JP2002514409A - 遺伝的に改変された繊維芽細胞及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 筋肉系統拘束遺伝子を発現する遺伝的に改変された繊維芽細胞を調製する方法、及び遺伝的欠損の処置のためのか又は治療的タンパク質の発現のためのその使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、原発性単一遺伝子性筋障害のような筋肉系先天的欠損症の矯正、又
は治療的タンパク質の製造における使用のための、遺伝的に改変された繊維芽細
胞のエキソビボ筋原性転換方法に関する。更に、本発明は、遺伝的病因学におけ
る筋肉病理処置のための細胞インプラント用組成物調製のためか、又は治療的に
重要なリコンビナントタンパク質のインビボでの分泌のための遺伝的に改変され
た繊維芽細胞の使用に関する。特に、本発明は、筋ジストロフィー、すなわち、
膜結合タンパク質ジストロフィン、又は筋繊維細胞骨格と細胞外マトリックスと
を結合するジストロフィン結合タンパク質複合体の他のメンバーをコードする遺
伝子の突然変異によって生じた、筋肉の重篤な変性疾患の不均質群の処置ために
有益である。

【０００２】 今日まで、筋肉又は他の組織の幹細胞の移植に基づく遺伝子治療を用いて筋ジ
ストロフィーを矯正しようとする試みは、適切数の遺伝的に改変すべき筋細胞の
単離における多くの問題点、又は表現型の転換の不十分な収率によって阻まれて
いる。例としては、遺伝的に改変すべき衛星細胞の妥当数を得ることの困難さが
、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者又はベッカー筋ジストロフィー患者の遺
伝子治療を制限している（Salvatori, G., et al., 1993; Webster, C. et al.,
1990）。ジストロフィー患者における遺伝的に改変された細胞の移植に関する
更なる問題は、ウイルスベクターの免疫原性、効果的投与経路開発の困難さ及び
注入細胞の不十分な生存である。更に、ジストロフィンの発現それ自体が、ジス
トロフィン欠乏患者での細胞性及び／又は体液性免疫応答を誘導することが報告
されている（New England J. of Medicine 333, 732-733, 1995）。

【０００３】 ＭｙｏＤ及び塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子の筋原性ファミ
リー関連メンバーの強制的発現が非筋肉細胞での筋形成を活性化することがここ
しばらくの間で知られてきた（Davis, R.L., et al., 1987; Cossu, G., et al.
, 1996; Cossu, G., 1997）。他の細胞タイプとではなく、筋原性細胞系又は初
代細胞と共培養した場合には、繊維芽細胞が筋原性分化を起こすことを、出願人
自身が最近報告した（Breton, M. et al., 1995; Gibson, A.J., et al., 1995;
Salvatori, G. et al., 1995）。WO95/12979は、細胞内へのＭｙｏＤ、ミオゲ
ニン、Ｍｙｆ−５及びＭＲＦ４のような因子の遺伝子配列を挿入することによっ
て新規表現型、例えば、筋原性表現型への細胞分化を誘導するための一般的方法
を開示する。同文献は、遺伝的に改変された細胞を、遺伝的治療のためにそれら
を適合させるために筋原性表現型へ転換させるいかなる可能性をも考慮せず、ま
た“エキソビボ”筋原性転換を実施する可能性を予見もしていない。

【０００４】 ＧＢ２２９３６０４は、筋肉の病状の処置における繊維芽細胞の使用を開示し
、ここで、筋原性因子による分化を誘導する可能性は考慮されていないが、繊維
芽細胞それ自体を、治療的に有効な遺伝子、例えばジストロフィン遺伝子で形質
転換することができる。

【０００５】 上記を考慮すれば、糖尿病、血友病、下垂体性小人病の場合のような、筋ジス
トロフィーのような遺伝的欠損、又は、例えば、タンパク質か血漿因子若しくは
他の分泌か循環タンパク質の産生不足又は誤った産生に関連するあらゆる他の機
能不全を矯正するために、エクソビボで遺伝的に改変した後に、多数の細胞を筋
原性表現型に転換することを可能にする方法によることが著しく好都合であると
思われる。

【０００６】 治療的タンパク質、又は遺伝的欠損、特に筋ジストロフィーを矯正することが
できるタンパク質を効率的に産生するために、高効率の方法で遺伝的に改変され
た繊維芽細胞を筋原性表現型に転換することが可能であることが今見出された。

