JP2002511494A

JP2002511494A - 自己抗原断片、方法及びアッセイ

Info

Publication number: JP2002511494A
Application number: JP2000544185A
Authority: JP
Inventors: ソーンバリイ，ナンシー; ローゼン，アントニー; キヤシオラ−ローゼン，リビア; アンドラード，フエリペ・アー; ニコルソン，ドナルド; ロイ，ソフイー
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-04-22
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2002-04-16
Also published as: CA2329495A1; EP1071327A1; AU3755199A; EP1071327A4; WO1999053757A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、自己抗原を生成する方法、自己抗原断片を含む組成物及び自己免疫応答に関連する状態の治療において自己抗原断片を使用する方法を提供する。また、自己免疫応答の検出あるいは評価のためのアッセイも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、自己抗原からの自己抗原断片の作製とかかる自己抗原断片の使用に
関する。

【０００２】（発明の背景）動物の成熟免疫系は自己分子と非自己分子を識別し、後者に対してのみ免疫応
答を開始する。免疫系は、通常は動物の一部である分子に絶えず接触することを
通して、いずれの分子が自己のものであるかを学習する。それ故、成熟免疫系は
自己のものである分子の存在に対して免疫寛容である。しかし、動物の体内に新
たに出現した分子に対しては免疫系は寛容でない。それらの分子は抗原と考えら
れ、従ってそれらに対する免疫応答を刺激する。一般に、新たに出現した抗原は
、感染のように体外ソースからのものである。この場合、免疫応答は抗原のソー
スを破壊し、それによって体内から感染を除去するのを助ける。

【０００３】新たに出現する抗原は、細胞成分の分解を通してｉｎｖｉｖｏで生成される
。免疫系がこれらの自己分子の分解産物を「非自己」抗原として認識すると、そ
れらに対して免疫応答が開始され、自己免疫疾患が発現すると考えられる。従っ
て、これらの抗原は一般に自己抗原と称される分子クラスのメンバーであり、そ
れらに対して産生される抗体は自己抗体と称される。本文中では明確を期して、
自己抗原は、体内で認められるような完全な自己分子を表わすために使用する。
自己抗原断片は、自己抗原の分解産物を表わすために使用する。従って、免疫応
答が誘発されるのは、自己抗原断片としてエピトープが免疫系に出現する場合で
ある。ひとたび誘発されると、免疫応答は自己抗原断片、自己抗原、あるいはそ
の両方を標的しうる。

【０００４】自己免疫疾患は、自己分子に対して特異的な免疫応答が起こり、しばしば組織
や器官の損傷と機能不全を導く疾患である。かかる疾患は、実際には器官特異的
であるか（例えばＩ型糖尿病、甲状腺炎、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変）
又は全身性である（例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性
筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、強皮症、対宿主性移植片病）。

【０００５】自己抗原断片の１つのソースはアポトーシスの際の自己抗原の開裂である。ア
ポトーシスは、広い範囲の生理的及び病理的状況で多くの異なる細胞型において
発生する、形態学的及び生化学的に異なる形態の細胞死である（（Ｊａｃｏｂｓ
ｏｎら、１９９７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９５；Ｗｈｉｔｅ、１９９６）にお
ける考察）。新しいファミリーのシステインプロテアーゼが触媒する特異的蛋白
質分解がアポトーシスを媒介する上で極めて重要であることが試験で報告されて
いる（ＣｈｉｎｎａｉｙａｎとＤｉｘｉｔ、１９９６ａ；ＭａｒｔｉｎとＧｒｅ
ｅｎ、１９９５；ＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙとＭｏｌｉｎｅａｕｘ、１９９５）。こ
れらのプロテアーゼ（カスパーゼと称される）は、アスパラギン酸で終了するコ
ンセンサステトラペプチド配列のあとの下流基質（Ｐ_１）を開裂する。カスパー
ゼは、活性化のためにアスパラギン酸残基以降の特異的蛋白質分解開裂を必要と
する不活性前駆体として合成される（（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎとＴｈｏｒｎｂｅｒ
ｒｙ、１９９７）における考察）。

【０００６】細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の細胞質
顆粒中に認められるセリンプロテアーゼであるグランザイムＢは、基質のＰ１位
置のアスパラギン酸についてカスパーゼと同様の必要条件を持つ（Ｏｄａｋｅら
、１９９１；Ｐｏｅら、１９９１）。グランザイムＢは、顆粒のエキソサイトー
シスが誘導する細胞傷害の際に標的細胞におけるアポトーシス性の核変化を引き
起こす上で重要な役割を果たすことが試験で報告された（Ｄａｒｍｏｎら、１９
９６；Ｈｅｕｓｅｌら、１９９４；Ｓａｒｉｎら、１９９７；Ｓｈｒｅｓｔａら
、１９９５；Ｔａｌａｎｉａｎら、１９９７）。

【０００７】グランザイムＢはいくつかのカスパーゼの開裂と活性化を触媒すると記述され
ている（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、１９９６ｂ；Ｄａｒｍｏｎら、１９９５；Ｄ
ｕａｎら、１９９６；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉら、１９９６；Ｇｕ
ら、１９９６；Ｍａｒｔｉｎら、１９９６；Ｍｕｚｉｏら、１９９６；Ｑｕａｎ
ら、１９９６；Ｓａｒｉｎら、１９９７；Ｓｏｎｇら、１９９６ａ；Ｓｒｉｎｉ
ｖａｓｕｌａら、１９９６；Ｔａｌａｎｉａｎら、１９９７；Ｗａｎｇら、１９
９６）。グランザイムＢはまた、標的細胞の死に寄与するカスパーゼ依存性経路
を開始させる。しかし、これらの付加的な経路についてはいくつかの候補が存在
するが、その大部分はまだ明らかにされないままである（Ｓａｒｉｎら、１９９
７；Ｔａｌａｎｉａｎら、１９９７）。

【０００８】１つの候補経路はグランザイムＢによる死亡基質の直接の蛋白質分解であるが
、このプロテアーゼについての効率的な非カスパーゼ細胞基質はまだ同定されて
いない。初期試験は、グランザイムＢが誘導する細胞死の際に認められるＰＡＲ
Ｐ、Ｕ１−７０ｋＤａ及びラミンＢの開裂はグランザイムＢによって直接行われ
るのではなく、カスパーゼによって触媒されることを示唆したが（Ｄａｒｍｏｎ
ら、１９９５；Ｍａｒｔｉｎら、１９９６；Ｔａｌａｎｉａｎら、１９９７）、
ｉｎｖｉｔｒｏ及び顆粒誘導の細胞傷害の際の他のカスパーゼ基質へのグラン
ザイムＢの作用は広汎には検討されていない。

【０００９】（図面の簡単な説明）図１。グランザイムＢは、ｉｎｖｉｔｒｏで様々な効率で精製ＤＮＡ−ＰＫ _ＣＳ、ＮｕＭＡ、ＰＡＲＰ並びにカスパーゼ３及び７を開裂する。０−１２．５
ｎＭのグランザイムＢ（ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＮｕＭＡについて）又は０−５０ｎ
ＭのグランザイムＢ（カスパーゼ３及び７とＰＡＲＰについて）を含む反応を、
実施例１で述べたように実施した。蛍光光度法又は免疫ブロット法（モノクロー
ナル抗体１８−２を使用してＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを検出した）によって開裂断片を
検出した。各々のパネルの右側に、無傷分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動位置を矢
印で表わし、断片の大きさを示している。

【００１０】図２。精製グランザイムＢ又はカスパーゼ−３によるｉｎｖｉｔｒｏでの自
己抗原の開裂は様々な断片を生じる。３０ｎＭの精製ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ（レーン
１−３）、ＨｅＬａ溶解産物中の内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＮｕＭＡ（レーン４
−９）又は［^３５Ｓ］メチオニン標識ＰＡＲＴ（レーン１０−１２）を含む反応
を、次の量のグランザイムＢと共にインキュベートした：１．２５ｎＭ（レーン
２）；１２．５ｎＭ（レーン５と８）又は５０ｎＭ（レーン１１）。次の量のカ
スパーゼ−３を使用してこれらの基質に関する同様の実験を行った：４２ｐＭ（
レーン３と１２）又は１００ｐＭ（レーン６と９）。反応混合物を３７℃で１５
分間（グランザイムＢの反応）又は６０分間（カスパーゼ−３の反応）インキュ
ベートした。グランザイムＢを使用してＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＨｅＬａ細胞溶解
産物中のＮｕＭＡを開裂するときには、ＨｅＬａ細胞カスパーゼの活性化を防ぐ
ために１００ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを加えたことに留意されたい。無傷
の開裂したＮｕＭＡとＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを免疫ブロット法で視覚化し、ＰＡＲＰ
はオートラジオグラフィーで視覚化した。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの場合には、モノク
ローナル抗体２５−４（Ｃ末端に対して指令）及び１８−２（Ｎ末端に対して指
令）を用いて得たブロットをそれぞれレーン（１−３）と（４−６）に示してい
る。

【００１１】図３。グランザイムＢによる開裂後、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのキナーゼ活性は消失
する。１０μｇ／ｍｌのＤＮＡの不在下（レーン２と４）又は存在下（レーン１
と３）で、無傷のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ（レーン１と２）又はグランザイムＢで開裂
したＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ（レーン３と４）を用いてキナーゼアッセイを実施した。
レーン５では対照として、完全なキナーゼ反応混合物からＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ自体
を排除した。ＳＰ１基質のリン酸化をオートラジオグラフィーによって検出した
。

【００１２】図４。ＨｅＬａ細胞溶解産物中の内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＮｕＭＡは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで精製グランザイムＢを加えてインキュベートした後、カスパーゼ
非依存的に開裂される。１００ｎＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（レーン３と６）
又は１００ｎＭＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（レーン４と７）の存在下で、１２．
５ｎＭの精製グランザイムＢ（レーン５−７）又は１０５ｐＭの精製カスパーゼ
−３（レーン２−４）を対照ＨｅＬａ細胞の溶解産物に加えた。３７℃で６０分
間インキュベートした後、反応を終了した。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰ
ＡＲＰを実施例１で述べたように免疫ブロット法によって検出した（モノクロー
ナル抗体１８−２を用いてＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを検出した）。各レーンで等量の蛋
白質を電気泳動した。

【００１３】図５。グランザイムＢはＶＧＰＤ^２６９８−Ｆ^２６９９及びＤＥＶＤ^２７１２ −Ｎ^２７１３でＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを開裂する。［^３５Ｓ］メチオニン標識野生型
（ｗｔ）ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳポリペプチド（ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ ^{２５６６−２９２８} ）並びに推定グランザイムＢ開裂部位（Ｄ^２６９８Ａ）と既知のカスパーゼ−３
開裂部位（Ｄ^２７１２Ａ）のＰ１位置での突然変異を含む２個の放射能標識ポリ
ペプチドを実施例１で述べたように生成した。これらのポリペプチドを、プロテ
アーゼを加えずに（レーン１、４及び７）又は８ｎＭ組換えカスパーゼ−３の存
在下に（レーン２、５及び８）又は８ｎＭ精製グランザイムＢの存在下に（レー
ン３、６及び９）、３７℃で６０分間インキュベートした。反応を終了した後、
サンプルを電気泳動し、無傷のポリペプチドと開裂産物を蛍光光度法によって検
出した。１８ｋＤａ（ａ）、２８ｋＤａ（ｂ）、２０ｋＤａ（ｃ）及び２６ｋＤ
ａ（ｄ）の断片サイズを生じた（下部の図式的表示のパネル参照）。

【００１４】図６。内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰは、ｉｎｖｉｖｏで
無傷のＫ５６２細胞をＹＴ細胞顆粒内容物と共にインキュベートした後開裂され
る。１００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの不在下（レーン１−３）又は存在下
に（レーン４）、Ｋ５６２細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。次にこ
れらの細胞懸濁液のアリコート（各々３×１０^５のＫ５６２細胞を含む）を、１
ｍＭＣａ^２＋（レーン１）、１ｍＭＥＤＴＡ＋ＹＴ細胞顆粒内容物（レーン
２）又は１ｍＭＣａ^２＋＋ＹＴ細胞顆粒内容物（レーン３と４）の存在下に３
７℃で９０分間さらにインキュベートした。反応を終了した後、ＤＮＡ−ＰＫ_Ｃ _Ｓ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰを実施例１で述べたように免疫ブロット法によって検
出した（患者血清Ｇ．Ａ．を使用してＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳをブロットした）。

【００１５】図７。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのグランザイムＢ特異的断片はＬＡＫ細胞によって攻
撃したＫ５６２細胞において生成される。Ｆａｓ陰性Ｋ５６２標的細胞を、１０
０μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの不在下（レーン１−３）又は存在下に（レー
ン４）３７℃で１時間プレインキュベートし、次いでさらに４時間コインキュベ
ートする（エフェクター：標的比５：１）。反応を終了した後、各々のゲルレ
ーンで次の数の細胞を電気泳動する：１．７×１０^６ＬＡＫ細胞（レーン１）；
０．３４×１０^６Ｋ５６２細胞（レーン２）；１．７×１０^６ＬＡＫ細胞プラス
０．３４×１０^６Ｋ５６２細胞（レーン３と４）。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＰＡＲＰ
を免疫ブロット法によって検出した；患者血清Ｇ．Ａ．を使用してＤＮＡ−ＰＫ _ＣＳを検出した。

【００１６】図８。ｉｎｖｉｖｏでＹＴ細胞顆粒内容物と共にインキュベートした後、無
傷ＨｅＬａ細胞においてＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ非感受性の核形態変化が誘発さ
れる。実験手順に述べたように、ＨｅＬａ細胞を１００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−
ＣＨＯの不在下（８Ａと８Ｂ）又は存在下に（８Ｃ）３７℃で１時間、ＹＴ細胞
顆粒内容物と共にインキュベートした。固定して透過性を上げた後、ＰＡＲＰに
対する抗体、並びにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とＤＡＰＩで細胞を染色した。
ＦＩＴＣヤギ抗ヒト抗体で抗体染色を視覚化した。抗体染色（緑色）、ＰＩ染色
（赤色）及びＤＡＰＩ染色（青色）を合併した画像を示している。（８Ａ、８Ｂ
）：ＹＴ細胞顆粒内容物は、凝縮した核（８Ａ）あるいはアポトーシス細胞体（
８Ｂ、矢印）の縁へのＰＡＲＰの特徴的な再分布を伴って、顕著なＰＩに富む表
面気泡、核凝縮と断片化を誘発する。（８Ｃ）：顆粒内容物は、Ａｃ−ＤＥＶＤ
−ＣＨＯの存在下でも著しい核凝縮を誘発する（矢印）；近接して、比較のため
にまだ形態変化を受けていない正常なＨｅＬａ細胞核を示している（矢印の先端
）。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる処理はＰＩに富む表面気泡、核の断片化、及
びＰＡＲＰの再分布を消失させることに注目されたい。サイズ表示棒：８Ａ：４
．４μｍ；８Ｂ：４．０μｍ；８Ｃ：６．６μｍ。

【００１７】図９。図９Ａ−９Ｂは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ２８４３３７；ＰＩＤｇ２８
４３３７；ＤＢＳＯＵＲＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ａ４２１８４においてＥｎｔｒ
ｅｚに認められるようなＮｕＭＡの２１０１個のアミノ酸配列を示す。

【００１８】図１０。図１０Ａ−１０Ｂは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１０７２２７；ＰＩＤ
ｇ１０７２２７；ＤＢＳＯＵＲＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ｓ２３６４７においてＥ
ｎｔｒｅｚに認められるようなＮｕＭＡの２１１５個のアミノ酸配列を示す。

【００１９】図１１。図１１Ａ−１１Ｂは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１３６２７８９；ＰＩＤ
ｇ１３６２７８９；ＤＢＳＯＵＲＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ａ５７０９９におい
てＥｎｔｒｅｚに認められるようなＤＮＡＰＫ_ＣＳのアミノ酸配列を示す。

【００２０】図１２。図１２Ａ−１２Ｂは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１３０７８１；ＰＩＤ
ｇ１３０７８１；ＤＢＳＯＵＲＣＥＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：遺伝子座ＰＰＯＬ
＿ＨＵＭＡＮ、アクセッションＰ０９８７４（参考文献１２のうち１と２のみを
リストしている）においてＥｎｔｒｅｚに認められるようなＰＡＲＰのアミノ酸
配列を示す。

【００２１】（発明の要旨）本発明は、自己抗原断片及び自己免疫疾患の処置におけるそれらの使用のため
の方法を提供する。また、自己免疫疾患の存在を含めて、動物における自己免疫
状態を検出するためのアッセイを提供する。

【００２２】下流基質のカスパーゼ媒介の蛋白質分解は、現在までに検討されたすべての形
態のアポトーシスに共通する中心的な執行経路の必須要素である。細胞溶解性リ
ンパ球顆粒誘導の細胞死はこのカスパーゼ依存性経路を活性化するが、最近の試
験で、この形態の細胞死におけるカスパーゼ非依存性経路についての証拠も提供
された。しかし、顆粒が誘導する細胞死の際のグランザイムＢ（及び潜在的な他
の顆粒プロテアーゼ）に関する非カスパーゼ基質はこれまで定義されていなかっ
た。本発明は、細胞成分がｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで、特にグラン
ザイムＢを含めた顆粒内容物によって直接且つ効率的に開裂されること、そして
この開裂が他の形態のアポトーシスの際には認められない独自の自己抗原断片の
生成を導くという所見を利用するものである。下流の死亡基質を自己抗原断片に
開裂するというグランザイムＢのこの直接のカスパーゼ非依存性能力は、内因性
アポトーシスカスケードのシグナル成分又は執行成分の阻害因子に対して感受性
のない、アポトーシスエフェクター機序である。

【００２３】本発明の１つの局面は、少なくとも１つの自己抗原断片を含む組成物である。
自己抗原断片は自己抗原への顆粒酵素の作用によって生成される。好ましい実施
態様では、酵素はＣＴＬ、ＮＫ又はＬＡＫ細胞顆粒の顆粒酵素である。最も好ま
しい実施態様では、酵素はグランザイムＢであり、抗原断片は、カスパーゼによ
って開裂されない部位でのグランザイムＢによる自己抗原の開裂によって生成さ
れる。好ましい実施態様では、自己抗原はＤＮＡＰＫ_ＣＳ、ＰＡＲＰ又はＮｕ
ＭＡである。最も好ましい実施態様では、自己抗原断片は、アミノ酸２６９９か
ら４０９６のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸３２１１から４０９６のＤＮＡ−ＰＫ _ＣＳ；アミノ酸１から５３７のＰＡＲＰ；アミノ酸５３８から１００４のＰＡＲ
Ｐ；アミノ酸４１２から２１１１のＮｕＭＡ及びアミノ酸１から１７９９のＮｕ
ＭＡの１つ又はそれ以上である。

【００２４】本発明の１つの局面は、１又はそれ以上の精製・単離された自己抗原断片で作
製される製薬組成物である。好ましい実施態様では、自己抗原断片は、カスパー
ゼによって開裂されない自己抗原中の部位でのグランザイムＢの開裂から誘導さ
れる少なくとも１つの末端を持つ。製薬上許容される担体も含まれる。好ましい
実施態様では、組成物は次の自己抗原断片の１つ又はそれ以上を含む：アミノ酸
２６９９から４０９６のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸３２１１から４０９６のＤ
ＮＡ−ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸１から５３７のＰＡＲＰ；アミノ酸５３８から１００
４のＰＡＲＰ；アミノ酸４１２から２１１１のＮｕＭＡ及びアミノ酸１から１７
９９のＮｕＭＡ。もうひとつの好ましい実施態様では、製薬組成物は悪性細胞か
ら誘導される１つ又はそれ以上の自己抗原断片を含む。

【００２５】本発明の１つの局面は、本発明の自己抗原断片を患者に投与することにより、
自己免疫疾患のための処置を必要とする患者を処置する方法である。自己免疫疾
患は、実際には、器官特異的、例えばＩ型糖尿病、甲状腺炎、重症筋無力症、原
発性胆汁性肝硬変であるか、又は全身性、例えば全身性エリテマトーデス、慢性
関節リウマチ、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、強皮症、対宿主性
移植片病である。１つの好ましい実施態様では、処置は治療的である。例えば、
免疫疾患に罹患している患者に、患者の血清中の自己抗体が断片に結合すること
ができる条件下で血清を断片に接触させることにより、自己抗原断片を投与する
ことができる。この実施態様では、患者の体内の循環自己抗体のレベルを低下さ
せることができる。もうひとつの実施態様では、処置は予防的である。この実施
態様では、自己免疫疾患を発現する危険性のある患者を少なくとも１つの自己抗
原断片に対して免疫寛容にする。その後は、後日ｉｎｖｉｖｏで自己抗原断片
の産生を生じさせる自己免疫疾患の危険度又は重症度が低下する又は排除される
。好ましい実施態様では、自己免疫疾患が起こりうる標的組織を同定し、少なく
とも１つの顆粒酵素を供給し、顆粒酵素を標的組織からの細胞に接触させて細胞
中に存在する自己抗原の自己抗原断片を生成することによって患者を免疫寛容に
する。その後自己抗原断片を患者に投与し、断片の存在に対して患者を免疫寛容
にする。好ましい実施態様では、自己抗原は標的組織の細胞から部分的に又は完
全に精製することができる。顆粒酵素はまた、自己抗原と接触させる前に部分的
又は完全に精製することもできる。酵素は組換え法によっても作製できる。好ま
しい実施態様では、自己抗原断片は、患者に投与する前に部分的又は完全に精製
される。免疫寛容の予防的方法においては、自己抗原断片を、断片に対する免疫
応答が生じないようにデザインされた製薬上許容される組成物として投与する、
すなわち免疫促進性アジュバントを断片と共に投与しない。好ましい実施態様で
は、処置は次の自己抗原断片の１つ又はそれ以上を使用する：アミノ酸２６９９
から４０９６のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸３２１１から４０９６のＤＮＡ−Ｐ
Ｋ_ＣＳ；アミノ酸１から５３７のＰＡＲＰ；アミノ酸５３８から１００４のＰＡ
ＲＰ；アミノ酸４１２から２１１１のＮｕＭＡ及びアミノ酸１から１７９９のＮ
ｕＭＡ。

