプラスミドの精製後、ＣＮＡａ−ｐＥＧＦＰベクター構成体をＣａｌＰＨ
ｏｓ（ＴＭ）感染キットを使ってＰＣ１２のラットの副腎褐色細胞腫中に、製造
メーカーのテキスト（Clontech Lab, Palo Alto, CA, USA）に従って感染させて
見た。安定した感染のＣＮＡｓ−ｐＥＧＦＰクローンは３ヶ月の普及期間中、蛍
光顕微鏡を活用して選定を行った（Biorad Lab, Hercules, CA, USA製の共焦点
のＭＲＣ １０２４顕微鏡は４８８ｎｍ励起、５２０ｎｍ放射である）。
【００５４】 １７．カルシニューリン−Ａ−βのｐＥＧＰ内へのサブクローンニング １６例に記載したと同一手順が適用されるが、ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０ベクタ
ーをＣＮＡｂ２−ｐＱＥ３０に替えてＣＮＡｂ−ｐＥＧＦＰを得る点が異なって
いる。
ーをＣＮＡｂ２−ｐＱＥ３０に替えてＣＮＡｂ−ｐＥＧＦＰを得る点が異なって
いる。
【００５５】 １８．カルシニューリン−Ａ−γのｐＥＧＦＰへのサブクローニング １６例に記載したと同一手順の適用であるが、ＣＮＡｇ−ｐＥＧＦＰを売るの
にＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０に替えてＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０ベクターを用いる点
が違っている。
にＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０に替えてＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０ベクターを用いる点
が違っている。
【００５６】 １９．ウエスタンブロッテイング方法と蛋白質シーケンス 精製蛋白質の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥからＰＶＤＦ膜（Boehringer-Mannheim,
Mannheim、独）への移動は、移動バッファー（４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリ
シン、２０％メタノール、１％ＳＤＳ、ｐＨ ９．２の組成）を用いた標準マニ
ュアルに従い実施され、また以下のブロッティング条件；２５Ｖ／１１０ｍＡの
もとで７５分が採用される。ブロッキング、ウォッシングおよび検出（ＨＲＰ検
知システム）も製造社側のマニュアル（ＥＣＬキット、Amersham, Bickinghamsh
ire, UK）に従って実施した。アンチ−ヒトＣｕＺｎＳＯＤ抗体（希釈率１：５
０００、ラビットpolyclonal抗ヒトＳＯＤ１抗体；BIOMOL, Hamburg，独）を一
次抗体として使用し、ＨＲＰと標識したアンチ−ラビットＩｇＧ抗体（希釈率
１：１０，０００）を第二抗体として使用した。カルシニューリン−Ａ（α、
β、γアイソフォーム）の検出用としてpolyclonalカルシニューリン−Ａ抗体を
１：５０００の希釈体（Sigma Aldrich, Deisenhofen、独）として用いた。Ｎ末
端蛋白質シーケンスに使用するため、ＰＶＤＦ膜を１００％メタノールに浸漬し
た。翻訳後修飾によりＮ末端ブロックされたと見られる蛋白質を、製造者側のマ
ニュアルに従って（Boehringer-Mannheim, Mannheim、独）、アシルアミノ−酸
−ペプチダーゼを使って処理した。クマシンブリリアントブルー染色バンドは切
り棄てた。ぺプチド自動のエドマン分解は、アプライドバイオシステムによる蛋
白質シーケンサー（４７６Ａ）を使って行った。
Mannheim、独）への移動は、移動バッファー（４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリ
シン、２０％メタノール、１％ＳＤＳ、ｐＨ ９．２の組成）を用いた標準マニ
ュアルに従い実施され、また以下のブロッティング条件；２５Ｖ／１１０ｍＡの
もとで７５分が採用される。ブロッキング、ウォッシングおよび検出（ＨＲＰ検
知システム）も製造社側のマニュアル（ＥＣＬキット、Amersham, Bickinghamsh
ire, UK）に従って実施した。アンチ−ヒトＣｕＺｎＳＯＤ抗体（希釈率１：５
０００、ラビットpolyclonal抗ヒトＳＯＤ１抗体；BIOMOL, Hamburg，独）を一
次抗体として使用し、ＨＲＰと標識したアンチ−ラビットＩｇＧ抗体（希釈率
１：１０，０００）を第二抗体として使用した。カルシニューリン−Ａ（α、
β、γアイソフォーム）の検出用としてpolyclonalカルシニューリン−Ａ抗体を
１：５０００の希釈体（Sigma Aldrich, Deisenhofen、独）として用いた。Ｎ末
端蛋白質シーケンスに使用するため、ＰＶＤＦ膜を１００％メタノールに浸漬し
た。翻訳後修飾によりＮ末端ブロックされたと見られる蛋白質を、製造者側のマ
ニュアルに従って（Boehringer-Mannheim, Mannheim、独）、アシルアミノ−酸
−ペプチダーゼを使って処理した。クマシンブリリアントブルー染色バンドは切
り棄てた。ぺプチド自動のエドマン分解は、アプライドバイオシステムによる蛋
白質シーケンサー（４７６Ａ）を使って行った。
【００５７】 ２０．カルシニューリン−ホスファターゼの検索 １００ｎｇ−４μｇの組換えカルシニューリン（カルシニューリン−Ａ／Ｂヘ
テロダイマー）、または１００ｎｇ−１μｇの精製したウシの脳からのカルシニ
ューリン（Sigma Aldrich, Deisenhofen、独）、または１００μｇ均質組織また
は細胞抽出物を、従来のカルシニューリンホスファターゼの検定用として用い
た。１００μｇ細胞または組織は記載（Stemmer他、１９９５）に従って十分に
均質化した。一部精製した酸化還元に鋭敏に応えるカルシニューリンを４℃で１
０分間、１４，０００ｒｐｍのもとで遠心分離に掛けて（Eppendorf遠心分離機
５４１７Ｒ使用）調製し、得られる上澄液は記載（Stemmer他、１９９５）のご
とく、１．５×１０ｃｍＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ５０のゲル濾過管を使って分離し
た。ホスホチロシン ホスファターゼの検定は、３０μＭの蛍光モノホスフェー
トまたは２０ｍＭのパラ−ニトロフェニルホスフェート（Sigma Aldrich, Deise
nhofen, 独製）を使って、（全検定容量１００μｌ）のマイクロプレート中で行
った。その他のテスト要件は１０μｌの組換え、精製のまたは一部精製の試料と
し、検定用バッファーの構成は（２５ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ ７；２ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ２；０．１μＭカルモジュリン；２５μＭのＦＫ５０６）とした。パラ−Ｎ
ｉ−トロフェニルホスフェートまたは蛍光モノホスフェートとの酵素反応を開始
した後の、パラ−ニトロフェニルホスフェートの４０５ｎＭでの吸光度または蛍
光を、３０℃、２０分間に亘り測定した結果、λ励起＝４８５ｎＭ、λ放射＝５
２０ｎＭであり、使用機器はＵＶ／ＶＩＳ／蛍光マイクロプレート光度計（Biol
umin９６０動式蛍光／吸光フォトメーター、Molecular Dynamics製）であった。
ホスホセリン ホスファターゼの検定は（HubbardおよびKlee、１９９１）、（Wa
ng他，１９９６）の記載に従って行った。その要点は、先ず４０μｌの組換え用
のまたは一部精製のカルシニューリンを試験用バッファー（４０ｍＭトリス／塩
酸 ｐＨ ８；０．１ＭＫＣＬ；０．４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ；０．６７ｍＭＤＴ
Ｔ；０．６７μＭカルモジュリン；１μＭＦＫＢＰ結合用蛋白質；０．５μＭ o
cadaic酸−ホスファターゼＡ１およびＡ２の抑制用の構成）と混合し、次に２０
μｌの基質バッファー（７．７μＭ放射性ホスホリレートＲＩＩ−ペプチド、
２．０ｍＭＣａＣｌ２構成）を添加して、カルシニューリンの酵素反応とＣａ誘
導による酸化還元不活性化反応を開始させた。試験内容は含量検定とし、それぞ
れの読み用としてカルシニューリンの活性の確認に、１μＭのＦＫ５０６つまり
シクロスポリンを添加使用した。カルシニューリンの酸化還元不活性化反応に対
するＣｕＺｎＳＯＤの保護効果の判定には、３μｇの組換えヒト野生型または突
然変異性ＣｕＺｎＳＯＤ（一定ＣｕＺｎＳＯＤ蛋白質）を加えるか、または１．
６７単位の上記ＣｕＺｎＳＯＤ系（一定ＣｕＺｎＳＯＤ活性剤）を添加した。反
応混合物は３０℃で２分間培養し、１００ｍＭのリン酸カリウム／５％ＴＣＡの
時点で停止した。反応混合を０．５ｍｌのイオン交換管（Dowex; AG50w-X8, Bio
RAD製）を通過させ、未結合リン酸塩は０．５ｍｌの水で溶離した。放出リン酸
塩量はシンチレーションカウンターで測定した。
テロダイマー）、または１００ｎｇ−１μｇの精製したウシの脳からのカルシニ
ューリン（Sigma Aldrich, Deisenhofen、独）、または１００μｇ均質組織また
は細胞抽出物を、従来のカルシニューリンホスファターゼの検定用として用い
た。１００μｇ細胞または組織は記載（Stemmer他、１９９５）に従って十分に
均質化した。一部精製した酸化還元に鋭敏に応えるカルシニューリンを４℃で１
０分間、１４，０００ｒｐｍのもとで遠心分離に掛けて（Eppendorf遠心分離機
５４１７Ｒ使用）調製し、得られる上澄液は記載（Stemmer他、１９９５）のご
とく、１．５×１０ｃｍＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ５０のゲル濾過管を使って分離し
た。ホスホチロシン ホスファターゼの検定は、３０μＭの蛍光モノホスフェー
トまたは２０ｍＭのパラ−ニトロフェニルホスフェート（Sigma Aldrich, Deise
nhofen, 独製）を使って、（全検定容量１００μｌ）のマイクロプレート中で行
った。その他のテスト要件は１０μｌの組換え、精製のまたは一部精製の試料と
