JP2002509115A

JP2002509115A - 哺乳動物におけるモラクセラ（ブランハメラ）カタラリス感染の予防のためのリポオリゴ糖ベースのワクチン

Info

Publication number: JP2002509115A
Application number: JP2000539859A
Authority: JP
Inventors: グ，ヅィン−ヅィング; ロビンス，ジョン，ビー
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1998-01-13
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2002-03-26
Also published as: CA2315746A1; EP1047447A1; KR20010034124A; BR9906902A; CN1288384A; AU2221299A; IL136903A0; AU2003200964A1; AU2003200964A8; WO1999036086A1; AU2003200964B2

Abstract

(57)【要約】エステル化脂肪酸を除去して解毒化リポオリゴ糖（ｄＬＯＳ）を産生し、あるいはリピドＡを除去して解毒オリゴ糖（ＯＳ）を産生し、免疫原性担体と結合される単離リポオリゴ糖を含む、モラクセラ(Moraxella)（ブランハメラ（Branhamella））カタラリス(catarrhalis)に対する複合体ワクチン。ワクチンは、哺乳動物、例えばヒトにおいてＭ．カタラリスにより引き起こされる中耳炎および呼吸器感染を防止するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［技術分野］本発明は、細菌感染を予防するための複合体ワクチンに関する。さらに詳しく
は、本発明は、ヒトにおけるモラクセラ (Moraxella)（ブランハメラ（Branham
ella））カタラリス(catarrhalis)感染に対する複合体ワクチンであって、細菌に由来し、エステル化脂肪酸またはリピドＡが除去され、免疫原性担体と結合さ
れたリポオリゴ糖を含むワクチンに関する。

【０００２】［発明の背景］モラクセラ（ブランハメラ）カタラリスは、ストレプトコッカスニューモニ
ア(Streptococcus pneumoniae)およびヘモフィルスインフルエンザの後の小児
における中耳炎および副鼻腔炎の第三の最も一般的な病原因子として認識される
病原性細菌である（Bluestone, C.D., 1986, Drugs 31（Suppl 3）:132-41; Cat
lin, B.W., 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320; Doern, G.V., 1986, Dia
gn. Microbiol. Infect. Dis. 4:191-201; Enright, M.C.& H. McKenzie, 1997,
J. Med. Microbiol. 46:360-71; Faden, H., et al., 1994, J. Infect. Dis.
169:1312-1317）。このグラム陰性双球菌属は、成人における（Boyle, F.M., et
al., 1991, Med. J. Aust. 154:592-596; Sarubbi, F.A.. et al., 1990, Am.
J. Med. 88:9S-14S）、特に免疫無防備状態の、または慢性閉塞性肺疾患の成人における（Enright, M.C. & H. McKenzie, 1997, J. Med. Microbiol. 46:360-3
71）気道感染も引き起こす。Ｍ．カタラリスにより引き起こされる疾患の発生率
は、増大しつつあると思われる（McLeod, D.T., et al., 1986, Br. Med. J. 29
2:1103-1105; Fung, C.P., et al., 1992, J. Antimicrob. Chemother. 30:47-5
5）。現在、Ｍ．カタラリス媒介性疾患に対するワクチンはない。

【０００３】Ｍ．カタラリスの防御抗原は明瞭に限定されてはいないが、Ｍ．カタラリスに
対する血清抗体の開発は、Ｍ．カタラリスに対する免疫において重要であると思
われる。例えば、自然コロニー形成または感染に起因する免疫を有する正常成人
は、小児（５０〜７８％）より、そして高齢者（＞２６％）より低い保菌率を有
し（１〜６％）、そして感染罹患率がより低い（Ejlertsen T. et al., 1994, J
. Infect. 29:23-31; Faden H. et al., 1994, J. Infect. Dis. 169:1312-1317
; Eliasson, I., 1986, Drugs 31（Suppl 3）:7-10; Vaneechoutte, M., et al.
, 1990, J. Clin. Microbiol. 28:2674-2680）。小児は、生後４年間に漸次、Ｍ
．カタラリスに対する血清抗体を発現し、これはＭ．カタラリスにより引き起こ
される菌血症および中耳炎の発生数の低減と相関すると思われる（CDR Weekly R
eports, 1992-1995, Communicable Disease Surveillance Centre, London; Gol
dblatt D., et al., 1990, J. Infect. Dis. 162:1128-1135; Vaneechoutte, M.
, et al., 1990., J. Clin Microbiol 28:2674-2680; Bluestone, C.D., 1986,
Drugs 31（Suppl 3）:132-141）。Ｍ．カタラリスに対する抗体は、成人患者の急性および回復期患者血清中でも検出されている（Christensen, J.J., et al.,
1990, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3:717-721; Rahman, M., et al., 1997, A
PMIS 105:213-220）。ほとんどの回復期患者血清は、対応するＭ．カタラリス単
離物に対する殺細菌活性を示す（Chapman, A.J.Jr., et al., 1985, J. Infect.
Dis. 151:878-882）。これらの結果は、血清抗体がＭ．カタラリスによる感染に対する防御に関与すると思われることを示す。

【０００４】重要な病原体としてＭ．カタラリスを研究するための今日までの努力は一般に
、外膜タンパク質（ＯＭＰ）のような表面抗原を説明することに集中していた（
Bhushan, R., et al., 1994, J. Bacteriol. 176:6636-6643; Campagnari, A.A.
, et al., 1994, Infect. Immun. 62:4909-4914; Helminen, M.E., et al., 199
3, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen, M.E., et al., 1994, J. Infect.
Dis. 170:867-872; Murphy, T.F., et al., 1993, Mol. Microbiol. 10:87-97 ）。広範に研究されてきた２つの外膜タンパク質は、高分子量タンパク質（Ｕｓ
ｐＡ）と主外膜タンパク質（ＣＤ）である。これらのタンパク質はともに、Ｍ．
カタラリスの異なる菌株中に相対的に保存され、殺細菌抗体を生成し得る（Helm
inen, M.E., et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872; Murphy, T.F., et
al., 1993, Mol. Microbiol. 10:87-97；Yang, Y.P., et al., 1997, FEMS Immu
nol. Med. Microbiol. 17:187-199）。さらに、ＵｓｐＡに対するモノクローナル抗体による受動免疫またはＵｓｐＡによる免疫処置は、マウスモデルにおける
Ｍ．カタラリス株の増強された肺クリアランスを生じる（Helminen, M.E., et a
l., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872; Chen, D., et al., 1996, Infect. I
mmun. 64:1900-1905）。ＣＤタンパク質をコードする遺伝子はクローン化され、
配列決定されている（Murphy, et al., 1993, Molec. Microbiol. 10（1）:87）
。

【０００５】精製され、特徴づけされているその他の外膜タンパク質としては、タンパク質
Ｅ（ＯＭＰＥ）（Bhushan et al., 1994, J. Bacteriol., 176（21）:6636）、タンパク質Ｂ１（Ducey et al., 1996, Abstracts, Gen. Mtg. Am. Soc. Micr
obiol., 96（0）:186）およびタンパク質ＣＯＰＢ（Aebi et al., 1996, Abstra
cts, Intersci. Conf. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 36:158）が挙げられる。その他の表面抗原としては、すべての単離物中に見出されたことがない
房状縁（Marrs, C.F. & S. Weir, 1990, Am. J. Med. 88（suppl 5A）:36S-40S ）、ならびにその存在が論争中である莢膜多糖（Ahmed, K., et al., 1991, Mic
robiol. Immunol. 35:361-366）が挙げられる。リポオリゴ糖関連高分子量外膜タンパク質も同定されている（Klingman & Murphy, 1992, Abstr. Gen Mtg. Am.
Soc. Microbiol.）。

【０００６】Ｍ．カタラリスの主要表面構成成分であるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）は、細菌感
染の病原のビルレンス因子である（Doyle, W.J., 1989, Pediatr. Infect. Dis.
J.81（Suppl）: S45-S47; Fomsgaard, J.S., et al., 1991, Infect. Immun. 5
9:3346-3349）。ＬＯＳは、以下の理由から、免疫防御の発現に関して重要である：（１）ＬＯＳに対する血清抗体がＭ．カタラリス感染患者で検出されており
、（２）患者からの回復期ＩｇＧ抗ＬＯＳはＭ．カタラリス株に対して殺細菌活
性を示し、そして（３）ＬＯＳはヒトにおけるその血清学的特性に基づいて保存
された構造を有すると思われる（Rahman, M., et al., 1995, Eur. J. Clin. Mi
crobiol. Infect. Dis. 14:297-304; Tanaka, H., et al., 1992, J. Jpn. Asso
c. Infect. Dis. 66:709-715）。同様に、その他の微生物（例えば、ｂ型インフ
ルエンザ菌、髄膜炎菌Neisseria meningitidis、コレラ菌Vibrio cholerae、ソンネ赤痢菌Shigella sonnei）に特異的な血清殺細菌性ＬＰＳまたはＰＳ抗体は、ヒトにおけるそれらの病原に対する免疫を付与する（Robbins, J.B., et al.,
1995, J. Infect. Dis. 171:1387-1398; Cohen, D., et al., 1997, Lancet 34
9:155-159）。

【０００７】ＬＯＳの３つの主要抗原型（Ａ、ＢおよびＣ）は、Ｍ．カタラリス株の約９５
％を占める（即ち、ある研究では、Ａ型６１％、Ｂ型２９％およびＣ型５％）（
Vaneechoutte, M., et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28:182-187）。これら
のＬＯＳはリピドＡと結合したオリゴ糖を含有して、Ｏ特異的多糖を含有せず、
そして３つの血清型からのオリゴ糖は共通の内部コアを有して分岐される、とい
うことが、研究から示されている（Edebrink, P., et al., 1994, Carbohydr. R
es. 257:269-284; Edebrink, P., et al., 1995, Carbohydr. Res. 266:237-261
; Edebrink, P., et al., 1996, Carbohydr. Res. 295:127-146）。

【０００８】種々の微生物からのリポ多糖（ＬＰＳ）およびＬＯＳは一般に、哺乳動物に対
してin vivoで有毒である。ＬＰＳまたはＬＯＳを解毒するために、あるいはＬＰＳから非毒性多糖をまたはＬＯＳからオリゴ糖を得るために、多数のアプロー
チが用いられてきた。例えば、Ｋｄｏ−グルコサミン結合でＬＯＳ分子からリピ
ドＡ部分を切り離すためにＬＰＳまたはＬＯＳの緩酸性処理が用いられている（
Gu, X.X., & C.M. Tsai, 1993, Infect. Immun. 61:1873-1880）。もう一つの方
法は、リピドＡのアミド結合脂肪酸を保存しながらエステル結合脂肪酸を除去す
る、ＬＯＳの緩アルカリ処理である（Gupta, R.K., et al., 1992, Infect. Imm
un. 60:3201-3208; Gu et al., 1996, Infect. & Imm. 64（10）:4047）。

【０００９】種々のアプローチを用いて、Ｍ．カタラリスおよびその他の微生物に対するワ
クチンの開発が試みられてきた（Karma et al., 1995, Int’l. J. Ped. Otorhi
nolaryngol. 32（SUPPL.）:S127-S134）。外膜タンパク質ＥおよびＣＤ、得られ
たペプチドおよびオリゴペプチド、またはこれらのタンパク質をコードするヌク
レオチドを基礎にしたＭ．カタラリスに対するワクチンは、米国特許第5,607,84
6号および米国特許第5,556,755号に開示されている。免疫調節サイトカイン、リ
ンホカイン、ホルモンまたは成長因子と結合した糖質含有抗原から作られる複合
体ワクチンは、米国特許第5,334,379号に開示されている。カナダ国特許第2,162
,193号には、精製細菌ラクトフェリンレセプタータンパク質がラクトフェリンレ
セプタータンパク質を産生する病原体、例えばＭ．カタラリスに対するワクチン
として用いられ得ることが開示されている。ＰＣＴ出願WO90/11777には、Ｍ．カ
タラリスおよびその他の細菌に対するワクチン中に用いるための非集成細菌繊毛
サブユニットを得るための方法が開示されている。

【００１０】哺乳動物、特にヒトの小児および成人における中耳炎、副鼻腔炎および同様の
気道感染を予防するためには、非毒性で且つ免疫原性であるＭ．カタラリスに対
するワクチンが必要である。その他の微生物からのＬＯＳの解毒の方法は知られ
ているが、しかし、解毒化された生成物（即ちハプテン）は一般に、in vivoで十分には免疫原性を示さない。したがって、解毒化されているが、しかし哺乳動
物におけるin vivoでの抗ＬＯＳ抗体、好ましくはＩｇＧの産生を伴う免疫応答を引き出すのに十分に免疫原性であるＭ．カタラリスＬＯＳの形態が必要である
。

