JP2002509896A

JP2002509896A - 細菌の無毒性遺伝子およびその産物の同定ならびにこれらを含有するワクチンおよび医薬組成物

Info

Publication number: JP2002509896A
Application number: JP2000540850A
Authority: JP
Inventors: モウレリー，アンソニー，ティー．; フェルナンデス，レイナルド; ファサノ，アレシオ; ブロシュ，クレイグ，エイ．
Original assignee: ヘンリー・エム・ジャクソン・ファンデイション・フォー・ジ・アドヴァンスメント・オヴ・ミリタリー・メディシン
Priority date: 1998-03-31
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2002-04-02
Also published as: US6344201B1; US20020192225A1; EP1071412A2; WO1999049888A2; WO1999049888A3; DE69928787D1; US6780414B2; EP1071412B1; CA2326391A1; AU763993B2; AU3218499A; ATE311882T1

Abstract

(57)【要約】細菌病原体のゲノム中の「ブラックホール」は、「抗ビルレンス」遺伝子の欠失、即ち、病原性のライフスタイルに作用する遺伝子の欠失に該当する。「ブラックホール」中の失われた遺伝子座を同定することによって、細菌の病原性と共存できない遺伝子が同定される。これらの遺伝子、その遺伝子産物、およびこれらの遺伝子産物の酵素作用によって生成する化合物は、細菌病原体を抑制し、かつ医薬としての有用性を秘めた新規な化合物に該当する。この概念の有用性は、リシン・デカルボキシラーゼ遺伝子の喪失と、その結果生じる赤痢菌エンテロトキシンに対するカダベリン(リシン・デカルボキシラーゼのジアミノアルキル反応生成物)の抑制活性において証明される。従って、ジアミノアルキル化合物は、大腸菌エンテロトキシンおよび赤痢菌spp.エンテロトキシンの強力なインヒビターである。遺伝子cadAから産生されるリシン・デカルボキシラーゼによってエンテロトキシンの作用は低下する。ジアミノアルキル化合物を薬剤として使用する新規な方法を記載する。cadA配列または他の「抗ビルレンス」遺伝子を含有する遺伝子構築物を、生化学的プローブ、トキシン受容体の同定、および医薬の発見に新たに利用することを記載する。さらに、ワクチンおよびDNAワクチン送達への利用も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】政府の権利ここに記載の本発明は、政府の目的のために、本出願人に特許使用料を支払う
ことなく、製造、実施件設定、および利用し得るものである。

【０００２】関連出願との対応本出願は、ここに参照として組み込む、1998年3月31日出願の仮特許出願第60/
080,202号に関連する。

【０００３】技術分野本発明は、ビルレンスと共存できない(imcompatible)、「抗ビルレンス」遺伝
子を同定する方法に関する。本発明の方法の原理を、抗ビルレンス遺伝子cadAの
同定により説明する。本発明のさらなる態様は、この同定に由来するものである
。なぜなら、抗ビルレンス遺伝子の遺伝子産物またはこれら遺伝子産物により酵
素的に生成される化合物は、医薬として有用であるからである。cadA遺伝子産物
（リシン・デカルボキシラーゼ）によって生成された化合物で例示されるように
、本発明は、病原性細菌感染の治療や予防をするために、ジアミノアルカンなら
びにポリアミノアルカンを医薬として使用することに関する。

【０００４】さらなる証拠ならびに実施形態としては、nadAおよびnadBを抗ビルレンス遺伝
子として同定すること、および対応する酵素的に生成した化合物、キノリネート
(quinolinate)を医薬として利用すること、があげられる。

【０００５】非病原性に関する遺伝子の同定はまた、この遺伝子を使った病原性細菌の改変
を可能にし、結果として病原性を減らす。したがって、本発明は、DNA構築物、ベクター、プラスミド、ならびに生物体を含む、改変した病原性細菌を含有する
。本発明のこの態様によって、赤痢菌(Shigella）や腸侵入性細菌などのその他病原性細菌から防御し得るワクチンを生成できる。本発明は、目的遺伝子または
その断片が弱毒細菌により下痢を伴うことなく消化器表皮に送達されるDNAワクチンの送達をも含有する。

【０００６】本発明はさらに、未知の病原性を含む培養物および細菌サンプル中のcadA遺伝
子欠失を調査することによる、病原性についてのアッセイに関する。病原性はま
た、この遺伝子のタンパク質産物であるリシン・デカルボキシラーゼ活性につい
てアッセイして同定してもよい。本発明は、こうした病原性アッセイを構築する
のに有用な、DNA構築物、断片、ベクター、プラスミドおよび抗体を含む。

【０００７】発明の背景人類は、ヒトの数をはるかに上回る微生物の世界と共存している。微生物の中
には、大腸菌などの友好的な住人もいれば、出血性の下痢（出血性大腸炎）、溶
血性尿毒症症候群や赤痢などの危険な疾病を引き起こすShigellaのようなものも
いる。

【０００８】 Shigella属の細菌は、細菌性赤痢（bacillary dysenteryまたはShigellosis）
の原因微生物である、グラム陰性腸管内病原体である。Shigella感染は、全世界
で急性下痢性疾患原因のかなりの割合を占めており、細菌性赤痢がいまだに子供
の主な死亡原因となっている発展途上の国々においては重大な公衆衛生問題であ
る。細菌性赤痢の世界的発生率は、1年で2億人を超えると推定される。およそ50
0万例で、入院が必要とされ、およそ65万人が毎年細菌性赤痢で命を落としている（Institute of Medicine (1986) 「赤痢菌spp.に対する免疫見通し」(The pr
ospect for immunizing against Shigella spp.), p329-337. In: 「新しいワク
チンの開発」(New Vaccine Development): 「プライオリティの確立」(Establis
hing priorities.) Vol. 2 「途上国で問題となる疾患」(Diseases of importan
ce in developing countries.) National Academy Press, Washington, D.C.）
。細菌性赤痢は、米国でさえ、1995年には3万2千件を超える例が報告されており
、公衆衛生上の重大な懸念であり続けている（Centers for Disease Control an
d Prevention. 1995. 「届け出の必要な疾患一覧」(Summary of notifiable dis
eases), United States, 1995. MMWR 44:1-3）。とりわけ重大なのは、経口によ
る発生、施設（デイケアセンター、ナーシングホームなど）およびインディアン
保護特別保留地での発生である。細菌性赤痢は臨床上、軽度な下痢から、値が混
じった粘液状の少量の便を頻繁に排泄する重度の赤痢まで、幅広い症状を呈する
。この病気は、結腸上皮層への広範囲にわたる損傷、細胞死、潰瘍、および結腸
の炎症によって特徴付けられる。通常、感染は自己制限的で、粘膜固有層から粘
膜下組織へ広がることはないが、幼いかまたは栄養不良の患者にとっては、生命
を脅かし得る疾患である（DuPont, H.L. 1995. Shigella種（細菌性赤痢）、p.2
033-2039. In G.L. Mandellら（編）「感染症の原理と実際」(Principles and P
ractice of Infectious Diseases.) Churchill Livingstone Inc., New York, N
Y）。

【０００９】 Shigellaのヒトからヒトへの伝染の主な手段は、糞便から口へのルートである
。細菌性赤痢は多くの場合、糞便により汚染された食物または水の摂取により引
き起こされる。食物の場合、汚染の主要因は、食物を取り扱う人の、不十分な個
人衛生である。低感染量のShigella spp.は、興味深い問題を提起している。ボランティアを使った研究では、ShigellaのID₅₀（ボランティアの50％に疾患を起
こすのに必要な感染量）は、200 shigellaeと低いことが示されたが、わずか10 のShigellaを摂取すれば十分に疾患を引き起こせるとの報告（DuPont. H.L.ら(1
989) J.Infect. Dis. 159:1126-1128）がある。Shigellaの低いID₅₀値が、特に貧しい、人口密度の高い地域における高い伝染性の理由といえる。この特性の結
果として、汚染された食品源には、感染者同士の密な接触による２次感染によっ
て赤痢の爆発的な大発生を引き起こす可能性があるのである。つまり、感染した
食品取扱者は、食品を汚染し、多数の人々に感染を広めてしまう可能性がある。

【００１０】 MaurelliとLampelは、細菌性赤痢の食品由来の大発生について複数例、記載し
ている（MaurelliおよびLampel(1997) Shigella種、p.216-227。In M.P.Doyleら
（編）、食品微生物学：Fundamentals and Frontiers. American Society for M
icrobiology Press, Washington, D.C.）。デイケアセンターの職員や保育所に預けられている子供達は、Shigellaに感染した子供がいれば、その危険にさらさ
れる。細菌は糞便に隠れており、個人衛生が未熟な乳児や幼児は他の子供や職員
にたやすく感染を引き起こしてしまう（Mohle-Boetani,J.C. ら（1995）Am.J.Pu
b. Health 85:812-816）。糞便に汚染された食品や水による経口伝染に結びつい
た病気を引き起こすのに必要な感染量が低い場合、自然災害（地震、洪水、飢饉
）や人災（戦争）の後にShigella spp.による赤痢が起こるのは当然である。ブルンジとルワンダでおきた内戦により、大量の難民が移動することになった。19
93年の終わりに、ルワンダの難民キャンプで赤痢が大発生し、6000人を超える人
々が罹患し（罹患率＞32%）、その多くは5才未満の幼児であった（Paquet, Cら（1995）Une epidemie de dysenteriae a Shigella dysenteriae type 1 dans u
n camp de refugies au Rwanda, Sante 5:181-184）。1994年の8月には、ザイー
ルの３つの難民キャンプから15,500件を超える出血性下痢の報告があった（Cent
ers for Disease Control and Prevention. (1996) Morbidity and mortality s
urveillance in Rwandan refugees -Burundi and Zaire, 1994. MMWR 45:104-10
7）。通常下痢の治療に用いる抗生剤のほとんどに対して、Shigellaeがますます
耐性になってきているという事実が、これら事例全てを悪化させている（Center
s for Disease Control and Prevention. (1994) Addressing emerging infecti
ous disease threats: A prevention strategy for the United States. U.S.
Department of Health and Human Services, Public Health Service, Atlanta,
GA）。

【００１１】細菌性赤痢に有効なワクチンは存在しない。腸病原性細菌に対するワクチンを
開発する試みは、下痢を引き起こさずに免疫原性を生じさせることに失敗したり
、あるいは複数回の服用が必要であったりかなりの数の生菌を追加免疫する必要
があったり、といった問題に悩まされてきた。したがって当業界においては、細
菌性赤痢のワクチンについての要請が満たされていない。こうしたワクチンは、
腸侵入性で宿主に免疫原を送達できてかつ、宿主に反応や下痢を起こさせない細
菌であり得る（Sizemore、D.R.ら（1995）Science 270：299−302）。

【００１２】 Shigellaが、通常は良性細菌であるE.coliと高い相同性を有する点は興味深い
。実際、Shigellaの4つの種は大腸菌と非常に近縁であり、これらの細菌は全て、一つの種の一員であると考えることもできる。DNA-DNA再結合分析によると、S
higellaとE.coliとの相同性は90%を超える（Brenner, D.J.ら (1969) J.Bacteri
ol.98, 637-650）。またこれら細菌の染色体は共直線性を呈し、ShigellaとE.co
li間の接合ならびに形質導入による遺伝子導入および組換え体の形成が高効率で
おきる（Formal,S.B.,ら（1970）Infect.Immun.,1,179-287）。それにもかかわらず、Shigella spp.は細菌性赤痢を引き起こす危険な病原体であって、E.coli は（一定の病原性クローンを除き）ヒトの腸の共生生物である。

【００１３】毒性のShigellaのような病原体と良性のE.coliなどの共生生物との間に類似性
があるため、これらの近縁の微生物を識別するための、簡単で信頼性のある試験
が、当業界で必要とされている。またさらに、病原性の進化的な基本原理につい
ての情報を提供するという最終目標のために、これらの細菌やその毒性に関連す
るレセプターを認識するプローブが、当業界で必要とされている。レセプターの
特性について知識があれば、侵襲性であるという細菌本来の特性を前向きに活用
するような、合理的なワクチン設計が促進される。病原性細菌感染は深刻で広範
囲にわたる側面があるために、ビルレンスおよび病原性分析、ならびに病原性細
菌感染治療用の新しい医薬の発見にむけての合理的なアプローチが当業界で求め
られている。

【００１４】以上の通り、Shigellaのような病原性生物による疾患を効果的に予防または治
療する方法、ならびにこうした病原性生物を非病原性生物から識別する方法が当
業界で必要とされている。

