JP2002511583A - Methods and apparatus for electroelution of biological samples - Google Patents
Methods and apparatus for electroelution of biological samplesInfo
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Abstract
(57)【要約】 核酸物質及び例えばタンパク質といった非核酸物質の両者を含む生物学的サンプルを、液体媒体中の電場の作用の下で処理する方法の提供。 (57) Abstract: A method is provided for treating a biological sample containing both a nucleic acid material and a non-nucleic acid material such as a protein under the action of an electric field in a liquid medium.
Description
【０００１】[0001]
本発明は、細胞溶解物からの核酸分画の電気分離のための方法、並びに上記電
気分離法を実施するための特に単一の使用のためのいずれかの装置に関する。The present invention relates to a method for the electroseparation of a nucleic acid fraction from a cell lysate, as well as any device for performing said electroseparation method, especially for a single use.
【０００２】[0002]
細胞溶解物から核酸物質又は核酸分画を分離することを目的とした、各種の方
法並びに装置が、現在までに提供または記載されている。Various methods and devices have been provided or described to date for separating nucleic acid substances or nucleic acid fractions from cell lysates.
【０００３】 「分離」は、媒体を富化若しくは濃縮、あるいは少なくとも一つの核酸物質、
つまりデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）を複合媒
体中で単離若しくは測定（低質的及び／または定量的）可能であるいずれかの方
法を一般的に意味するように解される。[0003] "Separation" refers to enriching or enriching a medium, or at least one nucleic acid substance,
That is, it is understood to generally mean any method capable of isolating or measuring (low quality and / or quantitative) deoxyribonucleic acid (DNA) and / or ribonucleic acid (RNA) in a complex medium. .
【０００４】 ISCO Application (Bulletin 54, "Electroelution of Nucleic Acids and Pr
oteins from Gels, and Electrophoretic Concentration of Macromolecules 19
89)と称されるISCO社の文書のみならず、US-C-4,164,464に従って、以下のもの
を含む電気溶出であるが電気分離ではないものが記載されている： − それぞれが浸透性の膜によって閉ざされた二つの相対する区画を含む、第一
の緩衝液のための第一の容器であって、一方は大きい断面を有し他方は小さい断
面を有し、それぞれが興味ある核酸またはタンパク質物質を維持可能であるカッ
トオフを有する、 − 上記膜によって第一の容器から分離された、第一の緩衝液と同一または異な
る第二の緩衝液のための第二の容器、 − 大きい断面を有する区画から小さい断面を有する区画へと、二つの浸透可能
な膜を通じて電場を生産し、それによって第一の緩衝液を通過させる、第二の緩
衝液と電気的に接触する二つの電極。[0004] ISCO Application (Bulletin 54, "Electroelution of Nucleic Acids and Pr
oteins from Gels, and Electrophoretic Concentration of Macromolecules 19
In accordance with US-C-4,164,464, not only the ISCO document referred to as 89), but also electroelution but not electroseparation, which includes:-each with a permeable membrane A first container for a first buffer, comprising two opposing compartments closed, one having a large cross section and the other having a small cross section, each of which is a nucleic acid or protein substance of interest. A second container for a second buffer, the same as or different from the first buffer, separated from the first container by the membrane, having a large cross section Two electrodes in electrical contact with a second buffer, producing an electric field through the two permeable membranes from the compartment to a compartment having a small cross-section, thereby passing the first buffer.
【０００５】 この装置は、核酸またはタンパク質分画を濃縮するように作用するが、その分
画は大きな断面の膜に配置され、同じもので回収することによって既に比較的精
製されているが希釈されており、小さな断面を有する膜で濃縮される。小さな断
面を有する膜のレベルで濃縮される、電場パターンによる生体分子の輸送のため
、濃縮物が得られる。[0005] This device acts to concentrate the nucleic acid or protein fraction, which fraction is placed on a large cross-section membrane and is relatively purified but diluted by collection with the same. And is concentrated in membranes with small cross sections. A concentrate is obtained for the transport of biomolecules by an electric field pattern, which is concentrated at the level of a membrane with a small cross section.
【０００６】 それ故、それは上述の定義の意味を有する、つまり複合的な媒体で開始し、興
味ある生体物質を分離または単離する意味を有する分離法及び分離装置ではない
。[0006] It is therefore not a separation method and apparatus having the meaning defined above, ie starting with a complex medium and having the meaning of separating or isolating a biological substance of interest.
【０００７】 文献US-C- 5,415,758の図５に従って、ミクロタイタープレート４１の複数の
ウェル４２の内部の平行な電気溶出法が記載されている。プレート４１を緩衝液
５２に浸し、緩衝液は各ウェル４２内を浸さないようにし、そして各ウェルは、
その底部に設けられた開口部５４を覆う膜５３を含み、浸透伝導が、緩衝液５２
と各ウェル４２に配置された緩衝液５５の間で確立できる。多様なウェル４２と
唯一の陽極１４の間に配置された陰極２４によって、各ウェル４２に電場が確立
される。例えば多孔性の支持体に配置された血液の小滴といった核酸物質を含む
生物学的サンプル４４を、核酸物質が各ウェルに溶解または配置されるように電
気的なフローによって溶出し、引き続き例えばピペットを使用して回収する。According to FIG. 5 of document US Pat. No. 5,415,758, a parallel electroelution method inside a plurality of wells 42 of a microtiter plate 41 is described. Plate 41 is immersed in buffer 52, buffer is not immersed in each well 42, and each well is
A membrane 53 covering an opening 54 provided at the bottom thereof;
And the buffer 55 arranged in each well 42. An electric field is established in each well 42 by the cathode 24 located between the various wells 42 and only one anode 14. A biological sample 44 containing nucleic acid material, e.g., a blood droplet placed on a porous support, is eluted by electrical flow such that the nucleic acid material is dissolved or placed in each well, followed by, for example, pipetting. Use to collect.
【０００８】 一般的に、文献US-C-5,415,758は、核酸物質及び例えばタンパク質といった非
核酸物質の両者を含む生物学的サンプルを、液体媒体中の電場の作用の下で処理
する方法を記載し、上記物質は電場の作用の下で上記液体媒体中で遊離し可動的
であり、該方法は以下の工程に従う： ａ）緩衝液を提供する、 ｂ）緩衝液と一方で接触し、上記緩衝液の側で、電場の作用の下での移動の間、
核酸材料を停止するようにカットオフを所定の位置に規定させる、浸透性の膜を
提供し、 ｃ）上記電場パターンが緩衝液の内部を通過し、浸透性の膜を通過するように、
上記電場を確立し、 ｄ）電場の作用の下で核酸物質の循環の向きで、膜の上流に、生物学的サンプル
を緩衝液中に配置する。In general, the document US-C-5,415,758 describes a method for treating a biological sample containing both nucleic acid substances and non-nucleic acid substances, for example proteins, under the action of an electric field in a liquid medium. The substance is free and mobile in the liquid medium under the action of an electric field, the method according to the following steps: a) providing a buffer, b) contacting one side with a buffer and the buffer On the side of the liquid, during movement under the action of an electric field,
Providing a permeable membrane that defines a cut-off in place to stop the nucleic acid material; c) such that the electric field pattern passes through the interior of the buffer and through the permeable membrane;
Establishing the electric field d) placing the biological sample in a buffer, upstream of the membrane, in the direction of circulation of the nucleic acid material under the action of the electric field.
【０００９】 実際、上記方法は、例えばタンパク質といった全ての非核酸物質実践的に除去
する目的で、生物学的サンプル中の核酸物質を分離することは可能ではない。In fact, the above method does not make it possible to separate nucleic acid material in a biological sample with the aim of practically removing all non-nucleic acid material, for example proteins.
【００１０】 他方で、核酸物質を分離する目的のために、国際特許出願WO 97/41219の下で
印刷された特許出願が周知であり、該文献は、例えば溶解された細胞より成る混
合物から核酸を捕捉する方法を開示する。該方法は、混合物中に電極を配置し、
電極に核酸を引きつけることが可能な電圧をかけ、次いで核酸で被覆された電極
を取り出すことを必要とする。次いで核酸で被覆された電極を、逆の電流により
、直接的に増幅可能な核酸を放出することが可能な溶液に浸す。増幅を実施可能
にするために適用される電圧は、好ましくは０．５から３ボルトで約３０秒間で
ある。この方法は、加熱によって溶解された大腸菌細胞に含まれるプラスミドを
分視するためには有用であるが、特に生物学的サンプルから得られるより複雑な
細胞溶解物中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを分離するためには適さない。[0010] On the other hand, for the purpose of separating nucleic acid material, patent applications printed under International Patent Application WO 97/41219 are well known, which include, for example, nucleic acids from mixtures consisting of lysed cells. Disclosed is a method of capturing The method comprises placing an electrode in the mixture,
It is necessary to apply a voltage capable of attracting the nucleic acid to the electrode, and then remove the electrode coated with the nucleic acid. The electrode coated with nucleic acids is then immersed in a solution capable of releasing nucleic acids that can be directly amplified by a reverse current. The voltage applied to enable amplification is preferably at 0.5 to 3 volts for about 30 seconds. This method is useful for visualizing plasmids contained in E. coli cells lysed by heating, but is particularly useful for separating DNA and / or RNA in more complex cell lysates obtained from biological samples. Not suitable for doing.
【００１１】 文献WO 97/34908の図１に従って、以下の二工程で生物学的サンプルから核酸
物質を分離する方法が記載される： − 第一の工程は、核酸物質を別に結合するように、溶解された生物学的サンプ
ルを吸着剤と接触させることより成り、 − 第二の工程は、吸着剤からこの核酸物質を放出することより成る。According to FIG. 1 of document WO 97/34908, a method for separating nucleic acid material from a biological sample in two steps is described: the first step is to bind the nucleic acid material separately, Contacting the lysed biological sample with the adsorbent, the second step comprising releasing the nucleic acid material from the adsorbent.
【００１２】 放出のため、二つの電極２０ａ及び２０ｂの間の電場にかけられる緩衝液が、
容器１０に提供される。緩衝液で浸されていない別の容器１５は、容器１０に配
置される。この容器は、電場の下で核酸材料の移動を停止することが可能な膜３
０を配置した孔１２を通過して、容器１０の台と連絡する。核酸材料を回収する
ためのウェル６０はこの孔の近傍に位置し、容器１５の一部１７に、核酸物質を
放出することが所望される吸着構成要素が配置される。A buffer, which is subjected to an electric field between the two electrodes 20a and 20b for release,
Provided in container 10. Another container 15 that is not soaked with buffer is placed in container 10. This container has a membrane 3 capable of stopping the movement of nucleic acid material under an electric field.
It communicates with the table of the container 10 through the hole 12 in which 0 is arranged. A well 60 for recovering nucleic acid material is located near this hole, and in part 17 of the container 15 an adsorbent component from which it is desired to release nucleic acid material is located.
【００１３】 この発明の目的として、この方法は、複雑な細胞溶解物で開始する、特にタン
パク質といった非核酸物質から核酸物質を、単純で有効な態様で分離することこ
とが可能であるとは思われない。[0013] For the purposes of the present invention, it is believed that the method is capable of separating nucleic acid substances from non-nucleic acid substances, especially proteins, in a simple and efficient manner, starting with complex cell lysates. I can't.
【００１４】[0014]
本発明は、この未解決の問題に対する回答を提供することを提案する。 The present invention proposes to provide an answer to this open question.
【００１５】[0015]
本発明に従って、少なくとも核酸物質が、液体媒体中の電場の作用の下で直接
生物学的サンプルを処理し、引き続き以下の条件を選択することによって、生物
学的サンプルから有効に電気分離できることが発見された： − 電場は、一方で緩衝液の側の核酸物質の存在を、核酸物質を停止する膜上に
到達させるのに十分な時間によって、他方で上記間の最後で非核酸物質が移動せ
ず、上記膜の側に移動する工程に依然としてあるという事実によって、制限され
定義される期間、緩衝液中の生物学的サンプルに直接適用される、 − 核酸物質は、上記期間の最後で回収される。In accordance with the present invention, it has been discovered that at least nucleic acid material can be effectively electroseparated from a biological sample by treating the biological sample directly under the action of an electric field in a liquid medium and subsequently selecting the following conditions: The electric field is moved by the time sufficient to allow, on the one hand, the presence of the nucleic acid substance on the side of the buffer to reach the membrane which stops the nucleic acid substance, and, on the other hand, the non-nucleic acid substance at the end between the above. And directly applied to the biological sample in the buffer for a limited and defined period of time due to the fact that it is still in the process of moving to the side of the membrane, the nucleic acid material being recovered at the end of the period You.