し、検定用バッファーの構成は（２５ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ ７；２ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ２；０．１μＭカルモジュリン；２５μＭのＦＫ５０６）とした。パラ−Ｎ
ｉ−トロフェニルホスフェートまたは蛍光モノホスフェートとの酵素反応を開始
した後の、パラ−ニトロフェニルホスフェートの４０５ｎＭでの吸光度または蛍
光を、３０℃、２０分間に亘り測定した結果、λ励起＝４８５ｎＭ、λ放射＝５
２０ｎＭであり、使用機器はＵＶ／ＶＩＳ／蛍光マイクロプレート光度計（Biol
umin９６０動式蛍光／吸光フォトメーター、Molecular Dynamics製）であった。
ホスホセリン ホスファターゼの検定は（HubbardおよびKlee、１９９１）、（Wa
ng他，１９９６）の記載に従って行った。その要点は、先ず４０μｌの組換え用
のまたは一部精製のカルシニューリンを試験用バッファー（４０ｍＭトリス／塩
酸 ｐＨ ８；０．１ＭＫＣＬ；０．４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ；０．６７ｍＭＤＴ
Ｔ；０．６７μＭカルモジュリン；１μＭＦＫＢＰ結合用蛋白質；０．５μＭ o
cadaic酸−ホスファターゼＡ１およびＡ２の抑制用の構成）と混合し、次に２０
μｌの基質バッファー（７．７μＭ放射性ホスホリレートＲＩＩ−ペプチド、
２．０ｍＭＣａＣｌ２構成）を添加して、カルシニューリンの酵素反応とＣａ誘
導による酸化還元不活性化反応を開始させた。試験内容は含量検定とし、それぞ
れの読み用としてカルシニューリンの活性の確認に、１μＭのＦＫ５０６つまり
シクロスポリンを添加使用した。カルシニューリンの酸化還元不活性化反応に対
するＣｕＺｎＳＯＤの保護効果の判定には、３μｇの組換えヒト野生型または突
然変異性ＣｕＺｎＳＯＤ（一定ＣｕＺｎＳＯＤ蛋白質）を加えるか、または１．
６７単位の上記ＣｕＺｎＳＯＤ系（一定ＣｕＺｎＳＯＤ活性剤）を添加した。反
応混合物は３０℃で２分間培養し、１００ｍＭのリン酸カリウム／５％ＴＣＡの
時点で停止した。反応混合を０．５ｍｌのイオン交換管（Dowex; AG50w-X8, Bio
RAD製）を通過させ、未結合リン酸塩は０．５ｍｌの水で溶離した。放出リン酸
塩量はシンチレーションカウンターで測定した。
【００５８】 酵素蛋白ホスファターゼの検定には、生理用外の基質フルオロセンモノリン酸
塩（ＦＭＰ）を用いた。ＦＭＰ用にはMiChaelis-Menten動反応を想定して、その
動的データの解析にはLineweaver-Burk法を採用した結果、ｋｍ＝４０μＭ；Ｖ
ｍａｘ＝４００μｍｏｌの値を得た。この検定方法はカルシニューリンにも、ま
たＭｇに影響される蛋白ホスファターゼ２ｃ（Grothe他によればデータの開示な
し）にも適用できた。カルシニューリンの１２．５〜７５ｐＭｋ範囲出は，酵素
活性度は直線性を示す。ＦＭＰはパラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）
より感度が高い。但しＦＭＰもｐＮＰＰも概して免疫抑制剤ＦＫ５０６つまりシ
クロスポリン（細胞ホモジェネート、一部精製のカルシニューリン）によるカル
シニューリン活性度の測定には向いていない。何れの基質においてもカルシニュ
ーリンまたはＣｕＺｎＳＯＤによるその不活性化の防止について、Ｃａの示す酸
化還元による不活性化の測定には失敗であった。この抑制試験はまた、カルシウ
ムを他の二価のカチオン例えば（Ｎｉ２＋、Ｍｇ２＋）で置き換えても不成功で
あった。免疫抑制薬剤の抑制試験について（例えばＲＩＩ−ペプチドホスホペプ
チド）採用できたのは、生理関連の基質のみであった。従来の放射性検定にあっ
ては、１μＭのＦＫ５０６つまりシクロスポリンの９５％の抑制効果が測定され
ていた。その結論として言えることは、免疫抑制薬剤によるカルシニューリンの
抑制活性効果を得るには、ｐＮＰＰおよびＦＭＰよりも分子量の大きな基質を必
要とするにある。さらに言えることとして、酸化還元の感度とホスホセリンホス
ファターゼの活性度とは関連しており、従ってＮＰＰまたはＦＭＰｓ４に類似の
ホスホチロシンでは検出は無理と言うことになる。組換えのヒト野生型のＣｕＺ
ｎＳＯＤ、並びに生成のヒト用エリスロシットタイプのＣｕＺｎＳＯＤ（Sigma
Aldrich, Deiasenhofen、独）のものは、カルシウム誘導の酸化還元不活性化の
後出は、強度の神経性疾病を伴う突然変異によるＣｕＺｎＳＯＤ蛋白質出は、レ
ドックス不活性化に対してカルシニューリンを守るには力不足と言う状態であっ
た。
塩（ＦＭＰ）を用いた。ＦＭＰ用にはMiChaelis-Menten動反応を想定して、その
動的データの解析にはLineweaver-Burk法を採用した結果、ｋｍ＝４０μＭ；Ｖ
ｍａｘ＝４００μｍｏｌの値を得た。この検定方法はカルシニューリンにも、ま
たＭｇに影響される蛋白ホスファターゼ２ｃ（Grothe他によればデータの開示な
し）にも適用できた。カルシニューリンの１２．５〜７５ｐＭｋ範囲出は，酵素
活性度は直線性を示す。ＦＭＰはパラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）
より感度が高い。但しＦＭＰもｐＮＰＰも概して免疫抑制剤ＦＫ５０６つまりシ
クロスポリン（細胞ホモジェネート、一部精製のカルシニューリン）によるカル
シニューリン活性度の測定には向いていない。何れの基質においてもカルシニュ
ーリンまたはＣｕＺｎＳＯＤによるその不活性化の防止について、Ｃａの示す酸
化還元による不活性化の測定には失敗であった。この抑制試験はまた、カルシウ
ムを他の二価のカチオン例えば（Ｎｉ２＋、Ｍｇ２＋）で置き換えても不成功で
あった。免疫抑制薬剤の抑制試験について（例えばＲＩＩ−ペプチドホスホペプ
チド）採用できたのは、生理関連の基質のみであった。従来の放射性検定にあっ
ては、１μＭのＦＫ５０６つまりシクロスポリンの９５％の抑制効果が測定され
ていた。その結論として言えることは、免疫抑制薬剤によるカルシニューリンの
抑制活性効果を得るには、ｐＮＰＰおよびＦＭＰよりも分子量の大きな基質を必
要とするにある。さらに言えることとして、酸化還元の感度とホスホセリンホス
ファターゼの活性度とは関連しており、従ってＮＰＰまたはＦＭＰｓ４に類似の
ホスホチロシンでは検出は無理と言うことになる。組換えのヒト野生型のＣｕＺ
ｎＳＯＤ、並びに生成のヒト用エリスロシットタイプのＣｕＺｎＳＯＤ（Sigma
Aldrich, Deiasenhofen、独）のものは、カルシウム誘導の酸化還元不活性化の
後出は、強度の神経性疾病を伴う突然変異によるＣｕＺｎＳＯＤ蛋白質出は、レ
ドックス不活性化に対してカルシニューリンを守るには力不足と言う状態であっ
た。
【００５９】 カルシウムによるカルシニューリンの不活性化に対するCuZnSODの保護効果 0分と20分後の抑制可能なRII-ホスホペプチドの活性度とFK506の比較率 ヒト用のCuZnSOD 定常蛋白質 定常活性度 (3μg) (1.67U) 赤血球野生型 (8330U/mg) 57±10% 57±10% 組換え野生型 (6380U/mg) 70±33% 58±22% 組換え、突然変異体D90A (4590U/mg) 42±17% 32±15% 組換え、突然変異体G93A (2130U/mg) 16±16% 21±22% 組換え、突然変異体A4V (1820U/mg) 22±27% 8±3% 対照(CuZnSODなし) (0U/mg) 9±7% 9±7% 保護効果はＣｕＺｎＳＯＤの活性度には影響されない。それは比較的高い酵素
活性度に見合う突然変異によるＣｕＺｎＳＯＤの蛋白質量が比較的高くても、カ
ルシニューリンの保護効果にはそれ程影響しなかったためである。
活性度に見合う突然変異によるＣｕＺｎＳＯＤの蛋白質量が比較的高くても、カ
ルシニューリンの保護効果にはそれ程影響しなかったためである。
【００６０】 従って家族に関係する萎縮性側索硬化症を伴うアミノ酸の置換は、カルシニュ
ーリン中の蛋白質の相互作用にとって重要であること、従ってまたこの置換がカ
ルシニューリンのカルシウムによる酸化還元の不活性化に対してＣｕＺｎＳＯＤ
が仲立ちする保護効果に含まれて来ると結論される。この保護効果は萎縮性側索
硬化症と、カルシニューリンのＣｕＺｎＳＯＤによる保護のもとで乱されるた
め、別の神経性および心筋疾病（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、て
んかん、虚血、心疾患）にとっても重要な要因になることがある。
ーリン中の蛋白質の相互作用にとって重要であること、従ってまたこの置換がカ
ルシニューリンのカルシウムによる酸化還元の不活性化に対してＣｕＺｎＳＯＤ
が仲立ちする保護効果に含まれて来ると結論される。この保護効果は萎縮性側索
硬化症と、カルシニューリンのＣｕＺｎＳＯＤによる保護のもとで乱されるた
め、別の神経性および心筋疾病（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、て
んかん、虚血、心疾患）にとっても重要な要因になることがある。
【００６１】 生物検定の処理範囲を高めてＣｕＺｎＳＯＤとカルシニューリンの相互作用を
高める人工的または内因性薬剤（活性剤）を見出し、分離することができる。従
って酸化還元による不活性化に対しカルシニューリンを保護するか、またはＣｕ
ＺｎＳＯＤとカルシニューリンの相互作用を弱める薬剤（抑制剤）を開発して、
カルシニューリンの活性を抑えることもできよう。抑制剤はＦＫ５０６またはシ
クロスポリン等の毒性の免疫抑制剤との置換に有用と思われる。活性剤および抑
制剤は何れも萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんか
ん、虚血の他に心血管疾患の治療に有用と見られる。
高める人工的または内因性薬剤（活性剤）を見出し、分離することができる。従
って酸化還元による不活性化に対しカルシニューリンを保護するか、またはＣｕ
ＺｎＳＯＤとカルシニューリンの相互作用を弱める薬剤（抑制剤）を開発して、
カルシニューリンの活性を抑えることもできよう。抑制剤はＦＫ５０６またはシ