【００１５】発明の概要本発明では、病原性と、酵素であるリシン・デカルボキシラーゼ(LDC)を産生する既知の遺伝子cadAとの相関関係、およびこの相関関係の応用を記載すること
により、これらの要求に応える。多くの野生型の細菌では、この遺伝子の存在は
病原性の欠如と相関している。この観察に基づいて、本発明者らは、病原性細菌
によって産生されるエンテロトキシンの新規なインヒビター、即ち、LDCの酵素生成物であるカダベリンを同定した。カダベリンはジアミノアルキル化合物であ
り、関連する広範なクラスの化合物のうちの１つに過ぎないが、病原性細菌感染
症の治療および予防に有望な治療薬をもたらすものである。さらに、本発明者ら
は、この遺伝子の発現が下痢の発生を抑える能力のみと相関し、DNAワクチン送達用ビヒクルや腸侵入性細菌に対するワクチンを設計するのに不可欠な作用であ
る侵入作用ついては依然として保持されることも見出した。

【００１６】この発見から、ビルレンスの合理的な分析並びに新規な治療方法および医薬(p
harmaceuticals)の合理的な探索において重要な段階が明らかである。非病原性祖先からの細菌病原体の進化は、ビルレンス遺伝子の獲得によって進行すると考
えられてきたが、本発明者らは、「抗ビルレンス(anti-virulence)」遺伝子の喪
失によってゲノムにブラックホールが誘導され、病原性を持つ表現型が生じるこ
とを発見した。

【００１７】この発見によって、単に、一対の近縁なビルレント／非ビルレント種のゲノム
を比較し、ビルレント株中の失われた「抗ビルレンス」遺伝子を同定し、この失
われた遺伝子の産物(タンパク質、任意の酵素生成化合物の双方)の侵入性細菌に
対する抑制作用または病状に対する予防作用を試験するだけで、新規な医薬を発
見することが可能になる。このアプローチから、Shigella flexneriの場合に「抗ビルレンス」遺伝子がcadAであり、かつ新規な医薬がカダベリンであることが
首尾よく証明されているが、このアプローチは他の病原性細菌にも同様に適用可
能である。初期の結果から、さらに２つの抗ビルレンス遺伝子nadAおよびnadBと
その対応の酵素生成化合物であるキノリネート(quinolinate)も同定されている。

【００１８】詳細な説明本発明は、病原性細菌により引き起こされる疾患または障害の治療または予防
、さらにこれら病原性細菌を同定するための組成物の同定に関する。病原性細菌
とは、ヒトまたはその他哺乳動物または鶏や豚のような家畜などの動物の宿主に
病気を引き起こす細菌性微生物を意味する。細菌性病原体の例としては、Shigel
laの４つの種、腸管組織侵入性大腸菌(E.coli）（EIEC）、エルシニア(Yersinia
）、サルモネラ(Salmonella）、ミコバクテリウム(Mycobacterium）、レジオネラ(Legionella）、リステリア(Listeria）、および腸出血性大腸菌（EHEC）など
があげられる。病原性大腸菌については新しい菌株も発見されてきており、病原
体を同定する必要性は依然として高い。

【００１９】本発明者らは、遺伝子または遺伝子座の不在に基づいて病原性細菌を非病原性
細菌から識別できることを見出した。本発明者らは最初、細菌性赤痢を引き起こ
す４つの種を含む病原性細菌、Shigella属に着目した。特に、リシン・デカルボ
キシラーゼ（LDC）という酵素をコードする遺伝子cadAについて検討した。リシン・デカルボキシラーゼは、リシンを脱カルボキシル化してカダベリン（1,5-ジ
アミノペンタン）として知られるジアミノアルカンとCO₂を形成する。

【００２０】本発明はまた、cadAとその産物LDCの他に、アミノ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む遺伝子座に関する。ここに含まれる遺伝子は、Hafnia alvei（GenBank
受託番号X03774）のリシン・デカルボキシラーゼおよびE.coliK12のオルニチン・デカルボキシラーゼ（speCはオルチニンを脱カルボキシル化してジアミノアル
カンプトレシン生成する。GenBank受託番号M33766）をコードする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子は共に、E.coli K12またはSalmonella typhimurium(それぞれGenBank M76411およびU37109)のどちらか由来のcadAの配列と高い類似性を有する。本発明はまた、やはりリシンを脱カルボキシル化してカダベリンを形成
させる、反応性の低いLDCを構造的に発現するldcと呼ばれる遺伝子（Kikuchi,Y ら（1997）J.Bacteriol.179,4486−4492）をも含む。こうした活性プロフィール
に基づき、本発明は、アルギニンのジアミノ誘導体である、アグマチンを生成す
る、アルギニン・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子をも含む。

【００２１】 CadAおよびLDCを評価するにあたり、毒性Shigellaの4種、これと近縁な良性E.
coli、および既知の病原性E.coliクローン数個、特にE.coliとShigella（実施例
１、Aと表１）との遺伝的雑種に類似する腸侵入性E.coli（EIEC）のLDC生産量を
比較した。実施例３および表2に示す通り、ほぼ全部のE.coli株にLDC活性の発現
が観察された一方、病原性Shigella spp.とEIECではLDCの発現がみられないこと
が確認された。こうした結果により、cadAのLDC発現は、ビルレンスとは共存できないこと、およびゲノムの欠失が病原性の原因であることが示された。

【００２２】この仮説を確かめるために、野生型S.flexneri 2a 株をcadAのクローン化した
コピーで形質転換し、BS529を得た。下記の実施例４および表２にある通り、形質転換したS.flexneri 2a BS529は、LDCを発現し、またウサギ結紮回腸（実施例
５）、ユッシング(Ussing)チャンバ（実施例６）および多形核白血球(PMN)経上皮移動アッセイ(実施例８)で試験したところ、この発現により毒性効果が弱めら
れることが分かった。上記3種のアッセイは、公知の一般に認められたビルレンスアッセイである。ウサギ結紮回腸アッセイでは、エンテロトキシンに対する腸
の応答の指標として液体用量を測定する。ユッシングチャンバでは、Cl^-分泌の指標、すなわち結紮回腸アッセイと同様に下痢作用を示す指標である、抵抗率と
電位とにおける経上皮（回腸）の変化を測定する。PMNアッセイでは、侵入性細菌に応答したPMN細胞のモデル上皮細胞層への動きを測定する。このin vitroの組織培養アッセイにより、細菌感染の発症を予告するin vivoの炎症プロセスモデルを作る。詳細について実施例８に記載するとおり、PMN細胞は侵入している細菌を取り込み、破壊するべく細菌の侵入部位にひきつけられるが、依然として
ShigellaによるcadAの発現は、通常、Shigellaにより誘導されるPMNの経上皮シグナリングを破壊していた。

【００２３】上記のビルレンスアッセイに基づき、さらにLDC発現の阻害効果をさらに調べた。実施例５に記載の通り、BS529の上清をLDC^-株由来の上清に加えた。そしてB
S529上清中のある因子がLDC^-株のエンテロトキシン活性を阻害することを発見し
た。

【００２４】この因子を同定するため、実施例７に記載の通り、LDCの産物である、カダベリンについてBS529の上清を分析し、この上清が誘導条件下で非病原性細菌が産生するのと同様のレベルのカダベリンを含むことを確かめた。カダベリンの効果
を確認するため、野生型のS.flexneriの上清にカダベリンを加えたところ、ユッ
シングチャンバ内でカダベリンはエンテロトキシン活性を阻害したが、カダベリ
ンだけでは組織の抵抗は変らないことが分かった。実施例７と表３を参照。

【００２５】カダベリンの作用機構を評価した際、S.flexneriが、異なる経路を経て作用す
ると考えられるShET1およびShET2として知られる少なくとも2種類のエンテロトキシンを産生することに注目した。実施例７に記載の通り、ウサギの粘膜をカダ
ベリンで前処理することで、ユッシングチャンバアッセイにてカダベリンを除去
した後、エンテロトキシンを加えても、粘膜はエンテロトキシンの作用から防御
された。カダベリンの防御能力は、カダベリンが直接標的細胞に作用して機能し
、病原性細菌のエンテロトキシンの作用を弱めることを示している。

【００２６】カダベリン活性の原因であると考えられる生理学的作用には、細菌毒素により
誘導されるイオンチャネルの閉鎖、細胞内シグナリングの変性または細胞レセプ
ター上の毒素の排除がある。もちろん、これらの考え得る生理学的活性リストま
たはカダベリンが直接標的細胞に作用するという考えに制限することを意図する
ものではない。

【００２７】上記の研究により、カダベリン、すなわちジアミノアルカンがShigellaおよび
EIECのような病原性細菌が産生するエンテロトキシンから標的細胞を防御できる
ことが明示された。カダベリンについてのその後の研究により、その他の細菌毒
素に対する強力な阻害活性が示されている。表４と表５にある通り、カダベリン
はCampylobacter jejuni、Shigella dysenteriae 1、Yersinia enterocolitica 、およびBacteroides fragilisに対して強力なビルレンス阻害活性を示す。表５
ではまた、細菌性病原体におけるLDC活性の不在と、この病原体が産生する毒素を阻害するカダベリンの能力との強い相関性が明らかになっている。この相関性
を細胞性病原体の予知材料として利用すれば、カダベリンあるいはその他のジア
ミノアルカンによって毒素を阻害できる。

【００２８】したがって、本発明は、各種の病原性細菌が作り出すエンテロトキシンから標
的細胞を防御するのに十分な量のジアミノアルカン、および製薬上許容される担
体を含む医薬組成物に関する。ジアミノアルカンとしてはカダベリンが好ましい
が、その他のジアミノアルカンも本発明の範囲に含まれる。同様に、本発明の好
ましい実施形態での病原性細菌はShigellaだが、その他のこうした細菌をも本発
明は含有する。

【００２９】当業者に理解される通り、ジアミノアルカンは、一般構造がNH₂-(CH₂)_n-NH₂（
ｎは2から12の整数)の任意の化合物およびその任意の構造異性体（例；1,5-、1;
4-、1,3-ジアミノペンタンなど）を含む。デカルボキシラーゼ酵素のその他の産
物もまた含まれる。例えば、アルギニン・デカルボキシラーゼから生成されるジ
アミンやアグマチンなど。さらに、本発明は、ジアミノアルカンの塩、例えばこ
れに限るものではないが、ジヒドロクロリド塩を含有する。カダベリン（1,5-ジ
アミノペンタン、n=5）が好ましい実施形態であるが、プトレシン（1,4-ジアミノブタン、n=4）も一例である。

【００３０】ジアミノアルカンは当業界では公知ではあるが、これを赤痢や出血性大腸炎の
ような腸病原性疾患の治療または予防用薬物として利用することは新規である。
ジアミノアルカンは、タンパク質または放射性プローブなどのその他分子に結合
させて診断用試薬や細菌性病原体の進化の研究に役立ててもよい。また本発明の
化合物は当業界で標準的な技術によって、例えば生物学的利用能を増したり、半
減期を増したり、あるいは当業界で周知のその他目的のために、改変してもよい
。

【００３１】本発明のまた別の実施形態は、エンテロトキシン阻害特性をもつ重合アミンに
関する。例えば、エンテロトキシン産生細菌を含むワクチンにアミンを含ませ、
毒素化させるために用いられる。

【００３２】毒素活性の強力なインヒビターとしてのジアミノアルカンの単純な構造に関す
る知識があれば、当業者は病原性に関連するレセプターを同定したり病原性細菌
による感染症を治療したりできる。したがって、こうしたレセプターもまた本発
明の範囲に含まれる。

【００３３】本発明の範囲に含まれるその他の化合物を明確に同定することは、本明細書に
ある情報に照らしてみれば、当業者の能力の範囲内で十分になされる。化合物族
に関する記載のほかに、本発明の抗ビルレンス剤の防御能力を評価する少なくと
も３つのアッセイの詳細も示す。３つのアッセイとは、すなわち、ウサギ結紮回
腸アッセイ、ユッシングチャンバアッセイ、および多形核白血球（PMN）の経上皮移動アッセイである。この３つのアッセイは全て、容認されているビルレンス
アッセイであって当業界でルーチンとなっている技術である。容認されているア
ッセイの４つめは、Sereny 試験である。この試験は、モルモットの眼に角結膜
炎を引き起こす能力の有無によってビルレンスについて試験する（Sansonetti、
P.J.ら（1983）Infect.Immun.39,1392-1402）。

