JP2002512007A - 微生物の効率的且つ高度に選択的な制御方法 - Google Patents

微生物の効率的且つ高度に選択的な制御方法

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fungus
spp
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Whitehead Institute for Biomedical Research
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】 本発明は、第一の微生物を選択的に死滅させる方法に関する。該方法は、１）前記第一の微生物を、殺微生物化合物を有する第二の微生物と接触させる工程と；２）前記第一の微生物と前記第二の微生物とを融合させることにより、前記殺微生物化合物を前記融合後に形成される微生物の中に搬送して、該微生物を死滅させる工程とを備えた方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
発明の背景 微生物病原体は、種々の重要な食用穀類（例えば、トウモロコシ、コメ）の収
量を著しく減少し、全産業（例えば、ゴム、タバコ）を脅かし、観葉植物や観葉
樹（例えば、ニレ、クリ、トネリコ）に壊滅的な打撃を与える。不幸にも、広ス
ペクトルの抗微生物剤を用いた治療は、病原体の他に、重要な片利共生又は非病
原性生物をも壊滅させるため、別の病原体がその後に定着するのを容易にし得る
。それ故、理想的な抗微生物治療又は療法は、微生物の生態に与える影響を最小
限に抑えつつ、特定の病原性生物を選択的に死滅又は除去する物質である。微生
物の生態系の重要性は、桃や他の果実の褐色朽の制御におけるエピコッカム・ニ
グラム（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、ペニシリウム・オキサリカム（
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）、及びカンジダ・サケ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｓａｋｅ）等の「拮抗的酵母（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｙｅａｓｔ
）」の使用の成功において十分に実証されている。これらの例では、保護は、適
用した真菌株が迅速に果実を定着させ、採取後腐朽（ｐｏｓｔ−ｈａｒｖｅｓｔ
ｄｅｃａｙ）に関与する生物がその後に定着するのを抑制することができる結
果である。これらの拮抗的アプローチは、予防的な処置としては役立ち得るが、
一旦定着が起こってしまった病原性微生物又は望ましくない微生物は、効果的に
置換し、又は選択的に死滅させにくい。
【０００２】 微生物の選択的な死滅は、選択毒性を有する物質か、又は一般毒性を有するが
選択的に標的化される物質の何れかによって達成することができる。何れのタイ
プの抗微生物物質の開発も、生理学、栄養素の要求性、および生物学のレベルで
の病原性生物と非病原性生物間の固有の類似性に悩まされている。
【０００３】 実質的に全ての生物が、交配又は融合して遺伝的成分及び／又は他の細胞内成
分の交換を生じる。真菌では、融合はランダムな現象ではなく、むしろ、同じ種
の一員の間でのみ限定的に起こり、多くの場合、交配型や植物和合性群（ＶＣＧ
；ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ）のような
二次的な特徴に対するさらなる依存性を含む。例えば、サッカロミセス・セレビ
シアエの一倍体株は、それらが反対の交配型であるときに限って交配し、融合す
るであろう。交配に加えて、多くの糸状菌は、同じ植物和合性群であるときに限
って、吻合（菌糸の融合）もなし得る。重要なことには、これらの融合反応は、
絶対的な選択性をもって起こる。
【０００４】
【発明の実施の形態】
連邦政府の資金援助でなされた研究についての陳述 本発明は、国立公衆衛生院からのグラントＧＭ３５０１０によって、一部資金
援助を受けた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。本発明は、デイモ
ン・ルニオン−ウォルター・ウィンチェル癌研究グラントＤＲＧ１３７８からの
資金によっても援助された。
【０００５】 発明の概要 我々は、病原体を選択的に標的とし、死滅させるために上述の生物的識別機構
を利用した。
【０００６】 従って、第一の側面において、本発明は、第一の微生物を選択的に死滅させる
方法に関する。該方法は、１）前記第一の微生物を、殺微生物化合物を有する第
二の微生物と接触させる工程と；２）前記第一の微生物と前記第二の微生物とを
融合させることにより、前記殺微生物化合物を前記融合後に形成される微生物の
中に搬送して、該微生物を死滅させる工程を含む。
【０００７】 好ましい態様では、第一の微生物は真菌である。好ましい真菌には、アブシジ
ア種（Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ．）、アクチノマデュラ・マデュラエ（Ａｃｔｉ
ｎｏｍａｄｕｒａ ｍａｄｕｒａｅ）、アクチノミセス種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｓ ｓｐｐ．）、アレシェリア・ボイディー（Ａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏ
ｙｄｉｉ）、アルテナリア種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ．）、アンソプシ
ス・デルトイディー（Ａｎｔｈｏｐｓｉｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅａ）、アファノミ
セス種（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、アポフィソミセス・エレカンス
（Ａｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓ ｅｌｅｑａｎｓ）、アルミラリア種（Ａｒｍｉ
ｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、アルニウム・レオポリナム（Ａｒｎｉｕｍ ｌｅｏ
ｐｏｒｉｎｕｍ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、
アウレオバシジウム・プルーランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕ
ｌａｎｓ）、バシジオボーラス・ラナラム（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｒａｎ
ａｒｕｍ）、バイポラーリス種（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｐｐ．）、ブラストミ
セス・デルマティティーディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉ
ｄｉｓ）、ボトリティス種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）、カンジダ種（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、セントロスポラ種（Ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ
．）、セファロスポリウム種（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、セ
ラトシスティス種（Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）、チャエトコニジウ
ム種（Ｃｈａｅｔｏｃｏｎｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、チャエトミウム種（Ｃｈａ
ｅｔｏｍｉｕｍ）、クラドスポリウム種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．
）、コッシディオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔ
ｉｓ）、コレトトリチャム種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、コ
ニディオボーラス種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、コリネバクテリ
ウム・テニュイス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｎｕｉｓ）、クリプ
トポリオプシス種（Ｃｒｙｐｔｏｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）、シリンドロ
クラジウム種（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、クリプトコッカ
ス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、クニンガメラ・ベルソレチアエ
（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａｅ）、カーブラリ
ア種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、ダクチラリア種（Ｄａｃｔｙｌａｒ
ｉａ ｓｐｐ．）、ディプロディア種（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｓｐｐ．）、エピデ
ルモフィトン種（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ．）、エピデルモフィ
トン・フロコッサム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、