【００１６】[0016]
本発明において「電気分離」なる用語は、同一の電荷を有する媒体中で共に存
在する分子が、同じ電場でのそれぞれのその多様な速度のため、上記媒体中で互
いに区別されることを意味するように解される。In the context of the present invention, the term "electroseparation" means that molecules which are present together in a medium with the same charge are distinguished from each other in said medium because of their respective velocities in the same electric field. It is understood as follows.
【００１７】 本発明に従った方法は、他の構成成分、特にタンパク質を含まない核酸分画を
迅速且つ容易に取得し、それが細胞溶解物から直接増幅可能であるという必須の
利点を提供する。増幅法に結びつく難点として、特に呼吸タイプのサンプルにつ
いて、増幅されるサンプルがインヒビターを含まない必要があるということが周
知である。本発明に従った方法を使用して、増幅法におけるタンパク質インヒビ
ターは、実質的に除去される。The method according to the invention offers the essential advantage that a nucleic acid fraction free of other components, in particular protein, is obtained quickly and easily and can be amplified directly from cell lysates. . It is well known that the difficulty associated with the amplification method, especially for respiratory-type samples, is that the sample to be amplified must be free of inhibitors. Using the method according to the invention, protein inhibitors in the amplification method are substantially eliminated.
【００１８】 本発明に従った方法を使用して取得される、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む
核酸物質で富化された分画は、特にＤＮＡについてのＰＣＲ法、及びＲＮＡにつ
いてのＮＡＳＢＡ若しくはＴＭＡ法のような、一般的に使用される方法によって
直接増幅できる。The fraction enriched with nucleic acid material containing DNA and / or RNA, obtained using the method according to the invention, is especially suitable for the PCR method for DNA, and the NASBA or TMA method for RNA. Can be directly amplified by a commonly used method such as
【００１９】 本発明に従った別の実施態様において、生物学的サンプルは、緩衝液と接触す
る後者の側で、別の膜上に配置される。In another embodiment according to the invention, the biological sample is placed on a separate membrane, on the latter side in contact with the buffer.
【００２０】 本発明に従った好ましい実施態様として、電場を適用する時間は、多くとも３
０分、好ましくは５から３０分の間である。In a preferred embodiment according to the invention, the time for applying the electric field is at most 3
0 minutes, preferably between 5 and 30 minutes.
【００２１】 本発明に従った非常に好ましい実施態様として、核酸分画の移動の継続時間は
、１０から２０分、より好ましくは１５分である。In a very preferred embodiment according to the invention, the duration of the transfer of the nucleic acid fraction is between 10 and 20 minutes, more preferably 15 minutes.
【００２２】 本発明に従った好ましい実施態様として、緩衝液のモル濃度の値は、少なくと
も０．１ｍｏｌ／ｌに等しい、好ましくは０．１から５ｍｏｌ／ｌの間である。In a preferred embodiment according to the invention, the molarity value of the buffer is at least equal to 0.1 mol / l, preferably between 0.1 and 5 mol / l.
【００２３】 緩衝液のモル濃度が０．１から５ｍｏｌ／ｌの間である場合、両区か国同じ緩
衝液のみを配置すること、または両区画に二つの異なる緩衝液を配置することの
いずれかが有効に可能である。When the molarity of the buffer is between 0.1 and 5 mol / l, either only the same buffer is placed in both compartments or two different buffers are placed in both compartments. Is effectively possible.
【００２４】 緩衝液のモル濃度は、両区画で同じでもよく、０．１から１ｍｏｌ／ｌの間、
好ましくは０．１ｍｏｌ／ｌであろう。The molarity of the buffer may be the same in both compartments, between 0.1 and 1 mol / l,
Preferably it will be 0.1 mol / l.
【００２５】 緩衝液のモル濃度は、両区画で異なってもよく、それぞれ第一の区画で０．１
ｍｏｌ／ｌ、第二の区画で１ｍｏｌ／ｌであろう。The molarity of the buffer may be different in both compartments, each being 0.1 in the first compartment.
mol / l, 1 mol / l in the second compartment.
【００２６】 本発明の好ましい実施態様として、電場は１００から２５０Ｖの間の値、好ま
しくは１５０Ｖを有する。In a preferred embodiment of the invention, the electric field has a value between 100 and 250 V, preferably 150 V.
【００２７】 本発明に従った別の非常に好ましい実施態様において、電場パターンに引き続
く、浸透性の膜から生物学的サンプルを分離する距離は、少なくとも３０ｍｍ、
好ましくは７５ｍｍである。In another highly preferred embodiment according to the invention, the distance separating the biological sample from the permeable membrane following the electric field pattern is at least 30 mm,
Preferably it is 75 mm.
【００２８】 本発明に従った方法を実施する細胞溶解物は、単純な培養物、若しくは異なる
細胞を含む複雑な培養物から得た細胞溶解物であってもよく、または特に血液、
尿、及び呼吸タイプの痰のような生物学的サンプルでもよい。The cell lysate for practicing the method according to the invention may be a simple culture or a cell lysate obtained from a complex culture comprising different cells, or in particular blood,
Biological samples such as urine and respiratory-type sputum may be used.
【００２９】 本発明に従った方法にかけられる核酸分画が得られる細胞溶解物は、特に機械
的ショックを使用する溶解、電気ショックを使用する溶解等のような異なる溶解
法によって得られてもよい。The cell lysate from which the nucleic acid fraction is subjected to the method according to the invention may be obtained by different lysis methods, such as lysis using mechanical shock, lysis using electric shock and the like. .
【００３０】 本発明に従った好ましい実施態様として、生物学的サンプルは、特に機械的ま
たは電気的経路によって、細胞サンプルの溶解物から直接生じる。この実施態様
は、以下に記載されるものと同じ装置で実施される。In a preferred embodiment according to the invention, the biological sample is derived directly from the lysate of the cell sample, in particular by a mechanical or electrical route. This embodiment is implemented on the same device as described below.
【００３１】 本発明に従った別の好ましい実施態様において、細胞溶解物は、例えば血液ま
たは呼吸の痰のような体液のサンプルから得られる。In another preferred embodiment according to the invention, the cell lysate is obtained from a sample of a body fluid, for example blood or respiratory sputum.
【００３２】 生物学的サンプルが血液の場合、緩衝液のｐＨは好ましくは７である。When the biological sample is blood, the pH of the buffer is preferably 7.
【００３３】 核酸物質で富化された分画を回収する膜は、所定のカットオフ、このましくは
１００ｋＤａ以下のカットオフを有する。The membrane from which the fraction enriched in nucleic acid material is collected has a predetermined cutoff, preferably a cutoff of 100 kDa or less.
【００３４】 生物学的サンプルが血液である場合、陰極での膜の孔度は、好ましくは１０ｋ
Ｄａより大きい。When the biological sample is blood, the porosity of the membrane at the cathode is preferably 10 k
It is larger than Da.
【００３５】 本発明に従った好ましい実施態様として、プロテイナーゼが生物学的サンプル
に加えられる。In a preferred embodiment according to the invention, a proteinase is added to the biological sample.
【００３６】 本発明に従ったさらに別の実施態様として、核酸物質で富化された分画は、後
の増幅工程に直接かけられる。[0036] In yet another embodiment according to the present invention, the fraction enriched in nucleic acid material is directly subjected to a subsequent amplification step.
【００３７】 細胞溶解物は、プロテイナーゼＫおよび界面活性剤の存在下での電気的溶解に
よって、より好ましくは実施される。The cell lysate is more preferably performed by electrolysis in the presence of proteinase K and a detergent.
【００３８】 本発明に従った第二の主題は、本発明に従った方法を実施するための単一の使
用のための装置であり、該装置は電気分離のために必要とされる特に電極といっ
た多様な手段、並びに一方で、生物学的サンプル、緩衝液、及び核酸物質で富化
された分画といった多様な液または液体を、支持体に向けて及び／または支持体
の外側に輸送するための手段、他方で、電場のものを含む電気分離のために少な
くとも必要とされる電気的手段の供給及び制御のための手段といった、外側で上
記支持体と相互作用するための手段（１ａ、１ｂ、１ｃ）が、集積され統合され
、及び互いに整列された支持体またはベースを含む。A second subject according to the invention is a device for a single use for performing the method according to the invention, said device comprising, in particular, the electrodes required for electrical isolation And, on the other hand, transport various liquids or liquids, such as biological samples, buffers, and fractions enriched in nucleic acid material, toward and / or outside the support. Means for interacting with said support on the outside, such as means for the supply and control of the electrical means at least required for electrical isolation, including those of an electric field (1a, 1b, 1c) comprises a support or base integrated, integrated and aligned with one another.
【００３９】 本発明に従った好ましい実施態様として、該装置は、生物学的サンプルを受け
取るための手段；生物学的サンプルを受け取るための手段を有する、一方及び他
方の上記区画と連絡した、浸透性の膜によって閉ざされた区画を含む、緩衝溶液
のための容器で、上記容器は第一の緩衝液を受け取るものと企図され；並びに上
記膜によってのみ第一の緩衝液から分離された、第一の緩衝液と同一または異な
る第二の緩衝液のための第二の容器；一方は核酸物質の循環の向きで膜の上流で
、第一の緩衝液と接触し、他方は第二の緩衝液と接触する、電場を生じるための
二つの電極；並びに膜によって閉ざされた区画から核酸物質に富む分画を抽出す
るための手段を含む。In a preferred embodiment according to the invention, the device comprises a means for receiving a biological sample; an osmosis, having means for receiving a biological sample, in communication with one and the other said compartments A container for a buffer solution, comprising a compartment closed by a permeable membrane, wherein the container is intended to receive a first buffer; and a second buffer separated from the first buffer only by the membrane. A second container for a second buffer which is the same as or different from the one buffer; one is in contact with the first buffer, upstream of the membrane in the direction of circulation of the nucleic acid substance, and the other is a second buffer It includes two electrodes for generating an electric field in contact with the liquid; and means for extracting a nucleic acid substance-rich fraction from a compartment enclosed by the membrane.
【００４０】 本発明に従った非常の好ましい実施態様において、該容器は、生物学的サンプ
ルを受け取るための手段と連絡した、核酸物質の循環の向きで上記区画の上流に
配置された、生物学的サンプルから得られる少なくとも一つの分画を受け取るた
めの別の区画を含む。In a very preferred embodiment according to the invention, the container is arranged upstream of said compartment in the direction of circulation of the nucleic acid material in communication with means for receiving a biological sample. A separate compartment for receiving at least one fraction obtained from the target sample.
【００４１】 本発明に従った別の好ましい実施態様として、二つの容器は、それぞれ曝気ベ
ンチ及び少なくとも一つの充填チャンネルと連絡する。In another preferred embodiment according to the invention, the two containers are each in communication with an aeration bench and at least one filling channel.
【００４２】 本発明に従ったさらに別の好ましい実施態様として、中間ウェルが配置され、
生物学的サンプルを受け取るための手段と第一の容器との間を連絡する。In yet another preferred embodiment according to the invention, an intermediate well is arranged,
Communication between the means for receiving the biological sample and the first container.
【００４３】 本発明に従ったさらに別の好ましい実施態様として、細胞サンプルを溶解可能
である手段を有する中間ウェルが提供される。In yet another preferred embodiment according to the present invention, there is provided an intermediate well having means capable of lysing a cell sample.
【００４４】 本発明に従ったさらに別の好ましい実施態様として、上記細胞サンプルの溶解
を実施する電極を有する中間ウェルが提供される。In yet another preferred embodiment according to the present invention, there is provided an intermediate well having electrodes for performing the lysis of the cell sample.
【００４５】 本発明に従ったさらに別の好ましい実施態様として、該装置は、溶解物を受け
取るための区画、中間溶解ウェル、並びに核酸物質に富む分画を受け取るための
区画を互いに連絡して含む。In yet another preferred embodiment according to the invention, the device comprises a compartment for receiving a lysate, an intermediate lysis well and a compartment for receiving a fraction rich in nucleic acid material in communication with each other. .
【００４６】 本発明に従ったさらに別の好ましい実施態様として、溶解物を受け取るための
区画の容量は、核酸物質に富む分画を受け取るための区画の容量より大きい。In a further preferred embodiment according to the invention, the capacity of the compartment for receiving the lysate is greater than the capacity of the compartment for receiving the fraction rich in nucleic acid material.
【００４７】 本発明に従ったさらに別の好ましい実施態様として、溶解物を受け取るための
区画及び核酸物質を受け取るための区画の容量の間の比は、１／２から１／５０
の間、特に１／５から１／２０の間である。In yet another preferred embodiment according to the invention, the ratio between the volume of the compartment for receiving the lysate and the volume of the compartment for receiving the nucleic acid material is １ ／ to 1/50.
, Especially between 1/5 and 1/20.
