JP2002516100A - 酵母小ｒｎａによるウイルスｉｒｅｓ媒介性翻訳への干渉は、重要なｒｎａ−タンパク質相互作用を明らかにする - Google Patents

酵母小ｒｎａによるウイルスｉｒｅｓ媒介性翻訳への干渉は、重要なｒｎａ−タンパク質相互作用を明らかにする

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JP2002516100A JP2000550997A JP2000550997A JP2002516100A JP 2002516100 A JP2002516100 A JP 2002516100A JP 2000550997 A JP2000550997 A JP 2000550997A JP 2000550997 A JP2000550997 A JP 2000550997A JP 2002516100 A JP2002516100 A JP 2002516100A
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Abstract

(57)【要約】 ｍＲＮＡの翻訳の阻害のためのペプチドおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドならびに使用方法が開示される。このｍＲＮＡの翻訳の阻害は、そのｍＲＮＡの内部リボソーム侵入部位で開始され、そしてその部位に対してタンパク質因子を結合させることを必要とする。Ｌａ自己抗原結合ドメイン（ＬＡＰ）を含むペプチドが開示される。ＬＡＰペプチドは、単独またはインヒビターＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＩＲＮＡ）との組合せで、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）媒介性ウイルス複製を阻害する抗ウイルス剤として使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願は、１９９７年１０月６日出願の米国特許出願番号第０８／８１７，９５
３号の一部継続出願（これは、１９９４年１０月１１日出願の米国特許出願番号
第０８／３２１，４２７号の一部継続出願であり、この開示は、その全体におい
て参考として援用される）である。本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの助成金番号ＡＩ１８２７２、ＡＩ−２７４５１お
よびＡＩ−３８０５６から資金を得て行われた。米国政府は、本発明に特定の権
利を有する。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、特定のｍＲＮＡの翻訳を選択的に阻害することに関する。より詳細
には、本発明は、小ＲＮＡまたはその分子模倣物により、内部リボソーム侵入部
位（ＩＲＥＳ）で開始されるｍＲＮＡ（例えば、ピコルナウイルスＲＮＡ）の選
択的阻害に関する。このＲＮＡまたは模倣物は、細胞タンパク質と特異的に相互
作用して、内部リボソーム侵入部位へのそのタンパク質の結合を妨げ、それによ
って、その侵入部位での翻訳開始を阻害する。さらにより詳細には、本発明は、
ＩＲＥＳ配列に結合する１つの細胞タンパク質であるＬａ自己抗原のＲＮＡ結合
ドメインを構成する、約１８アミノ酸ペプチドの組成物およびその使用方法に関
する。
【０００３】 （技術の背景） ピコルナウイルスは、特に、小児麻痺を引き起こすポリオウイルス、および一
般的な風邪を引き起こすライノウイルスを含む。ピコルナ関連ウイルスは、ピコ
ルナウイルスと同様の機構により複製し、このウイルスには、ヒトの肝炎の主な
原因であるＡ型肝炎およびＣ型肝炎が含まれる。ポリオウイルスウクチンは、入
手可能であるが、ワクチン接種が適切に使用されないポリオの症例がなお、発症
している。他のピコルナウイルスに対するワクチンは、実行可能であり得ない。
これは、例えば、ライノウイルスにおけるウイルス被膜タンパク質の速い速度の
変異性に起因する。従って、宿主細胞に対して毒性効果を与えることなく、ピコ
ルナウイルスの複製を選択的に阻害するための方法および組成物が必要である。
【０００４】 ピコルナウイルス科の基本型メンバーであるポリオウイルスは、単鎖であり、
感染された細胞の細胞質中で増殖するプラス−センスＲＮＡウイルスである。こ
のＲＮＡゲノムは、約７，５００ヌクレオチドを含み、そして２５０ｋＤａポリ
タンパク質をコードする（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）
２９１：５４７〜５５３およびＲａｃａｎｉｅｌｌｏ，Ｖ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：４８８７〜４８９１）
。ポリオウイルスＲＮＡ（７５０ヌクレオチド）の通常の長さでない５’非翻訳
領域（５’ＵＴＲ）は、高度に構築され（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ Ｍ
ｏｌ Ｂｉｏｌ（１９８９）２０７：３７９〜３９２；Ａｇｏｌ，Ｖ．、Ａｄｖ
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ（１９９１）４０：１０３〜１８０）、そして翻訳の開始
に使用されるようではないＡＵＧを６〜８個上流に含む（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，
Ｊ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９８８ａ）６２：４４８６〜４４９２）。
【０００５】 続いて大部分の哺乳動物細胞のｍＲＮＡの翻訳は、５’ｃａｐ構造へリボソー
ムが結合し、このリボソームが適切なＡＵＧと遭遇するまで、ｍＲＮＡのスキャ
ニングによって進行する（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（１９
８３）４７：１〜４５）。対照的に、自然にキャップされないポリオウイルスＲ
ＮＡの翻訳は、開始因子ＡＵＧの付近のリボソームの内部侵入を含む機構により
媒介されることが示されている（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（
１９８８）３３４：３２０〜３２５）。近年の研究により、リボソームの内部侵
入は、ポリオウイルスＲＮＡの５’ＵＴＲ内のヌクレオチド３２０〜６３１の間
に位置するエレメントを必要とすることが実証された（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ
ら、前出）。この配列エレメントは、リボソームランディングパッド（ＲＬＰ）
と呼ばれるか、または、より一般的には、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）
と呼ばれる。多くの細胞ポリペプチドが、ＩＲＥＳ依存性翻訳に関与しているが
、翻訳の内部開始の詳細な機構は、あまり理解されていないままである。
【０００６】 ポリオウイルスに加え、多くの他のピコルナウイルスは、翻訳開始のためにこ
の新規機構を利用することを示している（Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ（１９９０）４：１５６０−１５７２、Ｂｅｌｓｈａｍ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ（１９９０）６４：５３８９〜５３９５、Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．ら
、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ（１９９０）１５：４７７〜４８３、
Ｌｕｚ，Ｎ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：３１１〜３１
４、Ｌｕｚ，Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）６５：６４８６〜６４９４
、Ｂａｄｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９２）６６：６
２４９〜６２５６、Ｂｏｒｍａｎ，Ａ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８
８：６８５〜６９６、Ｂｏｒｍａｎ，Ａ．ら、Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ（１９９３）
７４：１７７５〜１７８８）。２つのピコルナ関連ウイルスであるＡ型肝炎およ
びＶ型肝炎のＲＮＡゲノムは、翻訳開始のための内部リボソーム侵入を利用する
ことが示されている（Ｋｏｈａｒａ，Ｋ．Ｔ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９２）
６６：１４７６〜１４８３およびＧｌａｓｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（
１９９３）１９３：８４２〜８５２）。免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂ
ｉｐ）、マウスアンドロゲンレセプター（３２）およびショウジョウバエのアン
テナペディアをコードする２つの細胞ｍＲＮＡもまた、翻訳の内部開始を使用す
ることが示されている（Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１
）３５３：９０〜９４およびＯｈ，Ｓ．Ｋ．らＧｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９９２）
６：１６４３〜１６５３）。
【０００７】 ＩＲＥＳ依存性翻訳を利用する全てのピコルナウイルスｍＲＮＡは、５’ＵＴ
Ｒ内のＩＲＥＳ配列の３’境界に位置するポリピリミジン付加物（ｔｒａｃｔ）
を含む。最近の証拠は、ポリオウイルス５’ＵＴＲのヌクレオチド５８６でポリ
ピリミジン付加物と潜在性ＡＵＧとの間の適切な空間が、ウイルスの翻訳に重要
であることを示す（Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９０、前出）、Ｊａｎｇら（１９９
０、前出）、Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏ，Ｅ．Ｖ．らＣｅｌｌ（１９９２）６８：１１
９〜１３１）。
【０００８】 ウサギ網状赤血球溶解産物におけるポリオウイルスｍＲＮＡの正確な翻訳は、
ＨｅＬａ細胞タンパク質を必要とする。このことは、翻訳の内部開始に細胞タン
パク質が関与することを示す（Ｂｒｏｗｎ，Ｂ．Ａ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１
９７９）９７：３７６〜４０５；Ｄｏｒｎｅｒ，Ｈ．Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（
１９８４）５０：５０７〜５１４）。５０ｋＤａのタンパク質は、ポリオウイル
ス１型ＲＮＡにおけるヌクレオチド１８６〜２２１の間に位置するＲＮＡステム
ループ構造と相互作用することが示されている（Ｎａｊｉｔａ，Ｌ．Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０）８７：５８４６〜５８５０）
。この結合の生理学的重要性はなお、明らかではない。
【０００９】 ウサギ網状赤血球中よりもＨｅＬａ細胞中により多く存在する、ｐ５２と呼ば
れる別のタンパク質は、２型のポリオウイルスＲＮＡのヌクレオチド５５９〜６
２４の間のステムループ構造に特異的に結合することが見出されている（Ｍｅａ
ｒｏｖｉｔｃｈ，Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９８９）３：１０２６〜１０
３４）。このｐ５２タンパク質は、ヒトＬａ自己抗原と同一であるようである（
Ｍｅｅｒｏｖｉｔｃｈ，Ｋ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９３）６７：３７９８〜
３８０７）。この核タンパク質は、自己免疫障害エリテマトーデスに罹患してい
る患者由来の抗体に認識され、ポリオウイルスが感染したＨｅＬａ細胞中の細胞
質に核を浸出させる。Ｌａ抗体で免疫抑制された細胞抽出物は、ｃａｐ非依存性
翻訳を促進せず、そして精製されたＬａタンパク質の外来的添加が、ｐ５２をほ
とんど含まないかまたは含まない網状赤血球溶解産物中のポリオウイルスＲＮＡ
の異常な翻訳を修正する（Ｍｅｅｒｏｖｉｔｃｈら（１９９３、前出））。
【００１０】 ＵＶ架橋の研究により、別の細胞タンパク質であるｐ５７は、 脳心筋炎（Ｅ
ＭＣ）、口蹄疫、ライノウイルス、ポリオウイルス、およびＡ型肝炎ウイルスの
ＩＲＥＳエレメントと相互作用することが実証されている（Ｊａｎｇら、１９９
０、前出；Ｂｏｒｏｖｊａｇｉｎ、Ａ．Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ（１９９１）１９：４９９９〜５００５；Ｌｕｚら、１９９１、前出；Ｐ
ｅｓｔｏｖａ，Ｔ．Ｖ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９１）６５：６１９４〜６２
０４；Ｂｏｒｍａｎら、１９９３、前出、およびＣｈａｎｇ，Ｋ．Ｈ．ら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ（１９９３）６７：６７１６〜６７２５）。ＥＭＣＶのＩＲＥＳへの
、ｐ５７の結合は、おそらく核のスプライシングにおいて役割を果たすポリピリ
ミジン付加物結合タンパク質（ＰＴＢ）のｐ５７結合と同一であることが、最近
実証されている（Ｈｅｌｌｅｎ，Ｃ．Ｕ．Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａ
ｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９３）９０：７６４２〜７６４６）。抗ＰＴＢ抗体は
、ＥＭＣＶおよびポリオウイルスＲＮＡの翻訳を阻害し、従って、ＰＴＢは、Ｉ
ＲＥＳに指向される翻訳に直接関与し得る。
【００１１】 さらに３８および４８ｋＤａの分子量を有する２つの他の細胞タンパク質は、
ポリオウイルスのヌクレオチド２８６〜４５６にわたるＲＮＡの構造と特異的に
相互作用することが示されている。これらの２つのタンパク質は、網状赤血球溶
解産物中よりもより高い量でＨｅＬａ細胞中に存在すると報告されており、そし
てポリオウイルスの翻訳に特異的に関与するようである（Ｇｅｂｈａｒｄ，Ｊ．
Ｒ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９２）６６：３１０１〜３１０９）。別の５４ｋ
Ｄａタンパク質は、ヌクレオチド４５６〜６２６の間の領域と架橋し、そして全
てのｍＲＮＡの翻訳を必要とする（Ｇｅｂｈａｒｄら、１９９２、前出）。最近
の報告は、ヒトライノウイルスＲＮＡのＩＲＥＳ依存性翻訳における９７ｋＤａ
タンパク質の役割を示す（Ｂｏｒｍａｎら、１９９３、前出）。ＲＮＡタンパク
質複合体形成はまた、ポリオウイルスＲＮＡのヌクレオチド９８〜１８２および
５１０〜６２９を含む領域を有することが実証されている（ｄｅｌ Ａｎｇｅｌ
，Ｐ．Ａ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８９
）８６：８２９９〜８３０３）。
【００１２】 まとめると、上記の結果は、細胞因子と内部開始を導くＲＮＡ配列および／ま
たは二次構造との間の直接的な相互作用を含むピコルナウイルスの翻訳の機構と
適合する。この機構において結合タンパク質の作用は公知でないが、トランス作
用タンパク質は、リボソームをｍＲＮＡに直接侵入させ得るか、またはＲＮＡ構
造を改変させてリボソームの結合を容易にし得る。
【００１３】 以前の研究において、本発明は、酵母細胞がポリオウイルスＲＮＡをインビボ
およびインビトロの両方で翻訳し得ず、そしてこの翻訳の欠損は、ウイルスＲＮ
Ａの５’ＵＴＲを必要とする選択的な翻訳の阻害を表すことを示した（Ｃｏｗａ
ｒｄ，Ｐら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９２）６６：２８６〜２９５）。この阻害効
果は、酵母溶解産物において存在するトランス作用因子に起因することが見出さ
れた。この因子はまた、ＨｅＬａ細胞抽出物がポリオウイルスＲＮＡを翻訳する
能力を阻害し得る。このインヒビターの最初の特徴付けは、その活性が熱に安定
であり、プロテイナーゼＫ消化、フェノール抽出およびＤＮａｓｅ消化に対して
耐性であるが、ＲＮａｓｅに対しては感受性であることを示した（Ｃｏｗａｒｄ
ら、１９９２、前出）。
【００１４】 （発明の開示） 本発明は、内部リボソーム侵入部位で開始され、そしてその部位へのタンパク
質因子の結合を必要とするｍＲＮＡ（例えば、ポリオウイルスＲＮＡ）の翻訳を
阻害するための方法および組成物に関する。本発明は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ由来の６０のヌクレオチドのＲＮＡの同定に基づき、これは、内部で翻訳
の開始を阻害するが、ｃａｐ依存性翻訳は阻害しない。酵母インヒビターＲＮＡ
（Ｉ−ＲＮＡ）は、翻訳の内部開始に関与すると報告される種々の細胞タンパク
質に結合し、その結果、そのようなタンパク質に結合するためのポリオウイルス
ＲＮＡの５’ＵＴＲと競合し、そして宿主細胞タンパク質合成に影響を与えずに
ウイルスｍＲＮＡの翻訳を選択的に阻害する。宿主細胞において発現される場合
、インヒビターＲＮＡはポリオウイルスＲＮＡの翻訳を特異的かつ有効に阻害し
、そしてそれによって、これらの細胞をウイルス感染から防御する。このＲＮＡ
の翻訳の阻害についての構造的な必要条件の分析は、内因的に開始されるＲＮＡ
の翻訳の、実質的により小さなＲＮＡインヒビターの設計、および最終的には、
そのようなインヒビターＲＮＡの非ＲＮＡ分子模倣物の設計を可能にした。
【００１５】 従って、１つの局面において、本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための方
法に関し、この翻訳は、ｍＲＮＡの内部リボソーム侵入部位で開始され、かつそ
の部位でのタンパク質因子の結合を必要とする。この方法は、このｍＲＮＡを翻
訳し得る系において、必要とされるタンパク質因子と選択的に結合する阻害に有
効な量の分子を提供し、それによって、その因子がｍＲＮＡの内部リボソーム侵
入部位に結合するのを防ぐ工程を包含する。好ましい実施態様において、このイ
ンヒビター分子は、３５未満のヌクレオチドまたはそのようなＲＮＡオリゴヌク
レオチドの構造模倣物からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００１６】 他の局面において、本発明は、異種ヌクレオチド配列に連結された３５ヌクレ
オチド未満からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ分子をコードする発
現構築物、および本発明の翻訳阻害の方法において使用するために適切なインヒ
ビター分子に関する。このインヒビター分子は、ｍＲＮＡの内部リボソーム侵入
部位によって示される分子間力の三次元アレイを提供する。