エクセロフィラム種（Ｅｘｓｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｐｐ．）、エクソフィアラ
種（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｓｐｐ．）、フォンセカエア種（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ
ｓｐｐ．）、ファルビア種（Ｆｕｌｖｉａ ｓｐｐ．）、フサリウム種（Ｆｕ
ｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、ゲオトリカム種（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．
）、ギグナルディア種（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、ヘルミントスポリ
ウム種（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、ヒストプラズマ種（
Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、レシトフォラ種（Ｌｅｃｙｔｈｏｐｈｏｒａ ｓｐ
ｐ．）、マクロフォミナ種（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｓｐｐ．）、マデュレ
ラ種（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、マグナポルセ種（Ｍａｇｎａｐｏｒｔ
ｈｅ ｓｐｐ．）、マラッセジア・ファーファ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒ
ｆｕｒ）、ミクロスポラム種（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｓｐｐ．）、モニリニ
ア種（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．）
、マイコセントロスポラ・アセリナ（Ｍｙｃｏｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒａ ａｃｅ
ｒｉｎａ）、ネクトリア種（Ｎｅｃｔｒｉａ ｓｐｐ．）、ノカルディア種（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ ｓｐｐ．）、ウースポラ種（Ｏｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、オ
フィオボーラス種（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、ペシロミセス種（Ｐａ
ｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、パラコッシディオイデス・ブラシリエンシ
ス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ペニシ
リウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、フェオスクレラ・デマチオイ
デス（Ｐｈａｅｏｓｃｌｅｒａ ｄｅｍａｔｉｏｉｄｅｓ）、フェオアンネロミ
セス種（Ｐｈａｅｏａｎｎｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、フィアレモニウム
・オボベイタム（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ ｏｂｏｖａｔｕｍ）、フィアロフ
ォラ種（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、フリクタエナ種（Ｐｈｌｙｃｔ
ａｅｎａ ｓｐｐ．）、フォーマ種（Ｐｈｏｍａ ｓｐｐ．）、フォモプシス種
（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）、フィマトトリカム種（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒ
ｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）、フィトフソラ種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ
．）、フィトフソラ種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ピチアム種（
Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ．）、ピエドライア・ホルタイ（Ｐｉｅｄｒａｉａ ｈ
ｏｒｔａｉ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒ
ｉｎｉｉ）、プッシニア種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ピチウム・インシ
ディオサム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、リノクラディエラ・ア
クアスペルサ（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ ａｑｕａｓｐｅｒｓａ）、リゾ
ムコール・プシラス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾクトニ
ア種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ．）、リゾパス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｓｐｐ．）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、サ
クセナエア・バシフォルミス（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｖａｓｉｆｏｒｍｉｓ）、
サルシノミセス・フェオムリフォルミス（Ｓａｒｃｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅ
ｏｍｕｒｉｆｏｒｍｉｓ）、スセロチウム種（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ ｓｐｐ．）
、スクレロチニア種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｐｐ．）、スファエロシカ種
（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｓｐｐ．）、スポロスリックス・シェンクイー（
Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、シンセファラストラム・ラセモ
サム（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ ｒａｃｅｍｏｓｕｍ）、テニオレラ・
ボッピー（Ｔａｅｎｉｏｌｅｌｌａ ｂｏｐｐｉｉ）、タフリナ種（Ｔａｐｈｒ
ｉｎａ ｓｐｐ．）、チエラビオプシス種（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｓｐ
ｐ．）、トルロプソシス種（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｏｓｉｓ ｓｐｐ．）、トリコフ
ィトン種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ．）、トリコスポロン種（Ｔｒｉ
ｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｓｐｐ．）、ウロクラジウム・チャータラム（Ｕｌｏｃｌ
ａｄｉｕｍ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、ウスティラゴ種（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｐ
ｐ．）、ベンチュリア種（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｓｐｐ．）、ベルチシリウム種（
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ワンギエラ・デルマティティーディス
（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、フェトキセリニア種（Ｗ
ｈｅｔｘｅｌｉｎｉａ ｓｐｐ．）、及びキシロハイファ種（Ｘｙｌｏｈｙｐｈ
ａ ｓｐｐ．）、及びそれらの同意語が含まれる。
【０００８】 別の好ましい態様では、化合物は、毒性化合物であるか、又は融合後に形成さ
れる微生物中で毒性化合物の産生を引き起こす化合物である。好ましくは、毒性
化合物は、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ｆ２断片、ジフテリア毒素Ａドメイ
ン、シュードモナスエキソトキシンＡ、及びシュードモナスエキソトキシンＡの
Ａドメインからなる群から選択される毒素又はその断片である。あるいは、化合
物は、融合後に形成される前記微生物中で毒性化合物の産生を引き起こす生合成
酵素である。
【０００９】 関連する態様では、第二の微生物は、殺微生物化合物に耐性がある。好ましい
態様では、第二の微生物は、非病原性真菌である。
【００１０】 第二の側面では、本発明は、ジフテリア毒素耐性真菌を生産する方法に関する
。該方法は、前記真菌のＤＰＨ１、ＤＰＨ３、又はＤＰＨ４遺伝子にジフサミド
の生合成を阻害する変異を導入する工程を含み、前記真菌は、アブシジア種、ア
クチノマデュラ・マデュラエ、アクチノミセス種、アレシェリア・ボイディー、
アルテナリア種、アンソプシス・デルトイディー、アファノミセス種、アポフィ