【００４８】 本発明に従った第三の主題は、細胞溶解物から核酸分画を電気分離するための
上述の装置の使用である。A third subject according to the present invention is the use of an apparatus as described above for electroseparating a nucleic acid fraction from a cell lysate.
【００４９】 本発明に従った第四の主題は、増幅の後核酸を直接検出及び／または同定する
ための、本発明に従った方法を使用して電気分離された分画の使用である。A fourth subject according to the invention is the use of the fractions electro-separated using the method according to the invention for directly detecting and / or identifying nucleic acids after amplification.
【００５０】[0050]
実施例１：本発明に従った方法を実施するための一般的方法 この方法は、図１に従った核酸の電気溶出のための装置の使用に基づく。生物
学的サンプルの容量は、区画Ｃ１の底部に注意深く乗せる。電流中の二つの電極
は、発電機に連結される。１５０Ｖの一定電圧を、発電機に適用する。電流を１
５から２０ｍＡに変化させ、区画Ｃ中の緩衝液の温度を２３から３０℃に変化さ
せる。区画Ｃ１の底部に最初に乗せた生物学的分子は、その電荷及びサイズの関
数として定義される速度で、かくして生産される電場中を移動する。各種の移動
時間の後、発電機の電圧を停止させ、陰極に移動し、１０ｋＤａ以下の見かけの
分子量を有する分子が、２００μｌの最終容量で区画Ｃｆ中に回収される。かく
して回収されたサンプルは、分析前に氷上で貯蔵される。Example 1 General Method for Performing a Method According to the Invention This method is based on the use of an apparatus for electroelution of nucleic acids according to FIG. Carefully place the volume of biological sample on the bottom of compartment C1. The two electrodes in the current are connected to the generator. A constant voltage of 150 V is applied to the generator. Current 1
Change from 5 to 20 mA and change the temperature of the buffer in compartment C from 23 to 30 ° C. The biological molecule initially loaded on the bottom of compartment C1 travels in the electric field thus produced at a rate defined as a function of its charge and size. After various transit times, the generator voltage is turned off and moved to the cathode, where molecules with an apparent molecular weight of 10 kDa or less are collected in compartment Cf in a final volume of 200 μl. The sample thus collected is stored on ice before analysis.
【００５１】 区画Ｃ１中に乗せた生物学的サンプルは、血液、尿及び呼吸タイプの痰のよう
な生物学的サンプルから得られた、細胞溶解物を精製したまたは精製していない
核酸及び／若しくはタンパク質物質であり得る。実験される細胞溶解物は、グラ
ム陽性壁含有細菌であるS. epidermidisから得られた（Ａ０５４）。これらの細
菌は、ＨＢＢ（心臓−能ブロス、bioMerieux 41019）で培養される。溶解の前、
それらは臨床上のサンプル（液化され脱混在物化された痰、血液、血漿、血清等
）、または溶解緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００
ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）のいずれかに懸濁される。３００μｌのこの細胞
懸濁液を、必須に以下の二つのプロトコールに従って溶解した：The biological sample loaded in compartment C1 may be nucleic acid and / or purified cell lysate, purified or not, obtained from biological samples such as blood, urine and sputum of the respiratory type. It can be a proteinaceous substance. The cell lysate studied was obtained from S. epidermidis, a gram-positive wall-containing bacterium (A054). These bacteria are cultured in HBB (heart-potency broth, bioMerieux 41019). Before dissolution,
They can be clinical samples (liquefied and demixed sputum, blood, plasma, serum, etc.) or lysis buffers (30 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 100 mM).
mM NaCl, pH 7.2). 300 μl of this cell suspension was lysed essentially according to the following two protocols:
【００５２】 − 機械的ショックを使用する溶解プロトコール：９０から１５０μｌの間の直
径を有する９０μｌのガラスビーズ、２ｍｍの直径を有する３鉄ビーズ、及び３
ｍｍの直径を有する５ガラスビーズを、特許(FR-A-2,768,743)に記載されたよう
に３００μｌの細胞懸濁液の存在下でファルコンチューブ中に配置する。プロテ
イナーゼＫ（ＰＫ）(E.C. 3.4.21.14 Boehringer-Mannheim, ref. 1092766)の最
終６ｍｇ／ｍｌを、細胞懸濁液に加えてもよい。密封チューブを、装置の最大出
力(Reax 2000, Heidolph)で２分間ボルテックスする。かくして処理され回収さ
れた細菌懸濁液を、図１に記載された装置の区画Ｃ１中に直ぐに乗せる。もしＰ
Ｋが細胞懸濁液中に存在するならば、１５分のさらなるインキュベーションを３
７℃で実施する。Lysis protocol using mechanical shock: 90 μl glass beads with a diameter between 90 and 150 μl, 3 iron beads with a diameter of 2 mm, and 3
Five glass beads with a diameter of mm are placed in a Falcon tube in the presence of 300 μl of the cell suspension as described in patent (FR-A-2,768,743). A final 6 mg / ml of proteinase K (PK) (EC 3.4.21.14 Boehringer-Mannheim, ref. 1092766) may be added to the cell suspension. Vortex the sealed tube at the maximum power of the instrument (Reax 2000, Heidolph) for 2 minutes. The bacterial suspension thus treated and recovered is immediately loaded into compartment C1 of the apparatus described in FIG. If P
If K is present in the cell suspension, a further incubation of 15 min.
Performed at 7 ° C.
【００５３】 − 電気的ショックを使用する溶解プロトコール：３００μｌの細胞懸濁液を、
最終０．０１から６ｍｇ／ｍｌのＰＫの存在下で、２ｍｍの間隔の二つの電極の
距離によって特徴付けられるエレクトロポレーションタンクに乗せる。タンクを
、以下のように選択されたパラメーターで電気回路に配置する：電圧５００Ｖ、
抵抗１８６オーム、静電容量５００から１５００μＦＤ。電気パルスを生じさせ
た後、電気的負荷を、二つの電極の間で数ミリ秒以内で生じさせる。かくして回
収された溶解物を、図１に記載された装置の区画Ａに直ぐに乗せる(FR-A-2,763,
957)。Lysis protocol using electric shock: 300 μl of cell suspension
In the presence of a final 0.01 to 6 mg / ml PK, it is loaded into an electroporation tank characterized by the distance between the two electrodes at a distance of 2 mm. The tank is arranged in an electric circuit with the parameters selected as follows: voltage 500V,
Resistance 186 ohms, capacitance 500 to 1500 μFD. After generating the electrical pulse, an electrical load is generated within a few milliseconds between the two electrodes. The lysate thus recovered is immediately loaded on compartment A of the apparatus described in FIG. 1 (FR-A-2,763,
957).
【００５４】 区画Ｃｆ中の移動の後、陰極のが輪に回収された核酸のパーセントを、回収さ
れたサンプルのＯＤを２６０ｎｍで測定することによって決定する。回収された
パーセントは、移動前の２６０ｎｍでのＯＤの値に対する、移動の後の２６０ｎ
ｍでのＯＤの値の比に等しい。同様に、移動の後に陰極で回収されたタンパク質
の量を、Bradfordアッセイ及び５９５ｎｍでのＯＤの読み取りによって決定する
。回収されたタンパク質のパーセントは、初期の量に対する回収されたタンパク
質の量の比に等しい。After migration in compartment Cf, the percent of nucleic acid recovered in the cathode loop is determined by measuring the OD of the recovered sample at 260 nm. The percent recovered is the value of the OD at 260 nm before the transfer, 260 n after the transfer.
It is equal to the ratio of the values of the OD at m. Similarly, the amount of protein recovered at the cathode after transfer is determined by Bradford assay and OD reading at 595 nm. The percentage of protein recovered is equal to the ratio of the amount of protein recovered to the initial amount.
【００５５】 １０μｌのサンプルをウェル当たり乗せ、電気泳動を一定電圧（１５０Ｖ）で
実施し、ゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色して紫外線照射の下で
顕視化することによって、移動の後に陰極の側で回収された核酸の量を０．８％
アガロースゲルでチェックする。平行して、移動の後に陰極で回収されたタンパ
ク質を、ＳＤＳの存在下（１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でのポリアクリルアミド
ゲルで顕視化する；５から１０μｌのサンプルをウェル当たり乗せ、電気泳動を
一定電流（２５ｍＡ）で実施し、ゲルをクマシーブルーで染色する。A 10 μl sample was loaded per well, electrophoresis was performed at a constant voltage (150 V), and the gel was stained with ethidium bromide (EtBr) and visualized under UV irradiation to remove the cathode after transfer. 0.8% of nucleic acid recovered on the side
Check with agarose gel. In parallel, the protein recovered at the cathode after the transfer is visualized on a polyacrylamide gel in the presence of SDS (10% SDS-PAGE); 5 to 10 μl of sample are loaded per well and electrophoresis is performed. Run at constant current (25 mA) and stain the gel with Coomassie blue.
【００５６】 陰極の側に回収された核酸の量を、bioMerieux (France)によって販売されて
いるVidas装置を使用して、サンドイッチハイブリダイゼーション法と称される
ものに従った特異的な検出によって測定する。S. epidermidis核酸に特異的な捕
獲及び検出オリゴヌクレオチドプローブ(EP-A-0,632,269)が選択された。捕獲及
び検出オリゴヌクレオチドは、それぞれ以下の配列を有する：5'-GACCACCTGTCAC
TCTGTCCC-3'（配列番号１）及び5'-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3'（配列番号２）。
検出プローブは、アルカリホスファターゼ（ＡＫＰ）での結合によってラベルさ
れる。溶解物中に放出される核酸とこれらのプローブの特異的なハイブリダイゼ
ーションは、存在する核酸の量に依存するが、使用されるプローブに対するそれ
らの接近性にも依存する。The amount of nucleic acid recovered on the side of the cathode is determined by a specific detection according to what is called a sandwich hybridization method, using a Vidas device sold by bioMerieux (France). . A capture and detection oligonucleotide probe (EP-A-0,632,269) specific for S. epidermidis nucleic acids was selected. The capture and detection oligonucleotides each have the following sequence: 5'-GACCACCTGTCAC
TCTGTCCC-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID NO: 2).
The detection probe is labeled by binding with alkaline phosphatase (AKP). The specific hybridization of these probes with the nucleic acids released into the lysate depends on the amount of nucleic acids present, but also on their accessibility to the probes used.
【００５７】 S. epidermidis ＤＮＡ及びＲＮＡの特異的な増幅のためのプロトコールは、
移動の後に回収されるサンプルで開始して実施された：ＤＮＡの増幅のためのＰ
ＣＲプロトコール、及び１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅のためのＮＡＳＢＡプロトコー
ル、及び１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅のためのＴＭＡプロトコール。The protocol for specific amplification of S. epidermidis DNA and RNA is as follows:
Performed starting with samples collected after transfer: P for DNA amplification
CR protocol, NASBA protocol for amplification of 16S rRNA, and TMA protocol for amplification of 16S rRNA.