【００２６】本発明の１つの局面は、悪性疾患の処置を必要とする患者を処置する方法であ
る。好ましい実施態様では、リンパ球顆粒の少なくとも１つの酵素を患者からの
悪性細胞に接触させる。これは、悪性細胞に由来する自己抗原断片を含む混合物
を生成することができる。断片を、好ましくはアジュバントと共に患者に投与し
て、悪性細胞に対する免疫応答を活性化させる。

【００２７】本発明の１つの局面は、患者における自己抗原断片の検出のためのアッセイで
ある。１つの実施態様では、患者のサンプル中に断片が存在するか否かが、患者
に自己免疫状態が存在するか否かの指標である。好ましい実施態様では、患者か
らのサンプルを、自己抗原断片の潜在型エピトープに特異的に結合する抗体に接
触させる。好ましくは、断片は、カスパーゼによって開裂されない部位でのグラ
ンザイムＢによる自己抗原の開裂に由来する少なくとも１つの末端を持つ。次に
、自己抗原断片への抗体の結合が存在するか否かを、患者において自己免疫状態
が存在するか否かの指標として評価する。これに代わる実施態様では、自己抗原
断片に結合する抗体の検出が患者における自己免疫状態の存在又は不在の指標で
ある。この実施態様では、患者からのサンプルを、顆粒酵素による開裂から誘導
される少なくとも１つの末端を持つ自己抗原断片と接触させる。サンプル中の自
己抗体が自己抗原断片に結合しているか否かを検出することが、患者において自
己免疫状態存在するか否かの指標である。

【００２８】本発明の１つの局面は、自己抗原から自己抗原断片を作製する方法である。好
ましい実施態様では、少なくとも１つの自己抗原を含む細胞を単離し、細胞をリ
ンパ球顆粒酵素と接触させて少なくとも１つの自己抗原断片を含む混合物を生成
する。さらなる実施態様では、混合物から少なくとも１つの自己抗原断片を分離
する。好ましい実施態様では、少なくとも１つの自己抗原を精製し、精製した自
己抗原をグランザイムＢと接触させる。さらなる好ましい実施態様では、グラン
ザイムＢと接触させるために次の自己抗原の１つ又はそれ以上を精製する：ＤＮ
Ａ−ＰＫ_ＣＳ、ＰＡＲＰ及びＮｕＭＡ。各々の実施態様において、顆粒酵素は、
リンパ球、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞（Ｎ
Ｋ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）及びＹＴ細胞系の細胞の顆粒か
ら単離することができる。

【００２９】本発明のすべての局面において、個々の実施態様の中でグランザイムＢを使用
することができ、かかる酵素は、顆粒含有リンパ球の顆粒から精製するか、又は
組換え手法によって調製することができる。

【００３０】定義：本文中で使用するとき、「処置」は、患者に対する組成物の治療的又は予防的
適用を含む。処置は、患者において疾患を予防、緩和又は治癒することができる
。処置が疾患に関連する少なくとも１つの症状の重症度又は頻度を軽減するとき
、患者において疾患が緩和される。処置は次のいずれかによって疾患を緩和する
ことができる：（１）疾患が発生したときに疾患の少なくとも１つの症状の影響
度を軽減するための、疾患のない患者への組成物の予防的投与又は（２）疾患の
少なくとも１つの症状を軽減するための、疾患を有する患者への治療的投与。

【００３１】本文中で使用するとき、「患者」は動物、特にヒトを含めた動物である。

【００３２】本文中で使用するとき、「自己免疫状態」は、患者における自己免疫疾患又は
自己免疫応答の存在又はそれらの発現のための素因の存在である。

【００３３】本文中で使用するとき、「自己抗原」は細胞分子であり、通常は蛋白質である
。免疫系は正常な条件下では体内で自己抗原の存在に対して寛容であるので、自
己抗原は典型的には抗原性ではない。自己抗原は典型的には少なくとも１つの潜
在型エピトープを含む。自己抗原は、適宜に、組換え法を用いた天然細胞によっ
て又は化学合成を通して生成することができる。

【００３４】本文中で使用するとき、「自己抗原断片」は自己抗原の分解産物である。自己
抗原断片は、免疫系が体内でその存在に対して寛容でないため、抗原性である。
自己抗原断片は通常免疫系に対して潜在型エピトープを示す。自己抗原断片は、
適宜に、組換え法を用いて細胞系又は細胞不含系において少なくとも１つの顆粒
酵素の作用を通して天然細胞によって生成されうるか、あるいは化学合成を通し
て生成することができる。

【００３５】本文中で使用するとき、「自己抗体」は、自己抗原断片の存在に応答して動物
の免疫系によって産生される抗体である。自己抗体は自己抗原断片、断片が由来
する自己抗原、又はその両方に結合することができる。

【００３６】本文中で使用するとき、「顆粒含有リンパ球」は、顆粒を含むすべてのリンパ
球を含むことが意図されている。特に、かかる語は、時として細胞傷害性リンパ
球と称される細胞型のファミリーを含み、これらの細胞から誘導される細胞系を
含み、さらに細胞傷害性リンパ球様細胞系、好ましくはＹＴ細胞系を含めて用い
られる。好ましい細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー
細胞（ＮＫ）及びリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）のような当該技術に
おいて既知の顆粒含有リンパ球である。

【００３７】本文中で使用するとき、「リンパ球顆粒酵素」又は「顆粒酵素」は、顆粒含有
リンパ球の顆粒中に認められる酵素である。顆粒酵素は、蛋白質精製の技術にお
いて一般的に用いられる方法によってリンパ球顆粒から精製することができる。
さらに、顆粒酵素は当該酵素に関する遺伝子をクローニングすることによって調
製でき、その後組換え酵素の生産において一般的に用いられる方法を使用して酵
素を調製する。

【００３８】本文中で使用するとき、「精製された」及び／あるいは「単離された」は、当
該蛋白質及びポリペプチド、又はそのそれぞれの断片がそのｉｎｖｉｖｏ環境
から切り離されていることを表わすために交換可能に使用される。蛋白質又はそ
の断片は、天然に認められるものよりも少なくとも約５倍から１０倍高い濃度で
得られるとき、「精製された」及び／あるいは「単離された」とみなされる。蛋
白質又はその断片は、天然に認められるものよりも少なくとも約１００倍高い濃
度で得られる場合、実質的に純粋とみなされる。蛋白質又はその断片は、天然に
認められるものよりも少なくとも約１０００倍高い濃度で得られる場合、本質的
に純粋とみなされる。蛋白質は、少なくとも精製又は単離されているが、本質的
に純粋でない場合、時として、部分的に精製されたと称される。化学合成された
蛋白質は、その化学的前駆物質から精製されたとき、実質的に精製されたとみな
される。精製又は分離された蛋白質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体、アミノ酸配列決定、及びペプチド消化を生じる機会を与える量で蛋白質又は
蛋白質断片を入手することのように、但しそれには限定されないが、当業者によ
って操作されうる。それ故、本文中で特許請求する自己抗原断片は、細胞溶解産
物中に存在するか、あるいは実質的に又は本質的に純粋な形態で存在しうる。

【００３９】略語：Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ｎ−（Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ）−３−
アミノ−４−オキソブタン酸；Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ｎ−（Ｎ−Ａｃ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ）−３−アミノ−４−オキソブタン酸；ＣＴＬ、細胞傷害性
Ｔリンパ球；ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＤＮＡ依存性蛋白質キナーゼ触媒サブユニット
；ＬＡＫ細胞、リンホカイン活性化キラー細胞；ＮＫ細胞、ナチュラルキラー細
胞；ＮｕＭＡ、核有糸分裂装置蛋白質；ＰＡＲＰ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポ
リメラーゼ；ＰＩ、ヨウ化プロピジウム（発明の詳細な説明）本発明は、自己抗原断片及び自己免疫疾患の処置におけるそれらの使用のため
の方法を提供する。また、自己免疫疾患の存在を含めて、動物における自己免疫
状態を検出するためのアッセイを提供する。

【００４０】本発明は、リンパ球顆粒の内容物が細胞に及ぼす作用が引き金となる形態のア
ポトーシスの際に、これまで認識されていなかった分類の自己抗原断片が生成さ
れるという発見を利用するものである。特にリンパ顆粒に見られる酵素は、蛋白
細胞自己抗原を開裂して、以前に見られなかった自己抗原断片を産生する。この
自己抗原断片の生成においては、グランザイムＢが重要な顆粒酵素であることが
認められている。この酵素は以前から、プロカスパーゼ酵素の一部を開裂して活
性カスパーゼを生じることが知られていた。現在、グランザイムＢは異なる部位
でカスパーゼの基質の一部を直接開裂して、新規自己抗原断片を産生することが
わかっている。

【００４１】本発明は、グランザイムが産生する自己抗原断片をいくつかの方法によりｉｎ
ｖｉｔｒｏで生成する方法を提供する。好ましい実施態様では、精製グランザ
イムＢを精製基質に接触させ、自己抗原断片を生成することができる。部分的又
は完全に精製された酵素を、部分的又は完全に精製された基質あるいは基質を含
む細胞溶解産物に対して使用することもできる。この場合は、基質の開裂後に自
己抗原断片を精製することができる。さらに、顆粒の内容物を使用して、顆粒内
容物又は精製基質又は患者から単離された組織サンプルの適用によりグランザイ
ムＢの作用によって産生されるカスパーゼ基質の自己抗原断を含めて、細胞成分
の自己抗原断片を生成することができる。一部の実施態様では、細胞を顆粒内容
物に接触させる前に、組織の細胞を溶解又は機械的破砕によって破壊して細胞の
内容物を放出させることができる。

【００４２】本文中で提供する自己抗原断片は、自己抗原断片の存在に対して患者を免疫寛
容にするための処置において使用できる。ひとたび免疫寛容が生じれば、患者は
その後体内での断片の出現に関連する自己免疫疾患を発現しなくなる。寛容誘導
の戦略は、非凝集形態の当該自己抗原断片の精製を含む。低用量の断片を、好ま
しくは低域免疫寛容を誘導するアジュバントを伴わずに、製薬上許容される担体
中で注入する。

【００４３】本発明はまた、患者において特定細胞に対する免疫応答を誘導する方法を提供
する。例えば、患者において悪性細胞に対する免疫応答を誘導することを所望す
る場合には、患者から細胞のサンプルを単離して、顆粒含有リンパ球から分離し
た顆粒の内容物に細胞を接触させることができる。細胞への顆粒内容物の作用が
自己抗原断片を生じさせることができる。一部の実施態様では、悪性細胞を溶解
又は機械的破砕によって破壊し、細胞を顆粒内容物に接触させる前に細胞の内容
物を放出させることができる。いずれの場合も、生じる混合物又は精製成分を患
者に投与することができる。このようにしてつくられる自己抗原断片は、例えば
ＣＴＬ、ＮＫ及びＬＡＫ細胞を含めて、顆粒含有リンパ球の悪性細胞への作用に
よってｉｎｖｉｖｏで産生されるものと同じであるので、それによって免疫系
が刺激され、悪性細胞に対する応答を生じる。それ故、本発明は、悪性細胞のよ
うな特定の種類の細胞に対して働く自然の免疫系プロセスを高める又は刺激する
ための方法を提供する。

【００４４】本文中で述べる発明において有用な自己抗原断片は潜在型エピトープを示す。
これらのエピトープは、顆粒に含まれる酵素によって前駆体蛋白質が自己抗原断
片に開裂された後で免疫系に現われる。説得力を持つ量の文献が、自己免疫疾患
における自己抗原への高度に特異的な体液性免疫応答がＴ細胞依存性であり、こ
の活性化された免疫系を自身の抗原で再度攻撃誘発すると、自己免疫疾患におけ
る拡大が生じることを報告している（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｒ．Ｗ．ら、１９
９３；Ｄｉａｍｏｎｄｏ，Ｂ．ら、１９９２；Ｒａｄｉｃ，Ｍ．Ｚ．とＭ．Ｗｅ
ｉｇｅｒｔ，１９９４における考察）。しかし、これらの分子に対する一次免疫
応答の開始、そしてその後の標的抗原に対する二次応答の刺激の原因となる機序
は完全には解明されていない（Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｆ．とＳ．Ｋｏｕｔｏｕｚｏｖ，
１９９７；Ｓｅｒｃａｒｚ，Ｅ．Ｅ．とＳ．Ｋ．Ｄａｔｔａ，１９９４）。免疫
寛容は全蛋白質抗原の自然のプロセシングの際に閾値以上の濃度で生成され、提
供される支配的決定基に対してのみ誘導されるので、Ｔ細胞の自己反応性につい
ての潜在的可能性は、自己分子の種々の領域の免疫学的不等価性にあることがい
くつかの試験で報告されている（（Ｓｅｒｃａｒｚ，Ｅ．Ｅ．ら、１９９３；Ｌ
ａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．１９９５）における考察）。抗原プロセシングの
際に全く生成されないか又は閾値より低いレベルで生成される（潜在型と称され
る）決定基は、Ｔ細胞を寛容化しない。従って、この潜在型自己エピトープを認
識する潜在的に自己反応性のＴ細胞は残存する。

【００４５】正常な潜在型決定基が免疫系に対して顕在となるとき自己免疫が起こりうると
いう機序は高い注目を集めた。現在いくつかの実験系が、自己分子における支配
型と潜在型のエピトープのバランスは、分子の「免疫学的」構造を変化させる力
によって深い影響を受けると考えられる証拠を提供している（Ｌａｎｚａｖｅｃ
ｃｈｉａ，Ａ．１９９５）。例としては、新しい開裂を通して（Ｂｏｃｋｅｎｓ
ｔｅｄｔ，Ｌ．Ｋ．ら、１９９５；Ｍａｍｕｌａ，Ｍ．Ｊ．１９９３）、あるい
は高い親和性のリガンド結合によって誘導されるコンフォメーションの変化を通
しての（Ｓａｌｅｍｉ，Ｓ．ら、１９９５；Ｓｉｍｉｔｓｅｋ，Ｐ．Ｄ．ら、１
９９５；Ｗａｔｔｓ，Ｃ．とＡ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、１９９３）潜在型
エピトープの顕在化を含む。それ故、種々の自己免疫疾患を特徴づける独自の高
い力価の自己抗体応答は、免疫前環境に非寛容構造の閾値以上の濃度が発現し、
従って一次免疫応答の開始のための厳密な判定基準を満たす、開始事象の免疫学
的痕跡とみなすことができる（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．とＡ．Ｒｏ
ｓｅｎ、１９９７）。

【００４６】アポトーシスの際の自己抗原の構造の変化は、免疫系による特定分子の標的の
基礎となる重要な特性である。アポトーシスの際にそれらの自己抗原のどの構造
がどのように開裂されるかを理解することは、自己免疫応答の開始におけるアポ
トーシスの役割についての洞察を提供する。そのような機序の１つは、顆粒含有
リンパ球において認められる顆粒の内容物中の酵素の作用を含み、本文中でそれ
について述べる。これらの顆粒の内容物は、自己抗原を自己抗原断片へと開裂す
ることによって潜在型エピトープを顕在化させる働きをすることが示されている
。好ましい方法では、グランザイムＢは自己抗原蛋白質を開裂して、免疫系に対
して潜在型エピトープを顕示する好ましい自己抗原断片を作製する。

【００４７】カスパーゼ阻害因子を用いた最近の報告は、標的細胞の死が細胞傷害性リンパ
球顆粒のエキソサイトーシスによって誘導されるときのカスパーゼ非依存性経路
の寄与を強調している（Ｓａｒｉｎら、１９９７；Ｔａｌａｎｉａｎら、１９９
７）。ここに示されている結果は、アポトーシスの際にカスパーゼファミリーの
プロテアーゼによって開裂される下流基質のいくつかは、ｉｎｖｉｔｒｏとリ
ンパ球顆粒誘導の細胞傷害を受ける標的細胞の両方において、グランザイムＢに
よっても直接且つ効率的に開裂されることを明らかにしている。このことは、こ
の形態の細胞死において効率的なカスパーゼ非依存性蛋白質分解経路が存在する
ことを確認する。

【００４８】カスパーゼ−３の下流基質の必ずしも全部が同様の効率でグランザイムＢによ
って開裂されるわけではない。ＰＡＲＰとＵ１−７０ｋＤａの場合には、カスパ
ーゼ−３による開裂の効率はグランザイムＢによるものを２００倍以上上回るが
、ＮｕＭＡとＤＡＮ−ＰＫ_ＣＳはグランザイムＢとカスパーゼ−３によって同様
の効率で開裂される（表Ｉ）。２つのプロテアーゼによる所与の基質の相対的な
開裂効率は、無傷細胞においてカスパーゼ−３の活性が阻害されるときに認めら
れる結果を説明すると思われる。すなわち、顆粒媒介の細胞傷害の際に、ＰＡＲ
Ｐの開裂はＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによって阻害されるが、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及
びＮｕＭＡの開裂はごくわずかしか影響を受けない。それ故、顆粒が媒介する細
胞死のカスパーゼ非依存性成分は、グランザイムＢ（及び潜在的に他の顆粒プロ
テアーゼ）によって効率的に開裂される下流基質の機能を変化させることを通し
て生じると考えられる。

【００４９】ここに示す結果は、無傷細胞モデルにおけるＰＡＲＰとＵ１−７０ｋＤａ（ど
ちらもグランザイムＢに関しては非効率的な直接基質）のグランザイムＢ誘導の
蛋白質分解が、カスパーゼ阻害因子によって良好に阻害されたという最近の試験
と一致する（Ｔａｌａｎｉａｎら、１９９７）。かかる結果は、ＣＴＬ誘導の標
的細胞死の際に、あるいはｉｎｖｉｔｒｏでグランザイムＢによって、特徴的
なＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ断片を明らかにすることができなかったこれまでの試験とは
異なっている（Ｓｏｎｇら、１９９６ａ）。２つの試験で使用したＤＮＡ−ＰＫ _ＣＳに対する抗体が異なることが、過去の試験では特徴的な１００ｋＤａＣ末
端断片がグランザイムＢによって生成されることを認められなかった理由であろ
うと考えられる。

【００５０】上記の結果は、グランザイムＢによるＮｕＭＡとＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの直接且つ
効率的な開裂は、他の形態のアポトーシスにおいてカスパーゼの開裂によって生
じるものと同様の機能的作用を達成することを示唆する。これは、グランザイム
ＢによるＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの開裂がそのキナーゼ活性を完全に消失させるという
所見によって裏付けられる（図３）。このグランザイムＢが媒介するＤＮＡ−Ｐ
Ｋ_ＣＳの開裂は、いくつかの点でカスパーゼ−３媒介のこの基質の開裂とは異な
っている：（ｉ）ＤＮＡ末端の存在はグランザイムＢ媒介の開裂の効率を有意に
低下させるが、一方カスパーゼ−３によるＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの開裂にはＤＮＡ末
端が必要である（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９６；Ｓｏｎｇら、１
９９６ｂ）。（ｉｉ）ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのカスパーゼ−３による開裂はそのキナ
ーゼ活性を対照レベルの約６０％に低下させるが（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅ
ｎら、１９９６）、グランザイムＢによる開裂はキナーゼ活性を完全に排除する
。これらのデータは、グランザイムＢが、顆粒媒介の細胞傷害の非常に早期に、
有意のヌクレオソーム間のＤＮＡ開裂が起こる前、従ってカスパーゼ−３がＤＮ
Ａ−ＰＫ_ＣＳを有効に開裂することができるより以前に、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを開
裂し、完全に不活性化することを示唆している。ひとたび豊富なＤＮＡ末端が生
成されれば、カスパーゼ−３による開裂が支配的となるはずである（生じる断片
は残存キナーゼ活性を有している）。

【００５１】ｉｎｖｉｖｏでのアポトーシスの際のカスパーゼによる基質開裂の機能的な
結果はほとんどの基質について不明であるが、最近の報告は、開裂が決定的なア
ポトーシス前活動（例えばカスパーゼ−３によるＤＮＡ断片化因子の活性化（Ｌ
ｉｕら、１９９７））を活性化することを明らかにしている。別の場合には、基
質開裂が重要な構造的及びホメオスタシス機能を無効にしうることを示唆する報
告もある（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９６；Ｇｈａｙｕｒら、１９
９６）。それ故、細胞溶解性リンパ球顆粒プロテアーゼが一部のカスパーゼ基質
を直接開裂する能力が、これらの細胞によって誘導される細胞死経路のカスパー
ゼ非依存性成分の基礎をなすと報告されている（Ｓａｒｉｎら、１９９７）。リ
ンパ球顆粒誘導の細胞傷害経路が、カスパーゼ活性が存在しない場合でも新しい
形態の核縮合を生じさせる能力は、この理論と一致する。

【００５２】高分子及びテトラペプチド基質に関する検討は、グランザイムＢの基質特異性
についての洞察を提供する。例えば、グランザイムＢによるＰＡＲＰの直接開裂
はＶＧＰＤ５３７−Ｓ５３８で起こるが（Ｆｒｏｅｌｉｃｈら、１９９６ａ）、
いくつかのカスパーゼ前駆体のプロセシングはＩＥＴＤ部位で起こる（Ｆｅｒｎ
ａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉら、１９９６；Ｒａｍａｇｅら、１９９５；Ｓｒｉ
ｎｉｖａｓｕｌａら、１９９６；Ｙａｍｉｎら、１９９６）。ここに示す試験は
、グランザイムＢが、組合せテトラペプチドライブラリーを用いて定義されるグ
ランザイムＢのテトラペプチド基質特異性）に一致する部位であるＶＧＰＤ−Ｆ ^２６９９で高分子基質（ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ）を開裂することを明らかにしている
（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９７）。興味深いことに、グランザイムＢはま
た、ＤＥＶＤ−Ｎ^２７１３の近傍においても直接この基質を開裂し、高分子基質
特異性の決定基が試験したテトラペプチドに含まれるものよりも複雑であること
を示唆している。