ソミセス・エレカンス、アルミラリア種、アルニウム・レオポリナム、アスペル
ギルス種、アウレオバシジウム・プルーランス、バシジオボーラス・ラナラム、
バイポラーリス種、ブラストミセス・デルマティティーディス、ボトリティス種
、カンジダ種、セントロスポラ種、セファロスポリウム種、セラトシスティス種
、チャエトコニジウム種、チャエトミウム種、クラドスポリウム種、コッシディ
オイデス・イミティス、コレトトリチャム種、コニディオボーラス種、コリネバ
クテリウム・テニュイス、クリプトポリオプシス種、シリンドロクラジウム種、
クリプトコッカス種、クニンガメラ・ベルソレチアエ、カーブラリア種、ダクチ
ラリア種、ディプロディア種、エピデルモフィトン種、エピデルモフィトン・フ
ロコッサム、エクセロフィラム種、エクソフィアラ種、フォンセカエア種、ファ
ルビア種、フサリウム種、ゲオトリカム種、ギグナルディア種、ヘルミントスポ
リウム種、ヒストプラズマ種、レシトフォラ種、マクロフォミナ種、マデュレラ
種、マグナポルセ種、マラッセジア・ファーファ、ミクロスポラム種、モニリニ
ア種、ムコール種、マイコセントロスポラ・アセリナ、ネクトリア種、ノカルデ
ィア種、ウースポラ種、オフィオボーラス種、ペシロミセス種、パラコッシディ
オイデス・ブラシリエンシス、ペニシリウム種、ファエオスクレラ・デマチオイ
デス、フェオアンネロミセス種、フィアレモニウム・オボベイタム、フィアロフ
ォラ種、フリクタエナ種、フォーマ種、フォモプシス種、フィマトトリカム種、
フィトフソラ種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、フィトフソラ種（Ｐ
ｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ピチアム種、ピエドライア・ホルタイ、
ニューモシスチス・カリニ、プッシニア種、ピチウム・インシディオサム、リノ
クラディエラ・アクアスペルサ、リゾムコール・プシラス、リゾクトニア種、リ
ゾパス種、サッカロミセス種、サクセナエア・バシフォルミス、サルシノミセス
・フェオムリフォルミス、スセロチウム種、スクレロチニア種、スファエロシカ
種、スポロスリックス・シェンクイー、シンセファラストラム・ラセモサム、テ
ニオレラ・ボッピー、タフリナ種、チエラビオプシス種、トルロプソシス種、ト
リコフィトン種、トリコスポロン種、ウロクラジウム・チャータラム、ウスティ
ラゴ種、ベンチュリア種、ベルチシリウム種、ワンギエラ・デルマティティーデ
ィス、フェトキセリニア種、及びキシロハイファ種からなる群から選択される。
【００１１】 第三の側面では、本発明は、ＤＰＨ１、ＤＰＨ３、又はＤＰＨ４遺伝子中に、
ジフタミドの生合成を減少させる変異を含有しているジフテリア毒素耐性真菌で
あって、前記真菌が、アブシジア種、アクチノマデュラ・マデュラエ、アクチノ
ミセス種、アレシェリア・ボイディー、アルテナリア種、アンソプシス・デルト
イディー、アファノミセス種、アポフィソミセス・エレカンス、アルミラリア種
、アルニウム・レオポリナム、アスペルギルス種、アウレオバシジウム・プルー
ランス、バシジオボーラス・ラナラム、バイポラーリス種、ブラストミセス・デ
ルマティティーディス、ボトリティス種、カンジダ種、セントロスポラ種、セフ
ァロスポリウム種、セラトシスティス種、チャエトコニジウム種、チャエトミウ
ム種、クラドスポリウム種、コッシディオイデス・イミティス、コレトトリチャ
ム種、コニディオボーラス種、コリネバクテリウム・テニュイス、クリプトポリ
オプシス種、シリンドロクラジウム種、クリプトコッカス種、クニンガメラ・ベ
ルソレチアエ、カーブラリア種、ダクチラリア種、ディプロディア種、エピデル
モフィトン種、エピデルモフィトン・フロコッサム、エクセロフィラム種、エク
ソフィアラ種、フォンセカエア種、ファルビア種、フサリウム種、ゲオトリカム
種、ギグナルディア種、ヘルミントスポリウム種、ヒストプラズマ種、レシトフ
ォラ種、マクロフォミナ種、マデュレラ種、マグナポルセ種、マラッセジア・フ
ァーファ、ミクロスポラム種、モニリニア種、ムコール種、マイコセントロスポ
ラ・アセリナ、ネクトリア種、ノカルディア種、ウースポラ種、オフィオボーラ
ス種、ペシロミセス種、パラコッシディオイデス・ブラシリエンシス、ペニシリ
ウム種、ファエオスクレラ・デマチオイデス、フェオアンネロミセス種、フィア
レモニウム・オボベイタム、フィアロフォラ種、フリクタエナ種、フォーマ種、
フォモプシス種、フィマトトリカム種、フィトフソラ種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏ
ｒａ ｓｐｐ．）、ピチアム種、ピエドライア・ホルタイ、ニューモシスチス・
カリニ、プッシニア種、ピチウム・インシディオサム、リノクラディエラ・アク
アスペルサ、リゾムコール・プシラス、リゾクトニア種、リゾパス種、サッカロ
ミセス種、サクセナエア・バシフォルミス、サルシノミセス・フェオムリフォル
ミス、スセロチウム種、スクレロチニア種、スファエロシカ種、スポロスリック
ス・シェンクイー、シンセファラストラム・ラセモサム、テニオレラ・ボッピー
、タフリナ種、チエラビオプシス種、トルロプソシス種、トリコフィトン種、ト
リコスポロン種、ウロクラジウム・チャータラム、ウスティラゴ種、ベンチュリ
ア種、ベルチシリウム種、ワンギエラ・デルマティティーディス、フェトキセリ
ニア種、及びキシロハイファ種からなる群から選択されるジフテリア毒素耐性真
菌に関する。第二又は第三の側面の好ましい態様では、前記遺伝子は、高ストリ
ンジェンシーで、サッカロミセス・セレビシアエのＤＰＨ１、ＤＰＨ３、又はＤ
ＰＨ４にハイブリダイズし、ＤＰＨ活性を有する。
【００１２】 第四の側面では、本発明は、Ｄｐｈ３ポリペプチドの実質的に純粋な調製物に
関する。
【００１３】 好ましい態様では、Ｄｐｈ３ポリペプチドは、図２１〜２２のアミノ酸配列（
配列番号１０）と少なくとも５５％同一であり、真菌（例えば、サッカロミセス
・セレビシアエ）に由来し、ＤＰＨ生物活性を有する。
【００１４】 第５の側面では、本発明は、Ｄｐｈ３ポリペプチドをコードするＤＮＡに関す
る。
【００１５】 好ましい態様では、該ＤＮＡは、図２１〜２２のＤＰＨ３遺伝子（配列番号９
）を含み、サッカロミセス・セレビシアエのＤＰＨ３変異を相補する。
【００１６】 「融合」とは、細胞内内容物の交換、混合、又は移動をもたらす二つの生物又
は細胞の任意の結合を意味する。好ましい融合形態は、交配と吻合である。
【００１７】 「死滅」とは、融合後に形成される微生物に死を引き起こし、微生物の数に減
少をもたらすことを意味する。好ましくは、減少は少なくとも２５％；より好ま
しくは減少は５０％、最も好ましくは、微生物の数の減少は７５％であり、又は
９５％に及んでもよい。
【００１８】 「殺微生物化合物」とは、微生物の死の誘導を引き起こす分子を意味する。殺
微生物化合物の例には、それ自体毒性のある分子、毒性化合物の産生を誘導する
分子、別の分子と組み合わせたときに毒性を有する分子、及び前記分子の何れか
をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】 「ＤＰＨ生物活性」とは、ジフタミドの生合成に必要とされる活性を意味し、
該活性の喪失は、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ｆ２断片、ジフテリア毒素Ａ
ドメイン、シュードモナスエキソトキシンＡ、及びシュードモナスエキソトキシ
ンＡのＡドメインを含む毒性化合物に対する耐性を与える。
【００２０】 「ポリペプチド」とは、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン
酸化）にかかわらず、任意のアミノ酸の鎖を意味する。
【００２１】 「高ストリンジェンシー条件」とは、４０℃、２×ＳＳＣ中における少なくと
も４０ヌクレオチド長のＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを意味する
。高ストリンジェンシー条件の他の定義については、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌらの、
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、ｐｐ．６．３．１−６．３．６、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，１９９４（本明細書に参考文献として組み込まれ
る）を参照されたい。
【００２２】 「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然の状態でそれを伴う成分から分離
されたポリペプチド（例えば、Ｄｐｈ３ポリペプチドのようなポリペプチド）を
意味する。典型的には、天然の状態では共存しているタンパク質や天然の有機分
子が失われ、少なくとも６０重量％であるときにポリペプチドは実質的に純粋で
ある。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくと
も９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％がＤｐｈ３ポリペプチドで
ある。実質的に純粋なＤｐｈ３は、例えば、天然の採取源（例えば、真菌細胞）
からの抽出によって；Ｄｐｈ３ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によ
って；又はタンパク質を化学的に合成することによって取得し得る。純度は、例
えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミド電気泳動、又はＨＰＬＣ
分析による任意の適切な方法によって測定することができる。
【００２３】 「単離されたＤＮＡ」は、本発明のＤＮＡが由来した生物の天然に存在するゲ
ノムにおいて、該遺伝子に隣接する遺伝子がないＤＮＡを意味する。それ故、該
用語には、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミド若しくはウイルス中
に、又は原核細胞若しくは真核細胞のゲノムＤＮＡに取りこまれた、又は他の配