【０００７】 第１の側面によれば、本発明は、筋肉系統拘束遺伝子を発現する遺伝的に改変
された繊維芽細胞を調製するための高効率な方法であって、 ａ）治療的遺伝子又は遺伝的欠損を矯正することのできる遺伝子を用いる繊維芽
細胞のエクソビボでの形質導入、 ｂ）高効率ＤＮＡ導入方法、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはバキ
ュロウイルス、アデノ随伴ウイルス、そして最も好ましくはアデノウイルス、又
はリポソーム、核タンパク質のような他の高効率ＤＮＡ導入方法を用いる細胞の
形質転換による、要点ａ）のように形質導入された繊維芽細胞の筋肉系統拘束遺
伝子の一過的発現（ここで、該筋肉系統拘束遺伝子は強力なプロモーター、好ま
しくはウイルスプロモーターの制御下にある）を含む方法を提供する。

【０００８】 “筋肉系統拘束遺伝子”とは、繊維芽細胞を筋原性表現型に転換させることが
可能なあらゆる遺伝子、特にＭｙＦ−５、ＭＲＦ４、ミオゲニン、及び、好まし
くはＭｙｏＤ遺伝子をいう。

【０００９】 筋原性転換の前に繊維芽細胞内に導入することができる治療的遺伝子は、例え
ば、サルコグリカン、エメリン及び好ましくはジストロフィン遺伝子のような筋
ジストロフィーの種々のタイプ、又は凝固因子若しくはインスリンのような循環
血漿タンパク質をコードする遺伝子、成長ホルモンのようなホルモンをコードす
る遺伝子、又は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、グルコセレブ
ロシダーゼ、低密度リポタンパク質レセプター、フェニルアラニンヒドロキシラ
ーゼ、アルギニンスクシナート及びアリールスルファターゼ等のような遺伝子で
ある。

【００１０】 本発明の第２の側面は、本発明の方法によって得られた、筋肉系拘束の遺伝子
、好ましくはＭｙｏＤを一過的に発現する遺伝的に改変された繊維芽細胞に関す
る。

【００１１】 筋肉系統拘束遺伝子の一過的発現による筋原性表現型への繊維芽細胞の転換は
、驚くべきことに他の選択的技術に比べてより効率的であることが分かった。実
際に、繊維芽細胞と衛星細胞との共培養、デキサメタゾンを用いる処理、及びリ
ン酸カルシウム、リポフェクトアミン若しくはＭｙｏＤを発現する同じプラスミ
ドのエレクトロポレーションを用いる形質移入は、リコンビナントアデノウイル
スベクターを用いる感染の場合の７０％より高い値と比べると、１％〜１４％の
範囲の百分率で筋原性転換を誘導する。更に、最大m.o.i.（“感染多重度”）値
での細胞毒性が許容し得る限度内であるのに、転換効率は、直線的に５００〜２
０００m.o.i.値増加した。同様の結果が、ヒト又はマウス繊維芽細胞で得られた
が、組織の繊維芽細胞に関する限り、皮膚繊維芽細胞がより効果的な結果を与え
た。本発明の方法の１つの主要な利点は、外来性筋肉系統拘束遺伝子の一過的な
発現によって、対応する内在性遺伝子が活性化され、その結果、細胞が筋形成へ
と不可逆的に拘束され、こうして不必要な導入遺伝子が構成的に発現されること
である。実際に、外来性ＭｙｏＤを一過的に発現させる繊維芽細胞の筋形成転換
を、免疫組織化学、電子顕微鏡及びミオシン軽鎖と重鎖、アセチルコリンレセプ
ターαサブユニット、Ｍクレアチンキナーゼ、ミオゲニン及びＭｙｏＤのような
種々の筋肉特異的マーカー遺伝子発現分析によって確認した。

【００１２】 この方法の高い効率は、筋原性表現型に安定的に転換することができる、治療
的遺伝子、又は筋肉内に遺伝的欠損を矯正する遺伝子が挿入された、遺伝的に改
変された繊維芽細胞の調製を可能にする。実際に、筋繊維の使用に基づく筋原性
表現型への転換は細胞複製を阻止しそして安定なインプラントを提供する。

【００１３】 更に、この方法の効率性、同じく得られる産生物の安定性が、遺伝的治療（こ
こで、適切なエクソビボ処置後、筋肉系統拘束遺伝子を発現する遺伝的に改変さ
れた繊維芽細胞を、筋繊維を再生することが可能であり、そして遺伝子を矯正す
ることができる部位の筋肉組織内に注入する）を首尾良く実施することを可能に
する。

【００１４】 ここで開示するようなエクソビボで処置された繊維芽細胞が、長期持続効果を
有する始原筋原（衛星）細胞が起源である識別不能なマウスの筋肉繊維を再生す
ることができることを、多くの証拠が証明している。更に、処置後、アデノウイ
ルス感染繊維芽細胞のタンパク質に対する免疫応答を介在する抗体だけが検出さ
れた。改変繊維芽細胞の注入部位では、細胞性免疫応答は全く観察されなかった
。アデノウイルスベクターのインビボでの使用に付随する主要な問題の１つが、
ウイルス及び遺伝子組換えタンパク質の両者に対する有意なＴ細胞性免疫応答の
誘導であることから、これは、遺伝子治療で有意義な利点である。