【００５８】 − ＰＣＲプロトコール：次のＰＣＲ法は、PCR Strategies, 編者：Innis, Gel
ford and Sninsky Academic press 1995, pp. 17-31中のGoodmanによって記載さ
れたものである。二つの増幅プライマーを使用した；それらは以下の配列を有す
る： プライマー１：5'-ATCTTGACATCCTCTGACC-3' （配列番号３） プライマー２：5'-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3' （配列番号４）-PCR protocol: The following PCR method is based on PCR Strategies, compiled by Innis, Gel
Ford and Sninsky Academic press 1995, pp. 17-31, by Goodman. Two amplification primers were used; they have the following sequences: Primer 1: 5'-ATCTTGACATCCTCTGACC-3 '(SEQ ID NO: 3) Primer 2: 5'-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3' (SEQ ID NO: 4)
【００５９】 以下の温度サイクルを使用した： １回 ９４℃で３分 ６５℃で２分 ３５回 ７２℃で１分 ９４℃で１分 ６５℃で２分 １回 ７２℃で５分The following temperature cycle was used: once 94 ° C. for 3 minutes 65 ° C. for 2 minutes 35 times 72 ° C. for 1 minute 94 ° C. for 1 minute 65 ° C. for 2 minutes 1 time 72 ° C. for 5 minutes
【００６０】 − ＴＭＡプロトコール：次のＴＭＡ法は、US-A-5,554,516に記載されたもので
ある。二つの増幅プライマーを使用した；それらは以下の配列を有する： プライマー１：5'-TCGAAGCAACGCGAAGAAGAACCTTACCA-3' （配列番号５） プライマー２：5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGA-3'
（配列番号６）-TMA protocol: The following TMA method is that described in US-A-5,554,516. Two amplification primers were used; they have the following sequences: Primer 1: 5'-TCGAAGCAACGCGAAGAAGAACCTTACCA-3 '(SEQ ID NO: 5) Primer 2: 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGA-3'
(SEQ ID NO: 6)
【００６１】 １０μｌまたは５０μｌの回収サンプルを、ＰＣＲ及びＴＭＡアッセイでそれ
ぞれ使用した。ＰＣＲによって生産されたアンプルコンを、０．８％アガロース
ゲルで顕視化し、上述のプロトコールに従ってVidasで定量した。ＴＭＡによっ
て生産されたアンプリコンを、Cros等, Lancet 1992, 240: 870によって記載さ
れた方法に従ってS. epidermidisに特異的な捕獲プローブ及び検出プローブでの
ハイブリダイゼーションによって、ミクロピペットで検出する。検出プローブを
、「セイヨウワサビプロオキシダーゼ」（ＨＲＰ）に結合する。二つのプローブ
は以下の配列を有する： 捕獲プローブ：5'-GATAGAGTTTTCCCCTTC-3' （配列番号７） 検出プローブ：5'-GACATCCTCTGACCCCTCTA-3' （配列番号８）[0061] 10 μl or 50 μl of the recovered samples were used in PCR and TMA assays, respectively. Ampulcons produced by PCR were visualized on a 0.8% agarose gel and quantified with Vidas according to the protocol described above. The amplicon produced by TMA is detected with a micropipette by hybridization with a capture and detection probe specific for S. epidermidis according to the method described by Cros et al., Lancet 1992, 240: 870. The detection probe binds to "horseradish prooxidase" (HRP). The two probes have the following sequences: Capture probe: 5'-GATAGAGTTTTCCCCTTC-3 '(SEQ ID NO: 7) Detection probe: 5'-GACATCCTCTGACCCCTCTA-3' (SEQ ID NO: 8)
【００６２】 実施例２：細胞溶解物からの核酸の回収の速度論 Staphylococcus epidermidisの懸濁液（１−５×１０9ｂ．／３００μｌ）を
、上述の一般的なプロトコールに記載されたように、機械的ショックまたは電気
的ショックによって溶解する。２００μｌの各溶解物を、区画Ｃ１の底部に乗せ
る。電場を、二つの電極の間で各種の時間で適用する。区画Ｃｆで回収されたサ
ンプル中に存在する核酸またはタンパク質の量を、Vidas装置またはBradfordア
ッセイのそれぞれでの分析によって測定する。回収された分子の量を、アガロー
スまたはＳＤＳの存在下でのアクリルアミドゲルで評価した。Example 2 Kinetics of Recovery of Nucleic Acid from Cell Lysates A suspension of Staphylococcus epidermidis (1-5 × 10 9 b./300 μl) was prepared as described in the general protocol above. Dissolves by mechanical or electrical shock. Place 200 μl of each lysate on the bottom of compartment C1. An electric field is applied between the two electrodes at various times. The amount of nucleic acid or protein present in the sample collected in compartment Cf is determined by analysis on a Vidas instrument or Bradford assay, respectively. The amount of recovered molecules was assessed on an acrylamide gel in the presence of agarose or SDS.
【００６３】 − 機械的ショックによって得られた細胞溶解物： 溶解物中の核酸は、図２に示されたように、段階的な時間で区画Ｃｆ中に移動
した。６０分後、溶解物中の全核酸物質を、溶解工程の間のプロテイナーゼＫの
存在下または不存在下に関わらず回収する。この結果は、溶解物中の核酸の良好
な放出及び接近性の嗜好を表す。回収されたＤＮＡ分子は、溶解物中の移動の前
と同様な０．８％アガロースゲルでの移動プロフィールを有する。図３に示され
るように、溶解工程の間のプロテイナーゼＫの存在下で、タンパク質の微量のパ
ーセントのみが６０分後に回収される一方、プロテイナーゼの不存在下で、約５
０％のタンパク質が回収される。Cell lysates obtained by mechanical shock: The nucleic acids in the lysate migrated into the compartment Cf at a gradual time, as shown in FIG. After 60 minutes, all nucleic acid material in the lysate is recovered, with or without proteinase K during the lysis step. This result indicates a good release of nucleic acids in the lysate and a preference for accessibility. The recovered DNA molecules have a migration profile on a 0.8% agarose gel similar to that before migration in the lysate. As shown in FIG. 3, in the presence of proteinase K during the lysis step, only a small percentage of the protein is recovered after 60 minutes, while in the absence of proteinase, about 5%
0% of the protein is recovered.
【００６４】 − 電気的ショックによって得られた細胞溶解物： 図４に示されるように、溶解工程の間のＰＫの存在下で、溶解物中の核酸は段
階的に陰極に移動する。６０分後、大量のパーセントの核酸が回収される。この
溶解物中に初めに存在する核酸物質の回収は、機械的ショックによって得られた
溶解物中に初めに存在する核酸物質のそれと同様である（上記参照）。他方で、
溶解工程の間でＰＫが存在しないと、移動の６０分後でさえ区画Ｃｆに核酸は検
出できない(Vidas分析及び０．８％アガロースゲル）。アガロースゲル上で、回
収されるＤＮＡ及びＲＮＡ分子が、移動の後別個に顕視化される一方で、それら
は溶解物中に最初には顕視化されない。Cell lysates obtained by electric shock: As shown in FIG. 4, in the presence of PK during the lysis step, the nucleic acids in the lysate move stepwise to the cathode. After 60 minutes, a large percentage of the nucleic acid is recovered. The recovery of the nucleic acid material initially present in the lysate is similar to that of the nucleic acid material initially present in the lysate obtained by mechanical shock (see above). On the other hand,
In the absence of PK during the lysis step, no nucleic acids can be detected in compartment Cf even after 60 minutes of transfer (Vidas analysis and 0.8% agarose gel). On agarose gels, while the recovered DNA and RNA molecules are separately visualized after migration, they are not initially visible in the lysate.
【００６５】 − 細胞溶解物から精製される核酸の増幅： ３００μｌの溶解緩衝液で希釈したS. epidermidis細菌を、実施例１の一般的
プロトコールに記載されたように、ＰＫの不存在下で機械的ショックによって溶
解する。２００μｌの溶解物を、区画Ｃ１の底部に乗せる。電場を二つの電極の
間で各種の時間で適用する。区画Ｃｆ内に移動した核酸物質を、ＰＣＲ（アッセ
イ当たり１０μｌ）またはＴＭＡ（アッセイ当たり５０μｌ）によって増幅する
。生産されたアンプリコンの量を、それぞれVidasまたはミクロプレートで特異
的なハイブリダイゼーションによって分析する。Amplification of nucleic acids purified from cell lysates: S. epidermidis bacteria diluted with 300 μl of lysis buffer were harvested in the absence of PK as described in the general protocol in Example 1. Dissolves by mechanical shock. Place 200 μl of lysate on the bottom of compartment C1. An electric field is applied between the two electrodes at various times. The nucleic acid material transferred into compartment Cf is amplified by PCR (10 μl per assay) or TMA (50 μl per assay). The amount of amplicon produced is analyzed by specific hybridization on Vidas or microplate, respectively.
【００６６】 − 移動の後回収されたＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅： 溶解され区画Ｃ１に乗せられた１０4の初期細菌について、各種の量のアンプ
リコンを、移動時間の関数として生産する。図５に示されたように、移動の１５
分で、回収されたＤＮＡ分子は、ＰＣＲによるアンプルコンの最適な生産を許容
する。１５分前で、ＤＮＡ分子のより少量が回収される。２０分以上で、大量の
ＤＮＡ分子が回収されるが、その量は最適なＰＣＲ増幅には比較的適さない。移
動時間が長いほど、核酸の構造がより損傷されるであろう。最適なＰＣＲ増幅を
得るために、陰極で回収されるＤＮＡ分子の量と質の間の妥協点を観察しなけれ
ばならない。この結果は、S. epidermidisのより濃縮された初期懸濁液を使用し
て確認された（１０5−１０6初期細菌／２００μｌ）。- [0066] PCR amplification of the recovered DNA molecules after the movement: the dissolved 10 4 initial bacteria put on compartment C1, various amounts of amplicon production as a function of travel time. As shown in FIG.
In minutes, the recovered DNA molecules allow for optimal production of ampulcon by PCR. Fifteen minutes ago, a smaller amount of the DNA molecule is recovered. In 20 minutes or more, large amounts of DNA molecules are recovered, but their amounts are relatively unsuitable for optimal PCR amplification. The longer the translocation time, the more the structure of the nucleic acid will be damaged. In order to obtain optimal PCR amplification, a compromise between the quantity and quality of the DNA molecules recovered at the cathode must be observed. This result was confirmed using a more concentrated initial suspension of S. epidermidis (10 5 -10 6 initial bacteria / 200 μl).
【００６７】 図６に示されるように、１×１０3初期細菌（／２００μｌ）以上の数のＤＮ
Ａが、細胞の機械的溶解及び電場での溶解物の構成物の移動の後増幅され検出で
きるであろう；それは移動物質が２００μｌ中に回収され、この物質の１０μｌ
が各ＰＣＲアッセイで使用されると仮定して、ＰＣＲアッセイ当たり１０2分子
のＤＮＡまたは細菌に相当する。１０2分子のＤＮＡは、一般的なＰＣＲプロト
コールの感度限界に相当する。この結果は、機械的ショックによる細胞溶解、及
び溶液中での電場による細胞内ＤＮＡ分子の精製の後、細菌ＤＮＡの分子の回収
の高い感度を表す。As shown in FIG. 6, more than 1 × 10 3 initial bacteria (/ 200 μl) of DN
A will be amplified and detectable after mechanical lysis of the cells and migration of the lysate constituents in an electric field; it will recover the transfer material in 200 μl and 10 μl of this material.
There are assumed to be used in each PCR assay, corresponding to DNA or bacterial 10 2 molecules per PCR assay. 10 2 molecules of DNA represent the sensitivity limit of a general PCR protocol. This result demonstrates the high sensitivity of recovery of bacterial DNA molecules after cell lysis by mechanical shock and purification of intracellular DNA molecules by electric field in solution.
【００６８】 − 移動の後に回収されるＲＮＡ分子のＴＭＡ増幅： 図７に示されているように、少なくとも４０の初期細菌（２００μｌ）のＲＮ
Ａを、細菌の溶解、電倍での細胞構成物の移動、及びS. epidermidis １６Ｓ ｒ
ＲＮＡの特異的増幅の後検出できる；それは移動した核酸物質が最終２００μｌ
に回収され、５０μｌをＴＭＡアッセイ当たり加えることを条件に、ＴＭＡアッ
セイ当たり１０の初期細菌に相当する。この結果は、機械的ショックによる溶解
、並びに電場による溶解物の核酸の精製の後、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡの分子の回
収の高い感度を反映する。TMA amplification of RNA molecules recovered after transfer: RN of at least 40 early bacteria (200 μl), as shown in FIG.
A was used for lysis of bacteria, migration of cell constituents at electromagnetization, and S. epidermidis 16S r
It can be detected after specific amplification of the RNA;
Corresponding to 10 initial bacteria per TMA assay, provided that 50 μl is added per TMA assay. This result reflects the high sensitivity of recovery of bacterial 16S rRNA molecules after lysis by mechanical shock, as well as purification of lysate nucleic acids by electric field.
【００６９】 実施例３：血液サンプルからの核酸の回収の速度論 血液サンプルを、事前に予備処理することなく使用する。２００μｌのこの臨
床上のサンプルを、区画Ｃ１の底部に乗せる。１５０Ｖの電圧を、各種の時間で
二つの電極の間に適用し、次いで区画Ｃｆの陰極の側で回収された物質を、Brad
ford法に従ったタンパク質アッセイ、及びＳＤＳの存在下でのポリアクリルアミ
ドゲル（１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析する。Example 3 Kinetics of Recovering Nucleic Acid from a Blood Sample A blood sample is used without prior pretreatment. Place 200 μl of this clinical sample on the bottom of compartment C1. A voltage of 150 V was applied between the two electrodes at various times, and then the material recovered on the cathode side of compartment Cf was Brad
Analyze by protein assay according to the ford method and polyacrylamide gel (10% SDS-PAGE) in the presence of SDS.