【００３４】さらに当業者に理解されるであろうが、エンテロトキシンに対する防御は、下
痢、赤痢および出血性大腸炎などの腸病原性や胃腸障害を患う宿主の予防および
／または治療にも利用できる可能性がある。当業界では理解される通り、こうし
た障害の予防は、宿主が胃腸障害の身体的な症状を一切呈していない段階になさ
れる。症状の治療または減衰は、先述のとおり身体的な症状の完全または部分的
な改善によってなされる。

【００３５】本発明の化合物を利用する上で、適当な服用量または有効量ならびに投与回数
の決定も、当業者により十分に成し得る。これらは使用する生物または化合物の
作用の効力ならびに持続期間に依存するが、さらに治療する疾患の性質と重篤度
、および治療する宿主の性別、年齢、体重ならびに個々の感受性にも依存する。
本発明の宿主は、どの動物であってもよいが、好ましくは哺乳類で、特に好まし
くはヒトである。その他の例としては、経済的に重要な動物、例えばウシ、ブタ
およびニワトリと、通常家庭で飼育されるペットがあげられる。

【００３６】本発明は、上記の化合物と共に、製薬上許容される任意の担体を含む。担体と
しては、水、石油、動物油、植物油、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等の油の
ような無菌の液体が使用できる。静脈内投与の場合、担体としては水が好ましい
。塩水、水性デキストロース、およびグリセロール溶液も、特に注射可能な溶液
の液体担体として使用できる。適当な医薬担体については、参照として組み入れ
てあるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition (A. Gennaro, ed
., Mack Pub., Easton, Pa., 1990)に記載がある。組成物はまた、安定剤、アジ
ュバントおよびその他成分と調剤してもよい。

【００３７】本発明のまた別の態様は、cadA遺伝子、その断片、およびこの遺伝子に基づく
構築物（およびアミノ酸デカルボキシラーゼをコードするその他遺伝子）を病原
性の弱毒化に使用することにも関する。例えば、Shigellaの弱毒化生菌株のワク
チンまたはワクチンベクターとしての開発に関わる懸案の1つは、研究中の菌株に付随する高度の反応生成性(reactogenicity)である（Kotloff, K.L.ら(1996)I
nfect.Immun.64, 4542-4548）。ボランティアにおける安全性試験では、S.flexn
eriのShET-1およびShET-2毒素が下痢の原因であることが示された。例えばcadA またはその断片を導入して、病原性細菌の形質転換をすると、細菌が産生する毒
素の腸毒性が阻害され、その結果低い毒性、すなわちより安全でたやすく寛容さ
れるワクチンが産生される。「ワクチン」という用語に、弱毒化生菌由来のワク
チン、死菌、細菌成分、複合ワクチン、プロテオソームワクチン、および核タン
パク質（リボソーム）ワクチンが含まれることは、当業者に理解されるだろう（
WHO、Weekly Epidem. Record (1997)72:73-80およびここに引用された参考文献）。

【００３８】こうした遺伝子の導入はまた、Salmonela typhimurium、Salmonella typhi、E
.coli、およびVivrio cholerae等の細菌ベクターにも適用してよい。これら病原
体はLDCの遺伝子を含み、また実験的条件下で酵素を合成するにもかかわらず、i
n vivo宿主感染条件下でLDCの発現を抑制できる。こうした方法でLDCをコードす
るかまたはその他の酵素をコードする遺伝子を導入して構成性発現を促すと、よ
り安全でよりたやすく寛容されるワクチン開発が促進される。

【００３９】このような方法のまた別の利点の1つは、投与した細菌（例えばShigellaあるいはその他の任意の腸侵入性細菌）の抗原性補体全部を減弱させるかさもなくば
減少させることなくして目的の宿主を防御するワクチンを生成する点である。毒
素遺伝子が欠損しているワクチン株とは異なり、こうした構築物は引き続き毒素
を産生するので、宿主の体は最大数の抗原性部位候補に暴露される。欠損ワクチ
ン株のもうひとつの利点は、病原体に暴露することで、構築したワクチンと、天
然の単離株とを生化学的に簡単に識別できる点にある。

【００４０】さらに、毒性を弱毒化するためにLDC発現を利用すると、菌株の構築を単純化できるという利点がある。なぜなら、単一の遺伝子カセットの導入は、少なくと
も２つの毒素遺伝子のノックアウト突然変異誘発よりも単純だからである（Fasa
noらの米国特許第5,589,380号の特許請求の範囲の通り）。また、上記のように、Shigellaゲノムにおける複数の遺伝子の欠失は、反応生成性であり続けること
が多い（Kotloff、K.L、ら（1996））。

【００４１】最後に、cadAの導入はまた、Shigella株をベクターとして用いるDNAワクチンの開発をも促進し得る（Sizemore、D.R.ら（1995）；Fennelly,G.J.ら（1999）J
.Immunol.162：1603-1610）。そのようなワクチンを形成するために、また別のD
NAまたは遺伝子を加えてもよい。このDNAまたは遺伝子は、例えばHIV抗原、核タ
ンパク質または、インフルエンザAウイルスあるいは麻疹ウイルスの赤血球凝集素、Mycobacterium tuberculosis分泌タンパク質、またはハンタウイルスの糖タ
ンパク質とヌクレオカプシドタンパク質由来のものがあげられる。その他適当な
遺伝子またはDNAも当業者により認識されるであろう。

【００４２】 LDCの発現はまた、Shigellaに感染した宿主において生成される特徴的な強烈な炎症応答を抑制できる可能性がある。この応答を予告するのは、多形核白血球
（PMN）の粘膜バリアから細菌感染部位への移動である。PMN移動の誘導は、in v
ivoでのかかる炎症応答についての安全で許容できるin vitroアッセイである。カダベリンは、投与量に依存する形でPMN移動の阻害を呈し、cadAの挿入はShige
llaへのPMN応答を妨げる（実施例8に記載）。

【００４３】本発明のまた別の実施形態は、cadA周辺領域をカバーするゲノムの大きな部分
の欠失と病原性の相関関係に関する。実施例１に記載の通り、Shigellaの４つの
種全てとEIECが、cadA周辺のこのタイプの大きな欠失部分を有することを確認し
た。近縁な非病原性共生E.coliと比較すると、この欠失は、Shigellaの病原性の
増強に働くゲノム内の「ブラックホール」に相当する。主要な病原体進化機構と
して提唱されている「病原性の島」（Hacker、Jら（1997）Mol.Microbiol.23、1
089-1097）に加え、ビルレンスと共存できない、通常は遺伝的に受け継がれる遺
伝子（「抗ビルレンス遺伝子」）の喪失である、「ブラックホール」は、病原性
細菌産生をもたらすと考えられる。

【００４４】このことはまた本発明のさらに別の実施形態に関し、多くの病原体に関連する
。すなわち、細菌の病原性に関する遺伝子座の同定に関する。特に、同一または
近縁種の非病原性変異体に存在する、ゲノムDNAの病原性株中の不在(欠失）を同
定する方法を、これらのゲノムと、近縁な非病原体のゲノムとを比較することで
その他細菌の病原体に適用してもよい。潜伏するゲノムの病原性を説明するのに
こうした比較が力をもつ。さらに、ブラックホール内の失われた遺伝子座を同定
すれば、病原体と共存できない候補遺伝子、遺伝子産物、および遺伝子産物によ
り酵素的に産生される化合物が同定され、よって細菌病原体を阻害する病原体に
より引き起こされる障害の治療に新規化合物を利用できる（LDCやカドベリンに対してうまく示したとおりである）。

【００４５】この原理に基づく有用なゲノム比較の例をいくつか以下に列挙する。当業者で
あれば近縁な病原体と非病原体をさらに同定できるであろう。この組み合わせは
病原性の新しいインヒビターや新しい医薬候補の発見を促すはずである。

【００４６】本発明の十分な理解を促すために、以下に実施例について述べる。但し本発明
の範囲は以下の実施例に制限されるものではない。

【００４７】実施例１細菌および遺伝子操作Ａ. 細菌株および培地本発明者らの研究に使った細菌株を以下の表１に掲げた。

【００４８】

【表１】上記株を37℃でLuria-Bertani培地（LB）中で曝気しながら、LB寒天上またはグルコースを含むM9最少塩類上で増殖させた（Miller, J. H. (1972) Experimen
ts in Molecular Genetics（分子遺伝学の実験） (Cold Spring Harbor Lab. Pr
ess, Plainview, NY)。培地にチアミン（50μg/ml）、スペクチノマイシン（100
μg/ml）、カナマイシン（50μg/ml）、またはクロラムフェニコール（15μg/ml
）を必要に応じて補給した。エンテロトキシン産生を最適化するため、細菌は、
鉄をキレート化するエチレンジアミン-N,N’-二酢酸を含むLB中で増殖させた。誘導条件下でLDC活性を測定するための大腸菌(E.coli)の培養物は、100mM 4-モルホリンエタンスルホン酸を用いてpH 5.5に緩衝化した培地中で増殖させた（Me
ng, S-Y.およびBennett, G. N. (1992) J. Bacteriol. 174, 2659-2669）。細菌
の一夜培養物からの上清を遠心分離して回収し、ろ過滅菌し、そして、使用する
まで氷上においた。

【００４９】Ｂ. 遺伝子操作 pCADAは、lacプロモーターの転写制御下にあるE.coli K-12由来の野生型cadA 遺伝子を含有するプラスミドである（Meng, S-Y.およびBennett, G. N. (1992) ）。pCADA中のcadA遺伝子は、Shigella flexneri中において、該生物および該プ
ラスミドベクター中にlacレプレッサーが存在しないので、構成的に発現される。P1による一般化した形質導入は既に記載されている（Miller, J. H. (1972)）
。Tn10dSpcRCP2またはTN10dCamRCP2挿入を含有するE.coli MG1655突然変異体を、記載されたように（Mahillon, J., Rode, C. K., Leonard, C.およびBloch, C
. A. (1997) Gene 187, 273-279）、プラスミドpGI300またはpGI310を用いてエレクトロポレーションにより生成した。MG1655挿入変異体のPIΔdam rev6溶解物
を用いて受容菌株を形質導入することによって、MG1655二重挿入変異体ならびに
S. flexneri 2a株BS103の単一および二重挿入変異体を生成した（Bloch, C. A. ら, (1994) J. Bacteriol. 176, 7121-7125）。

【００５０】 E.coli::Tn10dRCP2およびS. flexneri::Tn10dRCP2突然変異体の一夜培養物の5
.0mlから、ゲノムDNAを、（Rode, C. K.ら, (1995) Gene 166, 1-9）に記載され
たマクロ制限酵素切断断片（0.05-1.0 Mb）を得るための適当な方法で精製した。アガロースに埋め込まれたDNAの、I-SceI（Boehringer Mannheim）による１時
間、またはI-CeuI（Panvera, Madison, WI）による一夜の消化を、製造業者の指
示に従って実施した後、反応バッファーをデカントし、ドットを融解（70℃）し
、そして静かに1.3%アガロース（Fastlane, FMC）ゲルのサンプルウエル中にピペットで注入し、Bio-Rad DR-IIIパルスフィールドゲル装置中で電気泳動にかけ
た。パルス時間は、6V/cmの電界強度で、10時間にわたり10〜13秒、また12時間にわたり60〜65秒とした。サンプルの電気泳動後、ゲルを（Heath, J. D.ら, (1
992) J. Bacteriol. 174, 558-567）の記載のとおり分析した。

【００５１】図１は、１対のTn1OdRCP2挿入により区切られたゲノムセグメントのパルスフィールドゲル電気泳動分離を示す。レーン１およびレーン８は、酵母-染色体およびλ-コンカテマー基準を示す。レーン２、３、６、および７は、MG1655（親E
.coli K-12）、χM2500（K-12二重挿入変異体）、BS573（S. flexneri 2a二重挿
入変異体）、およびBS103（親S. flexneri 2a）のI-CeuI消化物をそれぞれ示す。レーン４および５は、I-SceIで消化したχM2500およびBS573を示す。挿入物の
NotIおよびBlnIマップ座標（Bloch, C. A.ら, (1996) BBRC 223, 104-111）およ
び生来のI-CeuIマップ（Liu, S.-L.ら, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
, 6874-6878）から予測すると、130kbおよび670kbのMG1655生体のI-CeuI断片は、二重挿入変異体χM2500中でそれぞれ30kbおよび100kbならびに235kbおよび435
kbのサブ断片対に切断された。BS573株（BS103バックグラウンドに同じ２つの挿
入物を含有する）からのゲノムDNAのI-CeuIパターンは、新しい135kbのサブ断片
（最も大きい生来のI-CeuI断片の切断および移動の変化の欠損と一致して）およ
び２つの140kbの生来I-CeuI断片のうち１つの切断から生じた１対の40kbおよび1
00kbのサブ断片を示し、株間のP1形質導入忠実度およびrrl遺伝子構造より判断した遺伝子マップ保存と一致した（Liu, S.-L.ら, (1993)。I-SceIによりχM250
0およびBS573を消化すると単離されたバンドが生じ、1対のI-SceI制限酵素切断断片（398kb_MG1655および205kb_BS103）と、対応するMG1655およびBS103バックグ
ラウンドからの終末点（end point）とを、並べて比較することが可能になる。白色バーはTn10dRCP2挿入のための野生型I-CeuI断片喪失を示し、黒色バーは生成した対応するI-CeuIサブ断片を示す（図１）。