クロスポリン等の毒性の免疫抑制剤との置換に有用と思われる。活性剤および抑
制剤は何れも萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんか
ん、虚血の他に心血管疾患の治療に有用と見られる。
【００６２】 ２１．組換えカルシニューリン−Ａ、組換えカルシニューリン−Ｂ、カルモジ
ュリンおよび組換えＣｕＺｎＳＯＤを用いた広範囲の生物検定（ＣｕＺｎＳＯＤ
／カルシニューリンとの相互作用向けとしての活性剤または抑制剤を識別する分
析手法） レーザによる揺らぎの相関を検定する分光計測（ＦＣＳ）はリガンド管の相互
作用を定量する有力な技術である。十分に設定された共焦点レーザで励起される
光量の内の蛍光Ｆ（ｔ）は、時間を関数として表し計測される。蛍光の揺らぎの
時間的自己相関δ Ｆ（Ｔ）により、この動機構の時間尺度とプローブ容積内の
独立蛍光群中の平均数が決まる。蛍光揺らぎが拡散運動と蛍光の感度反応から起
きるとすると、蛍光揺らぎによる相関信号は概略次式で表される。
ュリンおよび組換えＣｕＺｎＳＯＤを用いた広範囲の生物検定（ＣｕＺｎＳＯＤ
／カルシニューリンとの相互作用向けとしての活性剤または抑制剤を識別する分
析手法） レーザによる揺らぎの相関を検定する分光計測（ＦＣＳ）はリガンド管の相互
作用を定量する有力な技術である。十分に設定された共焦点レーザで励起される
光量の内の蛍光Ｆ（ｔ）は、時間を関数として表し計測される。蛍光の揺らぎの
時間的自己相関δ Ｆ（Ｔ）により、この動機構の時間尺度とプローブ容積内の
独立蛍光群中の平均数が決まる。蛍光揺らぎが拡散運動と蛍光の感度反応から起
きるとすると、蛍光揺らぎによる相関信号は概略次式で表される。
【００６３】 ＧＤＲ（τ）＝ＧＤｉｆｆ（τ）・〔１＋Ａ・ｅｘｐ（−ｋＲ・τ）〕 ここで、τは、蛍光相関時間 ｋRは、蛍光による標識リガンドの見かけ結合定数 Ａは、平衡係数で決まる定数 測定の一つが蛍光標識によるリガンドのみを含む溶液について行い、次に第二
の測定を蛍光標識リガンドと相互に作用する分子の一つを含む溶液について行う
ものとすると、相関信号のＧＤＲは別々に分析することができ、相互反応分子の
結合要素が得られる。相互作用を行う分子とこのリガンドとが結合すると、水力
半径は高まり従って拡散係数は減じて相関時間は延びる。
の測定を蛍光標識リガンドと相互に作用する分子の一つを含む溶液について行う
ものとすると、相関信号のＧＤＲは別々に分析することができ、相互反応分子の
結合要素が得られる。相互作用を行う分子とこのリガンドとが結合すると、水力
半径は高まり従って拡散係数は減じて相関時間は延びる。
【００６４】 蛍光標識としての蛍光で標識化した組換えＣｕＺｎＳＯＤを使ってカルシニュ
ーリンに対する結合動機構を監視測定するようにした。ＣｕＺｎＳＯＤは製造社
側の取扱説明書（FluoReporter Protein labeling Kit, Molecular Probes, Lei
den, オランダ）に従って、Oregon-Green-514染料を使って標識した。ＣｕＺｎ
ＳＯＤダイマー当りの蛍光染料の標識量は、２６５ｎｍでのＣｕＺｎＳＯＤ蛋白
質の吸光度対オレゴン−染料の５１４ｎｍ当りの吸光度の比率を決めて定量化し
た。拡散定数と標識化ＣｕＺｎＳＯＤ（１００ｎＭ）の相関時間とを、１０μｌ
の検定バッファー中自己相関器（λ励起＝４８８ｎｍ、λ放射＝５１１ｎＭ）に
直結した共焦点レーザー顕微鏡を使って、牛の血清アルブミン処理したガラス板
上で測ったが、このバッファーの組成はｐＨ ７．１のリン酸ナトリウムの５０
ｍＭ；ＮａＣｌの１５０ｍＭ：ＤＴＴの０．６７ｍＭ；カルモジュリンの０．６
７μＭ；ＣａＣｌ２の０．６７ｍＭ；ＭｇＣｌ２１ｍＭとした。モードをロック
したＴｉ：ＳａまたはＣＷアルゴンイオンレーザーからのビームは並行光線とし
て、浸漬顕微鏡の対物レンズ（ツアイスＣ−アポクロマット６３×１．２ｗ）の
後部開口部に注入され、小形の回折絞りスポットを形成させた。放出蛍光ライト
はビームスプリッター／フィルターを組合せ励起ライトから分離させた同一対物
レンズを使って集め、先ず始めに可変ピンホールに、続いてデテクターに映像を
結ばせた（Avalance PHotodiode EG & G SPCM AQ161またはPMT Hamamatsu R5600
-03）標識のＣｕＺｎＳＯＤは４１，０００Ｄａｋの水力半径に見合う自己相関
時間を示した。この半径はホモダイマーの予想分子量に比較しうる値である（３
４，０００Dalton）。次に０．２μｌのカルシニューリン−Ａ／Ｂヘテロダイマ
ー（５μＭ）を標識化したＣｕＺｎＳＯＤ混合物に供給し、蛍光の相関信号を求
めた。水力半径は４１ｋＤａから９０ｋＤａに高まり、略一つのカルシニューリ
ンのヘテロダイマーと他の一つのＣｕＺｎＳＯＤダイマーは相互に作用し合って
いる（予想値は１１４ｋＤａ）。突然変異のＤ９０ＡのＣｕＺｎＳＯＤを採用す
ると、１８０，０００ｋＤａの見かけ分子量が得られ、カルシニューリン／Ｃｕ
ＺｎＳＯＤの集合体の得られるのが分かる。ここでヒト野生型のＣｕＺｎＳＯＤ
とカルシニューリンとの間の見かけ結合定数は、ＫＤ＝２×１０−６Ｍ±１×１
０−６Ｍと見込まれた。結論としてはレーザーの相関分光技術はリガンドに対し
ては最高のスクリーニング能力が発揮されると見込まれ、ＣｕＺｎＳＯＤ／カル
シニューリンの相互作用は減じ、その状況は予想薬剤の添加後の自己相関タイム
の低減により判定できることになる。化学品としてペプチドまたは天然の化合物
を使った適合物質に対しては選別能力を示すことができる。
ーリンに対する結合動機構を監視測定するようにした。ＣｕＺｎＳＯＤは製造社
側の取扱説明書（FluoReporter Protein labeling Kit, Molecular Probes, Lei
den, オランダ）に従って、Oregon-Green-514染料を使って標識した。ＣｕＺｎ
ＳＯＤダイマー当りの蛍光染料の標識量は、２６５ｎｍでのＣｕＺｎＳＯＤ蛋白
質の吸光度対オレゴン−染料の５１４ｎｍ当りの吸光度の比率を決めて定量化し
た。拡散定数と標識化ＣｕＺｎＳＯＤ（１００ｎＭ）の相関時間とを、１０μｌ
の検定バッファー中自己相関器（λ励起＝４８８ｎｍ、λ放射＝５１１ｎＭ）に
直結した共焦点レーザー顕微鏡を使って、牛の血清アルブミン処理したガラス板
上で測ったが、このバッファーの組成はｐＨ ７．１のリン酸ナトリウムの５０
ｍＭ；ＮａＣｌの１５０ｍＭ：ＤＴＴの０．６７ｍＭ；カルモジュリンの０．６
７μＭ；ＣａＣｌ２の０．６７ｍＭ；ＭｇＣｌ２１ｍＭとした。モードをロック
したＴｉ：ＳａまたはＣＷアルゴンイオンレーザーからのビームは並行光線とし
て、浸漬顕微鏡の対物レンズ（ツアイスＣ−アポクロマット６３×１．２ｗ）の
後部開口部に注入され、小形の回折絞りスポットを形成させた。放出蛍光ライト
はビームスプリッター／フィルターを組合せ励起ライトから分離させた同一対物
レンズを使って集め、先ず始めに可変ピンホールに、続いてデテクターに映像を
結ばせた（Avalance PHotodiode EG & G SPCM AQ161またはPMT Hamamatsu R5600
-03）標識のＣｕＺｎＳＯＤは４１，０００Ｄａｋの水力半径に見合う自己相関
時間を示した。この半径はホモダイマーの予想分子量に比較しうる値である（３
４，０００Dalton）。次に０．２μｌのカルシニューリン−Ａ／Ｂヘテロダイマ
ー（５μＭ）を標識化したＣｕＺｎＳＯＤ混合物に供給し、蛍光の相関信号を求
めた。水力半径は４１ｋＤａから９０ｋＤａに高まり、略一つのカルシニューリ
ンのヘテロダイマーと他の一つのＣｕＺｎＳＯＤダイマーは相互に作用し合って
いる（予想値は１１４ｋＤａ）。突然変異のＤ９０ＡのＣｕＺｎＳＯＤを採用す
ると、１８０，０００ｋＤａの見かけ分子量が得られ、カルシニューリン／Ｃｕ
ＺｎＳＯＤの集合体の得られるのが分かる。ここでヒト野生型のＣｕＺｎＳＯＤ
とカルシニューリンとの間の見かけ結合定数は、ＫＤ＝２×１０−６Ｍ±１×１
０−６Ｍと見込まれた。結論としてはレーザーの相関分光技術はリガンドに対し
ては最高のスクリーニング能力が発揮されると見込まれ、ＣｕＺｎＳＯＤ／カル
シニューリンの相互作用は減じ、その状況は予想薬剤の添加後の自己相関タイム
の低減により判定できることになる。化学品としてペプチドまたは天然の化合物
を使った適合物質に対しては選別能力を示すことができる。
【００６５】 ２２．組換えカルシニューリン−Ａ、組換えカルシニューリン−Ｂ、カルモジ
ュリンおよびＲＩＩ−Ｆフルオホスを使った高処理量の見込まれる生物検定（カ
ルシニューリンの促進剤または抑制剤を識別する分析検定） ＲＩＩペプチドは標準のぺプチド合成のマニュアル〔Blumenthal他、１９８
８、Interactiva, Ulm、独〕に従って合成した。さらにSer-15でホスホエステル
を含む蛍光標識のペプチドを得るため、アミノ酸残基のSer-15をフルオレセン−
ホスホアミデイト（FluoreDite Labeling Reagent, Perseptive Biosystems）と
組合せ、このものは通常ヌクレオチドの標識に使用し、他方でＲＩＩ−フルオホ
ス（Interactiva, Ulm、独）を得た。予想される分子量（２５７８．８Dalton）
は質量分析で確かめた（２５８０．６Ｄａｌ）。フルオホス−ＲＩＩ−ペプチド
は、蛍光分光分析で測定されたごとく（Biolumin９６０ＵＶ−／ＶＩＳ／蛍光マ
イクロ板リーダー）カルシニューリンにより転化されなかった。従ってフルオホ
ス−ＲＩＩ−ペプチドを２０例で記載したごとく、レーザー蛍光相関分光分析に
使用した。但しλｅｘｉｔ＝４８８ｎｍ、λｅｍｉｓ＝５２０ｎｍであった。さ
らに標識ＣｕＺｎＳＯＤと１０ｎｍのフルオホス−Ｒｉｉ−ペプチドを入替えた
所、４ｋＤａ（見込値は２．６ｋＤａ）に見合う水力半径を得た。カルシニュー
リンを添加したところ、分子量は１００，０００ｋＤｚに上昇し、結合定数Ｋｄ
は、Ｋｄ＝０．６×１０−６Ｍと予想される。６組のカルシニューリンのアイソ
フォーム／スプライシング変異体の間では、結合定数は近似していた。結論とし
てはレーザー相関分光分析技術は見込まれる薬剤を添加した後では、自己相関時
間を測るだけで直接基質とカルシニューリンを結合させ、リガンドのスクリーニ