【００１１】［発明の概要］本発明の一態様によれば、モラクセラカタラリス(Moraxella catarrhalis、
カタル球菌)に対する複合体ワクチン、例えばＭ．カタラリスから単離され、エステル化脂肪酸を除去して解毒化リポオリゴ糖（ｄＬＯＳ）を産生するよう処理
することにより、またはリピドＡを除去してオリゴ糖（ＯＳ）を産生するよう処
理することにより解毒化されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）、ならびにそれと共有結
合した免疫原性担体が開示される。一実施態様では、免疫原性担体はタンパク質
である。別の実施態様では、免疫原性担体タンパク質は、Ｍ．カタラリスから単
離されたＵｓｐＡ、Ｍ．カタラリスから単離されたＣＤ、破傷風毒素／トキソイ
ド、分類不可能なヘモフィルスインフルエンザ(Haemophilus influenzae、インフルエンザ菌)から単離された高分子量タンパク質（ＨＭＰ）、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒化Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、クロストリジウムパーフリンゲン
ス(Clostridium perfringens、ウェルチ菌)外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルス（rotavirus）ＶＰ７タンパク質、ＣＲＭ（交差反応物質）、例えばＣＲＭ₁₉₇（Pappenheimer et al., Immunochem. 9:
891-906, 1972）およびＣＲＭ₃₂₀₁（Black et al., Science 240:656-659, 1988
）ならびに呼吸器シンシチウムウイルス（respiratory syncytial virus）ＦおよびＧタンパク質から成る群から選択される。ワクチンの一態様では、免疫原性
担体タンパク質は、破傷風トキソイドまたはＨＭＰである。別の実施態様は、ア
ジュバントを含み得る薬学的に許容可能な担体中にこのようなワクチン複合体を
含有する製剤組成物である。好ましくは、アジュバントはモノホスホリルリピド
Ａおよびトレハロースジミコレートまたはミョウバンの混和物である。一実施態
様では、免疫原性担体はリンカー化合物を介して脱エステル化ＬＯＳと共有結合
する。好ましくは、リンカー化合物はアジピン酸ジヒドラジド、ε−アミノヘキ
サン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトンおよ
びｐ−ニトロフェニルエチルアミンから成る群から選択され、さらに好ましくは
リンカー化合物はアジピン酸ジヒドラジドである。一実施態様では、ワクチンは
、免疫原性担体に共有結合される、ＬＯＳからのリピドＡの除去によりＭ．カタ
ラリスから単離されるオリゴ糖（ＯＳ）をさらに含む。

【００１２】本発明の別の態様によれば、モラクセラカタラリスから単離され、それから
のエステル結合脂肪酸の除去により解毒されるリポオリゴ糖（ｄＬＯＳ）、また
はＬＯＳからのリピドＡの除去から得られるオリゴ糖が開示される。一実施態様
では、リポオリゴ糖が単離されるモラクセラカタラリスは、モラクセラカタ
ラリスの精製株である。

【００１３】本発明の別の態様によれば、哺乳動物においてモラクセラカタラリスの感染
により引き起こされる中耳炎の予防方法であって、モラクセラカタラリスから
得られるＬＯＳの脱エステル化により産生される解毒化リポオリゴ糖（ｄＬＯＳ
）、またはＬＯＳからのリピドＡの除去により産生されるオリゴ糖（ＯＳ）を含
む有効免疫防御量の複合体ワクチン、ならびにｄＬＯＳとまたはＯＳと共有結合
した免疫原性担体を哺乳動物に投与することを含む方法が開示される。好ましい
実施態様では、哺乳動物はヒトである。別の実施態様では、複合体ワクチンは非
経口的に投与される。一実施態様では、複合体ワクチンは筋肉内注射、皮下注射
により、または鼻腔内粘膜上に沈着することにより、あるいはそれらの組合せに
より投与される。別の実施態様では、有効免疫防御量は約１０μｇ〜約５０μｇ
／用量である。本方法は、約１０μｇ〜約２５μｇの複合体ワクチンを約２ヶ月
目に、そしてその投与工程の約１３ヶ月後に再び注射することも含む。一実施態
様では、投与工程は第１の用量を投与し、次に第１の用量の約２ヶ月後に約１０
μｇ〜約２５μｇの複合体ワクチンの第２の用量を投与し、第２の用量の約２ヶ
月後に約１０μｇ〜約２５μｇの複合体ワクチンの第３の用量を投与し、そして
第３の用量の約１２ヶ月後に約１０μｇ〜約２５μｇの複合体ワクチンの第４の
用量を投与することを含む。

【００１４】本発明の別の態様によれば、ＬＯＳからエステル結合脂肪酸を除去することを
含むモラクセラカタラリスから単離されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）の解毒方法
が開示される。一実施態様では、エステル結合脂肪酸はヒドラジンまたは緩アル
カリ性試薬で除去される。

【００１５】本発明は、モラクセラカタラリスからのＬＯＳの解毒方法であって、ＯＳを
生成するためのＬＯＳからのリピドＡの除去を含む方法も含まれる。一実施態様
では、リピドＡは酸処理により除去される。

【００１６】本発明の別の態様によれば、モラクセラカタラリスに対する複合体ワクチン
の製造方法であって、Ｍ．カタラリスから単離されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）か
らエステル結合脂肪酸を除去して脱エステル化ＬＯＳ（ｄＬＯＳ）を生成し、そ
してｄＬＯＳを免疫原性担体と共有結合させる工程を含む方法が開示される。一
実施態様では、除去工程はＬＯＳをヒドラジンまたは緩アルカリ性試薬で処理す
ることを含む。一実施態様では、結合工程はｄＬＯＳをリンカー化合物と結合さ
せ、そしてリンカー化合物を免疫原性担体と結合させることを含む。好ましくは
、リンカー化合物はアジピン酸ジヒドラジド、ε−アミノヘキサン酸、クロロヘ
キサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトンまたはｐ−ニトロフェ
ニルエチルアミンであり、さらに好ましくは、リンカー化合物はアジピン酸ジヒ
ドラジドである。別の実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントを含み得る
。

【００１７】本発明は、哺乳動物におけるモラクセラカタラリスの感染により引き起こさ
れる中耳炎を予防するのに用いるための、Ｍ．カタラリスから単離され、そして
エステル化脂肪酸を除去して解毒化ＬＯＳ（ｄＬＯＳ）を生成するよう処理する
ことにより、またはリピドＡを除去してオリゴ糖（ＯＳ）を生成するよう処理す
ることにより解毒されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を、そしてそれと共有結合した
免疫原性担体を含む複合体ワクチンを提供する。好ましくは、免疫原性担体はタ
ンパク質である。この好ましい実施態様の一態様では、免疫原性担体タンパク質
は、Ｍ．カタラリスから単離されたＵｓｐＡ、Ｍ．カタラリスから単離されたＣ
Ｄ、破傷風毒素／トキソイド、分類不可能なヘモフィルスインフルエンザから
単離された高分子量タンパク質（ＨＭＰ）、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒
化Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、クロストリジウムパーフリンゲンス(Clostridium perfr
ingens)外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、ＣＲＭ、例えばＣＲＭ₁₉₇（Pappenheimer et al. 同上）およびＣＲＭ₃₂₀₁（Black et al. 同上）または呼吸器シンシチウムウイルスＦおよびＧタンパク質である。好ましくは、免疫原性担体タンパク質は破傷風ト
キソイドまたはＨＭＰである。

【００１８】［発明の詳細な説明］モラクセラ(Moraxella)（ブランハメラ（Branhamella））カタラリス(catar
rhalis)（カタル球菌）のリポオリゴ糖（ＬＯＳ）は、小児の中耳炎および副鼻腔炎ならびに成人の気道感染を引き起こす細菌に対する殺細菌抗体を引き出す主
要表面抗原である。分かり易くするために、本細菌は、以後、モラクセラカタ
ラリスまたはＭ．カタラリスと呼ぶ。Ｍ．カタラリスＬＯＳを単離し、Limulus
amebocyte溶解物（ＬＡＬ）試験を用いて検定した場合に、その毒性が約２０，０００倍低減されるよう処理した。解毒化ＬＯＳ（ｄＬＯＳ）を、リンカー化合
物を介して担体（例えば破傷風トキソイドまたは分類不可能なヘモフィルスイ
ンフルエンザから精製された高分子量タンパク質）と結合させて、ｄＬＯＳ−Ｔ
ＴまたはｄＬＯＳ−ＨＭＰを生成した。その結果生じる複合体中のｄＬＯＳ対Ｔ
ＴおよびＨＭＰのモル比は、それぞれ約１９：１および３１：１であった。２つ
の複合体の抗原性は、二重免疫拡散検定により確定した場合、単離ＬＯＳのもの
と同様であった。両方のｄＬＯＳ−担体複合体に関しては、動物中への皮下（ｓ
．ｃ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射は、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）対Ｌ
ＯＳの平均レベルの増大を引き出した。マウスでは、平均ＩｇＧレベルの５０〜
１００倍の増加が複合体の３回の注射後に検出され、そしてウサギでは、ＩｇＧ
レベルの３５０〜７００倍の増加が２回の注射後に検出された。複合体の免疫原
性は、複合体処方物中のアジュバントの含入により増進された。

【００１９】ウサギでは、複合体免疫処置後に産生された抗血清は、Ｍ．カタラリスの同種
菌株および異種菌株に対する補体媒介性殺細菌活性を誘導した。これらの結果は
、解毒化ＬＯＳ−タンパク質複合体がＭ．カタラリス原因性疾患に対する免疫処
置のためのワクチンとして有用であることを示す。

【００２０】精製Ａ型Ｍ．カタラリス株（ＡＴＣＣ25238菌株、アメリカ培養細胞コレクションAmerican Type Culture Collection, Rockville, MDから入手可能）は、標準的方法を用いたＬＯＳの精製のための適例の供給源として用いられた（Edebri
nk, P., et al., 1994, Carbohydr. Res. 257:269-284; Masoud, H., et al., 1
994, Can. J. Chem. 72:1466-1477）。その多くがＡＴＣＣまたはその他の貯蔵所から入手可能であるＭ．カタラリスのその他の既知の菌株、あるいは周知の細
菌学的方法を用いて得られる精製臨床単離物も、ＬＯＳの供給源としての使用に
関して、本発明の範囲内である。簡潔には、Ｍ．カタラリス25238菌株をチョコレート寒天培養基上で８時間増殖させ、次に３％トリプシンダイズブロス（ＴＳ
Ｂ）中に接種し、これを３７℃で一夜、振盪しながらインキュベートした。培養
をさらに稀釈して、ＴＳＢを含有するバッフル付フラスコに移し、振盪しながら
３７℃でさらに２４時間増殖させた。遠心分離により細胞を収集し、ペレット化
細胞を標準的方法（Masoud, H., et al., 1994, Can. J. Chem. 72:1466-1477に
記載されている）を用いてエタノール、アセトンおよび石油エーテルで洗浄後、
乾燥させて、粉末にした。標準熱フェノール−水法（Westphal, O., et al., 19
65, Methods Carbohydr. Chem. 5:83-91）の変法（Gu, X-X., 1995, Infect. Im
mun. 63:4115-4120）により、細胞からＬＯＳを抽出して、１％未満のタンパク質および核酸含量を有するＬＯＳを生成した（Smith, P.K., et al., 1985, Ana
l. Biochem. 150:76-85; Warburg, O. & W. Christian, 1942, Biochem. Z. 310
:384-421）。ＬＯＳ精製のその他の既知の方法は、本明細書中に記載した方法に
代替することができる。

【００２１】Ｍ．カタラリスからのＬＯＳの解毒のためのヒドラジンの使用が本明細書中に
記載されているが、しかし、緩アルカリ性処理、即ち希（０．１Ｎ）ＮａＯＨま
たは約１３．２〜１３．６のｐＨを有するその他の稀釈水性塩基溶液による処理
のような、リピドＡからエステル化脂肪酸を除去し得るどのような試薬または酵
素の使用も、本発明の範囲内である。解毒条件が、ＬＯＳのオリゴ糖部分を加水
分解しないのに十分に穏やかである、ということは重要である。オリゴ糖の加水
分解は、防御エピトープを破壊する。単離されたＭ．カタラリスＬＯＳは、実質
的に前記のような緩条件下で無水ヒドラジン処理を用いて解毒された（Gu, X-X.
, et al., 1996, Infect. Immun. 64:4047-4053; Gupta, R.K., et al., 1992,
Infect. Immun. 60:3201-3208）。簡潔には、ＬＯＳを無水ヒドラジン中に懸濁し、１℃〜１００℃、好ましくは２５℃〜７５℃、さらに好ましくは約３７℃の
温度でインキュベートした。攪拌しながらのインキュベーションは、１０分〜２
４時間、好ましくは約２時間〜約３時間で、その後、混合物を冷却し、冷アセト
ンを沈殿物が生成されるまで付加し、遠心分離によりそれを収集した。ペレット
をアセトンで洗浄し、水中に溶解させた後、超遠心分離した。超遠心分離後に得
られた上清を凍結乾燥し、再溶解させて、カラムクロマトグラフィー処理を施し
て、炭水化物含有分画を溶離し、これをプールして、凍結乾燥し、ｄＬＯＳと指
定した。重量に換算して、ｄＬＯＳはＬＯＳの約３８％であった。

【００２２】あるいは、リピドＡの除去を生じてオリゴ糖（ＯＳ）を生成する、Gu等（Infe
ct. Immun. 61:1873-1880, 1993）に開示されているような、約２〜３のｐＨを有する稀釈物または弱水性酸を用いる緩酸処理により、ＬＯＳを解毒し得る。こ
のＯＳを次に、ｄＬＯＳの場合と同一方法を用いて、担体と抱合させる。Ｍ．カ
タラリスＬＯＳからのリピドＡの除去のための酢酸の使用は本明細書中に記載さ
れているが、しかしリピドＡを除去し得るいずれの試薬または酵素の使用も本発
明の範囲内である。ＯＳ−タンパク質複合体も、マウスおよびウサギにおいて免
疫原性であり、ＬＯＳと担体タンパク質の両方に対する抗体を引き出す。マウス
では、複合体（アジュバントを伴う）免疫処置血清は、同種Ｍ．カタラリス2523
8菌株に対して殺細菌活性を示した。ウサギでは、複合体免疫処置血清は、同種2
5238菌株に対して殺細菌活性を示した。