【００１７】 より詳細には、本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法に関する。この翻訳
は、そのｍＲＮＡの内部リボソーム侵入部位で開始され、そしてその部位へのタ
ンパク質因子の結合を必要とする。この方法は、以下の工程を包含する：対象ｍ
ＲＮＡを翻訳し得る系において、その因子に選択的に結合する分子を翻訳阻害有
効量で提供し、それによって、その因子がｍＲＮＡのその部位に結合することを
阻害する工程であって、ここでその分子は、以下：３５ヌクレオチド未満からな
るＲＮＡオリゴヌクレオチド；およびそのＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模倣
物からなる群より選択される。
【００１８】 本法の好ましい実施態様において、このｍＲＮＡは、ピコルナウイルス、フラ
ビウイルス、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ラブドウイルス、アデノウイ
ルスおよびパラインフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスのウ
イルスＲＮＡである。特に、このウイルスは、ポリオウイルス、ライノウイルス
、Ａ型肝炎ウイルス、コクサッキーウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイル
ス、エコーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、アヒルＢ型
肝炎ウイルス、ヒトＢ型肝炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびセンダイウ
イルスからなる群より選択され得る。あるいは、阻害されるべきｍＲＮＡは、内
部リボソーム侵入部位を伴う細胞ｍＲＮＡであり得る（例えば、免疫グロブリン
重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）をコードする細胞ｍＲＮＡ）。
【００１９】 本発明の方法において、インヒビター分子は、本発明のＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを、そのｍＲＮＡを翻訳し得る系に添加することによって提供され得る。あ
るいは、この分子は、そのｍＲＮＡを翻訳し得る系に、異種ヌクレオチド配列に
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を添加することによって
提供される。このＲＮＡオリゴヌクレオチドはまた、対象ｍＲＮＡを翻訳し得る
系においてそのＲＮＡオリゴヌクレオチドのインサイチュ産生のための発現構築
物が提供され得る。
【００２０】 本発明の方法（これは、対象ｍＲＮＡを翻訳し得る）によって阻害される系は
、無細胞系であり得るか、または対象ｍＲＮＡを産生するウイルスに感染した宿
主細胞か、または感染する危険性がある宿主細胞であり得る。この宿主細胞は、
対象ｍＲＮＡの翻訳が阻害されるべき細胞培養物中または宿主動物中のいずれか
の哺乳動物細胞であり得る。
【００２１】 別の局面において、本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する分子に関する。この
翻訳は、このｍＲＮＡの内部リボソーム侵入部位で開始され、そしてタンパク質
因子のその部位への結合を必要とする。この分子は、その因子に選択的に結合し
、それによって、その因子がそのｍＲＮＡのリボソーム侵入部位へ結合すること
を妨害する。本発明の分子は、３５ヌクレオチド未満からなるＲＮＡオリゴヌク
レオチド；および該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模倣物、からなる群より選
択される。好ましい実施態様において、この分子は、図１Ａに示される配列；図
１Ａに示される配列に相補的な配列；ポリオウイルスのヌクレオチド１８６−２
２０の配列（ステム−ループＤ）；ポリオウイルスのヌクレオチド５７８−６１
８の配列（ステム−ループＧ）；ポリオウイルスのヌクレオチド２６０−４１５
の配列（ステム−ループＥ）；ポリオウイルスのヌクレオチド４４８−５５６の
配列（ステム−ループＦ）；および免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ
）ｍＲＮＡの配列（これは、そのタンパク質因子をそのｍＲＮＡの内部リボソー
ム侵入部位に結合させる）からなる配列群より選択される、少なくとも一部分を
含む配列を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドである。より好ましい実施態様にお
いて、そのＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、リボヌクレオチド
配列５’ＧＣＧＣＧＧＧＣＡＧＣＧＣＡ３’である。他の局面において、本発明
は、異種ヌクレオチド配列に連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ
分子およびＲＮＡ分子をコードする発現構築物に関する。ここで、このＲＮＡ分
子は、異種ヌクレオチド配列に連結された本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチドを
含む。
【００２２】 本発明はまた、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する分子を同定するためのスクリーニン
グアッセイを提供する。この翻訳は、このｍＲＮＡの内部リボソーム侵入部位で
開始され、そしてタンパク質因子のその部位への結合を必要とする。このインヒ
ビター分子は、翻訳開始因子に選択的に結合し、それによって、その因子が、そ
のｍＲＮＡのリボソーム侵入部位に結合することを妨害する。本発明の開始因子
結合分子を同定するためのアッセイとしては、固定されたリガンド結合アッセイ
、溶液結合アッセイ、シンチレーション近似アッセイ、ジハイブリッドスクリー
ニングアッセイなどが挙げられる。
【００２３】 本発明の方法および分子の好ましい実施態様において、そのタンパク質因子は
、５２ｋＤａのＬａ自己抗原である。さらに、見かけ上の分子量が８０ｋＤａ、
７０ｋＤａおよび３７ｋＤａの３つの他のヒト細胞ポリペプチドが、本発明のＩ
−ＲＮＡの翻訳阻害活性を示す分子を検出するために使用され得る。
【００２４】 なお別の実施態様において、本発明は、ＬａのＲＮＡ結合ドメインを構成し、
そしてそのＬａペプチド（ＬＡＰ）が、全長すなわち野生型Ｌａと、ウイルスＩ
ＲＥＳ配列または遺伝子エレメントに結合することについて競合するおよそ１８
アミノ酸のペプチドを提供する。本発明のＬＡＰは、哺乳動物宿主細胞における
ウイルスｍＲＮＡ翻訳を選択的に阻害することについて有用である。好ましい実
施態様において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中にＬＡＰを含む、治
療的組成物およびその使用方法を提供し、これらは、ヒト細胞中に自由に拡散し
、そしてウイルス複製をブロックする。
【００２５】 なおさらに好ましい実施態様において、ＬＡＰのアミノ酸配列は、以下： ＬＡＰ：Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−
Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ またはそのペプチドのビオチン化形態： Ｂ−ＬＡＰ：ビオチン−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｉ
ｌｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ をおおよそ含む。
【００２６】 本発明の治療組成物およびその使用方法は、以下のようなヒトＲＮＡウイルス
を含むウイルスの複製の阻害を提供する：ポリオウイルス；Ａ型、Ｂ型、Ｃ型お
よび非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウイルス；ライノウイルスおよびコクサッキーウイルス
。
【００２７】 （本発明の実行様式） （一般的記載および定義） 他に示されない限りは、本発明の実施は当該技術分野における慣用的な生化学
、免疫学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いる。このような技術は、
文献中に十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）
；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ
巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、
１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（
Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ
ｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００２８】 以下の用語は、本発明を記載する際に以下に説明する定義に従って使用される
。
【００２９】 ＤＮＡ「制御配列」とは、集合的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位
、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーな
どをいい、これらは集合的に宿主細胞中でコード配列の転写および翻訳を提供す
る。
【００３０】 コード配列は、発現系が適切な宿主細胞中に含まれるときに、そのコード配列
の発現がもたらされる場合に、制御配列に「作動可能に連結される」。
【００３１】 「宿主細胞」は、外因性のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むように改変され
たか、またはその配列を含むように改変され得る細胞である。これは、例えば、
ウイルスによって感染された細胞、または組換えＤＮＡ分子によって形質転換さ
れた細胞を含む。
【００３２】 ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物の「異種」領域は、他の天然の分子に付随して見出
されない別の核酸分子中にあるか、またはその核酸分子に結合した、ＤＮＡもし
くはＲＮＡの同定可能なセグメントである。
【００３３】 （翻訳インヒビター分子の同定） 本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための方法に関し、この翻訳は、このｍ
ＲＮＡの内部リボソーム侵入部位において開始され、そしてこの部位に対するタ
ンパク質因子の結合を必要とする。この方法は、ｍＲＮＡを翻訳し得る系におい
て、その因子に選択的に結合する分子の翻訳阻害の有効量を供給する工程を包含
し、それによってｍＲＮＡのリボソーム侵入部位へのその因子の結合を妨害する
。本発明の翻訳阻害分子は、３５ヌクレオチドより少ないヌクレオチドからなる
ＲＮＡオリゴヌクレオチド、およびこのＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造的模倣
物からなる群より選択される。
【００３４】 本発明に従う翻訳インヒビター分子の同定は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
由来の天然に存在するインヒビターＲＮＡの６０ヌクレオチド配列の単離および
決定によって、最初の例において例証される。このＲＮＡは、選択的に内部で開
始された翻訳を阻害するが、ｃａｐ−依存性翻訳（例えば、ピコルナウイルスｍ
ＲＮＡのｃａｐ−依存性翻訳）を阻害しない。この小さいインヒビターＲＮＡ（
Ｉ−ＲＮＡ）の単離および配列決定は、実施例１に記載される。インヒビターＲ
ＮＡの配列をコードする合成ＤＮＡクローンの調製、およびＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いる転写による合成クローン由来のＲＮＡの産生は、実施例２におい
て例証される。これらの方法は、当該分野で周知の慣用的なアプローチを用いて
、本発明の他のＲＮＡオリゴヌクレオチドの産生に適合させ得る。
【００３５】 実質的にｃａｐ依存性翻訳に影響を与えることなしに内部リボソーム進入によ
って開始される本発明に従う翻訳の選択的阻害は、ＩＲＥＳ−および５’−ｃａ
ｐ媒介性翻訳開始部位の両方を含む組換えＲＮＡ構築物を使用するインビトロ方
法によって好都合に例証され得る。例えば、実施例３を参照のこと。あるいは、
またはさらに、内部開始される翻訳の選択的阻害は、別のウイルスｍＲＮＡ（例
えば、実施例７に記載されるウイルスｍＲＮＡ）、または内部開始される細胞ｍ
ＲＮＡ（例えば、実施例８において例証されるような免疫グロブリン重鎖結合タ
ンパク質をコードするｍＲＮＡ）の組換え二シストロン性ｍＲＮＡ構築物を使用
してインビトロで実証され得る。
【００３６】 本発明の翻訳インヒビター分子は、リボソーム侵入部位における翻訳の開始に
必要とされるタンパク質因子に結合することによって、内部リボソーム侵入部位
からの翻訳を選択的に阻害し、それによってｍＲＮＡのリボソーム侵入部位に結
合することからその因子を妨害する。このようなインヒビター分子の結合は、必
要とされるタンパク質因子と選択されるｍＲＮＡとの間の複合体の破壊を示すた
めに、競合的結合方法（例えば、本発明の例示的な酵母Ｔ−ＲＮＡによる、ポリ
オウイルスＲＮＡ配列とＨｅＬａ宿主細胞タンパク質因子との間の複合体の破壊
について、実施例４に記載される方法）を使用していてもよい。さらに、内部の
翻訳の開始に必要とされるタンパク質因子への本発明のインヒビター分子の直接
的な結合が、例えば、実施例５において酵母Ｉ−ＲＮＡ分子について記載される
ＵＶ架橋法を使用して好都合に例証され得る。
【００３７】 インビボでウイルスｍＲＮＡの翻訳を阻害する本発明のインヒビター分子の能
力は、この酵母Ｉ−ＲＮＡによってトランスフェクトされた細胞におけるポリオ
ウイルスＲＮＡ翻訳の阻害について示されるように、細胞培養中で好都合に例証
され得る。この酵母Ｉ−ＲＮＡは、実施例９に例示されるように、ウイルス複製
および病原性効果を阻害する。
【００３８】 従って、本明細書中の一般的な手引きおよび実施例に基づいて、慣用的な方法
を用いて、所定の分子が本発明の翻訳インヒビターの活性（すなわち、ｍＲＮＡ
の翻訳の阻害）を示すか否かを決定し得る。この翻訳は、内部リボソーム侵入部
位において開始され、そしてその因子に対する選択的結合によるその部位へのタ
ンパク質因子の結合を必要とし、それによって対象のｍＲＮＡのリボソーム侵入
部位への結合からその因子を妨害する。
【００３９】 （酵母Ｉ−ＲＮＡに基づく活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの同定） １つの好ましい実施態様において、本発明の翻訳インヒビター分子は、例示的
な酵母Ｉ−ＲＮＡの配列に基づくＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、６０未満の
ヌクレオチドからなり、好ましくは３５ヌクレオチド未満のヌクレオチド、より
好ましくは２５未満のヌクレオチド、そしてなおより好ましくは１５未満のヌク
レオチドからなる。当該分野において公知であるように、タンパク質因子結合に
よる翻訳阻害に必要であるＩ−ＲＮＡの最小配列を決定することは有利である。
なぜなら、６０ヌクレオチドより短い機能的なＩ−ＲＮＡは、従来的な化学合成
による産生によって、および拡散によるインタクト細胞へのそれらの進入によっ
て、より大きな有効性を提供するからである。
【００４０】 酵母Ｉ−ＲＮＡのどのフラグメント（単数または複数）が本発明に従う翻訳阻
害活性を示すかを決定するために、従来的な遺伝子操作技術が使用されて、Ｉ−
ＲＮＡの５’末端および３’末端からの欠失変異体を調製する。１０、２０、ま
たは３０ヌクレオチドが一度にＩ−ＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれか
から欠失される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写によってこれらのクロ
ーンから産生されたＲＮＡは、本明細書中の実施例に記載されるような、ＩＲＥ
Ｓ−媒介性翻訳を阻害するがｃａｐ−依存性翻訳を阻害しない能力について試験
される。従来的な方法はまた、Ｉ−ＲＮＡ分子全体にわたる８〜１０ヌクレオチ
ド配列の欠失のネスト化されたセットを生成するために使用され得る。
【００４１】 これらの系統だった欠失アプローチは、ウイルス翻訳の阻害および宿主タンパ
ク質因子への結合に必要である配列を同定する。従って、ＩＲＥＳ−媒介性翻訳
を阻害するこのような変異体は、ウイルス翻訳のＩ−ＲＮＡ媒介阻害に関与する
タンパク質因子（例えば、本明細書中上記に述べた酵母Ｉ−ＲＮＡまたは他の因
子（例えば、ｐ５７）に結合することが示されるｐ５２因子）に対する結合活性
の損失について試験される。
【００４２】 図１２に例示されるように、酵母Ｉ−ＲＮＡに結合するｐ５２因子は、免疫学
的アッセイによって示されるように、ヒトＬａ自己抗原と同一である。この同一
性はさらに、組換えＬａタンパク質のＩ−ＲＮＡへのＵＶ架橋後の免疫沈殿、お
よび抗Ｌａ抗体とのＬａ−Ｉ−ＲＮＡ複合体をスーパーシフトする能力の両方に
よって確認された（図１２）。Ｉ−ＲＮＡへのＬａのこの結合は、精製された組
換えＬａタンパク質が、インヒビターＲＮＡの存在下において、ＰＶ ＩＲＥＳ
−媒介性翻訳を回復させ得るという事実によって示される翻訳阻害と関連する。
全長または欠失したＩ−ＲＮＡに結合し、そして本発明の他のインヒビター分子
を同定するために使用され得るさらなるタンパク質因子は、以下に記載される。
【００４３】 より選択的な変異分析はまた、活性Ｉ−ＲＮＡ（例えば、例示的な酵母Ｉ−Ｒ
ＮＡ）のより大きな配列に基づく本発明の活性オリゴヌクレオチドを同定するた
めに使用され得る。特に、酵母Ｉ−ＲＮＡの配列に正確に相補的な配列を有する
アンチセンスＲＮＡは、センスＩ−ＲＮＡ分子と同様にｐ５２に結合する際に有
効であることが見出された。図１３を参照のこと。翻訳の開始に必要である宿主
細胞タンパク質因子に結合するポリオウイルスＲＮＡ配列と酵母Ｉ−ＲＮＡとの
見かけの配列相同性が存在しないという事実とまとめて考えると、この結果は、
Ｉ−ＲＮＡの二次構造が、内部翻訳開始の阻害において重要な役割を果たし得る
ことを示唆する。従って、任意のＲＮＡに対する相補的な配列の二次構造の多く
の局面は、配列それ自体の二次構造に類似することが予想される。なぜなら、一
般的に、同じ内部鎖塩基の対合は、もともとの配列におけるような相補鎖におい
て形成され得るからである。
【００４４】 実際に、Ｉ−ＲＮＡの２つのコンピューター予測された熱力学的に比較的安定
である二次構造が生成され、これらは−２７および−２１Ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔ
Ｇを有する（図１０）。（これらの構造は、ＤＮＡＳｙＳと呼ばれる市販のソフ
トウェアを用いて予測されたが、他の類似のソフトウェアが広範に公知であり、