【００５２】サザンブロット用のゲノムDNAは、標準法（Ausubel, F. M.ら, (1997) Curren
t Protocols in Molecular Biology（分子生物学における最近のプロトコル） (
Wiley, New York)）によって調製した。ドットブロットのサザンハイブリダイゼ
ーションは、10μgのゲノムDNAをナイロンまたはニトロセルロースフィルター（
例えば、GENESCREEN^TM、Dupont/NEN）上にスポットして実施し、ジゴキシゲニン
（DIG/Genius標識キット、Boehringer Mannheim）で標識したオリゴヌクレオチドプローブ末端を用いてハイブリダイズした。ブロットは、（Boehringer Mannh
eim）から入手可能なCSPD(登録商標)（Tropix；ジナトリウム3-(4-メトキシスピ
ロ(1,2-ジオキセタン-3,2’-(5’-クロロ)トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン)-4-イ
ル)フェニルホスフェート）、または化学発光用の他のアルカリホスファターゼ基質を用いて、製造業者の指示にしたがって処理した。

【００５３】図２は、サザンブロットから得たデータの模式図であり、赤痢菌（Shigella）
種およびEIECのゲノム中の「ブラックホール」を示す。使用したオリゴヌクレオ
チドプローブは、塩基対4254428〜塩基対4406306の間の14個の異なる大腸菌(E.c
oli)遺伝子からのものであり、これらの種由来のゲノムDNAとハイブリダイズさせた。負符号はハイブリダイゼーションの欠落を示し、正符号は陽性のハイブリ
ダイゼーション反応を示す。全ての株は、ATCCから、または本明細書にあるもの
は疾患制御および予防センターのナンシー・ストロックバイン博士（Dr. Nancy
Strockbine, Centers for Disease Control and Prevention）から入手可能であ
る。この実験のS. flexneri 2a(2457T)は、本発明者らの研究室由来であるが、A
TCCから入手することも可能である。

【００５４】実施例２ビルエンスアッセイ（Virulence Assay）Ａ. 細胞、プラークおよび回腸ループ（Ileal Loop）アッセイ組織培養細胞侵入およびプラークアッセイは記載されている（Hromockyj, A.
E.およびMaurelli, A. T. (1989) Infect. Immun. 57, 2963-2970）。ウサギ回腸ループアッセイは、本質的に記載（Fasano, A.ら, (1990) Infect, Immun. 58
, 3717-3723）のとおり実施した。簡単に説明すると、成熟ニュージーランドシロウサギを24時間、水は自由に与えたが食餌は与えず、その後、ケタミン（50mg
/kg体重）およびアセプロマジン（1mg/kg）で麻酔をかけ、続いてキシラジン（7
mg/kg）を筋注した。非接種のLBおよび滅菌培養上清（1ml）を、中垂間膜の近く
にある結び目に隣接する腸管腔に注射した。第２の結び目が接種部位を隔離した
。回腸沿いに近位に進んで、（7-8cmの長さで２つの結び目により分離された）５つのループを隔離して接種した。異なる調製物によるループの接種の順序は無
作為化して、ウサギ毎に変化した。18時間後、動物を屠殺し、液容積とループ長
を測定した。

【００５５】 B ユッシングチャンバーッセイ（Ussing Chamber Assay）ユッシングチャンバー実験は、既に記載されたとおり実施した（Fasano, A.ら
, (1991) PNAS USA 88, 5242-5246）。簡単に説明すると、成熟ニュージーランドシロウサギを頸部脱臼（cervical dislocation）により屠殺し、遠位の回腸の
20cm部分を速やかに切除し、腸間膜境界沿いに切開した。回腸をすすいで管腔含
有物を取り除き、筋および漿膜層を剥ぎ取り、LUCITE（登録商標）（透明プラス
チック、Dupont）ユッシングチャンバー（開口部1.12cm²、World Precision Ins
truments, Sarasota, FL）にマウントした。組織を、37℃、95%O₂／5%CO₂ガス封
入して、リンゲル液浴に浸した。組織が定常状態に達したら、300μlの滅菌培養
上清を組織の粘膜側（mucosal side）に加えた。滅菌培養上清（300μl）は浸透
圧バランスを保つために漿膜側(serosal side)にも加えた。S. flexneri 2457T 株の上清も、300μlのS. flexneri BS529株からの上清のまたは上昇濃度のカダベリンのいずれかの存在下で試験した。一連の実験（さらに以下に説明される）
では、腸上皮をカダベリン（300μM）と共に30分間前処理し、２回新鮮なリンゲ
ル液で洗浄し、その後、300μlの2457T（野生型S. flexneri 2a）上清に曝した。

【００５６】該組織を上記の処理に曝した時の、ポテンシャル差（PD；組織の粘膜側および
漿膜側の間の電圧の差）を開路状態で測定した。100μA電流通過で生じる電圧増
加を利用して、短絡回路電流（Isc；PDをゼロにするため必要な電流量）およびオームの法則から組織抵抗を計算した（Isc＝PD／組織抵抗）（Fasano, A.ら, (
1991)）。

【００５７】Ｃ．多形核白血球移動アッセイ前記のビルエンスアッセイのように、野生型S. flexneri 2a 2457T株をBS529(
LDC+)およびBS103（無毒性）と比較した。ヒト腸上皮をモデル化するT84細胞の単層を使って、リシン・デカルボキシラーゼ発現およびカダベリンの前炎症性（
pro-inflammatory）事象を抑制する能力を測定した。モデル膜の両側の細胞当量
を、細菌株およびカダベリン存在または非存在の相関関係として計数し、モデル
腸上皮を横切るPMNの移動を測定した。

【００５８】実施例３リシン・デカルボキシラーゼ（LDC）の活性興味深いことに、病原性大腸菌(E.coli)の１つのクラス、腸侵入性大腸菌（EI
EC）は、大腸菌(E.coli)と赤痢菌（Shigella）の間の遺伝子ハイブリッドに似て
いる。EIECは、赤痢菌(Shigella)のビルエンスプラスミドと広範な相同性を有す
るプラスミドを担持し、臨床的に赤痢菌(Shigella)により引き起こされる赤痢と
類似の下痢性疾患を起こす（Sansonetti, P. J.ら, (1985) Microbiology-1985,
Schlesinger, D. 編(Am. Soc, Microbiol., Washington, DC), pp.74-77）。EI
ECと赤痢菌(Shigella)が共有する著しい生化学的特性の1つはリシン・デカルボキシラーゼ（LDC）活性の欠落である。大腸菌(E.coli)株のほとんど90%がLDC⁺で
ある（Edwards, P. RおよびEwing W. H. (1972) Identification of Enterobact
eriaceae（腸内細菌の同定） (Burgess, Minneapolis), 第3版）にも関わらず、
EIECと赤痢菌(Shigella)種の全ての株はLDC^-である（Silva, R. M.ら, (1980) J
. Clin. Microbiol. 11, 441-444）。この観察は、LDC活性の非存在が赤痢菌(Sh
igella)とEIECのビルエンスにとって重要である可能性を示唆した。LDC活性のア
ッセイは、ファルコフのアッセイ（Falkow, S. (1958) Am. J. Clin Pathol. 29
, 598-600）およびファンらのアッセイ（Phan, A. P. H.ら, (1982) Anal. Bioc
hem. 120, 193-197）によった。前者のアッセイは、リシンの脱炭酸からのカダベリン生成による、酸からアルカリへのpHシフトに基づくLDC活性の定性的尺度を与えた。細菌を、指示薬ブロモクレゾールパープル（Aldrich）を含有するリシン・デカルボキシラーゼブロス中で増殖させる。細菌がブロス中で増殖すると
、該細菌はデキストロースを発酵し、酸性pHとなる。リシン・デカルボキシラー
ゼを産生する細菌は、リシンを脱炭酸してカダベリンを産生し、該カダベリンは
塩基として培地のpHを上昇させるであろう。試験結果は、24-96時間後に、リシン・デカルボキシラーゼ産生細菌は紫または菫色（アルカリ）として、また該デ
カルボキシラーゼ非生産細菌は黄色（酸性）として読みとられる。定性的なLDC 試験結果を、表２に正または負の符号で示した。後者のアッセイは、2,4,6-トリ
ニトロベンゼンスルホン酸のカダベリン（>98%純度、Sigma）およびリシンとの反応生成物の溶解度が異なることに基づいて、リシンから生成されるカダベリン
を測定する。カダベリンはTNBSと反応して、トルエンに可溶である（しかし水に
不溶である）N,N’-ビストリニトロフェニルカダベリン（TNP-カダベリン）を生
成する。リシンはTNBSと反応して、トルエンに不溶である（しかし水に可溶であ
る）N,N’−ビストリニトロフィニルリシンを生成する。TNP-カダベリンを有機相に抽出し、TNP-カダベリンの量を340nmで分光光学的に測定する。その後、カダベリンの濃度を標準曲線から決定する。両方のアッセイには培地ブランクを使
って、培養上清中の痕跡量のアミンおよびアミノ酸を調節する。

【００５９】実施例４ cadA発現と赤痢菌(Shigella)ビルエンスの相関本発明者らは最初、LDC用の遺伝子であるcadA（E.coli K-12マップ位置93.83 分（Tabor, H,ら, (1980) J. Bacteriol. 144, 952-956））を2457Tに形質導入してS. flexneriのLDC⁺誘導体を構築することに失敗し、S. flexneri染色体はE.
coli K-12ゲノムに関係するcadA領域に大きな欠失を有するかも知れないという示唆を得た（回収した稀な形質導入体は、本発明者らが推測するに、非正統的組
換え（illegitimate recombination）事象の結果であった）。これは、赤痢菌(S
higella)種（4株）とEIEC（1株）の代表単離体のゲノムDNAに由来するcadAのコード配列にフランキングするプライマー（GenBankデータベース受託番号M76411 ならびにMeng, S-Y.およびBennett, G. N. (1992)）を用いたPCR増幅により確証
することができた。５種の毒素産生株からPCR産物は観察されなかったが、陽性対照であるE.coli K-12 MC4100株は予測された1.9kbのPCR産物を示した。全cadA
遺伝子の非存在に対するさらなる証拠は、プローブとしてpCADAからのcadAを含有する2.6kbの断片を使った、同じ赤痢菌(Shigella)とEIEC株由来のゲノム消化物のサザンブロット中に、ハイブリダイズしたバンドが検出されなかったことで
ある。唯一の例外は、S. sonnei株であり、cadAプローブを使うと陽性ハイブリダイゼーションシグナルを生じた。それにも関わらず、この株はLDC活性に対して一貫して陰性であった。これらの結果、ならびにE.coli K-12のこの領域からS
. flexneri 2aにマーカーを形質導入することが不可能であること（上記参照）は、赤痢菌(Shigella)種およびEIECはcadA遺伝子座周辺の染色体の大きな領域を
欠失していることを示唆した。

【００６０】形質転換を経由する、E.coli K-12由来cadAのコピーの、S. flexneri 2a 2457
T株中への他のクローニングにより、S. flexneriのLDC⁺誘導体を得た。得られた
形質転換体BS529はLDC活性を発現し、ビルエンス表現型の発現を試験した場合、
Hela細胞に侵入し、野生型親株と同様に効率的にプラークを形成した（データは
示していない）。したがって、cadAの発現は組織培養侵入アッセイにおける赤痢
菌(Shigella)ビルエンスに識別可能な作用を与えなかった。これは、ユッシング
チャンバーアッセイで測定したエンテロトキシン活性に対するcadAの著しい作用
と対照的である（表２参照）。