【００２３】ｄＬＯＳまたはＯＳ複合体の調製のためには、例えばグルタルアルデヒドのよ
うな架橋試薬を用いることにより、ｄＬＯＳを担体タンパク質と直接共有結合さ
せ得る。好ましくは、ｄＬＯＳまたはＯＳ複合体は、種々の既知の方法（例えば
、Marburg et al., 1986, J. Am. Chem. Soc. 108:5282、ならびに米国特許第4,
882,317号、第5,153,312号および第5,204,098号）を用いて、ｄＬＯＳまたはＯＳと担体を分離するリンカー化合物の使用により産生される。リンカーの存在は
ｄＬＯＳまたはＯＳの担体との有効な結合を促し、そして複合体の免疫原性を最
適化する。望ましい場合にはその長さおよび柔軟性が調整され得る鎖を有するリ
ンカーは、炭水化物と担体構成成分を分離し得る。リンカーは、複合体抗原の移
し替えおよび回転特徴の増大を可能にし、したがって抗体の結合部位のアクセス
を増大させ得る。二官能価部位間で、リンカー鎖は、異種原子および開裂部位を
含めた種々の構造的特徴を含有し得る。アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）は好
ましいリンカーであり、その他の適切なリンカーとしては、例えばヘテロ二官能
価リンカー、例えばε−アミノヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタ
ール、Ｄ−グルクロノラクトンおよびｐ−ニトロフェニルアミンが挙げられる。
本発明に用いるよう意図されたカップリング試薬としては、ヒドロキシスクシン
イミドおよびカルボジイミドが挙げられる。多数の適切なリンカーおよびカップ
リング試薬が当業者に知られている（Dick et al., Conjugate Vaccines, J.M.
Cruse & R.E. Lewis, Jr., eds., Karger, New York, pp. 48-114, 1989）。

【００２４】好ましい実施態様では、ｄＬＯＳまたはＯＳを、タンパク質担体に対するリン
カーとして作用するアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）で先ず誘導体化した。要
するに、既知の方法（Gu, X.X., & C.M. Tsai, 1993, Infect. Immun. 61:1873-
1880）を用いて、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）をｄＬＯＳまたはＯＳのＫ
ｄｏ部分のカルボキシル基と結合させて、ＡＨ−ｄＬＯＳまたはＡＨ−ＯＳ誘導
体を生成した。過剰モルのＡＤＨを用いてより有効なカップリングを確実にし、
そしてｄ−ＬＯＳ−ｄＬＯＳカップリングを制限した。反応混合物中では、ＡＤ
Ｈ対ｄＬＯＳまたはＯＳのモル比は典型的には約１０：１〜約２５０：１、好ま
しくは約５０：１〜約１５０：１、さらに好ましくは約１００：１である。好ま
しい実施態様では、ｄＬＯＳまたはＯＳ当たり１つのＡＤＨがＡＨ−ｄＬＯＳ複
合体中に存在する。別の好ましい実施態様では、最終ｄＬＯＳ−担体複合体中に
おいて、ｄＬＯＳまたはＯＳ対担体のモル比は、約１５〜約１００で、好ましい
下方限界は約２０〜約３５、好ましい上方限界は約４０〜約７５であって、好ま
しくは約２５〜約５０、さらに好ましくは約５０である。この比は一般に、ＡＨ
−ｄＬＯＳまたはＡＨ−ＯＳおよび担体の出発濃度、ならびに反応時間を変える
ことにより制御される。一般に、これらの範囲内では、その比とin vivoでの複合体に対する抗体応答との間に正の相関が認められた（即ち、比率が高いほど応
答が高かった）。カラムクロマトグラフィーにより反応混合物から誘導体化ｄＬ
ＯＳまたはＯＳを精製して、炭水化物とアジピン酸ヒドラジドの両方を含有する
溶出液分画を得た（Kemp, A.H. & M.R.A. Morgan, 1986, J. Immunol. Methods
94:65-72）。これらの分画をプールし、凍結乾燥して、ＡＨ−ｄＬＯＳまたはＡ
Ｈ−ＯＳと指定した。

【００２５】本発明の好ましい実施態様は、タンパク質、一層好ましくは破傷風トキソイド
（ＴＴ）またはＨ．インフルエンザから精製された高分子量タンパク質（ＨＭＰ
）に結合されたＭ．カタラリスｄＬＯＳまたはＯＳであるが、しかし当業界で既
知の種々の担体も、本発明のｄＬＯＳ−またはＯＳ−担体複合体を産生するのに
適している。ＨＭＰは、Ｈ．インフルエンザに感染した個体から得られるヒト回
復期血清中の主要抗体標的である表面曝露高分子量タンパク質の一群を指す（S.
J. Barenkamp, 1992, J. Infect. Dis. 165（Suppl. 1）:S181-184により構造的
および機能的にさらに限定される）。担体はオリゴ糖の免疫原性を増大し、そし
て担体に対して生じた抗体は医学的に有益であり得る。担体は、水溶性または水
不溶性であり得る。適切な天然または合成高分子免疫原性担体としては、例えば
第一および／または第二アミノ基、アジド基またはカルボキシル基を含有する物
質が挙げられる。

【００２６】種々の免疫原性担体タンパク質のいずれかを用いて、本発明のｄＬＯＳ−また
はＯＳ−担体複合体を生成し得る。これらのタンパク質としては、例えば病原細
菌の繊毛、外膜タンパク質および排出毒素、非毒性または「トキソイド」形態の
このような分泌毒素、細菌毒素と抗原的に類似した非毒性タンパク質（交差反応
物質またはＣＲＭとして知られている）、およびその他のタンパク質が挙げられ
る。好ましい外膜タンパク質は、グラム陰性細菌から単離されるものである。好
ましい外膜タンパク質としては、Ｍ．カタラリス外膜から単離されるＵｓｐＡお
よびＣＤが挙げられる。トキソイドも好ましい。本発明で用いるよう意図された
細菌毒素およびトキソイドの非限定的例としては、例えば破傷風毒素またはトキ
ソイド、ジフテリア毒素またはトキソイド、解毒化Ｐ．アエルギノサ（P. aerug
inosa）毒素Ａ、コレラ毒素またはトキソイド、百日咳毒素またはトキソイド、およびクロストリジウム属（Clostridium.sp）外毒素またはトキソイドが挙げら
れる。担体としてのウイルスタンパク質（例えばＢ型肝炎表面またはコア抗原、
ロタウイルスＶＰ７タンパク質、ならびに呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ
）ＦおよびＧタンパク質）の使用も意図される。

【００２７】ＣＲＭは、ジフテリア毒素と抗原的に等価のＣＲＭ₁₉₇（Pappenheimer et al.
、同上）および百日咳毒素の遺伝子操作変異体であるＣＲＭ₃₂₀₁（Black et al.
、同上）を含む。非哺乳動物供給源からの免疫原性担体タンパク質、例えばカギ
アナカサガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、カブトガニヘモシアニン（horseshoe crab hemocyanin）および植物エデスチン（plant edestin）
の使用も、本発明の範囲内である。

【００２８】多数のカップリング法がＭ．カタラリスｄＬＯＳ−またはＯＳ−タンパク質複
合体を生成するために意図される。例えば、本明細書中に示されているように、
ｄＬＯＳまたはＯＳはＡＨを用いて誘導体化され、次にＴＴまたはＨＭＰに結合
される。あるいは、適切なｄＬＯＳ−またはＯＳ−タンパク質複合体を生成する
ための別の方法は、ＥＤＣ媒介性誘導体化によるｄＬＯＳのシスタミン誘導体化
とその後のＮ−スクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート誘導
体化タンパク質とのジスルフィド抱合を含む。例えば、米国特許第5,153,312号、米国特許第5,204,098号ならびに欧州特許第0497525号および欧州特許第024504
5号に記載されているような、オリゴ糖を免疫原性担体タンパク質と抱合するためのその他の周知の方法も、本発明の範囲内である。

【００２９】ＡＨ−ｄＬＯＳまたはＡＨ−ＯＳを破傷風トキソイド（ＴＴ）またはＨ．イン
フルエンザからの高分子量タンパク質（ＨＭＰ）と結合させて複合体を生成した
（Gu, X.X., & C.M. Tsai, 1993, Infect. Immun. 61:1873-1880）。反応混合物
中のＡＨ−ｄＬＯＳまたはＡＨ−ＯＳ対タンパク質構成成分のモル比は、典型的
には約１０：１〜約２５０：１、好ましくは約５０：１〜約１５０：１、さらに
好ましくは約１００：１である。例えば水に溶解したＡＨ−ｄＬＯＳを、約１０
０：１のＡＨ−ｄＬＯＳ対抱合タンパク質のモル比で、ＴＴまたはＨＭＰと混合
した。次に、ｐＨを５．４±０．２に調整し、そして１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌを攪拌反応混合物に１〜３時間付
加した。反応混合物をｐＨ７．０に調整し、遠心分離して、カラムクロマトグラ
フィーにより精製した。タンパク質と炭水化物の両方を含有するピークをプール
し、複合体中で用いられるタンパク質によってｄＬＯＳ−ＴＴまたはｄＬＯＳ−
ＨＭＰと指定した。慣用的方法を、そして標準としてｄＬＯＳおよびＢＳＡを用
いて、それらの糖質およびタンパク質組成に関して、複合体を分析した（Dubois
, M., et al., 1956, Anal. Biochem. 28:250-256; Smith, P.K., et al., 1985
, Anal. Biochem. 150:76-85）。

【００３０】担体に結合されるｄＬＯＳまたはＯＳは、単一のＭ．カタラリス株を用いてま
たは種々の菌株を用いて生じて多価混合物を生成し得る、と当業者に理解される
。あるいは、ｄＬＯＳ−またはＯＳ−担体複合体は、単一複合体の産生のために
ｄＬＯＳまたはＯＳの単一供給源を用いて別々に調製され、次に、異なる複合体
は混合されて、１つより多い種類のｄＬＯＳ−またはＯＳ−担体複合体を含有す
るワクチンを生成し得る。このようにして、１つ又はそれ以上の既知の抗原型の
Ｍ．カタラリスＬＯＳを含有するワクチンが生成され得る。

【００３１】実質的に前記と同様に標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色法を用いて、精製ｄ
ＬＯＳを特徴づけし、精製ＬＯＳと比較した（Tsai, C.M. & C.E. Frasch, 1982
, Anal. Biochem. 119:115-119）。Ｍ．カタラリスＬＯＳ（２５、５０、１００
および２００ｎｇ）およびｄＬＯＳ（２０μｇ）のアリコートを、標準としてサ
ルモネラミネソタ（Salmonella minnesota）ＬＰＳＲａおよびＲｃも含有するゲル上で分離した。Ｍ．カタラリスＬＯＳを含有するレーンの各々は、約４
０００のＭ_rの単一のバンドを示した（Edebrink, P. et al., 1994, Carbohydr.
Res. 257:269-284）が、一方、２０μｇのｄＬＯＳを含有するレーンはＬＯＳの位置で検出可能なバンドを示さなかった。２０μｇのｄＬＯＳを含有するレー
ンは、代わりに、ほぼＳ．ミネソタ（S. minnesota）ＬＰＳＲａバンドのレベルで弱い不鮮明なバンドを示した。これらの結果は、ｄＬＯＳ試料が０．２５
％未満の残留Ｍ．カタラリスＬＯＳを含有することを示した。

【００３２】標準Limulus amebocyte溶解物（ＬＡＬ）検定（Hochstein, H.D., et al., 19
73, Bull. Parenter. Drug Assoc. 27:139-148）を用いて、単離ＬＯＳおよびｄ
ＬＯＳの毒性を検査した。ＬＡＬ検定の感度は、Ｕ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．Ａ．から入手
可能な標準を用いた場合には、０．２ＥＵ／ｍｌである。単離ＬＯＳは２０，０
００ＥＵ／μｇを示したが、一方ｄＬＯＳは１ＥＵ／μｇを示し、これは毒性
の２０，０００倍低減を表す。好ましくは、約５００倍〜約１，０００倍のＥＵ
／μｇまたはそれ以上の低減を示す組成物が、ワクチン用に用いられる。例えば
ＬＡＬ検定を用いて確定されるin vitro毒性のこのような低減は、in vivo毒性の低減および許容可能レベルと相関する。in vivo毒性は、in vivo発熱物質試験
法において標準を用いて容易に確定し得る（例えば、ウサギでは、０．１μｇ〜
１μｇ／体重１ｋｇの用量を用いる）。

【００３３】Ｍ．カタラリス全細胞（25238菌株）に対するウサギ超免疫血清を用いた二重免疫拡散法により、ｄＬＯＳ、ＡＨ−ｄＬＯＳ、ならびにｄＬＯＳ−ＴＴおよび
ｄＬＯＳ−ＨＭＰ複合体の抗原性を検査した。超免疫血清は、標準法により調製
した。要するに、２羽のニュージーランドシロウサギ（雌、各々２〜３ｋｇ）に
、１０⁹個のＭ．カタラリス全細胞（25238菌株）および不完全フロイントアジュ
バントのエマルション（１：１（ｖ／ｖ）の比率で）を４週間の間隔で皮下およ
び筋肉内に２回、注射した（各注射に関しては皮下および筋肉内の両方）。各注
射の前および注射後２週間目に、血液試料を収集した。

【００３４】リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の０．８％アガロースゲル
中で、標準法を用いて二重免疫拡散を実施した。この検定では、中央ウエルはＭ
．カタラリス全細胞に対するウサギ超免疫血清を含有し、周囲ウエルはＬＯＳ、
ｄＬＯＳ−ＴＴ、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ、ｄＬＯＳおよびＨＭＰを別々に含有した。
超免疫血清は、二重免疫拡散検定においてＬＯＳと反応して、鮮明で容易に検出
可能なバンドの沈降を生じた。同様に、超免疫血清はｄＬＯＳと反応して、多少
広いバンドの沈降を生じたが、これは単離ｄＬＯＳが単離ＬＯＳの抗原性を保持
したことを示す。また、超免疫血清は、ｄＬＯＳ−ＴＴおよびｄＬＯＳ−ＨＭＰ
複合体と反応して、ＬＯＳと比較した場合と同一のバンドの沈降を生じた。これ
に対比して、超免疫血清は、単離ＨＭＰと測定可能的に反応しなかった。