そして利用可能である。例えば、Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏら（１９９２、前出）、Ｊ
ａｃｋｓｏｎら（１９９０、前出）、およびＤｉｌｄｉｎｅ，Ｓ．Ｌ．ら（１９
９２、前出）を参照のこと）。これらの二次構造は、ポリオウイルスｍＲＮＡ上
のｐ５２結合部位と部分的に類似している。
【００４５】 さらに、６０ヌクレオチド長のネイティブＩ−ＲＮＡの二次構造（図１０）は
、例示的なクローニング手順の間に生成された１１のさらなるヌクレオチドの付
加によって有意に変化しない。従って、二次構造の適切な分析によって、異種配
列への本発明の活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの連結が、オリゴヌクレオチドの
二次構造を不安定化し、それによってその翻訳阻害活性を破壊するらしいか否か
を予測し得る。さらに、必要とされる活性の保持は、本明細書中に記載される慣
用的な方法を用いて、任意の所望のＲＮＡオリゴヌクレオチドについて容易に決
定され得る。
【００４６】 酵母Ｉ−ＲＮＡの推定二次構造における種々のループに対応するＲＮＡオリゴ
ヌクレオチドを試験することによって、Ｉ−ＲＮＡの１４ヌクレオチド長のフラ
グメントが、ポリオウイルスのＩＲＥＳ媒介性翻訳を特異的に阻害することが見
出された。図１４を参照のこと。コンピューター推定二次構造性においてループ
を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドの試験は、より大きいＩ−ＲＮＡ配列（例えば
、酵母Ｉ−ＲＮＡのヌクレオチド３０〜３６に（従来の５’〜３’ホスホジエス
テル結合によって）共有結合されたヌクレオチド７〜１３からなる実施例１４の
ヌクレオチドフラグメント）の非連続部分を含む活性ＲＮＡオリゴヌクレオチド
の同定を可能にすることを留意すべきである。
【００４７】 酵母Ｉ−ＲＮＡの系統的な欠失分析の実験結果は、以下の実施例１０に例示さ
れる。この分析は、ＰＶ ＩＲＥＳ媒介性翻訳を阻害するために必要とされる最
小Ｉ−ＲＮＡ配列が、ヌクレオチド３０〜４５の間に存在するようであることを
示す。この結論は、２つの観察によって支持される。第１に、ヌクレオチド３１
〜４５を除くＩ−ＲＮＡ配列全体を含む欠失変異体（Ｉ−３ ＲＮＡ）は、ウイ
ルスＩＲＥＳ媒介性翻訳を阻害する際に、全体的に不活性である。第２に、短縮
型Ｉ−ＲＮＡ（ｎｔ ３０〜４５、Ｉ−９ ＲＮＡ）は、かなりの量の翻訳阻害
活性を保持する。しかし、Ｉ−９ ＲＮＡ配列を含む、２５ｎｔ長の短縮型ＲＮ
Ａ（Ｉ−７ ＲＮＡ）は、特にインビボでより活性であるようである。より短い
Ｉ−９ ＲＮＡは、インビボでＩ−ＲＮＡのたった５０％の活性であった。Ｉ−
７ ＲＮＡおよびＩ−９ ＲＮＡの両方は、ステム−ループ配列を有する二次構
造をとり得る。明らかに、より小さなサイズのために、Ｉ−９ ＲＮＡは、Ｉ−
ＲＮＡよりも非常に安定性が低く、これは、細胞内部でのＩ−９ ＲＮＡの安定
性に影響し得る。既知のチオ誘導体または他のヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドア
ナログは、安定性を増大させるために使用され得、従って、本発明のＩ−９ Ｒ
ＮＡまたは他のインヒビターＲＮＡの活性は、細胞に外因的に提供される。Ｉ−
ＲＮＡまたはその短縮型誘導体の構造（単数または複数）は、ＩＲＥＳ媒介性翻
訳阻害に重要であり得る。Ｉ−７ ＲＮＡ（ｎｔ ２６〜５０）の３’末端への
さらに１０個のヌクレオチドの付加がその（１〜６ ＲＮＡ、ｎｔ．２６〜６０
）翻訳阻害活性を有意に減少させるという事実は、このＲＮＡの構造の変化を示
し得、これは、本発明のインヒビターＲＮＡの３’末端を設計する際に、回避さ
れるべきである。同様に、Ｉ−６ ＲＮＡの５’末端への別の５個のヌクレオチ
ドの付加は、翻訳を阻害するその（Ｉ−５、ｎｔ ２０〜６０）能力を著しく減
少させ、このことは、インヒビターＲＮＡ設計においてこのような５’末端効果
を考慮する必要性を示す。
【００４８】 翻訳阻害を担う配列および二次構造を同定するための別の代替的なアプローチ
は、例えば、ｐ５２結合によって、ｐ５２に結合したＩ−ＲＮＡドメインが当該
分野において公知である慣用的な方法に従うＲＮａｓｅ消化に耐性であるか否か
を決定することである。このアプローチにおいて、32Ｐ−標識（ｂｏｄｙ ｌａ
ｂｅｌｅｄ）Ｉ−ＲＮＡは、結合条件下で精製ｐＲ２とインキュベートされる。
得られた複合体は、ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅ Ｔ
１、Ｔ２、およびＡの混合物を用いて消化される。次いで、この混合物は、フェ
ノール抽出およびエタノール沈澱後に、１以上の保護されたフラグメントについ
て分析される。Ｉ−ＲＮＡの保護されたフラグメントは、例えば、市販されてい
る配列決定キットを使用して、直接的に配列決定される。代替的な配列決定アプ
ローチは、Ｉ−ＲＮＡをコードするｃＤＮＡと保護されたフラグメントをハイブ
リダイズさせ、続いてハイブリッドの一本鎖領域を消化し、そして保護されたＤ
ＮＡフラグメントの配列を決定することである（これは、ＲＮＡの配列決定より
も比較的に容易である）。次いで、保護されたフラグメントは、本明細書中に記
載されるように、翻訳阻害およびタンパク質因子への結合のために、未標識Ｉ−
ＲＮＡとの特異的競合（しかし非特異的ＲＮＡと競合しない）について試験され
る。
【００４９】 ｐ５２ Ｌａ自己抗原タンパク質に加えて、Ｉ−ＲＮＡまたはその欠失変異体
に結合する他のタンパク質因子が同定されており、従って、これらは、本発明の
Ｉ−ＲＮＡの翻訳阻害活性を有する他の分子を同定するために（例えば、結合ア
ッセイにおいて）使用され得る。種々の標識ＲＮＡを利用するＵＶ架橋研究およ
び競合実験は、Ｉ−７変異体Ｉ−ＲＮＡおよびＩ−４変異体ＲＮＡの両方が２つ
の共通のポリペプチド（すなわち５２ｋＤａおよび３７ｋＤａ）を結合したこと
を実証した（実施例１１を参照のこと）。しかし、これらの２つのＲＮＡは、Ｉ
−７ ＲＮＡが８０ｋＤａポリペプチドを結合したが、Ｉ−４ ＲＮＡが７０ｋ
Ｄａのポリペプチドと相互作用したという点で互いに異なった。従って、５２ｋ
Ｄａおよび３７ｋＤａのポリペプチドに加えて、ウイルス性５’−ＵＴＲへの８
０ｋＤａタンパク質の結合は、内部での開始が生じるために重要であり得、そし
てＩ−７ ＲＮＡは、これらのポリペプチドを結合する際に、５’−ＵＴＲと直
接的に競合し得る。ＵＶ架橋研究を利用する、Ｍｅｙｅｒらによる最近の報告は
、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＩＲＥＳ媒介性翻訳における８０ｋＤａタンパ
ク質の重要性を示す（Ｍｅｙｅｒ，Ｋ．、Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｎｉｅｐ
ｍａｎｎおよびＥ．Ｂｅｃｋ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２８１９〜２
８２４）。この８０ｋＤａタンパク質は、開始因子であるｅＩＦ−４Ｂとして同
定されている。Ｍｅｙｅｒらによって提示される結果は、さらなるタンパク質因
子がＦＭＤＶ ＩＲＥＳとｅＩＦ−４Ｂとのこの相互作用に寄与することを示唆
する。したがって、ウイルスＩＲＥＳとのｅＩＦ−４Ｂの結合は、Ｌａおよび３
７ｋＤａのポリペプチドならびにまたは他のポリペプチドを必要とし得る。Ｉ−
７ ＲＮＡは、これらのポリペプチドを結合することによって、ＩＲＥＳ媒介性
翻訳を妨害し得る。従って、８０ｋＤａタンパク質の結合を最終的に妨害する能
力は、本発明のＩ−ＲＮＡの翻訳阻害活性を有するインヒビターの指標であるこ
とが予測される。
【００５０】 ５２ｋＤａおよび３７ｋＤａのポリペプチドのそれらの相互作用にかかわらず
、Ｉ−４ ＲＮＡおよびＩ−８ ＲＮＡは、８０ｋＤａのポリペプチドと相互作
用しないそれらの能力のために、翻訳を効率的に阻害し得ない。Ｉ−４ ＲＮＡ
およびＩ−８ ＲＮＡへの７０ｋＤａタンパク質の結合は、おそらくこれらのＲ
ＮＡが８０ｋＤａポリペプチドと相互作用することを妨げることによって、ＩＲ
ＥＳ媒介性翻訳を妨害するそれらの能力を阻害し得る。従って、７０ｋＤａタン
パク質への結合の欠如はまた、本発明のＩ−ＲＮＡの翻訳阻害活性を有するイン
ヒビターの指標であることが予測される。
【００５１】 （阻害性ＲＮＡオリゴヌクレオチドについての他のＲＮＡ配列の同定） 例示的な酵母Ｉ−ＲＮＡの配列に加えて、種々のさらなるＲＮＡ配列が、本発
明に従うさらなる翻訳阻害性ＲＮＡオリゴヌクレオチドを誘導するために使用さ
れ得ることは、上記から明らかなはずである。例えば、さらなる活性オリゴヌク
レオチドは、酵母Ｉ−ＲＮＡ配列の相補体（「アンチセンス」）から誘導され得
る。なぜなら、この相補配列はまた、Ｉ−ＲＮＡ配列自体の翻訳阻害活性を示す
からである。図１３を参照のこと。Ｉ−ＲＮＡ配列について記載される同じ変異
アプローチおよび他の分析アプローチが、適切である慣用的な改変とともに適用
される。
【００５２】 さらに、例示的な酵母Ｉ−ＲＮＡとほとんどまたは全く配列相同性を有さない
天然に存在するＲＮＡ配列が、本明細書中に記載されるように、本発明の活性Ｒ
ＮＡオリゴヌクレオチドを生成するために改変され得ることは明らかである。従
って、上記の発明の背景に議論されるように、例えば、種々のピコルナウイルス
ＲＮＡの５’ＵＴＲの特定のループが、例えば、ＩＲＥＳ媒介性翻訳開始に必要
とされるタンパク質因子へのそれらのｍＲＮＡの結合を担うことが公知である。
実際、本発明の開示は、欠失分析によって、酵母Ｉ−ＲＮＡは、インビトロでポ
リオウイルスＲＮＡの翻訳を阻害するために、ｍＲＮＡが内部リボソーム侵入部
位（ＩＲＥＳ）配列を有することを必要とすることを示す。これらの配列を含む
オリゴヌクレオチドはまた、本発明に従う翻訳阻害活性を有する。
【００５３】 しかし、先行技術は、本発明に従う翻訳阻害のために、このような因子結合ル
ープの結合配列からなるＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用する可能性を、認識し
なかったようであり、そしていかなる目的のためにも、３５ヌクレオチド未満の
このようなＲＮＡオリゴヌクレオチドの産生さえ知られていないようである。
【００５４】 同様に、本開示において例示されるｐ５２タンパク質に加えて、他のタンパク
質因子に結合することが示されるＲＮＡループはまた、本発明のＲＮＡオリゴヌ
クレオチドの天然配列の適切な供給源である。さらに、３つのデータベース（す
なわち、ウイルス、構造ＲＮＡおよび酵母を含む植物のＧＣＧ形式Ｇｅｎｂａｎ
ｋ（１９９３年９月バージョン））のＢｉｏｖａｘコピーにおけるＦＡＳＴＡ（
Ｐｅａｒｓｏｎら、１９８８）を使用する、Ｉ−ＲＮＡ配列に類似する配列につ
いての検索は、部分的に関連する配列を同定した。従って、８９．５％の相同性
が、日本脳炎ウイルスのゲノムの領域で（１９ｎｔの重複にて）見出された。同
様に、７０〜８０％の相同性が、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、
エプスタイン‐バーウイルス、デングウイルス、およびインフルエンザウイルス
のゲノムの異なる領域で観察された。構造ＲＮＡデータベースに対して比較した
場合、最も著しい相同性（７９〜１００％、１１〜１９ｎｔの重複）は、種々の
生物由来の１６Ｓ ｒＲＮＡとであった。Ｉ−ＲＮＡはまた、トリパノソーマ類
の５Ｓ ｒＲＮＡと高度な相同性（９３．８％、１６ｎｔの重複）を有する。酵
母を含む植物のデータベースに対する比較は、酵母遺伝子のヒストンＨ４．１お
よびヒストンＨ３と９３．３％の相同性（１５ｎｔの重複）を示した。Ｉ−ＲＮ
Ａと相同性を有することが見出されたｍＲＮＡは、トウモロコシのスーパーオキ
シドジスムターゼ３アイソエンザイム（１００％の相同性、１３ｎｔの重複）だ
けであった。短い長さの重複配列を考慮すると、これらの知見の重要性は、現在
では明らかではない；しかし、これらの配列、特に、適切な推定二次構造を示す
配列は、本明細書中に記載されるような、本発明の阻害活性について試験するた
めに好ましい候補である。
【００５５】 （活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模倣物の同定） Ｉ−ＲＮＡ分子内の二次構造が、その翻訳阻害活性に対して重要であることを
決定するために、部位特異的変異誘発が、一度に１つまたは２つのヌクレオチド
を変化させることによって実行されＩ−ＲＮＡ二次構造を不安定化させる。Ｉ−
ＲＮＡの２つのコンピューター推定二次構造により、比較的熱力学的に安定であ
ることが予測され得る。これらのコンピューター推定されたＩ−ＲＮＡの二次構
造は、その（それらの）ジメチル硫酸（ＤＭＳ）での改変に対する影響の受けや
すさならびに一本鎖および二本鎖に特異的なヌクレアーゼに対する感受性を決定
することによって確認される。これらの方法は、ＰＶ ５’ＵＴＲのコンピュー
ター推定二次構造を支持するために使用されている。簡潔には、Ｉ−ＲＮＡは、
ＤＭＳ、Ｓ１、コブラ蛇毒（ＣＶ）、および記載される（１１）ような他のヌク
レアーゼで処理される。改変および切断が生じた部位の同定について、プライマ
ー伸長技術が使用される（１１）。ＤＮＡ鎖の伸長は、改変された塩基の前およ
び切断されたヌクレオチド間結合の直前の１つのヌクレオチドで停止するはずで
ある。より先にかつ実験的に検証したＩ−ＲＮＡの二次構造を記載する最初の欠
失研究は、どのヌクレオチドがＩ−ＲＮＡの内部で変異するかの決定を可能にす
る。Ｉ−ＲＮＡの二次構造を不安定化させ、また、その生物学的活性（インビト
ロおよびインビボの両方）を破壊する変異の発見に基づいて、その生物学的活性
が元に戻すはずであるさらに補償する変異を、その二次構造を安定化させるため
に導入し得る。それによって本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模倣物を
作成する。
【００５６】 さらにヌクレアーゼに対する耐性または膜に対する透過性の増大を有する構造
模倣物は、当該分野で公知の従来のヌクレオチドアナログを使用して合成され得
、そして本明細書中に記載されるように活性を試験する。
【００５７】 さらに、分析物に結合する分子のアナログを得る一般方法は、米国特許第５，
１３３，８６６号に記載される。これは、第１の部分の環境において存在するさ
らなる部分と比較して、この第１の部分に特異的な親和性を有する分析物に関し
てアフィニティークロマトグラフィーの実施に有用であるパラログを同定する方
法を、記載し、そして特許請求する。この方法は、上記第１の部分を選択的に結
合する能力について、個々の候補パラログのパネルをスクリーニングする工程で
あって、ここで上記候補パラログが少なくとも２つの異なるパラメータの値を系
統的に変動し、これらのパラメータの各々が他の基質を結合するパラログの能力
を決定する、工程を含む。この方法は、核酸である候補パラログを含む。この方
法は、任意の選択された部分に特異的に結合し得る物質の系統的かつ容易な選択
を可能にする。選択された部分がレセプターまたは他の生物学的標的である場合
、このパラログは、種々の薬理学的適用および治療的適用に有用である。
【００５８】 （本発明のインヒビターのスクリーニングアッセイ） 本発明の酵母Ｉ−ＲＮＡと同一の機構によってタンパク質翻訳を阻害する分子
（例えば、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉ
ｔｅ）に結合し、そして本発明の酵母Ｉ−ＲＮＡとの結合によって阻害されるタ
ンパク質翻訳開始因子の活性を調節する、抗体または他の化合物）を同定するた
めのインビトロアッセイもまた、本発明によって提供される。そのようなアッセ
イは、固定化されたリガンド（例えば、ＩＲＥＳ依存性のタンパク質翻訳開始に
必要な適切な開始因子、またはそのような因子の分子模倣物を固定化するか、あ
るいは、そのような開始因子が結合する天然のリガンド（例えば、Ｉ−ＲＮＡ）
を固定化する）を含み、固定化していない結合パートナーを検出可能に標識する
工程、結合パートナーをともにインキュベートする工程、および結合した標識の
量に対する試験化合物の効果を決定する工程を包含し得、ここで試験化合物の非
存在下で結合した標識の量と比較した、試験化合物の存在下で結合した標識の減
少は、この試験薬剤が開始因子の結合のインヒビターであることを示す。
【００５９】 翻訳開始因子とリガンドとの間の相互作用を調節する化合物を同定するための
アッセイの別のタイプは、蛍光剤でコートされた（または染み込ませた）固体支
持体上で、その因子またはその因子の模倣物もしくはフラグメントを固定化する
工程、その蛍光剤を励起し得る化合物でそのリガンドを標識する工程、推定され
る調節化合物の存在下または非存在下で、固定化された開始因子と標識されたリ
ガンドを接触させる工程、蛍光剤による放射光を検出する工程、および調節化合
物の非存在下における蛍光剤による放射光との比較において、蛍光剤による放射
光に影響を与える化合物として調節化合物を同定する工程、を包含するシンチレ
ーション近接アッセイである。あるいは、開始因子リガンドが、固定化され得、
そして開始因子は、アッセイにおいて標識され得る。
【００６０】 ＩＲＥＳ−依存性タンパク質開始因子とリガンドとの間の相互作用を調節する
化合物を同定するための、本発明によって意図されるさらに別の方法は、ダイハ
イブリッド（ｄｉ−ｈｙｂｒｉｄ）スクリーニングアッセイである。このアッセ
イは、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって調節
されるプロモーターの制御下のレポーター遺伝子を含有するＤＮＡ構築物で、適
切な宿主細胞を、形質転換またはトランスフェクトする工程、ＩＲＥＳ依存性翻
訳開始因子および転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれ
かの一部または全部の第１の融合物をコードする第１のハイブリッドＤＮＡ配列
を、その宿主細胞中で発現する工程、リガンドおよび第１の融合物中に取り込ま
れなかった転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインの一部または全
部をコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列を、その宿主細胞中で発現する工
程、推定される調節化合物の存在下および非存在下において、特定の宿主細胞中
のレポーター遺伝子産物の産生を測定することによる、その宿主細胞中での開始
因子に対するそのリガンドの結合を検出することにより、開始因子とそのリガン
ドとの間の相互作用に対する推定される調節化合物の影響を評価する工程、およ
びその調節化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子産物の産生との比較にお
いて、そのレポーター遺伝子産物の産生を変化させる化合物として、調節化合物
を同定する工程、を包含する。このアッセイにおける使用のために現在好ましい
のは、ｌｅｘＡプロモーター、ｌｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４トラン
ス活性化ドメイン、ｌａｃＺレポーター遺伝子、および酵母宿主細胞である。ダ
イハイブリッドアッセイの改変は、翻訳装置の他の成分と相互作用する、Ｌａタ