【００７０】 この実施例において、移動のために使用されるＴＢＥ緩衝液のｐＨは、ｐＨ７
．０にセットされ、ヘモグロビンの等電点は７．０に等しい。５０または１００
ｋＤａの膜を、区画ＣｆとＢの界面に配置した。図８に示されるように、移動の
６０分後、わずかなパーセントのタンパク質が１００ｋＤａの膜で回収され、１
０％のタンパク質が５０ｋＤａの膜で回収される。ｐＨ７．０で、該ｐＨで負に
荷電した血液タンパク質の１０％のみが、５０ｋＤａより大きく１００ｋＤａよ
り小さい見かけの分子量を有する。わずかなパーセントのタンパク質が、５０ま
たは１００ｋＤａの膜のいずれかを使用して、移動の１５分後で回収される。こ
れらの結論は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの存在下でのポリアクリルアミドゲルで
確認された。膜の孔度は、過剰に高いパーセントのタンパク質を得ないように、
１０ｋＤａより大きいのが好ましいであろう。In this example, the pH of the TBE buffer used for transfer was pH 7
. Set to 0, the isoelectric point of hemoglobin is equal to 7.0. 50 or 100
A kDa membrane was placed at the interface between compartments Cf and B. As shown in FIG. 8, after 60 minutes of transfer, a small percentage of the protein was recovered on a 100 kDa membrane and 1%
0% of the protein is recovered on a 50 kDa membrane. At pH 7.0, only 10% of the blood proteins negatively charged at that pH have an apparent molecular weight greater than 50 kDa and less than 100 kDa. A small percentage of the protein is recovered 15 minutes after transfer using either a 50 or 100 kDa membrane. These conclusions were confirmed on a polyacrylamide gel in the presence of 10% SDS-PAGE. The porosity of the membrane should be such that it does not get an excessively high percentage of protein.
Preferably, it will be greater than 10 kDa.
【００７１】 実施例４：呼吸タイプのサンプルからの核酸の回収の速度論 使用の前に、呼吸サンプルを、標準的なN-アセチル-L-システイン及び水酸化
ナトリウム（ＮＡＬＣ／ＮａＯＨ）に従って脱混在物化し、それを９５℃で２０
分インキュベーションする。Example 4 Kinetics of Recovery of Nucleic Acid from Respiratory Type Samples Prior to use, respiratory samples are demixed according to standard N-acetyl-L-cysteine and sodium hydroxide (NALC / NaOH) Materialize it at 95 ° C for 20
Incubate for a minute.
【００７２】 この実施例において、移動のために使用されるＴＢＥ緩衝液は、８．３または
７．０に等しいｐＨを有し、多様な孔サイズを有する膜が、区画ＣｆとＢの界面
に配置された：１０，５０または１００ｋＤａ。図９に示されるように、ｐＨ８
．３では、５０または１０ｋＤａの膜を使用して、１０％のタンパク質が３０分
後に回収され、７０−８０％が６０分後に回収され、このことは、痰中のタンパ
ク質の７０−８０％がこれらのｐＨ値で負に荷電し、５０ｋＤａより大きい見か
けの分子量を有することを示唆する。ｐＨ７．０で、ほぼ０％のタンパク質が、
使用される膜の孔のサイズに関わらず（使用される検出法の感度の限界以内で）
、移動の３０または６０分後で回収される。このｐＨでは、ｐＨ８．０で以前に
回収されたタンパク質の５５−６０％は、もはや負に荷電しない。１０または５
０ｋＤａの膜では、痰中のわずかなパーセントのタンパク質が、移動の１５分後
に回収される。この点は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの存在下でのポリアクリルア
ミドゲルで確認された。In this example, the TBE buffer used for the transfer has a pH equal to 8.3 or 7.0, and a membrane with various pore sizes is placed at the interface between compartments Cf and B. Deployed: 10, 50 or 100 kDa. As shown in FIG.
. 3, using a 50 or 10 kDa membrane, 10% of the protein was recovered after 30 minutes and 70-80% was recovered after 60 minutes, indicating that 70-80% of the protein in sputum was Negatively charged at a pH value of, suggesting that it has an apparent molecular weight greater than 50 kDa. At pH 7.0, almost 0% of the protein
Regardless of the pore size of the membrane used (within the limits of the sensitivity of the detection method used)
Collected 30 or 60 minutes after transfer. At this pH, 55-60% of the protein previously recovered at pH 8.0 is no longer negatively charged. 10 or 5
With a 0 kDa membrane, only a small percentage of the protein in sputum is recovered 15 minutes after transfer. This point was confirmed on a polyacrylamide gel in the presence of 10% SDS-PAGE.
【００７３】 実施例５：移動の後の呼吸タイプのサンプルによる増幅プロトコールの阻害の解
除 呼吸タイプのサンプルは、ＰＣＲ及びＴＭＡ反応のインヒビターである。２０
０μｌのこれらのサンプルを、図２に示される系の区画Ｃ１の底部に乗せた。１
５０Ｖの定常電圧を、１５分間二つの電極間に適用した。１０ｋＤａのＣｆとＢ
の間の分離膜を選択した。移動の後、区画Ｃｆで回収されたサンプル（２００μ
ｌ）に、各種の量の精製S. epidermidis核酸を補った。１０μｌまたは５０μｌ
のこの溶液を、それぞれＰＣＲまたはＴＭＡアッセイについて使用した。図１０
に示されるように、ＤＮＡの１０2−１０3の初期コピーまでが、１０μｌの移動
サンプル中で増幅され得る。この結果は、移動した痰がそのＰＣＲ阻害特性を失
ったことを示す。同様の結果は、ＴＭＡ増幅でも得られた。Example 5 Release of Inhibition of Amplification Protocol by Respiratory Type Samples After Migration Respiratory type samples are inhibitors of PCR and TMA reactions. 20
0 μl of these samples were placed on the bottom of compartment C1 of the system shown in FIG. 1
A steady voltage of 50 V was applied between the two electrodes for 15 minutes. 10kDa Cf and B
Was selected. After the transfer, the sample collected in the section Cf (200 μ
l) was supplemented with various amounts of purified S. epidermidis nucleic acid. 10 μl or 50 μl
This solution was used for PCR or TMA assays, respectively. FIG.
As shown in, up to 10 2 -10 3 initial copies of DNA can be amplified in a 10 μl transfer sample. This result indicates that the transferred sputum has lost its PCR inhibiting properties. Similar results were obtained with TMA amplification.
【００７４】 １−５×１０9のS. epidermidisを、上述の実施例４に記載されたように脱混
在物化され不活性化された痰の液体の３００μｌ内にイノキュレートした。懸濁
物中のこれらの細胞を、ＰＫの不存在下で機械的ショックにより溶解し、実施例
１に示されたスキームに従って、区画Ｃｆ及びＢの間で１０ｋＤａの膜を使用し
て、溶解物を１５０Ｖで１５分移動させた。移動の後に区画Ｃｆで回収された細
菌核酸の量を、試験された細菌種に特異的なVidas分析によって定量した。実験
を各種の痰を平均して使用して実施した。８０％のS. epidermidis核酸が回収さ
れた。この結果は、これらの条件の下で、痰中のマトリックスの分子が、電場に
おける細菌溶解物中のＤＮＡ及びＲＮＡ分子の移動を妨げないことを示す。これ
に対して、その環境は、これらの分子のよりすぐれた回収及び／または移動に適
しているようである。[0074] 1-5 × 10 9 S. epidermidis was inoculated into 300 μl of demixed and inactivated sputum fluid as described in Example 4 above. These cells in suspension were lysed by mechanical shock in the absence of PK, and lysate was lysed using a 10 kDa membrane between compartments Cf and B according to the scheme shown in Example 1. Was moved at 150 V for 15 minutes. The amount of bacterial nucleic acid recovered in compartment Cf after transfer was quantified by Vidas analysis specific for the bacterial species tested. The experiments were performed using various sputums on average. 80% of the S. epidermidis nucleic acid was recovered. The results indicate that under these conditions, the molecules of the matrix in the sputum do not prevent the movement of DNA and RNA molecules in the bacterial lysate in the electric field. In contrast, the environment appears to be suitable for better recovery and / or transfer of these molecules.
【００７５】 ＰＣＲ増幅： S. epidermidis細菌を、実施例１に記載されたように、脱混在物化され、不活性
化され、ＰＫの不存在下での機械的ショックによって溶解された液体の痰の３０
０μｌ中にイノキュレートした。２００μｌの溶解物を、区画ＣｆとＢの間の１
０ｋＤａの膜で、１５０Ｖで１５分間移動させた。サンプル中に存在する核酸物
質を、ＰＣＲ（アッセイ当たり１０μｌ）によって増幅し、生産されたアンプリ
コンをVidas分析によって定量した。図１１に示されるように、１０4−１０3ま
での溶解初期細菌（／２００μｌの溶解物）が、移動及びＤＮＡ分子の増幅の後
に検出できる（それは、ＰＣＲアッセイの１０μｌ当たり１００−１０のＤＮＡ
分子である）。この結果は、一方で、痰中の溶解物の細菌ＤＮＡの分子の非常に
優れた回収収率を確認し、他方で、痰中に最初に存在するＰＣＲインヒビターの
非常に優れた除去を示す。PCR Amplification: S. epidermidis bacteria were isolated from liquid sputum that was demixed, inactivated, and lysed by mechanical shock in the absence of PK, as described in Example 1. 30
Inoculated in 0 μl. 200 μl of lysate was added between compartments Cf and B
The film was moved at 150 V for 15 minutes using a 0 kDa film. Nucleic acid material present in the sample was amplified by PCR (10 μl per assay) and the amplicon produced was quantified by Vidas analysis. As shown in FIG. 11, up to 10 4 -10 3 lysing early bacteria (/ 200 μl lysate) can be detected after migration and amplification of DNA molecules (it is 100-10 DNA / 10 μl of PCR assay).
Molecule). The results confirm, on the one hand, a very good recovery yield of bacterial DNA molecules of the lysate in the sputum and, on the other hand, a very good removal of the PCR inhibitors initially present in the sputum.
【００７６】 ＴＭＡ増幅： 上述のＰＣＲ増幅実験と同様に、S. epidermidis細菌を、脱混在物化され、不
活性化され、次いでＰＫの不存在下での機械的ショックにより溶解された液体の
痰の３００μｌ中でインキュベートした。２００μｌの溶解物を、区画ＣｆとＡ
の間の１０ｋＤａの膜を使用して、１５０Ｖで１５分移動させた。回収されたサ
ンプル中に存在するｒＲＮＡ分子を、ＴＭＡ（アッセイ当たり５０μｌ）により
増幅し、生産されたアンプリコンを、ミクロプレートでの特異的なサンドイッチ
ハイブリダイゼーションにより定量した。図１２に示されるように、少なくとも
１０６−１０５の溶解初期細菌（／２００μlの溶解物）が、移動及びＲＮＡ分
子の増幅の後検出できる（それはＴＭＡアッセイの５０μｌ当たり少なくとも５
×１０4−５×１０3の初期細菌である）。この結果は、痰中に初めに存在するＴ
ＭＡのインヒビターの除去を示す。TMA Amplification: Similar to the PCR amplification experiments described above, S. epidermidis bacteria were demixed, inactivated, and then purified from liquid sputum lysed by mechanical shock in the absence of PK. Incubated in 300 μl. Add 200 μl of lysate to compartments Cf and A
Was moved at 150 V for 15 minutes using a 10 kDa membrane between the two. The rRNA molecules present in the recovered samples were amplified by TMA (50 μl per assay) and the amplicons produced were quantified by specific sandwich hybridization on microplates. As shown in FIG. 12, at least 106-105 lysed primary bacteria (/ 200 μl lysate) are detectable after migration and amplification of the RNA molecule, which is at least 5/50 μl in the TMA assay.
× 10 4 -5 × 10 3 initial bacteria). This result is due to the T
4 illustrates removal of an inhibitor of MA.
【００７７】 実施例６：電気的ショックによる溶解の後の電気分離 １−５×１０9のS. epidermidisを、実施例４に記載されたように脱混在物化
され、不活性化された液体の痰の３００μｌ中にイノキュレートした。懸濁物中
のこれらの細胞を、最終１０-2ｍｇ／ｍｌのＰＫ及び最終２％のＬＩＳ（リチウ
ムラウリルスルファート、Sigma）の存在下で電気的ショックにより溶解した。
２００μｌの溶解物を、実施例１に記載されたスキームに従って、区画ＣｆとＢ
の間の１０ｋＤａの膜を使用して、１５０Ｖで１５分間移動させた。移動の後回
収された核酸物質（２００μｌ）を、S. epidermidisに特異的なＰＣＲにより増
幅し（１０μｌ／アッセイ）、生産されたアンプリコンをVidas分析により定量
した。１０４−１０５までの溶解初期細菌（／ｍｌ）が、ＤＮＡ分子の移動及び
増幅の後に検出できた（それは、ＰＣＲアッセイのμｌ当たり１００−１０のＤ
ＮＡ分子に相当し、使用されるＰＣＲ法の感度限界を表す）。Example 6: Electroseparation after dissolution by electric shock 1-5 × 10 9 S. epidermidis was removed from a demixed, inactivated liquid as described in Example 4. Inoculated in 300 μl of sputum. These cells in suspension were lysed by electric shock in the presence of a final 10 -2 mg / ml PK and a final 2% LIS (lithium lauryl sulfate, Sigma).