列とは無関係の独立した分子（例えば、ＰＣＲによって、又は制限エンドヌクレ
アーゼ消化によって産生されたｃＤＮＡ又はゲノム若しくはｃＤＮＡ断片）とし
て存在している組換えＤＮＡが含まれる。別のポリペプチド配列をコードするハ
イブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。
【００２４】 本発明は、既存の病原性微生物制御法に比べて顕著な進歩を与える。
【００２５】 第一に、化学物質に比べて、該方法は高度に選択的であり；標的微生物のみを
除去し、このため、微生物の生態系の保護的要素は損傷されずに残る。
【００２６】 第二に、採取後疾病を制御するために「拮抗的な（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ
）」生物的コントロールを与えるのとは異なり、本発明の方法は、標的生物を積
極的に死滅させ、このため、確立された感染を除去する上で、より成功が収めら
れると予測される。
【００２７】 第三に、クリフォネクトリア・パラシティカ（クリの胴枯れ病の原因因子）の
病原株を減弱させるためのハイポウイルス（ｈｙｐｏｖｉｒｕｓ）の使用とは異
なり、本明細書に記載した方法は、広く適用可能であり、様々な毒性化合物と株
を利用できる。適切なウイルスの同定又は感染性因子の限られた宿主域によって
は制限を受けない。
【００２８】 歳後に、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ４、又はＤＰＨ５の変異は、細胞増殖に
著しい影響を与えないので、キラー生物はたくましく増殖し、環境中で十分に振
機能すると予測される。
【００２９】 本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい態様に関する以下の記載から、及
び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００３０】 発明の詳細な記載 我々は、（１）望ましくない属性を有する微生物を選択的に標的とし；（２）
融合後に形成される細胞を死滅する化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、Ｄ
ＮＡ、又はＲＮＡ）を標的微生物中に導入する生物的制御方法を発見した。望ま
しくない属性には、病原性、及び過剰な又は望まれない増殖が含まれる。
【００３１】 本発明は、標的微生物と第二の微生物を融合させることによって、微生物又は
真菌のような標的微生物中に殺微生物化合物を選択的に搬送する方法を提供する
。第二の微生物は、搬送された殺微生物化合物が融合後に形成される微生物を死
滅させるので、キラー微生物と称される。
【００３２】 キラー微生物は、二つの重要な点で改変された。第一に、それは、微生物中で
毒性化合物を作るであろう、生合成酵素のような毒性化合物又は産物を発現する
ように改変された。毒性化合物には、それ自体毒性のある化合物（例えば、細菌
の毒素）、又は微生物の中で毒性化合物の産生をもたらす化合物（例えば、毒性
化合物の産生を引き起こす生合成酵素）が含まれる。毒性化合物をコードするＤ
ＮＡ又はＲＮＡは、染色体外に（例えば、プラスミド中に）、又は染色体ＤＮＡ
中に安定的に、キラー微生物（又は祖先）の中に導入され得る。何れのケースで
も、毒性化合物は、キラー微生物中で発現される。
【００３３】 第二に、キラー微生物は、毒性化合物に耐性のあるような態様で修飾された。
これは、例えば、野生型又は未修飾の微生物を毒性化合物に対して感受性のある
ようにする遺伝子の全部又は一部を変異又は除去することによってなされる。結
果として、修飾された微生物は、それ自体その効果に対して耐性がある。
【００３４】 ある種の使用においては、キラー株は、標的微生物の望ましくない特徴（例え
ば、病原性、迅速な又は望まれない増殖）を示さないような態様でも改変される
。あるいは、標的微生物との融合を行う非病原性微生物（非病原性の野生型）は
、キラー微生物用の始源生物（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）として使用され得る。
【００３５】 本方法の様々な態様では、標的微生物は、アブシジア種、アクチノマデュラ・
マデュラエ、アクチノミセス種、アレシェリア・ボイディー、アルテナリア種、
アンソプシス・デルトイディー、アファノミセス種、アポフィソミセス・エレカ
ンス、アルミラリア種、アルニウム・レオポリナム、アスペルギルス種、アウレ
オバシジウム・プルーランス、バシジオボーラス・ラナラム、バイポラーリス種
、ブラストミセス・デルマティティーディス、ボトリティス種、カンジダ種、セ
ントロスポラ種、セファロスポリウム種、セラトシスティス種、チャエトコニジ
ウム種、チャエトミウム種、クラドスポリウム種、コッシディオイデス・イミテ
ィス、コレトトリチャム種、コニディオボーラス種、コリネバクテリウム・テニ
ュイス、クリプトポリオプシス種、シリンドロクラジウム種、クリプトコッカス
種、クニンガメラ・ベルソレチアエ、カーブラリア種、ダクチラリア種、ディプ
ロディア種、エピデルモフィトン種、エピデルモフィトン・フロコッサム、エク
セロフィラム種、エクソフィアラ種、フォンセカエア種、ファルビア種、フサリ
ウム種、ゲオトリカム種、ギグナルディア種、ヘルミントスポリウム種、ヒスト
プラズマ種、レシトフォラ種、マクロフォミナ種、マデュレラ種、マグナポルセ
種、マラッセジア・ファーファ、ミクロスポラム種、モニリニア種、ムコール種
、マイコセントロスポラ・アセリナ、ネクトリア種、ノカルディア種、ウースポ
ラ種、オフィオボーラス種、ペシロミセス種、パラコッシディオイデス・ブラシ
リエンシス、ペニシリウム種、ファエオスクレラ・デマチオイデス、フェオアン
ネロミセス種、フィアレモニウム・オボベイタム、フィアロフォラ種、フリクタ
エナ種、フォーマ種、フォモプシス種、フィマトトリカム種、フィトフソラ種、
ピチアム種、ピエドライア・ホルタイ、ニューモシスチス・カリニ、プッシニア
種、ピチウム・インシディオサム、リノクラディエラ・アクアスペルサ、リゾム
コール・プシラス、リゾクトニア種、リゾパス種、サッカロミセス種、サクセナ
エア・バシフォルミス、サルシノミセス・フェオムリフォルミス、スセロチウム
種、スクレロチニア種、スファエロシカ種、スポロスリックス・シェンクイー、
シンセファラストラム・ラセモサム、テニオレラ・ボッピー、タフリナ種、チエ
ラビオプシス種、トルロプソシス種、トリコフィトン種、トリコスポロン種、ウ
ロクラジウム・チャータラム、ウスティラゴ種、ベンチュリア種、ベルチシリウ
ム種、ワンギエラ・デルマティティーディス、フェトキセリニア種、及びキシロ
ハイファ種のような真菌である。該方法は、特に、（１）それらの病原性形態に
おいて主として単一の交配型であり（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマ
ンス、ヒストプラズマ・カプスレイタム）；（２）発病のために融合を必要とす
る（例えば、ウスティラゴ・メイディスのような黒穂病）；（３）高頻度で異系
交配する（例えば、うどんこ病）；又は（４）限られた数のＶＣＧを有する（例
えば、フサリウム・シルシネータム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｉｒｃｉｎａｔｕｍ
））生物に適用し得る。
【００３６】 本明細書に記載された方法によれば、キラー株中で発現された毒性化合物は、
それに感受性のある（不活化するか、そうでなければ非機能的にされる）標的微
生物まで拡散し、その成分と接触する。同時に、標的細胞の細胞質は、キラー株
に毒性化合物への感受性を与えるのに必要な手段（例えば、酵素的機構）を供給
することができる。交配又は融合の結果として、毒性化合物は、融合された細胞
（例えば、融合した接合体）の生存／増殖に不可欠な一又は複数のプロセス（例
えば、タンパク質合成）を阻害し、細胞死が起こる。キラー株の特性 本発明の中心要素は、標的（例えば、病原性）種を破壊し、又は不活化するた
めの手段として、キラー株の天然の生理、及び融合を行おうとするその傾向を使
用することである。それ故、抗微生物活性のスペクトルは、キラーと標的株の生
理、パートナーの選別を制御する条件と決定因子、（交配型とＶＣＧを含む）交
配及び／又は融合現象の統合によって決定される。ある環境では、これらの決定
因子は、望ましくないほど制限的であり得る（例えば、病原性株中の多くのＶＣ
Ｇの存在）。それ故、一以上の不和合性の座の相違に耐えるキラー株（例えば、
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａのｔｏｌ変異体）を開発するこ
とが望ましいといい得る。
【００３７】 もし消費され、溶解され、又は接種されれば、キラー株が実質的に無毒である
ために、毒性化合物は、細胞膜を通過できないか、又は極めて限られた程度でし
か通過できないことが望ましい。該毒素は、細胞内で作用する。その結果、細胞
非透過性の毒性化合物を用いると、毒素が細胞の中に侵入する唯一の手段は、融
合時であろう。しかしながら、多くの糸状真菌の菌糸は、菌糸細胞間の分子の輸
送を可能とする隔壁中の小孔を特徴とするので、毒性化合物の移動から生じた細
胞死は、必ずしも細胞融合の部位に限定されない。それ故、極めて安定であり、
触媒的に作用する（ジフテリア毒素のような）毒素を使用することにより、単一
の融合現象の結果、菌糸の繊維全体を死滅させることが可能である。
【００３８】 生物的な制御因子として利用するためには、キラー株は、それ自体非病原性で
あるように工作され、又は弱毒化することも望ましい。これによって、病原体に
比して過剰のキラー株を用いて、感染した植物又は生物を処置することが可能と
なる。それらの病原性カウンターパートと融合を行ったキラー細胞は、死滅する
か、不活化されるであろう。融合を行わない、あるいは別のキラー細胞と融合し
たキラー細胞は、非病原性形態であり続け、表面的に増殖し、毒素感受性病原性
株による挑戦（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を待ち受ける。殺微生物化合物 キラー株中の殺微生物化合物は、細胞内で作用する様々な有毒生成物（例えば