ンパク質またはｐ８０タンパク質の相互作用を含み得る。
【００６１】 上記のアッセイの変更されたバージョンは、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化
ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下のレポータ
ー遺伝子を含むＤＮＡ構築物を用いて適切な宿主細胞を形質転換するか、または
トランスフェクトする工程、開始因子および転写因子のＤＮＡ結合ドメインまた
は活性化ドメインのいずれかの一部または全部の第１の融合物をコードする第１
のハイブリッドＤＮＡ配列を、その宿主細胞中で発現する工程、第２の融合物あ
るいは、推定される開始因子結合タンパク質またはＲＮＡ、および第１の融合物
中に取り込まれなかった転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインの
一部または全部をコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列のライブラリーを、
その宿主細胞中で発現する工程、特定の宿主細胞中のレポーター遺伝子産物の産
生を検出することにより、その宿主細胞中での開始因子に対する開始因子結合タ
ンパク質またはＲＮＡの結合を検出する工程、および特定の細胞由来の開始因子
結合タンパク質またはＲＮＡをコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列を単離
する工程により翻訳開始因子に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドを単離する際に、使用され得る。
【００６２】 本発明のＩ−ＲＮＡの活性を有する翻訳インヒビターについてのさらなるアッ
セイは、Ｌａ−依存性インビトロ翻訳アッセイである。このアプローチは、実施
例に記載されるように、ＩＲＥＳ媒介性インビトロ翻訳の阻害の直接的観察に基
づく。あるいは、化合物を、トランスフェクトされた細胞において、ＩＲＥＳ依
存性翻訳の阻害についてスクリーニングし得る（例えば、実施例１０において記
載されるように、例えば、１つのタンパク質産物がＣＡＰ依存性様式において翻
訳され、そして第２のタンパク質産物がＩＲＥＳを介して翻訳される二シストロ
ン性ＲＮＡ分子を用いる）。そのようなスクリーニングは、細胞培養物由来のレ
ポーター分子のＩＲＥＳ依存性翻訳の阻害の検出に利用し得る。さらに、インヒ
ビターのスクリーニングはまた、ウイルス産生の阻害を使用し得る（実施例１０
に記載されるようなキャプシドタンパク質またはプラークアッセイを介するかの
いずれか）。最終的に、動物モデル系におけるピコルナウイルス媒介性効果が生
じるのをブロックする化合物についての、動物に基づくスクリーニングを使用し
て、Ｉ−ＲＮＡ模倣物の効力を評価する。
【００６３】 （本発明のインヒビター分子および関連する局面の使用） 本発明の方法およびインヒビター分子を、細胞または動物もしくはヒト被験体
においけるウイルス感染の処置または予防のために、使用し得る。本発明の方法
およびインヒビター分子はまた、特定のＲＮＡが、一般にウイルスｍＲＮＡを示
すＩＲＥＳ媒介性翻訳を示すか否かを決定するための診断ツールとして使用され
得る。
【００６４】 本発明に適切なウイルスの範囲に関して、酵母由来の阻害性ＲＮＡは、種々の
ピコルナウイルスＲＮＡ（ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス
、コクサッキーウイルス、およびピコルナウイルス科群の他のメンバーのＲＮＡ
を含む）によるＩＲＥＳ媒介性翻訳を特異的に阻害する。キャッピングされた細
胞性ｍＲＮＡの翻訳は、インビトロまたはインビボにおいて、この酵母インヒビ
ターＲＮＡによって影響されないようであるが、ピコルナウイルス複製は、ウイ
ルスＲＮＡ翻訳の阻害に起因して、インビボにおいて、酵母インヒビターＲＮＡ
によって阻害される。インヒビターＲＮＡは、ウイルスの５’ＵＴＲ内のＲＮＡ
構造エレメントと相互作用するタンパク質に、特異的に結合する。
【００６５】 ピコルナウイルス群に属さない多くの他のウイルスもまた、翻訳のためにＩＲ
ＥＳを使用する。主な例は、フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（１，２）であ
る。酵母インヒビターはまた、Ｃ型肝炎ウイルスの翻訳を阻害する。近年、伝染
性気管支炎ウイルス（コロナウイルス）のｍＲＮＡ３もまた、内部リボソーム進
入機構を利用することが報告されている（３，４）。さらになおアヒルおよびヒ
トのＢ型肝炎ウイルスの逆転写酵素、水疱性口内炎ウイルスＮＳタンパク質、ア
デノウイルスＤＮＡポリメラーゼ、およびセンダイウイルスＰ／Ｃタンパク質を
コードするｍＲＮＡが、リボソーム進入の内部での開始を使用することが示され
ている（５−９）。さらになお、内部リボソーム進入が、レトロウイルス科（例
えば、マウス白血病ウイルス；引用文献２９）、ペスチウイルス科（３０）、お
よび植物ポティ（ｐｏｔｙ）ウイルス（３１）における翻訳について示されてい
る。従って、翻訳の内部開始を使用する、多くの異なるウイルス群のメンバーに
対する抗ウイルス剤を、本発明に従って調製し得る。
【００６６】 本発明の阻害性ＲＮＡおよび構造模倣物をまた使用して、内部開始したｍＲＮ
Ａ（例えば、ウイルスｍＲＮＡ）の翻訳を、そのようなｍＲＮＡを保持する細胞
培養物または宿主生物において、制御し得る。その阻害性ＲＮＡまたは模倣物は
、標準的な投与方法（例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、
Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最終版に示される）を使用して供給される。好ましくは、
被験体のインビボ処置のために、そのＲＮＡまたは模倣物を、注入によって提供
する（そして、そのために、従来の賦形剤（例えば、リンガー溶液、ハンクス溶
液など）を使用して処方する）。適切な処方物を用いる経口投与もまた行われ得
る。ほとんどの投与が全身性であるが、ライノウイルスによる鼻腔感染のような
局所的条件の場合において、投与は、局所的であり得るか、またはそうでなけれ
ば局部的であり得る。薬物送達のための徐放性機構もまた使用し得る。
【００６７】 あるいは、ＲＮＡまたはその阻害性に有効なフラグメントをコードするＤＮＡ
を含有する発現系を、「逆配向」発現系において提供することにより、インサイ
チュにおいて、阻害性ＲＮＡ配列を、生成し得る。この発現系は、逆配向の配列
が、例えば、ＳＶ−４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター、ワクシニ
アウイルスプロモーターなどの制御下である、哺乳動物被験体のような宿主被験
体中で作動可能であるように設計され得、その結果ＲＮＡがインサイチュで転写
される。宿主細胞の培養物中において使用される場合、発現系は、宿主細胞と適
合するレプリコンにおいて、提供される。
【００６８】 より具体的には、本発明の酵母Ｉ−ＲＮＡは、ピコルナウイルス（ヒトピコル
ナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルスおよびコクサ
ッキーウイルスＢ３）および動物ピコルナウイルス（口蹄疫ウイルス；ＦＭＤＶ
）を含む）の５’ＵＴＲからＩＲＥＳ依存性翻訳開始、ならびにフラビウイルス
（Ｃ型肝炎ウイルス）ｍＲＮＡの内部翻訳を阻害することが示されている。さら
に養鶏産業において顕著な損失を生じる伝染性気管支炎ウイルス（コロナウイル
ス）のｍＲＮＡ３もまた、内部リボソーム進入機構を使用する（３，４）。さら
に、アヒルおよびヒトのＢ型肝炎ウイルスの逆転写酵素、水疱性口内炎ウイルス
ＮＳタンパク質、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ、ならびにセンダイウイル
スＰ／Ｃタンパク質をコードするｍＲＮＡが、リボソーム進入の内部での開始を
使用することが示されている（５−９）。さらになお、内部リボソーム進入が、
レトロウイルス科（例えば、マウス白血病ウイルス；引用文献２９）、ペスチウ
イルス科（３０）、および植物ポティ（ｐｏｔｙ）ウイルス（３１）における翻
訳について示されている。従って、本発明はまた、利用可能な遺伝子操作技術を
使用して、本発明のＩ−ＲＮＡ分子または関連する翻訳開始インヒビターを発現
し、それによってＩ−ＲＮＡがＩＲＥＳ依存性翻訳を阻害するウイルスの病原効
果に対して耐性である、トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物
の産生を可能にする。本発明者らは、従来の技術による、その複製が翻訳の内部
開始に依存するウイルスおよび他の病原に対して耐性なトランスジェニック植物
および動物の産生を意図する。
【００６９】 本発明の別の局面は、細胞（特に酵母細胞）中でのＩ−ＲＮＡ遺伝子の単離お
よび改変に関する。この細胞は、そのような細胞または細胞抽出物中の所望のｍ
ＲＮＡのＩＲＥＳ依存性翻訳開始を妨げる、本発明のＩ−ＲＮＡを発現する。こ
れらの遺伝的改変は、Ｉ−ＲＮＡの発現または活性を阻害し、それによって、所
望のＩＲＥＳ依存性翻訳開始を可能とする。第１の例において、本明細書に記載
されるように、酵母から単離されたＩ−ＲＮＡ分子の配列の同定は、Ｉ−ＲＮＡ
遺伝子（例えば、サザンブロッティングによる）およびその初期の転写産物（ノ
ザンブロッティングによる）を検出する従来の遺伝子操作方法とともに使用され
得る標識されたプローブの調製を可能とする。さらに、そのようなプローブを使
用して、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において
、酵母Ｉ−ＲＮＡ遺伝子または他の種由来のホモログ遺伝子あるいはそのような
遺伝子の転写物を、当該分野において周知の標準的な遺伝子クローニングアプロ
ーチによって単離し得る。例えば、所望の種のランダムなゲノムライブラリーを
、本発明によって提供されたＩ−ＲＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーシ
ョンによってスクリーニングし得る。酵母Ｉ−ＲＮＡ遺伝子および他の種由来の
ホモログ遺伝子の構造およびゲノム構成の調査は、そのような遺伝子の通常の機
能の、より良好な理解をもたらす。
【００７０】 さらに、本開示は、宿主細胞の改変によってＩ−ＲＮＡの発現または活性を阻
害することを可能にする。最初の例においては、このような改変の導入は、Ｉ−
ＲＮＡ活性が、このようなＩ−ＲＮＡを発現する宿主細胞の生存に必須か否かを
決定する。１つのアプローチにおいて、Ｉ−ＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮ
Ａ（すなわち、「アンチセンスＩ−ＲＮＡ」）は、Ｉ−ＲＮＡ分子を発現する宿
主細胞（例えば、酵母）において発現される。アンチセンスＩ−ＲＮＡの発現の
ためのベクターは、選択マーカー遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）を含み、形質転換
された細胞のみが確実に回収される。アンチセンスＩ−ＲＮＡを発現する形質転
換された細胞が回収されない場合、誘導性発現構築物を試験し得、このアンチセ
ンスＲＮＡベクターがアンチセンスＩ−ＲＮＡの発現の非存在下で細胞へ形質転
換され得るか否か、および引き続く発現がいずれかの細胞機能を阻害するか否か
を決定する。あるいは、Ｉ−ＲＮＡ遺伝子は、当該分野で公知の遺伝子「ノック
アウト」方法論を使用して除かれ得る。例えば、酵母細胞において、細胞に導入
された外因性ＤＮＡは、効率的かつ安定に、相同組換えにより染色体ＤＮＡに組
み込まれ、このことによって、野生型遺伝子の非機能的コピーでの効率的な置換
が可能になる。代表的には、非機能的コピーは、野生型コード配列を選択マーカ
ー遺伝子（例えば、ＬＥＵまたはＵＲＡ）で置換することにより生成される。二
倍体細胞の形質転換は、いくつかのＩ−ＲＮＡ活性が細胞生存性に必要とされる
場合、あり得る致死的効果を回避し得る。酵母もしくは他のＩ−ＲＮＡ発現宿主
細胞、またはその抽出物（これは、本発明に従うアンチセンスもしくは遺伝子ノ
ックアウト改変のいずれかの結果としてＩ−ＲＮＡ活性の減少を有する）は、Ｉ
ＲＥＳ依存性翻訳開始を必要とするｍＲＮＡの発現のために有用である。当該分
野で公知である遺伝子ノックアウト方法論により改変され得る酵母または他のＩ
−ＲＮＡ宿主細胞は、Ｌａまたはそのホモログをコードする遺伝子を除去して、
合成が翻訳の内部開始に依存するタンパク質の発現を可能にする宿主株を生成す
ることもまた企図される。
【００７１】 以下の実施例は、例示することが意図され、本発明を限定しないことが意図さ
れる。
【００７２】 （実施例１：酵母インヒビターＲＮＡの精製および配列決定） 使用したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＡＢＹＳ
Ｉ（Ｄ．Ｍｅｙｅｒ（ＵＣＬＡ）により提供）であった。ポリオウイルスＲＮＡ
からのＩＲＥＳ依存性翻訳を特異的に阻害し得る酵母細胞由来のインヒビターを
、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムを通過させることによって最初に精製した
（Ｃａｗａｒｄら、１９９２、前出）。このインヒビターはカラムに強く結合し
、そして１Ｍ酢酸カリウムでカラムを洗浄することにより溶出した。ＤＥＡＥ−
Ｓｅｐｈａｃｅｌ精製したインヒビターのさらなる精製は、ＤＮａｓｅおよびプ
ロテイナーゼＫ消化、次いで、フェノール−クロロホルム抽出を包含した。最終
的に、水相のアルコール沈澱により得られたＲＮＡを、５’末端でγ32Ｐ−ＡＴ
Ｐで末端標識し、そして単一のＲＮＡバンドを２０％ ＰＡＧＥ／８Ｍ尿素電気
泳動により分離した。各ＲＮＡバンドをゲルスライスから溶出し、そしてポリオ
ウイルス５’ＵＴＲ−ＣＡＴ構築物由来の翻訳の内部開始を阻害するその能力に
ついてアッセイしたが、ｃａｐ依存性様式で翻訳を開始することが公知のコント
ロールＣＡＴ構築物（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９８９）由来の翻訳の内部開始
を阻害する能力についてアッセイしなかった。６０ヌクレオチドのＲＮＡとして
移動した単一のバンドが阻害活性と関連した。
【００７３】 より詳細には、酵母細胞溶解物を、小球菌ヌクレアーゼで処理した以外は、以
前に記載のように調製した（Ｒｏｔｈｂｌａｔｔら、１９８６）。溶解物を、０
．１Ｍ酢酸カリウムにおけるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）カラム上にロードし、そして０．３、０．６および１Ｍ酢酸カリウムを含む緩
衝液で段階溶出した。これらの画分を０．１Ｍ塩に戻るように透析し、そして翻
訳阻害活性についてアッセイした。阻害活性を示した１Ｍ画分を、ＤＮａｓｅ処
理、次いで、プロテイナーゼＫ消化、そしてフェノールクロロホルム抽出に供し
た。次いで、この画分由来のＲＮＡをアルコール沈澱により単離した。次いで、
１Ｍ画分で同時精製した酵母ＲＮＡを、脱リン酸化し、そしてキナーゼ反応によ
り５’末端を標識した。標識したＲＮＡ種を、２０％アクリルアミド−８Ｍ尿素
配列決定ゲルで分離した。標識したバンドおよび非放射性のＲＮＡバンドを平行
レーンで泳動し、そして以下のようにゲルから溶出した。個々のゲルスライスを
、５００μｌの溶出緩衝液（２Ｍ酢酸アンモニウムおよび１％ ＳＤＳ）中に、
３７℃で４時間浸漬した。室温で短時間遠心分離した後、上清を収集し、フェノ
ール：クロロホルム（１：１）で抽出し、そして２０μｇのグリコーゲン（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の存在下で
アルコール沈澱した。
【００７４】 沈澱したＲＮＡペレットを、ヌクレアーゼを含まない水中に再懸濁し、そして
無ＨｅＬａ細胞翻訳系においてｐ２ＣＡＴ ＲＮＡの翻訳を阻害する能力につい
て試験した（Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、前出）。ＨｅＬａ細胞を、１ｇ／Ｌの
グルコースおよび６％の新生仔血清を補充した最小必須培地（ＧＩＢＣＯ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でスピナー培養で増殖させた。ＨｅＬａ細胞抽出物を
以下に記載のように調製した（Ｒｏｓｅら、１９９２；Ｃｏｗａｒｄら、１９９
２、前出）。無ＨｅＬａ細胞抽出物におけるインビトロ翻訳を本質的に以前に記
載のように行った（Ｒｏｓｅら、１９７８）。２μｇの各ｍＲＮＡを、２５μＣ
ｉの35Ｓ−メチオニン（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）および４０
ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下で、２５μｌ反応混合物中
、８０μｇのＨｅＬａ細胞抽出物とともに使用した。
【００７５】 ウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）における翻訳を、１２．５μｌの
溶解物、２５Ｃｉの35Ｓ−メチオニンを有する２μｇのｍＲＮＡ（比活性＞１０
００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む１５μｌ反応容量において３０℃で１時間行った。
３μｌの翻訳産物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１４％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析した。
【００７６】 精製したＲＮＡを市販の配列決定キット（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して配列決定した。末端標識したＲＮＡを塩基
特異的リボヌクレアーゼ−緩衝液の組み合わせと混合し、５０℃でインキュベー
トし、次いで、２０％アクリルアミド−ＳＭ尿素配列決定ゲル上にロードした。
図１Ａは、６０ヌクレオチドのＲＮＡの配列（配列番号１）を示す。
【００７７】 （実施例２：酵母インヒビターＲＮＡのクローニングおよび転写） 決定したＲＮＡ配列に基づいて、センス鎖特異的デオキシオリゴヌクレオチド
およびアンチセンス鎖特異的デオキシオリゴヌクレオチドを合成し、アニールし
、そしてポリリンカー領域におけるＨｉｎｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間
に、ｐＧＥＭ ３Ｚ発現ベクターにクローニングし、組換えプラスミドｐＳＤＩ
Ｒを形成した（図１Ｂ）。
【００７８】 クローンｐＳＤＩＲをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で線状化し、次いで、Ｔ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼを用いて転写して、インヒビターＲＮＡを生成した（センス転
写）。線状化したプラスミドからのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写は、イ
ンヒビターＲＮＡの合成を生じた。ゲル電気泳動により分析した場合、７１ヌク