【００５３】グランザイムＢによって生成されるＮｕＭＡ及びＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの断片サイ
ズ、使用した抗体のいくつかの既知のエピトープ特異性、及びグランザイムＢの
既知の基質特異性を用いたこれらの試験は、おそらくＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの１００
ｋＤａＣ末端断片を生じるグランザイムＢの開裂部位はＶＤＱＤ^{３２１０−Ｇ} ^３２１１であることを示唆している。同様に、ＮｕＭＡにおけるグランザイムＢ
の開裂部位はおそらくＶＬＧＤ４１１−Ｖ４１２に生じる。いくつかの試験は、
パーフォリン／グランザイムＢが誘導するアポトーシスの際のグランザイムＢの
細胞生物学を取り上げている（Ｆｒｏｅｌｉｃｈら、１９９６ｂ；Ｓｈｉｅら、
１９９７；Ｔｒａｐａｎｉら、１９９６）。これらの試験は、グランザイムＢが
自律的に標的細胞の細胞質に入り込むことを報告した。その事象だけでは標的細
胞のアポトーシスは誘導されない。しかし、パーフォリンが存在する場合には、
標的細胞においてアポトーシスが誘導される。その事象は、標的細胞の核及び核
小体においてグランザイムＢが急速に増加することを伴う（Ｊａｎｓら、１９９
６；Ｐｉｎｋｏｓｋｉら、１９９６；Ｔｒａｐａｎｉら、１９９６）。それ故、
ここで述べるグランザイムＢの基質が核蛋白であることは重要である。これらの
基質は、アポトーシスの際にカスパーゼによる影響を受ける構造的及びホメオス
タシス経路の両方で機能する。顆粒誘導の細胞死の成分がカスパーゼ非依存性で
あるという所見は、カスパーゼとグランザイムＢが顆粒誘導の細胞傷害の際に異
なる部位で下流基質の共通のサブセットを効率的に開裂する能力と合わせて考え
ると、アポトーシス表現型を生じる共通基質の蛋白質分解の重要性を強調してい
る（表ＩＩ）。

【００５４】ウイルス性又は内因性カスパーゼ阻害因子（Ｂｅｉｄｌｅｒら、１９９５；Ｂ
ｕｍｐら、１９９５；Ｉｒｍｌｅｒら、１９９７；Ｔｈｏｍｅら、１９９７；Ｘ
ｕｅとＨｏｒｖｉｔｚ、１９９５）、並びに低いレベルの特定のカスパーゼファ
ミリーのメンバーを発現する長命細胞又は腫瘍細胞（Ｋｒａｊｅｗｓｋａら、１
９９７；Ｋｒａｊｅｗｓｋｉら、１９９７）についていくつかの記述に照らすと
、グランザイムＢのカスパーゼ非依存性活性は、アポトーシスカスケードのシグ
ナル成分又は執行成分の阻害因子に感受性でないアポトーシスエフェクター機序
を持つ宿主を提供する。

【００５５】現在までに記述されている下流カスパーゼ基質の多くは、ヒト全身性自己免疫
疾患において標的される自己抗原である（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１
９９５；Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９４；Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏ
ｓｅｎら、１９９６；Ｃａｓｉａｎｏら、１９９６；Ｇｒｅｉｄｉｎｇｅｒら、
１９９６）。これらの基質のいくつかはグランザイムＢによっても直接開裂され
、これまでに検討された他の形態のアポトーシスの際には生成されない独自の断
片を生じるという本出願のデータは、特定の形態のＣＴＬ媒介のアポトーシスの
間に寛容されない自己抗原の決定基がどの程度顕示されうるかを明らかにしてい
る。

【００５６】ここに示す実験結果において、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＮｕＭＡはｉｎｖｉｔｒ
ｏ及び顆粒誘導の細胞傷害を受ける細胞の両方で、グランザイムＢによって直接
開裂されることが明らかにされている。これらの基質の開裂の効率はカスパーゼ
−３媒介の開裂について認められるものと同様であるが、２つのプロテアーゼに
よって生成される断片は異なる。カスパーゼは下流基質の機能を変化させること
によって（無傷基質の機能を低下させるか又はプロアポトーシス活性を持つ断片
を生成することにより）アポトーシスを開始させると思われるので、細胞傷害性
リンパ球顆粒誘導のアポトーシスの際のグランザイムＢによるカスパーゼ基質の
直接開裂は、カスパーゼ非依存性の標的細胞死において重要な役割を果たすと考
えられる。細胞傷害性リンパ球顆粒の内容物が細胞死経路におけるカスパーゼの
必要性を回避できることは、カスパーゼ経路が不完全であるか、又は厳密な内因
性又は外因性調節制御下にある標的細胞の死を保証することができる。

【００５７】特定自己抗原から特定自己抗原断片を生成する際のグランザイムＢの作用をこ
こで例示する。しかし、グランザイムＢモデル系で説明し、例示するような顆粒
プロテアーゼの役割を全般的に理解することにより、これらやその他の自己抗原
断片を生成することが可能となる。生成した自己抗原断片は、自己免疫疾患及び
癌の危険性がある又は罹患している患者を処置するための製薬組成物の調製にお
いて、並びに患者において自己免疫状態が存在するか否かを評価するためのアッ
セイにおいて使用することができる。

【００５８】下記の実施例は例示として提供するものであり、当業者には様々な他の実施態
様が明白であるので、下記の実施例を本発明の範囲に関する限定と解釈すべきで
はない。

【００５９】実施例１一般的試験材料及び方法試験材料。精製ＤＮＡ依存性蛋白質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）とＳＰＩをＰｒ
ｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。ＡＴＰはＦｌｕｋａ（Ｒｏ
ｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ）から購入し、^３２Ｐ−ＡＴＰはＤｕＰｏｎｔ／ＮＥ
Ｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）から購入した。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとＡ
ｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯはＭｅｒｃｋ（Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）によって製造された
。カスパーゼ−３は記述されているように精製した（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１
９９５）。患者血清を使用して、核有糸分裂装置蛋白質（ＮｕＭＡ）、ポリ（Ａ
ＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）及びＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを免疫ブロッ
トした（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９５；Ｇｒｅｉｄｉｎｇｅｒら
、１９９６）。モノクローナル抗体は、当該技術において既知の方法によって作
製することができる。１８−２と２５−４と称される２つの異なるモノクローナ
ル抗体（Ｄｒ．ＴｉｍＣａｒｔｅｒ，Ｓｔ．ＪｏｈｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ，Ｊａｍａｉｃａ，ＮＹの好意により提供された）も、免疫ブロット法によっ
てＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを検出するために使用した（ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとその開裂断
片を検出するために使用する抗体の要約については表ＩＩ参照）。カスパーゼに
対するウサギポリクローナル抗体を、当該技術において一般的に知られる方法を
用いて、カスパーゼ−３とカスパーゼ−７の大きなサブユニットに対して惹起し
た。免疫ブロットした蛋白質は、製造者の指示に従って、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡ
Ｌ^ＴＭ基質系（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて検出した。

【００６０】精製ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及び［^３５Ｓ］メチオニン標識カスパーゼ−３前駆体、
カスパーゼ−７前駆体、ＰＡＲＰ及びＮｕＭＡのｉｎｖｉｔｒｏ開裂。カスパ
ーゼ−３、カスパーゼ−７、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰについてのｃＤＮＡを使用し
て、ウサギ網状赤血球溶解産物における結合転写／翻訳によって「^３５Ｓ］メチ
オニン標識蛋白質の合成を推進した。すべての精製基質について、図１に示すグ
ランザイムＢ濃度の存在下に、５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．４、１０％スク
ロース及び５ｍＭＤＴＴを含む緩衝液中で開裂反応を実施した。３７℃で１５
分間インキュベートした後、反応を終了し、サンプルを１０％（ＤＮＡ−ＰＫ_Ｃ _Ｓ、ＮｕＭＡ）、１２％（ＰＡＲＰ）又は１５％（カスパーゼ３及び７）ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。放射能標識蛋白質とそれらの断片
を蛍光光度法によって視覚化した。無傷及び開裂ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳをモノクロー
ナル抗体１８−２での免疫ブロット法によって視覚化した（Ｃａｓｃｉｏｌａ−
Ｒｏｓｅｎら、１９９５）。

【００６１】触媒定数値の計算。触媒定数（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ）の値を基本的に記述されてい
るように（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９６）計算した。簡単に述べ
ると、各々のｉｎｖｉｔｒｏ反応において飽和以下の基質濃度を使用し、生成
物の出現を第一段階プロセスと仮定した。オートラジオグラム上の基質と生成物
のバンドをデンシトメトリーによって走査した。いくつかの適切なデンシトメト
リー系、例えばＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅＳｏｆｔｗａｒｅによるＰＤＩＤ
ｉｓｃｏｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍ、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａｂａｓｅｓ，Ｉｎ
ｃ．（ＨｕｎｔｉｎｇｔｏｎＳｔａｔｉｏｎ，ＮＹ）が使用できる。ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値は、用量−反応データを一次反応速度式に適合させることによって計算
した：

【００６２】

【数１】

【００６３】ＨｅＬａ溶解産物中の内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰのｉｎ
ｖｉｔｒｏでの開裂。Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９４が述べてい
るように、当該技術において一般的に適用される方法を用いて対照ＨｅＬａ溶解
産物を調製した。次に１００ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ又はＡｃ−ＹＶＡＤ
−ＣＨＯの不在下又は存在下で、１２．５ｎＭ精製グランザイムＢ又は１０５ｐ
Ｍ精製カスパーゼ−３を溶解産物に加えた。混合物を氷上で１５分間インキュベ
ートしてプロテアーゼへの阻害因子の結合を促進し、その後３７℃で６０分間開
裂反応を実施した。０．０８７％ビスアクリルアミドを含む１０％ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルでサンプルを電気泳動した後、無傷蛋白質とそれらの開裂断
片を免疫ブロット法によって視覚化した。

【００６４】Ｐ１Ａｓｐ突然変異誘発によるＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ中のグランザイムＢ開裂部
位の決定。Ｍｅｔ^２５６６からＬｅｕ^２９２８まで（カスパーゼ−３開裂部位並
びに推定上のグランザイムＢ部位を含む領域）をコードする、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳについての部分的ｃＤＮＡクローンを、５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＸｂａＩ制限酵
素アダプターを含むプライマーを使用してＨｅＬａ細胞ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから
逆転写酵素ＰＣＲによって増幅した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の対応する制限部位に連結した後、このクローンをオー
バーラップ−延長ＰＣＲによる突然変異誘発のためのテンプレートとして使用し
、Ｄ^２６９８Ａ（推定上のグランザイムＢ部位のＰ１）とＤ^２７１２Ａ（既知の
カスパーゼ−３部位のＰ１）の修飾を含むクローンを生成した。結合ｉｎｖｉ
ｔｒｏ転写／翻訳により［^３５Ｓ］放射標識ポリペプチドを生成し、次に組換え
カスパーゼ−３（８ｎＭ）又は精製したＹＴ細胞誘導グランザイムＢ（８ｎＭ）
のいずれかと共に、５０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、１０％（ｗ
／ｖ）スクロース、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ
ジチオトレイトールから成る緩衝液中３７℃で６０分間インキュベートした。生
じた開裂産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０−２０％勾配のゲル）で
分解し、蛍光光度法によって視覚化した。

【００６５】無傷Ｋ５６２細胞のＹＴ細胞顆粒内容物が誘発する細胞障害の際の内因性ＤＮ
Ａ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰのｉｎｖｉｖｏでの開裂。無傷細胞質顆
粒をＹＴ細胞から精製し、既知の方法（Ｔｓｃｈｏｐｐ、１９９４）を用いて顆
粒内容物を分離した。これらの試料の一部をグランザイムＢのさらなる精製のた
めに使用した（Ｔｓｃｈｏｐｐ、１９９４）。プロテアーゼの純度を過負荷ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルの銀染色によって確認した。ＹＴ顆粒内容物の細胞
障害作用を次のようにして測定した：ＪｕｒｋａｔＴ細胞又はＫ５６２細胞を
１００μＣｉ／ｍｌ［^５１Ｃｒ］クロム酸ナトリウムで放射標識し、洗浄し、Ｃ
ａ^２＋−遊離ＨＢＳＳに懸濁して、その後顆粒内容物（０−５μｌ）及び１ｍＭ
ＣａＣｌ_２と共に時間を漸増してインキュベートした。特異的［^５１Ｃｒ］の
パーセンテージを次の式を用いて計算した：％特異的溶解＝［(サンプルｃｐｍ
−自発ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−自発ｃｐｍ）］×１００。無傷Ｋ５６２細胞中
のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰへのＹＴ細胞顆粒内容物の作用を検
定するためのｉｎｖｉｖｏ実験を次のように実施した：Ｋ５６２細胞をＰＤ（
２．７ｍＭＫＣｌ、１．５ＭｍＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ＭｍＮａＣｌ、８ｍ
ＭＮａ_２ＨＰＯ_４）で２回洗浄し、次に１００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ
の不在下又は存在下でＰＤ中に１．７×１０^７細胞／ｍｌの割合で懸濁して、３
７℃で３０分間インキュベートした。３．４×１０^５細胞を含むアリコートを１
ｍＭＥＤＴＡ又は１ｍＭＣａ^２＋及びＹＴ顆粒内容物２μｌと共に３７℃で
さらに９０分間インキュベートした（これは６０分間で２０−４０％の特異的ク
ロム放出を誘発し、また特徴的なヌクレオソーム間ＤＮＡの分解を誘発する）。
各々のサンプルの総反応用量は３０μｌであった。ＳＤＳゲル緩衝液中で煮沸し
て反応を終了し、サンプルを上述したように電気泳動して、免疫ブロットした。
２つの異なる顆粒内容物標本と４つの異なる細胞型（Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、
ＨｅＬａ、始原ヒト筋芽細胞）を用いて実験を行った。

【００６６】共焦点免疫蛍光顕微鏡検査。Ｎｏ．１カバーガラスで増殖したＨｅＬａ細胞に
ついて形態学的実験を行った。Ｃａ^２＋を含まない氷冷ＨＢＳＳでカバーガラス
を３回洗浄した後、２００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの存在下又は不在下で
、ＹＴ細胞顆粒内容物（上記参照）０．８μｌを含む、Ｃａ^２＋を省いたＨＢＳ
Ｓ２５μｌと共にインキュベートした（４℃、３０分間）。次に２ｍＭＣａ
Ｃｌ_２を含むＨＢＳＳ２５μｌを各々のカバーガラスに加えて（繰り返し静か
に吸引して十分に混合する）、その後３７℃で６０分間加湿チェンバーにおいて
インキュベートした。細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定して（４℃、５分
間）、アセトンで透過性を上げ（４℃、１５秒間）、上述したようにＰＡＲＰ又
はＮｕＭＡに対する抗体、ヨウ化プロピジウム及びＤＡＰＩで連続的に染色した
（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９４ａ）。カバーガラスをＰｅｒｍａ
ｆｌｕｏｒ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でスライドガラス
上に載せ、走査共焦点顕微鏡検査系（ＬＳＭ４１０，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ，
Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＪ）で共焦点顕微鏡検査を実施した。

【００６７】ＬＡＫ細胞媒介の細胞障害。ヒトＰＢＭＣをＬＡＫ培地（１０ｍＭＨｅｐｅ
ｓｐＨ７．４、Ｌ−グルタミン、２％自己血清を補足したＲＰＭＩ）及び１０
００Ｃｅｔｕｓ単位／ｍｌのｈｒＩＬ−２（ＣｈｉｒｏｎＴｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）において４日間培養してＬＡＫ細胞を得
た（Ｔｏｐａｌｉａｎら、１９８９）。Ｆａｓ陰性標的細胞（Ｋ５６２赤白血病
細胞）を１００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの存在下又は不在下でＬＡＫ培地
に１．３×１０^６細胞／ｍｌの割合で懸濁し、３７℃で６０分間培養した後、Ｌ
ＡＫエフェクター細胞（５：１のエフェクター：標的比率）と共に４時間同時イ
ンキュベートした。ＰＤで２回洗浄した後、ＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解して
煮沸し、ＰＡＲＰ、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡを上述したように免疫ブロッ
ト法によって検定した。

【００６８】キナーゼアッセイ。無傷ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ又は次のようにして最初にグランザ
イムＢで開裂しておいたＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳに関してキナーゼアッセイを実施した
。１２．５ｎＭ精製グランザイムＢの不在下又は存在下で、１０ｍＭＨｅｐｅ
ｓｐＨ７．４、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＫＣｌ、２．７ｍＭＤＴＴ
、及び５０ｎｇＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを含む反応混合物を３７℃で１３．５分間イ
ンキュベートした。その後、１０μｇ／ｍｌの剪断したニシン精子ＤＮＡ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）の不在下又は存在下で、１００ｎｇＳＰ１及び１．５μＣｉ［^３ ^２Ｐ］−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む１５０μＭＡＴＰを加えて
キナーゼ反応を開始させた。サンプルを３７℃で１０分間インキュベートした後
（十分にアッセイの線形範囲内である、データは示していない）、ＳＤＳゲル緩
衝液を加えて煮沸し、反応を終了させた。サンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電
気泳動した後、オートラジオグラフィーによってＳＰ１のリン酸化を検出し、デ
ンシトメトリーで定量した。平行してキナーゼの開裂状態を免疫ブロット法によ
って確認した。

【００６９】実施例２ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡは精製グランザイムＢにとって非常に効率的な
基質である。

【００７０】これまでに、グランザイムＢはいくつかのカスパーゼ（カスパーゼ３、７及び
１０を含む）の前駆体を開裂して、それらの蛋白質分解作用の活性化を生じるこ
とが報告されている。グランザイムＢによるこれらの基質の開裂の触媒効率は、
他の基質のグランザイムＢ媒介開裂を比較することができる有用な基準として役
立つ。カスパーゼ−３とカスパーゼ−７の精製［^３５Ｓ］メチオニン標識前駆体
、又はＴＨＰ．１サイトゾル（これらの前駆体のプロテアーゼを含む）を漸増濃
度の精製グランザイムＢと共にｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートした。得られ
た用量−反応データ（図１）を使用して、カスパーゼ−７については１．８±０
．６×１０^５Ｍ^{−１Ｓ−１}（放射標識基質）と１．９±０．１×１０^５Ｍ^−１Ｓ ^−１（免疫ブロット法）、カスパーゼ−３については３．６±１．０×１０^４Ｍ ^{−１Ｓ−１} （放射標識基質）と２．３±０．４×１０^４Ｍ^{−１Ｓ−１}（免疫ブロ
ット法）という触媒定数（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ）値を計算した（表Ｉ）。従って、こ
れまでの報告（Ｔａｌａｎｉａｎら、１９９７）と一致して、グランザイムＢは
カスパーゼ−７をカスパーゼ−３より約６倍高い効率で開裂する。

【００７１】次に、アポトーシスの際にカスパーゼによって開裂されることが知られている
下流基質もグランザイムＢによって直接開裂されるのかどうかを検討し、さらに
２つのプロテアーゼによる各々の基質の開裂効率を比較した。精製ＤＮＡ−ＰＫ _ＣＳは、ＤＮＡを付加せずに、グランザイムＢによって非常に効率的に開裂され
（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ＝２．５±０．８×１０^６Ｍ^{−１Ｓ−１}、図１及び表Ｉ参照）
、カスパーゼ−３前駆体のグランザイムＢ媒介開裂について述べられているより
も２次数良好な開裂効率を有する、これまでに記述されたグランザイムＢについ
ての最良の基質であった。１０μｇ／ｍｌＤＮＡの存在下で同様の実験を実施
すると、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの開裂は約９０％低下した。

【００７２】ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのカスパーゼ−３媒介の開裂も極めて効率的であった（ｋ_ｃ _ａｔ／Ｋ_ｍ値＝７．５±０．８×１０^６Ｍ^{−１Ｓ−１}）。この場合には、効率的
な開裂はＤＮＡの存在下でのみ得られた（（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、
１９９５）、及び表Ｉ）。カスパーゼファミリーの特徴を有する同定されていな
いプロテアーゼによりアポトーシス細胞において開裂される核基質蛋白質である
ＮｕＭＡも、グランザイムＢによって非常に効率的に開裂された（ｋ_ｃａｔ／Ｋ _ｍ値＝５．４±１．４×１０^５Ｍ^{−１Ｓ−１}、表Ｉ参照）。この開裂の効率はカ
スパーゼ−３前駆体のグランザイムＢ媒介プロセシングについて認められたもの
より１次数高かった。ＮｕＭＡは精製カスパーゼ−３によっても効率的に開裂さ
れ、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値＝５．０±１．０×１０^５Ｍ^{−１Ｓ−１}（表Ｉ）であった
。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡ（グランザイムＢとカスパーゼ−３媒介の開裂
が同様に効率的である）と異なって、ＰＡＲＰは、グランザイムＢについては比
較的効率的でない基質であり、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値（２．３±１．８×１０^４Ｍ⁻ ^１Ｓ−１）はカスパーゼ−３よりも約２００倍低い（表Ｉ参照）。グランザイム
ＢはＵ１−７０ｋＤａの開裂についても効率的でない触媒であり、ｋ_ｃａｔ／Ｋ _ｍ値＜１０３Ｍ^{−１Ｓ−１}であった。それ故グランザイムＢによる基質開裂の効
率は、一部の基質（例えばＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡ）についてはカスパー
ゼ−３と同様であるが、また別の基質（例えばＰＡＲＰ及びＵ１−７０ＫＤａ）
については２次数以上非効率的である。