、酵素、タンパク質、小分子）のうちの任意のものであり得る。好ましくは、毒
性化合物は、限られた程度でしか細胞膜を通過しないか、又は全く通過しない。
キラー細胞によって産生され得る毒性化合物には、ジフテリア毒素、ジフテリア
毒素Ｆ２断片、ジフテリア毒素Ａドメイン、シュードモナスエキソトキシンＡ、
又はシュードモナスエキソトキシンＡのＡドメインが含まれる。それらは、キラ
ー細胞中で個別に発現させることができ、あるいは、ニ以上を発現させることも
できる。毒性化合物をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは、公知の方法を用いて、適
切に修飾された野生型細胞中に導入される。例えば、それは、キラー株を産生す
るために微生物中に導入されるプラスミドのような発現ベクター中に組み込むこ
とができる。この場合には、導入されたＤＮＡ又はＲＮＡは、染色体外で発現さ
れる。あるいは、導入されたＤＮＡは、レシピエントのゲノムＤＮＡ中に取りこ
まれる。これは、例えば、相同性、非相同性、又は部位特異的組換えによって、
毒性化合物をコードするＤＮＡを宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に導入するベクター
によって実施し得る。その結果、毒性化合物の合成を誘導するＤＮＡは、ゲノム
の一部として保持される。本方法の適用 本発明の本方法、キラー細胞、及び毒素耐性株は、融合を行う任意の微生物に
対して広範な適用性を有する。それらは、微生物の選択的な生物的制御が望まれ
る広範な情況にも幅広く適用できる。例えば、可能性のある適用には、農業用穀
物（例えば、コーン、米、ゴム、タバコ等）又は観葉樹（例えば、ニレ、クリ）
の微生物感染の予防又は逆行性の治療；腐敗又はその他の損傷を引き起こす微生
物による果実及び野菜の採取後定着の予防；「シックハウス（ｓｉｃｋ ｂｕｉ
ｌｄｉｎｇ）」症候群に関与する揮発性有機化合物（ＶＯＣ；ｖｏｌａｔｉｌｅ
ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）を産生する微生物を除去するための換
気ユニットの予防的又は逆行性処置；及び微生物、特に病原型の微生物が定着又
は感染したヒト、ペット、又は家畜類の治療が含まれるが、これらに限定されな
い。
【００３９】 本発明は、以下の例によって説明されるが、これは如何なる意味においても限
定を意図するものではない。例１ 本態様では、キラー株は、標的酵母とは反対の交配型の酵母株である。キラー
株は、毒性化合物を発現し、毒性化合物に対して耐性があり、非病原性であるよ
うに修飾されている。例えば、キラー株は、毒性分子（例えば、ジフテリア毒素
、ジフテリア毒素Ｆ２断片、ジフテリア毒素Ａドメイン、シュードモナスエキソ
トキシンＡ、又はシュードモナスエキソトキシンＡのＡドメイン）を産生し、該
毒素に対して耐性となるように改変されている。キラー株は、ジフテリア毒素の
細胞内標的であるジフタミドの生合成に必要な遺伝子の欠失によって耐性型にし
得る。
【００４０】 この場合には、ジフテリア毒素耐性変異体は、制御されたプロモーター（ＧＡ
Ｌ−ＤＴ）下でジフテリア毒素を発現したときに生存している酵母株を選別する
ことによって単離された。ジフタミドの生合成をブロックした合計五つの遺伝子
中に変異が同定された（図１３〜２７）。これらの遺伝子のうち三つ（ＤＰＨ１
、ＤＰＨ３、及びＤＰＨ４）は、これまでに特性決定がなされておらず、それ故
、ジフタミドの生合成に関与していることは知られていなかった。さらに、本研
究の前には、ＤＰＨ３は、そのサイズが小さいために（８２アミノ酸の予想タン
パク質産物をコードする２４６ｂｐのＯＲＦ）、タンパク質をコードしている可
能性がある配列として認識されていなかった。（ここで同定された三つの新規な
遺伝子を含む）ＤＰＨ遺伝子の何れかに変異を有する株は、本明細書に記載され
た方法に適したジフテリア毒素の細胞内での非毒性発現、及びその他の応用を可
能とする。
【００４１】 具体的な例では、ＤＰＨ１遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、ｄｐｈ１：：Ｔ
ＲＰ１株を作るために、ＴＲＰ１マーカーＤＮＡと置き換えられた。該株は、ジ
フタミドを作らず、ジフテリア毒素を発現しながらでさえ、生存し、増殖するこ
とができる。標的酵母とキラー酵母は互いに混合又は接触することによって、そ
れらは融合する。続いて、核も融合して、二つの交配対の各々の合計に当たるゲ
ノムを有する二倍体の生物ができる。最初の細胞融合の結果、キラー株の細胞質
内部に含有された毒素は、標的細胞の毒素感受性成分まで拡散し、酵素的に不活
化させる。ジフテリア毒素を用いた記載例では、該毒素は、ジフタミド残基上の
翻訳伸長因子（ＥＦ−２；ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２）をＡＤＰ
リボシル化して該タンパク質を不活化し、その結果、タンパク質合成を阻害する
。同時に、標的細胞の細胞質は、キラー細胞の毒素耐性ＥＦ−２上にジフタミド
を合成し、それを毒素感受性型に転換する酵素的装置を与える。交配反応の結果
、毒素は、融合後に形成された微生物中でのタンパク質合成を阻害し、該融合の
結果生じた接合子の増殖の中止を引き起こし、最終的には細胞死を引き起こす。例２ 以下は、サッカロミセス・セレビシアエで行った実験である。類似の遺伝子と
標準的な方法を用いて、任意の微生物において類似の修飾を行うことができる。 毒素の発現 ジフテリア毒素Ｆ２断片は、ジフテリア毒素の触媒活性を含有しているので、
翻訳伸長因子２（ＥＦ−２）のジフタミド残基のＡＤＰリボシル化を触媒するの
に十分である。Ｆ２断片は、細胞表面受容体に結合するための、及び細胞膜を通
過するための決定因子を欠いている。該断片をコードするＤＮＡ配列は、ＥＦＴ
２遺伝子の転写開始及び終結領域の間に挿入された。これによって、Ｆ２断片に
相当するＤＮＡ配列の高レベルな、構成的転写、及び活性なＦ２タンパク質への
その後の翻訳が可能となる。この場合には、該ＥＦＴ２−ＤＴ−ＥＦＴ２融合物
は、酵母での染色体外複製を可能とするプラスミドベクター（ｐＲＳ３１３）中
に導入された。生物的制御因子を構築するために、該融合物は、より安定的に保
持されるように、好ましくは、キラー株のゲノム中に組み込まれ得る。 毒素耐性 ジフテリア毒素は、ジフタミド残基上のＥＦ−２のＡＤＰリボシル化を特異的
に触媒する。ジフタミドは、ＥＦ−２中にのみ見出されるユニークな翻訳後修飾
されたアミノ酸残基である。ジフタミドを作ることができない、又はジフタミド
のヒスチジン前駆体を欠く変異体は、毒素に対して耐性である。それ故、七つ以
上のうちの遺伝子の何れか一つ遺伝子の変異でも、ジフテリア毒素に対する耐性
を与えるのに十分である。これらは、ＥＦ−２をコードする遺伝子（二つの遺伝
子）、Ｄｐｈ１、Ｄｐｈ２、Ｄｐｈ３、Ｄｐｈ４、及びＤｐｈ５である。これら
の遺伝子の配列は、図３〜２７に示されている。ＤＰＨ遺伝子の何れか一つでも
欠失すれば、ほぼ完全にジフテリア毒素に対して耐性を与えるのに十分である。
変異又は欠失したコピーの数にかかわらず、あるＤＰＨ遺伝子の機能的コピーを
少なくとも一つ保有する株は毒素感受性となるように、毒素耐性表現型は完全に
劣性である。対照的に、毒素耐性を与えるＥＦ−２（ＥＦＴ１及びＥＦＴ２）を
コードする遺伝子の変異は、一般的に、優性形式の挙動を示し、このため、効率
的なキラー株の構築における有用性は劣る。ＤＰＨ３が変異又は欠失した株は、
遅い増殖、様々な薬物への高い感受性、および寒天基質の侵入欠損を含む（これ
らに限定されない）多面的な増殖欠損を示す。ｄｐｈ３変異株の多面的且つ顕著
な欠損は、病原性生物の細胞の生存性及び幾つかの増殖特性（例えば、基質侵入
）を減弱させつつ、同時に毒素に対する耐性を与えるので、キラー株のための優
れた変異候補である。あるいは、ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ４、及びＤＰＨ５
の変異は、生物が長期間の飢餓状態を生存する能力を損傷することが見出された
。後者の群の遺伝子の変異は、キラー株単独の発病性を弱めるには十分でないが
、それらは、該環境下でキラー株の持続性を効率的に制限するのに有用であり得
る。ｄｐｈ１、ｄｐｈ２、ｄｐｈ４、及びｄｐｈ５変異は、該微生物の増殖と交
配を顕著に損傷しないので、該環境下でよく機能すると予測されるであろう。図
３〜２７に示された配列は、ジフテリア毒素耐性を与えるために変異し得るサッ
カロミセス・セレビシアエの遺伝子を詳細に示している。さらに、ＤＮＡ配列デ
ータベースの分析は、様々な生物に、構造的に、そしておそらくは機能的に関連
した遺伝子が明確に存在することを明らかにしている（図２８〜３０）。 キラー及び標的株の構築及び交配 原型のキラー及び標的株をサッカロミセス・セレビシアエで構築した。キラー
株、ＴＭＹ４０１（ＭＡＴａ ｄｐｈ１：：ＴＰＲＰ１ ｕｒａ３−５２ ｌｅ
ｕ２−３ １１２ｈｉｓ３−１１、１５ｔｒｐ１−１ ａｄｅ２−１）を、ｐＴ
Ｍ１４７（ＥＦＴ２：ＤＴ：ＥＦＴ２ ＨＩＳ３ ＣＥＮ）で形質転換した。該
株も、ｐＴＭ１４７のＨＩＳ３マーカーの結果、Ｈｉｓ＋である。ＴＭＹ４０７
＜ｐＲＳ４２６＞は、サンプル標的株として選択した。それは、ＴＭＹ４０７（
ＭＡＴα ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−３ １１２ｈｉｓ３−１１、１５ｔｒｐ
６３ ａｄｅ２−１）を、ウラシル原栄養性を与えるｐＲＳ４２６（２μ ＵＲ
Ａ３）で形質転換することによって構築した。
【００４２】 キラー及び標的細胞を、それぞれＳＣ−Ｈｉｓ及びＳＣ−Ｕｒａ培地に植え継
ぎ、３０℃で一晩増殖させた。キラー及び標的株を混合し、（レプリカプレーテ
ィングによって）それらをリッチ培地（ＹＰＤ）に移すことによって、交配させ
た（すなわち、融合を行わせた）。３０℃で一晩インキュベートした後、続いて
、交配した二倍体の増殖を選別する培地（ＳＣ−Ｕｒａ、Ｈｉｓ）に交配混合物
を移した。二倍体は、二つの交配対の交差部位に、増殖するパッチ（多数のコロ