ングを最高に保持することができる。６組の異なるヘテロダイマーと薬剤との結
合をコントロールすることにより、例えばカルシニューリン−Ａ−α１／カルシ
ニューリン−Ｂ；カルシニューリン−Ａ−α２／カルシニューリン−Ｂ；カルシ
ニューリン−Ａ−β１／カルシニューリン−Ｂ；カルシニューリン−Ａ−β２／
カルシニューリン−Ｂ；カルシニューリン−Ａ−γ１／カルシニューリン−Ｂ；
カルシニューリン−Ａ−γ３／カルシニューリン−Ｂの組合せにより、特殊組織
を識別することができ従って毒性の低いカルシニューリンの抑制剤を見分けるこ
とができる。
ュリンおよびＲＩＩ−Ｆフルオホスを使った高処理量の見込まれる生物検定（カ
ルシニューリンの促進剤または抑制剤を識別する分析検定） ＲＩＩペプチドは標準のぺプチド合成のマニュアル〔Blumenthal他、１９８
８、Interactiva, Ulm、独〕に従って合成した。さらにSer-15でホスホエステル
を含む蛍光標識のペプチドを得るため、アミノ酸残基のSer-15をフルオレセン−
ホスホアミデイト（FluoreDite Labeling Reagent, Perseptive Biosystems）と
組合せ、このものは通常ヌクレオチドの標識に使用し、他方でＲＩＩ−フルオホ
ス（Interactiva, Ulm、独）を得た。予想される分子量（２５７８．８Dalton）
は質量分析で確かめた（２５８０．６Ｄａｌ）。フルオホス−ＲＩＩ−ペプチド
は、蛍光分光分析で測定されたごとく（Biolumin９６０ＵＶ−／ＶＩＳ／蛍光マ
イクロ板リーダー）カルシニューリンにより転化されなかった。従ってフルオホ
ス−ＲＩＩ−ペプチドを２０例で記載したごとく、レーザー蛍光相関分光分析に
使用した。但しλｅｘｉｔ＝４８８ｎｍ、λｅｍｉｓ＝５２０ｎｍであった。さ
らに標識ＣｕＺｎＳＯＤと１０ｎｍのフルオホス−Ｒｉｉ−ペプチドを入替えた
所、４ｋＤａ（見込値は２．６ｋＤａ）に見合う水力半径を得た。カルシニュー
リンを添加したところ、分子量は１００，０００ｋＤｚに上昇し、結合定数Ｋｄ
は、Ｋｄ＝０．６×１０−６Ｍと予想される。６組のカルシニューリンのアイソ
フォーム／スプライシング変異体の間では、結合定数は近似していた。結論とし
てはレーザー相関分光分析技術は見込まれる薬剤を添加した後では、自己相関時
間を測るだけで直接基質とカルシニューリンを結合させ、リガンドのスクリーニ
ングを最高に保持することができる。６組の異なるヘテロダイマーと薬剤との結
合をコントロールすることにより、例えばカルシニューリン−Ａ−α１／カルシ
ニューリン−Ｂ；カルシニューリン−Ａ−α２／カルシニューリン−Ｂ；カルシ
ニューリン−Ａ−β１／カルシニューリン−Ｂ；カルシニューリン−Ａ−β２／
カルシニューリン−Ｂ；カルシニューリン−Ａ−γ１／カルシニューリン−Ｂ；
カルシニューリン−Ａ−γ３／カルシニューリン−Ｂの組合せにより、特殊組織
を識別することができ従って毒性の低いカルシニューリンの抑制剤を見分けるこ
とができる。
【００６６】 戦略上、２０および２１例のスクリーニング手順を組合せることもできる。カ
ルシニューリンとＣｕＺｎＳＯＤとの相互作用（２０例でのポジティブヒット）
は抑制できるが２１例の効果を示せなかった物質（ネガティブヒット）は、神経
疾患では治療使用として優先して採用できる。理由としては毒性の免疫抑制の副
作用が低められることが挙げられる。カルシニューリンとＣｕＺｎＳＯＤとの相
互作用（ポジティブヒット）を抑え得ぬが、２１例では効果を挙げた（ネガティ
ブヒット）物質は、優先して免疫抑制のプラス候補として挙げられる。両実施例
で有効な物質は毒性を示し易い。
ルシニューリンとＣｕＺｎＳＯＤとの相互作用（２０例でのポジティブヒット）
は抑制できるが２１例の効果を示せなかった物質（ネガティブヒット）は、神経
疾患では治療使用として優先して採用できる。理由としては毒性の免疫抑制の副
作用が低められることが挙げられる。カルシニューリンとＣｕＺｎＳＯＤとの相
互作用（ポジティブヒット）を抑え得ぬが、２１例では効果を挙げた（ネガティ
ブヒット）物質は、優先して免疫抑制のプラス候補として挙げられる。両実施例
で有効な物質は毒性を示し易い。
【００６７】 ２３．カルシニューリン−Ａ−ＥＧＦＰ融合蛋白質またはＣｕＺｎＳＯＤ−Ｅ
ＧＦＰ融合蛋白質に感染した、真核生物細胞を使用する細胞についての生物検定 ＣｕＺｎＳＯＤおよびカルシニューリン・イソ酵素で安定して感染を受けるＰ
Ｃ１２細胞は、神経細胞中に過剰発現効果を示すＣｕＺｎＳＯＤまたはカルシニ
ューリン効果判定のモデルとして役立つ。ＣｕＺｎＳＯＤは低酸素症の耐性の仲
介役として報じられているが、一方カルシニューリンの抑制過剰とてんかん、パ
ーキンソン病またはアルツハイマー病とは関連があるとされている。上記細胞は
引き続き実施例２０および２１の薬剤の判定に用いることができる。見込まれる
神経保護薬剤の毒性とカルシニューリンアイソフォームまたはＣｕＺｎＳＯＤの
サブ細胞分布への影響はそれぞれ継続監視して然るべきである。
ＧＦＰ融合蛋白質に感染した、真核生物細胞を使用する細胞についての生物検定 ＣｕＺｎＳＯＤおよびカルシニューリン・イソ酵素で安定して感染を受けるＰ
Ｃ１２細胞は、神経細胞中に過剰発現効果を示すＣｕＺｎＳＯＤまたはカルシニ
ューリン効果判定のモデルとして役立つ。ＣｕＺｎＳＯＤは低酸素症の耐性の仲
介役として報じられているが、一方カルシニューリンの抑制過剰とてんかん、パ
ーキンソン病またはアルツハイマー病とは関連があるとされている。上記細胞は
引き続き実施例２０および２１の薬剤の判定に用いることができる。見込まれる
神経保護薬剤の毒性とカルシニューリンアイソフォームまたはＣｕＺｎＳＯＤの
サブ細胞分布への影響はそれぞれ継続監視して然るべきである。
【００６８】 ２４．ヒスチジンタグ付き組換えＣｕＺｎＳＯＤを利用してＣｕＺｎＳＯＤの
相互作用リガンドを精製する簡易生物検定（生物源からＣｕＺｎＳＯＤ／カルシ
ニューリンの相互作用による活性剤または抑制剤を分離する予備検定法） ｐＨ８．０のリン酸ナトリウム５０ｍＭ中のヒスチジンタグ付き組換えＣｕＺ
ｎＳＯＤを、１００μｌのビーズサスペンションを１００μｌのＣｕＺｎＳＯＤ
溶液（０．３μｇ／μｌ）を使って、３０分間室温で、マイクロ板シェーカー
（６００ｒｐｍ）上でインキュベートすることで、ＣｕＺｎ−ＮＴＡの磁性アガ
ロースビーズに取付けた。ここで、ＣｕＺｎ−ＮＴＡの磁性ビーズが、実施例５
で述べたと同一手順で、Ｎｉ−ＮＴＡビーズから得られた（Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ア
ガロースビーズは、独、Hilden在のQiagen社の提供による）。マイクロ板を９６
wellマグネット上に１分間据え、上澄液は液貯めから取り除いた。
相互作用リガンドを精製する簡易生物検定（生物源からＣｕＺｎＳＯＤ／カルシ
ニューリンの相互作用による活性剤または抑制剤を分離する予備検定法） ｐＨ８．０のリン酸ナトリウム５０ｍＭ中のヒスチジンタグ付き組換えＣｕＺ
ｎＳＯＤを、１００μｌのビーズサスペンションを１００μｌのＣｕＺｎＳＯＤ
溶液（０．３μｇ／μｌ）を使って、３０分間室温で、マイクロ板シェーカー
（６００ｒｐｍ）上でインキュベートすることで、ＣｕＺｎ−ＮＴＡの磁性アガ
ロースビーズに取付けた。ここで、ＣｕＺｎ−ＮＴＡの磁性ビーズが、実施例５
で述べたと同一手順で、Ｎｉ−ＮＴＡビーズから得られた（Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ア
ガロースビーズは、独、Hilden在のQiagen社の提供による）。マイクロ板を９６
wellマグネット上に１分間据え、上澄液は液貯めから取り除いた。
【００６９】 細胞質型リガンドの分離は次の通りである：２００μｌの相互作用目的のバッ
ファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾ
ール ｐＨ８．０、０．１％のTween−８０）を液貯め含有のＣｕＺｎ−ＮＴＡア
ガロースビーズ／ＣｕＺｎＳＯＤに加え、９６wellマグネット上に液を据え、相
互反応バッファーを除去し、次いで１００ｍｇティッシュ、ＣｕＺｎＳＯＤ内部
作用のＣｕＺｎＳＯＤのリガンド用として分析すべき細胞その他の生物検定試料
を、２００μｌ lysisバッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、，１０ｍＭ イミダゾール ｐＨ８．０，０．１％のTween−８０）中で均
質化させたが、これにはdounceホモジナイザーを使用した。溶出物を３０分、１
０，０００ｇを掛けて４℃下に遠心分離し、澄明性を得た。上澄液は吸収組換え
のヒト用ＣｕＺｎ−ＮＴＡ含有の液貯めに加え、混合後０℃で６０分間培養し
た。マイクロ板を９６wellマグネット上に１分間据え、上澄液を除いた。溶解物
を除去した後、液貯めは２００ｌの内部作用バッファーを加えて二度洗浄した。
ＣｕＺｎＳＯＤの溶解液および相互作用リガンドは、１００μｌの溶解バッファ
ー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５０ｍＭ イミダゾー
ル ｐＨ８．０、０．１％ Tween−８０）の添加で得られる。
ファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾ
ール ｐＨ８．０、０．１％のTween−８０）を液貯め含有のＣｕＺｎ−ＮＴＡア
ガロースビーズ／ＣｕＺｎＳＯＤに加え、９６wellマグネット上に液を据え、相
互反応バッファーを除去し、次いで１００ｍｇティッシュ、ＣｕＺｎＳＯＤ内部
作用のＣｕＺｎＳＯＤのリガンド用として分析すべき細胞その他の生物検定試料
を、２００μｌ lysisバッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、，１０ｍＭ イミダゾール ｐＨ８．０，０．１％のTween−８０）中で均
質化させたが、これにはdounceホモジナイザーを使用した。溶出物を３０分、１
０，０００ｇを掛けて４℃下に遠心分離し、澄明性を得た。上澄液は吸収組換え
のヒト用ＣｕＺｎ−ＮＴＡ含有の液貯めに加え、混合後０℃で６０分間培養し