レオチドの単一バンドが観察され、このバンドは、酵母インヒビターＲＮＡおよ
び５’ポリリンカー領域由来のＥｃｏＲＩ部位ｌからのさらなる１０ヌクレオチ
ド、ならびにＨｉｎｄＩＩＩ部位からの３’末端に１ヌクレオチドを含んだ。
【００７９】 合成クローンから合成したＲＮＡが活性であるか否かを決定するために、ＣＡ
Ｔ遺伝子（Ｐ２−ＣＡＴ）の５’末端にポリオウイルス５’ＵＴＲを含むＣＡＴ
構築物からの翻訳に対するその効果を決定した。酵母由来の部分的に精製された
インヒビターおよびｐＳＤＩＲから転写した精製したインヒビターの両方は、無
ＨｅＬａ細胞抽出物においてインビトロでＰ２ＣＡＴ ＲＮＡからの翻訳を阻害
した（図１Ｄ、レーン４、５、６）。しかし、ＣＡＴ ＲＮＡからの翻訳（ｃａ
ｐ依存性翻訳）は、いずれのインヒビターでも有意に阻害されなかった（図１Ｄ
、レーン１、２、３）。従って、合成クローンから合成したインヒビターＲＮＡ
を、酵母細胞由来の部分精製インヒビターとともに以前見出されたように、ポリ
オウイルスＩＲＥＳ依存性翻訳を特異的に阻害する活性があった（Ｃｏｗａｒｄ
ら、１９９２、前出）。
【００８０】 （実施例３：酵母ＲＮＡインヒビターによる阻害に必要とされるポリオウイル
ス５’ＵＴＲ配列の同定） ポリオウイルスＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の特異的配列が、酵母イ
ンヒビターＲＮＡがＩＲＥＳ依存性翻訳を阻害するために必要か否かを決定する
ために、多くの欠失させた５’ＵＴＲ−ＣＡＴ構築物をＮ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ
博士（ＭｃＧｉｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の実験室から得た。図２Ｄを参照
のこと。
【００８１】 ｍＲＮＡを、異なる線状化プラスミドからのＴ７またはＳＰ６プロモーターの
いずれかを使用して、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロ
で転写した。プラスミドｐＧＣＡＴおよびＰ２ＣＡＴ（Ｃｏｗａｒｄら、１９９
２、前出）の両方を、ＢａｍＨＩで線状化し、そしてランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）
転写を、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成した。プラスミドｐＢＩＰ
−ＬＵＣ構築物をＰ．Ｓａｒｎｏｗ（Ｍａｃｅｊａｋら、１９９１）から得、そ
してＨｐａＩ酵素で線状化し、そしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し
た。ＴＭＥＶ−ＩＲＥＳ含有構築物ｐＰＢ３１０を、Ｈｏｗａｒｄ Ｌ．Ｌｉｐ
ｔｏｎ（Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙら、１９９２）から得、そしてＨｐａＩで線
状化し、そしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。
【００８２】 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写のためのオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドテンプレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＤＮＡ合成機で
合成し、次いで、精製した。等モル量の１８マー Ｔ７プライマーオリゴヌクレ
オチドおよびテンプレートオリゴヌクレオチドを０．１Ｍ ＮａＣｌ中に混合し
、そして５分間１００℃に加熱し、次いで、室温までゆっくりと冷却することに
よりアニーリングした。ＳＬ−Ｂ、ＳＬ−Ｃ、ＳＬ−Ｄ、およびＳＬ−ＧのＲＮ
Ａを上記の方法に従ってインビトロで合成した。
【００８３】 インヒビターは、ｐＰ２ ＣＡＴからの翻訳を効率的に阻害したが、ｐＧ３
ＣＡＴ（またはｐＣＡＴ）構築物からの翻訳は阻害しなかった（図１Ｄ）。Δ５
’−３３ ＣＡＴ構築物をインヒビターＲＮＡの存在下で翻訳した場合に、ほぼ
完全な阻害が観察された（データは示さず）。ＵＴＲの５’末端からの最初の３
２０ヌクレオチドの欠失は、このインヒビターがΔ５’−３２０／ＣＡＴ構築物
からの翻訳を阻害する能力に対して有意な効果を有さなかった（図２Ａ、レーン
１および２）。ほぼ８０％の翻訳阻害がインヒビターの存在下で観察された（レ
ーン１および２）。インヒビターありで観察された阻害のいくつかは、テンプレ
ートＲＮＡが翻訳の前にキャップされた場合に逆転され得た（図２Ａ、レーン３
および４）。
【００８４】 Δ３’−６３１／ＣＡＴ構築物で類似の結果が観察され；この構築物からの翻
訳のほぼ完全な阻害が、インヒビターの存在下で観察され、そしてキャップされ
たＲＮＡの付加により、Δ５’−３２０構築物ほどではないが、ある程度まで翻
訳の阻害が逆転された（図２Ｂ、レーン５〜８）。対照的に、Δ５’−６３２／
ＣＡＴ構築物からの翻訳は、インヒビターの存在下でもほとんど影響を受けなか
った（図２Ｂ、レーン１および２）。
【００８５】 従って、インヒビターがポリオウイルスＩＲＥＳ依存性翻訳を効率的にほとん
ど全て阻害するために、ウイルスＲＮＡのＩＲＥＳ領域ほぼ全体（３２０〜６３
１）が必要とされる。しかし、有意な阻害は、ウイルスＵＴＲのヌクレオチド３
２０〜４６１のみを含む構築物で観察された。従って、ＵＴＲのヌクレオチド３
２０〜４６１のみを含む構築物Δ５’−３２０／Δ３’−４６１／ＣＡＴからの
翻訳は、インヒビターＲＮＡにより有意に阻害された（図２Ｃ、レーン１および
２）。この阻害は、翻訳の前にＲＮＡをキャップすることにより有意な程度まで
克服され得る（図２Ｃ、レーン３および４）。このことは、ｃａｐ依存性翻訳が
実質的にインヒビターにより影響を受けないことを示す。
【００８６】 （実施例４：ゲル電気泳動間のＲＮＡ遅延を使用する、タンパク質因子とｍＲ
ＮＡ ５’ＵＴＲ配列との複合体の、酵母Ｉ−ＲＮＡによる破壊の実証） 理論的には、インヒビターＲＮＡは、２つの可能な機構によりＩＲＥＳ依存性
翻訳を阻害し得る：アンチセンスＲＮＡとしてのＵＴＲ配列への結合またはリボ
ソームの内部侵入のために必要なタンパク質因子への結合。これらの２つの機構
を区別するために、均一に32Ｐ標識されたインヒビターＲＮＡプローブを調製し
、そしてＨｅＬａ Ｓ１０抽出物と混合し、そして得られたＲＮＡ−タンパク質
複合体を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００８７】 ＨｅＬａ Ｓ１０細胞質抽出物を、ＨｅＬａ細胞を含まない翻訳抽出物の１０
，０００ｇ、３０分、４℃での遠心分離後に上清を収集することによって調製し
た。Ｓ１０抽出物の５０μｇサンプルを、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２
５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３．８％ グリ
セロールおよび２ｍＭ ＤＴＴを含む１５μｌ反応混合液で、４μｇのポリ［ｄ
（Ｉ−Ｃ）］（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に、３０℃で、１０分間プレインキュ
ベートした。競合実験のために、１０〜１００倍過剰の非標識競合的ＲＮＡを反
応液に添加して、そして１０分間、３０℃でインキュベートした。最後に５〜１
０フェムトトモルの標識ＲＮＡプローブをそれぞれの反応液に添加し、そしてイ
ンキュベーションをさらに３０分間、３０℃で継続した。競合アッセイに用いて
非特異的なＲＮＡは、ｐＧｅｍ３Ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のポリリンカー
領域（ＥｃｏＲＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ）の配列であった。３μｌのゲルローディン
グ色素を反応混合液に、１０％のグリセロールならびにともに０．２％のブロモ
フェノールブルーおよびキシレンシアノールの最終濃度まで添加した。次いで、
ＲＮＡ−タンパク質複合体を、０．５×ＴＢＥ中、４％ポリアクリルアミドゲル
（３９：１−アクリルアミド：ビス）上で分析した。
【００８８】 図３Ａに示されるように、単一の複合体（Ｃと命名する）が明らかに示された
。漸増濃度の非標識Ｉ−ＲＮＡは、標識複合体の形成を競合した（図３Ｂ、レー
ン２−５）。同様の結果が、非標識ポリオウイルス５’ＵＴＲ ＲＮＡを競合に
使用した場合に観察された。明らかに、最も高い濃度で、試験したＵＴＲ配列は
、ＨｅＬａ Ｓ１０タンパク質への結合について、首尾よくＩ−ＲＮＡと競合し
た（図３Ｂ、レーン６〜９）。しかし、無関係なＲＮＡは、標識Ｉ−ＲＮＡと競
合し得なかった（図３Ｂ、レーン１０）。従って、インヒビターＲＮＡは、ウイ
ルス５’ＵＴＲ ＲＮＡと特異的に競合し得る、ＨｅＬａ Ｓ１０タンパク質と
ゲル遅延（ｇｅｌ−ｒｅｔａｒｄｅｄ）複合体を形成した。
【００８９】 （実施例５：インヒビターＲＮＡがポリオウイルス５’ＵＴＲと相互作用する
タンパク質に結合することの実証） このウイルス５’ＵＴＲと相互作用する特異的なポリペプチドがまた、酵母イ
ンヒビターＲＮＡと相互作用するか否かを決定するために、一連のＵＶクロスリ
ンク実験を行った。これらの実験において、均一に標識したインヒビターＲＮＡ
を最初にＨｅＬａ Ｓ１０抽出物とインキュベートし、次いで、ＵＶ光を用いて
クロスリンクさせた。リボヌクレアーゼ処置後に、タンパク質−ヌクレオチド複
合体を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【００９０】 ４０〜５０フェムトモルの32Ｐ標識ＲＮＡプローブ（８×１０4ｃｐｍ）を、
上記のようにＨｅＬａ細胞のＳ−１０抽出物５０〜１００μｇと共にインキュベ
ートした。結合反応が完了した後、このサンプルをＵＶランプ（マルチバンドＵ
Ｖ−２５４／３６６ＮＭ Ｍｏｄｅｌ Ｕ ＧＬ−２５；ＵＶＰ，Ｉｎｃ．）か
らのＵＶ光で３〜４ｃｍ離れて、１０分間照射した。非結合ＲＮＡを、２０μｇ
のＲＮａｓｅ Ａと１０ＵのＲＮａｓｅ Ｔ１の混合物で、３７℃、３０分間で
消化し、次いで、ＳＤＳ−１４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【００９１】 32Ｐ標識インヒビターＲＮＡを使用して、ＨｅＬａ抽出物中のタンパク質とク
ロスリンクさせた場合、１００ｋＤａ、７０ｋＤａ、５２ｋＤａおよび３７ｋＤ
ａの推定分子量を有するポリペプチドを検出した（図４Ａ、および４Ｂレーン２
）。これらのペプチドの間で、５２ｋＤａタンパク質が、いくつかの実験におい
て最も強く標識された（図４Ｂ、レーン２）。非標識インヒビターＲＮＡの添加
は、首尾よくこの５２ｋＤａバンドと競合した（図４Ａ、レーン３）。非標識ポ
リオウイルス５’ＵＴＲを競合剤として使用した場合、この５２ｋＤａならびに
１００ｋＤａ、７０ｋＤａ、および３７ｋＤａバンドも完全に競合し消失した（
図４Ａ、レーン４）。非標識ＲＮＡと対照的に、無関係のＲＮＡは、インヒビタ
ーＲＮＡにクロスリンクされたいずれのポリペプチドととも競合し得なかった（
レーン５）。
【００９２】 ５２ｋＤａタンパク質は、以前にこのウイルス５’ＵＴＲの特異的領域（ヌク
レオチド５５９〜６２４）と相互作用することが示されているために、この配列
を含むＲＮＡ（“ＵＴＲ ５５９〜６２４”）の、標識Ｉ−ＲＮＡにクロスリン
クされた５２ｋＤａバンドに競合する能力を決定した。図４Ｂ（レーン４）に示
されるように、非標識ＵＴＲ５５９〜６２４は、このＩＲＮＡ−５２ｋＤａ複合
体の形成を完全に阻害した。５’ＵＴＲ配列全体とは異なり、ＵＴＲ５５９〜６
２４は、５２ｋＤａタンパク質のみと競合した（図４Ａおよび４Ｂのレーン４と
比較のこと）。これらの結果は、この酵母インヒビターＲＮＡが、ポリオウイル
ス５’ＵＴＲ配列５５９〜６２４によって結合されたタンパク質と類似または同
一の５２ｋＤａタンパク質に結合することを示す。
【００９３】 （実施例６：酵母インヒビターＲＮＡが、ステムループＤおよびＧの両方とタ
ンパク質結合について競合することの実証） ポリオウイルス５’ＵＴＲは、いくつかの熱力学的に安定なステムループ構造
を含み、これらの構造は、ウイルスＲＮＡ複製および翻訳に重要な役割を果たす
と考えられる（図５）。これらの間で、ステムループＡ、Ｂ、およびＣは、推定
的にＲＮＡ複製に関与する。反対に、ステムループＤ〜Ｇは、ウイルスｍＲＮＡ
の翻訳に関与すると考えられる（Ｄｉｌｄｉｎｅら、１９９２）。ステムループ
Ｄ（ＳＬ−Ｄ）（ヌクレオチド１８６〜２２１を含む）は、５０ｋＤａタンパク
質（ｐ５０）に結合することが示されている（Ｎａｊｉｔａら（１９９０、前出
））が、ステムループＧ（ＳＬ−Ｇ）（ポリオウイルス５’ＵＴＲ配列の５５９
〜６２４を表す）は、５２ｋＤａタンパク質（ｐ５２）に結合し、このタンパク
質は、ヒトＬａタンパク質として最近同定されている（Ｍｅｅｒｏｖｉｔｃｈら
（１９９３、前出））。
【００９４】 先の実施例で示された結果は、インヒビターＲＮＡが、このウイルス５’ＵＴ
ＲないのステムループＧに正常に結合するｐ５２に相互作用することを示した。
このインヒビターＲＮＡがまた、ｐ５０に結合し得、そしてステムループＤと競
合し得るか否かを決定するために、５’ＵＴＲのヌクレオチド１７８〜２２４に
対応するＲＮＡを調製した。第一の実験において、個々に32Ｐ標識した、Ｉ−Ｒ
ＮＡ、５’ＵＴＲ全体、ステムループＧ（ＵＴＲ５５９〜６２４）、およびステ
ムループＤ（ＵＴＲ１７８〜２２４）を、ＨｅＬａ Ｓ−１０抽出物と共に別々
にインキュベートし、そして生じたタンパク質−ヌクレオチド複合体を、図６Ａ
に示されるようにＵＶクロスリンクによって分析した。約５２ｋＤａの主要なタ
ンパク質−ヌクレオチド複合体が、４つ全ての反応物中で検出された（レーン２
、４、６、および８）。
【００９５】 ステムループＧを標識プローブとして使用した場合、５４ｋＤａにさらなるバ
ンドが検出された（図６Ａ、レーン６）。３７〜４８ｋＤａの他のクロスリンク
タンパク質もまた、４つの全ての標識プローブで検出された。標識ステムループ
Ｇに結合するタンパク質を示すレーン（図６Ａ、レーン６）は比較的過剰に曝露
されたために、ＳＬ−ＧとＳＬ−Ｄの結合を比較する別の実験を行った（図６Ｂ
、レーン１および２）。これは、明らかに、ステムループＤおよびＧの両方がタ
ンパク質に結合し、これがＳＤＳゲル上で同様に移動する（５２ｋＤａバンド）
ことを示す。
【００９６】 類似のタンパク質が、Ｉ−ＲＮＡならびにステムループＤおよびＧと相互作用
し得るという結果を確認するために、以下の競合実験を行った。32Ｐ標識した、
５’ＵＴＲあるいはＳＬ−Ｄ（ＵＴＲ１７８〜２２４）またはＳＬ−Ｇ（ＵＴＲ
５５９〜６２４）のＲＮＡを、ＨｅＬａ Ｓ１０抽出物単独と共にか、または非
標識競合的ＲＮＡ（例えば、５’ＵＴＲ、ＳＬ−Ｄ、Ｉ−ＲＮＡ、ＳＬ−Ｂ、Ｓ
Ｌ−Ｃ、非特異的ＲＮＡ）の存在下でＨｅＬａ Ｓ１０抽出物と共にインキュベ
ートした。次いで、生じた複合体をＵＶクロスリンク研究によって分析した。ス
テムループＢおよびＣ（ＳＬ−ＢおよびＳＬ−Ｃ）を表すＲＮＡ配列を、ネガテ
ィブコントロールとして使用した。
【００９７】 ポリオウイルス５’ＵＴＲを標識プローブとして使用した場合、５２ｋＤａタ
ンパク質−ヌクレオチド複合体の形成のほぼ完全な阻害が、非標識のＵＴＲ、Ｉ
−ＲＮＡおよびステムループＧを用いて観察された（図７Ａ、レーン２−５）。
ステムループＤは、ｐ５２結合について標識５’ＵＴＲと部分的に競合した（図
７Ａ、レーン６）。非標識ＳＬ−Ｂ、ＳＬ−Ｃおよび非特異的ＲＮＡは、ｐ５２
結合について５’ＵＴＲとの競合に比較的効果的でなかった（図７Ａ、レーン７
〜９）。非標識ＵＴＲ ＲＮＡのみが、全ての標識バンドの形成に競合したが、
Ｉ−ＲＮＡならびにステムループＧおよびＤは、ｐ５２バンドの形成を特異的に
阻害した。
【００９８】 ステムループＧを標識プローブとして使用した場合、５２ｋＤａおよび５４ｋ
Ｄａでの２つの移動を、予期されたように検出した（図７Ｂ、レーン２）。非標
識ＳＬ−Ｇでの相同性競合は、これらの複合体の形成を完全に阻害した（図７Ｂ
、レーン３）。これらのＵＶクロスリンク複合体形成のほぼ８０％の阻害が、非
標識のＩ−ＲＮＡおよびＳＬ−Ｄ ＲＮＡの存在下で観察された（レーン４、５
）。しかし、無関係のＲＮＡおよびＳＬ−ＢまたはＳＬ−Ｃ ＲＮＡを競合剤と
して使用した場合、阻害は検出されなかった（レーン６〜８）。同様の結果が、
ＵＶクロスリンクアッセイにおいて放射標識したＳＬ−Ｄ ＲＮＡをプローブと
して使用した場合に得られた。タンパク質−ヌクレオチド複合体の形成のほぼ全
阻害が、非標識のＩ−ＲＮＡ、ＳＬ−Ｇ ＲＮＡおよび相同性ＳＬ−Ｄ ＲＮＡ
の存在下で観察された（図７Ｃ、レーン２〜４、および６）。予期されたように
、ＳＬ−ＢおよびＳＬ−Ｃ ＲＮＡは、標識ＳＬ−Ｄプローブで首尾よく供養号
し得なかった。
【００９９】 まとめると、これらの結果は、約５２ｋＤａの分子量を有する類似または同一
のタンパク質が３つ全てのＲＮＡ：ステムループＤおよびＧ、ならびにＩ−ＲＮ
Ａと相互作用することを示す。
【０１００】 （実施例７：酵母インヒビターＲＮＡが、インビトロでの翻訳の内部開始を優
先的に阻害することの実証） クローン化し、そして精製されたＩ−ＲＮＡが、５’ｃａｐからまた開始され
たＲＮＡからの翻訳の内部開始を優先的に阻害するか否かを決定するために、二
シストロン（ｂｉｃｙｓｔｒｏｎｉｃ）のメッセンジャーからの転写に対するそ
の効果を決定した。この目的のために、Ｔｈｉｅｌｅｒ‘ｓマウス脳脊髄炎ウイ
ルス（ＴＭＥＶ）５’ＵＴＲに連結された、ＣＡＴおよびルシフェラーゼ（ＬＵ
Ｃ）遺伝子を含む二シストロンの構築物を得た。ＴＭＥＶ ５’ＵＴＲは、ＩＲ
ＥＳ配列を含むことが公知であり、そして内部から翻訳を開始することが示され
ている（Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙら、１９９２）。ＴＭＥＶ ５’ＵＴＲから
の内部から生じる翻訳の開始は、ルシフェラーゼの合成を生じるが、一方、ｃａ
ｐ依存性の翻訳は、ＣＡＴタンパク質を正常に生成する。
【０１０１】 網状赤血球溶解物中で翻訳された場合、二シストロンのメッセージからの翻訳
は、ＣＡＴおよびルシフェラーゼタンパク質の両方を生成した（図８Ｂ、レーン
１）。精製された酵母インヒビターＲＮＡの存在下で、有意なＣＡＴ合成が観察
されたが、ルシフェラーゼの合成は、ほぼ完全に阻害された。標識ＣＡＴおよび
ルシフェラーゼバンドの定量化により、ルシフェラーゼ合成が、コントロールに
比べ９０％を超えて阻害されるが、ＣＡＴ合成の２０％のみの阻害が観察される
ことが示された。翻訳反応物中のバックグラウンドの取り込みもまた、インヒビ
ターを含む反応物において有意により低かったが、理由は完全に理解されなかっ
た。
【０１０２】 二シストロンのＲＮＡ構築物を使用して、Ｉ−ＲＮＡは、種々のピコルナウイ
ルスＲＮＡ（ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＴＭＥＶウ
イルスなどのウイルスＲＮＡ含む）による内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）