【００６１】上述で検出された赤痢菌(Shigella)欠失のさらなる確証を得るために、稀な制
限部位を担持する大腸菌(E.coli)挿入対立遺伝子を使って、E.coli K-12とS. fl
exneri 2aの対応する遺伝子座間の染色体距離を測定した。I-SceIおよびI-CeuI 制限部位の両方ならびに種々の抗生物質耐性遺伝子を担持する大腸菌(E.coli)（
Bloch, C. A.ら, (1996)）中のcadAにフランキングする２つの短いTn10dRCP2挿入物を、個別にP1形質導入によって、E.coli K-12 χM2115株およびχM2125株か
らMG1655 (E.coli K-12)およびBS103（S. flexneri 2a）中へ入れた。これら２つの挿入物間の染色体距離の、大腸菌（E.coli）からS. flexneriのバックグラウンドへの変化は、その後、これらにより導入された新しい制限部位を分離する
ゲノムDNAの長さの差によって測定することができる。E.coli MG1655およびS. f
lexneri BS103の二重挿入変異体（χM2500およびBS573）由来のゲノムDNAを、18
bpの認識部位は極度に稀であり挿入部位にのみ存在するI-SceIを用いて消化した
（Monteilhet, C.ら, (1990) Nucleic Acids Res. 18, 1407-1413）。図１（レーンは実施例１に詳細に説明した）に示すように、これらの消化物はI-SceI制限
断片を生じ、該サイズはそれぞれのバックグラウンドにおける２つの挿入物間の
距離を示した。これらの約398kbおよび205kbのサイズは、それぞれ（レーン４お
よび５）、E.coli K-12と比較して190kbの大きさのS. flexneri 2a欠失と一致し
た。6つの別々のBS103形質導入体から得た205kbの同じI-SceI断片（データは示してない）ならびにI-CeuI制限によるMG1655株およびBS103株の染色体組織の類似性（図１）は、それぞれ、株間においてP1形質導入忠実度および遺伝子マップ
保存で一致した。

【００６２】赤痢菌(Shigella)種およびEIECにおけるこの大きな欠失の限界を大まかに定義
するために、本発明者らはゲノムDNAを、cadAの時計方向および反時計方向に1-2
分異なる14種の遺伝子由来のオリゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイズさ
せた。結果は、図２に示すように、予測したとおり、これらの代表株中に可変終
末点をもつ大きな欠失（最高約90kb）を示す。S. flexneri中の14種のプローブのハイブリダイゼーションパターンは比較マクロ制限マッピングにより検出され
た変化を部分的に説明するのみであり、プローブが覆う領域の隣接セグメントの
欠失の他に更なる事象を示唆した。また、全ての単離体が、K-12マップ上で欠失
領域により囲まれたproPへのハイブリダイダイゼーションを保持することは、赤
痢菌(Shigella)種ゲノム内の、欠失セグメントにフランキングしたproP「アイラ
ンド」または他所からのトランスポジション（transposition）もしくは他所への反転（inversion）によるproPの転位を示唆した。いずれの場合でも、proP遺伝子の保持は、該遺伝子の機能（グリシンベタインおよびプロリンに対する低い
アフィニティ輸送）が該細菌にとって好都合であることを示すのであろう。proP
プローブをもつ陽性ハイブリダイゼーションシグナルの性質を解明し、かつS. f
lexneri 2aの欠失の終末点を正確に定義するための実験は進行中である。それに
関わらず、該ハイブリダイゼーションの結果は、図１の結果と一致し、かつ、大
きなサイズの欠失はまた、マーカーをE.coli K-12のこの領域からS. flexneri中
に形質導入することができないことを説明する。

【００６３】実施例５ cadA発現は、回腸ループアッセイにおける赤痢菌(Shigella)エンテロトキシン毒性をブロックする野生型S. flexneri 2aはエンテロトキシンを産生し、その活性は連結したウサ
ギ回腸ループ内の液分泌を引き起こす能力により測定することができる。先の研
究は、S. flexneri 2a供与菌とE.coli K-12受容菌との間の交配（mating）により得た大腸菌(E.coli)-赤痢菌(Shigella)ハイブリッドは、該組換体がE.coli受容菌のLDC⁺表現型を保持する場合に、連結したウサギ回腸ループ内の液分泌を誘
導しないことを実証した。対照的に、90分付近のS. flexneri領域を継承してLDC ^- となるハイブリッドは、野生型S. flexneriの親と同様に効率よく液分泌を誘導
した（Sansonetti, P. J.ら, (1983) Infect. Immun. 39, 1392-1402）。これら
の実験で伝達されたDNAはサイズが大きく未確定であるため、LDC^-トランスコンジュゲートの液分泌能力がcadAの非存在により誘発されたのか、または未連結の
毒素遺伝子の遺伝によるのかを決定することはできなかった。そこで、本発明者
らは、連結したウサギ回腸ループにこの株の上清を注入して、cadAを発現するBS
529がなお液分泌を誘導することができるかを決定しようとした。野生型S. flex
neri 2a親2457Tは平均0.6 ml/cmの液蓄積を生じたが、LDC⁺ BS529株は連結したループに液蓄積を全く誘導しなかった。これらの結果は、このアッセイにおいて
赤痢菌(Shigella)の液分泌誘導能をブロックするためには、cadA発現のみで十分
であることを示した。

【００６４】実施例６無細胞の上清は、ユッシングチャンバーアッセイにおいてエンテロトキシンを抑制する S. flexneri 2aにより産生される２つ以上の鉄調節型エンテロトキシンが、連
結した回腸ループアッセイにおける液蓄積に関係すると考えられる。ShET1は、染色体によりコードされ、S. flexneriの全ての株に存在し、他の血清型では稀にしか見当たらない、そして、ShET2（試験された赤痢菌(Shigella)の>80%に存在した；Nataro, J. P.ら, (1995) Infect. Immun. 63, 4721-4728を参照）は、
赤痢菌(Shigella)およびEIECの全ての株に見出される大きなビルレンスのプラス
ミド上にコードされている（Fasano, A.ら, (1995) J. Clin. Invest. 95, 2852
-2861；Noreiga, F. R.ら, (1995) J. Infect. Dis. 172, 1408-1410；Nataro,
J. P.ら, (1995) Infect Immun. 63, 4721-4728）。両方の毒素は、ウサギ回腸中でin vitroおよびin vivoで電解質と水透過体に不可逆的に変化する（Fasano,
A.ら, (1995)、 Nataro, J. P.ら, (1995)、 Fasano, A.ら, (1997) Gut 40, 5
05-511）。これらおよび他のエンテロトキシンの活性はユッシングチャンバーで
より正確に測定することができる（Fasano, A.ら, (1997)）ので、BS529の上清をこのアッセイで試験した。表２は、BS529にcadA遺伝子が存在すると、親株と比較してエンテロトキシン活性が有意に抑制されることを示す。ΔIsc値は、プラスミド除去（plasmid cured）株（BS103）よりさらに低く、cadA遺伝子の存在
によりプラスミドおよび染色体にコードされたエンテロトキシン活性の両方が低
下することを示唆した。BS529の上清はまた、野生型S. flexneri2457Tの上清と混合すると、時間に依存してΔIscを著しく低下させることができた。この後者の結果は、cadA⁺の作用がBS529の毒素遺伝子発現のレベルではなく、むしろ無細
胞の上清に存在する毒素にトランス作用することを示唆した。

【００６５】

【表２】

【００６６】実施例７カダベリンは分泌されるエンテロトキシン阻害剤であるユッシングチャンバーの結果は、S. flexneri BS529株のcadA発現から生じる阻害因子が培養上清に関係することを示す。本発明者らは、この因子はLDCまたはそれが触媒する反応生成物のいずれかであるという仮説をたてた。LDCは細胞質タンパク質であり、その流出（export）は意外であろう。対照的に、カダベリ
ンは、リシンのLDCによる脱炭酸化産物であり、LDC⁺細胞から分泌される（Meng,
S-Y.およびBennett, G. N. (1992)）。本発明者らはLBで増殖させたBS529の上清に存在するカダベリンを、分光光学的アッセイにより定量した（Phan, A. P.
H.ら, (1982)）。野生型S. flexneri 2a 2475T株の培養物は測定可能なカダベリ
ンを含有しないが、BS529の上清は225-300μMのカダベリンを含有した。これらのレベルは、E.coli K-12 MC4100により誘導条件下で産生されるカダベリンの量
に相当しうる（データは示していない；Meng, S-Y.およびBennett, G. N. (1992
)）。純粋なカダベリンが上清に関連する赤痢菌(Shigella)エンテロトキシン抑制作用をユッシングチャンバーアッセイで模擬できるかを確認するために、2457
Tの上清をカダベリンと混合し、毒素活性を測定した。表３は、カダベリン濃度が上昇すると共に増加する、2457T上清のエンテロトキシン活性の抑制を示す。ユッシングチャンバーに300μMカダベリンを単独で添加した場合、無接種のLBと
比較してΔIscに差は見られなかった。このように、カダベリンは、その帯電性にも関わらず、2457T上清により誘導されるΔIscの完全な抑制を示す濃度で使用
されると、ユッシングチャンバーにおける電気シグナル伝達作用は全くなかった
。

【００６７】

【表３】

【００６８】カダベリンが毒素を直接抑制したか、または宿主細胞を保護する作用をしたか
を確認するため、ユッシングチャンバー内の組織を300μMカダベリンと共に30分
間前処理した後、リンゲル液で２回洗浄し、その後、S. flexneri 2457Tからのエンテロトキシン含有上清に曝した。カダベリンでの前処理によって、ΔIscは、前処理していなかった組織で観察された値の40%に低下した（61.5±19.8 対 1
53.6±25.5）。この結果は、カダベリンが、毒素に曝される前に宿主細胞を保護
するよう作用したことを示唆した。

【００６９】本発明者らの結果は、カダベリンの作用に対して２つの可能なモデルを示唆す
る：第１に、カダベリンは赤痢菌(Shigella)により合成される毒素を不活性化す
る、または、第２に、カダベリンは直接、標的細胞に作用してそれを保護する。
第１モデルは、カダベリンがS. flexneriにより産生されるShET1とShET2の両方（および他の未確定エンテロトキシン）を抑制できることが必要である。これら
２つの毒素の分子的作用機構はまだ確認されてないが、本発明者らはそれらが異
なる経路を介して作用すると考える。対照的に、第２モデルは、ユッシングチャ
ンバー内のウサギ粘膜のカダベリンによる前処理により、該組織からカダベリン
を洗った後に加えたエンテロトキシンの作用から粘膜が保護されたという、本発
明者らの結果により支持される。カダベリンのようなポリアミンは、管腔からウ
サギ小腸細胞により吸収され（Brachet, P.ら, (1995) Am. J. Physiol. 269, 7
54-762）、そして、細胞内ポリアミンは、Gたんぱく質共役型受容体を介して伝達される細胞外シグナルのモジュレーションにより、真核生物細胞において第２
メッセンジャーとして作用すると説明されている（Bueb, J. L.ら, (1992) Bioc
hem. J. 282, 545-550）。この説明では、カダベリンは、細菌毒素により誘導さ
れるイオンチャネルを閉止するか、細胞内シグナル伝達を改変するか、または細
胞受容体から毒素を移動することにより、細胞を保護することができる。これら
の可能性の分析が、本発明の１つの様態である。

【００７０】

【表４】

【００７１】

【表５】

【００７２】実施例８カダベリンは、S. flexneriが誘導するPMN経上皮移動をブロックする PMN経上皮移動アッセイを、本質的に先に記載されたように実施した；例えば、HensenおよびOades, (1975) J. Clin Invest. 56 1053-1061；McCormack, S.A
.ら, (1993) Am. J. Physiol. 264 G367-G374；Nashら, (1987) J. Clin. Inves
t. 80: 1104-113；Parkosら, (1992) J. Cell Biol. 117, 757-764；Parkosら,
(1991) J. Clin. Invest. 88, 1605-1612、を参照すること。簡単に説明すると、ヒトPMNを、正常ヒトボランティアから静脈穿刺により採集した全血（クエン酸13.2g/デキストロース11.2gを含む500ml水、pH 6.5で抗凝集した）から精製し
た。バフィーコート（buffy coat）を室温、400xgで得た。血漿および単核細胞をアスピレーションで除去し、大部分の赤血球をHensenおよびOades(1975)およびParkosら(1991)が記載した2%ゼラチン沈降技術により除去した。その後、残り
の赤血球を冷NH₄Cl溶解バッファー中に静かに溶解して除去した。この技術は、トリパンブルー排除で測定した98%生存度で95%純粋である機能的に活性なPMNの迅速な単離（90分）を可能にした。単離した後、PMNを改変HBSS（Ca²⁺およびMg² ⁺ を含まないが10mM HEPESを含む、pH 7.4；Sigma）中に、4℃、5 x 10⁷/mlの濃度で懸濁し、単離後１時間以内に実験に使った。