【００３５】抗原性は、従来記載の方法（ Gu, X-X., et al., 1996, Infect. Immun. 64:4
047-4053）にいくつかの修正を加えて用いる酵素連結イムノソルベント検定（Ｅ
ＬＩＳＡ）を用いても測定した。ＥＬＩＳＡプレートをＬＯＳで被覆し、次に３
％ＢＳＡでブロックした。その後、ＥＬＩＳＡウエルを稀釈ウサギ血清とともに
インキュベートした後、アルカリ性ホスファターゼ抱合化ヤギ抗ウサギＩｇＧお
よびＩｇＭ（Sigma）を加えた。全工程間に、ウエルを、高分子分散剤（０．０１％トゥイーン２０）を含有するＰＢＳで十分に洗浄した。酵素基質を３０分間
付加し、次にＡ₄₀₅で反応を計量した。同様に、コーティング抗原として複合体を、そして結合抗体として稀釈ウサギ免疫血清を用いて、ｄＬＯＳ−担体複合体
の抗原性を確定した。両方のｄＬＯＳ−担体複合体は、匹敵するウサギ超免疫血
清への結合を示し、ｄＬＯＳ−担体複合体の抗原性は同一条件下ではＬＯＳの場
合より高かった。

【００３６】 in vivo抗原性を確定するために、ｄＬＯＳ−担体複合体をマウスおよびウサギに非経口的に注入して、その後動物血清中の抗ＬＯＳ抗体のレベルをＥＬＩＳ
Ａを用いて測定した。マウスでは、ｄＬＯＳとＴＴまたはＨＭＰの非抱合化混合
物は抗ＬＯＳ抗体を生じなかった。これに対比して、ｄＬＯＳ−ＴＴおよびｄＬ
ＯＳ−ＨＭＰ複合体はともに、複合体の第2の注射後に低レベルの抗ＬＯＳＩｇＧを生じた。複合体の第3の注射後には、抗ＬＯＳＩｇＧのおよそ５０〜１００倍の上昇が認められた。３回の注射後に、ｄＬＯＳ−ＴＴおよびｄＬＯＳ−
ＨＭＰはともに同様のレベルの抗ＬＯＳＩｇＧを引き出した。ＬＯＳ単独およ
びｄＬＯＳ−担体複合体は、同様のレベルの抗ＬＯＳＩｇＧを引き出した。

【００３７】ｄＬＯＳ−ＴＴおよびｄＬＯＳ−ＨＭＰ複合体の両方のアジュバントとの処方
物は、マウスにおいて免疫原性を有意に高めた。即ち、アジュバントを伴うｄＬ
ＯＳ−担体複合体の２つの用量は、複合体単独の３つの用量に匹敵するかまたは
それより高いＩｇＧレベルを引き出した。アジュバントを伴うｄＬＯＳ−担体複
合体の３回の注射後に、アジュバントを含まない同一複合体の３回の注射後に得
られたレベルの約９〜１５倍の抗ＬＯＳＩｇＧの上昇が認められた。ｄＬＯＳ
−ＴＴ複合体は、複合体−アジュバント処方物の３回注射後にｄＬＯＳ−ＨＭＰ
複合体が示したより低いレベルのＩｇＧを引き出した。

【００３８】使用したアジュバントは、モノホスホリルリピドＡおよびトレハロースジミコ
レートを含有した（リビ−７００としてRibi Immunochemical Research, Hamilt
on, MTから市販されている）。その他の周知の標準アジュバント、例えばアルミ
ニウム化合物（即ち、ミョウバン）、化学修飾化リポ多糖、殺菌したボーデテラ
パーツシス（Bordetella pertussis、百日咳菌）の懸濁液、Ｎ−アセチルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミンおよび当業者に既知のその他のアジュバン
トも、本発明の範囲内で意図される。さらに別のアジュバントが、Warren等（An
n. Rev. Biochem. 4:369-388, 1986; New Generation Vaccines, 2^nd Edition,
Levine, M.M. et al., Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, 1997）により記
載されている。アルミニウム化合物の使用は好ましく、ヒトに用いることが承認
されたアジュバントは特に好ましい。マウス血清をＩｇＭレベルに関して検定し
た場合、複合体は各注射後に低〜中レベルの抗ＬＯＳ抗体を引き出したが、一方
、ＬＯＳは第3の注射後に高レベルの抗ＬＯＳＩｇＭを引き出した。ｄＬＯＳ −タンパク質複合体へのアジュバントの付加は、第2の注射後に産生される抗ＬＯＳＩｇＭのレベルを高めた。

【００３９】ｄＬＯＳ−タンパク質複合体のタンパク質構成成分（ＴＴまたはＨＭＰ）に向
けられる抗体に関してマウス血清を同様に検定した場合、抗タンパク質抗体が見
出された。抗ＴＴ抗体に関しては、ｄＬＯＳ−ＴＴは第1の注射後に低レベルのＩｇＧを引き出し、そのレベルは第2のおよび第3の注射後に有意に上昇した。ｄ
ＬＯＳ−ＴＴ複合体をアジュバントとともに注射すると、アジュバントを伴わな
い同一複合体を摂取したマウスと比較して、ｄＬＯＳ−ＴＴ注射群において産生
されるＩｇＧのレベルが増大した。ＴＴおよびｄＬＯＳの非抱合化混合物は、ｄ
ＬＯＳ−ＴＴにより引き出されるよりも高レベルの抗ＴＴＩｇＧを引き出した。
すべての免疫原が低レベルの抗ＴＴＩｇＭを引き出し、これは注射液中のアジュ
バントの含入により増大された。

【００４０】抗ＨＭＰ抗体に関してマウス血清を同様に検定した場合、ｄＬＯＳ−ＨＭＰは
第1の注射後に低レベルのＩｇＧを引き出し、抗ＨＭＰＩｇＧレベルは第2のお
よび第3の注射後に有意に上昇した。アジュバントの含入は、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ複合体を摂取したマウスにおけるＩｇＧレベルを高めた。ＨＭＰおよびｄＬＯＳ
の非抱合化混合物は、アジュバントを含有する場合もしない場合も、ｄＬＯＳ−
ＨＭＰ摂取マウスで観察されたよりも高レベルの抗ＨＭＰＩｇＧを引き出した
（下記の表２参照）。免疫原のすべてが、低レベルの抗ＨＭＰＩｇＭを引き出
した。

【００４１】皮下および筋肉内注射したウサギに関しても、０時間目および１ヶ月後に、ｄ
ＬＯＳ−タンパク質複合体の免疫原性を確定した（注射は、各注射に関して皮下
および筋肉内の両方であった）。０時間目（即ち第1の注射時）、第1の注射後２
週間目、第2の注射後２週間目に、血液試料を収集した。マウス血清の抗原性を測定するために用いたのと同様にＥＬＩＳＡ法を用いて、ＩｇＭおよびＩｇＧのレベルを、以下の免疫原（すべて５０μｇ／免疫原／注射）を注射後に得られ
たウサギ血清に関して確定した：ＬＯＳ、ｄＬＯＳ−ＴＴ、ｄＬＯＳ−ＴＴ＋ア
ジュバント、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ＋アジュバント、ｄＬＯＳ、
ＴＴおよびＨＭＰの非抱合化混和物、またはＭ．カタラリス細胞。ｄＬＯＳ、Ｔ
ＴおよびＨＭＰの混合物またはＬＯＳ単独は、2回の注射後に低レベルの抗ＬＯＳＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を引き出した。ｄＬＯＳ−ＴＴ複合体は、注射前血
清レベルと比較して、第1のおよび第2の注射後に抗ＬＯＳＩｇＧの有意の上昇
を引き出した。ｄＬＯＳ−ＨＭＰ複合体の注射は、ｄＬＯＳ−ＴＴ複合体の場合
より低レベルのＩｇＧを引き出した。アジュバントの含入は各注射後の両方の複
合体に関する抗ＬＯＳＩｇＧのレベルを高めたが、アジュバントを含入する２
回の注射後の２つの複合体間に有意差は認められなかった。ＩｇＭに関しては、
両複合体は低〜中レベルの抗ＬＯＳ抗体を引き出し、アジュバントの含入は一般
的に、アジュバントを含入せずに注射した同一複合体と比較して、各注射後に検
出された抗ＬＯＳＩｇＭ抗体の高められたレベルを引き出した。

【００４２】ｄＬＯＳ−タンパク質複合体のタンパク質構成成分に向けられる抗体に関して
ウサギ血清を同様に検定した場合、抗タンパク質抗体が見出された。抗ＴＴ抗体
に関しては、ｄＬＯＳ−ＴＴは第1の注射後に低レベルのＩｇＧを引き出し、そのレベルは第2の注射後に有意に上昇した。ｄＬＯＳ−ＴＴをアジュバントとともに注射すると、アジュバントを含入しない注射と比較して、抗ＴＴＩｇＧが
有意に一層多く検出された。ＴＴ、ｄＬＯＳおよびＨＭＰの非抱合化混合物の注
射は、ｄＬＯＳ−ＴＴにより引き出されるよりも高レベルの抗ＴＴＩｇＧを引
き出したが、しかし第2の注射後のアジュバントを伴うｄＬＯＳ−ＴＴにより引き出されたよりも低かった。すべての免疫原が低〜中レベルの抗ＴＴＩｇＭを
引き出した。

【００４３】ウサギ血清中に見出された抗ＨＭＰ抗体に関しては、ｄＬＯＳ−ＨＭＰは第1 の注射後に低レベルのＩｇＧを引き出し、そのレベルは第2の注射後に有意に上昇した。ｄＬＯＳ−ＨＭＰのアジュバントへの含入は、抗ＨＭＰＩｇＧ抗体の
レベルを高めた。ＨＭＰ、ｄＬＯＳおよびＴＴの混和物はアジュバントを含入し
ないｄＬＯＳ−ＨＭＰの注射よりも高レベルの抗ＨＭＰＩｇＧを引き出したが
、しかしアジュバントを伴うｄＬＯＳ−担体複合体よりもやや低かった。全免疫
原が低〜中レベルの抗ＨＭＰＩｇＭを引き出した。

【００４４】マウスおよびウサギで産生された抗血清を、標準的方法（Gu X-X., et al., 1
996, Infect. Immun. 64:4047-4053）を用いて、Ｍ．カタラリスの同種および異
種菌株に対するin vitro殺細菌活性に関して検定した。ウサギモデルでは、ＬＯ
Ｓまたは非抱合化ｄＬＯＳで免疫処置後に産生された血清は、同種Ｍ．カタラリ
ス株に対して殺細菌活性を示さなかった。これに対比して、ｄＬＯＳ−ＴＴによ
る免疫処置に応答して産生された血清は、１：１６（アジュバントなし）および
１：４０（アジュバント含入）の平均力価で殺細菌活性を示し、ｄＬＯＳ−ＨＭ
Ｐによる免疫処置後に産生された血清は、１：１０（アジュバントなし）および
１：４０（アジュバント含入）の平均力価で殺細菌活性を示した。抗ＬＯＳＩ
ｇＧレベルは、ＥＬＩＳＡにより確定した場合、検出された殺細菌力価と相関し
た。

【００４５】異なる地理的地域（例えば日本）からの同種Ｍ．カタラリス株および異種菌株
に対する抗血清の殺細菌活性は、ｄＬＯＳ−タンパク質複合体に応答して産生さ
れたウサギ血清が同様に産生されたマウス血清の場合より高い殺細菌活性を有す
ることを示した。すべての複合体誘導性ウサギ血清が同種Ｍ．カタラリス株に対
する殺細菌活性を示し、代表的な血清がほとんどの非同種菌株に対して殺細菌活
性を示した（１０のＡＴＣＣ菌株および臨床的単離物中９つ）。これに対比して
、半分未満のｄＬＯＳ−担体複合体誘導性マウス抗血清が同種菌株に対して殺細
菌活性を示した。一般に、殺細菌力価と抗ＬＯＳＩｇＧ抗体のレベルは相関し
た。

【００４６】アジュバントを用いて処方したｄＬＯＳ−ＴＴにより引き出されたウサギ抗血
清の殺細菌活性を、さらに別の２０のＭ．カタラリス株（野生型ＡＴＣＣ菌株１
０と臨床単離物１０）を用いて検定した。２０菌株のうちの１０株は、補体感受
性または血清感受性であった。残りの１０株を用いて、ウサギ抗血清は、１：１
５の平均力価（１：２〜１：３２の範囲）で、４つのＡＴＣＣおよび５つの臨床
単離物に対する殺細菌活性を実証した。１菌株は、殺細菌検定で陰性であった。

【００４７】マウスモデルでは、ｄＬＯＳ−タンパク質複合体で免疫処置したマウスからの
血清の２０％（マウス２０匹中４匹）、そして複合体およびアジュバントで免疫
処置後産生された血清の４５％（マウス２０匹中９匹）が、ｄＬＯＳ−担体複合
体の３回の注射後に同種Ｍ．カタラリス株（ＡＴＣＣ25238）に対して低力価の殺細菌活性を示した。

【００４８】後述の実施例に示した結果は、解毒後、Ｍ．カタラリスｄＬＯＳは抗原決定基
を保持したが、しかしin vivoで免疫原性でなかった、ということを示す。ｄＬＯＳをタンパク質担体と抱合させた場合、ｄＬＯＳ構成成分は免疫原性になる。
即ち、Ｍ．カタラリスｄＬＯＳ−担体複合体は、哺乳動物においてＬＯＳに応答
する有意のＩｇＧ抗体を誘導した。哺乳動物においては、ｄＬＯＳ−担体複合体
は、ＬＯＳの場合と少なくとも同様のレベルの抗ＬＯＳＩｇＧ抗体を引き出し
た。ｄＬＯＳ−タンパク質複合体の免疫原性は、マウスよりもウサギの方が良好
であった（即ち、ウサギへの複合体の２回の注射後、抗ＬＯＳ抗体の重畳増加は
一般に、同一複合体の２または３回注射後のマウスで観察された抗ＬＯＳ抗体の
重畳増加より大きかった）。両方の種において、抗ＬＯＳ抗体のレベルは、アジ
ュバントを含入せずに同一複合体を注射した場合と比較して、複合体をアジュバ
ントとともに注射した場合に高められた。ｄＬＯＳ−ＴＴおよびｄＬＯＳ−ＨＭ
Ｐ複合体はともに同様レベルの抗ＬＯＳＩｇＧ抗体を引き出したが、これは、
複合体をアジュバントとともに処方した場合には増大された。