媒介性翻訳を優先的に阻害することが実証されている。例えば、図１１を参照の
こと。
【０１０３】 これらの結果は、酵母インヒビターＲＮＡが、第二のウイルス制御領域、ＴＭ
ＥＶ ５’ＵＴＲにおける翻訳の内部開始を優先的に阻害することを示す。
【０１０４】 （実施例８：酵母インヒビターＲＮＡが、細胞性ｍＲＮＡの内部開始を阻害す
ることの実証） 最近の結果は、いくつかの細胞性ｍＲＮＡが、翻訳を内部で開始することを示
している（Ｍｅｃｅｊａｋら、１９９１；Ｏｈら、１９９２）。例えば、免疫グ
ロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）は、内部開始によって合成され得る・Ｂ
ｉｐ合成がインヒビターＲＮＡによって特異的に阻害され得るか否かを決定する
ために、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）に連結されたＢｉｐ ｍＲＮＡの
５’ＵＴＲを含む構築物を、Ｐ．Ｓａｒｎｏｗ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｃｏｌｏｒａ
ｄｏ）から得た。ＨｅＬａ抽出物におけるこのｍＲＮＡの翻訳は、ルシフェラー
ゼタンパク質を生成した（図８Ａ、レーン１）。酵母インヒビターＲＮＡの添加
は、このＲＮＡ構築物からのルシフェラーゼ合成を完全に阻害した（レーン２）
予期されたように、ＣＡＴ構築物からのｃａｐ依存性翻訳は、同じ条件下で完全
には阻害されなかった（レーン３および４）。実際ＣＡＴ翻訳は、以前に観察さ
れたように（Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、前出）コントロールより有意に刺激さ
れた。これらの結果は、この酵母インヒビターＲＮＡが、ウイルスｍＲＮＡと同
様に細胞性ｍＲＮＡからの内部開始を阻害し得ることを示す。
【０１０５】 （実施例９：インビボにおけるポリオウイルスＲＮＡの翻訳阻害の実証） クローニングされたインヒビターＲＮＡが、インビボにおいてポリオウイルス
ＲＮＡの翻訳を阻害するか否かを決定するために、ポリオウイルスＲＮＡをＨｅ
Ｌａ細胞中に単独でかまたは精製された酵母ＲＮＡとともにトランスフェクトし
た。単層ＨｅＬａ細胞を、５％ウシ胎仔血清を補充した最小必須培地（ＧＩＢＣ
Ｏ）中で組織培養フラスコにおいて増殖した。ポリオウイルスＲＮＡ（１型Ｍａ
ｈｏｎｅｙ）を、初期に記載されたように（Ｄａｓｇｕｐｔａ、１９８３）感染
させたＨｅＬａ細胞から単離した。合成Ｉ−ＲＮＡまたはポリオＲＮＡを、トラ
ンスフェクション反応あたり総量２０μｇのＲＮＡを産出するようにキャリア酵
母ｔＲＮＡと混合した。次いで、ＲＮＡサンプルを、３０μｇのリポフェクチン
（ＧＩＢＣＯ−ＲＥＬ）および２０単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混
合し、そして室温で３０分間インキュベートした。最後に、サンプルを、２．５
％ウシ胎児血清を含有する４ｍｌの最小必須培地（ＧＩＢＣＯ）と混合し、そし
て７０〜８０％のコンフルエントな単層ＨｅＬａ細胞を含有するぺトリ皿に添加
した。次いで、この細胞を、２４時間ＣＯ2インキュベーター中で３７℃にてイ
ンキュベートした。
【０１０６】 タンパク質を35Ｓ−メチオニンの添加により標識し、そしてウイルスタンパク
質の合成を、細胞を含まない抽出物の直接分析によってか（図９、パネルＡ）ま
たは抗キャプシド抗血清によるウイルスキャプシドタンパク質の免疫沈降により
（図９、パネルＢ）モニターした。より詳細には、トランスフェクション後のタ
ンパク質のインビボ標識のために、細胞をメチオニンを含まない培地（ＭＥＭ、
ＧＩＢＣＯ）中で３７℃にて４０分間プレインキュベートした。次いで、１００
μＣｉのトランス標識したメチオニン（ｓｐ．ａｃｔ．＞１０００ Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌｅ）を細胞に添加し、そしてインキュベーションをさらに１時間継続した。 35 Ｓ−メチオニン標識化ＨｅＬａ細胞抽出物を、以前に記載されたように調製し
た（Ｒａｎｓｏｎｅら、１９８７）。
【０１０７】 トランスフェクトした細胞中のインビボ標識化ウイルスタンパク質を、ポリオ
ウイルス抗キャプシド抗体（アメリカンタイプカルチャーコレクションより購入
）で免疫沈降することにより検出した。免疫沈降を、１×ＲＩＰＡ緩衝液（５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．９、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１
００、０．１％ ＳＤＳ、１％ デオキシコール酸ナトリウム）を含有する５０
０μｌの反応容量中の５μｌの抗キャプシド抗体とともに４℃で一晩行った。こ
の免疫複合体を、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＲＩＰＡ緩衝液および０
．２％ ＢＳＡの７５μｌの２０％溶液）で沈降させ、次いで初期に記載された
（Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、前出）ようにＳＤＳ１４％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分析した。
【０１０８】 ウイルスＲＮＡおよびインヒビターＲＮＡを添加しなかった場合、細胞タンパ
ク質の合成が明らかであった（パネルＡ、レーン１）。ウイルスＲＮＡ（１μｇ
）を細胞中にトランスフェクトした場合、はっきりとしたウイルスタンパク質の
合成が認められた（レーン２）。さらに、宿主細胞タンパク質のバックグラウン
ドが、ポリオウイルスによる宿主細胞タンパク質合成の遮断に起因して相当減少
した（レーン２）。
【０１０９】 インヒビターＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞中にウイルスＲＮＡ（１μｇ）とともに
同時トランスフェクトした場合、検出可能なウイルスタンパク質の合成は観察さ
れず、そして宿主細胞タンパク質の合成が回復した（レーン３）。インヒビター
ＲＮＡ単独の発現は、細胞タンパク質の合成と干渉しなかった（レーン４）。レ
ーン５（パネルＡ）は、トランスフェクション実験に使用したキャリアｔＲＮＡ
が、細胞タンパク質の合成に効果を有さなかったことを示す。
【０１１０】 増加した量のポリオウイルスＲＮＡ（２μｇ）での細胞のトランスフェクショ
ンは、ウイルスタンパク質の合成およびより明らかな細胞タンパク質合成の遮断
を生じた（レーン６）。しかし、インヒビターＲＮＡの存在下で、ウイルスタン
パク質の合成は阻害され、そして宿主細胞タンパク質の合成は、コントロール反
応において見られたレベルに対して回復した（レーン７）。パネルＢにおいて示
される結果は、ウイルスタンパク質の合成が、インヒビターＲＮＡを含有する細
胞において阻害されたという事実を確認した。ウイルスキャプシドタンパク質の
合成は、ウイルスＲＮＡおよびインヒビターＲＮＡで同時トランスフェクトした
細胞において阻害された（レーン３、パネルＢ）。
【０１１１】 従って、酵母インヒビターＲＮＡは、インビボにおいてポリオウイルスＲＮＡ
の翻訳を効果的に阻害した。さらに、酵母インヒビターＲＮＡの存在下でのポリ
オウイルス感染の細胞溶解性効果からの単層細胞の保護は、レーン３および７に
おいて見られる宿主細胞タンパク質合成の回復と対応した（図９Ａ）。
【０１１２】 （実施例１０：酵母Ｉ−ＲＮＡの欠失変異体の分析） ポリオウイルスＩＲＥＳ媒介性翻訳の阻害に必要とされるＩ−ＲＮＡの配列を
決定するために、酵母Ｉ−ＲＮＡ配列の１５ｎｔ長欠失のネステッド（ｎｅｓｔ
ｅｄ）セットを生成した（Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３およびＩ−４と命名される；
図１６）。Ｉ−ＲＮＡ欠失変異体をオリゴヌクレオチドテンプレートからＴ７
ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写により生成した。異なる長さのオリゴヌ
クレオチドを、それぞれＴ７プロモーターアダプター配列に続いてＩ−ＲＮＡ配
列の異なる領域由来の種々の長さで開始するように合成した（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ Ｉｎｃ．）。オリゴデオキシリボヌクレオチドテンプレートを、０．
１Ｍ ＮａＣｌ中の等モル量の１７マーＴ７プライマーオリゴヌクレオチドと混
合し、そして１００℃で５分間加熱することによりアニールし、続いて室温まで
ゆっくりと冷却した。異なるＩ−ＲＮＡ欠失変異体のヌクレオチド位置を図１６
に示す。
【０１１３】 ポリオウイルス５ ＵＴＲを含有するＰ２ ＣＡＴ ＲＮＡによりプログラム
されたインビトロ翻訳に対する短縮型Ｉ−ＲＮＡ変異体の効果を決定した。Ｉ−
１ＲＮＡおよびＩ−２ＲＮＡの両方は、翻訳阻害下においてもなお活性であった
が、無処理のＩ−ＲＮＡほど活性ではなかった。しかし、Ｉ−ＲＮＡからのヌク
レオチド３１〜４５、または４６〜６０（Ｉ−３またはＩ−４）の欠失は、ポリ
オウイルスＲＮＡの５’−ＵＴＲによりプログラムされたＨｅＬａ溶解物におけ
るインビトロ翻訳の阻害により示されるような、ＩＲＥＳ媒介性翻訳を阻害する
能力をほぼ全体的に破壊した。より詳細には、ＨｅＬａ溶解物中のｐＧ３ＣＡＴ ＲＮＡおよびＰ２ＣＡＴ ＲＮＡのインビトロ翻訳に対する異なるＩ−ＲＮＡ
欠失変異体の効果を決定した。インビトロ翻訳を、２ｐｇの欠失Ｉ−ＲＮＡの非
存在または存在下で、およそ２ｐｇの非キャップ化ｐ２ＣＡＴ ＲＮＡまたはキ
ャップ化ｐＧ３ＣＡＴ ＲＮＡのいずれかで行なった。
【０１１４】 これらの試験の結果は、Ｉ−ＲＮＡの３’−末端の半分が、ウイルスＩＲＥＳ
媒介性翻訳の阻害に必要な主要な配列を含むことを示した。しかし、最初の１５
ヌクレオチド（すなわち、Ｉ−１において欠失された）または次の１５ヌクレオ
チド（Ｉ−２）内に存在する配列はまた、阻害において役割を果たす。なぜなら
、これらの配列を欠く変異体は、無処理のＩ−ＲＮＡほど活性ではないからであ
る。さらなる欠失分析は、Ｉ−ＲＮＡの２５ｎｔ長のフラグメント（Ｉ−７ Ｒ
ＮＡ、ｎｔ ２６〜５０）が、ウイルス翻訳阻害においてＩ−ＲＮＡと同じよう
に活性であることを示した。その３’−末端でさらなる１０ヌクレオチドを含む
同様の欠失変異体（Ｉ−６ ＲＮＡ、ｎｔ ２６〜６０）もまた活性であったが
、Ｉ−７ＲＮＡのように活性ではなかった。しかし、ｎｔ １〜２５を含有する
Ｉ−ＲＮＡのフラグメント（Ｉ−８ ＲＮＡ）は、翻訳阻害において全体的に不
活性であった。Ｉ−７ ＲＮＡのさらなる欠失は、より小さなフラグメント（Ｉ
−９ ｎｔ ３０〜４５）を生じ、これは、ＩＲＥＳ媒介性翻訳を阻害し得た。
このフラグメント（Ｉ−９）が翻訳を阻害する能力は、Ｉ−３ ＲＮＡがｎｔ
３１〜４５を欠くので、Ｉ−３ ＲＮＡが翻訳を阻止する能力を欠いていると以
前に記載したことと十分一致している（図３）。
【０１１５】 試験した変異体Ｉ−ＲＮＡは、いずれもｐＣＡＴ ＲＮＡのｃａｐ依存性翻訳
を阻害し得なかった。
【０１１６】 短縮型Ｉ−ＲＮＡが、翻訳の内部開始を阻害し得るか否かを決定するために、
二シストロン構築物からの翻訳に対するそれらの効果を決定した。ポリオウイル
ス５’ＵＴＲに隣接するＣＡＴ遺伝子およびルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子を
含有する二シストロン構築物をこの実験に使用した。ポリオウイルス５’ＵＴＲ
から内部的に生じるｃａｐ非依存性翻訳の開始は、ルシフェラーゼの合成を生じ
るが、一方ｃａｐ依存性翻訳は、通常ＣＡＴタンパク質を産生する。非感染Ｈｅ
Ｌａ細胞抽出物において、キャップ化二シストロンメッセージからの翻訳は、異
なる細胞抽出物を用いる別々の実験においてＣＡＴタンパク質およびルシフェラ
ーゼタンパク質の両方を産生した。全長Ｉ−ＲＮＡの添加は、ルシフェラーゼの
合成を優先的に阻害したが、ＣＡＴの合成は阻害しなかった。２５ｎｔ長のＩ−
７ＲＮＡは、ほぼ全体的にルシフェラーゼの産生を阻害した。しかし、ＣＡＴ合
成は、Ｉ−７ ＲＮＡを含有する反応において有意に刺激されなかった。
【０１１７】 ルシフェラーゼ合成を阻害しないことは、Ｉ−４ ＲＮＡ変異体で明らかであ
った。ＣＡＴタンパク質の合成もまた、Ｉ−４ ＲＮＡにより刺激された。同様
の結果が、Ｉ−９ ＲＮＡおよびＩ−８ ＲＮＡで得られた。１６ｎｔ長のＩ−
９ ＲＮＡは、コントロールと比較して、ルシフェラーゼ合成を有意に阻害した
。ＣＡＴ生成の２０％の阻害が、Ｉ−９ ＲＮＡの存在下で観察されたが、ルシ
フェラーゼ合成は、コントロールよりほぼ８５％多く阻害した。対照的に、Ｉ−
８ ＲＮＡは、ルシフェラーゼまたはＣＡＴのいずれかの合成を有意に阻害しな
かった。これらの結果は、Ｉ−７ ＲＮＡおよびＩ−９ ＲＮＡは、ポリオウイ
ルス５ ＵＴＲによりプログラムされた翻訳の内部開始を優先的に阻害するが、
Ｉ−４ ＲＮＡおよびＩ−８ ＲＮＡはそうでないことを示唆する。
【０１１８】 変異体Ｉ−ＲＮＡが、インビボにおいてポリオウイルスＲＮＡの翻訳を阻害す
るか否かを決定するために、ポリオウイルスＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞に単独でか
、または精製したＩ−７、Ｉ−９、Ｉ−４、Ｉ−８およびＩ−ＲＮＡとともに（
リポソームを用いて）トランスフェクトした。タンパク質を35Ｓ−メチオニンに
より標識し、そしてウイルスタンパク質の合成を抗キャプシド抗血清による細胞
抽出物からのウイルスキャプシドタンパク質の免疫沈降によりモニターした。偽
トランスフェクトした細胞からは、キャプシドタンパク質は沈降し得なかった。
ポリオウイルスＲＮＡ単独での細胞のトランスフェクションの際、キャプシドタ
ンパク質の合成を明瞭に検出した。Ｉ−７ ＲＮＡまたはＩ−ＲＮＡとポリオウ
イルスＲＮＡとの同時トランスフェクションは、９０％を超えるキャプシドタン
パク質合成の阻害を生じた。Ｉ−９ ＲＮＡの活性は、Ｉ−７またはＩ−ＲＮＡ
で観察された活性の約５０％であった。しかし、より高い濃度のＩ−９ ＲＮＡ
は、Ｉ−７ ＲＮＡで見られた程度までウイルスタンパク質の合成を阻害した。
予想されるように、Ｉ−８ ＲＮＡおよびＩ−４ ＲＮＡは、ウイルスタンパク
質の翻訳を阻害することができなかった。同様な量の細胞内ポリオウイルスＲＮ
Ａが、ポリオウイルスＲＮＡ単独でトランスフェクトした細胞ならびにＰＶ Ｒ
ＮＡおよびＩ−７ ＲＮＡまたはＩ−９ ＲＮＡの混合物でトランスフェクトし
た細胞の両方において検出されたことは注目すべきことであり、このことは、Ｐ
Ｖ ＲＮＡの安定性が、Ｉ−ＲＮＡまたはその誘導体を含む細胞において有意に
変化しないことを示唆する。
【０１１９】 （実施例１１：全長Ｉ−ＲＮＡおよび欠失Ｉ−ＲＮＡと相互作用する細胞タン
パク質の同定） ヒトＬａ自己抗原および種々の他の細胞タンパク質因子と同一であることが示
されている上記の５２ｋＤａのＩ−ＲＮＡ結合タンパク質が、全長Ｉ−ＲＮＡま
たは欠失Ｉ−ＲＮＡに結合することが示された。
【０１２０】 移動度シフト実験について、５０μｇのＨｅＬａ Ｓ１０抽出物または１０ｐ
ｇのＨｅＬａリボソーム塩洗浄（ＲＳＷ）を、１５μｌの反応混合物（５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、２５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ
ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰおよび３
．８％のグリセロールを含む）中の４ｐｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）とともに１０分間３０℃でプレインキュベートした。競合実験について
、１００倍モラー（ｍｏｌａｒ）過剰の標識していない競合的ＲＮＡを反応物に
添加し、そして１０分間３０℃にてインキュベートした。最後に、５〜１０ｆｍ
ｏｌの標識したＲＮＡプローブをそれぞれの反応混合物に添加し、そしてさらに
２０分間３０℃にてインキュベーションを継続した。３μｌのゲルローディング
色素を、終濃度の５％グリセロールならびに各々０．０２％のブロモフェノール
ブルーおよびキシレンシアノールまで反応混合物に添加した。スーパーシフト（
ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ）アッセイについて、Ｓ１０抽出物を、２．５μｌの非免
疫ヒト血清またはＬａタンパク質に対する２．５μｌの免疫ヒト血清のいずれか
とともに氷上で１０分間プレインキュベートし、次いで、それぞれ32Ｐ−標識し
たＲＮＡプローブを反応混合物に添加し、そしてさらに２０分間氷上でインキュ
ベーションを継続した。次いで、ＲＮＡタンパク質複合体を、０．５×ＴＢＥ中
で５％グリセロールを含有する４％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：
ビスの比は３９：１）上で分析した。
【０１２１】 ＵＶで誘導した架橋分析および免疫沈降分析のために、上記のように生成した
３２Ｐ標識化ＲＮＡ−タンパク質複合体を、ＵＶランプ（多重バンドＵＶ）２５
４／３６６ｎｍ（モデルＵＧＬ；２５ＵＶＰ Ｉｎｃ．）を用いて、マイクロタ
イタープレート中で１５分間、２〜３ｃｍの距離で照射した。次いで、結合して
いないＲＮＡを、２０μｇのＲＮアーゼＡと２０単位のＲＮアーゼＴ１との混合
物を用いて、３７℃で１５分間消化した。標識化複合体の免疫沈降のために、２
〜５μｌの非免疫ヒト血清または狼瘡疾患を有する患者由来の免疫ヒト血清（標
準的な参照Ｌａ抗体）のいずれかを添加し、そして２００μｌの１×ＲＩＰＡ緩
衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉ
ｔｏｎ−Ｘ１００、０．１％ ＳＤＳおよび１％ デオキシコール酸ナトリウム
）の存在下で、氷上で２時間放置した。次いで、５ｍｇのプロテインＡセファロ
ースを、それぞれの反応チューブに添加し、低温室で１時間振動させ、次いで、
１２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。ビーズを１×ＲＩＰＡで３
回洗浄して、非特異的結合を減少させた。最後に、１×ＳＤＳゲルローディング
色素（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ ＤＴＴ ２％ ＳＤＳ
、０．１％ ＢＰＢ、１０％ グリセロール）中で再懸濁したビーズを、５分間
１００℃に加熱し、そしてＳＤＳ１４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【０１２２】 図１２において示されるように、標識Ｉ−ＲＮＡおよびＨｅＬａ細胞タンパク
質を含む、ゲル遅延複合体（Ｃで示される）は、ヒトＬａタンパク質に対する抗
体によってスーパーシフト（ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ）した（ＳＣで示される）（
図１２、左のゲル、レーン３および４）。標識Ｉ−ＲＮＡおよび精製した組換え
Ｌａタンパク質（レーン５、複合体Ｃ）を用いて形成した同様の複合体もまた、
ＨｅＬａ細胞抽出物を用いて見出されるのと同一の相対的位置まで抗Ｌａ抗体と
ともにスーパーシフトし得る。第２のより遅く移動する複合体もまた、精製した