【００１５】 更なる側面によると、本発明は上記方法で得られた繊維芽細胞の、“エクソビ
ボ”遺伝子治療のための使用、又は筋繊維に基づく安定的細胞インプラント用の
組成物の調製のための使用に関する。

【００１６】 エクソビボ遺伝子治療の代表的な適用は、例えば、ジストロフィーのような筋
肉構造又は機能性を変化させる遺伝的疾患を患う患者から皮膚繊維芽細胞を単離
すること、培養細胞を膨張させること、矯正遺伝子を含有するレトロウイルスベ
クターを用いてエクソビボで細胞を形質導入すること、そして筋肉系拘束遺伝子
を含有するアデノウイルスベクター又は上記のようなベクター等での感染によっ
て筋形成を誘導すること、及び筋肉組織内に改変細胞を再移植することを含む。

【００１７】 筋繊維を基礎とする細胞インプラントを調製するための別の代表的な手段は、
例えば、血漿タンパク質の欠損を特徴とする疾患（糖尿病、下垂体性小人病、血
友病）を患う患者からの皮膚繊維芽細胞を単離すること、培養細胞を膨張させる
こと、矯正遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを用いてエクソビボで細胞
を形質導入すること、及び、筋肉系統拘束遺伝子を含有するアデノウイルスベク
ター又は上記のようなベクター等での感染によって筋形成を誘導すること、最も
適切な移植マトリックス内に改変細胞をカプセル化すること、並びに適切な身体
部位に調製物を移植することを含む。この特定の適用においては、筋形成の誘導
及び続く筋肉組織への分化は、筋肉機能性の回復を目的としないが、細胞分裂の
停止によるインプラントの安定性を目的とする。

【００１８】 本発明の更なる適用については、ここで開示された方法を用いてエクソビボで
処理され、次いで動物中に再移植された細胞によるホルモン又はあらゆる他の物
質の産生によって、動物に特定の特徴、例えば体重の増加を誘導するための畜産
技術分野でのその使用、あるいは本発明の方法が行われるべき新規治療方法研究
のためのヒト病状の動物モデルの創出又は使用を考えることができる。

【００１９】 以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。

【００２０】 実施例１ ＭｙｏＤ発現遺伝的に改変された繊維芽細胞の調製 Salvatori et al., Human Gene Ther., 1992, 4:713-723に記載されていると
おりに、Ｃ３Ｈマウス胚又は合法的に中絶したヒト胎児の皮膚及び骨格筋から胎
児繊維芽細胞を単離するか、又はヒト皮膚細胞若しくは筋肉繊維芽細胞を外傷後
手術を受けている患者の組織から得た。この場合、組織をハサミで細かく刻み、
２mg／mLジスパーゼ、０．１mg／mLコラゲナーゼを含むリン酸緩衝生理食塩液（
ＰＢＳ）で、３７℃で４５分間消化し、ＲＰＭＩ培地で洗浄し、そしてピペッテ
ィングして単一細胞懸濁液を得た。

【００２１】 核に局在するｌａｃＺ遺伝子の遺伝子組換えマウス骨髄繊維芽細胞を、８〜１
０週齢のＭＬＣ３Ｆ／ｎｌａｃＺマウスの長骨から流出させた細胞を再懸濁し、
そしてプレーティングすることによって得た。非付着細胞の除去後、ヒト骨髄繊
維芽細胞を健常ドナーから得た。全ての細胞を１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、
１％ゲンタマイシン及び０．３mMβメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ（
増殖培地）で増殖させた。ヒト骨髄繊維芽細胞には２ng／mLｂＦＧＦを添加した
。

【００２２】 筋原性分化を、２％ウマ血清を添加したＲＰＭＩ（分化培地）に細胞を移すこ
とによって誘導した。繊維芽細胞を増殖培地中の継代によって精製した（少なく
とも２回転）。筋原細胞の除去を分化培地中で５日間継代した細胞アリコートの
免疫細胞化学的染色によって日常的に確認した。

【００２３】 形質移入のために、繊維芽細胞（継代３回目〜１０回目）を、Salvatori, G.,
et al., 1993に記載されているように、ＬＴＲプロモーター下の細胞質のβガ
ラクトシダーゼ遺伝子を発現する複製欠損レトロウイルスベクターで感染させた
。