ニー）としてこれらのプレート上に出現する。一倍体の交配対は、Ｕｒａ又はＨ
ｉｓのうちの何れかの従属栄養性の結果、何れもＳＣ−Ｕｒａ、Ｈｉｓプレート
上では増殖しないであろう。図３１に示されているように、キラー株と標的株の
交点には生きた二倍体は殆ど出現しない。これに対して、キラー株をジフテリア
毒素に耐性なＵｒａ＋株ＴＭＹ４０３（ＭＡＴα ｄｐｈ１：：ＴＲＰ１ ｕｒ
ａ３−５２ ｌｅｕ２−３、１１２ｈｉｓ３−１１、１５ｔｒｐ１−１ ａｄｅ
２−１＜ＨＩＳ＞ ＣＥＮ）と交配すれば、健康な二倍体が容易に得られる。 ジフテリア毒素耐性真菌の生産 毒素に対して耐性があり、それ故、キラー株として有用である真菌を単離する
ことが可能である。ある例では、別の真菌に由来するサッカロミセス・セレビシ
アエのＤＰＨ遺伝子の任意の特異的相同体を単離した後に、相同遺伝子中に変異
を導入することによって該第二の真菌をキラー株に改変することができる。任意
のこのような遺伝子は、真菌ジフテリア毒素耐性を作るであろう。あるいは、毒
素耐性株を単離するために、本明細書に記載されている選別を使用することがで
きる。これらの株は、ＤＰＨ１、ＤＰＨ３、及びＤＰＨ４に相同な遺伝子を含む
本明細書に記載されたＤＰＨ遺伝子の一つに変異を含有しているらしい。
【００４３】 形質転換及び相同的組換え手法を含む遺伝子工学的方法が、多くの真菌で実施
されている（Ｐｕｎｔ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９２，２１６：４４７−４５７；Ｔｉｍｂｅｒｌａｋ
ｅ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４：１３１３
−１３１７；Ｆｉｎｃｈａｍ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９８９，５３：
１４８−１７０）。遺伝子欠失手法は、現在、カンジダ・アルビカンス（Ｆｏｎ
ｚｉ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９３，１３４：７１７−７
２８）、ウスティラゴ・メイディス（Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｈｏ
ｌｌｍａｎ，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９，９：４０５２−４０５
５；Ｂｏｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１
９９５，２４８：５４７−５５２）、ヤロウィワ・リポリティカ（Ｎｅｕｖｅｇ
ｌｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９９８，２１３：３７−４６；Ｃｈｅｎ
ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９
９７，４８：２３２−２３５；Ｃｏｒｄｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，４６：１４３−１４８）
、アクレモニウム・クリソジェナム（Ｓｋａｔｒｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒ
ｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９８７，１２：３３７−３４８；Ｗａｌｚ ａｎｄ Ｋｕｃ
ｋ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３，２４：４２１−４２７）、マグナポルセ
・グリージー（Ｓｗｅｉｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
．１９９２，２３２：１８３−１９０）；Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．１９９８，１７：３８３８−３８４９、ヒストプラズマ・カプスレイ
タム（Ｗｏｏｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８，１８
０：５１３５−５１４３）、及びアスペルギルス種（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ
．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８５，５：１７１４−１７２１；ｄｅ
Ｒｕｉｔｅｒ−Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９８
９，１６：１５９−１６３；Ｇｏｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ
．１９９５，２７：５３６−５４０；ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９６，２５１：５４２−５５０；
Ｄ‘Ｅｎｆｅｒｔ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９６，３０：７６−８２；Ｗｅ
ｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８，３３：３７８−
３８５）を含む（これらに限定されない）現在多くの真菌で実施されている。
【００４４】 他の態様 本発明は、特に、本発明の好ましい態様を参照しながら示され、記載されてい
るが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定されている本発明の
精神及び範囲から逸脱せずに、形態及び細部に様々な変化を加え得ることが理解
できるであろう。当業者であれば、一般的な作業、本明細書に具体的に記載され
た本発明の実施態様の多くの均等物のみを使用することを認識し、又は確認する
ことができるであろう。このような均等物は、特許請求の範囲に包含されること
が意図されている。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 交配と死亡（ＭＡＤ；Ｍａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｅ）手法と称する本方法の
模式図。
【図２】 ＥＦＴ２プロモーター（ＰＥＦＴ２）の制御下でジフテリア毒素Ｆ２断片（Ｄ
Ｔ Ｆ２）を発現するプラスミドｐＴＭ１４７の模式図（転写は、矢印で示され
ており、ＥＦＴ２転写終結配列（ＴＥＦＴ２）で終結する。ＡＲＳ／ＣＥＮは、
酵母での複製および分離のための配列を表し、ＨＩＳ３は、選択可能な栄養要求
性マーカーを表している。大腸菌での複製を可能とする配列も存在する（図示せ
ず））。
【図３】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ１）のＤＮＡ配列（配列番号１）、及び
ＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号２）（６９９番目の
アミノ酸残基（太字）は、ヒスチジンとしてリストされている）を示す図（成熟
した毒素Ｓタンパク質では、該ヒスチジンは、ＤＰＨ遺伝子産物によって、ジフ
テリア毒素の標的であるジフタミド残基に翻訳後修飾される）。
【図４】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ１）のＤＮＡ配列（配列番号１）、及
びＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号２）（６９９番目
のアミノ酸残基（太字）は、ヒスチジンとしてリストされている）を示す図（成
熟した毒素Ｓタンパク質では、該ヒスチジンは、ＤＰＨ遺伝子産物によって、ジ
フテリア毒素の標的であるジフタミド残基に翻訳後修飾される）。
【図５】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ１）のＤＮＡ配列（配列番号１）、及
びＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号２）（６９９番目
のアミノ酸残基（太字）は、ヒスチジンとしてリストされている）を示す図（成
熟した毒素Ｓタンパク質では、該ヒスチジンは、ＤＰＨ遺伝子産物によって、ジ
フテリア毒素の標的であるジフタミド残基に翻訳後修飾される）。
【図６】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ１）のＤＮＡ配列（配列番号１）、及び
ＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号２）（６９９番目の
アミノ酸残基（太字）は、ヒスチジンとしてリストされている）を示す図（成熟
した毒素Ｓタンパク質では、該ヒスチジンは、ＤＰＨ遺伝子産物によって、ジフ
テリア毒素の標的であるジフタミド残基に翻訳後修飾される）。
【図７】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ１）のＤＮＡ配列（配列番号１）、及び
ＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号２）（６９９番目の
アミノ酸残基（太字）は、ヒスチジンとしてリストされている）を示す図（成熟
した毒素Ｓタンパク質では、該ヒスチジンは、ＤＰＨ遺伝子産物によって、ジフ
テリア毒素の標的であるジフタミド残基に翻訳後修飾される）。
【図８】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ２）のＤＮＡ配列（配列番号３）、及び
ＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号４）（６９９番目の
アミノ酸残基（太字）は、ヒスチジンとしてリストされており、図３〜７に記載
したように翻訳後修飾される）を示す図（ＥＦＴ２遺伝子のＤＮＡは、ＥＦＴ１
遺伝子とは若干異なるが、同一のタンパク質をコードしている）。
【図９】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ２）のＤＮＡ配列（配列番号３）、及び
ＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号４）を示す図。
【図１０】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ２）のＤＮＡ配列（配列番号３）、及び
ＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号４）を示す図。
【図１１】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ２）のＤＮＡ配列（配列番号３）、及び
ＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号４）を示す図。
【図１２】 ＥＦ−２をコードする遺伝子（ＥＦＴ２）のＤＮＡ配列（配列番号３）、及び
ＥＦ−２タンパク質のコードされたアミノ酸配列（配列番号４）を示す図。
【図１３】 ＤＰＨ１遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）、及びこれから生じるＤｐｈ１の
アミノ酸配列（配列番号６）を示す図。
【図１４】 ＤＰＨ１遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）、及びこれから生じるＤｐｈ１の
アミノ酸配列（配列番号６）を示す図。
【図１５】 ＤＰＨ１遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）、及びこれから生じるＤｐｈ１の
アミノ酸配列（配列番号６）を示す図。
【図１６】 ＤＰＨ１遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）、及びこれから生じるＤｐｈ１の
アミノ酸配列（配列番号６）を示す図。
【図１７】 ＤＰＨ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号７）、及びこれから生じるＤｐｈ２の
アミノ酸配列（配列番号８）を示す図。
【図１８】 ＤＰＨ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号７）、及びこれから生じるＤｐｈ２の
アミノ酸配列（配列番号８）を示す図。
【図１９】 ＤＰＨ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号７）、及びこれから生じるＤｐｈ２の
アミノ酸配列（配列番号８）を示す図。
【図２０】 ＤＰＨ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号７）、及びこれから生じるＤｐｈ２の
アミノ酸配列（配列番号８）を示す図。
【図２１】 ＤＰＨ３遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号９）、及びこれから生じるＤｐｈ３の
アミノ酸配列（配列番号１０）を示す図。
【図２２】 ＤＰＨ３遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号９）、及びこれから生じるＤｐｈ３の
アミノ酸配列（配列番号１０）を示す図。
【図２３】 ＤＰＨ４遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１１）、及びこれから生じるＤｐｈ４
のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図。
【図２４】 ＤＰＨ４遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１１）、及びこれから生じるＤｐｈ４
のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図。
【図２５】 ＤＰＨ５遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１３）、及びこれから生じるＤｐｈ５
のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図。
【図２６】 ＤＰＨ５遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１３）、及びこれから生じるＤｐｈ５
アミノ酸配列（配列番号１４）を示す図。
【図２７】 ＤＰＨ５遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１３）、及びこれから生じるＤｐｈ５
アミノ酸配列（配列番号１４）を示す図。
【図２８】 ＤＰＨ遺伝子産物の構造的相同物の例を示す図（分析は、１９９８年２月に、
Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴデータベースサーチツールを用いて行われた（ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡ
ＳＴ／）。エントリーは、遺伝子（ＤＰＨ１、ＤＰＨ２、ＤＰＨ３、又はＤＰＨ
５）によって、配列のデータベースの出所（ＧｅｎＢａｎｋでの注釈か、又は発
現配列タグ（ＥＳＴ）として）によって、及びそこから単離された対応する種に
よってまとめられている。利用できる場合には、タンパク質産物の予想サイズが
、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号と共に示されている。相対的類似性は、観察された類
似性がランダムな偶然によって起こり得る確率（ｐ値）に対応する「スコア」に
よって表記されている）。
【図２９】 ＤＰＨ遺伝子産物の構造的相同物の例を示す図
【図３０】 ＤＰＨ遺伝子産物の構造的相同物の例を示す図。
【図３１】 ジフテリア毒素（ＤＴ；キラー＋ＤＴ）を発現しているキラー株と標的株（Ｔ
ａｒｇｅｔ）との交配、及び標的と毒素を発現していないキラー株（Ｋｉｌｌｅ
ｒ ｎｏ ＤＴ）と間の交配、毒素発現キラー株（Ｋｉｌｌｅｒ＋ＤＴ）と前記
標的の毒素Ｒ誘導体（ＴｏｘｉｎＲＴａｒｇｅｔ）間の交配；又は標的の毒素Ｒ 誘導体（ＴｏｘｉｎＲＴａｒｇｅｔ）と毒素を発現していないキラー株（Ｋｉｌ
ｌｅｒ ｎｏ ＤＴ）間の交配のうちの何れかの結果を示す写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/395 Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フィンク、ジェラルド・アール アメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02167 チェスナット・ヒル、アストン・ ロード 40

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第一の微生物を選択的に死滅させる方法であって ａ）前記第一の微生物を、殺微生物化合物を含有する第二の微生物と接触させ
    る工程と； ｂ）前記第一の微生物と前記第二の微生物とを融合させることにより、前記殺
    微生物化合物を前記融合後に形成される微生物の中に搬送して、該微生物を死滅
    させる工程と を備えた方法。
  2. 【請求項２】 前記第一の微生物が真菌である請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記真菌がサッカロミセス・セレビシアエである請求項２の
    方法。
  4. 【請求項４】 前記真菌が病原性真菌である請求項２の方法。
  5. 【請求項５】 前記病原性真菌が、アブシジア種、アクチノマデュラ・マデ
    ュラエ、アクチノミセス種、アレシェリア・ボイディー、アルテナリア種、アン
    ソプシス・デルトイディー、アファノミセス種、アポフィソミセス・エレカンス
    、アルミラリア種、アルニウム・レオポリナム、アスペルギルス種、アウレオバ
    シジウム・プルーランス、バシジオボーラス・ラナラム、バイポラーリス種、ブ
    ラストミセス・デルマティティーディス、ボトリティス種、カンジダ種、セント
    ロスポラ種、セファロスポリウム種、セラトシスティス種、チャエトコニジウム
    種、チャエトミウム種、クラドスポリウム種、コッシディオイデス・イミティス
    、コレトトリチャム種、コニディオボーラス種、コリネバクテリウム・テニュイ
    ス、クリプトポリオプシス種、シリンドロクラジウム種、クリプトコッカス種、
    クニンガメラ・ベルソレチアエ、カーブラリア種、ダクチラリア種、ディプロデ
    ィア種、エピデルモフィトン種、エピデルモフィトン・フロコッサム、エクセロ
    フィラム種、エクソフィアラ種、フォンセカエア種、ファルビア種、フサリウム
    種、ゲオトリカム種、ギグナルディア種、ヘルミントスポリウム種、ヒストプラ
    ズマ種、レシトフォラ種、マクロフォミナ種、マデュレラ種、マグナポルセ種、
    マラッセジア・ファーファ、ミクロスポラム種、モニリニア種、ムコール種、マ
    イコセントロスポラ・アセリナ、ネクトリア種、ノカルディア種、ウースポラ種
    、オフィオボーラス種、ペシロミセス種、パラコッシディオイデス・ブラシリエ
    ンシス、ペニシリウム種、ファエオスクレラ・デマチオイデス、フェオアンネロ
    ミセス種、フィアレモニウム・オボベイタム、フィアロフォラ種、フリクタエナ
    種、フォーマ種、フォモプシス種、フィマトトリカム種、フィトフソラ種、ピチ
    アム種、ピエドライア・ホルタイ、ニューモシスチス・カリニ、プッシニア種、
    ピチウム・インシディオサム、リノクラディエラ・アクアスペルサ、リゾムコー
    ル・プシラス、リゾクトニア種、リゾパス種、サッカロミセス種、サクセナエア
    ・バシフォルミス、サルシノミセス・フェオムリフォルミス、スセロチウム種、
    スクレロチニア種、スファエロシカ種、スポロスリックス・シェンクイー、シン
    セファラストラム・ラセモサム、テニオレラ・ボッピー、タフリナ種、チエラビ
    オプシス種、トルロプソシス種、トリコフィトン種、トリコスポロン種、ウロク