200 μl of the lysate were added to compartments Cf and B according to the scheme described in Example 1.
For 15 minutes at 150 V using a 10 kDa membrane between the two. The nucleic acid material (200 μl) recovered after the transfer was amplified by S. epidermidis specific PCR (10 μl / assay) and the amplicon produced was quantified by Vidas analysis. Up to 104-105 lysed germs (/ ml) could be detected after transfer and amplification of DNA molecules (it was 100-10 D / μl of PCR assay).
(Corresponds to NA molecule and represents the sensitivity limit of the PCR method used).
【００７８】 図１３から１６に従って、上述の及び例示された電気分離法を実施可能である
、単一の使用、つまり消費可能である、または使用の後廃棄できる装置が以下に
記載される。In accordance with FIGS. 13 to 16, a device which can carry out the above and exemplified electroseparation method, which is single-use, ie consumable or can be disposed of after use, is described below.
【００７９】 上記装置は、図１３及び１４に示されるように、特に上部面１ｂ、底部面１ｃ
及び横部面１ａを含む、平行六面体の形状を一般的に有する支持体１またはベー
スを含む。The above device, as shown in FIGS. 13 and 14, has in particular a top surface 1 b, a bottom surface 1 c
And a support 1 or base that generally has a parallelepiped shape, including a lateral surface 1a.
【００８０】 一般的にこの支持体１において、電気分離のために必要とされる特に電極とい
った多様な手段、並びに一方で、処理される生物学的サンプル、水性液体媒体（
緩衝液）、及び核酸材料で富化された分画を含む、支持体１に向けて及び／また
はそれの外側への多様な体液または液体の輸送のための、他方で、電場のものを
含む電気分離のために少なくとも必要とされる電気的手段の供給及び制御のため
の、外部と支持体１の壁面１ａに相当する界面の形成のための手段が、集積及び
統合され、並びに互いに整列される。In general, in this support 1, various means are required for electrical separation, in particular electrodes, as well as, on the one hand, the biological sample to be treated, the aqueous liquid medium (
Buffer), and for transport of various bodily fluids or liquids towards and / or outside of the support 1, including fractions enriched with nucleic acid material, while including those in electric fields Means for the formation of the interface corresponding to the exterior and the wall 1a of the support 1, for the supply and control of at least the electrical means required for electrical separation, are integrated and integrated and aligned with one another. You.
【００８１】 示されている態様ではないが、例として、装置またはマップの二つの面１ａと
１ｂは、支持体に接着した薄い透明な被膜で皮膜され、それは図１３及び１４の
表面に表される各種の管及び空洞を覆う。By way of example, but not by way of illustration, the two surfaces 1a and 1b of the device or map are coated with a thin transparent coating adhered to a support, which is represented on the surface of FIGS. 13 and 14. Cover various tubes and cavities.
【００８２】 この装置は、さらに以下のものを含む： − 処理される生物学的サンプルを受け取るための手段２， − 例えば１００μｌのオーダーの容量を有する浸透性の膜４によって閉ざされ
た区画３１，並びに生物学的サンプルから得られる少なくとも一つの分画を受け
取るための１ｍｌの容量を有する別の区画３２をそれ自体備えた、第一の水性液
体媒体（１０倍に希釈されたＴＢＥ緩衝液）のための第一の容器３；上記の後者
の区画は、電場の影響の下で核酸物質の循環の方向において区画３１の上流に配
置され、生物学的サンプルを受け取るための手段２とそれ自体連絡している、 − 膜４によってのみ第一の容器３から分離している、第一の水性液体と同じま
たは異なる第二の水性液体媒体（例えば１倍に濃縮されたＴＢＥ緩衝液）のため
の第二の容器５， − 壁部１ａに電気的に接触するための二つのブロック６３及び６４と連絡する
、電場を生産するための電極６１及び６２；電極の一方、主に６１または陰極は
、第一の容器３中で第一の水性液体媒体と接触し、他方の電極６２または陽極は
、第二の容器５中の第二の水性媒体と接触している、 − 膜４によって閉ざされた区画３１中で核酸物質で富化された分画を抽出する
ための手段９。The device further comprises: a means 2, for receiving the biological sample to be treated, 2, a compartment 31, closed by a permeable membrane 4, for example having a volume on the order of 100 μl, As well as a first aqueous liquid medium (10-fold diluted TBE buffer), itself equipped with a separate compartment 32 having a volume of 1 ml for receiving at least one fraction obtained from a biological sample A first container 3 for the latter, said latter compartment being arranged upstream of the compartment 31 in the direction of circulation of the nucleic acid material under the influence of an electric field and in itself in communication with the means 2 for receiving a biological sample A second aqueous liquid medium that is the same or different from the first aqueous liquid, such as a 1 × concentrated TBE buffer, separated from the first container 3 only by the membrane 4 A second container 5, for the electrodes 61 and 62 for producing an electric field, in communication with two blocks 63 and 64 for making electrical contact with the wall 1a; one of the electrodes, mainly 61 or The cathode is in contact with the first aqueous liquid medium in the first container 3 and the other electrode 62 or the anode is in contact with the second aqueous medium in the second container 5; Means 9 for extracting a fraction enriched in nucleic acid material in a closed compartment 31.
【００８３】 二つの容器３及び５は、曝気ベント３３及び５３とそれぞれ連絡し、部分的に
第二の容器５と連絡する少なくとも一つの充填チャンネル３４と連絡する。The two containers 3 and 5 are in communication with the aeration vents 33 and 53, respectively, and in part with at least one filling channel 34 which is in communication with the second container 5.
【００８４】 中間ウェル７が配置され、生物学的サンプルを受け取るための手段２と第一の
容器３との間を連絡する。このウェルは、溶解物が直接区画３２内に配置できる
ため、必須ではない。このウェル７は、次に電気分離を受ける分画を得るために
、細胞サンプルを溶解することを可能にする手段を提供する；これらの手段は電
極８１及び８２であり、それらは、本出願人の名の下の仏国特許出願FR-A-2 763
に記載された方法に従って、一つ以上の電気的パルスをサンプルにさらすことが
可能である。電極８１及び８２は、それぞれ壁部１ａに提供された電気的接触部
８３及び８４のためのブロックと連絡する。従って二つの電気回路が存在し、一
方は電極８１及び８２と関連し、他方は電極６１及び６２と関連する。An intermediate well 7 is arranged, communicating between the means 2 for receiving a biological sample and the first container 3. This well is not required, as the lysate can be placed directly in compartment 32. This well 7 provides a means that allows the cell sample to be lysed in order to obtain a fraction which is then subjected to electroseparation; these means are electrodes 81 and 82, which are French patent application FR-A-2 763 in the name of
One or more electrical pulses can be exposed to the sample according to the method described in US Pat. The electrodes 81 and 82 communicate with blocks for electrical contacts 83 and 84 provided on the wall 1a, respectively. Thus, there are two electrical circuits, one associated with electrodes 81 and 82 and the other associated with electrodes 61 and 62.
【００８５】 Ｉ−装置の調整 いずれかの反応を開始する前に、容器３と５を緩衝液で満たす。後者は、濃度
が一方の容器から他方へ変化するＴＢＥ(Tris-Borate-EDTA)より成ってもよい。
第一に、上部、容器３を１０倍に希釈した緩衝液で受け取り手段２によって満た
し、第二に、底部、容器５を１倍に濃縮した緩衝液でチャンネル３４によって満
たす。曝気ベント３３及び５３を、面部１ａと１ｂを被覆する薄膜のレベルで貫
通させ、空気が容器の充填の間逃げるようにする。I-Device Adjustment Before starting any reaction, fill containers 3 and 5 with buffer. The latter may consist of TBE (Tris-Borate-EDTA) in which the concentration changes from one container to the other.
Firstly, the top, container 3 is filled with receiving solution 2 with 10-fold diluted buffer, and second, the bottom, container 5 is filled with channel 34 with 1-fold concentrated buffer. Aeration vents 33 and 53 are pierced at the level of the thin film covering faces 1a and 1b so that air can escape during filling of the container.
【００８６】 １）溶解 サンプルを、手動または自動装置によって、ピペットの助けの下で受け取り手
段２に導入する。サンプルの容量は０から１ｍｌの間である。次いでそれを、溶
解のために中間ウェル７に到達させる。電極８１及び８２の間の５００Ｖで約１
秒間の電気的負荷により、溶解を実施する。1) Lysis The sample is introduced into the receiving means 2 with the aid of a pipette, manually or by means of an automatic device. The volume of the sample is between 0 and 1 ml. It is then allowed to reach intermediate well 7 for lysis. Approx. 1 at 500 V between electrodes 81 and 82
The dissolution is carried out by an electrical load for a second.
【００８７】 サンプルの容量が５０μｌより大きい場合、複数の溶解工程を次々に実施し、
溶解分画を段階的に受け取り区画３２に移す。If the sample volume is greater than 50 μl, multiple lysis steps are performed one after the other,
The lysed fraction is transferred to the receiving compartment 32 stepwise.
【００８８】 ２）電気分離 一度サンプルが溶解され、電気分離の開始のための区画３２内に完全に移され
たら、電極８１及び８２の第一の電気回路を開き、電極６１及び６２の第二の電
気回路を閉じる。次いで、溶解物の負に荷電した構成物は、陽極６２に移動する
であろう。核酸は、非常に負に荷電しているため、より早く移動するであろう。
それ故回収チャンネル９によって受け取り区画３１のレベルで、膜４の上部に選
択的にそれらを回収可能であろう。2) Electrical Separation Once the sample has been lysed and completely transferred into compartment 32 for initiation of electrical separation, the first electrical circuit of electrodes 81 and 82 is opened and the second electrical circuit of electrodes 61 and 62 is opened. Close the electrical circuit. The negatively charged constituents of the lysate will then migrate to the anode 62. Nucleic acids will migrate faster because they are very negatively charged.
Therefore, at the level of the receiving compartment 31, at the level of the receiving compartment 31, they could be selectively collected on top of the membrane 4.
【００８９】 この移動のために課せられる電流は、１５０Ｖの電圧下で０から３０ｍＡの間
である。最適な移動の継続時間は約１５分である。The current imposed for this transfer is between 0 and 30 mA under a voltage of 150V. The optimal travel duration is about 15 minutes.
【００９０】 核酸を回収するために、上部容器３は、区画３２と受け取り区画３１の間の液
体連絡がもはや存在しなくなるまで空にされる。次いで区画３１に含まれる１０
０μｌの緩衝液が、チャンネル９を通してピペットで回収される。この回収は、
手動または自動化装置によってなすことができる。To recover nucleic acids, the upper container 3 is emptied until there is no longer any liquid communication between the compartment 32 and the receiving compartment 31. Next, 10 included in section 31
0 μl of buffer is pipetted through channel 9. This recovery
It can be done manually or by automated equipment.
【００９１】 精製タンパク質を受け取ることもまた考慮可能である。そのために、電気精製
の二つの連続した駆動を実施することが必要であり、第一は核酸で富化された分
画の回収を可能にし、第二はタンパク質で富化された分画の回収である。この正
しい場合において、移動を終えていないタンパク質を含む緩衝液の上部容器３を
空にする工程なしで、核酸が二つの駆動の間で回収されるべきである。Receiving purified protein is also conceivable. For that, it is necessary to carry out two successive drives of electropurification, the first allowing the recovery of the nucleic acid-enriched fraction and the second the recovery of the protein-enriched fraction. It is. In this correct case, the nucleic acid should be recovered between the two drives, without the step of emptying the upper container 3 of the buffer containing the untransferred protein.
【００９２】 上述の装置は、三つの電極のみで構成することが可能である。実際、二つの陰
極６１及び８１は、それぞれ電気分離回路及び溶解回路に向けられ、二つの回路
に共通の陰極とすることができる。この場合、生物学的サンプルの溶解は、区画
３２において実施される。上記装置は、エッジセクション(edge-section)で使用
できる。かくして、この空間の増分により、それを自動装置に導入することが容
易となるであろう。The device described above can be composed of only three electrodes. In fact, the two cathodes 61 and 81 are respectively directed to the electrical separation circuit and the melting circuit and can be a common cathode for the two circuits. In this case, lysis of the biological sample is performed in compartment 32. The device can be used in an edge-section. Thus, this increase in space will make it easier to introduce it into an automated device.