【００２４】 続く工程のために、細胞をラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲの転写制御下
の完全長マウスＭｙｏＤ ｃＤＮＡを発現するＡｄ５由来Ｅ１Ａ欠失アデノウイ
ルスベクターで処理した（Murry, C. E., et al., 1996）。いくつかのコントロ
ール実験において、ＣＭＶプロモーターの制御下のＭｙｏＤ ｃＤＮＡを含有す
るＰＭＣ１１プラスミド１０μgを、リン酸カルシウム又はリポフェクトアミン
（Ｄｏｔａｐ）を用いる標準沈降技術によって細胞に感染させた。

【００２５】 別の方法としては、細胞を、増殖培地中で同じプラスミド６μgを用いて１２
０Ｖ、９６０mFでエレクトロポレーションした。形質移入後、細胞を増殖培地中
で２４時間増殖させ、次に３〜４日間種々の培地に移すか、又はインビボで注入
した。

【００２６】 いくつかの実験では、細胞を２４時間〔１４Ｃ〕チミジン（Amersham）０．５
mCi／mLで前標識し、次いでＭｙｏＤ発現アデノウイルスベクターに暴露させ、
そして取り込まれた残留cpmをカウントすることによって生存を測定した。

【００２７】 実施例２ マウス筋肉へのＭｙｏＤ転換繊維芽細胞の移植 ＭｙｏＤの一過的発現によって転換した、形質移入された（又は形質導入され
た）ヒト又はマウス繊維芽細胞１×１０⁶又は２×１０⁶をトリプシン処理し、Ｐ
ＢＳ２０〜５０μLに再懸濁させ、そして４８時間前に１０^-5Mカルジオトキシン
（Latoxan）３０μLを投与した、同質遺伝子的マウス（Ｃ３Ｈ）又は免疫不全マ
ウス（ｓｃｉｄ／ｂｇ）のいずれかの再生する前脛骨筋の単一部位に注入した。

【００２８】 いくつかの実験では、インビボでの注入１時間までに、筋原的転換マウス繊維
芽細胞を、ＤｉＩ色素（０．５％ＤｉＩ無水エタノール溶液を０．３Ｍショ糖で
最終濃度０．０５％になるまで使用直前に希釈した）でラベルした。

【００２９】 マウスを種々の期間後に屠殺し、そして筋肉を凍結切片し、次いでβガラクト
シダーゼ活性のため染色するか、又は免疫組織化学的に処理した。屠殺時に、血
清をＣ３Ｈマウスから収集し、そしてアデノ感染又はコントロール細胞と種々の
希釈度で反応させ、続いてフルオレセイン結合ＩｇＧ２次抗体と反応させた。

【００３０】 実施例３ 免疫細胞化学、電子顕微鏡及びＲＮＡ分析技術。 免疫蛍光分析を、下記抗体、すなわち、全ての腹節ミオシンを認識するモノク
ローナル抗体であるＭＦ２０（Bader, D., et al., 1982）、腹節タンパク質に
対するウサギ抗血清（Tajbakhrsh, S., et al., 1994）、抗ＭｙｏＤポリクロー
ナル抗体（Hasty, P., et al., 1993）、遅いミオシン重鎖を認識するモノクロ
ーナル抗体（Yasin, R., et al., 1977）、ヒト胎児ミオシンに対するウサギポ
リクローナル抗体（Edom, F., et al., 1994）、抗ブロモデオキシウリジン（Ｂ
ｒｄＵ）モノクローナル抗体、抗ｌｅｕ、抗ＣＤ４及び抗Ｍａｃ３ラット抗マウ
ス白血球抗原抗体を用いて記載されるように（Cusella-De Angelis, M. G., et
al., 1994）行った。概略すると、細胞培養物又は凍結切片を４％パラホルムア
ルデヒドを用いて、４℃で１０分間固定し、３×ＰＢＳで洗浄し、そして１次抗
原を含むＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と４℃でインキュベートし
た。ＢｒｄＵラベル細胞培養を２MＨＣｌと室温で１０分間処理し、そして抗Ｂ
ｒｄＵ抗体でのインキューベーション前にＰＢＳで３回洗浄した。

【００３１】 最初のインキュベーション後に、細胞又は切片をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで３回洗
浄し、そしてローダミン結合ヤギ抗マウスＩｇ又はフルオレセイン結合ヤギ抗ウ
サギＩｇ（１：１００希釈）と一緒に室温で１時間インキュベートした。

【００３２】 次に、培養物又は切片を洗浄し、７５％グリセロール／ＰＢＳ（pH７．５）中
でマウントし、そしてZeiss Axiophot epifluorescence microscope下で観察し
た。

【００３３】 電子顕微鏡鏡検のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、２％グルタルアルデヒドを
含む０．１Ｍミロニグバッファー（pH７．４）で４℃で１時間固定し、１％緩衝
４酸化オスミウム及び脱水等級アルコールで１時間、後固定した。細胞を酸化プ
ロピレンで処理し、Epon812に包埋し、そして超薄切片に切り出した。超薄切片
を酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、そしてZeiss 109 electron microscop
eで検鏡した。