Ｌａタンパク質を用いて観察され（レーン５）、そのほとんどは、抗Ｌａ抗体（
レーン６）とともにスーパーシフトし得ない。これらの結果は、標識Ｉ−ＲＮＡ
およびＨｅＬａ細胞抽出物をインキュベートすることによって形成される複合体
Ｃが、Ｌａ自己抗原を含むことを示唆する。複合体Ｃが確かにＬａタンパク質を
含むことを確認するために、ＵＶ−架橋研究を、ＨｅＬａ細胞抽出物または精製
したＬａタンパク質を使用して、32Ｐ標識Ｉ−ＲＮＡまたは５’−ＵＴＲ（５５
９〜６２４ｎｔ）プローブを用いて実施した。次いで、ＵＶ架橋した複合体を、
抗Ｌａまたは非免疫血清を用いて免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した。複合体を、標識Ｉ−ＲＮＡまたはＵＴＲプローブにのいずれかを使用
してＨｅＬａ細胞抽出物を用いて形成した場合、５２ｋＤａのＵＶ架橋したタン
パク質は、抗Ｌａ抗体によって特異的に免疫沈降された（図１２、右のゲル、レ
ーン２および５）。この５２ｋＤａのバンドは、精製したＬａタンパク質を、32 Ｐ Ｉ−ＲＮＡ（レーン３）または32Ｐ ５’−ＵＴＲ（レーン６）とともにイ
ンキュベートすることによって形成される、ＵＶ架橋した抗Ｌａ免疫沈降複合体
とともに同時に移動した。レーン２および５において顕著に見られた約１２０ｋ
Ｄａの複合体は、非免疫血清を含むレーンにおいてもまた検出され得たので、Ｌ
ａ抗体に特異的ではなかった。これらの結果は、Ｉ−ＲＮＡがヒトＬａ自己抗原
と相互作用することを実証する。
【０１２３】 Ｉ−ＲＮＡによって結合されるｐ５２タンパク質の同一性を、Ｉ−ＲＮＡによ
るＩＲＥＳ媒介性翻訳の阻害がＬａ抗原の添加によって取り消されることを実証
することによって、さらに確認した。ポリオウイルスは、ｃａｐ結合タンパク質
複合体のｐ２２０成分をタンパク質分解的に切断することによって、宿主細胞ｍ
ＲＮＡのｃａｐ依存性翻訳を阻害することが、公知である。従って、ウイルスに
感染した細胞由来の抽出物は、ｃａｐ非依存性のＩＲＥＳ媒介性翻訳においての
み活性であるが、ｃａｐ依存性翻訳においては活性ではない。
【０１２４】 ＩＲＥＳ媒介性翻訳のＩ−ＲＮＡ誘導性阻害が、外因性の精製されたＬａタン
パク質の添加によって特異的に奪回され得るか否かを決定するために、ｐ２ＣＡ
Ｔ ＲＮＡ（５−ＵＴＲ−ＣＡＴ）の翻訳を、ウイルス感染した細胞抽出物にお
いて実施した。ＰＶ感染したＨｅＬａ細胞抽出物におけるｐ２ ＣＡＴ ＲＮＡ
の翻訳を、Ｉ−ＲＮＡによって有意に阻害した。ウイルス性の５’−ＵＴＲ媒介
性翻訳の有意な刺激を、精製したＬａタンパク質を感染した細胞抽出物に添加し
た場合に観察した。これは、おそらく、ウイルス感染した細胞におけるＬａタン
パク質の制限的な量に起因する。Ｉ−ＲＮＡによって媒介される翻訳の阻害を、
精製したＬａタンパク質の添加によって、ほぼＬａタンパク質単独を含む抽出物
において見られる範囲にまで取り消し得る。対照的に、等価な量のＢＳＡの添加
は、ＩＲＥＳ媒介性翻訳を回復することができない。偽感染した抽出物をウイル
ス感染した細胞抽出物の代わりに使用した場合に、同様の結果を観察した。
【０１２５】 Ｉ−ＲＮＡ変異体に対する種々のタンパク質因子の結合もまた、試験した。上
記に提示した結果は、ＩＲＥＳ媒介性翻訳を阻害する際の種々のＩ−ＲＮＡ変異
体の差次的な活性を実証した。Ｉ−７ＲＮＡおよびＩ−９ＲＮＡは、ポリオウイ
ルスＩＲＥＳ媒介性翻訳を阻害し得たが、Ｉ−４ＲＮＡおよびＩ−８ＲＮＡは、
翻訳のインヒビターとしてほとんど全く不活性であった。類似のタンパク質また
は異なるタンパク質がこれらのＲＮＡによって結合されるか否かを決定するため
に、種々の標識化ＲＮＡプローブを、ＨｅＬａタンパク質と共にインキュベート
し、そしてタンパク質−ＲＮＡ複合体を、ＵＶ架橋し、続いてリボヌクレアーゼ
消化することによって試験した。
【０１２６】 ＨｅＬａタンパク質の２つの供給源（Ｓ１０およびリボソーム塩洗浄液（ｒｉ
ｂｏｓｏｍａｌ ｓａｌｔ ｗａｓｈ）（ＲＳＷ））を、これらの実験のために
使用した。ＨｅＬａ細胞は、抽出物を含まず（Ｓ１０）およびＲＳＷ調製物を含
まない。ＨｅＬａ Ｓ１０細胞抽出物を、本明細書上記のように調製した。Ｈｅ
Ｌａ細胞由来のリボソーム塩洗浄液を、いくつかの改変を伴ってＢｒｏｗｎおよ
びＥｈｒｅｎｆｅｌｄ（３３）に記載されるように調製した。ＨｅＬａ細胞（４
×１０5細胞／ｍｌ）の培養物を、遠心分離によって収集し、冷等張緩衝液（３
５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１４６ｍＭ ＮａＣｌ、１１ｍＭ グルコー
ス）で３回洗浄し、そして２倍の充填した細胞容量の溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１．５ｍＭ 酢酸Ｍｇ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、および１ｍ
Ｍ ＤＴＴ）中に再懸濁し、続いて膨張のために、１０分間氷上でインキュベー
ションした。細胞を、０℃にて、Ｂ型ダンス型ホモジェナイザーで、５０行程で
崩壊させた。崩壊後、抽出物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローターで、４℃に
て１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、核およびミトコンドリア画分を
除去した。上清（Ｓ１０抽出物）を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ６０ローターで、４
℃にて２時間、５０，０００ｒｐｍで遠心分離した。リボソームペレットを、氷
浴上で穏やかに振盪しながら、溶解緩衝液中に約２５０Ａ２６０／ｍｌの濃度で
再懸濁した。次いで、ＫＣｌ濃度を５００ｍＭに調整し、そしてこの溶液を氷浴
上で３０分間攪拌した。得られた溶液を、４℃にて、５０，０００ｒｐｍで２時
間遠心分離した。次いで、上清（塩洗浄液）を、０〜７０％の硫酸アンモニウム
沈殿に供した。開始因子を含むペレットを、低容量の透析緩衝液（グリセロール
を含まない）に溶解し、続いて５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ
ＫＣｌ、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび５％ グリセロールを
含む透析緩衝液）に対して、４℃にて一晩透析した。次いで、この透析物を、１
０，０００ｒｐｍで１０分間、４℃にて遠心分離し、そしてこの上清を、いくつ
かの予め冷却したチューブに少容量でアリコートし、そして−７０℃で保存した
。
【０１２７】 全長の標識Ｉ−ＲＮＡをＨｅＬａ Ｓ１０抽出物と共にインキュベートした場
合、１００ｋＤａ、７０ｋＤａ、４８ｋＤａおよび４６ｋＤａの少量のバンドに
加えて、約５２ｋＤａおよび１１０ｋＤａの分子量を有する２つの主なバンドを
検出した。リボソーム塩洗浄タンパク質を使用した場合、タンパク質−ヌクレオ
チド複合体のプロフィールは、Ｓ１０のプロフィールとは有意に異なった。第１
に、１１０ｋＤａのバンドは、ＲＳＷを含む反応において、非常に少量で存在し
た。第２に、５２ｋＤａタンパク質は、５４〜５２ｋＤａの二重線として存在し
、そしてＳ１０における量と比較して、比較的少量であった。第３に、約８０ｋ
Ｄａおよび３７ｋＤａにおける新たなバンドは、ＲＳＷを含む反応において現れ
た。全長Ｉ−ＲＮＡと比較して、標識化短縮型Ｉ−ＲＮＡをＵＶ架橋する実験に
おいて使用した場合、各ＲＮＡについてのタンパク質−ヌクレオチドプロフィー
ルは、Ｓ１０とＲＳＷとの間で顕著に類似していた。Ｉ−４ＲＮＡおよびＩ−８
ＲＮＡは、主に７０ｋＤａ、５２ｋＤａ、４８ｋＤａ、４６ｋＤａおよび３７ｋ
Ｄａのポリペプチドを結合したが、一方、Ｉ−７ＲＮＡおよびＩ−９ＲＮＡは、
８０ｋＤａの新たなバントと相互作用した。この８０ｋＤａのバンドは、Ｉ−７
ＲＮＡを用いると、より明確であった。さらに、Ｉ−４ＲＮＡおよびＩ−８ＲＮ
Ａによって結合される７０ｋＤａのポリペプチドは、Ｉ−７ＲＮＡおよびＩ−９
ＲＮＡでは検出されなかった。別の非常に高分子量のポリペプチド（２２０ｋＤ
ａのマーカーよりも速く移動する）は、Ｉ−４ＲＮＡおよびＩ−８ＲＮＡを含む
反応においてのみ存在した。同様に、ＲＳＷを利用する実験において、１００ｋ
Ｄａのポリペプチドは、Ｉ−７ＲＮＡおよびＩ−９ＲＮＡによって優先的に結合
された。競合実験において、標識されていないＩ−７ＲＮＡおよびＩ−４ＲＮＡ
の両方は、標識化Ｉ−７ＲＮＡプローブおよびＩ−４ＲＮＡプローブによって結
合される全ての主なタンパク質バンドと首尾良く競合することが観察された。例
えば、Ｉ−７ＲＮＡに対して複合体化した全部で３つポリペプチド（８０ｋＤａ
、５２ｋＤａおよび３７ｋＤａ）は、標識されていないＩ−７ＲＮＡおよびＩ−
４ＲＮＡと競合したが、非特異的ＲＮＡとは競合しなかった。標識化Ｉ−４ＲＮ
Ａでも同様に、７０ｋＤａ、５２ｋＤａおよび３７ｋＤａのバンドは、標識され
ていないＩ−７ＲＮＡおよびＩ−４ＲＮＡと競合したが、非特異的競合物とは競
合しなかった。より高分子量のポリペプチドは、非特異的競合物と全体的に競合
し得るので、Ｉ−４ＲＮＡに非特異的に結合した。これらの結果は、活性なＩ−
７ＲＮＡおよび不活性なＩ−４ＲＮＡが同じ２つのポリペプチド（５２ｋＤａお
よび３７ｋＤａ）を結合する一方、これらの２つの短縮型Ｉ−ＲＮＡは少なくと
も１つのポリペプチドを結合することにおいて互いに異なる（Ｉ−７ＲＮＡは８
０ｋＤａのポリペプチドを結合するがＩ−４ＲＮＡは７０ｋＤａのポリペプチド
を結合する）ことを実証する。
【０１２８】 （実施例１２：Ｌａペプチド（ＬＡＰ）結合ドメイン） 特定のヒトＲＮＡウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイル
ス、ポリオウイルス、ライノウイルスならびにコクサッキーウイルス）の翻訳は
、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）媒介性翻訳として公知のウイルス性ｍＲ
ＮＡ内の内部配列へのリボソームの結合を含む。これは、ｍＲＮＡの５’ｃａｐ
（７メチルグアノシン）構造へのリボソームの結合に依存する、細胞性ｍＲＮＡ
翻訳と対照的である。ＩＲＥＳ媒介性翻訳は、最初にＩＲＥＳ配列への細胞性ポ
リペプチドの結合、続いてリボソーム結合を必要とする。ＩＲＥＳと相互作用す
るこのような１つのタンパク質は、Ｌａ自己抗原（約５２ｋＤａの細胞タンパク
質）である。ウイルスＩＲＥＳエレメントに対するＬａ結合は、リボソーム結合
に予め必要であると考えられている。本発明者らは、野生型Ｌａ自己抗原のアミ
ノ酸１１〜２８に対応し、かつＬａのＲＮＡ結合ドメインを構築する１８−アミ
ノ酸ペプチドを合成した。そして本発明者らは、ＬＡＰ結合ドメイン配列が、ウ
イルスＩＲＥＳエレメントに結合するように全長Ｌａと競合することをさらに示
した。これは、インビトロでマイクロモル濃度のペプチドによってウイルス性ｍ
ＲＮＡ翻訳の選択的阻害を誘導する。さらに、このペプチド（ＬＡＰ、Ｌａペプ
チドと呼ばれる）は、ヒト細胞内へ自由に分散し、そしてマイクロモル濃度のＬ
ＡＰでの組織培養細胞上のウイルス性プラークにおける１０００倍の減少によっ
て証明されるように、ウイルス複製をブロックするようである。ＬＡＰのみがウ
イルス性タンパク質産生を阻害し、そして細胞性翻訳を妨害しないので、ＬＡＰ
を抗ウイルス剤として使用し得る。このペプチドによるウイルス複製の阻害の効
率を、小動物モデルにおいて試験し得る。
【０１２９】 例えば、本発明の１つの配列は、以下を含む：
【０１３０】
【化１】 さらに、この配列のビオチン化誘導体もまた使用し得る：
【０１３１】
【化２】 先の実施例１〜１１の結果は、ポリオウイルス（ＰＶ）ＩＲＥＳ媒介性翻訳が
、ＰＶ ＩＲＥＳ媒介性翻訳を阻害し得る小さなＲＮＡに起因して、酵母Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて制限されることを示した
。このインヒビターＲＮＡ（ＩＲＮＡと呼ばれる）は、ｃａｐ非依存性；ＩＲＥ
Ｓ媒介性翻訳を特異的に阻害したが、細胞性ｍＲＮＡのｃａｐ依存性翻訳に対し
てはほとんど効果を有さなかった。ＩＲＮＡは、いくつかの細胞性ポリペプチド
（ピコルナウイルスＩＲＥＳ媒介性翻訳に必要であるＬａ自己抗原を含む）に強
力に結合することが見出された。他の細胞性ペプチドは、本明細書中に記載され
るような手順を使用して同定され得る。
【０１３２】 Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）およびＰＶ ＩＲＥＳエレメントは類似のポリペプチドを
結合するので、本発明者らは、ＩＲＮＡもまたＨＣＶ ＩＲＥＳ媒介性翻訳を妨
害し得ると判断した。インビトロにおける翻訳、一過性のトランスフェクション
およびＩＲＮＡを構成的に発現するヘパトーム細胞株を使用して、本発明者らは
、ＩＲＮＡによるＨＣＶ ＩＲＥＳ媒介性翻訳の特異的阻害を実証した。さらに
、ＩＲＮＡを構成的に発現するヘパトーム細胞株は、ＰＶ ＩＲＥＳがＨＣＶ
ＩＲＥＳによって置換される、ＰＶおよびＰＶ／ＨＣＶキメラウイルスの両方に
よる感染に対して抵抗性になった（図１８を参照のこと）。ＨＣＶ−ＩＲＥＳエ
レメントへのＬａ自己抗原の結合は、特異的であり、かつＩＲＮＡによって効率
的に競合した。また、本発明者らは、ＬａのＲＮＡ結合ドメインを含む小さなペ
プチドが、ウイルス性ＲＮＡへの結合について全長Ｌａと競合し得ることを実証
した（図１７を参照のこと）。組み合わせて使用される場合、ペプチドおよびＩ
ＲＮＡは共に、個々の成分よりもより強力にウイルス性ＲＮＡのＩＲＥＳ媒介性
翻訳を阻害する（図１９を参照のこと）。
【０１３３】 抗ウイルス剤は、薬学的に受容可能なキャリア中で治療的有効量のＬＡＰと共
に処方され得る。多くの薬学的処方物および投与の経路を使用して処置する方法
は、標準的な臨床の実施および手順に基づいて確認され得る。
【０１３４】 インヒビターとしてＩＲＮＡを評価することに加えて、これは、ピコルナウイ
ルスおよびＣ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ媒介性翻訳において、機能的に重要な細
胞タンパク質因子を検出するための手段として使用された。本発明は、本明細書
中に記載される方法を使用して同定される、このような他のインヒビターを企図
する。
【０１３５】
【表１】 上記に記載されそして例示された原理の適用によって、当業者が、１つ以上の
タンパク質因子の結合によって翻訳が内部リボソーム結合部位で開始される任意
の所望の標的ＲＮＡについて、有効なインヒビターＲＮＡまたはそれらの構造的
模倣物を設計し得、そして本発明に従う翻訳阻害の至適条件を決定し得ることは
、明白である。
【０１３６】 本明細書中で引用される各刊行物の全体の開示は、本明細書中で参考として援
用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、例示的な酵母翻訳インヒビターＲＮＡ（Ｉ−ＲＮＡ）のヌクレオチド
配列、クローニング、発現および活性を示す。パネルＡ：６０ヌクレオチドの精
製した酵母インヒビターＲＮＡの配列（配列番号１）を、材料および方法におい
て記載されるように決定した。そのＲＮＡの５’末端および３’末端が示される
。パネルＢ：Ｉ−ＲＮＡを発現するｐＳＤＩＲプラスミドの略図。ＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＥｃｏＲＩの制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を示す。Ｔ７およびＳ
Ｐ６は、それぞれのプロモーターの位置を示し、そして矢印は転写の方向を示す
。パネルＣ：このＩ−ＲＮＡ（センス転写物）を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用
いて線状化したプラスミドｐＳＤＩＲから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて
インビトロ転写した。次いで、４μｇの合成ＲＮＡを変性ゲルローディング色素
（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と混合し、５５℃にて１０分間加熱し、次
いでＤＮＡサンプルの分析のための条件下で１ｋｂラダーＤＮＡ（ＢＲＬ）マー
カー（レーンＭ）を用いて１．２％アガロースゲル上で分析した。ゲル上のＩ−
ＲＮＡバンドの位置を示す。パネルＤ：ＨｅＬａ細胞なしの翻訳溶解物における
ｐＧ３ＣＡＴおよびｐ２ＣＡＴ ＲＮＡのインビトロ翻訳を、インヒビターＲＮ
Ａの非存在下または存在下で行った。８０μｇのＨｅＬａ細胞溶解物を含む１反
応物あたり２μｇのｐＧ３ＣＡＴまたはＰ２ＣＡＴ ＲＮＡを添加した。およそ
４μｇの部分精製した酵母インヒビターＲＮＡおよび１μｇの合成インヒビター
ＲＮＡを、図において示されたそれぞれの反応において使用した。ＣＡＴ遺伝子
産物の位置を矢印の先を用いて示す。
【図２】 図２は、酵母インヒビターＲＮＡによる翻訳の阻害のための、ポリオウイルス
の５’ＵＴＲ配列の必要性を例示する。パネルＡ、ＢおよびＣ：ＨｅＬａ細胞な
しの翻訳溶解物を、各パネルの上記に列挙したレーンのＲＮＡを翻訳するために
使用した。インビトロ翻訳を、各欠失変異体構築物について示されるように、１
μｇの精製されたＩ−ＲＮＡの非存在下または存在下において、キャップされた
かまたはキャップされていないかのいずれかのＲＮＡをおよそ２μｇ用いて行っ
た。各反応物は、８０μｇのＨｅＬａ細胞溶解物タンパク質を含んだ。ＣＡＴタ
ンパク質の位置を、パネルＡの左にて示す。パネルＤ：この図は、上記の実験の
ために使用したポリオウイルス５’−ＵＴＲ欠失変異体構築物を示す。垂直上に
線を引いたボックスは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを表す。黒色
で塗りつぶしたボックスは、ポリオウイルス ５’−ＵＴＲからの配列を表し、
そして斜めに線を引いたボックスは、ＣＡＴ遺伝子コード配列を示す。このプラ
スミドの下の数字は、欠失の端のヌクレオチドを表す。
【図３】 図３は、ゲル電気泳動の間にＩ−ＲＮＡを遅延させ、そしてポリオウイルスＲ
ＮＡの５’ＵＴＲによって競合阻害されるＩ−ＲＮＡと細胞タンパク質との間の
複合体の形成を示す。32Ｐ標識Ｉ−ＲＮＡプローブを、以下の実施例において記
載されるように結合反応においてＨｅＬａ Ｓ−１０抽出物とともにまたはそれ
なしで、インキュベートした。ＲＮＡ−タンパク質複合体を、非変性の４％ポリ
アクリルアミドゲル上で分析した。パネルＡは、Ｓ−１０抽出物の非存在下での
遊離のプローブ（ＦＰ）（レーン２）からＳ−１０抽出物の存在下でのその複合
体化形態（Ｃ）までのの移動度シフトを示す。パネルＢは、非標識競合物ＲＮＡ
を用いた競合実験の結果を示す。１０倍、５０倍および１００倍のモル過剰の非
標識Ｉ−ＲＮＡ（レーン３〜５）または非標識５’−ＵＴＲ（レーン７〜９）を
、結合反応物において使用した。レーン１０の反応物は、１００倍モル過剰の、
非標識の非特異的ＲＮＡ（ＮＳＰ）を含んだ。
【図４】 図４は、Ｉ−ＲＮＡがポリオウイルス５’−ＵＴＲと相互作用するタンパク質
を結合することを示す。ＨｅＬａ細胞タンパク質との、32Ｐ標識したＩ−ＲＮＡ
のＵＶ架橋を、上記の実施例に記載されるように行った。パネルＡ：左の数字は