【図１】 図１は、主として本発明に従った電気分離である、多様な方法
で使用される、ゲルからの核酸及びタンパク質の電気溶出のための、並びにマク
ロ分子の電気泳動濃縮(Isco, Nebraska, USA)のための装置を表す。それぞれ不
及び正である二つの電極が浸されている区画Ａ及びＢは、１×ＴＢＥ緩衝液で満
たされている；区画Ｃｆは、０．１×ＴＢＥ緩衝液で満たされている。透析膜が
、区画ＣｆとＢの間（１００ｋＤａの孔）並びに区画Ｃ１とＡの間（１０ｋＤａ
の孔）の界面に配置されている。FIG. 1 shows the electroseparation of macromolecules for electroelution of nucleic acids and proteins from gels and for the electrophoretic concentration of macromolecules (Isco, Nebraska, USA). Compartments A and B, which are immersed in two electrodes, respectively non-positive and positive, are filled with 1 × TBE buffer; compartment Cf is filled with 0.1 × TBE buffer. The dialysis membrane is located between compartments Cf and B (100 kDa pore) and between compartments C1 and A (10 kDa).
(Holes).
【図２】 図２は、実施例２に従って、Vidas装置(BioMerieux, France)
での分析によって測定された、機械的ショックによって得られた細胞溶解物から
の移動の後、区画Ｃｆで回収されたS. epidermidis核酸のパーセントを示す。移
動時間（分）がｘ軸で表され、区画Ｃｆで回収された核酸のパーセントがｙ軸で
表される。FIG. 2 shows a Vidas device (BioMerieux, France) according to Example 2.
5 shows the percentage of S. epidermidis nucleic acid recovered in compartment Cf after transfer from cell lysate obtained by mechanical shock, as determined by analysis in. The migration time (minutes) is represented on the x-axis, and the percentage of nucleic acid recovered in compartment Cf is represented on the y-axis.
【図３】 図３は、細胞溶解物中のタンパク質の回収の速度論を表す。細
菌溶解物中のタンパク質のパーセントは、実施例２に従って、Braddordアッセイ
によって測定された、機械的ショックによって得られた細胞溶解物からの移動の
後、区画Ｃｆで回収される。移動時間（分）がｘ軸で表され、５９５ｎｍでの光
学密度（ＯＤ）として表される区画Ｃｆで回収された核酸のパーセンテージがｙ
軸で表される。FIG. 3 depicts the kinetics of recovery of proteins in cell lysates. The percentage of protein in the bacterial lysate is recovered in compartment Cf after transfer from the cell lysate obtained by mechanical shock, measured by the Bradord assay, according to Example 2. The migration time (minutes) is represented on the x-axis and the percentage of nucleic acid recovered in compartment Cf, represented as optical density (OD) at 595 nm, is y
It is represented by an axis.
【図４】 図４は、細胞溶解物から核酸を回収する速度論を表す。電気的
ショックによって得られた細胞溶解物からの移動の後、区画Ｃｆで回収されたSt
aphycoccus epidermids核酸のパーセントを、実施例２に従ってVidas装置での分
析によって測定した。移動時間（分）がｘ軸で表され、相対的蛍光単位として表
される区画Ｃｆで回収された核酸のパーセントがｙ軸で表される。FIG. 4 depicts the kinetics of recovering nucleic acids from cell lysates. After transfer from the cell lysate obtained by electric shock, the St recovered in compartment Cf
The percentage of aphycoccus epidermids nucleic acid was determined by analysis on a Vidas apparatus according to Example 2. The transit time (minutes) is represented on the x-axis, and the percentage of nucleic acid recovered in compartment Cf, represented as relative fluorescence units, is represented on the y-axis.
【図５】 図５は、細胞溶解物から精製された核酸の増幅を表す。１０μ
ｌのＤＮＡ分子からＰＣＲによって生産されたアンプリコンの量が、実施例２に
従って、各種の移動時間の後、機械的ショックによって得られた細胞溶解物から
区画Ｃｆで回収される。移動時間（分）がｘ軸で表され、相対的蛍光単位として
表される区画Ｃｆで回収された核酸のパーセントがｙ軸で表される。FIG. 5 depicts amplification of nucleic acids purified from cell lysates. 10μ
The amount of amplicon produced by PCR from 1 DNA molecule is recovered in compartment Cf from cell lysates obtained by mechanical shock after various transit times according to Example 2. The transit time (minutes) is represented on the x-axis, and the percentage of nucleic acid recovered in compartment Cf, represented as relative fluorescence units, is represented on the y-axis.
【図６】 図６は、実施例２に従って、機械的ショックによる細菌の各種
の初期濃度の溶解、及び電場での１５分間の核酸物質の移動の後、ＰＣＲ増幅に
よって生産されたアンプリコンの量を表す。２００μｌの溶解物当たりの初期細
菌の数がｘ軸で表され、相対的蛍光単位として表される、ＰＣＲの後得られた市
シグナルがｙ軸で表される。FIG. 6 shows the amount of amplicon produced by PCR amplification after lysis of various initial concentrations of bacteria by mechanical shock and transfer of nucleic acid material for 15 minutes in an electric field, according to Example 2. Represents The city signal obtained after PCR, in which the number of initial bacteria per 200 μl lysate is expressed on the x-axis and expressed as relative fluorescence units, is expressed on the y-axis.
【図７】 図７は、実施例２に従って、機械的ショックによる細菌の各種
の初期濃度の溶解、及び電場での１５分間の核酸物質の移動の後、ＴＭＡ増幅に
よって生産されたアンプリコンの量を表す。２００μｌの溶解物当たりの初期細
菌の数がｘ軸で表され、ＯＤ×１０００として表される、ＴＭＡの後得られるシ
グナルがｙ軸で表される。FIG. 7 shows the amount of amplicon produced by TMA amplification after lysis of various initial concentrations of bacteria by mechanical shock and transfer of nucleic acid material for 15 minutes in an electric field, according to Example 2. Represents The number of initial bacteria per 200 μl lysate is represented on the x-axis and the signal obtained after TMA, represented as OD × 1000, is represented on the y-axis.
【図８】 図８は、実施例３に従って、機械的ショックにより溶解された
臨床上の血液サンプルの移動時間の関数としての、区画Ｃｆで回収された血液中
のタンパク質のパーセントを表す。移動時間（分）がｘ軸で表され、５９５ｎｍ
でのＯＤとして表される区画Ｃｆで回収されたタンパク質のパーセントがｙ軸で
表される。FIG. 8 represents the percentage of protein in blood collected in compartment Cf as a function of transit time of a clinical blood sample lysed by mechanical shock, according to Example 3. The transit time (min) is represented on the x-axis, 595 nm
The percentage of protein recovered in compartment Cf, expressed as OD in, is represented on the y-axis.
【図９】 図９は、実施例２に従って、機械的ショックにより溶解された
呼吸タイプの臨床上のサンプルの移動時間の関数としての、区画Ｃｆで回収され
る痰中のタンパク質のパーセントを表す。移動時間（分）がｘ軸で表され、５９
５ｎｍでのＯＤとして表される、区画Ｃｆで回収されたタンパク質のパーセント
がｙ軸で表される。FIG. 9 represents the percentage of protein in sputum recovered in compartment Cf as a function of the transit time of a respiratory-type clinical sample dissolved by mechanical shock, according to Example 2. The travel time (minutes) is represented on the x-axis and 59
The percentage of protein recovered in compartment Cf, expressed as OD at 5 nm, is represented on the y-axis.
【図１０】 図１０は、呼吸タイプの臨床上のサンプル中に最初に存在す
るＰＣＲのインヒビターの除去を示す。それは、実施例５に従って、S. epiderm
idis ＤＮＡの各種の初期量からＰＣＲによって生産されたＤＮＡアンプリコン
の量を示す。１０μｌのサンプル当たりのＤＮＡの初期コピーの数がｘ軸で表さ
れ、相対的蛍光単位として表される、ＰＣＲの後に得られたシグナルがｙ軸で表
される。FIG. 10 shows the removal of inhibitors of PCR that are initially present in a respiratory-type clinical sample. It is, according to Example 5, S. epiderm
Shows the amount of DNA amplicon produced by PCR from various initial amounts of idis DNA. The number of initial copies of DNA per 10 μl sample is represented on the x-axis and the signal obtained after PCR, represented as relative fluorescence units, is represented on the y-axis.
【図１１】 図１１は、区画Ｃ１で溶解され堆積した細菌の各種の初期量
から生産されたアンプリコンの量を示す。グラフに表された各時点は、実施例５
に従って、１３の多様な気管支吸引及び痰から得られた平均値を表す。２００μ
ｌのサンプル当たりのＤＮＡの初期コピーの数がｘ軸で表され、相対的蛍光単位
として表される、ＰＣＲの後に得られるシグナルがｙ軸で表される。FIG. 11 shows the amount of amplicon produced from various initial amounts of bacteria lysed and deposited in compartment C1. Each time point shown in the graph corresponds to Example 5.
Represent the average values obtained from 13 different bronchial aspirates and sputum. 200μ
The number of initial copies of DNA per 1 sample is represented on the x-axis and the signal obtained after PCR, represented as relative fluorescence units, is represented on the y-axis.
【図１２】 図１２は、実施例５に従って、機械的ショックにより溶解さ
れ区画Ｃ１に堆積した細菌の各種の初期量から生産されるアンプリコンの量を示
す。この研究は、４の異なる痰で平行に実施された。２００μｌのサンプル当た
りのＤＮＡの初期コピーの数がｘ軸で表され、ＯＤ×１０００として表される、
ＴＭＡの後に得られるシグナルがｙ軸で表される。FIG. 12 shows the amount of amplicon produced from various initial amounts of bacteria lysed by mechanical shock and deposited in compartment C1, according to Example 5. This study was performed in parallel on four different sputums. The number of initial copies of DNA per 200 μl sample is represented on the x-axis and represented as OD × 1000,
The signal obtained after TMA is represented on the y-axis.
【図１３】 図１３は、本発明に従った単一の使用のための装置の遠近図
を表す。FIG. 13 represents a perspective view of a device for single use according to the invention.
【図１４】 図１４は、図１３に示される装置の底部の図を表す。FIG. 14 depicts a bottom view of the device shown in FIG.
【図１５】 図１５は、図１３に示される装置の上部の図を表す。FIG. 15 represents a top view of the device shown in FIG.
【図１６】 図１６は、図１３に従った装置の、図１５に表される断面線
に沿った断面図を表す。FIG. 16 shows a sectional view of the device according to FIG. 13 along the section line represented in FIG.
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty
【提出日】平成１２年３月２０日（２０００．３．２０）[Submission date] March 20, 2000 (2000.3.20)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ０２Ｆ 1/46 １０３ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ブリュノ・コラン フランス・Ｆ−69280・マルスィ・レトワ ール・シュマン・デ・ギャレンヌ・23 (72)発明者 ソフィー・バラル−カディエ フランス・Ｆ−69008・リヨン・ルート・ ドゥ・ヴィエンヌ・175 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC01 FA12 FA15 4B063 QA20 QQ02 QQ03 QQ04 QQ05 QQ21 QQ41 QQ61 QS16 QS39 QX10 4D006 GA06 GA07 PB09 PB70 PC41 4D061 DA10 DC12 EA10 FA09 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme court ゛ (Reference) C12Q 1/68 C02F 1/46 103 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK) , ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR) , NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU) , TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, E , FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG , US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Bruno Corinn France F-69280 Marsi-Lettir-Chumman-des-Garennes 23 (72) Inventor Sophie Barral-Cadier France F-69008 Lyon Route de Vienne 175 F-term (reference) 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC01 FA12 FA15 4B063 QA20 QQ02 QQ03 QQ04 QQ05 QQ21 QQ41 QQ61 QS16 QS39 QX10 4D006 GA06 PC0710B10P10D FA09
Claims (22)
含む生物学的サンプルを、液体媒体中の電場の作用の下で処理する方法であり、
上記物質は電場の作用の下で上記液体媒体中で遊離し可動的であり、以下の工程
： ａ）緩衝液を準備する、 ｂ）緩衝液と片側で接触し、上記緩衝液の側に、電場の作用の下での移動の間、
核酸材料を停止するように予め定めたカットオフを備えた、浸透性の膜を準備し
、 ｃ）上記電場パターンが緩衝液の内部を通過し、浸透性の膜を通過するように、
上記電場を確立し、 ｄ）電場の作用の下で核酸物質の循環の向きにおいて、膜の上流に、生物学的サ
ンプルを緩衝液中に配置する； に従う方法において、 − 電場は、一方で緩衝液の側の核酸物質の存在を、該膜上に到達させるのに十
分な時間によって、他方で上記期間の最後に非核酸物質が移動せず、及び／また
は上記膜の側に移動する工程にあるという事実によって、制限され定義される期
間、緩衝液中の生物学的サンプルに直接適用され、 − 核酸物質は、上記期間の最後に回収され、それによって少なくとも核酸物質
が生物学的サンプルから電気分離される； ことを特徴とする方法。1. A method for treating a biological sample containing both a nucleic acid substance and a non-nucleic acid substance, for example a protein, under the action of an electric field in a liquid medium,
The substance is free and mobile in the liquid medium under the action of an electric field and comprises the following steps: a) preparing a buffer, b) contacting with the buffer on one side and, on the side of the buffer, During movement under the action of an electric field,
Providing a permeable membrane with a predetermined cut-off to stop the nucleic acid material; c) such that the electric field pattern passes through the interior of the buffer and through the permeable membrane;
Establishing said electric field, d) placing the biological sample in a buffer upstream of the membrane in the direction of circulation of the nucleic acid material under the action of the electric field; The time sufficient to allow the presence of the nucleic acid material on the liquid side to reach onto the membrane, while the non-nucleic acid material does not migrate and / or migrates to the membrane side at the end of the period Due to the fact that it is applied directly to the biological sample in the buffer for a limited and defined period of time, the nucleic acid substance is recovered at the end of said period, whereby at least the nucleic acid substance is Being separated;
請求項１記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the biological sample comprises a cell lysate.