【００３４】 ＲＮＡ分析については、ＲＮＡをChomczynski et al.（Chomczynski et al.,
1987）の方法によって抽出し、アリコート１５μgを１％アガロース／ホルムア
ルデヒドゲルで泳動し、そしてナイロンメンブラン（Amersham Hybond-N）に、
ノーザンブロットによって移した。フィルターを、真空下８０℃で２時間、クロ
スリンクさせ、そして標準条件下（２６）で、ＭｙｏＤ及びミオゲニン（Bober,
E., et al., 1991）、ＭｌＣ１Ｆ及びＭＣＫ（Lyons, G. E., et al., 1991）
、及びＡｃｈ−レセプターαサブユニット（２５）の〔３２Ｐ〕ラベルプローブ
にハイブリダイズさせた。

【００３５】 実施例４ 筋原性表現型を発現するインビトロ転換繊維芽細胞の分析 アデノＭｙｏＤ誘導表現型と始原筋原細胞のそれとを比べるため、免疫細胞化
学、電子顕微鏡及び遺伝子発現分析によって、ヒト及びマウス転換皮膚繊維芽細
胞の筋肉特異的マーカーの数、及び似た年齢の、分化する衛星細胞の数を分析し
た。

【００３６】 転換マウス新生皮膚繊維芽細胞の融合に由来する全ての分化筋管は、速い胚性
ミオシン重鎖を発現し、同時に、またその画分は遅いミオシン重鎖を発現もし、
またその画分は、衛星細胞に由来する筋管に見られるように、遅いミオシン重鎖
を発現もする。

【００３７】 同様に、ヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来の筋管は、インビトロで決して筋繊維誘
発を完了しない始原筋原細胞由来筋管について報告されるように、整列した腹節
及びＺ縞線模様を有するよく配列された初期筋繊維分節誘発を示した。

【００３８】 始原繊維芽細胞のＭｙｏＤの導入が、膜及び代謝性筋肉特異的機能の遺伝子応
答性転写を活性化するかどうかをも確認するために、出願人はアセチルコリン（
ＡＣｈ）レセプターαサブユニット、Ｍクレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、同じく
ＭｙｏＤ、ミオゲニン及び陽性コントロールとして選択した速いミオシン軽鎖１
（ＭＬＣ１Ｆ）のような筋肉特異的タンパク質をコードするＲＮＡの発現をノー
ザンブロッティングによって測定した。

【００３９】 あらゆるこれらのメッセージの検出可能レベルは、決して非転換繊維芽細胞で
検出されないが、一方では、これらのｍＲＮＡは転換繊維芽細胞に由来する筋管
内において、また相当する年齢の衛星細胞に由来する筋管において匹敵するレベ
ルで発現した。

【００４０】 このように、インビトロで分析した全てのパラメーターの下では、転換繊維芽
細胞に起源する筋管は始原筋原細胞に由来するそれらと識別することができなか
った。

【００４１】 後に、出願人は、ＭｙｏＤ過発現が抗増殖効果を有していることから、Ｍｙｏ
Ｄアデノウイルスベクターに暴露させた繊維芽細胞が、分裂する能力をまだ維持
しているかどうかを調べた。マウス及びヒト胚性皮膚繊維芽細胞を無血清培地中
で、２，０００m.o.i.で３時間ＭｙｏＤアデノウイルスベクターで感染させ、１
０mMＢｒｄＵを含有する増殖培地で１２時間培養し、感染後１２、２４、４８及
び７２時間固定し、そして抗ＭｙｏＤ及び抗ＢｒｄＵ抗体で２重染色した。

【００４２】 アデノウイルスベクターへの暴露２４時間後に、ＭｙｏＤを発現する少量の細
胞はＢｒｄＵを取り込んでいたが、４８及び７２時間では、非２重陽性細胞が全
く検出されなかった。したがって、ＭｙｏＤの発現は、転換繊維芽細胞での細胞
分裂を遮断する。

【００４３】 実施例５ 種々の起源の、ヒト及びマウスの筋原性転換効率 繊維芽細胞を単離し、伸展させ、２，０００m.o.i.で３時間ＭｙｏＤアデノウ
イルスベクターで感染させ、更に２４時間培養し、次に記載したように分化を誘
導した。表１は転換％値を示す。

【００４４】 転換効率を抗ミオシン抗体での染色によって示されるように、腹節ミオシン重
鎖を発現する細胞の百分率として測定した。（ＭＦ２０）。示された値は、それ
ぞれトリプリケートで行った、２つの別個の実験の平均を示す。