【００７３】実施例３グランザイムＢ又はカスパーゼ−３によるｉｎｖｉｔｒｏでの自己抗原の開
裂後、種々の基質断片が検出される。

【００７４】グランザイムＢとカスパーゼ−３によって生成される断片を直接比較するため
、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳した［^３５Ｓ］メチオニン標識ＰＡＲＰ及び内因性基質
（ＨｅＬａ細胞溶解産物中のＮｕＭＡとＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ）をプロテアーゼと共
にインキュベートし、隣接するレーンで電気泳動した。グランザイムＢを使用し
てＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを開裂したときには、１００ｋＤａと２５０ＫＤａの断片が
生じた（それぞれＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのＣ末端又はＮ末端を認識する抗体を用いた
免疫ブロット法によって検出した）。これに対し、カスパーゼ−３による開裂は
１５０ｋＤａのＣ末端断片（図２、レーン３）と２５０ｋＤａのＮ末端断片（図
２、レーン６）を生じた。

【００７５】ＮｕＭＡのグランザイムＢ媒介の開裂は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１７５ｋ
Ｄａで移動する新規断片を生じ、これはカスパーゼ−３による開裂後に検出され
る１８５ｋＤａ断片とは異なっていた（図２、レーン７−９）。同様に、７２、
６２及び４２ｋＤａで移動するＰＡＲＰの新規断片がグランザイムＢとのインキ
ュベーション後に検出された；これらはＰＡＲＰのカスパーゼ−３媒介開裂によ
って生じる８９及び２４ｋＤａ断片とは異なっていた（図２、レーン１０−１２
及び表ＩＩ）。それ故グランザイムＢは、ｉｎｖｉｔｒｏでカスパーゼ−３の
下流基質のいくつかを直接開裂する。いずれの場合にも、グランザイムＢによっ
て生じる断片はカスパーゼ−３によって生じるものとは異なっている。

【００７６】実施例４ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのキナーゼ活性はグランザイムＢ開裂によって消失する。

【００７７】グランザイムＢ媒介の開裂がＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのキナーゼ活性に及ぼす作用を
調べるため、無傷及び開裂ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳがＳＰ１をリン酸化する能力を定量
した。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのキナーゼ活性は全面的にＤＮＡ依存性であった（図３
、レーン１及び２）。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを１２．５ｎＭのグランザイムＢにより
３７℃で１３．５分間前処理し（この処理はＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを開裂する（図１
））、その後ＤＮＡ、［^３２Ｐ］ＡＴＰ及びＳＰ１を加えた（これはリン酸化反
応を開始させる）とき、キナーゼ活性は完全に消失した（図３、レーン３）。Ｄ
ＮＡ−ＰＫ_ＣＳのグランザイムＢ媒介開裂によって生じる断片が、本文中で明ら
かにした自己抗原反応に加えて新たな活性を持つかどうかは不明である。

【００７８】実施例５グランザイムＢは細胞溶解産物中のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡの新規断片
を誘導する。

【００７９】以前の試験は、グランザイムＢを発現するＣＯＳ細胞の溶解産物中で起こるＰ
ＡＲＰの開裂は、カスパーゼ阻害因子、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによってほぼ完
全に抑制されうることを報告した（Ｄａｒｍｏｎら、１９９５）。この化合物は
グランザイムＢの阻害因子ではないので、この所見は、この開裂がこれらの抽出
物中のグランザイムＢによって活性化されたカスパーゼによってのみ媒介される
ことを示唆している。ＰＡＲＰ自体はカスパーゼ−３よりも約２００倍低い効率
でグランザイムＢによって開裂されるという所見がこの結論をさらに裏付ける（
表Ｉ参照）。ＮｕＭＡとＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳはカスパーゼ−３とグランザイムＢに
よって同様の効率で開裂されるので、これらの基質が、カスパーゼ前駆体を含む
細胞溶解産物中のグランザイムＢによって直接開裂されるかどうかを調べるのは
興味深いことであった。それ故、精製カスパーゼ−３又はグランザイムＢを加え
た後の内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰの開裂を監視するｉｎ
ｖｉｔｒｏアッセイ系を確立した。アッセイは、カスパーゼ阻害因子、Ａｃ−Ｄ
ＥＶＤ−ＣＨＯの存在下又は不在下で実施した。

【００８０】対照抽出物を３７℃で６０分間インキュベートすると、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ又は
ＰＡＲＰの有意の開裂は生じなかったが、ＮｕＭＡのごくわずかな開裂をもたら
し、１８５と１８７ｋＤａのわずかな断片の生成を導いた（図４、レーン１）。
精製カスパーゼ−３を対照抽出物に加えると、ＰＡＲＰ（８９ｋＤａ）、ＮｕＭ
Ａ（１８５ｋＤａ）及びＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ（２５０ｋＤａのＮ末端断片、１５０
ｋＤａのＣ末端断片）のカスパーゼ−３特異的断片を生じた（図４、レーン２）
。上記に示したように、カスパーゼ−３の作用によって生じる基質断片は１００
ｎＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによって完全に消失するが（Ｋｉカスパーゼ−１
＝１７ｎＭ；Ｋｉカスパーゼ−３＝０．２ｎＭ；Ｋｉカスパーゼ−６＝３１ｎＭ
；Ｋｉカスパーゼ−７＝１ｎＭ；Ｋｉカスパーゼ−８＝０．９２ｎＭ；Ｋｉカス
パーゼ−９＝６０ｎＭ；Ｋｉカスパーゼ−１０＝１２ｎＭ）（図４、レーン３）
、１００ｎＭＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯによっては影響を受けなかった（Ｋｉカ
スパーゼ−１＝０．６ｎＭ；Ｋｉカスパーゼ−３及びカスパーゼ−７＞１０μＭ
；Ｋｉカスパーゼ−１０＝４０８ｎＭ）（図４、レーン４）。

【００８１】１２．５ｎＭのグランザイムＢ存在下では、３基質すべてが効率的に開裂され
た（図４、レーン５）。グランザイムＢによって誘導される支配的なＰＡＲＰ断
片は、カスパーゼ−３によって誘導される断片と同時移動した（図４、レーン５
）。精製基質上のグランザイムＢによって誘導される断片に相当する６２ｋＤａ
のわずかな（＜５％）断片も存在した。これに対し、グランザイムＢによって誘
導されるＮｕＭＡ断片のごくわずかの割合だけが、カスパーゼ−３によって誘導
される断片と同時移動した（１８５ｋＤａ）。１７５ｋＤａの主要な新規断片（
図４、レーン５）は、精製ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳基質上のグランザイムＢによっ
て誘導される断片に相当した。グランザイムＢが媒介するＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの開
裂は、カスパーゼ−３によって生成されるものと同時移動する２５０ｋＤａのＮ
末端断片（図４、レーン２及び５）並びに精製基質上のグランザイムＢによって
誘導されるものに相当する独自の１００ｋＤａのＣ末端断片（図２、レーン２）
を生じた。

【００８２】グランザイムＢの添加の１５分前にＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ又は２ｍＭヨード
アセトアミドを抽出物に加えると、ＰＡＲＰの開裂はほぼ完全に消失した（図４
、レーン６）。これに対し、ＮｕＭＡとＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの開裂は部分的にしか
阻害されなかった（図４、レーン６）（５つの別個の実験において２０−４０％
の阻害）。ＮｕＭＡ（１８５ｋＤａ）及びＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ（１５０ｋＤａのＣ
末端断片）の両方のカスパーゼ−３特異的断片の生成はこれらの状況下で消失し
たが、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの２５０ｋＤａのＮ末端断片の形成は２０−４０％だけ
抑制された（図４、レーン６）。

【００８３】グランザイムＢ特異的断片（１７５ｋＤａのＮｕＭＡ断片及び１００ｋＤａの
Ｃ末端ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ断片）の生成はカスパーゼ阻害因子によって影響されな
かった（図４、レーン６）。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯが２５０ｋＤａのＤＮＡ−
ＰＫ_ＣＳ断片の生成を著明に阻害できなかったことは、溶解産物にグランザイム
Ｂを加えた後で検出されるＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ開裂の大部分が、（カスパーゼ−３
の活性化を通して間接的にではなく）このプロテアーゼの直接開裂から生じるこ
とを示唆する。

【００８４】合わせて考えると、上記の結果は、グランザイムＢが細胞溶解産物中の内因性
基質の開裂に関してカスパーゼ−３と競合することを明らかにしている。この競
合の結果はｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値を比較することによって正確に予測できる：カスパ
ーゼ−３による開裂についてのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値がグランザイムＢによるものよ
りも大きい基質（例えばＰＡＲＰ）に関しては、カスパーゼ−３断片がほぼ独占
的に検出される。ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値が当該プロテアーゼについて同様である基質
に関しては、グランザイムｂの添加は新しいグランザイムＢ特異的断片の形成を
もたらす（例えばＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡ）。

【００８５】実施例６ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳにおけるグランザイムＢ開裂部位カスパーゼ−３とグランザイムＢによって生成される２５０ｋＤａのＤＮＡ−
ＰＫ_ＣＳ断片が、同じ部位及び／又は異なるがＳＤＳ−ＰＡＧＥによっては識別
できない近接した間隔の部位における開裂から生じるのかどうかを調べるため、
ＤＥＶＤ^２７１２−Ｎ^２７１３にある既知のカスパーゼ−３開裂部位（Ｃａｓｃ
ｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９６；Ｓｏｎｇら、１９９６ｂ）並びにＶＧＰＤ ^２６９８ −Ｆ^２６９９の潜在的グランザイムＢ開裂部位の両方を含むＤＮＡ−Ｐ
Ｋ_ＣＳの断片（Ｍｅｔ^２５６６−Ｌｅｕ^２９２８）を作製した。この断片中の当
該Ｐ１アスパラギン酸（Ｄ^２６９８及びＤ^２７１２）をアラニンに突然変異させ
（Ｄ^２６９８Ａ；Ｄ^２７１２Ａ）、野生型と突然変異形態のカスパーゼ−３又は
グランザイムＢによる開裂への感受性を評価した（図５）。カスパーゼ−３によ
る野生型蛋白質の開裂は２６ｋＤａと２０ｋＤａの２つの断片を生じた（図５、
レーン１、２）；この開裂はＤ^２７１２Ａ突然変異によって完全に消失し（図５
、レーン７、８）、カスパーゼ−３がＤＥＶＤ^２７１２−Ｎ^２７１３で開裂する
ことを確認した。カスパーゼ−３によって生じるのと同じ２０ｋＤａ及び２６ｋ
Ｄａ断片に加えて、グランザイムＢの開裂は２８ｋＤａと１８ｋＤａの断片を生
じた（図５、レーン３）；これらの特徴的な断片はＤ^２７１２Ａ突然変異によっ
て増強された（図５、レーン９）が、Ｄ^２６９８Ａ突然変異によって消失し（図
５、レーン６）、グランザイムＢ開裂部位をＶＧＰＤ^２６９８−Ｆ^２６９９と位
置付けた。これらのデータは、グランザイムＢが、組合せテトラペプチド基質ラ
イブラリーを用いた以前の試験（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９７）によって
予想された部位である、ＶＧＰＤ^２６９８−Ｆ^２６９９で開裂しうることを明ら
かにしている。さらに、グランザイムＢはカスパーゼ−３開裂部位、ＤＥＶＤ^２ ^７１２ −Ｎ^２７１３においても開裂する。Ｃ末端のグランザイムＢ独自の開裂部
位はＶＤＱＤ^{３２１０−Ｇ３２１１}であると考えられる。この開裂は、アミノ酸
３２１２から４０９６までの約１００ｋＤａの断片を生じる。

【００８６】実施例７ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡのグランザイムＧ特異的断片は、細胞障害性リ
ンパ球顆粒誘導の標的細胞死の際に生成される。

【００８７】細胞溶解産物中で明らかにされたグランザイムＢ特異的断片は、細胞障害性リ
ンパ球顆粒の内容物によって標的細胞死が誘導されるときにも生じるのかどうか
を調べるため、顆粒誘導の標的細胞死が基質開裂に及ぼす影響を検討した。パー
フォリンとグランザイムを含む顆粒を、ヒトＮＫ細胞系であるＹＴから精製した
。顆粒内容物を採集し、実施例１で述べたように標的細胞の障害を誘導するため
に使用した。いくつかの異なる標的細胞（ＪｕｒｋａｔＴ細胞、Ｋ５６２赤白
血病細胞、ヒト筋芽細胞又はＨｅＬａ細胞）を顆粒内容物（〜１，５×１０^７Ｙ
Ｔ細胞当量／ｍｌ）と共にＣａ^２＋の存在下でインキュベートした。速やかな標
的細胞の溶解を誘導した（６０分間で〜２０％−４０％の特異的^５１Ｃｒの放出
を達成する）。Ｃａ^２＋が存在しない場合は顆粒内容物による標的細胞の溶解は
起こらなかった（ＰｏｄａｃｋとＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，１９８４；Ｙｏｕｎｇ
ら、１９８６）。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰはすべて、顆粒の添
加後速やかに、Ｃａ^２＋依存的に開裂した（図６、レーン２及び３）。上述した
溶解産物系で認められたように、ＰＡＲＰの開裂はほぼ全面的に８９ｋＤａのカ
スパーゼ−３特異的断片の生成をもたらした（図６、レーン３）。６２ｋＤａの
グランザイムＢ特異的断片が小量だけ生成された。８９ｋＤａ断片の生成はＡｃ
−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによって完全に阻害された（図６、レーン４）。これに対し
、顆粒内容物は、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＮｕＭＡのグランザイムＢ特異的開裂断片
の形成を誘導した（図６、レーン３）。これらの断片の生成はＡｃ−ＤＥＶＤ−
ＣＨＯによって阻害されなかった（図６、レーン４）。

【００８８】ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの場合には、顆粒内容物の添加は小量の１５０ｋＤａ及び１
２０ｋＤａ断片の形成も生じさせたことに留意しなければならない。これらは、
より長時間Ｘ線フィルムに露光した後初めて良好に視覚化された。これらの断片
の生成もＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによって完全に阻害された。

【００８９】実施例８リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）によって攻撃されるＦａｓ陰性標的細胞
において、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡのグランザイムＢ特異的断片が生成さ
れる。

【００９０】リンパ球誘導の細胞障害の際にグランザイムＢ特異的断片が生成されるかどう
かを調べるため、ＬＡＤ細胞の標的としてＦａｓ陰性細胞系、Ｋ５６２を使用し
た（ＭｃＧａｈｏｎら、１９９５；Ｔｏｐａｌｉａｎら、１９８９）。標的細胞
中の開裂蛋白質の生化学的分析ができるように、５：１のエフェクター：標的細
胞比を使用した。ＰＡＲＰのシグナチャー８９ｋＤａカスパーゼ−３断片がＬＡ
Ｋ誘導の標的細胞死の際に生成された（図７、レーン３）。ＰＡＲＰ開裂は１０
０μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによって完全に排除された（図７、レーン４）
。これは、標的細胞死がＹＴ細胞顆粒内容物によって開始されるときに認められ
た結果と一致した（図６、レーン４）。抗Ｃ末端抗体を使用して、ＬＡＫ誘導標
的細胞死の際のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの１００ｋＤａグランザイムＢ特異的断片と１
５０ｋＤａカスパーゼ−３特異的断片の生成を検出した（図７、レーン３）。さ
らに、１２０ｋＤａ断片がこれらの細胞において認められ、これまでにｉｎｖ
ｉｔｒｏと無傷細胞の両方で認められているＤＷＶＤ−ＧでのＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのカスパーゼ−３媒介開裂と一致した（Ｃａｓｃｉｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９
６；Ｓｏｎｇら、１９９６ｂ）。１００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯはＤＮＡ
−ＰＫ_ＣＳのカスパーゼ−３特異的断片の生成を＞９０％抑制したが、１００ｋ
ＤａのグランザイムＢ特異的断片はこの阻害因子に対して感受性ではなかった（
図７、レーン４）。このデータは、ＹＴ細胞顆粒内容物による標的細胞死の開始
後に得られたものと一致する（図６、レーン４及び提示していないデータ）。グ
ランザイムＢ特異的ＮｕＭＡ断片についても同様の所見が得られた。合わせて考
えると、これらのデータは、これらの試験で定義されたＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮ
ｕＭＡの新規断片が、無傷リンパ球が顆粒経路を使用して標的細胞の障害を誘導
するときに実際に生成されることを確認している。

【００９１】実施例９細胞障害性リンパ球顆粒は核形態の変化を誘導する：カスパーゼ阻害因子の作用。

【００９２】カスパーゼについての下流基質のいくつかは、カスパーゼ阻害因子の存在下で
あっても、リンパ球顆粒誘導の細胞障害の際にグランザイムＢによって直接且つ
効率的に開裂される。これらの顆粒が標的細胞の形態学的変化も誘導するのかど
うかを検討した。１００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの存在下又は不在下でＨ
ｅＬａ細胞をＹＴ細胞顆粒内容物と共に予備インキュベートした後、Ｃａ^２＋を
加えてさらにインキュベートした。ＹＴ細胞顆粒内容物は顕著な表面気泡の速や
かな発生（＜６０分）を誘導し（図８Ａ）、続いて核圧縮と膜結合アポトーシス
体への断片化を誘導した（図８Ｂ）。ＵＶＢ誘導のアポトーシスについて記述さ
れているように（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、１９９４）、全身性自己免
疫疾患において標的される自己抗原は、ＹＴ細胞顆粒内容物に接触する標的細胞
中で速やかに再分布されて、圧縮したアポトーシス核の縁に沿って集合し（図８
Ａ）、最終的にはアポトーシス体の周囲に集まる（図８Ｂ）。顆粒内容物が誘導
する表面気泡、核の断片化、アポトーシス体の形成、及び核自己抗原の特徴的な
再分布は、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによって妨げられた（図８Ｂ、８Ｃを比較さ
れたい）。しかし、核の大きさの顕著な低下（クロマチンの縮合を伴った）が、
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ処置細胞中の顆粒内容物によって誘導された（図８Ｃ）
；これらの核変化は、細胞をＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ単独でインキュベートした
ときには認められなかった。

【００９３】実施例１０自己抗原及び自己抗原断片に対する抗体。

【００９４】本発明はまた、本文中で開示する自己抗原断片に応答して惹起されるポリクロ
ーナル及びモノクローナル抗体に関する。当業者が、組織の細胞からのサンプル
のウエスタンブロット法において自己抗原断片を検出できる条件を判定するため
の標準的な手法を使用できれば、抗体は自己抗原断片のエピトープについて特異
的である。ブロットはエピトープに応じて適宜天然又は変性ゲルでありうる。非
特異的なバックグラウンド結合が可視的に検出できなければ、抗体は自己抗原断
片エピトープについて高度に特異的である。また、抗体の結合がランダムなペプ
チド、ポリペプチド又は蛋白質によっては競合されないが、特定の自己抗原断片
、自己抗原、又はそれらから誘導されるペプチド又はポリペプチドによって競合
されうる場合も、抗体は自己抗原断片について高度に特異的とみなすことができ
る。

【００９５】自己抗原断片は、自己抗原に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体
で作製した免疫アフィニティーカラムを使用して他の細胞蛋白質から分離するこ
とができる。さらに、ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、自己抗原又は
自己抗原断片の一部からの合成ペプチド（通常は約９個から約２５個のアミノ酸
の長さ）に対して惹起することができる。単一特異性抗体を、自己抗原断片に対
して反応性の抗体を含む哺乳類抗血清から精製するか、又はＫｏｈｌｅｒとＭｉ
ｌｓｔｅｉｎの手法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７）を用
いてモノクローナル抗体として調製する。本文中で使用するとき、単一特異性抗
体は、自己抗原断片に関して相同な結合特性を持つ単一抗体種又は複数の抗体種
と定義される。本文中で使用するとき、相同結合は、抗体種が、本文中で述べた
自己抗原断片に関連するもののような特異的抗原又はエピトープに結合する能力
をさす。自己抗原断片特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等のような動物を、免疫アジュバントと共に又は免疫アジュバントなし
で、適当な濃度の自己抗原断片又は自己抗原断片の一部から生成される合成ペプ
チドで免疫することによって惹起される。

【００９６】初回免疫の前に免疫前血清を採集する。各々の動物に約０．１ｍｇから約１０
００ｍｇまでの自己抗原断片を許容される免疫アジュバントと共に投与する。そ
のような許容されるアジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント
不完全アジュバント、ミョウバン沈殿物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐ
ａｒｖｕｍを含む油中水乳剤、並びにＲＮＡを含むがこれらに限定されない。初
回免疫は、好ましくはフロイント完全アジュバント中で、自己抗原断片又はその
ペプチド断片を皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）又はその両方の経路で複数部位に
注射することからなる。各々の動物から規則正しい間隔で、好ましくは週に１回
採血して抗体価を測定する。初回免疫後、動物にブースター注射を行ってもよい
し又は実施しなくてもよい。ブースター注射を行う動物には、一般にフロイント
不完全アジュバント中等量の自己抗原断片を同じ経路で投与する。ブースター注
射は、最大の抗体価が得られるまでおよそ３週間の間隔で実施する。各ブースタ
ー免疫後約７日目又は単回免疫後週に１回の割合で、動物から採血し、血清を採
集して、アリコートを約−２０℃で保存する。

【００９７】近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを自己抗原断片で免疫して、自己抗原
断片と反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製する。本文中で述べたよう
な許容されるアジュバントの等量を組み込んだ緩衝液又は生理食塩水約０．５ｍ
ｌ中、約１ｍｇから約１００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇの自己抗原断片で、Ｉ
Ｐ又はＳＣ経路によりマウスを免疫する。フロイント完全アジュバントが好まし
い。０日目にマウスに初回免疫し、約３から約３０週間休ませる。免疫したマウ
スに、静脈内（ＩＶ）経路により、リン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液中約１
から約１００ｍｇの自己抗原断片のブースター免疫を１回以上実施する。抗体陽
性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当該技術において既知の標
準的手法により、免疫したマウスから脾臓を切除することによって入手する。安
定なハイブリドーマを形成することができる条件下で、脾リンパ球を適当な融合
パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合することにより、ハイブリドーマ細胞
を作製する。融合パートナーは、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、ＭＰ
Ｃ−１１、Ｓ−１９４及びＳｐ２／０を含みうるが、これらに限定されず、ＳＰ
２／０が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞を、分子量約１０００のポリエチ
レングリコールにおいて約３０％から約５０％の濃度で融合する。融合したハイ
ブリドーマ細胞を、当該技術で既知の手順によりヒポキサンチン、チミジン及び
アミノプテリン補足ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）での増殖によって
選択する。およそ１４、１８及び２１日目に増殖陽性ウエルから上清液を採集し
、自己抗原断片を抗原として使用する固相放射免疫測定法（ＳＰＩＲＡ）のよう
なイムノアッセイによって抗体産生に関してスクリーニングする。また培養液を
オークタロニー沈降アッセイ（二次元二重ゲル拡散沈降試験）において試験し、
ｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウエルからのハイブリドーマ細胞を
、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９７３の軟寒天手法、ＳｏｆｔＡｇａｒＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ，ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓより，ＫｒｕｓｅａｎｄＰａｔｅｒｓｏｎ編集、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、のような手法によってクローニングする。