た。マイクロ板を９６wellマグネット上に１分間据え、上澄液を除いた。溶解物
を除去した後、液貯めは２００ｌの内部作用バッファーを加えて二度洗浄した。
ＣｕＺｎＳＯＤの溶解液および相互作用リガンドは、１００μｌの溶解バッファ
ー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ，２５０ｍＭ イミダゾー
ル ｐＨ８．０、０．１％ Tween−８０）の添加で得られる。
【００７０】 膜状リガンドの分離は次の通りである：変性相互作用バッファー（６Ｍ 塩酸
グアニジン、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、０．１％ Tween−８０）
をＣｕＺｎ−ＮＴＡアガロースビーズ、液貯め含有のＣｕＺｎＳＯＤにこれを加
え、９６wellマグネット上に据え、相互作用バッファーを取り除いた。上記操作
による排出ペレットは、２００μｌ変性の相互作用バッファー（６Ｍ 塩酸グア
ニジン、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、０．１％ Tween−８０）中で
室温で６０分可溶化した。可溶物は、室温で１０，０００ｇ下に３０分遠心分離
し、澄明性を得た。上澄液をＣｕＺｎ−ＮＴＡ吸収組換えヒトのＣｕＺｎＳＯＤ
含有の液貯めに加え、混合後、室温で６０分培養した。マイクロ板を９６wellマ
グネット上に１分間据えて、上澄液を除去するようにした。液貯めは２００μｌ
の変性相互作用バッファー（６Ｍ 塩酸グアニジン、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４
ｐＨ８．０、０．１％ Tween−８０）で一度洗浄し、次に二度目の洗浄を２０
０μｌの変性洗浄バッファー（８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ
８．０、０．１％ Tween−８０）で行う。ＣｕＺｎＳＯＤの溶解性と相互作用リ
ガンドは、１００μｌの変性溶解バッファー（８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２
ＰＯ４ ｐＨ４．０，０．１％ Tween−８０）の添加により得られる。
グアニジン、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、０．１％ Tween−８０）
をＣｕＺｎ−ＮＴＡアガロースビーズ、液貯め含有のＣｕＺｎＳＯＤにこれを加
え、９６wellマグネット上に据え、相互作用バッファーを取り除いた。上記操作
による排出ペレットは、２００μｌ変性の相互作用バッファー（６Ｍ 塩酸グア
ニジン、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、０．１％ Tween−８０）中で
室温で６０分可溶化した。可溶物は、室温で１０，０００ｇ下に３０分遠心分離
し、澄明性を得た。上澄液をＣｕＺｎ−ＮＴＡ吸収組換えヒトのＣｕＺｎＳＯＤ
含有の液貯めに加え、混合後、室温で６０分培養した。マイクロ板を９６wellマ
グネット上に１分間据えて、上澄液を除去するようにした。液貯めは２００μｌ
の変性相互作用バッファー（６Ｍ 塩酸グアニジン、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４
ｐＨ８．０、０．１％ Tween−８０）で一度洗浄し、次に二度目の洗浄を２０
０μｌの変性洗浄バッファー（８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ
８．０、０．１％ Tween−８０）で行う。ＣｕＺｎＳＯＤの溶解性と相互作用リ
ガンドは、１００μｌの変性溶解バッファー（８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２
ＰＯ４ ｐＨ４．０，０．１％ Tween−８０）の添加により得られる。
【００７１】 ＨＰＬＣ分析用の低分子量リガンドを除くため、溶離物（細胞質型または膜
状）を５ｋＤａの膜を使って、実施例７に準じ限外濾過した。低分子量リガンド
は、予備用の逆相ＨＰＬＣを使って分離した（検出は２００ｎＭのＵＶ使用）。
均質性とＵＶ検出留分の分子量とは、質量分光分析される。高分子量リガンド
（限外濾過残分）を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、１９例で述べた
通り、蛋白質バンドはシーケンス処理またはＭＡＬＤＩ質量分光分析によって得
られる。相互作用の核酸を、１％アガロースゲルを使って膜状溶離液を分離し、
また臭化エチジウムを使って染色処理して測定した。蛍光バンドはアガロース
（Qiagenゲル抽出キット、Qiagen, Hilden、独）から抽出し、ＲｓａＩを使って
蒸解し、同じくＲｓａＩ処理のｐＱＥ３０ベクター中でサブクローン操作を行
い、ＤＮＡシーケンス操作を行った。
状）を５ｋＤａの膜を使って、実施例７に準じ限外濾過した。低分子量リガンド
は、予備用の逆相ＨＰＬＣを使って分離した（検出は２００ｎＭのＵＶ使用）。
均質性とＵＶ検出留分の分子量とは、質量分光分析される。高分子量リガンド
（限外濾過残分）を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、１９例で述べた
通り、蛋白質バンドはシーケンス処理またはＭＡＬＤＩ質量分光分析によって得
られる。相互作用の核酸を、１％アガロースゲルを使って膜状溶離液を分離し、
また臭化エチジウムを使って染色処理して測定した。蛍光バンドはアガロース
（Qiagenゲル抽出キット、Qiagen, Hilden、独）から抽出し、ＲｓａＩを使って
蒸解し、同じくＲｓａＩ処理のｐＱＥ３０ベクター中でサブクローン操作を行
い、ＤＮＡシーケンス操作を行った。
【００７２】 ２５．ヒスチジンタグ付き組換えカルシニューリン−Ａおよびカルシニューリ
ン−Ｂを利用してカルシニューリンの相互作用リガンドを精製する簡易生物検定
（生物源からＣｕＺｎＳＯＤ／カルシニューリンの相互作用による活性剤または
抑制剤を分離する予備検定法） カルシニューリンの内部作用を起こすリガンドの分離と識別は、実施例２４に
準ずるが、異なる点は、組換え用としてのカルシニューリン−Ａ／Ｂヘテロダイ
マーを、Ｆｅ−ＮＴＡ磁性アガロースビーズに吸着させたことであり、このビー
ズの調整は実施例１５で述べた。なお、６組の異なるヘテロダイマーの組合わせ
（カルシニューリン−Ａ−α１／カルシニューリン−Ｂ、カルシニューリン−Ａ
−α２／カルシニューリン−Ｂ、カルシニューリン−Ａ−β１／カルシニューリ
ン−Ｂ、カルシニューリン−Ａ−β２／カルシニューリン−Ｂ、カルシニューリ
ン−Ａ−γ１／カルシニューリン−Ｂ、カルシニューリン−Ａ−γ２／カルシニ
ューリン−Ｂ）を用いて、イソ酵素とスプライシング変異体の相互作用を識別す
る。
ン−Ｂを利用してカルシニューリンの相互作用リガンドを精製する簡易生物検定
（生物源からＣｕＺｎＳＯＤ／カルシニューリンの相互作用による活性剤または
抑制剤を分離する予備検定法） カルシニューリンの内部作用を起こすリガンドの分離と識別は、実施例２４に
準ずるが、異なる点は、組換え用としてのカルシニューリン−Ａ／Ｂヘテロダイ
マーを、Ｆｅ−ＮＴＡ磁性アガロースビーズに吸着させたことであり、このビー
ズの調整は実施例１５で述べた。なお、６組の異なるヘテロダイマーの組合わせ
（カルシニューリン−Ａ−α１／カルシニューリン−Ｂ、カルシニューリン−Ａ
−α２／カルシニューリン−Ｂ、カルシニューリン−Ａ−β１／カルシニューリ
ン−Ｂ、カルシニューリン−Ａ−β２／カルシニューリン−Ｂ、カルシニューリ
ン−Ａ−γ１／カルシニューリン−Ｂ、カルシニューリン−Ａ−γ２／カルシニ
ューリン−Ｂ）を用いて、イソ酵素とスプライシング変異体の相互作用を識別す
る。
【００７３】
【表２】 シーケンスリスト目次 １．真核生物発現ベクターＣｕＺｎＳＯＤ−ＥＧＦＰ（ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＥ
ＧＦＰ）（ＤＮＡ） ２．ＣｕＺｎＳＯＤ（ＰＲＴ） ３．ＥＧＦＰ（ＰＲＴ） ４．真核生物発現ベクターＥＧＦＰ−カルシニューリンＡ α（ＣＮＡａ−ｐ
ＥＧＦＰ）（ＤＮＡ） ５．ＥＧＦＰ（ＰＲＴ） ６．カルシニューリンＡ α（ＰＲＴ） ７．真核生物発現ベクターＥＧＦＰ−カルシニューリンＡ β（ＣＮＡｂ−ｐ
ＥＧＦＰ）（ＤＮＡ） ８．ＥＧＦＰ（ＰＲＴ） ９．カルシニューリンＡ β（ＰＲＴ） １０．真核生物発現ベクターＥＧＦＰ−カルシニューリンＡ α（ＣＮＡａ−
ｐＥＧＦＰ）（ＤＮＡ） １１．ＥＧＦＰ（ＰＲＴ） １２．カルシニューリンＡ γ（ＰＲＴ） １３．原核生物発現ベクターＨｉｓ−ＣｕＺｎＳＯＤ（ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱ
Ｅ３０）（ＤＮＡ） １４．ＣｕＺｎＳＯＤ（ＰＲＴ） １５．原核生物発現ベクターＣｕＺｎＳＯＤ−Ｈｉｓ（ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱ
Ｅ６０）（ＤＮＡ） １６．ＣｕＺｎＳＯＤ（ＰＲＴ） １７．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ α１−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡａ１−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） １８．カルシニューリンＡ α１（ＰＲＴ） １９．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ２０．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ α２−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ２１．カルシニューリンＡ α２（ＰＲＴ） ２２．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ２３．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ β１−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡｂ１−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ２４．カルシニューリンＡ β１（ＰＲＴ） ２５．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ２６．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ β２−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡｂ２−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ２７．カルシニューリンＡ β２（ＰＲＴ） ２８．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ２９．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ γ１−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡｇ１−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ３０．カルシニューリンＡ γ１（ＰＲＴ） ３１．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ３２．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ γ２−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ３３．カルシニューリンＡ γ２（ＰＲＴ） ３４．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ３５．ペプチドＲＩＩ（ＰＲＴ）
ＧＦＰ）（ＤＮＡ） ２．ＣｕＺｎＳＯＤ（ＰＲＴ） ３．ＥＧＦＰ（ＰＲＴ） ４．真核生物発現ベクターＥＧＦＰ−カルシニューリンＡ α（ＣＮＡａ−ｐ
ＥＧＦＰ）（ＤＮＡ） ５．ＥＧＦＰ（ＰＲＴ） ６．カルシニューリンＡ α（ＰＲＴ） ７．真核生物発現ベクターＥＧＦＰ−カルシニューリンＡ β（ＣＮＡｂ−ｐ
ＥＧＦＰ）（ＤＮＡ） ８．ＥＧＦＰ（ＰＲＴ） ９．カルシニューリンＡ β（ＰＲＴ） １０．真核生物発現ベクターＥＧＦＰ−カルシニューリンＡ α（ＣＮＡａ−
ｐＥＧＦＰ）（ＤＮＡ） １１．ＥＧＦＰ（ＰＲＴ） １２．カルシニューリンＡ γ（ＰＲＴ） １３．原核生物発現ベクターＨｉｓ−ＣｕＺｎＳＯＤ（ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱ
Ｅ３０）（ＤＮＡ） １４．ＣｕＺｎＳＯＤ（ＰＲＴ） １５．原核生物発現ベクターＣｕＺｎＳＯＤ−Ｈｉｓ（ＣｕＺｎＳＯＤ−ｐＱ
Ｅ６０）（ＤＮＡ） １６．ＣｕＺｎＳＯＤ（ＰＲＴ） １７．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ α１−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡａ１−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） １８．カルシニューリンＡ α１（ＰＲＴ） １９．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ２０．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ α２−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡａ２−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ２１．カルシニューリンＡ α２（ＰＲＴ） ２２．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ２３．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ β１−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡｂ１−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ２４．カルシニューリンＡ β１（ＰＲＴ） ２５．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ２６．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ β２−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡｂ２−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ２７．カルシニューリンＡ β２（ＰＲＴ） ２８．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ２９．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ γ１−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡｇ１−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ３０．カルシニューリンＡ γ１（ＰＲＴ） ３１．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ３２．原核生物発現ベクターＨｉｓ−カルシニューリンＡ γ２−カルシニュ
ーリンＢ（ＣＮＡｇ２−ｐＱＥ３０）（ＤＮＡ） ３３．カルシニューリンＡ γ２（ＰＲＴ） ３４．カルシニューリンＢ（ＰＲＴ） ３５．ペプチドＲＩＩ（ＰＲＴ）
【表３】
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年９月２８日（２０００．９．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/533 1/42 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/533 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 FB03 FB07 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 BA09 BA11 CA04 CA07 CA20 DA02 DA06 EA04 FA10 GA11 GA27 HA03 HA11 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QQ91 QR13 QR19 QR24 QR48 QR58 QR75 QR77 QS39 QX02 QX10 4B065 AA01X AA26X AA58X AA72X AA87X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA16 BA25 BB01 BC01 BD14 CA28 CA31 CA46 4H045 AA10 AA30 BA17 BA51 BA70 EA50 FA20 FA52
Claims (23)
- 【請求項１】 カルシニューリンおよびスーパーオキシドジスムターゼとの
間の相互作用を測定する場合において、 ・少なくとも一つの潜在モジュレータとインキュベーション下にあるカルシニ
ューリンおよびスーパーオキシドジスムターゼから成る複合体を形成する段階
と、 ・複合体の形成を直接監視測定することにより、および／または活性状態、特
に複合体の酵素活性を監視することにより潜在モジュレータへの影響を検出する
段階とから成ることを特徴とする、 カルシニューリンに活性を付与するモジュレータのスクリーニング方法。 - 【請求項２】 スーパーオキシドジスムターゼが銅／亜鉛スーパーオキシド
ジスムターゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 複合体の形成を潜在モジュレータの存在下で行わせることを
特徴とする、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 複合体の形成後に潜在モジュレータを加えることを特徴とす
る、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】 監視測定を標識の検出、特に蛍光標識の検出により行うこと
を特徴とする、請求項１から４の何れかに記載の方法。 - 【請求項６】 カルシニューリンおよび／またはスーパーオキシドジスムタ
ーゼが標識、特に蛍光マーカーを備え、この場合好ましくは標識が緑色蛍光蛋白
質であることを特徴とする、請求項１から５の何れかに記載の方法。 - 【請求項７】 カルシニューリンおよび／またはスーパーオキシドジスムタ
ーゼが蛍光蛋白質として、特に融合蛋白質として緑色蛍光蛋白質と共に発現する
ことを特徴とする、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 複合体形成の監視測定をレーザ揺らぎの相関分光分析で行う
ことを特徴とする、請求項１から７の何れかに記載の方法。 - 【請求項９】 カルシニューリンおよびスーパーオキシドジスムターゼが細
胞中、特に真核生物細胞中で共発現され、かつ複合体の形成を細胞中で行わせる
ことを特徴とする、請求項１から８の何れかに記載の方法。 - 【請求項１０】 カルシニューリンおよび／またはスーパーオキシドジスム
ターゼが細胞中、特に原核生物細胞中で発現され、かつカルシニューリンおよび
／またはスーパーオキシドジスムターゼが分離され、および／または複合体形成
前に精製されることを特徴とする、請求項１から９の何れかに記載の方法。 - 【請求項１１】 カルシニューリンの精製をアフィニティクロマトグラフィ