【００４５】 表１ ―――――――――――――――――――――――――――――― マウス ヒト 胎児 成体 胎児 成体 ―――――――――――――――――――――――――――――― 真皮 ７０ ５６ ６５ ４２ 筋肉 ４３ ４４ ４０ ３２ 骨髄 ＮＤ ６ ＮＤ ６ ―――――――――――――――――――――――――――――― ＮＤ：実施せず

【００４６】 実施例６ ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの再生する前脛骨筋（ＴＡ）への注入後の（ＭＬＣ３Ｆ
／ＬａｃＺマウスの）ＭｙｏＤ転換繊維芽細胞及び衛星細胞の生存

【００４７】 １×１０⁶細胞を含有する２０μLをＳＣＩＤ／ｂｇマウスの再生するＴＡの単
一部位内に注入した。

【００４８】 表示された時間で、マウスを屠殺し、そして連続する１５μm凍結切片をＴＡ
筋から調製した。５スライド毎の１スライドをＸ−ｇａｌ染色した。核をヘキス
トで対比染色した。Ｘ−ｇａｌ染色した切片のβ−ｇａｌ⁺の数をスコアし、そ
して得られた値を５倍した（全核数）。更に２００μ²領域のβ−ｇａｌ⁺／全核
を計数した。結果を表２に示した。β−ｇａｌ+／全核比率の増加は、筋肉再生
（融合）間に次第に生じる単核細胞の減少のためであることに注意すること。

【００４９】

【表１】

【００５０】 実施例７ ＭｙｏＤを発現する遺伝的に改変された繊維芽細胞による筋肉再生 ヒト胎児皮膚から単離した繊維芽細胞を伸展させ、そして細胞質形態のβガラ
クトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子を有するレトロウイルスベクターＬＢ
ＳＮの高力価ストックを用いてインビトロで形質導入した（Salvatori, G., et
al., 1993）。

【００５１】 培養物のβｇａｌ染色細胞の数によって推定した形質導入効率は、４０〜７０
％の範囲であり、さらなる形質導入細胞（例えば、Ｇ４１８耐性）の選択を不要
にする。形質導入繊維芽細胞を２，０００m.o.i.でアデノＭｙｏＤベクターに暴
露させ、次にｓｃｉｄ／ｂｇマウスの再生するＴＡ筋肉内に注入した（１回注入
で１０⁶細胞／筋肉）。

【００５２】 形質導入した繊維芽細胞の筋原性転換効率を、細胞培養の一部をインビトロで
分化することができるようにして調べた。平均で、これらの条件で、約７０％の
繊維芽細胞が筋原性転換を起こし、そして大部分の筋管（＞９０％）が細胞質β
ｇａｌ発現について陽性と記録された。１、２及び４週間後、マウスを屠殺し、
そしてＴＡを連続的に切片化し、そして前脛骨筋を切断し、そしてβｇａｌ活性
について染色した。

【００５３】 注入２週間後、βｇａｌ⁺繊維を注入筋肉８個中の７個について観察した。よ
り高倍率によって繊維が種々のレベルでレポーター遺伝子産物を蓄積すること、
βｇａｌ⁺繊維における注入細胞／ホスト細胞の比率の変動性を示唆することが
明らかに示された。 新規に形成された繊維でのヒト細胞の存在及び寄与を、再生領域内のヒト筋肉
特異的タンパク質の強い発現のパッチを示す、ヒトを認識するがマウス胎児ミオ
シン重鎖を認識しない抗体を用いる免疫細胞化学的分析によって確認した。

【００５４】 一般に、ヒト転換繊維芽細胞の注入によって得られた筋肉当たりのβｇａｌ⁺
繊維の平均数は、マウス繊維芽細胞の注入後に観察されたそれに比べて低いが、
ｌａｃＺ形質導入ヒト衛星細胞を用いた実験で観察された陽性細胞の数に匹敵す
る。これは、期待したように、ヒト細胞がマウス筋肉をコロニー化することにお
いてマウス細胞に比べて低い効率であることを示す。

【００５５】 しかし、そしてより重要には、ヒト転換繊維芽細胞は、新規形成繊維の数及び
サイズの両者に関して、インビボで始原筋原性細胞のようにふるまう。

【００５６】 マウス筋肉での筋原性転換繊維芽細胞の生存のより良い定量化のために、出願
人は、以前に記載したように、Ａｌｕプローブを用いるドットブロットサザン分
析も行った（Salvatori, G., et al., 1993）。

【００５７】 ドットブロットの結果は、転換繊維芽細胞を注入したＴＡからのＤＮＡ抽出の
約０．１％がヒト起源であり、一方この値は、ヒト衛星細胞を注入したサンプル
の場合では０．３％まで上昇したことを示した。