【００４９】本発明のＭ．カタラリスｄＬＯＳ−担体複合体は、哺乳動物におけるＭ．カタ
ラリス感染に対する免疫を誘導するためのワクチンとして、特にヒトにおける中
耳炎および呼吸器疾患を防止するために有用である。本明細書中に開示したよう
なｄＬＯＳ−担体複合体の生成方法は、このようなワクチンを製造するのに有用
である。本明細書中に開示した方法は、哺乳動物、特に小児を含めたヒトにおけ
るＭ．カタラリスに対する防御免疫応答を誘導するために有用であるその他のｄ
ＬＯＳ−担体複合体（即ち、ｄＬＯＳとその他の担体部分との複合体）を同定す
るためにも有用である。Ｍ．カタラリスに対するワクチンは、ｄＬＯＳ−担体複
合体を、その他の構成成分、例えば免疫原性的に不活性な薬学的に許容可能な作
用物質または臨床的に許容可能なアジュバントと一緒に含み得る、と理解される
。Ｍ．カタラリスｄＬＯＳ−担体複合体は、（例えば、Ｍ．カタラリスおよび小
児疾患を引き起こす１つ又はそれ以上のその他の細菌またはウイルスに対する組
合せワクチンを製造するために）、その他の感染性作因に向けられるその他の免
疫原性的活性構成成分、例えば細菌性中耳炎を防止するために、Ｍ．カタラリス
、分類不可能なヘモフィルスインフルエンザおよびストレプトコッカスニュ
ーモニア（Streptococcus pneumoniae、肺炎連鎖球菌）に対する三価ワクチンと
組合せ得る、ということも当業者には理解される。

【００５０】ワクチン接種に関しては、ｄＬＯＳ−担体複合体は、非経口的に投与される。
ワクチン投与の種々の経路、例えば筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹
腔内（ｉ．ｐ．）、経粘膜（例えば鼻腔内）および動脈内投与が意図されるが、
経粘膜、ｓ．ｃ．およびｉ．ｍ．投与が好ましい。非経口投与のためには、ｄＬ
ＯＳ−担体複合体は、滅菌製剤の形態、例えばアジュバント含入または非含入の
滅菌注射水性または油性懸濁液であり得る。このような懸濁液は、適切な分散剤
または湿潤剤および沈澱防止剤を用いて、当業界で周知の方法により処方される
。滅菌製剤は、非経口的に許容可能な稀釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または
懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液でもあり得る。その他の適切な
希釈剤としては、例えば水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げら
れる。さらに、滅菌不揮発性油が、溶媒または懸濁媒質として慣用的に用いられ
得る。例えば、あらゆる低刺激性の不揮発性油、例えば合成モノ−またはジグリ
セリドが用いられ得る。さらに、脂肪酸、例えばオレイン酸も同様に注射可能製
剤の製造に用いられ得る。鼻腔内投与のためには、処方物は、種々の慣用的方法
のいずれかを用いて、不活性担体（例えば空気または炭化水素）を用いてエアロ
ゾル化され得る。

【００５１】本発明のワクチン中のｄＬＯＳ−担体複合体は可溶性または微粒子形態である
か、あるいはミクロスフィアまたは微小嚢、例えばリポソーム中に組み入れられ
得る。一実施態様では、投与される複合体の用量は、約１０μｇ〜約１００μｇ
、好ましくは約２０μｇ〜約５０μｇの範囲である。別の好ましい実施態様では
、投与量は、約２５μｇ〜約４０μｇである。的確な投与量は、当業者に既知の
ルーチン投与量／応答プロトコールにより確定され得るし、一般的に、投与量は
、特に小児に関しては、体重を基礎にしている。

【００５２】本発明のワクチンはあらゆる年齢の哺乳動物に投与され得るし、Ｍ．カタラリ
スにより引き起こされる中耳炎および呼吸器感染に対して、若年哺乳動物、特に
ヒトにおいて、活発な免疫処置を誘導するために適合される。小児用ワクチンと
しては、ｄＬＯＳ−担体複合体は、生後約２〜１２ヶ月、好ましくは約２〜６ヶ
月で投与される。追加注射がおそらく施される。典型的には、約１０μｇ〜約２
５μｇの２回の追加注射が、例えば最初の注射後約２ヶ月および約１３ヶ月目に
投与される。あるいは、追加注射は、最初の注射後、２、４および１６ヶ月目に
施される。その他の追加注射プロトコールも意図される。

【００５３】ワクチン組成物は、すべてのまたはほとんどの医学的関連菌株を防御する異な
るＭ．カタラリス株からの複合体のカクテルを含み得る。ｄＬＯＳに基づいて３
つの既知の種類のＭ．カタラリスが存在する：即ち、Ａ、ＢおよびＣ型で、それ
ぞれ臨床単離物の６１％、２９％および５％に相当する。実施例６に示されてい
るように、ある菌株に対して生じた抗血清はいくつかの、しかしすべてではない
、その他の菌株と交差反応する。したがって、異なる複合体のカクテルが用いら
れると思われる。ＡおよびＢ型からのｄＬＯＳまたはＯＳを含有する複合体の混
合物は全医学的関連菌株の９０％に及ぶが、一方Ａ、ＢおよびＣ型からのｄＬＯ
ＳまたはＯＳを含有する複合体の混合物は、全医学的関連菌株の９５％に及ぶ。

【００５４】後述の実施例７で考察されるように、ｄＬＯＳ−ＴＴに対するいずれかのウサ
ギ抗血清で免疫処置し、次にエアロゾル小室によりＭ．カタラリス25238株を投与したマウスにおいて、受動防御試験を実施した。細菌ＣＦＵ／肺の有意の低減
が、ワクチン群で観察された。このマウス肺クリアランスモデルは、ヒトにおけ
る細菌の自然伝達を模倣する。このモデルの利点は、それが単純で、反復可能で
、エアロゾル機械により十分制御され、同一攻撃条件下で多数のマウスを検査で
きて、細菌の接種に外科的侵襲性手法を必要としないという点である。

【００５５】特定の作用様式またはメカニズムに束縛されることを望まないが、しかしｄＬ
ＯＳ−担体複合体に応答して引き出される殺細菌抗体、特にＩｇＧは、鼻咽頭の
粘膜表面に滲出し得る。そこで、抗体は粘膜表面のＭ．カタラリス接種物を不活
性化し、したがってＭ．カタラリス病因性中耳炎および呼吸器疾患の症状を防止
または軽減する。分泌ＩｇＡは、特に複合体ワクチンが鼻粘膜に投与される場合
には、呼吸器粘膜免疫においてある役割を演じ得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様のいくつかを説明する。

【００５６】実施例１：Ｍ．カタラリスからのＬＯＳの精製および解毒ＬＯＳの精製のための適例供給源として、Ｍ．カタラリス（Ａ型）ＡＴＣＣ25
238株を用いた（Edebrink, P., et al., 1994, Carbohydr. Res. 257:269-284;
Masoud, H., et al., 1994, Can. J. Chem. 72:1466-1477）。その菌株を、チョ
コレート寒天上で３７℃で５％ＣＯ₂で８時間増殖させ、そして５００ｍＬ瓶中の３％トリプシンダイズブロス（ＴＳＢ）（Difco Laboratories, Detroit, Mic
h.）２５０ｍＬ中に移した。瓶を３７℃で一夜、インキュベーター振盪機（Mode
l G-25, New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ）中で１１０ｒｐｍでインキュベートした。培養を、各々１．４リットルのＴＳＢを含有する６本の２．
８リットルバッフル付フェルンバック(Fernbach)フラスコに移した。フラスコを
１１０ｒｐｍで振盪し、３７℃で２４時間保持した。培養を４℃で１０分間、１
５，０００×ｇで遠心分離して、細胞を収集した。

【００５７】細胞ペレットを慣用的方法（実質的にMasoud, H., et al., 1994, Can. J. Ch
em. 72:1466-1477に記載されているのと同様）を用いて９５％エタノールで１回
、アセトンで２回、そして石油エーテルで２回洗浄し、乾燥して、粉末にした。
標準熱フェノール−水法（Westphal, O. et al., 1965, Methods Carbohydr. Ch
em. 5:83-91）の変法（Gu X-X., 1995, Infect. Immun. 63:4115-4120）により、細胞からＬＯＳを抽出して、１％未満のタンパク質および核酸含量を有するＬ
ＯＳを生成した（Smith, P.K., et al., 1985, Anal. Biochem. 150:76-85; War
burg, O. & W. Christian, 1942, Biochem. Z. 310:384-421）。緩アルカリ条件を用いる無水ヒドラジン処理を用いて、エステル化脂肪酸をリ
ピドＡから除去した（Gu, X.X., et al,. 1996, Infect. Immun. 64:4047-4053;
Gupta, R.K., et al., 1992, Infect. Immun. 60:3201-3208）。要するに、ＬＯＳ（１６０ｍｇ）を１６ｍＬの無水ヒドラジン（Sigma Chemical Co., St. Lo
uis, MO）中に懸濁し、混合しながら３７℃で３時間インキュベートした。この懸濁液を氷上で冷却し、冷アセトンを沈殿物が生成するまで滴下した。混合物を
５℃で３０分間、５，０００×ｇで遠心分離した。ペレットを冷アセトンで２回
洗浄し、発熱物質無含有水中に最終濃度１０〜２０ｍｇ／ｍＬで溶解させた後、
５℃で３時間、１５０，０００×ｇで超遠心分離した。上清を凍結乾燥し、セフ
ァデックスＧ−５０（Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden）のカラ
ム（１．６×９０ｃｍ）を通して、２５ｍＭの酢酸アンモニウムで溶離し、示差
屈折率計（Ｒ−４００；Waters, Milford, Mass.）でモニタリングした。ミクロ
フェノール−硫酸法（Dubois, M., et al., 1956, Anal. Biochem. 28:250-256 ）により、溶離液を炭水化物に関して検定した。炭水化物含有分画をプールして
、凍結乾燥し、ｄＬＯＳと指定したが、これは重量に換算して、ＬＯＳの約３８
％であった。

【００５８】Ｍ．カタラリスＬＯＳの解毒のためのこの方法は、Ｋｄｏ−グルコサミン結合
でＬＯＳ分子からリピドＡ部分を切り離すためのＬＯＳの緩酸処理（即ち、Gu,
X.X., & C.M. Tsai, 1993, Infect. Immun. 61:1873-1880）と比較して、タンパ
ク質担体との抱合後のｄＬＯＳのより良好な収量をもたらした。

【００５９】実施例２：ｄＬＯＳの誘導体化およびタンパク質との抱合実施例１の方法により調製したｄＬＯＳのアジピン酸ヒドラジド（ＡＨ）誘導
体を以下のように生成し、そして精製した。１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホ−
スクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）（Pierce）を用いて、アジピン酸ジヒドラジ
ド（ＡＤＨ）（Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.）をｄＬＯＳのＫｄｏ部分のカルボキシル基と結合させて、ＡＨ−ｄＬＯＳ誘導体を生成した（Gu, X.
X., & C.M. Tsai, 1993, Infect. Immun. 61:1873-1880）。要するに、ｄＬＯＳ
（７０ｍｇ）を３４５ｍＭのＡＤＨ７ｍＬ中に溶解した（ＡＤＨ対ＬＯＳのモル
比は、ｄＬＯＳに関して概算された３，０００Ｍ_rを基礎にして、約１００：１である）（Edebrink, P., et al., 1994, Carbohydr. Res. 257:269-284）。スルホ−ＮＨＳを８ｍＭの濃度となるように加え、ｐＨを４．８に調整し、そして
ＥＤＣを０．１Ｍの濃度となるように加えた。反応混合物を攪拌し、ｐＨ４．８
で３時間保持した。反応混合物をｐＨ７．０に調整し、実施例１で記載したのと
同様のＧ−５０カラムに通した。溶離液を、炭水化物、およびアジピン酸ヒドラ
ジド（ＡＨ）に関して検定した（Kemp, A.H. & M.R.A. Morgan, 1986, J. Immun
ol. Methods 94:65-72）。炭水化物とＡＨの両方を含有するピークをプールし、
凍結乾燥して、ＡＨ−ｄＬＯＳと指定した。標準としてｄＬＯＳおよびＡＤＨを
用いて、その組成に関してＡＨ−ｄＬＯＳを測定した。