    ラジウム・チャータラム、ウスティラゴ種、ベンチュリア種、ベルチシリウム種
    、ワンギエラ・デルマティティーディス、フェトキセリニア種、及びキシロハイ
    ファ種からなる群から選択される請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 前記化合物が、毒性化合物又は融合後に形成される前記微生
    物中で毒性化合物の産生を引き起こす化合物である請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 前記毒性化合物が、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ｆ２断
    片、ジフテリア毒素Ａドメイン、シュードモナスエキソトキシンＡ、及びシュー
    ドモナスエキソトキシンＡのＡドメインからなる群から選択される毒素又はその
    断片である請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 前記第二の微生物が前記殺微生物化合物に耐性を有する請求
    項１の方法。
  9. 【請求項９】 前記化合物が、融合後に形成される前記微生物中で毒性化合
    物の産生を引き起こす生合成酵素である請求項６の方法。
  10. 【請求項１０】 前記第二の微生物が非病原性真菌である請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 前記第二の微生物がサッカロミセス・セレビシアエである
    請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 前記融合が前記第一の微生物と前記第二の微生物の交配か
    ら生じる請求項１の方法。
  13. 【請求項１３】 前記融合が前記第一の生物と前記第二の微生物の吻合から
    生じる請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】 真菌をジフテリア毒素耐性にする方法であって、前記真菌
    のＤＰＨ１、ＤＰＨ３、又はＤＰＨ４遺伝子にジフサミドの生合成を減少させる
    変異を導入する工程を備え、前記真菌が、アブシジア種、アクチノマデュラ・マ
    デュラエ、アクチノミセス種、アレシェリア・ボイディー、アルテナリア種、ア
    ンソプシス・デルトイディー、アファノミセス種、アポフィソミセス・エレカン
    ス、アルミラリア種、アルニウム・レオポリナム、アスペルギルス種、アウレオ
    バシジウム・プルーランス、バシジオボーラス・ラナラム、バイポラーリス種、
    ブラストミセス・デルマティティーディス、ボトリティス種、カンジダ種、セン
    トロスポラ種、セファロスポリウム種、セラトシスティス種、チャエトコニジウ
    ム種、チャエトミウム種、クラドスポリウム種、コッシディオイデス・イミティ
    ス、コレトトリチャム種、コニディオボーラス種、コリネバクテリウム・テニュ
    イス、クリプトポリオプシス種、シリンドロクラジウム種、クリプトコッカス種
    、クニンガメラ・ベルソレチアエ、カーブラリア種、ダクチラリア種、ディプロ
    ディア種、エピデルモフィトン種、エピデルモフィトン・フロコッサム、エクセ
    ロフィラム種、エクソフィアラ種、フォンセカエア種、ファルビア種、フサリウ
    ム種、ゲオトリカム種、ギグナルディア種、ヘルミントスポリウム種、ヒストプ
    ラズマ種、レシトフォラ種、マクロフォミナ種、マデュレラ種、マグナポルセ種
    、マラッセジア・ファーファ、ミクロスポラム種、モニリニア種、ムコール種、
    マイコセントロスポラ・アセリナ、ネクトリア種、ノカルディア種、ウースポラ
    種、オフィオボーラス種、ペシロミセス種、パラコッシディオイデス・ブラシリ
    エンシス、ペニシリウム種、ファエオスクレラ・デマチオイデス、フェオアンネ
    ロミセス種、フィアレモニウム・オボベイタム、フィアロフォラ種、フリクタエ
    ナ種、フォーマ種、フォモプシス種、フィマトトリカム種、フィトフソラ種、ピ
    チアム種、ピエドライア・ホルタイ、ニューモシスチス・カリニ、プッシニア種
    、ピチウム・インシディオサム、リノクラディエラ・アクアスペルサ、リゾムコ
    ール・プシラス、リゾクトニア種、リゾパス種、サッカロミセス種、サクセナエ
    ア・バシフォルミス、サルシノミセス・フェオムリフォルミス、スセロチウム種
    、スクレロチニア種、スファエロシカ種、スポロスリックス・シェンクイー、シ
    ンセファラストラム・ラセモサム、テニオレラ・ボッピー、タフリナ種、チエラ
    ビオプシス種、トルロプソシス種、トリコフィトン種、トリコスポロン種、ウロ
    クラジウム・チャータラム、ウスティラゴ種、ベンチュリア種、ベルチシリウム
    種、ワンギエラ・デルマティティーディス、フェトキセリニア種、及びキシロハ
    イファ種からなる群から選択される方法。
  15. 【請求項１５】 前記遺伝子が、高ストリンジェンシーで、サッカロミセス
    ・セレビシアエのＤＰＨ１、ＤＰＨ３、又はＤＰＨ４にハイブリダイズし、且つ
    ＤＰＨ生物活性を有する請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 ＤＰＨ１、ＤＰＨ３、又はＤＰＨ４遺伝子中に、ジフタミ
    ドの生合成を減少させる変異を含有しているジフテリア毒素耐性真菌であって、
    前記真菌が、アブシジア種、アクチノマデュラ・マデュラエ、アクチノミセス種
    、アレシェリア・ボイディー、アルテナリア種、アンソプシス・デルトイディー
    、アファノミセス種、アポフィソミセス・エレカンス、アルミラリア種、アルニ
    ウム・レオポリナム、アスペルギルス種、アウレオバシジウム・プルーランス、
    バシジオボーラス・ラナラム、バイポラーリス種、ブラストミセス・デルマティ
    ティーディス、ボトリティス種、カンジダ種、セントロスポラ種、セファロスポ
    リウム種、セラトシスティス種、チャエトコニジウム種、チャエトミウム種、ク
    ラドスポリウム種、コッシディオイデス・イミティス、コレトトリチャム種、コ
    ニディオボーラス種、コリネバクテリウム・テニュイス、クリプトポリオプシス
    種、シリンドロクラジウム種、クリプトコッカス種、クニンガメラ・ベルソレチ
    アエ、カーブラリア種、ダクチラリア種、ディプロディア種、エピデルモフィト
    ン種、エピデルモフィトン・フロコッサム、エクセロフィラム種、エクソフィア
    ラ種、フォンセカエア種、ファルビア種、フサリウム種、ゲオトリカム種、ギグ
    ナルディア種、ヘルミントスポリウム種、ヒストプラズマ種、レシトフォラ種、
    マクロフォミナ種、マデュレラ種、マグナポルセ種、マラッセジア・ファーファ
    、ミクロスポラム種、モニリニア種、ムコール種、マイコセントロスポラ・アセ
    リナ、ネクトリア種、ノカルディア種、ウースポラ種、オフィオボーラス種、ペ
    シロミセス種、パラコッシディオイデス・ブラシリエンシス、ペニシリウム種、
    ファエオスクレラ・デマチオイデス、フェオアンネロミセス種、フィアレモニウ
    ム・オボベイタム、フィアロフォラ種、フリクタエナ種、フォーマ種、フォモプ
    シス種、フィマトトリカム種、フィトフソラ種、ピチアム種、ピエドライア・ホ
    ルタイ、ニューモシスチス・カリニ、プッシニア種、ピチウム・インシディオサ
    ム、リノクラディエラ・アクアスペルサ、リゾムコール・プシラス、リゾクトニ
    ア種、リゾパス種、サッカロミセス種、サクセナエア・バシフォルミス、サルシ
    ノミセス・フェオムリフォルミス、スセロチウム種、スクレロチニア種、スファ
    エロシカ種、スポロスリックス・シェンクイー、シンセファラストラム・ラセモ
    サム、テニオレラ・ボッピー、タフリナ種、チエラビオプシス種、トルロプソシ
    ス種、トリコフィトン種、トリコスポロン種、ウロクラジウム・チャータラム、
    ウスティラゴ種、ベンチュリア種、ベルチシリウム種、ワンギエラ・デルマティ
    ティーディス、フェトキセリニア種、及びキシロハイファ種からなる群から選択
    されるジフテリア毒素耐性真菌。
  17. 【請求項１７】 前記遺伝子が、高ストリンジェンシーで、サッカロミセス
    ・セレビシアエのＤＰＨ１、ＤＰＨ３、又はＤＰＨ４にハイブリダイズし、且つ
    ＤＰＨ生物活性を有する請求項１６の微生物。
  18. 【請求項１８】 実質的に純粋なＤｐｈ３ポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 前記Ｄｐｈ３ポリペプチドのアミノ酸配列が、図７のアミ
    ノ酸配列（配列番号１０）と少なくとも５５％同一であり、且つＤＰＨ生物活性
    を有する請求項１８のＤｐｈ３ポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 前記Ｄｐｈ３ポリペプチドが真菌のＤｐｈ３ポリペプチド
    である請求項１８のポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 前記真菌が酵母である請求項２０のポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 前記酵母がサッカロミセス・セレビシアエのポリペプチド
    。
  23. 【請求項２３】 前記ポリペプチドがＤＰＨ生物活性を有する請求項１８の
    ポリペプチド。
  24. 【請求項２４】 Ｄｐｈ３ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。
  25. 【請求項２５】 前記ＤＮＡが図７のＤＰＨ３遺伝子（配列番号９）を含む
    請求項２４のＤＮＡ。
  26. 【請求項２６】 前記ＤＮＡがサッカロミセス・セレビシアエのＤＰＨ３変
    異を相補する請求項２４のＤＮＡ。
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