【００５８】 組織化学的分析が、実質的に全部のβガラクトシダーゼ染色が筋肉繊維の内側
であることを明らかにしていることから、我々は、観察された値は再生された筋
繊維内に取り込まれたヒト核の百分率を精確に反映することを結論することがで
きる。

【００５９】 実施例８ アデノウイルスベクターへのエクソビボで暴露された細胞に対する免疫応答 免疫適格性レシピエントでのアデノウイルスベクターのインビボでの使用に関
連する主要問題の一つは、ウイルスタンパク質及び導入遺伝子産物の両者に対す
る有意なＴ細胞介在免疫応答の誘導である。ここで記載しているモデルでは、少
しのウイルス粒子もインビボに注入しない。しかし、注入された細胞は投与直前
にインビトロでアデノウイルスベクターに暴露させた。

【００６０】 複製欠損アデノウイルスＤＮＡは、急速に希釈され、そして活発な細胞分裂に
ある細胞で最終的に無くなることが期待される。しかし、ＭｙｏＤ導入遺伝子の
発現は、転換繊維芽細胞の細胞分裂をほとんど直ぐにブロックし、このようにし
て連続培養によるアデノウイルスベクター希釈の可能性を妨げる。

【００６１】 免疫応答がインビボで欠損アデノウイルスゲノムを発現する細胞によって高め
ることができるかどうかをテストするため、出願人は、アデノＭｙｏＤベクター
への暴露によって筋原性に転換したＣ３Ｈマウス皮膚繊維芽細胞２×１０⁶細胞
を同系マウスの再生する筋肉内に注入した。

【００６２】 注入前に細胞をＤｉＩでラベルしたが、βガラクトシダーゼタンパク質に対す
る起こり得る免疫反応を避けるためにｌａｃＺ導入遺伝子でラベルしなかった。
動物を注入後７、１４及び２１日目に屠殺し、そして筋肉をマウス白血球及びマ
クロファージの表面マーカーに対する抗体を用いる免疫蛍光法によって免疫浸潤
の存在について分析した。

【００６３】 この時間までに全ての処理マウスが、アデノ感染繊維芽細胞を認識するがコン
トロールＣ３Ｈ繊維芽細胞を認識しない、Ａｄ５タンパク質に対する抗体を生じ
たにもかかわらず、ラベル細胞周囲に注入後３週間まで、有意な免疫浸潤は全く
検出されなかった。

【００６４】 これらの実験は、アデノＭｙｏＤへの暴露によってインビトロで転換された繊
維芽細胞、及び筋肉内注入によってインビボで投与された繊維芽細胞は、細胞介
在細胞毒性免疫応答を誘導せず、そしてそれゆえにそれによって除去されそうに
ないことを示す。

【００６５】 対照的に、再生する筋肉へのアデノウイルスベクターの直接注入は、すでに報
告されているように、強い免疫浸潤を誘導する（Yang, Y., et al., 1996）。