ー、特に鉄−ニトリロトリアセテート−金属アフィニティクロマトグラフィーで
達成することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 スーパーオキシドジスムターゼの精製をアフィニティクロ
マトグラフイー、特に銅／亜鉛−ニトリロトリアセテート−金属アフィニティク
ロマトグラフィーにより達成することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 複合体形成段階中追加的にカルモジュリンおよび／または
カルシウムを加えることを特徴とする、請求項１から１２の何れかに記載の方
法。 - 【請求項１４】 カルシニューリンのホスファターゼ活性を分析することに
より酵素活性を測定することを特徴とする、請求項１から１３の何れかに記載の
方法。 - 【請求項１５】 ホスファターゼ活性を好ましくは標識、特に蛍光標識を運
ぶ少なくとも一つの基質を使用して分析することを特徴とする、請求項１４に記
載の方法。 - 【請求項１６】 基質をぺプチド、特にアミノ酸の下記配列による特定ペプ
チドとすることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ - 【請求項１７】 基質が残基、特にフルオレセンで標識したセリン残基を含
むペプチドであることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 カルシニューリン活性用のモジュレータのスクリーニング
用キットであって、 ・カルシニューリンを発現し得るカルシニューリンおよび／または細胞向けに
符号化するカルシニューリンおよび／またはベクターと、 ・カルシニューリンを発現し得るスーパーオキシドジスムターゼおよび／また
は細胞向けに符号化する、スーパーオキシドジスムターゼおよび／またはベクタ
ーとで構成される、 カルシニューリン活性用のモジュレータのスクリーニング用キット。 - 【請求項１９】 少なくとも一つのタグ、特にヒスチジンタグを備えたカル
シニューリンおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼを符号化する発現ベ
クター、特に原核生物発現ベクター。 - 【請求項２０】 標識蛋白質として、特に蛍光蛋白質、特に緑色蛍光蛋白質
と組み合わせてカルシニューリンおよび／またはスーパーオキシドジスムターゼ
を符号化する、発現ベクター、特に真核生物発現ベクター。 - 【請求項２１】 序列リストＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １，４，７，１０，１３，
１５，１７，２０，２３，２６，２９，または３２で設定する請求項１９または
２０に記載の発現ベクター。 - 【請求項２２】 請求項１９から２１の少なくとも一つに記載の少なくとも
一つのベクターを有する細胞。 - 【請求項２３】 セリン残基をフルオレセンで標識することを特徴とする、
配列リストＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３５で規定するぺプチド。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98113876A EP0976823A1 (de) | 1998-07-22 | 1998-07-22 | Rekombinantes Expressions System und Hoch-Durchsatz BioAssay für die therapeutische Anwendung von Calcineurin-A-Alpha, Calcineurin-A-Beta, Calcineurin-A-Gamma, Calcineurin-B und Copper/Zinc-Superoxide Dismutase bzw. zur Identifizierung von Pharmazeutika |
| EP98113876.1 | 1998-07-22 | ||
| PCT/EP1999/005220 WO2000005363A1 (en) | 1998-07-22 | 1999-07-22 | Method for screening of modulators of calcineurin activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002522015A true JP2002522015A (ja) | 2002-07-23 |
Family
ID=8232338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000561309A Pending JP2002522015A (ja) | 1998-07-22 | 1999-07-22 | カルシニューリン活性付与モジュレータのスクリーニング方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6875581B1 (ja) |
| EP (2) | EP0976823A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002522015A (ja) |
| AT (1) | ATE270709T1 (ja) |
| AU (1) | AU5412499A (ja) |
| CA (1) | CA2335278A1 (ja) |
| DE (1) | DE69918557T2 (ja) |
| DK (1) | DK1100912T3 (ja) |
| WO (1) | WO2000005363A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1281756A1 (en) * | 2001-07-31 | 2003-02-05 | GENOPIA Biomedical GmbH | Regulator of calcineurin |
| JP2005113721A (ja) * | 2003-10-06 | 2005-04-28 | Hitachi Ltd | 蒸気タービン |
| US8399185B2 (en) | 2006-01-05 | 2013-03-19 | Immune Disease Institute, Inc. | Regulators of NFAT |
| EP1810675A1 (en) | 2006-01-18 | 2007-07-25 | Institut Curie | Method for treating Huntington's disease by inhibiting dephosphorylation of huntingtin at S421 |
| US8507269B2 (en) | 2007-05-24 | 2013-08-13 | Calcimedica, Inc. | Calcium channel proteins and uses thereof |
| JP5559049B2 (ja) * | 2007-07-10 | 2014-07-23 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | 間質相互作用分子ノックアウトマウス及びその使用 |
| CA2694329A1 (en) | 2007-08-01 | 2009-02-05 | Emory University | Methods for determination of protein phosphatase activity, and uses in predicting therapeutic outcomes |
| US20110039789A1 (en) * | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Institut Curie | Use of Huntingtin Protein for the Diagnosis and the Treatment of Cancer |
| US8394778B1 (en) | 2009-10-08 | 2013-03-12 | Immune Disease Institute, Inc. | Regulators of NFAT and/or store-operated calcium entry |
| WO2012048316A2 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Immune Disease Institute, Inc. | Regulators of nfat and/or store-operated calcium entry |
| US9871201B2 (en) | 2012-03-15 | 2018-01-16 | Merck Patent Gmbh | Electronic devices |
| WO2019035034A1 (en) * | 2017-08-16 | 2019-02-21 | The Broad Institute, Inc. | NEURONAL DOSAGE METHOD INVOLVING CALCINEURIN |
| EP3715406A1 (en) | 2019-03-29 | 2020-09-30 | Henkel AG & Co. KGaA | Process for modifying the surface polarity of rubber substrates |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3366358B2 (ja) * | 1992-12-16 | 2003-01-14 | 武田薬品工業株式会社 | ヒトカルシニューリンＡαアイソフォーム蛋白質をコードするＤＮＡおよびその用途 |
| CN1147853A (zh) * | 1994-03-10 | 1997-04-16 | 藤泽药品工业株式会社 | 免疫抑制剂的定量法 |
| US5723436A (en) | 1994-10-24 | 1998-03-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Calcineurin interacting protein compositions and methods |