【００９８】プリスチン（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）感作されたＢａｌｂ／ｃマウスに、約０．５
ｍｌ／マウスの割合で、初回免疫からおよそ４日後に約２×１０^５から約６×１
０^６ハイブリドーマ細胞を注射してモノクローナル抗体を作製する。細胞の移入
後約８−１２日目に腹水を採取し、当該技術で既知の手法によってモノクローナ
ル抗体を精製する。

【００９９】約２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させて十分な量
の特異的ｍＡｂを得ることにより、抗自己抗原断片ｍＡｂのｉｎｖｉｔｒｏ生
産を実施する。ｍＡｂを当該技術において既知の手法によって精製する。

【０１００】腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体価を、沈降反応、受身凝集反応、酵素結
合免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）手法及び放射免疫測定（ＲＩＡ）手法を含むがこ
れらに限定されない、様々な血清学的又は免疫学的アッセイによって測定する。
同様のアッセイを使用して、体液又は体組織及び細胞抽出物中の自己抗原断片の
存在を検出する。

【０１０１】単一特異性抗体を作製するために本文中で述べた方法が、自己抗原断片のペプ
チド断片又は完全長の自己抗原に特異的な抗体を作製するために使用できること
は、当業者には直ちに明白である。

【０１０２】抗体アフィニティーカラムを、例えば、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と
共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルで前活性化され
ているゲル支持体、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えること
によって作製する。次にスペーサーアームとのアミド結合を通して抗体をゲルに
結合する。残存する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で
クエンチングする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６
）で洗浄して、非結合抗体又は外来性蛋白質を除去する。その後カラムをリン酸
緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡させ、自己抗原断片を含む細胞培養上清
又は細胞抽出物をゆっくりとカラムに通過させる。光学密度（Ａ_２８０）がバッ
クグラウンドに低下するまでカラムをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、その後０
．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で蛋白質を溶出する。精製した自己抗
原断片をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析する。

【０１０３】細胞及び組織中の自己抗原断片のレベルを、免疫アフィニティー及び／又はリ
ガンドアフィニティー手法を含むがこれらに限定されない様々な手法によって定
量する。自己抗原断片アフィニティービーズ又は自己抗原断片特異的抗体を使用
して、^３５Ｓメチオニン標識自己抗原断片又は標識していない自己抗原断片を分
離する。標識自己抗原断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。標識していな
い自己抗原断片は、自己抗原断片特異的抗体及び／又は抗ホスホチロシン抗体を
用いるウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイによって検出する
。

【０１０４】好ましい抗体は、自己抗原断片に結合するが、無傷自己抗原又は無傷自己抗原
の他の断片には結合しない。好ましい抗体の例は、自己抗原断片において出現す
る潜在型エピトープを認識するもの、又は自己抗原断片中にのみ存在する末端エ
ピトープを認識する抗体である。

【０１０５】実施例１１自己免疫状態の検出のためのアッセイ。

【０１０６】本発明の教示に従って生成され、同定された自己抗原断片は、自己免疫状態の
存在を検出するためのアッセイにおいて使用することができる。かかる状態は、
疾患状態が発現する前の自己抗原断片の産生、自己免疫疾患の存在又は疾患の軽
減でありうる。

【０１０７】患者から誘導したサンプルに関してアッセイを実施する。最も一般的には、サ
ンプルは組織サンプルである。自己抗原断片の存在は、ｉｎｓｉｔｕで検出す
るか又はアッセイを実施する前に部分的に精製することができる。

【０１０８】本発明の範囲内のアッセイを実施するために、自己抗原断片を調製する。例え
ば、蛋白質をグランザイムＢで開裂することにより、ＤＮＡＰＫ_ＣＳの自己抗
原断片を調製することができる。次に自己抗原断片を使用して、広く知られてお
り、当該技術で用いられる何らかの方法によってモノクローナル又はポリクロー
ナル抗体を作製する。

【０１０９】抗体を使用してサンプル中に存在する自己抗原断片を特性付ける又は定量する
ことができる。これは、^１２５Ｉ、金、酵素又は他の既知の標識で検出可能に標
識した抗体を使用することを含めて、当該技術において既知の数多くの手法によ
って実施できる。その代わりに、第一抗体に特異的な第二抗体に関して検出可能
な標識を行うこともできる。認められた自己抗原断片の量を対照細胞で認められ
た量と定量的又は定性的に比較する。後者に対する前者の変化が、自己免疫疾患
状態が存在するかどうか、進行しつつあるかどうか又は軽減しているかどうかの
指標である。

【０１１０】代替的な形態のアッセイでは、本文中で述べたように細胞を処理し、処理した
細胞と対照細胞中に存在する自己抗原断片を分離する。標本は、粗細胞抽出物と
して、細胞の膜又は細胞内画分として、又は例えばクロマトグラフィー、沈降反
応又はアフィニティー分離段階のような精製段階後に調製することができる。粗
標本、部分的又は高度に精製された標本は、例えば自己抗原断片に特異的な抗体
を使用することにより、自己抗原断片内容物に関して分析することができる。

【０１１１】もうひとつの形態のアッセイでは、自己抗原断片を使用して、自己免疫状態の
存在又は不在の指標として患者における自己抗体の存在又は不在を測定する。特
定の型又は自己抗原断片を使用すると、自己免疫状態のタイプを示すこともでき
る。検定する自己抗体は、患者の血清又は組織サンプル中に存在すると考えられ
る。自己抗体はｉｎｓｉｔｕで又は患者からの免疫グロビンの精製後に検出す
ることができる。１つの形態のアッセイでは、自己抗原断片を支持体に固定し、
次にサンプル中に存在する自己抗体を断片に接触させて自己抗原断片に自己抗体
を結合させることができる。適切な洗浄後、患者からの抗体に対する標識第二抗
体の使用を含めて、当該技術で使用可能な方法によって結合自己抗体の存在を検
出することができる。

【０１１２】いずれのアッセイにおいても、異なるランのアッセイの結果を相互に比較でき
るように内部対照を案出することが有利と考えられる。自己抗原断片に関係して
おらず、アッセイで使用する細胞中に比較的一定な量で存在する細胞蛋白質が内
部対照として使用できる。

【０１１３】上述したアッセイは本発明の範囲内のすべてのアッセイの例示である。当業者
は、当該技術で既知の又は開発される多くのアッセイ様式において本発明の自己
抗原断片と抗体を使用することができる。

【０１１４】実施例１２患者を自己抗原断片の存在に対して寛容にする。

【０１１５】本発明は、通常自己抗原性である化合物が将来ｉｎｖｉｖｏで生成されるこ
とに対して患者を寛容にする方法を提供する。この方法は予防的でありうる。

【０１１６】自己免疫応答を発現する危険性があると診断される患者を同定する。自己免疫
応答が起こりうる組織のサンプルを患者から分離する。組織から生成しうる自己
抗原断片を同定する。低域寛容を誘導するため、アジュバントを含まない製薬上
許容される担体中で自己抗原断片を患者に投与する。

【０１１７】免疫寛容は、典型的には非凝集形態の当該自己抗原断片の精製を含む。特定実
施態様では、ＤＮＡＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ又はＰＡＲＰの自己抗原断片をグラン
ザイムＢの作用によって作製する。

【０１１８】自己抗原断片は混合物中にも存在しうる。そのような混合物の１つは、潜在的
な自己免疫応答が診断される組織のサンプルに顆粒内容物を適用した産物であり
うる。その場合、自己抗原断片は、グランザイムＢを含めた顆粒内容物の作用に
よって混合物中に産生される。

【０１１９】いずれの場合も、患者において低域寛容を誘導するために、熟達した医師又は
獣医が選択する低用量で自己抗原断片を投与する。ひとたび患者の寛容が達成さ
れれば、通常通りにｉｎｖｉｖｏで組織中に自己抗原断片が産生されても、免
疫系はそれらに対する応答を開始せず、自己免疫疾患状態の発生が回避できるか
又はその重症度が軽減されうる。

【０１２０】実施例１３悪性細胞のための処置。

【０１２１】本発明はまた、患者において特定細胞に対する自己免疫応答を生じさせる方法
を提供する。例えば、そのような応答から恩恵を受けるであろう患者において、
悪性細胞に対する自己免疫応答を誘導することができる。

【０１２２】例えば、患者から悪性細胞のサンプルを分離して、細胞を顆粒内容物又はグラ
ンザイムＢに接触させることができる。細胞への顆粒内容物又はグランザイムＢ
の作用は、細胞中に存在する自己抗原から自己抗原断片を生成しうる。その後生
じた混合物を患者に投与することができる。この場合、アジュバントを自己抗原
断片と共に投与することが好ましい。

【０１２３】変化して新しい抗原を生成することがない混合物の成分は、免疫系によって自
己分子として認識される。しかし、変化して新たな自己抗原断片を生じる成分は
、免疫によって非自己分子と認識され、それらに対して免疫応答が生じることに
なる。

【０１２４】このようにして生成される自己抗原断片は、悪性細胞へのＣＴＬ、ＮＫ及びＬ
ＡＫ細胞の作用によってｉｎｖｉｖｏで生成されるものと同じであるので、免
疫系が刺激されて悪性細胞に対する応答を生じさせる。それ故本発明は、悪性細
胞のような特定の種類の細胞に対して働くように自然の免疫系プロセスを高める
又は刺激するための方法を提供する。例えば悪性細胞からの自己抗原断片のｉｎ
ｖｉｖｏでの生成は、免疫系を刺激できないほど低い割合で、又は免疫系の寛
容を導きうるような速度で起こりうるので、かかる方法は特に有益である。

【０１２５】実施例１４製薬組成物本発明の自己抗原断片を含む製薬上有用な組成物は、製薬上許容される担体の
混合のような既知の方法に従って製剤することができる。そのような担体及び製
剤方法の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉ
ｅｎｃｅｓの中に認められる。有効な投与に適した製薬上許容される組成物を形
成するために、そのような組成物は有効量の阻害因子を含む。

【０１２６】本発明の治療的、予防的又は診断用組成物は、疾患を処置する又は診断するの
に十分な量で個体に投与される。有効量は、個体の状態、体重、性別及び年齢の
ような様々な因子に従って変化しうる。その他の因子として投与方法が含まれる
。熟達した医師によって適切な量が決定されうる。

【０１２７】製薬組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内のような様々な経路によって個体
に供給することができる。

【０１２８】「化学的誘導体」という用語は、通常は基礎分子の一部でない付加的な化学的
部分を含む分子を表わす。そのような部分は、基礎分子の溶解度、半減期、吸収
等を改善しうる。その代わりに、当該部分が基礎分子の好ましくない副作用を減
弱させる又は基礎分子の毒性を低下させる場合もありうる。そのような部分の例
は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ
ｓのような様々なテキストの中に述べられている。

【０１２９】本文中に開示されている方法に従って同定される自己抗原断片を含む組成物は
、適切な用量で単独で投与することができる。その代わりに、他の薬剤との同時
投与又は連続的投与が望ましい場合もありうる。

【０１３０】本発明はまた、本発明の処置方法において使用するのに適した局所、経口、全
身及び非経口製薬製剤を得るための手段を提供する。本発明に従って同定される
自己抗原断片を有効成分として含む組成物は、投与のための従来の賦形剤におい
て広範囲の治療用投与形態で投与することができる。例えば当該組成物は、適宜
に、錠剤、カプセル（それぞれ時間制御放出及び持続放出性製剤を含む）、丸剤
、散剤、顆粒剤、エリキシル、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ及び乳剤のよ
うな経口投与形態中で、又は注射によって投与することができる。同様に、静脈
内（ボーラス及び持続注入の両方で）、腹腔内、皮下、閉鎖を伴う又は伴わない
局所、又は筋肉内形態でも投与することができ、これらはすべて製薬技術で使用
される当業者には周知の形態である。

【０１３１】有利には、本発明の自己抗原断片は１日１回用量として投与することができ、
又は１日当りの総用量を１日２回、３回又は４回の分割用量として投与すること
ができる。

【０１３２】さらに、本発明のための化合物は、適当な鼻腔内賦形剤の局所使用を通して鼻
腔内形態で、又は当業者に周知の経皮的皮膚パッチの形態を用いて経皮経路を通
して投与することができる。経皮供給送達系の形態で投与するためには、薬剤投
与は、言うまでもなく、投与レジメン全体を通して間欠的ではなく持続的である
。

【０１３３】有効成分が別個の投与製剤である場合の１又はそれ以上の有効成分との組合せ
処置については、有効成分を同時に投与するか、又はそれぞれを別々のずらせた
時間に投与することができる。

【０１３４】本発明の組成物を使用する投与レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、
性別及び医学的状態；処置が予防的である治療的であるか；処置する状態の重症
度；投与経路；患者の腎、肝及び心臓血管機能；ならびに使用する個々の化合物
を含めた様々な因子に従って選択される。通常の技術を有する医師又は獣医は、
状態を予防する、状態に対抗する又は状態の進行を止めるために必要な薬剤の有
効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴わずに効果をもたらす範
囲内の、精製自己抗原断片を含む本発明の化合物の濃度を至適正確さで達成する
には、標的部位への化合物のアベイラビリティーの動態に基づくレジメンを必要
とする。これには化合物の分布、平衡及び排出についての配慮が含まれる。

【０１３５】実施例１５グランザイムＢによって開裂される自己抗原グランザイムＢは３つのカスパーゼ−３基質を効率的に開裂して、他の形態の
細胞死の際には生成されない特徴的な断片を生成する。グランザイムＢによる特
徴的な自己抗原断片の生成が自己抗原の普遍的な特徴であるのかどうかを調べる
ため、広い範囲の自己抗原をｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏでのグランザ
イムＢによる開裂に関して試験した。それらの多様な構造、分布及び機能にも関
わらず、全身性自己免疫疾患において記述されている自己抗原の＞７０％がグラ
ンザイムＢによって効率的に開裂され、特徴的な断片が産生される。これに対し
、検討したすべての非自己抗原分子においてグランザイムＢは特徴的な断片を生
成しない。グランザイムＢによる開裂に感受性であることが発見された自己抗原
のパネルを開裂部位と共に表３にリストする。

【０１３６】自己抗原におけるグランザイムＢ開裂部位を定義した。すべての場合に、開裂
部位のすぐ近くにあるテトラペプチド配列は高度に保存された。それ故グランザ
イムＢ開裂への感受性は特異的であり、さもなければ関連性のないこれらの分子
の特徴を一様にする。さらに、グランザイムＢがこれらの抗原の特徴的な断片を
生成する能力は、グランザイムＢが、自己免疫応答が開始されるこれらの分子の
断片を選択的に産生する上で機能的な役割を果たすことを示している。これらの
結果は、自己免疫の開始と伝播における細胞傷害性リンパ球顆粒誘導の細胞死経
路の潜在的役割を強調するものである。

【０１３７】グランザイムＢによる直接開裂への感受性が、上記に示したＰＡＲＰ、ＮｕＭ
Ａ及びＤＡＮ−ＰＫ_ＣＳの孤立した特徴であるのか、又は自己抗原のより一般的
な特徴であるのかを調べるため、全身性自己免疫疾患のスペクトル全体から選択
した、十分に定義された様々な自己抗原を、精製グランザイムＢによる開裂に対
する感受性に関して試験した。精製グランザイムＢによる基質の開裂効率も検討
した（表３）。最初に、十分に定義された特異性を持つ一連の自己抗体を使用し
て、グランザイムＢと共に又はグランザイムＢなしにｉｎｖｉｔｒｏでインキ
ュベートしておいたＨｅＬａ細胞の溶解産物を免疫ブロットした。溶解産物は、
内因性カスパーゼ活性による干渉を防ぐためヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で前
処理した。

【０１３８】興味深いことに、これまでにアポトーシスの際にカスパーゼによって開裂され
ることが示されていたいくつかの自己抗原が、グランザイムＢによっても効率的
に開裂された。これらの基質には、Ｕ１−７０ｋＤａ、トポイソメラーゼ−１、
ＳＲＰ−７２、ＰＡＲＰ及びＮＯＲ−９０が含まれた。各々の場合に、特徴的な
断片が生成された。Ｍｉ−２、ＰＭＳ２及びＫｉ−６７も、これらの溶解産物中
のカスパーゼとグランザイムＢの両方によって別個の様々なセットの断片に開裂
される追加的な自己抗原として同定された。

【０１３９】また、Ｕ１−７０ｋＤａ、ＰＡＲＰ、トポイソメラーゼ−１、ＰＭＳ２、及び
Ｍｉ−２の場合には、精製グランザイムＢを用いてｉｎｖｉｔｒｏ翻訳した基
質を開裂し、効率的な開裂と新規断片の生成を確認した。一定量の精製プロテア
ーゼを使用して、細胞溶解産物中の内因性基質又はｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳
によって発現される放射標識基質のいずれか、又は両方を開裂し、グランザイム
Ｂによるそれらの基質の開裂効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ）を測定した。これまでの試
験で、いずれの形態の基質を使用しても等しい結果が得られることが明らかにさ
れた（Ａｎｄｒａｄｅら、１９９８）。ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値は１．３９×１０^４Ｍ ^−１．Ｓ^−１（ＰＭＳ２）から１．６×１０^６Ｍ^−１．Ｓ^−１（トポイソメラー
ゼ−１）までの範囲であった（表３参照）。

【０１４０】これまでの試験で、アポトーシスの際のカスパーゼによる開裂に対して感受性
でないいくつかの自己抗原が同定されている（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら
、１９９５＆１９９６）。これらの自己抗原の多くがグランザイムＢによって効
率的に開裂された。これらの分子にはフィブリラリン、ＰＭＳ１、ＣＥＮＰ−Ｂ
、Ｋｕ−７０、Ｌａ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩのラージサブユニットが含まれ
た。グランザイムＢによるこれらの基質の開裂の効率は５．９×１０^３Ｍ^−１．
Ｓ^−１（ＣＥＮＰ−Ｂ）から８×１０^４Ｍ^−１．Ｓ^−１（Ｌａ）までの範囲であ
った（表３参照）。興味深いことに、いくつかのリボ核蛋白質自己抗原は、グラ
ンザイムＢあるいはカスパーゼのいずれによる開裂にも感受性ではなかった。こ
れらは、Ｒｏ５２ｋＤａ及び６０ｋＤａ、リボソーム蛋白質Ｐ、ヒストン及びＳ
ｍ蛋白質を含んだ。

【０１４１】グランザイムＢによる開裂への感受性は自己抗原の高度に特異的な特徴であっ
た。検討した１８の異なるヒト非自己抗原のいずれも、グランザイムＢによって
開裂されなかった。カスパーゼ３及び７の前駆体が自己抗原であるかどうかは不
明であるが、これらはグランザイムＢによって効率的に開裂される。興味深いこ
とに、これらの基質は同じ部位でグランザイムＢとカスパーゼ−８によって開裂
され、同じ断片を生成する（下記参照）。

【０１４２】十分に定義されている自己抗体の一部は免疫ブロット法によってそれらの抗体
を認識しないため、ｉｎｖｉｔｒｏでグランザイムＢによる開裂に対する放射
標識内因性基質の感受性を評価した。これらの試験を実施するため、ＨｅＬａ細
胞を［^３５Ｓ］メチオニン／システインで放射標識し、ヒト自己抗体を用いて蛋
白質を免疫沈降した。洗浄した沈降蛋白質を含むプロテインＡ−アガロースビー
ズを、グランザイムＢの活性を保持する緩衝液に懸濁して、精製グランザイムＢ
を添加して又は添加せずにインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと蛍光光度法
を用いて反応産物を視覚化した。このアプローチの有効性を確認するため、グラ
ンザイムＢによって開裂されることが知られているいくつかの異なる自己抗原、
並びにグランザイムＢによって開裂されないいくつかの自己抗原と非自己抗原を
試験した。免疫ブロットし且つ免疫沈降する自己抗体を使用して、グランザイム
Ｂを用いて溶解産物中の分子を開裂して（その後免疫ブロット法で検出すること
により）得られる開裂プロフィールと、免疫沈降後に（［^３５Ｓ］メチオニン標
識ＨｅＬａ溶解産物から）得られる開裂プロフィールを比較した。開裂された自
己抗原（トポイソメラーゼ−１、Ｍｉ−２、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのラージサ
ブユニット、Ｋｕ−７０、ＰＡＲＰ、及びＮＯＲ−９０）、開裂されなかった自
己抗原（Ｋｕ−８０、Ｒｏ６０ｋ）、及び対照基質（β−チューブリン、ビン
キュリン）について、これら２つの方法を用いて同じ結果が得られた。この免疫
沈降アプローチを使用して、いくつかの追加自己抗原（ＰＭＳｃ１、ＲＮＡポリ
メラーゼＩのラージサブユニット、ヒスチジルｔＲＮＡシンテターゼ、イソロイ
シルｔＲＮＡシンテターゼ及びアラニルｔＲＮＡシンテターゼ）がグランザイム
Ｂによって開裂され、特徴的な断片を生じることが明らかになった（表３）。注
意すべき点として、これらの追加的自己抗原はすべて（ＲＮＡポリメラーゼＩを
除いて）自己免疫性筋炎において標的される。しかし、やはり自己免疫性筋炎に
おける自己抗原である他の２つのｔＲＮＡシンテターゼ（トレオニルｔＲＮＡシ
ンテターゼ及びグリシルｔＲＮＡシンテターゼ）はこのアプローチを用いて開裂
されなかった。