【００６６】 参考文献 Salvatori, G., G.Ferrari, A. Mezzogiorno, S. Serivdei, M. Coletta, P.
Tonali, R. Giavazzi, G. Cossu, and F. Mavilio. 1993. Retroviral vector-m
ediated gene transfer into human primary myogenic cells leads to express
ion in muscle fibers in vivo. Human Gene Ther. 4: 713-723. Webster, C. e, H.M. Blau 1990. Accelerated age-related decline in repl
icative life span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implication
for cell and gene therapy. Somatic Cell Mol. Genet. 16:557-565. Davis, R. L., H. Weintraub, and A. B. Lassar. 1987. Expression of a si
ngle trasfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell 51:987-1000
. Cossu, G., S. Tajbakhsh, and M. Buckingham. 1996. Myogenic specificati
on in mammals. Trends Genet. 12:218-223. Cossu, G. 1997. Unorthodox myogenesis: possible developmental signific
ance and implications for tissue histogenesis and regeneration. Histol.
Histopathol. 12: 755-760. Breton, M., Z., Li, D. Paulin, J. A. Harris, F. Rieger, M. Pincon-Raym
ond, and L. Garcia. 1995. Myotuve driven myogenic recruitment of cells d
uring in vitro myogenesis. Develop. Hynam. 202; 126-136. Gibson, A. J., J. Karasinski, J. Relvas, J. Moss, T.G. Sherratt, P.N.
Strong, and D. J. Watt. 1995. Dermal fibroblasts converts to a myogenic
lineage in mdx mouse muscle. J. Cell Science 108; 207-214. Salvatori, G., L. Lattanzi, M. Coletta, S. Aguanno, E. Vivarelli, R. K
elly, G. Ferrari, J.A. Harris, F. Mavilio, M. Molinaro, and G. Cossu. 19
95. Myogenic conversion of mammalian fibroblasts induced by differentiat
ing muscle cells. J. Cell Science 108:2733-2739. Murry, C. E., M. A. Kay, T. Bartosek, S. D. hauschka, and S.M. Schwart
z. 1996. Muscle differentiation during repair of myocardinal necrosis in
rats via gene transfer with MyoD. J. Clin. Invest. 98:2209-2217. Cusella - De Angelis, M. G., S. Molinari, A. Ledonne, M. Coletta, E. V
ivarelli, M. Bouche, M. Molinaro, S. Ferrari, and G. Cossu, 1994. Differ
ential response of embryonic and fetal myoblasts to TGFβ: a possible re
gulatory mechanism of skeletal muscle histogenesis. Development 120: 925
-933 Bader, D., T. Masaki, and D. A. Fischman. 1982. Immunochemical analysi
s of myosin heavy chain during avian myogenesis in vivo and in vitro. J.
Cell Biol. 95: 763-770. Hasty, P., A. Bradley, J. H. Morris, D. G. Edmondson, J. M. Venuti, E.
N. Olson, and W. H. Klein. 1993. Muscle deficiecy and neonatal death in
mice with a targeted mutaion in the myogenin gene. Nature 375; 787-790.
Edom, F., V. Mouly, J. P. Babert, M. Y. Fiszman, and G. S. Butler-Brow
ne. 1994. Clones of human satellite cells can express in vitro both fast
and slow myosin heavy chains. Develop. Biology 164;219-229. Yasin, R., K. C. Van Beers, C. E. Nurse, S. Al-Ani, D. N. Landon, and
E. J. Thompson. 1977. A quantitative technique for growing human adult s
keletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol.
Sci. 32: 347-360. Chomczynski, P., and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolat
ion by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction. Anal.
Biochem. 162: 156-159. Bober, E., G. E. Lyons, T. Braun, G. Cossu, M. Buckingham, and H. H. A
rnold. 1991. The muscle regulatory gene Myf-6 has a biphasic pattern of
expression during early mouse development. J. Cell Biol. 113: 1255-1265.
Boulter, J., W. Luyten, K. Evans, P. Mason, M. Ballivet, D. Goldman, D
. Stengelin, S. Martin, S. Hinemann, and J. Patric, 1985. Isolation fo a
clone coding for the α-subunit of a mouse acetylcholine receptor. J.Ne
urosci. 5:2545-2552. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and Mniatis. 1989. Molecular cloning: a l
aboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
. Yang, Y., S. E. Haecker, Q. Su, and J. Wilson, 1996. Immunology of gen
e therapy with adenoviral vectors. Hum. Mol. Genet. 5: 1703-1712. Tajbakhsh, S., E. vivarelli, M. G. Cossu 1994. A population fo myogeni
c cells derived from the mouse neural tuve. neuron 13: 813-821. Lyons, G. E., S. Muhlebach, A. Moser, r., Masood, B. M. Paterson, M. B
uckingham, and J. C. Perriard. 1991. Development regulation of creatin k
inase gene expression by myogenic factors in embryogenic mouse and chick
skeletal muscle. Development 113: 1017-1029.

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年５月１０日（２０００．５．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 筋肉系統拘束遺伝子を発現する遺伝的に改変された繊維芽細
   胞を調製するための方法であって、 ａ）治療的遺伝子又は遺伝的欠損を矯正することができる遺伝子での繊維芽細胞
   のエクソビボでの形質導入、 ｂ）高効率ＤＮＡ導入方法での細胞の形質転換による、要点ａ）のように形質導
   入された繊維芽細胞内の筋肉系拘束遺伝子の一過的発現（ここで、該筋肉系拘束
   遺伝子は、強力なプロモーターの制御下にある）を含む方法。
2. 【請求項２】 治療的遺伝子がジストロフィン遺伝子である、請求項１記載
   の方法。
3. 【請求項３】 高効率ＤＮＡ導入手段がウイルスベクターである、請求項１
   記載の方法。
4. 【請求項４】 該ウイルスベクターが、バキュロウイルス、アデノ関連ウイ
   ルス、アデノウイルスから選択される、請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 該ベクターがアデノウイルスである、請求項３記載の方法。
6. 【請求項６】 筋肉系拘束遺伝子が、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ−５、ＭＲＦ４及び
   ミオゲニンから選択される、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 該遺伝子がＭｙｏＤである、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 筋肉系拘束遺伝子がウイルスプロモーターの制御下にある、
   請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 筋肉系統拘束遺伝子を一過的に発現する、遺伝的に改変され
   た繊維芽細胞。
10. 【請求項１０】 筋肉系統拘束遺伝子がＭｙｏＤである、請求項９記載の繊
    維芽細胞。