【００７３】 PMNをこのアッセイシステムに添加する前に、コンフルエントな倒立（inverte
d）T84分極単層（3.5 x 10⁵ 細胞/ウエル）（Madaraら, (1992) J. Tissue Cult
. Meth. 14, 209-213；Parkosら, (1991)）をHBSS(+)中で広範にリンス洗いして
残りの血清成分を除去した。S. flexneri株の培養は、該細菌をHBSS(+)中で２回
洗浄し、300μlバッファー/10ml培養中に再分散して調製した（最終濃度≒1.5 x
10⁹細菌/ml）。側底（basolateral）表面曝露のために、側底バッファーを除去
した後に、細菌懸濁液の25μl（3.5 x 10⁷細菌）を、直接、T84細胞倒立単層の上部隔室（以下を参照）に100細菌/上皮細胞の感染多重度で加えた。頂端（apic
al）表面曝露の必要な研究では、倒立単層を各ウエルから取り除き、上皮頂端膜
（下部隔室）が上方に向くように、湿チャンバ中に置いた。再び、細菌懸濁液の
25μlを静かに頂端表面上に供給した。簡単のために、受器（reservoir）は、界
面を接する上皮膜領域によって呼称する（すなわち、頂端（apical）または側底
（basolateral））。S. flexneri株を、側底上皮界面で90分間、37℃でインキュ
ベートした。次に、非付着細菌をHBSS(+)バッファー中で３回洗浄して除去し、この条件下で80細胞随伴細菌/上皮細胞であることを確認した。その後、単層を、底部（頂端）隔室にHBSSバッファーの1.0mlをまた頂部（側底）隔室に100μl を含有する、新鮮な24ウエル組織培養トレー中に移した。側底浴に対して、単離
したPMNの40μl（1x10⁶）を、各単層に加え、150分間、37℃でインキュベートし
た。ポジティブ対照トランス移動（transmigration）アッセイは、向き合う頂端
受器に化学遊走物質（10nM N-ホルミル-Met-Leu-Phe, fMLP；Sigma Chemical Co
.）を添加して実施した。全ての実験は37℃室内で実施して、上皮単層、溶液、およびプラスチック材料を均一な温度に維持した。

【００７４】トランス移動を、PMNアズール親和性顆粒マーカーであるミエロペルオキシダーゼのアッセイにより、先に記載されたように定量した（Madaraら, (1992)；Mc
Cormickら, (1993)；Parkosら, (1992)；Parkosら, (1991)）。それぞれのトランス移動アッセイの後、PMN細胞当量（CE）を、単層を完全に横切った（すなわち、頂端受器中へ）PMN数として評価した。単層群間のTER（基線抵抗範囲650-1,
500Ωcm²）および異なる供与者から得たPMNの両方に変動があるので、個々の実験は、個々の日の1人の血液供与者からの多数（large number）の単層およびPMN
を使って実施した。PMN単離は、これらの研究期間全体で10人の異なる供与者に制限した（反復供与）。

【００７５】カダベリンは、水中に20mMの貯蔵濃度で再構築した。その後の希釈液はHBSS(+
)中で調製し、100、300、および500μMの濃度にした。S. flexneriの分極T84細胞単層の側底膜に侵入する能力に対するカダベリンの影響を分析するために、細
菌を、100、300、または500μMカダベリンのいずれかを含有するHBSS(+)の1ml中
に5x10⁸/mlの濃度で再懸濁した。その後、カダベリンが連続した濃度で存在する
細菌を、倒立単層の側底表面に加え、T84上皮細胞単層の側底領域に付着しかつ侵入する能力を、上記の標準方法により測定して評価した。

【００７６】 S. flexneriのPMN経上皮移動を誘導する能力に対するカダベリンの影響を分析
するために、４つの補足実験を実施した。第１に、S. flexneriのPMN経上皮移動
を誘導する能力に対するカダベリンの初期影響を評価するために、細菌を100、3
00、または500μMカダベリンのいずれかで再構築し、続いて、側底表面T84上皮細胞単層に90分間加えた。これらの条件下でのPMNの上皮細胞単層を横切ってトランス移動する能力を、上記の標準方法により測定して、評価した。第２に、カ
ダベリンが上皮細胞の標的細胞に直接作用するかどうかを評価するために、T84 上皮細胞単層の頂端または側底膜領域のいずれかを300μMカダベリンで30分間37
℃で前処理し、洗浄した後に、S. flexneriを添加した。その後、PMN経上皮移動
を、前記の確立されたプロトコルによって評価した。第３に、S. flexneriのPMN
経上皮移動を誘導する能力を、300μMカダベリンを頂端または側底上皮細胞表面
に同時に加え、同時にS. flexneriを側底上皮細胞表面に加えた条件のもとで、評価した。90分間、37℃でインキュベーションの後に、PMN経上皮移動を上記のように評価した。最後に、末梢血PMNに対する300μMカダベリンの直接的影響を試験した。これらの実験においては、PMNを300μMカダベリンで30分間、37℃で前処理して後、側底上皮膜領域に加え、そしてPMNトランス移動事象を上記のように評価した。PMNトランス移動のポジティブ対照は、実施した各処理条件に対して、強力な化学走化性ペプチドfMLP（10nM）の勾配をかけて設定した。ネガテ
ィブ対照は、化学遊走物質および細菌刺激の非存在でインキュベートした単層と
した。

【００７７】 T84腸上皮細胞（46-66継代）を、15 mM HEPES (pH 7.5)、14 mM NaHCO₃, 40 m
g/mlペニシリン、8 mg/mlアンピシリン、90 mg/mlストレプトマイシン、および5
%新生仔ウシ血清を補給したDulbecco-Vogt改変Eagle培地とHam’s F-12培地の1 ：1混合培地中で増殖した。単層を0.33cm²懸濁コラーゲンコートした透過性ポリ
カーボネートフィルター（Costar Corp., Cambridge, MA）上で増殖し、プレーティング後7-14日に、MadaraおよびDarmsathapthorn (1985) J. Cell Biol. 101
, 2124-2133；Madamら, (1992)；およびParkosら, (1992)、に先に記載されたよ
うに使用した。倒立単層を使って、その後、生理学的側底対頂端方向の、細菌の
侵入能力および好中球のトランス移動を研究した。定常状態の経上皮細胞抵抗（
TER）、約1,500Ωcm²、に5日間で到達し、その可変性は細胞継代数に大きく関係
した。単層は、最初のプレーティング後、１回の週給餌を受けた。

【００７８】Ａ． S. flexneri誘導PMN移動のカダベリン減弱の用量依存性この炎症誘発性反応をブロックするカダベリンの役割を試験して、野生型S. f
lexneri 2aのカダベリンとのインキュベーションが該細菌のPMN経上皮移動を誘導する能力に影響を与えるかを確認した。先に記載した方法により、T84上皮細胞単層の側底表面をS. flexneri 2457TまたはBS103にカダベリン（100、300、ま
たは500μM）と共に曝し、PMN経上皮移動を誘導する能力を評価した。このアッセイの結果を図３に示し、ここに、ネガティブ対照（-）は細菌または化学走化性刺激の非存在におけるPMNのHBSS(+)バッファーへのトランス移動を表す。デー
タは、単独実験の４つの単層に対する平均値±SEMとして表現され、全て同じ結果を示す３つの別々の実験を代表する。星印は、S. flexneri（2457T）に対する
統計的有意（ここにp<0.05）を示す。図３に示すように、本発明者らは、2457T を変化した濃度のカダベリンと共にT84細胞単層の側底領域に添加すると、S. fl
exneriのPMN経上皮移動を促進する能力の用量依存低下をもたらすことを見出した。病原性S. flexneriにより誘導されるPMNの経上皮シグナル伝達がカダベリン
に依存して消滅することは、このタイプの化合物の製薬的可能性を、特に細菌性
赤痢の治療において確証した。

【００７９】この結果がカダベリンの細菌に対する影響により起こったのでないことを確め
る目的で、付着性および内部移行アッセイを実施した。表６に示すように、試験
したどの濃度（100-500μM）でもカダベリンの存在は、2457TのT84腸上皮細胞に
付着または該細胞により内部移行する能力に悪影響を与えなかった。したがって
、カダベリンの存在下でS. flexneri 2aのPMN経上皮移動を誘導できないのは、カダベリンの存在下で腸上皮細胞に侵入する生物の能力が阻害されることによる
のではない。

【００８０】

【表６】Ｂ． LDC+細菌はPMN移動を誘導することができない

【００８１】本発明者らは、cadAのS. flexneriによる発現が、腸上皮細胞を横切るPMN輸送
を支配する炎症誘発性事象を誘導する能力に影響を与えるかを確認する検討を行
った。先のアッセイのように、野生型S. flexneri 2a株2457TをBS529(LDC+)およ
びBS103（アビルレント：avirulent）と比較した。ここで本発明者らはモデル腸
上皮を横切るPMN経上皮移動を指令する能力を測定した。分極した(polarized)T8
4細胞単層の側底表面に加えると、2457Tのみ特異的にPMN経上皮移動に必要なシグナルを誘導した（1.05(±0.03) x 10⁴細胞当量、CE/ml）。LDC+形質転換体であるBS529はPMNトランス移動を誘発しなかった（0.011(±0.001) x 10⁴ CE/ml）
。これらの値は、同じくPMN移動を誘導しなかった（0.011(±0.001) x 10⁴ CE/m
l）ネガティブ対照（アビルレントのプラスミド除去株BS103およびバッファー対
照）の値と同じであった。これらの実験においてS. flexneri上皮相互作用により移動が誘導されたPMN数は1 x 10⁴ - 6 x 10⁴の範囲にあり、血液供与者変動お
よびT84細胞継代数による大きく変化した。BS529がPMN経上皮移動を誘導しないのは、この株が腸上皮細胞に侵入できないことによるのではなかった。本発明者
らは先に、BS529の上皮細胞侵入の能力が野生型レベルを示すことを実証した（M
aurelliら， 1998、および実施例）。したがって、これらのデータは、S. flexn
eriによるcadAの発現、それによるLDC活性が赤痢菌（Shigella）誘導PMN経上皮移動を支配するシグナル伝達カスケードを動揺させるのに十分であったことを示
す。

【００８２】Ｃ．カダベリン前処理はS. flexneriが誘導するPMN移動を減弱する図４に示すように、洗浄前のT84細胞の頂端表面の300μMカダベリンを用いた3
7℃、30分間の前処理および2457Tを用いた側底上皮膜領域での感染は、この生物
のPMN経上皮移動を誘導する能力を著しく低下させる。これらの結果は、カダベリンが細菌曝露前の標的細胞に作用し、S. flexneriによりPMN経上皮移動を誘導
するのに使われるシグナル経路をブロックすることを示す。T84細胞の側底表面のカダベリンによる前処理も、頂端前処理に認められたより少ない程度であるが
、S. flexneriのPMN経上皮移動を誘導する能力の実質的低下をもたらした。この
ように、カダベリンへの上皮細胞膜領域のいずれの曝露も、著しいS. flexneri 誘導PMN経上皮移動の減弱をもたらすが、最強の阻害は頂端上皮膜領域の相互作用を介して起こる。T84細胞をカダベリン（300μM）により37℃で30分間、頂端または側底上皮細胞表面のいずれかを前処理した後、2457Tにより側底上皮細胞領域に感染させ、続いてPMN経上皮移動を誘導する能力を評価した。ネガティブ対照（-）は上記実施例8Aと同じである。データは、単独実験の４つの単層に対する平均値±SEMとして表現し、全て同じ結果を示す３つの別々の実験を代表する。星印は、S. flexneri（2457T）に対する統計的有意（p<0.05）を示す。図４
は、この前処理が毒性細菌のPMN経上皮移動を誘導する能力を著しく低下させることを示す。頂端細胞表面が好ましく、基底細胞応用と比較してより強い阻害を
生成する。