【０１４３】従って、カスパーゼ−３とグランザイムＢによって開裂される上述した３つの
自己抗原に加えて、これらの結果は、両方のプロテアーゼによって、但し異なる
部位で開裂される追加的な７つの自己抗原を同定する。さらに、別の１０の自己
抗原はもっぱらグランザイムＢによってのみ開裂され、カスパーゼによっては開
裂されない。それ故、ヒト全身性自己免疫疾患のスペクトルにわたって標的した
２０の自己抗原は、グランザイムＢによって効率的に開裂され、他の形態の細胞
死の際には認められない特徴的な断片を生じる（表３）。

【０１４４】顆粒誘導細胞死の際に無傷細胞において同様の自己抗原断片が生成されること
を確認するため、Ｋ５６２細胞をＣａ^２＋の存在下でＹＴ細胞顆粒内容物に接触
させ、自己抗原の生化学的状態を免疫ブロット法によって分析した。自己抗原が
カスパーゼとグランザイムＢの両方の基質である場合には、両方の断片が生成さ
れた（Ｕ１−７０ｋＤａ、ＰＡＲＰ。Ｍｉ−２、トポイソメラーゼ−１、Ｋｉ−
６７）。グランザイムＢによってのみ開裂されることが知られている自己抗原は
、実際にＫ５６２／ＹＴ顆粒系において開裂され、Ｋｕ−７０、ＰＭＳ−１及び
ＲＮＡポリメラーゼＩＩのラージサブユニットのグランザイム−Ｂ特異的断片を
生成した。

【０１４５】細胞傷害性リンパ球顆粒誘導の標的細胞死の際にＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのグランザ
イムＢ特異的断片が生成されることが示された。同様のアプローチを用いて、ｉ
ｎｖｉｔｒｏでグランザイムＢによって開裂される他の自己抗原も、リンホカ
イン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞による無傷Ｆａｓ陰性標的細胞の死滅の際に開
裂されるかどうかを検討した。Ｍｉ−２、Ｕ１−７０ｋＤａ、トポイソメラーゼ
−１、ＰＭＳ−１及びＳＲＰ−７２並びにＫｕ−７０、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ
及びＫｉ−６７のグランザイムＢ特異的断片がこの形態の細胞死の際に生成され
、適当な抗体での免疫ブロット法によって同定された。すべてカスパーゼ−３と
グランザイムＢの両方による直接開裂に感受性である、Ｍｉ−２、Ｕ１−７０ｋ
Ｄａ、ＳＲＰ−７２及びトポイソメラーゼ−１の場合には、これらの抗原のグラ
ンザイムＢ特異的断片の量は、２つのプロテアーゼによる開裂の相対的効率によ
って決定されると思われる。それ故、Ｍｉ−２とトポイソメラーゼ−１（これら
はグランザイムＢによって効率的に開裂される）のグランザイムＢ特異的断片は
明らかに認められた。それに対し、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの添加によってカス
パーゼが阻害されなければ、無傷細胞死アッセイにおいてＵ１−７０ｋＤａ、Ｓ
ＰＲ−７２の非常に低いレベルのグランザイムＢ特異的断片、あるいはトポイソ
メラーゼ−１（７２及び７５ｋＤａ）に関してはより効率的でない開裂部位が認
められた。グランザイムＢの基質であるがカスパーゼにとっての基質ではないＰ
ＭＳ１の開裂は、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによって影響されなかった。

【０１４６】実施例１６自己抗原のグランザイムＢ開裂の特異性。

【０１４７】グランザイムＢは、位置走査組合せテトラペプチドライブラリーを用いて特異
性が定義されたセリンプロテアーゼである。このプロテアーゼは、Ｐ_４ではＩ、
Ｖ又はＬ、Ｐ_３ではＥ、Ｇ、Ｓ、及びＰ_２ではＰ、Ｓ、Ｎ、Ａ、Ｑ、Ｈ、Ｔ、Ｖ
、Ｅ、Ｄ、そしてＰ_１ではＤに対する選択性を持つ。グランザイムＢ開裂によっ
て生成される断片の大きさと開裂の特異性を用いて、開裂部位と考えられる部位
を同定した。グランザイムＢはＰ１位置ではＡｓｐを選択し、その部位ではＡｌ
ａを許容しないので、部位特異的突然変異誘発を用いていくつかのグランザイム
Ｂ基質における一連のＡｓｐ−Ａｌｐ置換を行った。プロテアーゼによる開裂の
効率への各々の突然変異の影響を評価した。

【０１４８】ＰＡＲＰとＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳにおけるグランザイムＢ開裂部位を定義した。上
記のアプローチを使用して、フィブリラリン、Ｍｉ−２、トポイソメラーゼ１、
ＰＭＳ１、ＰＭＳ２及びＵ１−７０ｋＤａにおけるグランザイムＢ開裂部位も定
義した（表３）。興味深いことに、これらの１１の開裂部位のうち１０がＰ_２位
置にＰ（７）、Ａ（２）又はＳ（１）を含み、それらはグランザイムＢによって
選択されるがＩＩＩ群カスパーゼによってはほとんど許容されない。さらに、４
つの開裂部位はＰ_３にＧ又はＳも含む。これらの残基もＩＩＩ群カスパーゼによ
っては許容されない。他の自己抗原において可能性のあるグランザイムＢ開裂部
位を予測するための断片サイズを使用して、これらの蛋白質において可能性のあ
る開裂部位を同定した。いずれの場合も、これらの開裂部位は、グランザイムＢ
によって選択されるがＩＩＩ群カスパーゼによっては許容されないＰ_２及び／又
はＰ_３の残基を含んでいた（表３）。

【０１４９】これらの基質がＩＩＩ群カスパーゼによって開裂されないことを確認するため
、基質を５０ｎＭ精製カスパーゼ−８と共にインキュベートした。最初に内因性
カスパーゼを１ｍＭヨードアセトアミドによって不可逆的に不活性化した（４℃
で１５分間）後、５ｍＭＤＴＴを加えて外因性カスパーゼ−８活性を促進して
おいたＨｅＬａ細胞溶解産物において、開裂アッセイを実施した。トポイソメラ
ーゼ−１、Ｍｉ−２、Ｕ１−７０ｋＤａ、ＰＡＲＰ、Ｋｕ−７０、ＲＮＡポリメ
ラーゼＩＩのラージサブユニット、ＳＲＰ−７２、ＮｕＭＡ又はＫｉ−６７の開
裂は起こらなかった。ＩＡＡ「毒作用」段階を省いたときに見られるＰＡＲＰと
Ｕ１−７０ｋＤａの強固なカスパーゼ−３開裂産物が示すように、カスパーゼ−
８は実際にこれらの溶解産物において活性であった。放射標識したＰＭＳ１とＰ
ＭＳ２（ＩＶＴＴによって生成される）も精製カスパーゼ−８によって開裂され
なかった。

【０１５０】検討した２８の自己抗原のうち２０がグランザイムＢによる効率的開裂に感受
性であり、特徴的な断片を生じることが明らかになった。開裂される分子は非細
胞位置、機能及び伸張一次配列においては著しく異なるが、２つの特徴を共有す
る：（ｉ）すべてが、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、広汎性及び限局性強皮症及
び自己免疫性筋炎を含めて、ヒト自己免疫疾患において高い力価の自己抗体応答
によって標的される自己抗原である；そして（ｉｉ）分子が、カスパーゼ−８に
よる開裂に感受性でないグランザイムＢ開裂部位を含むという統一性を持つ（下
記参照）。興味深いことに、カスパーゼ３及び７の前駆体に対する自己抗体（グ
ランザイムＢとカスパーゼ−８によって同じ部位で開裂され、同じ断片を生じる
）は、免疫ブロット法により＞１０００の自己免疫血清において検出されなかっ
た。

【０１５１】それ故、自己抗原としての分子の状態と、グランザイムＢによって開裂される
がカスパーゼ−８によっては開裂されないというその特徴的な感受性は、高度に
関連している（Ｐ＜０．０００１；カイ二乗検定）。グランザイムＢによる特徴
的な開裂への感受性と自己抗原としての状態の正の予測値はこれら４８基質につ
いて１００％であるが、負の予測値は７３％であり、付加的な機序が一部の分子
の自己抗原としての選択に関与していることを示唆する。開裂されない分子の大
部分が核蛋白質複合体（例えばヌクレオソームの成分やｓｎＲＮＰ）であること
は注目すべきである。

【０１５２】いくつかの分子のグランザイムＢ開裂部位は、ショウジョウバエや酵母におい
てさえも、高度に保存される。細胞傷害性リンパ球がまだ進化していない生物に
おけるグランザイムＢ開裂部位のこの著明な配列保存は、重要な、しかしまだ定
義されていない機能がこれらの領域によって果たされていることを意味する。そ
れ故、グランザイムＢのこの新しい、拡大されたファミリーは、アスパラギン酸
特異的アポトーシスプロテアーゼの進化と生物学的機能を探求し、細胞傷害性リ
ンパ球顆粒が媒介する細胞死の機序を探索するための強力なツールを提供する。

【０１５３】ヒトの全身性自己免疫疾患は、個人の感受性、開始及び組織標的に影響を及ぼ
す数多くの変数を持つ、極めて複雑な疾患スペクトルである。これらの疾患のス
ペクトル全体にわたって標的した自己抗原が、グランザイムＢによる効率的開裂
に対する感受性と、他の形態の細胞死の際には生成されない特徴的な断片の生成
によって統一されることを明らかにすることにより、これらの試験は、自己免疫
の開始における細胞傷害性リンパ球顆粒経路の役割に焦点を当てる。基質がカス
パーゼとグランザイムＢの両方によって開裂される場合には、独自のグランザイ
ムＢ断片の生成はカスパーゼの相対的阻害に依存する。それ故、特定の理論に縛
られるのは望むところではないが、カスパーゼ活性が相対的抑制下にあるミクロ
環境で起こる免疫前細胞内感染の間に、独自のグランザイムＢ断片の産生が促進
されると考えられる。アポトーシス物質のクリアランスが損なわれている感受性
個体においては、これらの断片の閾値以上の量が蓄積し、樹状細胞によって有効
に捕獲されて提供される。生じる免疫応答はＣＴＬ顆粒誘導の細胞死の産物に向
けられ、これらの自己持続性疾患の自己増幅する損傷特性を生じさせる。

【０１５４】実施例１７処置のための候補薬剤のスクリーニング本文中で述べるアッセイは、自己免疫疾患、癌、又はそのような疾患の症状の
予防的又は治療的処置のための候補薬剤のスクリーニングに適合させることがで
きる。１つの例示としての様式では、候補薬剤を開裂されない自己抗原とリンパ
球顆粒内容物、顆粒酵素又はグランザイムＢに接触させる。顆粒酵素又はグラン
ザイムＢは様々な純度で調製することができる。自己抗原は、顆粒内容物によっ
て開裂されうる基質であるか、あるいは精製された又は部分的に精製された酵素
を使用する場合には特定の酵素にとっての基質でなければならない。ひとたび接
触させると、自己抗原が自己抗原断片に開裂されるのを監視することができる。
所望する場合には、候補薬剤を含まない、又は酵素の既知の阻害因子を含む対照
アッセイを平行して実施することができる。自己抗原断片の生成は、開裂を通し
て産生されるエピトープの抗体捕獲、開裂部位にまたがるエピトープの喪失、ク
ロマトグラフィー又は電気泳動を通しての開裂産物の分離、並びに当該技術にお
いて既知であり、使用されているか又はその後検出技術において開発される他の
手法を含めて、当該技術において既知の様々な手段によって監視することができ
る。スクリーニングアッセイは定量的又は定性的でありうる。

【０１５５】候補薬剤は、有機又は無機の化学的化合物、又は蛋白質、ペプチド、糖蛋白質
又は糖ペプチド、多糖類又は他の高分子を含めた生化学的化合物でありうる。

【０１５６】自己抗原の自己抗原断片への開裂の速度又は量を低下させる候補薬剤を、プロ
セスの阻害因子と称する。製薬科学の技術において認められている方法と手順に
よって、動物及びヒトの処置における適用についての適合性を調べるために候補
薬剤を検討することができる。試験を通して適切な効果と許容される安全性プロ
フィールを持つことが示された候補薬剤が、患者の予防的又は治療的処置におい
て使用される。

【０１５７】参考文献Ａｎｄｒａｄｅ，Ｆ．，Ｒｏｙ，Ｓ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｔｈｏｒｎ
ｂｅｒｒｙ，Ｎ．，Ｒｏｓｅ，Ａ．，及びＣａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．
１９８８。グランザイムＢはいくつかの下流カスパーゼ基質を直接且つ効率的に
開裂する：ＣＴＬ誘導のアポトーシス免疫に関する示唆。８：４５１−４６０。

【０１５８】Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｆ．とＳ．Ｋｏｕｔｏｕｚｏｖ．（１９９７）。全身性狼瘡に
とっての新たな糸口。Ｌａｎｃｅｔ３５０：１１−１１。

【０１５９】Ｂｅｉｄｌｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．，Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ｐ．Ｄ．
，Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｇ．，及びＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．（１９９５）。バキュロウ
イルスｐ３５蛋白質はＦａｓ及び腫瘍壊死因子が誘導するアポトーシスを阻害す
る。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１６５２６−１６５２８。

【０１６０】Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔ，Ｌ．Ｋ．，Ｒ．Ｊ．Ｇｅｅ，及びＭ．Ｊ．Ｍａｍｕ
ｌａ．（１９９５）。狼瘡自己免疫の開始における自己ペプチド。Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５４：３５１６−３５２４。

【０１６１】Ｂｕｍｐ，Ｎ．Ｊ．，Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｍ．，Ｈｕｇｕｎｉｎ，Ｍ．，Ｓｅｓ
ｈａｇｉｒｉ，Ｓ．，Ｂｒａｄｙ，Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．，Ｆｅｒｅｎｚ，Ｃ．
，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｓ．，Ｇｈａｙｕｒ，Ｔ．，Ｌｉ，Ｐ．，Ｌｉｃａｒｉ，
Ｐ．，Ｍａｎｋｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｓｈｉ，Ｌ．Ｆ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ．
Ｈ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｋ．，及びＷｏｎｇ，Ｗ．Ｗ．（１９９５）。バキュ
ロウイルス抗アポトーシス蛋白質ｐ３５によるＩＣＥファミリープロテアーゼの
阻害。Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９，１８８５−１８８８。

【０１６２】Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｒ．Ｌ．Ｒｕｂｉｎ，Ｒ．Ｓ．Ｂａｌｄｅ
ｒａｓ，及びＡ．Ｎ．Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｓ．（１９９３）。マウス狼瘡
における抗クロマチン自己抗体の発生と進行は自己抗原によるＴ依存性免疫に関
係する。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１６８７−１６９６。

【０１６３】Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．Ａ．，Ａｎｈａｌｔ，Ｇ．Ｊ．，及びＲ
ｏｓｅｎ，Ａ．（１９９４ａ）。全身性エリテマトーデスにおいて標的される自
己抗原は、アポトーシス性ケラチノサイト上の２群の表面構造に集合する。Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１３１７−１３３０。

【０１６４】Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｋ．，Ａｎｈ
ａｌｔ，Ｇ．Ｊ．，及びＲｏｓｅｎ，Ａ．（１９９４ｂ）。Ｕ１小核リボ核蛋白
質の７０ｋＤａ蛋白質成分の特異的開裂はアポトーシス性細胞死の特徴的な生化
学特性である。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３０７５７−３０７６０。

【０１６５】Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ．，Ｌ．Ａ．，Ａｎｈａｌｔ，Ｇ．Ｊ．，Ｒｏ
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に早期に特異的に開裂される自己抗原のサブセットの１つである。Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１８２，１６２５−１６３４。

【０１６６】Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．Ａ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，
Ｃｈｏｎｇ，Ｔ．，Ｒｏｗａｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．，
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｋ．，及びＲｏｓｅｎ，Ａ．（１９９６）。アポパイン／Ｃ
ＰＰ３２は細胞修復に必須の蛋白質を開裂する：アポトーシス細胞死の基本的原
理。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，１９５７−１９６４。

【０１６７】Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．及びＡ．Ｒｏｓｅｎ．（１９９７）。紫
外線が誘発するケラチノサイトアポトーシス：皮膚病変誘発の潜在的機序とＬＥ
における自己抗体産生。Ｌｕｐｕｓ６：１７５−１８０。

【０１６８】Ｃａｓｉａｎｏ，Ｃ．Ａ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．
，及びＴａｎ，Ｅ．Ｍ．（１９９６）。ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）媒介の
Ｔ細胞アポトーシスの際の核自己抗原の選択的開裂。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
４，７６５−７７０。

【０１６９】Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．及びＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．（１９９６ａ）。
細胞死マシン。Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，５５５−５６２。

【０１７０】Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｈａｎｎａ，Ｗ．Ｌ．，Ｏｒｔｈ，Ｋ．，
Ｄｕａｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｇ．Ｇ．，Ｆｒｏｅｌｉｃｈ，Ｃ．Ｊ．
，及びＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．（１９９６ｂ）。細胞傷害性Ｔ細胞誘導のグランザ
イムＢは、アポトーシスプロテアーゼＩＣＥ−ＬＡＰ３を活性化する。Ｃｕｒｒ
．Ｂｉｏｌ．６，８９７−８９９。

【０１７１】Ｄａｒｍｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｌｅｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．
，及びＢｌｅａｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｃ．（１９９６）。グランザイムＢによるＣＰ
Ｐ３２の開裂は、標的細胞ＤＮＡ断片化の誘導におけるグランザイムＢの重要な
役割である。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２１７０９−２１７１２。

【０１７２】Ｄａｒｍｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，及びＢｌｅａｃｋ
ｌｅｙ，Ｒ．Ｃ．（１９９５）。細胞傷害性Ｔ細胞誘導のグランザイムＢによる
アポトーシスプロテアーゼＣＰＰ３２の活性化。Ｎａｔｕｒｅ３７７，４４６
−４４８。

【０１７３】Ｄｅｖｅｒａｕｘ，Ｑ．Ｌ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｒ．，Ｓａｌｖｅｓｅｎ
，Ｇ．Ｓ．及びＲｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．（１９９７）。Ｘ結合ＩＡＰは細胞死プロテ
アーゼの直接阻害因子である。Ｎａｔｕｒｅ３８，３００−３０４。

【０１７４】Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｂ．，Ｊ．Ｂ．Ｋａｔｚ，Ｅ．Ｐａｕｌ，Ｃ．Ａｒａｎｏｗ
，Ｄ．Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ，及びＭ．Ｄ．Ｓｃｈａｒｆｆ．（１９９２）。病
原性抗ＤＮＡ応答における体細胞突然変異の役割。Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１０：７３１−７５７。

【０１７５】Ｄｕａｎ，Ｈ．，Ｏｒｔｈ，．，Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｐｏｉｒ
ｉｅｒ，Ｇ．Ｇ．，Ｆｒｏｅｌｉｃｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｅ，Ｗ．−Ｗ．，及びＤｉ
ｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．（１９９６）。ＩＣＥ／Ｃｅｄ−３遺伝子ファミリーの新規メ
ンバー、ＩＣＥ−ＬＡＰ６は細胞傷害性Ｔ細胞プロテアーゼ、グランザイムＢに
よって活性化される。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１６７２０−１６７２
４。

【０１７６】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｔ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｃ．
，Ｋｒｅｂｓ，Ｊ．，Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ，Ｓ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂ
ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｆ．，Ｆｒｉｔｚ，Ｌ．Ｃ．，Ｔｒａｐａｎｉ，Ｊ．Ａ．，Ｔ
ｏｍａｓｅｌｌｉ，Ｋ．Ｊ．，Ｌｉｔｗａｃｋ，Ｇ．，及びＡｌｎｅｍｒｉ，Ｅ
．Ｓ．（１９９６）。２つのＦＡＤＤ様ドメインを含む新規ヒトアポトーシス性
システインプロテアーゼ、Ｍｃｈ４によるＣＰＰ３２とＭｃｈ３のｉｎｖｉｔ
ｒｏ活性化。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，７４６４
−７４６９。

【０１７７】Ｆｒｏｅｌｉｃｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｈａｎｎａ，Ｗ．Ｌ．，Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｇ．
Ｇ．，Ｄｕｒｉｅｚ，Ｐ．Ｊ．，Ｄ’Ａｍｏｕｒｓ，Ｄ．，Ｓａｌｖｅｓｅｎ，
Ｇ．Ｓ．，Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｅ．Ｓ．，Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．，及びＳｈ
ａｈ，Ｇ．Ｍ．（１９９６ａ）。ｊｕｒｋａｔ細胞のグランザイムＢパーフォリ
ン媒介のアポトーシスは、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼを８９ｋＤａ
のアポトーシス断片とそれより少ない割合の６４ｋＤａ断片に開裂する。

【０１７８】Ｆｒｏｅｌｉｃｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｏｒｔｈ，Ｋ．，Ｔｕｒｂｏｖ，Ｊ．，Ｓｅｔ
ｈ，Ｐ．，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｒ．，Ｂａｂｉｏｒ，Ｂ．，Ｓｈａｈ，Ｇ．Ｍ．
，Ｂｌｅａｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｃ．，Ｄｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．及びＨａｎｎａ，Ｗ．
（１９９６ｂ）。リンパ球顆粒媒介の細胞傷害に関する新しいパラダイム−標的
細胞はグランザイムＢに結合し、内在化するが、サイトゾルの供給送達とその後
のアポトーシスにはエンドソーム溶解物質が必要である。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７１，２９０７３−２９０７９。