The method of claim 1.
されることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the biological sample is placed on a side of another membrane in contact with the buffer.
３０分の間であることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the time for applying the electric field is at most 30 minutes, preferably between 5 and 30 minutes.
しい、好ましくは０．１から５ｍｏｌ／ｌの間であることを特徴とする、請求項
１または２記載の方法。5. The process according to claim 1, wherein the molarity of the buffer is at least equal to 0.1 mol / l, preferably between 0.1 and 5 mol / l. .
有することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。6. The method according to claim 1, wherein the electric field has a value between 100 and 250 volts, preferably 150 volts.
とも３０ｍｍ、好ましくは７５ｍｍであることを特徴とする、請求項１または２
記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the distance separating the biological sample from the permeable membrane is at least 30 mm.
The described method.
液のサンプルから得られることを特徴とする、請求項７記載の方法。8. The method according to claim 7, wherein the biological sample is obtained from a sample of a body fluid, such as, for example, blood or respiratory sputum.
とする、請求項１または２記載の方法。9. The method according to claim 1, wherein the proteinase is added to the biological sample.
れることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。10. The method according to claim 1, wherein the fraction enriched in the nucleic acid material is directly subjected to a subsequent amplification step.
めの単一の使用のための装置であり、電気分離のために必要とされる特に電極と
いった多様な手段、並びに一方で、生物学的サンプル、緩衝液、及び核酸物質で
富化された分画といった多様な液または液体を、支持体に向けて及び／または支
持体の外側に輸送するための手段、他方で、電場の供給及び制御を含む、少なく
とも電気分離のために必要とされる電気的手段の供給及び制御のための手段とい
った、外側で上記支持体と相互作用するための手段（１ａ、１ｂ、１ｃ）が、集
積され統合され、及び互いに整列された支持体またはベースを含むことを特徴と
する装置。11. Apparatus for single use for carrying out the method according to any one of claims 1 to 10, wherein various means are required for electrical isolation, in particular electrodes. And, on the one hand, means for transporting various liquids or liquids, such as biological samples, buffers and fractions enriched in nucleic acid material, towards and / or outside the support, Means for interacting with said support on the outside, such as means for supplying and controlling the electrical means required for at least electrical separation, including supplying and controlling the electric field (1a, 1b, 1c) comprises a support or base integrated, integrated and aligned with one another.
膜（４）によって閉ざされた区画（３１）を備え、生物学的サンプルを受け取る
ための手段（２）を備えた上記区画（３１）の反対の端部で連結した、緩衝液の
ための容器（３）で、第一の緩衝液を受け取ることを企図された容器；膜によっ
てのみ第一の容器から分離している、第一の緩衝液と同じまたは異なる第二の緩
衝液のための第二の容器（５）；電場の発生のための二つの電極（６１，６２）
であり、一方（６１）は核酸物質の循環の向きで膜の上流で、第一の緩衝液と接
触し、他方（６２）は第二の緩衝液と接触する電極；並びに膜によって閉ざされ
た区画（３１）から核酸物質で富化された分画を抽出するための手段（９）を含
むことを特徴とする、請求項１１記載の装置。12. A means (2) for receiving a biological sample; comprising a compartment (31) closed by a permeable membrane (4), comprising means (2) for receiving a biological sample. A buffer (3) connected at the opposite end of said compartment (31) for receiving a first buffer; separated from the first container only by a membrane. A second container (5) for a second buffer which is the same or different from the first buffer; two electrodes (61, 62) for the generation of an electric field
One (61) is in contact with the first buffer upstream of the membrane in the direction of circulation of the nucleic acid material and the other (62) is an electrode in contact with the second buffer; as well as closed by the membrane. Device according to claim 11, characterized in that it comprises means (9) for extracting a fraction enriched in nucleic acid material from a compartment (31).
の上流に配置され、生物学的サンプルを受け取るための手段と連絡している、生
物学的サンプルから得た少なくとも一つの分画を受け取るための別の区画（３２
）を含むことを特徴とする、請求項１２記載の装置。13. The compartment (31) wherein the container (3) is oriented in the direction of circulation of the nucleic acid substance.
A separate compartment (32) for receiving at least one fraction obtained from the biological sample, which is located upstream of and in communication with the means for receiving the biological sample.
13. The device according to claim 12, comprising:
れぞれ連絡し、並びに少なくとも一つの充填チャンネル（３４）と連絡すること
を特徴とする、請求項１２記載の装置。14. The container according to claim 12, characterized in that the two containers (3, 5) each communicate with an aeration vent (33, 53) and with at least one filling channel (34). apparatus.
手段（２）と第一の容器（３）との間に配置され連絡していることを特徴とする
、請求項１２記載の装置。15. The intermediate well (7) is arranged and connected between the means (2) for receiving a biological sample and the first container (3). 13. The apparatus according to claim 12.
を提供することを特徴とする、請求項１５記載の装置。16. Device according to claim 15, characterized in that the intermediate well (7) provides a means by which the cell sample can be lysed.
電極（８１，８２）を提供することを特徴とする、請求項１６記載の装置。17. The device according to claim 16, characterized in that the intermediate well (7) provides electrodes (81, 82) for effecting the lysis of the cell sample.
７）、及び核酸物質で富化された分画を受け取るための区画（３１）を互いに連
絡する構成を有することを特徴とする、請求項１１記載の装置。18. A compartment (32) for receiving lysate, an intermediate lysis well (
Device according to claim 11, characterized in that it comprises an arrangement for communicating with each other 7) and a compartment (31) for receiving a fraction enriched in nucleic acid material.
化された分画を受け取るための区画（３１）の容量よりも大きいことを特徴とす
る、請求項１８記載の装置。19. The method according to claim 18, wherein the capacity of the compartment for receiving the lysate is greater than the capacity of the compartment for receiving the nucleic acid-enriched fraction. Equipment.
るための区画の容量の間の比が、１／２から１／５０の間、特に１／５から１／
２０の間であることを特徴とする、請求項１９記載の装置。20. The ratio between the volume of the compartment for receiving the lysate and the volume of the compartment for receiving the nucleic acid fraction is between か ら and 1/50, in particular 1/5 to 1 /
20. The device according to claim 19, which is between 20 and 20.
るための、請求項１１から２０のいずれか一項記載の装置の使用。21. Use of an apparatus according to any one of claims 11 to 20 for fractionating nucleic acids from cell lysates or electroseparating all nucleic acids.
請求項１から１０のいずれか一項記載の方法を使用する、電気分離された分画の
使用。22. A method for detecting and / or identifying a nucleic acid directly after amplification,
Use of an electro-separated fraction using the method according to any one of claims 1 to 10.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005110503A (en) * | 2003-10-02 | 2005-04-28 | Arkray Inc | Method for purifying nucleic acid and device therefor |
| JP2006078475A (en) * | 2004-08-09 | 2006-03-23 | Nsk Ltd | Reactor and manufacturing method therefor |
| JP2013533040A (en) * | 2010-06-30 | 2013-08-22 | アンパック バイオ−メディカル サイエンス カンパニー リミテッド | Equipment for disease detection |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7338805B2 (en) | 2001-05-04 | 2008-03-04 | Bio Merieux | Labeling reagents, methods for synthesizing such reagents and methods for detecting biological molecules |
| FR2855832B1 (en) | 2003-06-03 | 2007-09-14 | Biomerieux Sa | DIAGNOSTIC AND / OR PROGNOSTIC METHOD OF SEPTIC SYNDROME |
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| FR2868071B1 (en) | 2004-03-26 | 2006-06-09 | Biomerieux Sa | MARKING REAGENTS, METHODS FOR SYNTHESIZING SUCH REAGENTS AND METHODS FOR DETECTING BIOLOGICAL MOLECULES |
| FR2868433B1 (en) | 2004-04-06 | 2008-01-18 | Biomerieux Sa | METHOD FOR THE PROGNOSIS AND / OR DIAGNOSIS OF CANCER |
| FR2881437B1 (en) | 2005-01-31 | 2010-11-19 | Biomerieux Sa | METHOD FOR THE DIAGNOSIS / PROGNOSIS OF A SEPTIC SYNDROME |
| FR2886735B1 (en) | 2005-06-01 | 2015-09-11 | Biomerieux Sa | PROCESS FOR MARKING OR PROCESSING A BIOLOGICAL SAMPLE CONTAINING BIOLOGICAL MOLECULES OF INTEREST, IN PARTICULAR NUCLEIC ACIDS |
| FR2902430B1 (en) | 2005-11-25 | 2012-11-02 | Biomerieux Sa | OLIGONUCLEOTIDES, USE, DETECTION METHOD AND KIT FOR DIAGNOSING THE PRESENCE OF INFLUENZA VIRUS H5 AND N1 GENES |
| FR2900158A1 (en) | 2006-04-25 | 2007-10-26 | Biomerieux Sa | Probe for detecting a target sequence comprises a first nucleotide segment with a sterically hindering structure at its 5' end and a second nucleotide segment complementary to the target sequence |
| FR2906537A1 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-04 | Biomerieux Sa | METHOD FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF BRONCHO-PULMONARY CANCER BY DETECTION OF ALTERNATIVE MAJORITY TRANSCRIPTS OF KLK8 GENE ENCODING KALLICREIN 8 AND USE THEREOF FOR THE PROGNOSIS OF SURVIVAL |
| FR2917090B1 (en) | 2007-06-11 | 2012-06-15 | Biomerieux Sa | MARKING REAGENTS HAVING DIAZO AND NITRO FUNCTIONS, METHODS FOR SYNTHESIZING SUCH REAGENTS AND METHODS FOR DETECTING BIOLOGICAL MOLECULES |
| FR2934595B1 (en) | 2008-07-29 | 2013-04-05 | Biomerieux Sa | MARKING REAGENTS HAVING A PYRIDINE CORE HAVING DIAZOMETHYL FUNCTION, METHODS FOR SYNTHESIZING SUCH REAGENTS AND METHODS FOR DETECTING BIOLOGICAL MOLECULES |
| MX2011007624A (en) | 2009-01-19 | 2011-10-12 | Hospices Civils Lyon | Methods for determining the likelihood of a patient contracting a nosocomial infection and for determining the prognosis of the course of a septic syndrome. |
| US9422598B2 (en) | 2010-06-04 | 2016-08-23 | Biomerieux | Method and kit for the prognosis of colorectal cancer |
| WO2012129758A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Biomerieux | Method and kit for determining in vitro probability for individual to suffer from colorectal cancer |
| US9333463B2 (en) * | 2013-07-26 | 2016-05-10 | General Electric Company | Devices and systems for elution of biomolecules |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4164464A (en) * | 1977-03-25 | 1979-08-14 | Instrumentation Specialties Company | Sample concentrator |
| US4750982A (en) * | 1985-03-21 | 1988-06-14 | Lifecodes Corp. | Process and apparatus for purifying and concentrating DNA from crude mixtures containing DNA |
| US5415758A (en) * | 1993-11-19 | 1995-05-16 | Theobald Smith Research Institute, Inc. | Method and apparatus for electro-elution of biological molecules |
| DE19610354C1 (en) * | 1996-03-15 | 1997-11-20 | Innova Gmbh | Device, method and device for isolating nucleic acids |
| GB9608644D0 (en) * | 1996-04-26 | 1996-07-03 | Scient Genarics Ltd | Nucleic acid manipulation |
-
1998
- 1998-04-10 FR FR9804878A patent/FR2777293B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-04-09 JP JP2000543820A patent/JP2002511583A/en not_active Withdrawn
- 1999-04-09 WO PCT/FR1999/000830 patent/WO1999053304A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-04-09 AU AU31518/99A patent/AU745247B2/en not_active Ceased
- 1999-04-09 CA CA002328298A patent/CA2328298A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-09 EP EP99913375A patent/EP1070246A1/en not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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