、Ｉ−ＲＮＡと相互作用するタンパク質のおよその分子量をいう。競合研究につ
いて、１００倍モル過剰のそれぞれの非標識競合物ＲＮＡを各結合反応物に添加
した。使用したこの競合物ＲＮＡは：Ｉ−ＲＮＡ（レーン３）、５’−ＵＴＲ（
レーン４）および非特異的（Ｎｓｐ）ＲＮＡ（レーン５）であった。パネルＢ：
左の数字は、タンパク質マーカー（ＢＲＬ）（レーンＭ）の分子量をいう。右の
数字は、標識したＩ−ＲＮＡプローブと架橋する各タンパク質の分子量をいう。
１００倍モル過剰の非標識競合物ＲＮＡ（例えば、Ｉ−ＲＮＡ（レーン３）、Ｕ
ＴＲ ５５９−６２４ ＲＮＡ（レーン４）、および非特異的（Ｎｓｐ）ＲＮＡ
（レーン５）を、結合反応物において使用した。
【図５】 図５は、ポリオウイルスＲＮＡの５’ＵＴＲの推定二次構造を例示する。これ
は、異なる構造ドメインによる細胞タンパク質との可能な相互作用部位を示す。
相互作用のそれらの可能な部位（括弧内のヌクレオチドにより示す）を有する細
胞タンパク質の分子量を示す。この図は、Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏら（１９９２、前
出）、Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９０、前出）およびＤｉｌｄｉｎｅ、Ｓ．Ｌ．ら
、Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）６６：４３６４−４３７６により公開され
た二次構造推定の改変版である。
【図６】 図６は、ＨｅＬａ細胞タンパク質の32Ｐ標識Ｉ−ＲＮＡ、５’ＵＴＲ ＲＮＡ
、ステム−ループＳＬ−ＧおよびＳＬ−ＤのＲＮＡプローブへのＵＶ架橋を例示
する。パネルＡ：左の数字は、タンパク質マーカー（レーンＭ）の分子量をいう
。個々の32Ｐ標識ＲＮＡプローブ（例えば、Ｉ−ＲＮＡ（レーン１、２）、５’
ＵＴＲ ＲＮＡ（レーン３、４）、ステム−ループＧ ＲＮＡ（レーン５、６）
およびステム−ループＤ ＲＮＡ（レーン７、８））を、結合反応物において、
ＨｅＬａ Ｓ−１０抽出物とともに（レーン２、４、６、８）または伴わずに（
レーン１、３、５、７）かのいずれかで、インキュベートし、次いで、ＵＶ架橋
およびゲル分析を行った。パネルＡの右の数字は、架橋されたタンパク質のおよ
その分子量を示す。パネルＢ：32Ｐ標識されたステム−ループＳＬ−Ｇ（ＵＴＲ
５５９−６２４）ＲＮＡおよびＳＬ−Ｄ（ＵＴＲ１７８−２２４）ＲＮＡ（それ
ぞれレーン１および２）を、ＨｅＬａ Ｓ−１０抽出物と共にインキュベートし
、架橋し、そして架橋タンパク質の移動度を並べて比較して分析した。右の数字
は、矢印の先を用いて示されるタンパク質の推定分子量をいう。
【図７】 図７は、Ｉ−ＲＮＡがステムループＳＬ−ＧおよびＳＬ−Ｄの両方とタンパク
質結合について競合することを示す。ＵＶ架橋実験において使用した32Ｐ標識Ｒ
ＮＡプローブを、各パネルの上に列挙する。パネルＡの左の数字は、レーンＭに
おけるタンパク質マーカーの分子量を示す。パネルＡ：レーン１、抽出物なし；
レーン２、非標識競合物ＲＮＡを用いない抽出物；レーン３、非標識５’ＵＴＲ
競合物；レーン４、非標識Ｉ−ＲＮＡ競合物；レーン５、非標識ステム−ループ
ＳＬ−Ｇ（すなわち、ＵＴＲ５５９−６２４）；レーン６、非標識ＳＬ−Ｄ（す
なわち、ＵＴＲ１７８−２２４）；レーン７、非標識非特異的ＲＮＡ；レーン８
、非標識ＳＬ−Ｂ ＲＮＡ（すなわち、ＵＴＲ５１−７８）；レーン９、非標識
ＳＬ−Ｃ ＲＮＡ（すんわち、ＵＴＲ１２４−１６２）。パネルＢ：レーン１、
抽出物なし；レーン２、非標識ＲＮＡを用いない抽出物；レーン３、非標識５’
ＳＬ−Ｇ ＲＮＡ競合物；レーン４、非標識Ｉ−ＲＮＡ競合物；レーン５、非標
識５’ＳＬ−Ｄ ＲＮＡ競合物；レーン６、非標識非特異的ＲＮＡ競合物；レー
ン７、非標識ＳＬ−Ｂ ＲＮＡ；レーン８、非標識ＳＬ−Ｃ ＲＮＡ。パネルＣ：レーン１、抽出物なし
；レーン２、非標識競合物なしの抽出物；レーン３、非標識ＳＬ−Ｄ競合物；レ
ーン４、非標識Ｉ−ＲＮＡ競合物；レーン５、非特異的ＲＮＡ；レーン６、非標
識ＳＬ−Ｇ競合物；レーン７、非標識ＳＬ−Ｂ ＲＮＡ；レーン８、非標識ＳＬ
−Ｃ ＲＮＡ。矢印の先は、タンパク質の分子量が、下から上に向って、それぞ
れ、５２ｋＤａ、５４ｋＤａおよび５７ｋＤａのタンパク質−ヌクレオチドの複
合体を示す。
【図８】 図８は、Ｉ−ＲＮＡがインビトロで翻訳の内部開始を阻害することを実証する
。パネルＡ：レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）に連結したＢｉｐ ｍＲＮＡ
の５’ＵＴＲを含む構築物ｐＢＩＰ−ＬＵＣを、インビトロで、ＨｅＬａ細胞溶
解物中で、酵母インヒビターの非存在下（レーン１）または存在下（レーン２）
で、翻訳させた。コントロールとして、構築物ｐＧ３ＣＡＴもまた、その酵母イ
ンヒビターの非存在下（レーン３）または存在下（レーン４）で翻訳させた。こ
の産物を、ＳＤＳ−１４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。左における矢
印の先は、ルシフェラーゼ遺伝子産物（ＬＵＣ）の位置を示し、右側の矢印の先
は、ＣＡＴ遺伝子産物（ＣＡＴ）を示す。パネルＢ：ＴＭＥＶ ５’ＵＴＲに隣
接するＣＡＴ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を含む二シストロン性構築物ｐ
ＰＢ３１０を、インビトロで、ＨｅＬａ細胞溶解物中で、Ｉ−ＲＮＡの非存在下
（レーン１）または存在下（レーン２）で翻訳させた。この産物を、ＳＤＳ−１
４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。左における矢印の先は、ＣＡＴ遺伝
子産物（ＣＡＴ）およびルシフェラーゼ遺伝子産物（ＬＵＣ）の位置を示す。
【図９】 図９は、Ｉ−ＲＮＡがインビボでポリオウイルスＲＮＡの翻訳を阻害すること
を示す。ＨｅＬａ細胞の単層を、ウイルスＲＮＡ単独を用いて、Ｉ−ＲＮＡ単独
を用いて、またはウイルスＲＮＡおよびＩ−ＲＮＡを共に用いて、トランスフェ
クトした。トランスフェクション後、この細胞を、以下の実施例に記載されるよ
うに、35Ｓメチオニンで標識し、そしてインビボで標識したタンパク質を、ＳＤ
Ｓ−１４％ポリアクリルアミドゲル上で、直接（パネルＡ）または抗キャプシド
抗体を用いた免疫沈降後（パネルＢ）のいずれかで分析した。パネルＡ：各トラ
ンスフェクション反応に添加したＲＮＡは、図に示されるとおりである。パネル
Ｂ：このパネルは、パネルＡ、レーン１〜５に示したトランスフェクション反応
物からの、免疫沈降したインビボ標識したタンパク質を示す。ポリオウイルスキ
ャプシドタンパク質の位置を、パネルＢの左に示す。
【図１０】 図１０は、酵母インヒビターＲＮＡのコンピュータ予測した二次構造を例示す
る。パネルＡおよびＢは、そのＲＮＡの２つの可能な二次構造を示す。数字は、
そのＲＮＡの５’末端からのヌクレオチドの位置をいう。各推定構造について計
算された自由エネルギーを、それぞれの構造の下に与える。
【図１１】 図１１は、酵母Ｉ−ＲＮＡが、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）媒介性イ
ンビトロ転移を特異的に阻害することを示す。（Ａ）ＨｅＬａ細胞抽出物におけ
る二シストロン性構築物からのＩＲＥＳ媒介性の翻訳のＩ−ＲＮＡによる阻害。
ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の合成は、ウイルスＩＲＥＳエレメントから内部で始
まり、そしてＣＡＴの合成は、Ｃａｐ依存性様式で始まる（５’Ｃａｐ−ＣＡＴ
−ＩＲＥＳ−ＬＵＣ３’）。レーン１、４、５および７は、Ｉ−ＲＮＡを含まな
かった。レーン２、３、６および８は、１μｇのＩ−ＲＮＡを含んだ。（Ｂ）免
疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ、レーン１、２）、ＣＡＴ（レーン３
、４、９、１０）、Ｐ２ ＣＡＴ（ＰＶ ５’ＵＴＲを含む、レーン７、８）、
ｐＧｅｍＬＵＣ（レーン５、６）、ｐＣＩＴＥ（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含む、レ
ーン１１、１２）、ならびに酵母α３６ ｍＲＮＡ（レーン１３、１４）の種々
のモノシストロン性ＲＮＡによって媒介されるインビトロ翻訳に対するＩ−ＲＮ
Ａの効果。レーン１、３、５、７、９、１１、１３は、インヒビターを含まなか
った。レーン２、４、６、８、１０、１２、１４は、１μｇのＩ−ＲＮＡを含ん
だ。
【図１２】 図１２は、ＨｅＬａ ５２ｋＤａ Ｉ−ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｌａ自己抗
原と同一であることを示す。２つのアッセイ、ゲル遅延に続くＬａ抗体を用いる
スーパーシフト（左）およびＵＣ−架橋に続くＬａ抗体を用いる免疫沈降（右）
を行って、この５２ Ｋｄａ Ｉ−ＲＮＡ結合性ＨｅＬａ細胞タンパク質が、Ｌ
ａ抗原であると同定した。
【図１３】 図１３は、アンチセンスＩ−ＲＮＡもまた、ＵＴＲ（５５９−６２４）と相互
作用するＨｅＬａ ５２ｋＤａタンパク質に結合することを示す。32Ｐ標識した
Ｉ−ＲＮＡ（レーン１および２）またはアンチセンスＩ−ＲＮＡ（レーン３およ
び４）と、ＨｅＬａ細胞なしの抽出物（Ｓ１０）Ａ ５２ ｋＤａタンパク質と
のＵＶ架橋は、Ｉ−ＲＮＡおよび抗Ｉ−ＲＮＡの両方と複合体化する（矢印の先
で示す）。これは、コールドのＵＴＲ ５５９−６２４（レーン２）と競合され
得る。レーンＭは、上からそれぞれ、４３ｋＤａおよび２９ｋＤａのサイズを有
する14Ｃ標識したタンパク質分子量マーカーを含んだ。（Ａ）ゲル遅延：32Ｐ−
標識したＩ−ＲＮＡプローブを、５０μｇのＨｅＬａ Ｓ１０抽出物（レーン２
および３）か、またはこれらのクローンから発現された精製したＬａタンパク質
０．３μｇ（レーン４および５）とともに、Ｌａタンパク質の抗体の存在下（レ
ーン３および５）または非存在下（レーン２および４）でインキュベートした。
ＨｅＬａ Ｓ１０を用いてか（Ｃで示す）または精製されたＬａタンパク質を用
いて形成されたＩ−ＲＮＡ−タンパク質複合体の両方が、抗Ｌａ抗体を用いてス
ーパーシフトした（ＳＳにより示す）。免疫前のＩｇＧは、複合体（Ｃ）の移動
度を変化させなかった。（Ｂ）32Ｐ−Ｉ−ＲＮＡ（レーン１、２および３）また
は32Ｐ ＵＴＲ ５５９−６２４ ＲＮＡ（レーン４、５および６）を、ＨｅＬ
ａ Ｓ１０タンパク質（レーン２および５）または精製されたＬａタンパク質（
レーン３および６）に対してＵＶ架橋した。ＲＮアーゼ消化後、タンパク質−ヌ
クレオチドの複合体を、抗Ｌａ抗体を用いて免疫沈降した。免疫前ＩｇＧは、こ
の５２ｋＤａ（Ｌａ）−Ｉ−ＲＮＡ複合体を認識しなかったが、疑問符により示
す約１１０ｋＤａに移動する非特異的なタンパク質を認識した（データは示さず
）。
【図１４】 図１４は、内部開始（Ｐ２ ＣＡＴ）による翻訳を特異的に阻害するがｃａｐ
依存性翻訳（ＣＡＴ）は阻害しない際の、Ｉ−ＲＮＡ配列を含む１４ヌクレオチ
ド長のＲＮＡ（ＢＩ−ＲＮＡ）の阻害活性を示す。この図は、Ｉ−ＲＮＡおよび
ＢＩ−ＲＮＡの非存在下（レーン１および５）もしくはＩ−ＲＮＡの存在下（レ
ーン２）またはＢＩ−ＲＮＡの１μｇ（レーン３および６）および２μｇ（レー
ン４）の存在下のいずれかでの、Ｐ２ ＣＡＴ構築物（レーン１〜４）またはｐ
ＣＡＴ構築物（レーン５および６）からのＣＡＴ遺伝子の翻訳（矢印の先で示す
）を示す。
【図１５】 図１５は、図１０に示されるように、酵母インヒビターＲＮＡのコンピュータ
予測した二次構造の状況において、Ｉ−ＲＮＡ配列を含む活性な１４ヌクレオチ
ドのＢＩ−ＲＮＡの配列を示す。パネルＢにおける実線は、図１４において記載
されるような内部開始を用いる翻訳を阻害することが示されたＢＩ−ＲＮＡの１
４ヌクレオチドを包含する。ＢＩ−ＲＮＡにおいて、ネイティブＩ−ＲＮＡ構造
のヌクレオチド１３は、従来のホスホジエステル結合によって、ヌクレオチド３
０に直接連結されている。
【図１６】 図１６は、翻訳阻害活性について試験されＩ−ＲＮＡ欠失変異体構築物を示す
。変異部位のヌクレオチド位を、各変異体について示す。それぞれの変異体の名
称を一番左に列挙する。
【図１７】 図１７は、野生型ＬＡＰおよびＬＡＰ欠失変異体の競合結合阻害を測定するこ
とによる、Ｌａペプチド（ＬＡＰ）のＩ−ＲＮＡ結合ドメインを例示する。
【図１８】 図１８は、力価決定されたプラークアッセイを用いて、培養された肝癌細胞に
おけるＰＶの複製を阻害するに置けるＬａペプチドの効果を例示する。ＬＡＰを
、感染の開始後１時間で細胞に添加して、ＬＡＰがウイルス付着を妨害する可能
性を解明した。感染を２４時間まで継続し、その時点でその感染を終結させ、そ
してウイルスの力価を、ＨｅＬａ細胞におけるプラーク形成について無細胞抽出
物をアッセイすることによって決定した。ＮＳＰ（非特異的タンパク質）と比較
すると、ＬＡＰは、宿主細胞への侵入およびＰＶ複製を阻害するにおいて有効で
あった。
【図１９】 図１９は、Ｉ−ＲＮＡ−ＬＡＰの組合せが、個々の分子よりも、ＨＣＶ−ＩＲ
ＥＳ媒介性の翻訳を阻害するにおいて、より有効であることを例示する。
【図２０】 図２０は、Ｉ−ＲＮＡおよびＬＡＰがＨＣＶ ＩＲＥＳ媒介性翻訳を阻害する
機構を例示する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ダスグプタ， アシム アメリカ合衆国 カリフォルニア 90034， ロサンゼルス， マルコム アベニュー 3314 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA03 DA01 DA02 DA11 EA04 FA01 4C084 AA02 BA18 BA23 CA01 ZB331 ZB332 4H045 AA10 AA30 BA10 BA17 CA15 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に結合するアミノ酸配
    列を含む単離されたペプチドであって、該結合がウイルスタンパク質翻訳を阻害
    する、ペプチド。
  2. 【請求項２】 内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に結合するアミノ酸配
    列を含む単離されたペプチドであって、該結合がウイルス複製を阻害する、ペプ
    チド。
  3. 【請求項３】 前記ペプチドが、Ｌａペプチド（ＬＡＰ）インヒビターＲＮ
    Ａ（ＩＲＮＡ）結合ドメインを含む、請求項１または２に記載のペプチド。
  4. 【請求項４】 前記ＬＡＰ結合ドメインが、野生型Ｌａ自己抗原タンパク質
    のアミノ酸１１〜２８を含む、請求項３に記載のペプチド。
  5. 【請求項５】 前記ＬＡＰ結合ドメインが、配列：Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
    −Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ
    −Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅを含む、請求項４に記載の
    ペプチド。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドの治療上有効
    な量を、薬学的に受容可能なキャリア中に含む、抗ウイルス剤。
  7. 【請求項７】 ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法であって、該翻訳は、該ｍＲ
    ＮＡの内部リボソーム侵入部位で開始され、そして該部位へのタンパク質因子の
    結合を必要とし、該方法は以下の工程： 該ｍＲＮＡを翻訳し得る系において、該ｍＲＮＡの該部位に選択的に結合する
    ペプチドの翻訳阻害有効量を提供する工程、 を包含し、ここで、 該ペプチドは、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドから選択される
    、 方法。
  8. 【請求項８】 前記ｍＲＮＡが、ピコルナウイルス、フラビウイルス、コロ
    ナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ラブドウイルス、アデノウイルスおよびパライ
    ンフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスのウイルスＲＮＡであ
    る、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ウイルスが、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝
    炎ウイルス、コクサッキーウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、エコ
    ーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイ
    ルス、ヒトＢ型肝炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびセンダイウイルスか
    らなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ｍＲＮＡの翻訳を阻害するペプチドであって、該翻訳は、
    該ｍＲＮＡの内部リボソーム侵入部位で開始され、そして該部位へのタンパク質
    因子の結合を必要とし、該ペプチドは、該部位に選択的に結合し、それによって
    、該ｍＲＮＡの該部位への該因子の結合を妨害し、ここで、 該ペプチドは、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドから選択される
    、 ペプチド。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドおよびＲＮ
    Ａオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、該オリゴヌクレオチドがインヒビ
    ターＲＮＡ（ＩＲＮＡ）配列を含む、組成物。
  12. 【請求項１２】 前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが以下： ３５ヌクレオチド未満からなるＲＮＡオリゴヌクレオチド；および 該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模倣物、 からなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
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FR2884522A1 (fr) Methode d'inhibition de la traduction et/ou la replication d'une sequence d'arn par multimerisation d'une de ses regions d'arn non codant replie

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