【０１７９】Ｇｈａｙｕｒ，Ｔ．，Ｈｕｇｕｎｉｎ，Ｍ．，Ｔａｌａｎｉａｎ，Ｒ．Ｖ．，
Ｒａｔｎｏｆｓｋｙ，Ｓ．，Ｑｕｉｎｌａｎ，Ｃ．，Ｅｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｐａｎ
ｄｙ，Ｐ．，Ｄａｔｔａ，Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｋｈａｒｂａｎｄａ，Ｓ．
，Ａｌｌｅｎ，Ｈ．，Ｋａｍｅｎ，Ｒ．，Ｗｏｎｇ，Ｗ．，及びＫｕｆｅ，Ｄ．
（１９９６）。ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼによる蛋白質キナーゼＣｄ
の蛋白質分解性活性化はアポトーシスの特徴を誘導する。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１８４，２３９９−２４０４。

【０１８０】Ｇｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｋ．，Ｙａｍｉｎ，Ｔ
．−Ｔ．，Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．，及びＲｏｓｅｎ，Ａ．８１９
９６）。Ｆａｓ結合Ｊｕｒｋａｔ細胞における３つの異なるＩＣＥ様作用の連続
的活性化。ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３９０，２９９−３０３。

【０１８１】Ｇｕ，Ｙ．，Ｓａｒｎｅｃｋｉ，Ｃ．，Ｆｌｅｍｉｎｇ，ＭＡ．，Ｌｉｐｐｋ
ｅ，Ｊ．Ａ，Ｂｌｅａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｃ．，及びＳｕ，Ｍ．Ｓ．Ｓ．（１９９６
）。グランザイムＢによるＣＭＨ−１のプロセシングと活性化。Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ２７１，１０８１６−１０８２０。

【０１８２】Ｈｅｕｓｅｌ，Ｊ．Ｗ．，Ｗｅｓｓｅｌｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｈｒｅ
ｓｔａ，Ｓ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｈ．，及びＬｅｙ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）
。細胞傷害性リンパ球は、同種異系標的細胞におけるＤＮＡ断片とアポトーシス
の速やかな誘導のためにグランザイムＢを必要とする。Ｃｅｌｌ７６，９７７
−９８７。

【０１８３】Ｉｒｍｌｅｒ，Ｍ．，Ｔｈｏｍｅ，Ｍ．，Ｈａｈｎｅ，Ｍ．，Ｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｂ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｖ．，Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ
．Ｌ．，Ｓｃｈｒｏｔｅｒ，Ｍ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｋ．，Ｍａｔｔｍａｎｎ，Ｃ．
，Ｒｉｍｏｌｄｉ，Ｄ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｌ．Ｅ．，及びＴｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．
（１９９７）。細胞ＦＬＩＰによる細胞死レセプタシグナルの阻害。Ｎａｔｕｒ
ｅ３８８，１９０−１９５。

【０１８４】Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｗｅｉｌ，Ｍ．，及びＲａｆｆ，Ｍ．Ｃ．（１
９９７）。動物の発達におけるプログラム細胞死。Ｃｅｌｌ８８，３４７−３
５４。Ｊａｎｓ，Ｄ．Ａ．，Ｊａｎｓ，Ｐ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｌ．Ｊ．，Ｓｕｔｔｏｎ
，Ｖ．，及びＴｒａｐａｎｉ，Ｊ．Ａ．（１９９６）。グランザイムＢ（フラグ
メンチン２）の核輸送。ｉｎｖｉｖｏでのパーフォリン及びｉｎｖｉｔｒｏ
でのサイトゾル因子への依存。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３０７８１−
３０７８９。Ｋｒａｊｅｗｓｋａ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｇ．，Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｓ．，
Ｚａｐａｔａ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈａｂａｉｋ，Ａ．，Ｇａｓｃｏｙｎｅ，Ｒ．，
及びＲｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．（１９９７）。細胞死プロテアーゼ、ＣＰＰ３２（カス
パーゼ−３）の発現のｉｎｖｉｖｏパターンの免疫組織化学的分析。Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ．５７，１６０５−１６１３。

【０１８５】Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｇａｓｃｏｙｎｅ，Ｒ．Ｄ．，Ｚａｐａｔａ，Ｊ
．Ｍ．，Ｋｒａｊｅｗｓｋａ，Ｍ．，Ｋｉｔａｄａ，Ｓ．，Ｃｈｈａｎａｂｈａ
ｉ，Ｍ．，Ｈｏｒｓｍａｎ，Ｄ．，Ｂｅｒｅａｎ，Ｋ．，Ｐｉｒｏ，Ｌ．Ｄ．，
Ｆｕｇｉｅｒ−Ｖｉｖｉｅｒ，Ｉ．，Ｌｉｕ，Ｙ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｇ．，
及びＲｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．（１９９７）。非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血
病、及び反応性リンパ節におけるＩＣＥ／Ｃｅｄ−３ファミリープロテアーゼ、
ＣＰＰ３２（カスパーゼ−３）の免疫学的局在決定。Ｂｌｏｏｄ８９，３８１
７−３８２５。

【０１８６】Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．（１９９５）。潜在型エピトープはいかにし
て自己免疫の引き金となりうるか。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１，１９４５−１
９４８。

【０１８７】Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｚｏｕ，Ｈ．，Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ，Ｃ．，及びＷａｎｇ，Ｘ
．（１９９７）。カスパーゼ−３の下流で機能してアポトーシスの際のＤＮＡ断
片化の引き金となるヘテロダイマー蛋白質、ＤＦＦ。Ｃｅｌｌ８９，１７５−
１８４。

【０１８８】Ｍａｍｕｌａ，Ｍ．Ｊ．（１９９３）。自己ペプチドのプロセシングが不能で
あることは自己反応性Ｔ細胞に寛容を回避させる。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７
：５６７−５７１。Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ａｍａｒａｎｔｅ−Ｍｅｎｄｅｓ
，Ｇ．Ｐ．，Ｓｈｉ，Ｌ．Ｆ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｈ．，Ｃａｓｉａｎｏ，Ｃ
．Ａ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｇ．Ａ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｐ．，Ｔａｎ，Ｅ
．Ｍ．，Ｂｏｋｏｃｈ，Ｇ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．，及びＧｒｅ
ｅｎ，Ｄ．Ｒ．（１９９６）。細胞傷害性細胞プロテアーゼ、グランザイムＢは
、新しい２段階の機序を通してＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリープロテアーゼ、Ｃ
ＰＰ３２の蛋白質分解プロセシングと活性化により細胞不含系においてアポトー
シスを開始させる。ＥＭＢＯＪ．１５，２４０７−２４１６。

【０１８９】Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｊ．及びＧｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．（１９９５）。アポトーシ
スの際のプロテアーゼ活性化：無数の切断による死滅？Ｃｅｌｌ８２，３４９
−３５２。

【０１９０】ＭｃＧａｈｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｗ．Ｋ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ
．Ｊ．，Ｍａｈｂｏｕｂｉ，Ａ．，Ｃｏｔｔｅｒ，Ｔ．Ｇ．及びＧｒｅｅｎ，Ｄ
．Ｒ．（１９９５）。ＡｂｌによるＦａｓアポトーシス性細胞死経路の調節。Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２２６２５−２２６３１。

【０１９１】Ｍｕｚｉｏ，Ｍ．，Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｋｉｓｃｈｋｅｌ，Ｆ
．Ｃ．，Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．，Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．，Ｎｉ，Ｊ．，
Ｓｃａｆｆｉｄ，Ｃ．，Ｂｒｅｔｚ，Ｊ．Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｍ．，Ｇｅｎｔｚ
，Ｒ．，Ｍａｎｎ，Ｍ．，Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｐｅｔｅｒ，Ｍ．Ｅ．，
及びＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．（１９９６）。新しいＦＡＤＤ相同なＩＣＥ／ＣＥＤ
−３様プロテアーゼ、ＦＬＩＣＥは、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）の死滅を
誘導するシグナル複合体に集積される。Ｃｅｌｌ８５，８１７−８２７。

【０１９２】Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，Ａｌｉ，Ａ．，Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．
Ａ．，Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｄｉｎｇ，Ｃ．Ｋ．，Ｇａｌｌａ
ｎｔ，Ｍ．，Ｇａｒｅａｕ，Ｙ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｌａｂｅｌｌｅ
，Ｍ．，Ｌａｚｅｂｎｉｋ，Ｙ．Ａ．，Ｍｕｎｄａｙ，Ｎ．Ａ．，Ｒａｊｕ，Ｓ
．Ｍ．，Ｓｍｕｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｙａｍｉｎ，Ｔ．，Ｙｕ，Ｖ．Ｌ．，及び
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｋ．（１９９５）。哺乳類のアポトーシスに必要なＩＣＥ／
ＣＥＤ−３プロテアーゼの同定と阻害。Ｎａｔｕｒｅ３７６，３７−４３。

【０１９３】Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．とＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．（１９９７
）。カスパーゼ：キラープロテアーゼ。ＴＩＢＳ２２，２９９−３０６。Ｏｄａｋｅ，Ｓ．，Ｋａｍ，Ｃ．Ｍ．，Ｎａｒａｓｈｉｍｈａｎ，Ｌ．，Ｐｏｅ
，Ｍ．，Ｂｌａｋｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｋｒａｈｅｎｂｕｈｌ，Ｏ．，Ｔｓｃｈｏｐｐ
，Ｊ．，及びＰｏｗｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．（１９９１）。ヒト及びマウス細胞傷害性
Ｔリンパ球セリンプロテアーゼ：ペプチドチオエステル基質によるサブサイトマ
ッピング並びにイソクマリンによる酵素活性と細胞溶解の阻害。Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ３０，２２１７−２２２７。

【０１９４】Ｐｉｎｋｏｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｕ．，Ｈｕｄｉｇ，Ｄ．，及
びＢｌｅａｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｃ．（１９９６）。標的細胞の核におけるグランザ
イムＢの結合。８０ｋＤａ蛋白質の認識。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１
０２２５−１０２２９。

【０１９５】Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．及びＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｐ．Ｊ．（１９８４）。細胞
溶解性Ｔ細胞顆粒。分離、構造的、生化学的及び機能的特性指摘。Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１６０，６９５−７１０。

【０１９６】Ｐｏｅ，Ｍ．，Ｂｌａｋｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｂｏｕｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｇａｍｍ
ｏｎ，Ｍ．，Ｓｉｇａｌ，Ｎ．Ｈ．，Ｗｕ，Ｊ．Ｋ．，及びＺｗｅｅｒｉｎｋ，
Ｈ．Ｊ．（１９９１）。ヒト細胞傷害性リンパ球グランザイムＢ：顆粒からのそ
の精製と基質及び阻害因子特異性の特性指摘。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６
，９８−１０３。

【０１９７】Ｑｕａｎ，Ｌ．Ｔ．，Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．，Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．，Ｄｉｘ
ｉｔ，Ｖ．，Ｓｎｉｐａｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｇ．Ｇ．，Ｒａｙ，Ｃ
．，Ｐｉｃｋｕｐ，Ｄ．Ｊ．，及びＳａｌｖｅｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９６）。
グランザイムＢによる細胞死プロテアーゼＹａｍａ／ＣＰＰ３２の蛋白質分解性
活性化。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，１９７２−１
９７６。

【０１９８】Ｒａｄｉｃ，Ｍ．Ｚ．とＭ．Ｗｅｉｇｅｒｔ．（１９９４）。抗ＤＮＡ抗体の
抗原選択に関する遺伝的及び構造的証拠。Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
２：４８７−５２０。Ｒａｍａｇｅ，Ｐ．，Ｃｈｅｎｅｖａｌ，Ｄ．，Ｃｈｖｅ
ｉ，Ｍ．，Ｇｒａｆｆ，Ｐ．，Ｈｅｍｍｉｇ，Ｒ．，Ｈｅｎｇ，Ｒ．，Ｋｏｃｈ
ｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ａ．，Ｍｅｍｍｅｒｔ，Ｋ．，Ｒｅｖｅ
ｓｚ，Ｌ．，及びＷｉｓｈａｒｔ，Ｗ．（１９９５）。インターロイキン−１ｂ
−変換酵素前駆体の発現、ひだ形成及び自己触媒的蛋白質分解プロセシング。Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，９３７８−９３８３。

【０１９９】Ｓａｌｅｍｉ，Ｓ．，Ａ．Ｐ．Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ，Ｌ．Ｂｏｆｆａ，Ｍ．Ｇ
．Ｌｏｎｇｏｂａｒｄｉ，及びＶ．Ｂａｒｎａｂａ．（１９９５）。ＨＩＶｇｐ
１２０は、プロセシングの際に隠蔽ＣＤ４ペプチドの顕在化によって自己反応性
ＣＤ４特異的Ｔ細胞応答を活性化する。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２２５３
−２２５７。

【０２００】Ｓａｒｉｎ，Ａ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｓ．，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｍｉ
ｌｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，
Ｃ．Ｍ．，及びＨｅｎｋａｒｔ，Ｐ．Ａ．（１９９７）。ＣＴＬ顆粒エキソサイ
トーシスによる標的細胞溶解はＩＣＥ／Ｃｅｄ−３ファミリープロテアーゼに関
係しない。Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６：２０９−２１５。

【０２０１】Ｓｅｒｃａｒｚ，Ｅ．Ｅ．，Ｐ．Ｖ．Ｌｅｈｍａｎｎ，Ａ．Ａｍｅｔａｎｉ，
Ｇ．Ｂｅｎｉｃｈｏｕ，Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ，及びＫ．Ｍｏｕｄｇｉｌ．（１９９
３）。Ｔ細胞抗原決定基の優性度と潜在性。Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１１：７２９−７６６。

【０２０２】Ｓｅｒｃａｒｚ，Ｅ．Ｅ．とＳ．Ｋ．Ｄａｔｔａ．（１９９４）。自己免疫の
機序：１９９０年代半ばからの眺望。Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：８７５−８８１。

【０２０３】Ｓｈｉ，Ｌ．Ｆ．，Ｍａｉ，Ｓ．，Ｉｓｒａｅｌ，Ｓ．，Ｂｒｏｗｎｅ，Ｋ．
，Ｔｒａｐａｎｉ，Ｊ．Ａ．，及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．（１９９７）
。グランザイムＢ（ＧｒａＢ）は自律的に細胞膜を通過し、パーフォリンがアポ
トーシスとＧｒａＢの核局在を開始させる。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，８５
５−８６６。

【０２０４】Ｓｈｒｅｓｔａ，Ｓ．，ＭａｃＩｖｏｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈｅｕｓｅｌ，Ｊ．Ｗ．
，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｈ．，及びＬｅｙ，Ｔ．Ｊ．（１９９５）。ナチュラル
キラー及びリンホカイン活性化キラー細胞は、感受性標的細胞におけるアポトー
シスの速やかな誘導のためにグランザイムＢを必要とする。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２，５６７９−５６８３。

【０２０５】Ｓｉｍｉｔｓｅｋ，Ｐ．Ｄ．，Ｄ．Ｇ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｌａｎｚａｖ
ｅｃｃｈｉａ，Ｎ．Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ，及びＣ．Ｗａｔｔｓ．（１９９５
）。結合抗体による抗原プロセシングの変調は、様々なＴ細胞決定基のクラスＩ
Ｉの主要な組織適合性複合体の発現を促進する又は抑制することができる。Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１９５７−１９６３。

【０２０６】Ｓｏｎｇ，Ｑ．Ｚ．，Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｓ．Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．，Ｌｅｅ
ｓ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｔｒａ
ｐａｎｉ，Ｊ．Ａ．，Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｅ．，Ｌｉｔｗａｃｋ，Ｇ．，Ｌｕ，Ｈ
．，Ｍｏｓｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．，及びＬａｖｉｎ，Ｍ．Ｆ．（
１９９６ａ）。インターロイキン−１Ｂ変換酵素様プロテアーゼは、細胞傷害性
Ｔ細胞の死滅の際にＤＮＡ依存性蛋白質キナーゼを開裂する。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１８４，６１９−６２６。

【０２０７】Ｓｏｎｇ，Ｑ．Ｚ．，Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．
，Ｚｈａｎｇ，Ｎ．，Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｃ．Ｍ．，Ｊａｃ
ｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｅ．Ｓ．，Ｌｉｔｗａｃｋ，Ｇ．，Ｋｈ
ａｎｎａ，Ｋ．Ｋ．，及びＬａｖｉｎ，Ｍ．Ｆ．（１９９６ｂ）。ＤＮＡ依存性
蛋白質キナーゼ触媒サブユニット：アポトーシスにおけるＩＣＥ様プロテアーゼ
の標的。ＥＭＢＯＪ．１５，３２３８−３２４６。

【０２０８】Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ，Ｓ．Ｍ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ，
Ｔ．，Ｚａｎｇｒｉｌｌｉ，Ｊ．，Ｒｏｇｅｒｔｓｏｎ，Ｎ．，Ａｒｍｓｔｒｏ
ｎｇ，Ｒ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｊ．，Ｔｒａｐａｎｉ，Ｊ．Ａ．，Ｔｏｍａｓ
ｅｌｌｉ，Ｋ．Ｊ．，Ｌｉｔｗａｃｋ，Ｇ．，及びＡｌｎｅｍｒｉ，Ｅ．Ｓ．（
１９９６）。Ｃｅｄ−３／インターロイキン１ｂ変換酵素様類似体、Ｍｃｈ６及
びラミン開裂酵素、Ｍｃｈ２ａは、アポトーシス媒介物質、ＣＰＰ３２の基質で
ある。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２７０９９−２７１０６。

【０２０９】Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ，Ｓ．Ｍ．，Ａｈｍａｄ，Ｍ．，Ｏｔｔｉｌｉｅ，Ｓ
．，Ｂｕｌｌｒｉｃｈ，Ｆ．，Ｂａｎｋｓ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｆｅｒｎａ
ｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｔ．，Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｌｉｔｗａｃｋ，Ｇ
．，Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ，Ｋ．Ｊ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｃ．及びＡｌｎ
ｅｍｒｉ，Ｅ．Ｓ．（１９９７）。Ｆａｓ／ＴＮＦＲ１誘導のアポトーシスを調
節する新規ＦＡＤＤ様抗アポトーシス分子、ＦＬＡＭＥ−１。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７２，１８５４２−１８５４５。

【０２１０】Ｔａｌａｎｉａｎ，Ｒ．Ｖ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｔｕｒｂｏｖ，Ｊ．，Ｓｅｔ
ｈ，Ｐ．，Ｇｈａｙｕｒ，Ｔ．，Ｃａｓｉａｎｏ，Ｃ．Ａ．，Ｏｒｔｈ，Ｋ．，
及びＦｒｏｅｌｉｃｈ，Ｃ．Ｊ．（１９９７）。顆粒媒介の細胞死：グランザイ
ムＢが開始させるアポトーシスの経路。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６，１３２３
−１３３１。

【０２１１】Ｔｈｏｍｅ，Ｍ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｆｉ
ｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，Ｈ．，Ｍｅｉｎｌ，Ｅ．，Ｎｅｉｐｅｌ，Ｆ．，Ｍａｔｔ
ｍａｎｎ，Ｃ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｋ．，Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｃｈｒｏｔｅ
ｒ，Ｍ．，Ｓｃａｆｆｉｄｉ，Ｃ．，Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｐｅｔｅｒ，
Ｍ．Ｅ．，及びＴｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．（１９９７）。ウイルス性ＦＬＩＣＥ阻害
性蛋白質（ＦＬＩＰ）は細胞死レセプタによって誘導されるアポトーシスを妨げ
る。Ｎａｔｕｒｅ３８６，５１７−５２１。

【０２１２】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（１９９５）。病因及び疾患の処置におけるアポ
トーシス。Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７，１４５６−１４６２。

【０２１３】Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．とＭｏｌｉｎｅａｕｘ，Ｓ．Ｍ．（１９９５
）。インターロイキン−１β変換酵素：ＩＬ−１βの産生に必要であり、プログ
ラム細胞死に関係する新規システインプロテアーゼ。ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅ
ｎｃｅ４，３−１２。

【０２１４】Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．，Ｒａｎｏｎ，Ｔ．Ａ．，Ｐｉｅｔｅｒｓｅ
ｎ，Ｅ．Ｐ．，Ｒａｓｐｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｔｉｍｋｅｙ，Ｔ．，Ｇａｒｃｉａ−
Ｃａｌｖｏ，Ｍ，Ｈｏｕｔｚａｇｅｒ，Ｖ．Ｍ．，Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ，Ｐ．Ａ
．，Ｒｏｙ，Ｓ．，Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｋ
．Ｔ．，及びＮｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．（１９９７）。組合せアプローチは
カスパーゼファミリーのメンバー及びグランザイムＢの特異性を明らかにする−
アポトーシスのキーメディエイターに関して確立された機能的関係。Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ２７２，１７９０７−１７９１１。

【０２１５】Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｄ．及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ
，Ｓ．Ａ．（１９８９）。ヒト黒色腫に浸潤するリンパ球による腫瘍特異的細胞
溶解。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２，３７１４−３７２５。

【０２１６】Ｔｒａｐａｎｉ，Ｊ．Ａ．，Ｂｒｏｗｎｅ，Ｋ．Ａ．，Ｓｍｙｔｈ，Ｍ．Ｊ．
，及びＪａｎｓ，Ｄ．Ａ．（１９９６）。核におけるグランザイムＢの局在−細
胞傷害性リンパ球媒介のアポトーシスの機序における推定上の役割。Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，４１２７−４１３３。

【０２１７】Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．（１９９４）。グランザイムＢ。ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ．２４４，８０−８７。

【０２１８】Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｙ．，Ｍｉｕｒａ，Ｍ．，Ｊｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｚｈｕ，Ｈ．
，Ｇａｇｌｉａｒｄｉｎｉ，Ｖ．，Ｓｈｉ，Ｌ．Ｆ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ
．Ｈ．，及びＹｕａｎ，Ｊ．Ｙ．（１９９６）。インターロイキン−１ｂ変換酵
素（ＩＣＥ）／Ｃｅｄ−３ファミリーのメンバーであり、ＩＣＥの上流調節因子
であるＩｃｈ−３の同定と特性指摘。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２０５
８０−２０５８７。