【００８３】Ｄ． S. flexneriに感染したT84単層に対するカダベリン処理はPMN移動をブロックするモデル腸上皮の頂端表面をカダベリンによる標的として赤痢菌(Shigella)誘導
炎症応答のシグナルカスケードをダウンレギュレーションできることを確立した
ので、次に検討すべき重要事項は、カダベリンが、確立された病原体-上皮細胞相互作用の後にS. flexneri誘導PMN経上皮移動をダウンレギュレーションできる
かである。これは、in vivoの状況を密接に模擬する一連の事象である。指令されたPMN経上皮移動を支配する炎症誘発性反応を誘発するためには、細菌-上皮の
接触が必要であるが（McCorrnickら, (1998) Infect. Immun. 66, 4237-4243）、本発明者らはS. flexneri-側底上皮相互作用を起こさせる（1時間）ことができた。感染した細胞単層を、その後、カダベリンを用いて上皮頂端領域を処理し
（30分）、洗浄し、その後、上皮を横切ってトランス移動したPMNのレベルを評価した。明らかに、図５に示すように、カダベリンによるS. flexneriコロニー形成T84単層の処理は、S. flexneriのPMN経上皮移動を統合する能力を著しくダウンレギュレーションした（60%）。T84細胞側底膜領域を2457Tにより１時間感染した後、カダベリン（300μM）を頂端に投与し、続いてPMN経上皮移動を誘導する能力を評価した。ネガティブ対照（-）は上記実施例8Aと同じである。データは、単独実験の４つの単層に対する平均値±SEMとして表現し、全て同じ結果を示す３つの別々の実験を代表する。星印は、S. flexneri（2457T）に対する統
計的有意（p<0.05）を示す。したがって、図５に示すように、カダベリン処理の
有効性は、モデル腸上皮がS. flexneri感染前にカダベリン処理された条件に限定されるものでない。

【００８４】実施例９非病原性大腸菌Eschrichia coli K-12と病原性赤痢菌Shigella. Flex neriとの比較を経由する、「抗ビルレンス（anti-virulence）」遺伝子、遺伝子産物、および酵素により作られた阻害化合物の同定この実施例は、cadAについて記載した手順を使って赤痢菌(Shigella)中の他の
「抗ビルレンス」anti-virulence)」遺伝子およびさらなる赤痢菌(Shigella)ビルレンスを阻害する化合物を同定する方法を記載する。

【００８５】上記のように、赤痢菌(Shigella)と大腸菌(E.coli)の間の遺伝子類似性はこれ
らを同じ属（genus）に置くことを正当化するのに十分なほど説得力がある。赤痢菌(Shigella)は、大腸菌(E.coli)の代謝的に不活性な生物群とすら考えること
ができる。赤痢菌(Shigella)と大腸菌(E.coli)の間の遺伝子類似性は非常に著し
いが、該生物を区別する複数の周知の代謝的相違がある。これらの中に、大腸菌
(E.coli)の単離体に見られない赤痢菌(Shigella)の栄養要求性要件がある。赤痢
菌(Shigella)のほとんどの臨床単離体は最少培地で増殖しない。これらの栄養要
求性単離体のうちの98%は、メチオニン、トリプトファン、およびニコチン酸を補給した最少培地で増殖する（Ahmed, Z.U.ら, (1988) Infecf. Immun. 56:107-
1009）。S. flexneri 2a株191bのニコチン酸栄養要求は、２つの非連結遺伝子座
、nadA(17min.)およびnadB(56min.)の突然変異によると報じられている（Gemski
, P. Jr.ら, (1971) Infecf. Immun. 3:500-503）。他方、ニコチン酸原栄養は、サルモネラ（Salmonella）からクローニングしたnadB遺伝子を用いた形質転換
によってS. flexneri 5株M90Tに明らかに回復されうる（Mantis, N.J.およびP.J
. Sansonetti. (1996) Mol. Gen. Genet. 252:626-629）。このデータは代謝経路で消失する「抗ビルレンス」遺伝子を示唆し、その産物は赤痢菌(Shigella)ビ
ルレンス阻害剤の候補薬となる。

【００８６】大腸菌(E.coli)では、キノリネートがニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NAD）の前駆体であり、L-アスパラギン酸およびジヒドロキシ-アセトン-リン酸（DHAP）から合成される。nadB遺伝子によりコードされるL-アスパラギン酸オ
キシダーゼは、キノリネートシンターゼA（nadA遺伝子の産物）と多酵素複合体を形成する。この酵素複合体は、L-アスパラギン酸のイミノアスパラギン酸への
酸化を触媒し、その後、DHAPと縮合してキノリネート(quinolinate)を形成する。キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼ（nadC遺伝子の産物）は、キ
ノリネートをニコチン酸モノヌクレオチドに転化し、これは、その後NAD合成の経路に入ることができる。nadAまたはnadBの非存在では、キノリネートは作られ
ず、このニコチン酸モノヌクレオチド合成への経路はブロックされる。しかし、
外因性ニコチン酸を、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（pnc遺伝子の産物）の作用により、ニコチン酸モノヌクレオチドに転化することができる
。この方法で、NAD合成の経路が、赤痢菌(Shigella)のようなニコチン酸栄養要求株に回復される。

【００８７】本発明者らは、１つまたは他の（または両方の）nad遺伝子座がS. flexneri 2
a 2457Tのゲノム中のブラックホールに該当するという本発明者らの仮説を試験した。大腸菌(E.coli)のnadB遺伝子にフランキングするPCRプライマーを使って、S. flexneri 2aからnadB遺伝子座を増幅する。該PCR産物をクローニングし、クローニングしたPCR産物を大腸菌(E.coli)のnadB突然変異体中に形質転換することにより、機能性nadB遺伝子産物について試験する。ニコチン酸を欠く最少培
地における形質転換体の増殖は、S. flexneri 2aから増幅したnadBによりコード
された機能性L-アスパラギン酸オキシダーゼの産生の確証である。E.coli nadB 突然変異体がニコチン酸栄養要求性を補完する能力のないことは、S. flexneri からのnadB遺伝子座が突然変異体であることの確証である。類似の手法をとって
、S. flexneriのnadA遺伝子座をクローニングし、クローニングした遺伝子の大腸菌（E.coli）のnadA突然変異体を補完する能力により確めた機能について試験
する。このステップで抗ビルレンス遺伝子が同定される。

【００８８】これらの遺伝子のいずれかまたは両方の非存在は、ニコチン酸モノヌクレオチ
ドの合成経路における中間物が、cadAについて上に示したのと同じ論理的方法に
より、赤痢菌(Shigella)の病原性を減弱することができることを示唆した。S. f
lexneri 2a株2457Tの組織培養細胞に侵入する能力を、ニコチン酸、ニコチン酸モノヌクレオチド、またはキノリネートの存在および非存在下でアッセイした。
図７に示すように、抗ビルレンス遺伝子産物の酵素的生成化合物であるキノリネ
ートは1mMの濃度で、細菌による単層細胞の侵入を阻害した。他方、ビルレンスに適合性のある遺伝子から誘導された化合物、ニコチン酸およびニコチン酸モノ
ヌクレオチドは効果がなかった。ニコチン酸およびニコチン酸モノヌクレオチド
はまた、侵入した細胞からの花火（firework）(細胞質の投影)を形成する能力に
より確認される細胞内細菌の運動性に対する効果もなかった。細菌を単層に加え
る前の指数関数的な増殖期間におけるキノリネートによる細菌の前処理は、侵入
に対する阻害効果を観察するために必要でなかった。キノリネートの阻害作用は
、該成分が侵入アッセイ中にのみ存在する場合でさえ観察された。この結果は、
キノリネートは、主にビルレンス遺伝子発現を阻害することによって作用するの
でなく、むしろ病原性細菌に対して直接、阻害効果を与えて単層の細胞に侵入す
る細菌の能力を減弱することを示唆する。lacZオペロン（転写の）と代表的ビル
レンス遺伝子との融合体の発現は、この結論を支持し（表８）、S. flexneri 2a
のキノリネート処理はビルレンス遺伝子発現を約50%だけ減少することを示す。

【００８９】まとめると、この実施例はさらに、細菌病原の治療のための新しい製薬を同定
する新規の合理的な方法を実証する。

【００９０】

【表７】

【００９１】

【表８】

【００９２】実施例10 カダベリンおよびLDC⁺突然変異体のワクチン生産への使用カダベリンの赤痢菌(Shigella)エンテロトキシン活性に対する強力な阻害効果
は、赤痢菌 spp.のビルレンス表現形質の完全な発現に対して障害を果たす可能性を示し、したがって、赤痢菌(Shigella)ワクチンの開発を容易にする。本発明
者らは、カダベリンは侵入をブロックしないが、望ましくない下痢効果を示す組
織抵抗の変化を防止することを示した。有利なことに、トランスジェニックLDC⁺ 細菌は、毒素の作用がブロックされるだけなので、免疫的にワクチンとしてより
効果的である。これは、腸侵入性作用を消化器系内の遺伝子送達に用いる場合、
これらの減弱LDC⁺細菌をDNAワクチンとして使うことにより、さらに発展する。当業界で公知の方法を使って、cadA遺伝子を細菌染色体DNA中に組込む。該形質転換細菌はLDCを産生し、次々と、カダベリンを分泌し、毒素効果の治療を果たす。cadA遺伝子をコードするDNAのサイズと性質は、構築物の必要性により変化し、限定されるものでないが、便利な制限酵素切断部位、全遺伝子またはその部
分であってよい遺伝子の任意の活性断片を考慮することが含まれる（ここに「活
性」は、腸毒性毒素の毒性原性の減少または機能性リシンデカルボキシラーゼの
産生を含むことを意味する）。

【００９３】例えば、リシンデカルボキシラーゼ遺伝子を赤痢菌Shigella flexneri 2aワク
チン株中に組込む。次の判定基準を使って、リシンデカルボキシラーゼ用の遺伝
子が組換えにおいて標的とするゲノム領域を決定する：１．最適な安定性で、cadA、リシンデカルボキシラーゼのための遺伝子、を細
菌染色体中に組み替える。

【００９４】２．挿入遺伝子不活化および分極の問題を避けるために、cadA遺伝子を染色体
の属間（intergenic）領域中に挿入する。

【００９５】３．染色体標的場所にcadAの組換えに対するポジティブ選択を与えるマーカー
を連結する。

【００９６】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使って、大腸菌(E．coli)K-12株MC4100からの
固有プロモーター配列を欠くcadAオープンリーディングフレーム（ORF）を増幅する。cadA ORFの構成的発現を与えるプロモーターをORFの次に結合する。上記判定基準を満足するS. flexneri 2a染色体のある領域を、S. flexneri 2aからPC
Rにより増幅する。このような領域の一例は、４キロ塩基hnr-galU-hns-tdk領域である。cadA発現カセットを、S. flexneri 2a染色体からのこのPCR増幅産物の属間領域中にクローニングする。hnr-galU-hns-tdkの属間領域中にクローニング
されたcadA遺伝子を含有するDNA断片を、cadA対立遺伝子交換カセットと呼ぶ。これを、自殺ベクターの性質すなわち条件的複製の性質を有するpGP704のような
プラスミド中にクローニングする。このcadA対立遺伝子交換カセットを運ぶ自殺
ベクターを、galU::Tn10対立遺伝子を含有するS. flexneri 2aの株中に導入する
。対立遺伝子交換の選択は、最少ガラクトース培地上またはフザリン酸を含むLB
上の増殖を選択してなされる。この選択で生存する細菌コロニーを、cadA遺伝子
を含有する対立遺伝子交換カセット（すなわち、リシンデカルボキシラーゼ活性
）およびgalU::Tn10対立遺伝子の消失（すなわち、テトラサイクリン感受性およ
びガラクトース最少培地での増殖能力）の同時遺伝について試験する。ゲノム構
造を、PCRおよび/またはサザンブロットにより実証する。自殺遺伝子の消失は、
ベクター主鎖にコードされた抗生物質耐性マーカーについてスクリーニングして
確かめる。pGP704の実施例では、自殺プラスミド上のマーカーはアンピシリン耐
性である。この株はS. flexneri 2aの染色体中に安定して組み込まれた構成的プ
ロモーターから発現されるcadA遺伝子を含有する。この株は、cadA遺伝子を、以
下に記載したように、対象とする任意のワクチン株中に導入するための供与体を
果たす。