| US5871945A (en) * | 1994-11-23 | 1999-02-16 | Icos Corporation | Modulators of anchoring protein function |
| US5807693A (en) | 1994-11-23 | 1998-09-15 | Icos Corporation | Calcineurin inhibitory compounds and anchoring protein |
| US5978740A (en) * | 1995-08-09 | 1999-11-02 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Molecules comprising a calcineurin-like binding pocket and encoded data storage medium capable of graphically displaying them |
-
1998
- 1998-07-22 EP EP98113876A patent/EP0976823A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-07-22 CA CA002335278A patent/CA2335278A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-22 AU AU54124/99A patent/AU5412499A/en not_active Abandoned
- 1999-07-22 WO PCT/EP1999/005220 patent/WO2000005363A1/en active IP Right Grant
- 1999-07-22 JP JP2000561309A patent/JP2002522015A/ja active Pending
- 1999-07-22 AT AT99940032T patent/ATE270709T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-07-22 DE DE69918557T patent/DE69918557T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-22 DK DK99940032T patent/DK1100912T3/da active
- 1999-07-22 EP EP99940032A patent/EP1100912B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-22 US US09/744,016 patent/US6875581B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0976823A1 (de) | 2000-02-02 |
| AU5412499A (en) | 2000-02-14 |
| EP1100912B1 (en) | 2004-07-07 |
| ATE270709T1 (de) | 2004-07-15 |
| DE69918557D1 (de) | 2004-08-12 |
| DK1100912T3 (da) | 2004-11-15 |
| US6875581B1 (en) | 2005-04-05 |
| CA2335278A1 (en) | 2000-02-03 |
| DE69918557T2 (de) | 2005-07-28 |
| WO2000005363A1 (en) | 2000-02-03 |
| EP1100912A1 (en) | 2001-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stone et al. | Activation of an MAP kinase cascade leads to Sir3p hyperphosphorylation and strengthens transcriptional silencing. | |
| Roelants et al. | Differential roles of PDK1-and PDK2-phosphorylation sites in the yeast AGC kinases Ypk1, Pkc1 and Sch9 | |
| Rogowski et al. | Evolutionary divergence of enzymatic mechanisms for posttranslational polyglycylation | |
| JP2002522015A (ja) | カルシニューリン活性付与モジュレータのスクリーニング方法 | |
| EP1862802A1 (en) | Methods for the identification of ZAP-70 interacting molecules and for the purification of ZAP-70 | |
| Soupene et al. | Activity of the acyl-CoA synthetase ACSL6 isoforms: role of the fatty acid Gate-domains | |
| WO2006015084A2 (en) | Compositions, kits and assays containing reagents directed to cortactin and an arg/abl protein kinase | |
| Park et al. | Conformational changes of the leukocyte NADPH oxidase subunit p47phox during activation studied through its intrinsic fluorescence | |
| JP2002500511A (ja) | Ｄｎａの損傷ならびにこれら損傷のリガンドの定性的および定量的検出法 | |
| Bao et al. | The mammalian Rad24 homologous to yeast Saccharomyces cerevisiae Rad24 and Schizosaccharomyces pombe Rad17 is involved in DNA damage checkpoint | |
| Esch et al. | Pheromone-induced degradation of Ste12 contributes to signal attenuation and the specificity of developmental fate | |
| IL196874A (en) | Filtration method for operators of soluble guanylate cyclase with iron are oxidized | |
| Adamkewicz et al. | Purification and enzymic properties of Mot1 ATPase, a regulator of basal transcription in the yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| Park et al. | Phosphorylation induces conformational changes in the leukocyte NADPH oxidase subunit p47phox | |
| CA2409809A1 (en) | Method for selecting enzyme inhibitors | |
| US8088574B2 (en) | Poly(A) polymerase | |
| US20090017010A1 (en) | Novel artemis/dna-dependent protein kinase complex and methods of use thereof | |
| Bamm et al. | Expression and purification of the active variant of recombinant murine Golli-interacting protein (GIP)—characterization of its phosphatase activity and interaction with Golli-BG21 | |
| US20020042115A1 (en) | Regulation of human S-acyl fatty acid synthase thioesterase-like enzyme | |
| Neumann et al. | Nucleosome-associated protein kinases in murine erythroleukemia cells | |
| JP4378523B2 (ja) | 蛋白質のリン酸化を測定するためのモニター蛋白質 | |
| Granger et al. | Human hnRNPA1 reorganizes telomere-bound Replication Protein A | |
| Bathon | Mutations in protein kinase A catalytic subunit as a cause of adrenal Cushing's syndrome: mechanisms and functional consequences | |
| Hsu et al. | Structural and Functional Biology Approaches of Leptospirosis Kidney Disease | |
| JP2002524719A (ja) | 翻訳終結の忠実度を示すモジュレータであるｒｎａヘリカーゼのサブファミリーおよびその使用 |