【０２１９】Ｗａｔｔｓ，Ｃ．とＡ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ．（１９９３）。Ｔ細胞エ
ピトープのプロセシングへの抗体の抑制作用。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１
４５９−１４６３。

【０２２０】Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．（１９９６）。生、死、及びアポトーシスの遂行。Ｇｅｎｅ
ｓＤｅｖ．１０，１−１５。

【０２２１】Ｘｕｅ，Ｄ．とＨｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．（１９９５）。バキュロウイルスｐ
３５蛋白質のＣＥＤ−３開裂部位によるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅ
ｇａｎｓ細胞死プロテアーゼ、ＣＥＤ−３の阻害。Ｎａｔｕｒｅ３７７，２４
８−２５１。

【０２２２】Ｙａｍｉｎ，Ｔ．Ｔ．，Ａｙａｌａ，Ｊ．Ｍ．，及びＭｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｋ．
（１９９６）。天然の４５ｋＤａ前駆体形態のインターロイキン−１β変換酵素
の活性化。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１３２７３−１３２８２。

【０２２３】Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．−Ｅ．，Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｈ．，Ｐｏｄａｃｋ，
Ｅ．，及びＣｏｈｎ，Ｚ．Ａ．（１９８６）。ナチュラルキラー活性を持つクロ
ーニングしたリンパ球の顆粒からの細胞溶解性孔形成蛋白質の精製と特性指摘。
Ｃｅｌｌ４４，８４９−８５９。

【０２２４】表Ｉ：グランザイムＢとカスパーゼ−３による種々の基質の開裂に関するｋ_ｃ _ａｔ／Ｋ_ｍ（触媒定数）値の比較。経時的実験で得られたデータをデンシトメ
トリーで走査し、各々の基質の％開裂を計算するために使用した。これらの数値
を一次反応速度式［開裂基質の％＝１００^＊（１−ｅ−（（ｋｃａｔ^＊［Ｅ］／
Ｋｍ）^＊時間））］に適合させて、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍを計算した。ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍの実験での変動を評価できるように、３つの異なるプロテアーゼ濃度で各々のプ
ロテアーゼ−基質の組合せに関する測定を実施した。

【０２２５】

【表１】

【０２２６】表ＩＩ：グランザイムＢとカスパーゼ−３による自己抗原のｉｎｖｉｔｒｏ
開裂後には種々の断片が検出される。精製ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、［^３５Ｓ］メチ
オニン標識ＰＡＲＰ、内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＮｕＭＡ、並びに精製プロテ
アーゼを用いて図２で得たデータを、下記の表の作成に使用した。

【０２２７】

【表２】

【０２２８】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】グランザイムＢは、ｉｎｖｉｔｒｏで様々な効率で精製ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、
ＮｕＭＡ、ＰＡＲＰ並びにカスパーゼ３及び７を開裂する。０−１２．５ｎＭの
グランザイムＢ（ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＮｕＭＡについて）又は０−５０ｎＭのグ
ランザイムＢ（カスパーゼ３及び７とＰＡＲＰについて）を含む反応を、実施例
１で述べたように実施した。蛍光光度法又は免疫ブロット法（モノクローナル抗
体１８−２を使用してＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを検出した）によって開裂断片を検出し
た。各々のパネルの右側に、無傷分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動位置を矢印で表
わし、断片の大きさを示している。

【図２】精製グランザイムＢ又はカスパーゼ−３によるｉｎｖｉｔｒｏでの自己抗原
の開裂は様々な断片を生じる。３０ｎＭの精製ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ（レーン１−３
）、ＨｅＬａ溶解産物中の内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＮｕＭＡ（レーン４−９）
又は［^３５Ｓ］メチオニン標識ＰＡＲＴ（レーン１０−１２）を含む反応を、次
の量のグランザイムＢと共にインキュベートした：１．２５ｎＭ（レーン２）；
１２．５ｎＭ（レーン５と８）又は５０ｎＭ（レーン１１）。次の量のカスパー
ゼ−３を使用してこれらの基質に関する同様の実験を行った：４２ｐＭ（レーン
３と１２）又は１００ｐＭ（レーン６と９）。反応混合物を３７℃で１５分間（
グランザイムＢの反応）又は６０分間（カスパーゼ−３の反応）インキュベート
した。グランザイムＢを使用してＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ及びＨｅＬａ細胞溶解産物中
のＮｕＭＡを開裂するときには、ＨｅＬａ細胞カスパーゼの活性化を防ぐために
１００ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを加えたことに留意されたい。無傷の開裂
したＮｕＭＡとＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを免疫ブロット法で視覚化し、ＰＡＲＰはオー
トラジオグラフィーで視覚化した。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳの場合には、モノクローナ
ル抗体２５−４（Ｃ末端に対して指令）及び１８−２（Ｎ末端に対して指令）を
用いて得たブロットをそれぞれレーン（１−３）と（４−６）に示している。

【図３】グランザイムＢによる開裂後、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのキナーゼ活性は消失する。
１０μｇ／ｍｌのＤＮＡの不在下（レーン２と４）又は存在下（レーン１と３）
で、無傷のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ（レーン１と２）又はグランザイムＢで開裂したＤ
ＮＡ−ＰＫ_ＣＳ（レーン３と４）を用いてキナーゼアッセイを実施した。レーン
５では対照として、完全なキナーゼ反応混合物からＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ自体を排除
した。ＳＰ１基質のリン酸化をオートラジオグラフィーによって検出した。

【図４】ＨｅＬａ細胞溶解産物中の内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＮｕＭＡは、ｉｎｖｉ
ｔｒｏで精製グランザイムＢを加えてインキュベートした後、カスパーゼ非依存
的に開裂される。１００ｎＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（レーン３と６）又は１
００ｎＭＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（レーン４と７）の存在下で、１２．５ｎＭ
の精製グランザイムＢ（レーン５−７）又は１０５ｐＭの精製カスパーゼ−３（
レーン２−４）を対照ＨｅＬａ細胞の溶解産物に加えた。３７℃で６０分間イン
キュベートした後、反応を終了した。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰ
を実施例１で述べたように免疫ブロット法によって検出した（モノクローナル抗
体１８−２を用いてＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを検出した）。各レーンで等量の蛋白質を
電気泳動した。

【図５】グランザイムＢはＶＧＰＤ^２６９８−Ｆ^２６９９及びＤＥＶＤ^２７１２−Ｎ^２ ^７１３でＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを開裂する。［^３５Ｓ］メチオニン標識野生型（ｗｔ
）ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳポリペプチド（ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ ^{２５６６−２９２８}）並び
に推定グランザイムＢ開裂部位（Ｄ^２６９８Ａ）と既知のカスパーゼ−３開裂部
位（Ｄ^２７１２Ａ）のＰ１位置での突然変異を含む２個の放射能標識ポリペプチ
ドを実施例１で述べたように生成した。これらのポリペプチドを、プロテアーゼ
を加えずに（レーン１、４及び７）又は８ｎＭ組換えカスパーゼ−３の存在下に
（レーン２、５及び８）又は８ｎＭ精製グランザイムＢの存在下に（レーン３、
６及び９）、３７℃で６０分間インキュベートした。反応を終了した後、サンプ
ルを電気泳動し、無傷のポリペプチドと開裂産物を蛍光光度法によって検出した
。１８ｋＤａ（ａ）、２８ｋＤａ（ｂ）、２０ｋＤａ（ｃ）及び２６ｋＤａ（ｄ
）の断片サイズを生じた（下部の図式的表示のパネル参照）。

【図６】内因性ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、ＮｕＭＡ及びＰＡＲＰは、ｉｎｖｉｖｏで無傷の
Ｋ５６２細胞をＹＴ細胞顆粒内容物と共にインキュベートした後開裂される。１
００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの不在下（レーン１−３）又は存在下に（レ
ーン４）、Ｋ５６２細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。次にこれらの
細胞懸濁液のアリコート（各々３×１０^５のＫ５６２細胞を含む）を、１ｍＭ
Ｃａ^２＋（レーン１）、１ｍＭＥＤＴＡ＋ＹＴ細胞顆粒内容物（レーン２）又
は１ｍＭＣａ^２＋＋ＹＴ細胞顆粒内容物（レーン３と４）の存在下に３７℃で
９０分間さらにインキュベートした。反応を終了した後、ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ、Ｎ
ｕＭＡ及びＰＡＲＰを実施例１で述べたように免疫ブロット法によって検出した
（患者血清Ｇ．Ａ．を使用してＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳをブロットした）。

【図７】ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳのグランザイムＢ特異的断片はＬＡＫ細胞によって攻撃した
Ｋ５６２細胞において生成される。Ｆａｓ陰性Ｋ５６２標的細胞を、１００μＭ
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの不在下（レーン１−３）又は存在下に（レーン４）
３７℃で１時間プレインキュベートし、次いでさらに４時間コインキュベートす
る（エフェクター：標的比５：１）。反応を終了した後、各々のゲルレーンで
次の数の細胞を電気泳動する：１．７×１０^６ＬＡＫ細胞（レーン１）；０．３
４×１０^６Ｋ５６２細胞（レーン２）；１．７×１０^６ＬＡＫ細胞プラス０．３
４×１０^６Ｋ５６２細胞（レーン３と４）。ＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳとＰＡＲＰを免疫
ブロット法によって検出した；患者血清Ｇ．Ａ．を使用してＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳを
検出した。

【図８】ｉｎｖｉｖｏでＹＴ細胞顆粒内容物と共にインキュベートした後、無傷Ｈｅ
Ｌａ細胞においてＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ非感受性の核形態変化が誘発される。
実験手順に述べたように、ＨｅＬａ細胞を１００μＭＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ
の不在下（８Ａと８Ｂ）又は存在下に（８Ｃ）３７℃で１時間、ＹＴ細胞顆粒内
容物と共にインキュベートした。固定して透過性を上げた後、ＰＡＲＰに対する
抗体、並びにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とＤＡＰＩで細胞を染色した。ＦＩＴ
Ｃヤギ抗ヒト抗体で抗体染色を視覚化した。抗体染色（緑色）、ＰＩ染色（赤色
）及びＤＡＰＩ染色（青色）を合併した画像を示している。（８Ａ、８Ｂ）：Ｙ
Ｔ細胞顆粒内容物は、凝縮した核（８Ａ）あるいはアポトーシス細胞体（８Ｂ、
矢印）の縁へのＰＡＲＰの特徴的な再分布を伴って、顕著なＰＩに富む表面気泡
、核凝縮と断片化を誘発する。（８Ｃ）：顆粒内容物は、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨ
Ｏの存在下でも著しい核凝縮を誘発する（矢印）；近接して、比較のためにまだ
形態変化を受けていない正常なＨｅＬａ細胞核を示している（矢印の先端）。Ａ
ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる処理はＰＩに富む表面気泡、核の断片化、及びＰＡ
ＲＰの再分布を消失させることに注目されたい。サイズ表示棒：８Ａ：４．４μ
ｍ；８Ｂ：４．０μｍ；８Ｃ：６．６μｍ。

【図９Ａ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ２８４３３７；ＰＩＤｇ２８４３３７；ＤＢＳＯＵＲ
ＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ａ４２１８４においてＥｎｔｒｅｚに認められるような
ＮｕＭＡの２１０１個のアミノ酸配列を示す。

【図９Ｂ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ２８４３３７；ＰＩＤｇ２８４３３７；ＤＢＳＯＵＲ
ＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ａ４２１８４においてＥｎｔｒｅｚに認められるような
ＮｕＭＡの２１０１個のアミノ酸配列を示す。

【図１０Ａ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１０７２２７；ＰＩＤｇ１０７２２７；ＤＢＳＯＵＲ
ＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ｓ２３６４７においてＥｎｔｒｅｚに認められるような
ＮｕＭＡの２１１５個のアミノ酸配列を示す。

【図１０Ｂ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１０７２２７；ＰＩＤｇ１０７２２７；ＤＢＳＯＵＲ
ＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ｓ２３６４７においてＥｎｔｒｅｚに認められるような
ＮｕＭＡの２１１５個のアミノ酸配列を示す。

【図１１Ａ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１３６２７８９；ＰＩＤｇ１３６２７８９；ＤＢＳＯ
ＵＲＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ａ５７０９９においてＥｎｔｒｅｚに認められるよ
うなＤＮＡＰＫ_ＣＳのアミノ酸配列を示す。

【図１１Ｂ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１３６２７８９；ＰＩＤｇ１３６２７８９；ＤＢＳＯ
ＵＲＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ａ５７０９９においてＥｎｔｒｅｚに認められるよ
うなＤＮＡＰＫ_ＣＳのアミノ酸配列を示す。

【図１１Ｃ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１３６２７８９；ＰＩＤｇ１３６２７８９；ＤＢＳＯ
ＵＲＣＥＰＩＲ：遺伝子座Ａ５７０９９においてＥｎｔｒｅｚに認められるよ
うなＤＮＡＰＫ_ＣＳのアミノ酸配列を示す。

【図１２Ａ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１３０７８１；ＰＩＤｇ１３０７８１；ＤＢＳＯＵＲ
ＣＥＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：遺伝子座ＰＰＯＬ＿ＨＵＭＡＮ、アクセッション
Ｐ０９８７４（参考文献１２のうち１と２のみをリストしている）においてＥｎ
ｔｒｅｚに認められるようなＰＡＲＰのアミノ酸配列を示す。

【図１２Ｂ】ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ１３０７８１；ＰＩＤｇ１３０７８１；ＤＢＳＯＵＲ
ＣＥＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：遺伝子座ＰＰＯＬ＿ＨＵＭＡＮ、アクセッション
Ｐ０９８７４（参考文献１２のうち１と２のみをリストしている）においてＥｎ
ｔｒｅｚに認められるようなＰＡＲＰのアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｚ 33/564 33/564 Ｚ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (71)出願人メルクフロストカナダアンドカンパニーカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス−カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ソーンバリイ，ナンシーアメリカ合衆国、ニユージヤーシイ・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ローゼン，アントニーアメリカ合衆国、メリイランド・21205、ボルテイモア、ラトランド・アベニユー・ 720 (72)発明者キヤシオラ−ローゼン，リビアアメリカ合衆国、メリイランド・21205、ボルテイモア、ラトランド・アベニユー・ 720 (72)発明者アンドラード，フエリペ・アーアメリカ合衆国、メリイランド・21205、ボルテイモア、ラトランド・アベニユー・ 720 (72)発明者ニコルソン，ドナルドカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス−カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ロイ，ソフイーカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス−カナダ・ハイウエイ・16711 Ｆターム(参考） 4B064 AG31 CA21 DA01 4C085 AA08 AA32 BA01 CC03 DD33 EE01 FF24

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも１つの精製・単離された自己抗原断片を含み、か
かる断片が少なくとも１つのリンパ球顆粒酵素の作用によってプレアポトーシス
細胞の自己抗原から生成され、且つかかる断片が前記の酵素の開裂部位に由来す
る少なくとも１つの末端を持つ組成物。
【請求項２】顆粒酵素がグランザイムＢである、請求項１の組成物。
【請求項３】自己抗原断片がカスパーゼの基質である自己抗原に由来し、
またかかる断片が、カスパーゼによって開裂されない部位でグランザイムＢが触
媒する前記蛋白質の開裂によって生成される、請求項２の組成物。
【請求項４】ＤＮＡＰＫ_ＣＳ、ＰＡＲＰ及びＮｕＭＡから成る群から選
択される自己抗原のグランザイムＢ触媒の開裂によって生成される自己抗原断片
を含む、請求項２の組成物。
【請求項５】アミノ酸２６９９から４０９６のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ；アミノ
酸３２１１から４０９６のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸１から５３８のＰＡＲＰ
；アミノ酸５３８から１００４のＰＡＲＰ；アミノ酸４１２から２１１１のＮｕ
ＭＡ及びアミノ酸１から１７９９のＮｕＭＡから成る群から選択される少なくと
も１つの自己抗原断片を含む、請求項４の組成物。
【請求項６】顆粒酵素開裂部位に由来する少なくとも１つの末端を持ち、
かかる開裂部位がカスパーゼによって開裂されない少なくとも１つの精製・単離
された自己抗原断片と、製薬上許容される担体を含む製薬組成物。
【請求項７】顆粒酵素がグランザイムＢである、請求項６の組成物。
【請求項８】自己抗原断片が、アミノ酸２６９９から４０９６のＤＮＡ−
ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸３２１１から４０９６のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸１から
５３８のＰＡＲＰ；アミノ酸５３８から１００４のＰＡＲＰ；アミノ酸４１２か
ら２１１１のＮｕＭＡ及びアミノ酸１から１７９９のＮｕＭＡから成る断片群か
ら選択される、請求項６の組成物。
【請求項９】悪性細胞に由来する少なくとも１つの自己抗原断片を含む、
請求項６の製薬組成物。
【請求項１０】少なくとも１つの請求項１の自己抗原断片を投与すること
を含む、自己免疫疾患のための処置を必要とする患者を処置する方法。
【請求項１１】処置が予防的である、請求項１０の方法。
【請求項１２】自己抗原断片が、アミノ酸２６９９から４０９６のＤＮＡ
−ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸３２１１から４０９６のＤＮＡ−ＰＫ_ＣＳ；アミノ酸５３
８から１００４のＰＡＲＰ；アミノ酸４１２から２１１１のＮｕＭＡ及びアミノ
酸１から１７９９のＮｕＭＡから成る断片群から選択される、請求項１０の方法
。
【請求項１３】（ａ）標的組織を同定し、組織から細胞を単離する、（ｂ）少なくとも１つのリンパ球顆粒酵素を供給する、（ｃ）細胞を前記の少なくとも１つのリンパ球顆粒酵素に接触させ、少なくとも
１つの自己抗原断片を生成する、（ｄ）前記の少なくとも１つの自己抗原断片を患者に投与する段階を含む、当該患者を当該断片の存在に対して免疫寛容にする方法である、請
求項１０の方法。
【請求項１４】（ｂ）段階で供給される少なくとも１つの当該リンパ球顆
粒酵素がリンパ球顆粒の内容物から単離される、請求項１３の方法。
【請求項１５】（ａ）患者の自己免疫状態に関連する分離自己抗原断片を
供給する、（ｂ）自己抗体が当該自己抗原断片に結合することができる条件下で患者の血清
を自己抗原断片に接触させる段階を含む、自己抗原断片及びかかる断片に対する自己抗体を産生する患者の治
療処置のための請求項１０の方法。
【請求項１６】自己抗体の少なくとも一部を患者の血清から除去する、請
求項１５の方法。
【請求項１７】ｉｎｖｉｖｏで自己抗体を分離自己抗原断片に結合させ
る、請求項１５の方法。
【請求項１８】（ａ）リンパ球顆粒の少なくとも１つの酵素を供給する、（ｂ）患者から悪性細胞を単離する、（ｃ）悪性細胞を酵素に接触させて、自己抗原断片を含む混合物を生成する、そ
して（ｄ）自己抗原断片を患者に投与する段階を含む、悪性疾患のための処置を必要とする患者を処置する方法。
【請求項１９】（ａ）患者からのサンプルを供給する、（ｂ）顆粒酵素開裂部位から誘導される少なくとも１つの末端を持つ自己抗原断
片の潜在型エピトープに特異的に結合する抗体にサンプルを接触させる、（ｃ）患者において自己免疫状態が存在するか否かの指標として、自己抗原断片
への抗体の結合が存在するか否かを検出する段階を含む、患者において自己免疫状態が存在するか否かの指標として患者の自
己抗原断片を検出するためのアッセイ。
【請求項２０】顆粒酵素がグランザイムＢである、請求項１９のアッセイ
。
【請求項２１】（ａ）患者からのサンプルを供給する、（ｂ）顆粒酵素による開裂に由来する少なくとも１つの末端を持つ自己抗原断片
にサンプルを接触させる、（ｃ）患者において自己免疫状態が存在するか否かの指標として、サンプル中の
抗体の自己抗原断片への結合が存在するか否かを検出する段階を含む、患者において自己免疫状態が存在するか否かの指標として自己抗原
断片に結合する抗体を検出するためのアッセイ。
【請求項２２】顆粒酵素がグランザイムＢである、請求項２１のアッセイ
。
【請求項２３】（ａ）少なくとも１つの自己抗原を含む細胞を単離する、
そして（ｂ）細胞をリンパ球顆粒酵素に接触させて、少なくとも１つの自己抗原断片を
含む混合物を生成する段階を含む、自己抗原から自己抗原断片を作製する方法。
【請求項２４】（ｃ）前記の少なくとも１つの自己抗原断片を分離する段
階をさらに含む、請求項２２の方法。
【請求項２５】（ａ）段階が細胞から少なくとも１つの自己抗原を精製す
ることをさらに含み、（ｂ）段階が前記の精製自己抗原をグランザイムＢに接触
させることを含む、請求項２２の方法。
【請求項２６】（ａ）段階において、少なくとも１つの自己抗原がＤＮＡ
−ＰＫ_ＣＳ、ＰＡＲＰ及びＮｕＭＡの少なくとも１つであり、（ｂ）段階が前記
の少なくとも１つの自己抗原をグランザイムＢに接触させることを含む、請求項
２５の方法。
【請求項２７】当該リンパ球顆粒酵素が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ
）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）
及びＹＴ細胞系の細胞から成る群から選択される少なくとも１つのリンパ球の顆
粒から分離される、請求項２２の方法。
【請求項２８】ａ）試験物質を少なくとも１つの顆粒酵素と、前記の少な
くとも１つのグランザイム酵素の基質である自己抗原に接触させる、ｂ）前記の酵素によって自己抗原が自己抗原断片に開裂するのを監視する；ｃ）候補薬剤が自己抗原断片の産生を変化させるかどうかを判定する；そして開裂を阻害する試験物質を、自己免疫疾患を処置するための候補薬剤と
して同定する段階を含む、自己免疫疾患の症状を予防する又は処置するための候補薬剤を同定
する方法。
【請求項２９】顆粒酵素がグランザイムＢである、請求項２８の方法。