【００９７】ワクチン株またはベクターとして使うように設計され、当業界周知の様々な方
法（例えば、侵入能力の減少、in vivo複製の制限、上皮内の拡大能力の減少等）によりビルレンスが減弱された赤痢菌 spp.の株に、galU::Tn10対立遺伝子を含有するS. flexneri 2aの供与体株上で調製されたP1L4一般化形質導入溶解物を
使って、形質導入してテトラサイクリン耐性にする。galU::Tn10対立遺伝子を含
有する該ワクチン株を、染色体に安定して組み込まれた構成的プロモーターから
発現されるcadA遺伝子を運ぶ上記の供与体株上で調製されたP1L4溶解物を用いて
形質転換する。最少ガラクトース培地上またはフザリン酸を含むLB上の増殖につ
いて選択を行う。この選択で生存する細菌コロニーを、cadA遺伝子を含有する対
立遺伝子交換カセット（すなわち、リシンデカルボキシラーゼ活性）およびgalU
::Tn10対立遺伝子の消失（すなわち、テトラサイクリン感受性およびガラクトー
ス最少培地での増殖能力）の同時遺伝について試験する。ゲノム構造を、PCRおよび/またはサザンブロットにより実証する。

【００９８】同様な手法を使って、cadBA遺伝子座をクローニングし、赤痢菌(Shigella)のワクチン株中への導入する。該cadB遺伝子は、リシンの細菌細胞中への推定トラ
ンスポーターおよび該細胞からカダベリンの輸送をコードする。cadBのワクチン
株への封入（cadAと共に）は、in vivoで細菌からのカダベリンの輸送を容易にすることにより減弱を改善することができる。

【００９９】当業者であれば、以上の開示に基づいて、本発明を使用し実施する方法を理解
するであろう。本発明の他の実施様態は、本明細書に開示された本発明の明細お
よび実施を考慮すれば、当業者には明白であろう。本明細書および実施例は例示
としてのみ考えられ、本発明の真の範囲および思想は請求の範囲により示される
と意図する。以上に述べた参照はいずれも本明細書に参照により組み入れられ、
先行技術を構成するこれらの出版物について何の承認も意図しない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、パルスフィールドゲル電気泳動によるゲノムセグメントの分離を示す
。実施例に記載したように、形質導入の忠実性と遺伝子地図の保存が明らかであ
る。

【図２】図２は、細菌病原体ゲノムと、そのサザンブロットハイブリダイゼーションの
概略を示したものである。病原性に関与する「ブラックホール」が明らかである
。

【図３】図３は、実施例２および８に記載した多形核白血球遊走アッセイ(PMN)におけるカダベリンの用量に対する応答を示す。

【図４】図４は、PMNアッセイにおけるT84単層のカダベリンによる予備処理の作用を示
す。

【図５】図５は、PMNアッセイにおけるS. flexneri感染T84単層のカダベリン処理の作用を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者フェルナンデス，レイナルドアメリカ合衆国 20906 メリーランド州，シルバースプリング，ウィスパリングパインズドライブナンバー 41 3115 (72)発明者ファサノ，アレシオアメリカ合衆国 21794 メリーランド州，ウェストフレンドシップ，リバーバリーチェイス 3128 (72)発明者ブロシュ，クレイグ，エイ．アメリカ合衆国 48104 ミズーリ州，アンアーバー，ファードンロード 1125 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA31 BA35 CA01 CA02 DA05 EA04 GA11 4C085 AA03 BA07 BB23 CC07 CC08 EE03 4C206 FA01 MA28 NA01 NA06 NA13 ZA66 ZB32 【要約の続き】を、生化学的プローブ、トキシン受容体の同定、および医薬の発見に新たに利用することを記載する。さらに、ワクチンおよびDNAワクチン送達への利用も記載する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】胃腸障害の治療または予防のための医薬組成物であって、ジ
アミノアルキル化合物および製薬上許容される担体を含んでなる前記組成物。
【請求項２】ジアミノアルキル化合物がカダベリンである、請求項１記載
の組成物。
【請求項３】ジアミノアルキル化合物がプトレシンである、請求項１記載
の組成物。
【請求項４】胃腸障害が、赤痢菌spp.、腸病原性大腸菌、腸出血性大腸菌
、腸毒性大腸菌、腸凝集性(enteroaggregative)大腸菌、尿病原性(uropathogeni
c)大腸菌、腸侵入性大腸菌、髄膜炎発症性大腸菌K-1、ペスト菌(Yersinia pesti
s)、偽結核エルジニア菌(Yersinia pseudotuberculosis)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、ヒト型結核菌(Mycobacterium tubercul
osis)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)、鳥型結核菌(Mycobacterium avium
)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、リステ
リア菌(Listeria monocytogenes)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、化膿連鎖球菌(
Streptococcus pyogenes)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jeju
ni)、バクテロイデス-フラジリス(Bacteroides fragilis)およびインフルエンザ
菌(Haemophilus influenzae)からなる群より選択される生物の感染によるもので
ある、請求項１記載の組成物。
【請求項５】請求項１記載の医薬組成物の使用方法であって、組成物を、
胃腸障害を予防または治療するのに十分な量で宿主へ投与する、前記方法。
【請求項６】胃腸障害の治療または予防方法であって、有効量のカダベリ
ンを製薬上許容される担体と共に、胃腸障害に罹患したまたは胃腸障害の危険性
のある哺乳動物へ投与する工程を含んでなる前記方法。
【請求項７】哺乳動物がヒトである、請求項６記載の方法。
【請求項８】胃腸障害が赤痢菌spp.感染によるものである、請求項６記載
の方法。
【請求項９】リシン・デカルボキシラーゼをコードするDNAの導入によって改変された病原性細菌を含んでなるワクチン。
【請求項１０】病原性細菌が、赤痢菌spp.、腸病原性大腸菌、腸出血性大
腸菌、腸毒性大腸菌、腸凝集性大腸菌、尿病原性菌、腸侵入性大腸菌、髄膜炎発
症性大腸菌K-1、ペスト菌、偽結核エルジニア菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、鳥型結核菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌
、コレラ菌、化膿連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、バクテロイデス・
フラジリスおよびインフルエンザ菌からなる群より選択される、請求項９記載の
ワクチン。
【請求項１１】病原性細菌が赤痢菌spp.である、請求項１０記載のワクチ
ン。
【請求項１２】弱毒化生菌、死菌、細菌成分、複合ワクチン、プロテオソ
ームワクチン、および核タンパク質(リボソーム)ワクチンからなる群より選択さ
れる製剤の状態である、請求項９記載のワクチン。
【請求項１３】リシン・デカルボキシラーゼをコードするDNAが、speC、l
dc、およびcadAからなる群より選択される、請求項９記載のワクチン。
【請求項１４】リシン・デカルボキシラーゼをコードするDNAが、cadA遺伝子またはその一部である、請求項１３記載のワクチン。
【請求項１５】少なくとも１つのさらなる遺伝子またはその一部の挿入に
よってさらに改変されている、請求項９記載のワクチン。
【請求項１６】さらなる遺伝子またはその一部が、HIV抗原、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素、麻
疹ウイルス核タンパク質、麻疹ウイルス赤血球凝集素、ヒト型結核菌分泌タンパ
ク質、ハンタウイルス糖タンパク質、およびヌクレオカプシドタンパク質をコー
ドするDNAからなる群より選択される、請求項１５記載のワクチン。
【請求項１７】病原性細菌によって産生されるエンテロトキシンを弱毒化
するワクチンであって、ジアミノアルキル化合物および病原性細菌に基づくワク
チンを含んでなる前記ワクチン。
【請求項１８】病原性細菌が、赤痢菌spp.、腸病原性大腸菌、腸出血性大
腸菌、腸毒性大腸菌、腸凝集性大腸菌、尿病原性菌、腸侵入性大腸菌、髄膜炎発
症性大腸菌K-1、ペスト菌、偽結核エルジニア菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、鳥型結核菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌
、コレラ菌、化膿連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、バクテロイデス・
フラジリスおよびインフルエンザ菌からなる群より選択される、請求項１７記載
のワクチン。
【請求項１９】病原性細菌が赤痢菌spp.である、請求項１８記載のワクチ
ン。
【請求項２０】弱毒化生菌、死菌、細菌成分、複合ワクチン、プロテオソ
ームワクチン、および核タンパク質(リボソーム)ワクチンからなる群より選択さ
れる製剤の状態である、請求項１７記載のワクチン。
【請求項２１】細菌の病原性と共存できない (incompatible)細菌遺伝子を同定する方法であって、 a. 一方の種が病原性であり、他方の種が非病原性である、一対の近縁な細菌種を同定する工程、 b.前記一対の細菌種のゲノムを比較する工程、 c.非病原性種に存在するが、病原性種には存在しない少なくとも１つの遺伝子
座を決定する工程、 d.非病原性細菌に存在するが、病原性細菌には存在しないかまたは機能しない
前記遺伝子座に位置する少なくとも１つの遺伝子を同定する工程、並びに e.前記遺伝子の発現によって前記病原性細菌の病原性が低下することを確認す
る工程を含んでなる前記方法。
【請求項２２】非病原性細菌に存在するが、病原性細菌には存在しないか
または機能しない細菌遺伝子が、「抗ビルレンス」遺伝子である、請求項２１記
載の方法。
【請求項２３】非病原性細菌に存在する遺伝子が、リシン・デカルボキシ
ラーゼ(LDC)をコードする、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】存在する遺伝子がspeC、ldcおよびcadAからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】病原性細菌が赤痢菌spp.である、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】非病原性細菌に存在する遺伝子が、nadAまたはnadBの少な
くとも一方である、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】細菌感染症(bacterial pathogenesis)を治療するための新
規な医薬を同定する方法であって、 a. 一方の種が病原性であり、他方の種が非病原性である、一対の近縁な細菌種を同定する工程、 b.前記一対の細菌種のゲノムを比較する工程、 c.非病原性種に存在するが、病原性種には存在しない少なくとも１つの遺伝子
座を決定する工程、 d.非病原性細菌に存在するが、病原性細菌には存在しないかまたは機能しない
前記遺伝子座に位置する少なくとも１つの遺伝子を同定する工程、 e.前記遺伝子の遺伝子産物を少なくとも１つ同定する工程、並びに f.前記遺伝子産物、または前記遺伝子産物の酵素活性により生成する化合物に
よって前記病原性細菌の病原性を低下させることを確認する工程を含んでなる前記方法。
【請求項２８】非病原性細菌に存在するが、病原性細菌には存在しない遺
伝子が、「抗ビルレンス」遺伝子である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】細菌感染症が胃腸内で起こる、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】細菌感染症を治療する方法であって、このような治療が必
要な患者へ、請求項２７記載の方法によって同定される遺伝子産物または前記遺
伝子産物の酵素活性によって生成する化合物の有効量を投与することを含んでな
る前記方法。
【請求項３１】細菌感染症が赤痢菌spp.によって引き起こされる、請求項
２９記載の方法。
【請求項３２】病原性細菌に対するワクチンを設計する方法であって、請
求項２２記載の方法によって同定される「抗ビルレンス」遺伝子を、病原性細菌
のゲノムへ挿入し、前記細菌をワクチンにて使用することを含んでなる前記方法
。
【請求項３３】病原性細菌が、赤痢菌spp.、腸病原性大腸菌、腸出血性大
腸菌、腸毒性大腸菌、腸凝集性大腸菌、尿病原性菌、腸侵入性大腸菌、髄膜炎発
症性大腸菌K-1、ペスト菌、偽結核エルジニア菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、鳥型結核菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌
、コレラ菌、化膿連鎖球菌、カンピロバクター・ジェジュニ、バクテロイデス・
フラジリスおよびインフルエンザ菌からなる群より選択される、請求項２７記載
の方法。
【請求項３４】ワクチンを、少なくとも１つのさらなる遺伝子またはその
一部の挿入によってさらに改変する、請求項２７記載の方法。
【請求項３５】さらなる遺伝子またはその一部が、HIV抗原、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質、インフルエンザＡ型ウイルス赤血球凝集素、麻
疹ウイルス核タンパク質、麻疹ウイルス赤血球凝集素、ヒト型結核菌分泌タンパ
ク質、ハンタウイルス糖タンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質をコード
するDNAからなる群より選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】胃腸障害を治療または予防するための医薬組成物であって
、キノリネートおよび製薬上許容される担体を含んでなる前記組成物。
【請求項３７】胃腸障害が赤痢菌spp.の感染によるものである、請求項３
６記載の組成物。
【請求項３８】請求項３６記載の医薬組成物の使用方法であって、組成物
を、胃腸障害を予防または治療するのに十分な量で宿主へ投与する、前記方法。
【請求項３９】胃腸障害の治療または予防方法であって、有効量のキノリ
ネートを製薬上許容される担体と共に、胃腸障害に罹患したまたは胃腸障害の危
険性のある哺乳動物へ投与する工程を含んでなる前記方法。
【請求項４０】哺乳動物がヒトである、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】胃腸障害が赤痢菌spp.の感染によるものである、請求項４
記載の組成物。