【００６０】ＡＨ−ｄＬＯＳを以下のようにしてタンパク質（ＴＴおよびＨＭＰ）と抱合さ
せた。ＴＴ（Connaught Labs. Inc., Swiftwater, Pa.）およびＨＭＰを分類不可能なヘモフィルスインフルエンザ１２株（Barenkamp, S.J., 1996, Infect.
Immun. 64:1246-1251）から精製した。ＡＨ−ｄＬＯＳをＴＴまたはＨＭＰと結
合させて、複合体を生成した（Gu, X.X., & C.M. Tsai, 1993, Infect. Immun.
61:1873-1880）。要するに、ＡＨ−ｄＬＯＳ（３０ｍｇ）を３ｍＬの水を用いて
溶解し、１５ｍｇのＴＴ（５．９ｍｇ／ｍＬ）または１２ｍｇのＨＭＰ（４ｍｇ
／ｍＬ）と混合させた。ＡＨ−ｄＬＯＳ対ＴＴ（１５０ＫのＭ_r）およびＨＭＰ（１２０ＫのＭ_r）の両方のモル比は、約１００：１であった。ｐＨを５．４に調整し、ＥＤＣを約０．０５〜０．１Ｍの濃度となるように加えた。反応混合物
を攪拌し、ｐＨを５．６で１時間〜３時間保持した。反応混合物をｐＨ７．０に
調整し、遠心分離して、０．９％ＮａＣｌ中のセファクリルＳ−３００のカラム
（１．６×９０ｃｍ）に通した。タンパク質および炭水化物の両方を含有するピ
ークをプールし、ｄＬＯＳ−ＴＴまたはｄＬＯＳ−ＨＭＰと指定した。標準とし
てｄＬＯＳおよびＢＳＡを用いて、それらの炭水化物およびタンパク質組成に関
して、両複合体を分析した（Dubois, M., et al., 1956, Anal. Biochem. 28:25
0-256; Smith, P.K., et al., 1985, Anal. Biochem. 150:76-85）。

【００６１】誘導体化生成物中のＡＨおよびｄＬＯＳの、または複合体中のｄＬＯＳおよび
タンパク質の測定量（μｇ／ｍｌ）に基づいて、誘導体化ＡＨ−ｄＬＯＳおよび
ｄＬＯＳ−タンパク質複合体を物理的に特徴づけした。炭水化物含量に基づいた
ＡＨ−ｄＬＯＳの収率は、９３％であった。ｄＬＯＳ−ＴＴに関しては、１０３
μｇ／ｍｌのｄＬＯＳおよび２６６μｇ／ｍｌのタンパク質が測定され、そして
ｄＬＯＳ−ＨＭＰに関しては、２２０μｇ／ｍｌのｄＬＯＳおよび２８０μｇ／
ｍｌのタンパク質が測定された。ｄＬＯＳに関しては３，０００、ＴＴに関して
は１５０，０００、そしてＨＭＰに関しては１２，０００の分子量を用いて、タ
ンパク質１モル当たりのｄＬＯＳのモル数として、複合体のモル比を計算した。
２つの複合体製剤中のｄＬＯＳ対ＴＴおよび対ＨＭＰのモル比は、それぞれ１９
：１および３１：１であった。複合体に関する収率を、フェノール−硫酸法によ
り測定した場合のｄＬＯＳの出発量および複合体中に含有されるｄＬＯＳを基礎
にして計算した。収率は、ｄＬＯＳ−ＴＴに関しては８％、ｄＬＯＳ−ＨＭＰに
関しては１９％であった。

【００６２】実施例３：ｄＬＯＳ、誘導体化ｄＬＯＳおよびｄＬＯＳ−タンパク質複合体の
抗原性Ｍ．カタラリス全細胞（25238菌株）に対するウサギ超免疫血清を用いた二重免疫拡散法および酵素連結イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）により、ｄＬＯ
Ｓ、ＡＨ−ｄＬＯＳおよび複合体の抗原性を検査した。超免疫血清は、前記と同
様に調製した。

【００６３】リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の０．８％アガロースゲル
中で、標準法を用いて二重免疫拡散を実施した。この検定では、中央ウエルはＭ
．カタラリス全細胞に対するウサギ超免疫血清を含有し、周囲ウエルは以下のも
のを別々に含有した：１ｍｇ／ｍｌのＬＯＳ、１０３μｇ／ｍｌのｄＬＯＳ−Ｔ
Ｔ、２２０μｇ／ｍｌのｄＬＯＳ−ＨＭＰ（ｄＬＯＳの量を基にして）、１ｍｇ
／ｍｌのｄＬＯＳ、２００μｇ／ｍｌのｄＬＯＳおよび５００μｇ／ｍｌのＨＭ
Ｐ。超免疫血清は、二重免疫拡散検定においてＬＯＳと反応して、鮮明で容易に
検出可能なバンドの沈降を生じた。同様に、超免疫血清はｄＬＯＳと反応して（
検査した両方の濃度で）、二重免疫拡散法で多少広いバンドの沈降を生じたが、
これは単離ｄＬＯＳが単離ＬＯＳの抗原性を保持したことを示す。超免疫血清は
、ｄＬＯＳ−ＴＴおよびｄＬＯＳ−ＨＭＰ複合体と反応して、明瞭なバンドの沈
降を生じた。２つの複合体およびＬＯＳは、二重免疫拡散法により実質的に同一
の沈降線を生じた。これに対比して、超免疫血清は、単離ＨＭＰと測定可能的に
は反応しなかった。

【００６４】ＥＬＩＳＡは、従来記載の方法（Gu, X.X., et al., 1996, Infect. Immun. 6
4:4047-4053）と実質的に同様に実施したが、以下の修正を加えた。標準ＥＬＩＳＡプレート（Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA）のウエルをＬＯＳ（１０μｇ／ｍｌ）で被覆後、ウエルをＰＢＳ中の３％ＢＳＡで１時間ブロ
ックした後、ウサギ血清（１／８，０００稀釈液）を２時間インキュベーション
のために付加した。次にアルカリ性ホスファターゼ抱合化ヤギ抗ウサギＩｇＧお
よびＩｇＭ（Sigma）を１時間インキュベーションのために付加した。全工程間の洗浄に、０．０１％トゥイーン２０を含有するＰＢＳを用いた。血清およびホ
スファターゼのための稀釈剤は、ＰＢＳ、０．０１％トゥイーン２０中の１％Ｂ
ＳＡであった。酵素基質を３０分間付加後、Ａ₄₀₅でマイクロプレート自動読み取り機（EL309, Bio-Tek Instruments）を用いて反応を読み取った。Ａ₄₀₅でのＥＬＩＳＡ反応性として、ｄＬＯＳ−担体複合体の抗原性を同様に確定した。コ
ーティング抗原として複合体（１０μｇ／ｍｌで）を用い、そして結合抗体とし
てウサギ免疫血清（１／８，０００稀釈液）を用いた。

【００６５】実施例３に記載した複合体調製物に関しては、両複合体は、ウサギ超免疫血清
への匹敵する結合を示した。ｄＬＯＳ−ＴＴに関するＡ₄₀₅値は１．９であり、ｄＬＯＳ−ＨＭＰに関する値は１．３であった。同一条件下では、ＬＯＳ（１０
μｇ／ｍｌ）は１．１のＡ₄₀₅値を示した。ｄＬＯＳ−タンパク質複合体のin vivo抗原性を次に、動物モデル、即ちマウスおよびウサギで調べた。

【００６６】実施例４：マウスにおけるｄＬＯＳ−タンパク質複合体の免疫原性１０〜２０匹／群の５週齢雌マウス（ＮＩＨ／Swiss）に、アジュバントを含入した場合としない場合とで、０．９％ＮａＣｌ０．２ｍＬ中の５μｇ（炭水化
物を基礎にして）のｄＬＯＳ−ＴＴ、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ、ＬＯＳまたはｄＬＯＳ
＋ＴＴまたはＨＭＰ（５μｇのタンパク質）を皮下注射した。使用したアジュバ
ントは、１回の注射当たり、不活性担体中に５０μｇのモノホスホリルリピドＡ
（ＭＰＬ）および５０μｇの合成トレハロースジコリノミコレート（ＳＴＤ）を
含有した（リビ−７００としてRibi ImmunoChem research, Inc., Hamilton, MT
から市販されている）。注射を３週間間隔で３回施し、第1の注射後１４日目に、そして第2のおよび第3の注射後７日目に、マウスを採血した。

【００６７】コーティング抗原として25238菌株から単離したＬＯＳを用いて、血清抗ＬＯＳレベルをＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として表した。参照として、25238株の全細胞に対する超免疫血清を用いて、ＩｇＧに関しては６５，０００ＥＵ／ｍＬ、そ
してＩｇＭに関しては８００ＥＵ／ｍＬの値を選定した。ＴＴまたはＨＭＰ（５
μｇ／ｍＬ）をコーティング抗原として用い、参照マウス血清（ＴＴまたはＨＭ
Ｐの３回注射により産生）を基にしてＥＬＩＳＡ単位で表したＥＬＩＳＡにより
ＴＴまたはＨＭＰに対する血清抗体を測定し、これに、ＩｇＧに関しては２，０
００ＥＵ／ｍＬ、ＩｇＭに関しては１０ＥＵ／ｍＬの値を選定した。

【００６８】これらの結果の統計的分析のために、抗体レベルを、ｎ個の個々の観測値±標
準偏差または範囲（ｎ＜４）の相乗平均ＥＬＩＳＡ単位または力価（逆数）とし
て表す。両側ｔ検定を用いて有意性を検査し、０．０５より小さいＰ値を有意と
みなした。

【００６９】表１のデータにより示されているように、ｄＬＯＳとＴＴまたはＨＭＰの非抱
合化混合物は抗ＬＯＳ抗体を生じなかった。両複合体は、第2の注射後に低レベルの抗ＬＯＳＩｇＧを生じたが、第1の注射後には生じなかった。そして、第3
の注射後、約５０〜１００倍の上昇が認められた（Ｐ＜０．０１）。３回の注射
後に、ｄＬＯＳ−ＴＴおよびｄＬＯＳ−ＨＭＰはともに同様のレベルの抗ＬＯＳ
ＩｇＧを引き出した。ＬＯＳ単独および複合体は、同様のレベルの抗ＬＯＳ
ＩｇＧを引き出した。

【００７０】リビアジュバントを含入した両複合体の処方物は、それらの免疫原性を有意に
増強した。アジュバントを伴う複合体の２回の投与は、複合体単独の３回投与に
匹敵するかまたはそれより高いＩｇＧレベルを引き出し、３回注射後に抗ＬＯＳ
ＩｇＧの約９〜１５倍の上昇が認められた。アジュバントを含入して処方した
場合、ｄＬＯＳ−ＴＴ複合体は、３回注射後にｄＬＯＳ−ＨＭＰ複合体より低レ
ベルのＩｇＧを引き出した（Ｐ＜０．０５）。

【００７１】ＩｇＭに関しては、複合体は各注射後に低〜中レベルの抗ＬＯＳを引き出した
が、一方、ＬＯＳは第3の注射後に一層高レベルの抗ＬＯＳＩｇＭを引き出した。リビアジュバントは複合体群の抗ＬＯＳＩｇＭレベルを高めた。

【００７２】

【表１】

【００７３】 ^a 各群に関して１０〜２０匹のマウスに、５μｇのＬＯＳ、５μｇの複合体、５μｇの複合体＋リビアジュバント、ＬＯＳ、またはｄＬＯＳおよびＴＴまた
はＨＭＰの混合物（各々５μｇ）を用いて、３週間間隔で計３回の皮下注射を施
した。 ^b 血液試料を採取した：１、第1の注射後２週間目；２、第2の注射後１週間目；３、第3の注射後１週間目。 ^c ＥＬＩＳＡ単位は、25238菌株に対する参照血清を基にし、25238菌株からのＬＯＳをコーティング抗原として用いた。データに関しては、単一免疫原に対
して^*および^**の印を付けた。測定値は有意に異なる（ｐ＜０．０１）。

【００７４】マウスにおける抗タンパク質抗体。表２に示したデータにより示されているよ
うに、ｄＬＯＳ−ＴＴは第1の注射後低レベルの抗ＴＴＩｇＧ抗体を引き出し、そのレベルは第2のおよび第3の注射後有意に上昇した（Ｐ＜０．０１）。リビ
アジュバントを含入した注射は、ｄＬＯＳ−ＴＴ群におけるＩｇＧレベルを高め
た。ＴＴおよびｄＬＯＳの混合物は、ｄＬＯＳ−ＴＴにより引き出されたよりも
高レベルのＩｇＧを引き出した。全免疫原が低レベルの抗ＴＴＩｇＭを引き出
した。表２には、抗ＨＭＰ抗体から得られた結果も示す。ｄＬＯＳ−ＨＭＰ複合体は
、第1の注射後低レベルのＩｇＧを引き出し、そのレベルは第2のおよび第3の注射後有意に上昇した（Ｐ＜０．０１）。リビアジュバントは、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ
群におけるＩｇＧレベルを高めた。ＨＭＰおよびｄＬＯＳの混合物は、ｄＬＯＳ
−ＨＭＰにより引き出されたものよりも高レベルのＩｇＧを引き出した。全免疫
原が低レベルの抗ＨＭＰＩｇＭを引き出した。

【００７５】

【表２】

【００７６】 ^a 各群に関して１０〜２０匹のマウスに、５μｇのＬＯＳ、５μｇの複合体、５μｇの複合体＋リビアジュバント、またはｄＬＯＳおよびＴＴまたはＨＭＰ
の混合物（各々５μｇ）を用いて、３週間間隔で計３回の皮下注射を施した。 ^b 血液試料を採取した：１、第1の注射後２週間目；２、第2の注射後１週間目；３、第3の注射後１週間目。

【００７７】実施例５：ウサギにおけるｄＬＯＳ−タンパク質複合体の免疫原性ウサギ（２または３羽／群）に、５０μｇ／注射のＬＯＳ、複合体ｄＬＯＳ−
ＴＴ（アジュバントを含入した場合としない場合）、複合体ｄＬＯＳ−ＨＭＰ（
アジュバントを含入した場合としない場合）、またはｄＬＯＳ＋ＴＴまたはＨＭ
Ｐの混和物（５０μｇの各構成成分）を、４週間間隔で別々に２回（皮下および
筋肉内）注射した。アジュバントを含入しない注射に関しては、免疫原は、１ｍ
Ｌの０．９％ＮａＣｌ中に存在した。アジュバントを含入した注射に関しては、
免疫原は、２５０μｇのモノホスホリルリピドＡおよび２５０μｇのトレハロー
スジミコレート（リビ−７００アジュバント、Ribi Immunochemical Research,
Hamilton, MT）を含有した１ｍＬの０．９％ＮａＣｌ中に存在した。各注射後２
週間目に、標準手法を用いて耳静脈から１０〜２０ｍｌの血液試料を採取した。

【００７８】表３に示した結果により示されるように、ｄＬＯＳ、ＴＴおよびＨＭＰの混和
物、またはＬＯＳは２回注射後に低レベルの抗ＬＯＳＩｇＧまたはＩｇＭ抗体
を引き出した。ｄＬＯＳ−ＴＴ複合体は、第1のおよび第2の注射後に抗ＬＯＳ
ＩｇＧの有意の上昇を生じた（前免疫処置血清の３７および７００倍）。ｄＬＯ
Ｓ−ＨＭＰは、ｄＬＯＳ−ＴＴより低レベルのＩｇＧを示した（それぞれ前免疫
処置血清レベルの６および３４７倍）。リビアジュバントは、各注射後に両複合
体群の抗ＬＯＳＩｇＧのレベルを高めた（前免疫処置血清レベルの４０〜２０
００倍）。２回注射後の２つの複合体に対する応答間に有意差は認められなかっ
た。ＩｇＭに関しては、両複合体は各注射後に低〜中レベルの抗ＬＯＳ抗体を引き
出し、リビアジュバントを伴う複合体は低〜中レベルの抗ＬＯＳ抗体を引き出し
た。

【００７９】

【表３】

【００８０】 ^a 各群に関して２〜３羽のウサギを、５０μｇのＬＯＳ、５０μｇの複合体、５０μｇの複合体＋リビアジュバント、あるいはｄＬＯＳ、ＴＴおよびＨＭＰ
の混合物（各々５０μｇ）を用いて、０時間目および１ヶ月後に、皮下および筋
肉内注射で免疫処置した。Ｍ．カタラリスに対する超免疫ウサギ血清は、本明細
書中に前記した。 ^b 血液試料を採取した：０、免疫原注射前；１、第1の注射後１４日目；およ
び２、第2の注射後１４日目。

【００８１】ウサギにおける抗タンパク質抗体。表４に示した抗ＴＴ抗体に関するデータに
より示されているように、ｄＬＯＳ−ＴＴは２回注射後に有意レベルのＩｇＧを
引き出した（前免疫処置血清レベルの３８９倍）。リビアジュバントは、２回注
射後、ｄＬＯＳ−ＴＴにより引き出されるＩｇＧレベルを４倍高めた。ＴＴおよ
びｄＬＯＳの混合物は、特に１回注射後に、ｄＬＯＳ−ＴＴ複合体により引き出
されたよりも高レベルの抗ＴＴＩｇＧを引き出した。全免疫原が低レベルの抗
ＴＴＩｇＭを引き出した。抗ＨＭＰ抗体に関して表４に示されているように、ｄＬＯＳ−ＨＭＰは、２回
注射後、有意レベルのＩｇＧを引き出した（前免疫処置血清の８１倍）。リビア
ジュバントの含入は、２回注射後、ｄＬＯＳ−ＨＭＰにより引き出されるＩｇＧ
のレベルを４倍高めた。ＨＭＰおよびｄＬＯＳの混合物は、特に１回注射後に、
ｄＬＯＳ−ＨＭＰにより引き出されたよりも高レベルのＩｇＧを引き出した。全
免疫原が低レベルの抗ＨＭＰＩｇＭを引き出した。

【００８２】

【表４】

【００８３】 ^a 各群に関して２〜３羽のウサギを、５０μｇのＬＯＳ、５０μｇの複合体、５０μｇの複合体＋リビアジュバント、あるいはｄＬＯＳ、ＴＴおよびＨＭＰ
の混合物（各々５０μｇ）を用いて、０時間目および１ヶ月後に、皮下および筋
肉内注射で免疫処置した。Ｍ．カタラリスに対する超免疫ウサギ血清は、本明細
書中に前記した。 ^b 血液試料を採取した：０、免疫原注射前；１、第1の注射後１４日目；およ
び２、第2の注射後１４日目。

【００８４】実施例６：Ｍ．カタラリス株に対する動物血清の殺細菌活性本実施例では、実施例４および５により調製された動物血清の殺細菌活性を、
ＬＯＳが単離された同一Ｍ．カタラリス株（ＡＴＣＣ25238；「同種菌株」）に対して、そしてＭ．カタラリスのその他の野生型菌株（「異種菌株」）に対して
検査した。Ｍ．カタラリスの１１の野生型菌株（ＡＴＣＣ番号8176、8193、2324
6、25238、25239、25240、43617、43618、43627、43628および49143）（アメリカ培養細胞コレクションAmerican Type Culture Collection, Rockville, MDから購入）、ならびに中耳炎または呼吸器感染患者から精製した１０種の日本臨床
単離物（Ｍ１〜Ｍ１０と命名）（Goro Mogi, Oita Medical University, Japan のご厚意により提供いただいた）を検査した。Ｍ．カタラリスのさらに別の菌株
は、標準細菌学的技法を用いて臨床試料から容易に単離され、同様に検査され得
る、と当業者には理解される。

【００８５】殺細菌検定のために、ウサギ前−および後免疫血清（２回注射後）を、５６℃
で３０分間インキュベートすることにより、補体構成成分に関して不活性化した
。次に、従来記載されている（Gu, X.X., et al., 1996, Infect. Immun. 64:40
47-4053）のとほぼ同様に、補体媒介性殺細菌検定を用いて、Ｍ．カタラリス株に対する殺細菌活性に関して不活性化血清を検査したが、但し、補体供給源とし
てモルモット（guinea pig）血清（１：１稀釈液、２０μｌ／ウエル）（Sigma
, St. Louis, MO）を用い、反応プレートを３７℃で３０分間インキュベートした後、寒天プレート中で平板培養した。５０％以上の殺害を引き起こした最高血
清稀釈度を、相反殺細菌力価として表した。マウスモデルでは、複合体免疫処置血清の２０％（マウス２０匹中４匹）、または複合体（＋アジュバント）免疫処置血清の４５％（マウス２０匹中９匹）
が、ｄＬＯＳ−ＴＴまたはｄＬＯＳ−ＨＭＰの３回の注射後に同種菌株に対して
低力価の殺細菌活性を示した。

【００８６】図１のグラフに示されているように、ウサギモデルでは、ＬＯＳ（またはｄＬ
ＯＳ）免疫処置動物からの血清は、同種Ｍ．カタラリス株（ＡＴＣＣ25238）に対して殺細菌活性を示さなかった。これに対比して、ｄＬＯＳ−ＴＴ免疫処置血
清は、１：１６（アジュバントなし）および１：４０（アジュバント含入）の平
均力価の殺細菌活性を示し、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ免疫処置血清は、１：１０（アジ
ュバントなし）および１：４０（アジュバント含入）の平均力価の殺細菌活性を
示した。ＬＯＳＩｇＧＥＬＩＳＡレベルと殺細菌力価の間には相関が認めら
れた（ｒ＝０．６０、Ｐ＝０．０２）が、しかしＩｇＭレベルとの間には認めら
れなかった。

【００８７】リビアジュバントを用いて処方したｄＬＯＳ−ＴＴにより引き出されるウサギ
抗血清の殺細菌活性を、１０のさらに別の野生型株（ＡＴＣＣ菌株）および１０
種の日本臨床単離物を用いてさらに分析した。２０菌株のうち１０株は補体感受
性（菌株23246、43617、M9）または血清感受性（菌株43627、43628、49143、M4 、M7、M8、M10）であった。残り１０株を用いた場合、ウサギ抗血清は、１：１５の平均力価（１：２〜１：３２の範囲）で、４つのＡＴＣＣおよび５つの日本
菌株に対する殺細菌活性を実証した。１菌株（ＡＴＣＣ25240）は、殺細菌検定で陰性であった。殺細菌活性に関してここで示された交差反応性は、Ｍ．カタラ
リスのすべての有毒菌株に対して防御的であるワクチンが、異なる菌株からのｄ
ＬＯＳから作られる比較的少数の複合体から処方され得ることを示す（２１ペー
ジの下部参照）。

【００８８】実施例７：マウス肺クリアランスモデルにおける受動防御試験４０匹のマウスを、ｄＬＯＳ−ＴＴに対するウサギ抗血清または前免疫血清で
免疫処置し、次に免疫処置の１８時間後にエアロゾル小室により１０⁸ｃｆｕのＭ．カタラリス25238株を投与した。投与後３および６時間目にマウスを屠殺した（図２）。分析のために肺および血液試料を採取した。結果を図３に示す。投
与後３時間目に、ワクチン群中の細菌量は、対照と比較して５０％低減した。投
与後６時間目に、対照群と比較して、ワクチン群に６１％の低減が認められた。
各時点での対照群とワクチン群との間に有意な差異が認められた。抗体レベルも
分析したが、これは細菌ｃｆｕと逆相関した。これらの結果は、ｄＬＯＳ−ＴＴ
複合体誘導化抗体が、マウスにおいてはＭ．カタラリスの肺クリアランスを増強
したことを示す。

【００８９】実施例８：Ｍ．カタラリスｄＬＯＳ−タンパク質複合体によるヒトの免疫処置最初に、実施例１および２と同様に調製したｄＬＯＳ−担体複合体、あるいは
実施例９〜１１と同様に調製したＯＳ−担体複合体の安全性および免疫原性を検
査するために、成人を選定した。比較的低レベルの内因性抗体（例えば、Ｍ．カ
タラリスの小児期感染に起因する）に関して個体をスクリーニングし、一般集団
と比較して比較的低レベルを示す成人を試験用に選択した。これらの個体に、薬
学的に許容可能な担体中のｄＬＯＳ−ＴＴ複合体、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ複合体、Ｏ
Ｓ−ＴＴ複合体またはＯＳ−ＨＭＰ複合体（体重によって２５μｇ〜５０μｇ）
を筋肉内注射した。成人に関しては、１回の注射は一般に、３日〜２週間以内に
抗体応答を引き出すのに十分である。その結果生じる抗血清の免疫原性および殺
細菌活性を、実施例４〜６に記載したのと実質的に同様の方法を用いて確定した
。第1の注射の約１〜６ヶ月後に第2の注射を投与し、抗Ｍ．カタラリス抗体のレ
ベルを約１週間後に測定した。対照個体には、免疫処置成人に関するものと同一
の注射スケジュールで、同一の薬学的に許容可能な担体中の同一量の複合体（単
独）の対応するタンパク質構成成分の対照ワクチンを注射した。

【００９０】ｄＬＯＳ−またはＯＳ−担体複合体を接種した個体に関しては、免疫処置後の
血清抗体レベルは、複合体がin vivoで免疫原性で、許容不可能な副作用を生じないということを示す。殺細菌活性は、これらの個体からの血清抗体と関連する
。いくつかの個体に関しては、最適抗体応答を達成するためには多重免疫処置が
好ましい。これに対比して、対照注射を摂取した対照個体から得られる血清は、
測定可能な免疫原性または該個体の注射前血清中に見出された以上の抗Ｍ．カタ
ラリス殺細菌活性は示さない。即ち、ｄＬＯＳ−ＴＴ複合体、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ
複合体、ＯＳ−ＴＴ複合体またはＯＳ−ＨＭＰ複合体を摂取した成人からの抗血
清は、対照群と比較して、有意に大きい免疫原性または抗Ｍ．カタラリス殺細菌
活性を示す。さらに、個体における中耳感染の発生頻度を数年間モニタリングし
た結果、ｄＬＯＳ−ＴＴ、ｄＬＯＳ−ＨＭＰ、ＯＳ−ＴＴまたはＯＳ−ＨＭＰ複
合体で免疫処置された成人は誰もその期間中に中耳感染に罹患しなかった。

【００９１】成人で得られた抗血清結果に基づいて、生後２〜４ヶ月目に筋注ワクチンの初
回投与（量は体重に基づく。一般に１０〜４０μｇ）を受け、初回ワクチン接種
後２および４ヶ月目に２回の追加免疫ワクチン接種を受けた小児にワクチン検査
を広げる。１小児群は、初回ワクチン接種後２、４および１６ヶ月目に３回の追
加免疫ワクチン接種を受ける。ワクチンを摂取していない年齢が適合する小児を
対照被験者として用いる。血清抗体を免疫処置小児においてモニタリングし、前
記と同様に検出したが、これは免疫原性および殺細菌活性の両方を示す。第1のワクチン接種後から約４歳まで、中耳炎と副鼻腔炎に関して小児をモニタリング
する。ワクチン接種を受けた小児は、対照被験者と比較して、モニタリング期間
中、中耳炎および副鼻腔炎のエピソードが有意に少なく、中耳炎および／または
副鼻腔炎が検出された場合、症状軽減を示す。

【００９２】実施例９：オリゴ糖（ＯＳ）を生成するためのＭ．カタラリス25238株ＬＯＳの酸加水分解オリゴ糖（ＯＳ）を生成するために、Ｋｄｏ−グルコサミン結合でＬＯＳ分子
からリピドＡ部分を切り離すためのＬＯＳの緩酸処理（即ち、Gu, X.X., & C.M.
Tsai, 1993, Infect. Immun. 61:1873-1880の方法）によりＭ．カタラリスＬＯ
Ｓを解毒した。要するに、４２１ｍｇのＬＯＳを蒸留水に溶解して１０ｍｇ／ｍ
ｌとし、次に１％酢酸中で１００℃で２〜３時間加水分解した。１５０，０００
×ｇで３時間の遠心分離により、リピドＡ部分および非加水分解化ＬＯＳを除去
した。上清を凍結乾燥し、少容量の水に溶解し、２つに分離して、各々を２５ｍ
Ｍの酢酸アンモニウムで平衡させたセファデックスＧ−２５カラム（１．６×９
０ｃｍ）に通した。溶離液を糖含量に関して検定し、主ＯＳ分画をプールして、
３回凍結乾燥して、塩を除去した。出発ＬＯＳからのＯＳの収率は４７重量％で
あった。

【００９３】実施例１０：ＡＤＨによるＯＳの誘導体化従来記載されている（Gu et al., 1993、同上）ようにＥＤＣおよびスルホ− ＮＨＳを用いたカルボジイミド媒介性縮合により、ＡＤＨをＯＳと結合させた。
Bio-GelＰ−４カラム（１．６×９０ｃｍ；Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて反
応混合物を精製した。溶離液を、糖およびＡＨ含量に関して検定した。糖および
ＡＨの両方を含有するピークをプールし、３回凍結乾燥して、塩を除去した。Ｏ
Ｓ対ＡＤＨの比は、約１であった。ＡＨ−ＯＳ誘導体における糖の収率は、約７
４％であった。

【００９４】実施例１１：ＡＨ−ＯＳのタンパク質との抱合０．０５〜０．１ＭのＥＤＣを用いて、ｐＨ５．２±０．２で、カップリング
反応を実施した。ＯＳ−ＴＴに関しては、３０ｍｇのＡＨ−ＯＳを蒸留水３ｍｌ
に溶解し、１５ｍｇのＴＴ（５．９０ｍｇ／ｍｌ）と混合させた。ＯＳ−ＨＭＰ
反応に関しては、２０ｍｇのＡＨ−ＯＳを水２ｍｌに溶解して、８．４ｍｇのＨ
ＭＰ（４．２ｍｇ／ｍｌ）と混合させた。ＡＨ−ＯＳ対ＴＴまたはＨＭＰのモル
比は、１５０または１４１対１（分子量を基にして：ＯＳを２，０００、ＴＴを
１５０，０００、そしてＨＭＰを１２０，０００とした）であった。精製工程は
、実施例２に記載したｄＬＯＳ−タンパク質複合体に関する工程と同様であった
。これらのＯＳ−タンパク質複合体は、前記のｄＬＯＳ−タンパク質複合体と、
即ちヒトにおけるモラクセラ（ブランハメラ）カタラリス感染に対するワクチ
ンと同一の効用を有する。ＯＳ−ＴＴおよびＯＳ−ＨＭＰ複合体の組成、収率お
よび抗原性を、表５に示す。

【００９５】

【表５】

【００９６】ａ．比率は、ｄＬＯＳに関しては２，０００、ＴＴに関しては１５０，０００
およびＨＭＰに関しては１２０，０００の分子量を有するタンパク質１モル当た
りのＯＳのモル数として表される。ｂ．ＯＳの出発量、およびミクロフェノール−硫酸法により測定した場合の複
合体中に含有されるＯＳを基礎にした。ｃ．複合体の抗原性を、コーティング抗原として複合体（１０μｇ／ｍｌ）を
、そして結合抗体としてウサギ超免疫血清（１／８，０００）を用いた場合のＡ ₄₀₅ でのＥＬＩＳＡ反応性として表した。同一条件下では、ＬＯＳ（１０μｇ／ｍｌ）も１．１のＡ₄₀₅値を示した。

【００９７】ＯＳ−タンパク質複合体は、ＬＯＳに対するマウスおよびウサギの両方におけ
る抗体応答を引き出した。タンパク質複合体も、マウスおよびウサギの両方での
ＴＴおよびＨＭＰに対する抗体を引き出した。複合体により引き出されたＭ．カ
タラリス25238株ＬＯＳに対するマウス抗体応答を、表６に示す。１０匹／群の雌マウス（ＮＩＨ／Swiss）に、アジュバントを含入した場合としない場合とで、０．２ｍＬの０．９％ＮａＣｌ中の５μｇ（炭水化物を基礎にして）のＯＳ−
ＴＴ、ＯＳ−ＨＭＰ、ＬＯＳまたはＯＳ＋ＴＴおよびＨＭＰの混合物（５μｇの
タンパク質）を皮下注射した。使用したアジュバントは、ｄＬＯＳ抗体応答の場
合と同一であった。注射は３週間間隔で３回施され、第1の注射後１４日目に、そして第2のおよび第3の注射後７日目に、マウスを採血した。コーティング抗原として25238菌株から単離したＬＯＳを用いて、血清抗ＬＯＳレベルをＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として表した。参照として、25238株の全細胞に対する超免疫血清を用いて、ＩｇＧに関しては６５，０００ＥＵ／ｍＬ、そ
してＩｇＭに関しては８００ＥＵ／ｍＬの値を選定した。ｄＬＯＳ複合体に関し
て記載したように、ＥＬＩＳＡによりＴＴまたはＨＭＰに対する血清抗体を測定
した。これらの結果の統計的分析のために、抗体レベルを、ｎ個の個々の観測値
±標準偏差または範囲（ｎ＜４）の相乗平均ＥＬＩＳＡ単位または力価（逆数）
として表す。両側ｔ検定を用いて有意性を検査し、０．０５より小さいＰ値を有
意とみなした。

【００９８】表６のデータにより示されているように、ＯＳとＴＴおよびＨＭＰの非抱合化
混合物は抗ＬＯＳ抗体を生じなかった。両複合体は、第2の注射後に低レベルの抗ＬＯＳＩｇＧを生じたが、第1の注射後には生じなかった。そして、第3の注
射後に、わずかな増大が認められた（Ｐ＜０．０１）。３回の注射後に、ＯＳ−
ＴＴおよびＯＳ−ＨＭＰはともに同様のレベルの抗ＬＯＳＩｇＧを引き出した
。ＬＯＳ単独および複合体は、２回注射後に同様のレベルの抗ＬＯＳＩｇＧを
引き出した。しかしながら、ＬＯＳ単独は第3の注射後に、複合体より有意に大きい増大を引き出した。アジュバントを含入した両複合体の処方物は、それらの
免疫原性を有意に増強した。

【００９９】

【表６】

【０１００】 ^a 各群に関する１０匹のマウスに、５μｇの複合体、複合体＋リビアジュバント、ＬＯＳ、またはＯＳ、ＴＴおよびＨＭＰの混合物（各々５μｇ）を、３週
間間隔で３回皮下注射した。第1の注射後２週間目、そして第2のおよび第3の注射後１週間目に、血液試料を採取した。 ^b ＥＬＩＳＡ単位は25238株に対する参照血清を基礎にし、25238株からのＬＯＳをコーティング抗原として用いた。前免疫血清は、１（１〜２）ＵのＩｇＧ
および１ＵのＩｇＭを含有した。

【０１０１】ＯＳ−ＴＴ複合体により引き出されたＴＴに対するマウス抗体応答を表７に示
す。ＩｇＧ抗体応答は、ＩｇＭ抗体応答よりはるかに強かった。アジュバントは
ＯＳ−ＴＴ２に関する免疫応答を有意に増強したが、しかしＯＳ−ＴＴ１に関し
ては効果は劇的には示されなかった。

【０１０２】

【表７】

【０１０３】 ^a 表６の脚注ａ参照 ^b ＥＬＩＳＡ単位はＴＴに対する参照血清を基にし、ＴＴをコーティング抗原として用いた。前免疫血清は、＜１単位のＩｇＧまたはＩｇＭを示した。

【０１０４】ＯＳ−ＨＭＰ複合体により引き出されたＨＭＰに対するマウス抗体応答を表８
に示す。ＴＴ抗体応答と同様、ＩｇＧレベルは有意に増大したが、一方、ＩｇＭ
レベルは低いままであった。アジュバントの存在は、表７で示したＴＴ抗体応答
に関するよりもはるかに大きく、ＩｇＧ抗体応答を劇的に増大した。

【０１０５】

【表８】

【０１０６】 ^a 表６の脚注ａ参照 ^b ＥＬＩＳＡ単位はＨＭＰに対する参照血清を基にし、ＨＭＰをコーティング抗原として用いた。前免疫血清は、１〜３単位のＩｇＧまたはＩｇＭを示した
。

【０１０７】複合体により引き出されたＭ．カタラリスＬＯＳに対するウサギ抗体応答を、
表９に示し、複合体により引き出されたＴＴまたはＨＭＰに対するウサギ抗体応
答を表１０に示す。

【０１０８】

【表９】

【０１０９】 ^a 各群に関する２〜３羽のウサギを、５０μｇの複合体、複合体＋リビアジュバント、ＬＯＳ、またはＯＳ、ＴＴおよびＨＭＰの混合物（各々５０μｇ）で
、１ヶ月間隔で皮下および筋肉内注射で２回免疫処置した。各注射前および１４
日後に、血液試料を採取した。 ^b 表６の脚注ｂ参照。

【０１１０】

【表１０】

【０１１１】 ^a 表９の脚注ａ参照 ^b 表７および８の脚注ｂ参照。

【０１１２】マウスにおいては、ＯＳ−ＴＴまたはＯＳ−ＨＭＰの３回の注射後、１：８〜
１：６４の範囲で、同種Ｍ．カタラリス25238株に対する殺細菌活性を、ＯＳタンパク質複合体免疫処置血清は全く示さず、複合体（＋アジュバント）免疫処置
血清の４０％（マウス２０匹中８匹）が示した。ウサギでは、３７．５％（ウサ
ギ８羽中３羽）の複合体免疫処置血清が、ＯＳ−ＴＴまたはＯＳ−ＴＴ＋アジュ
バントの２回注射後に、１：２〜１：８の範囲で、同種25238株に対する殺細菌活性を示した。

【０１１３】本発明の特定の実施態様を詳細に記載してきたが、これらの実施態様は例示の
ためであって、本発明を限定するものではなく、本発明の真の範囲は特許請求の
範囲により規定されることが、当業者には明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】２〜３羽のウサギの群から得られたウサギ抗血清のＭ．カタラリス25238株に対する殺細菌力価を示すグラフであって、この場合、群の各成員は、ＬＯＳ（「
ＬＯＳ」）、複合体（「ｄＬＯＳ−ＴＴ」および「ｄＬＯＳ−ＨＭＰ」）または
アジュバントを含有する複合体（「ｄＬＯＳ−ＴＴ＋Ｒｉｂｉ」および「ｄＬＯ
Ｓ−ＨＭＰ＋Ｒｉｂｉ」）を用いて個別に２回ワクチン接種された。殺細菌力価
は、５０％より多い細菌殺害を引き起こす血清稀釈を基にした前免疫血清に関す
る値を上回る重畳増大として示され、各群に関して相乗平均（棒）および標準偏
差（棒上の線）として表される。Ｍ．カタラリス全細胞により引き出される高度
免疫血清の殺細菌力価は、１：１，６００であった。

【図２】Ｍ．カタラリス25238株のエーロゾル攻撃を用いたマウス肺クリアランスモデルにおける受動防御試験の略図である。４０匹のマウスを、ｄＬＯＳ−ＴＴに対
するウサギ抗血清または前免疫血清で免疫処置し、次に免疫処置の１８時間後に
エアロゾル小室によりＭ．カタラリスを投与した。投与後３および６時間目にマ
ウスを屠殺した。

【図３】図２に対する凡例に記載された受動防御試験の結果を示すグラフである。肺お
よび血液試料を分析のために収集した。ｙ軸は、肺当たりの細菌コロニー形成単
位（ＣＦＵ）を示す。第1の棒は対照群を示し、第2の群はワクチン群を示す。投
与後３時間目に、ワクチン群中の細菌量は、対照と比較して５０％低減した。投
与後６時間では、対照群と比較して、ワクチン群に６１％の低減が認められた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｐ // Ａ６１Ｐ 27/16 Ａ６１Ｐ 27/16 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4C085 AA03 AA04 AA13 AA21 AA22 AA25 BA34 BA51 BA89 BB11 EE06 4C090 AA01 AA02 AA09 BA76 BA97 BB99 BC25 CA41 DA09 DA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】モラクセラカタラリス(Moraxella catarrhalis）から単離
され、そしてエステル化脂肪酸を除去して解毒化されたリポオリゴ糖（ｄＬＯＳ
）を生成するよう処理することにより、またはリピドＡを除去してオリゴ糖（Ｏ
Ｓ）を生成するよう処理することにより、解毒化されたリポオリゴ糖（ＬＯＳ）
、およびそれと共有結合した免疫原性担体を含む、モラクセラカタラリスに対
する複合体ワクチン。
【請求項２】免疫原性担体がタンパク質である請求項１記載のワクチン。
【請求項３】免疫原性担体タンパク質が、Ｍ．カタラリス(M. catarrhali
s)から単離されたＵｓｐＡ、Ｍ．カタラリスから単離されたＣＤ、破傷風毒素／
トキソイド、分類不可能なヘモフィルスインフルエンザ(Haemophilus influen
zae)から単離された高分子量タンパク質（ＨＭＰ）、ジフテリア毒素／トキソイ
ド、解毒化されたＰ．アエルギノサ（P. aeruginosa）毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、クロストリジウムパーフリンゲンス(Clo
stridium perfringens)外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、ＣＲＭ、ＣＲＭ₁₉₇、ＣＲＭ₃₂₀₁、ならびに呼吸器シンシチウムウイルスＦおよびＧタンパク質から成る群から選択され
る請求項２記載のワクチン。
【請求項４】免疫原性担体タンパク質が破傷風トキソイドまたはＨＭＰで
ある請求項３記載のワクチン。
【請求項５】薬学的に許容可能な担体中に請求項１記載のワクチン複合体
を含む製剤組成物。
【請求項６】アジュバントをさらに含む請求項５記載の製剤組成物。
【請求項７】アジュバントがモノホスホリルリピドＡおよびトレハロース
ジミコレートまたはミョウバンの混和物である請求項６記載の製剤組成物。
【請求項８】免疫原性担体がリンカー化合物を介してｄＬＯＳまたはＯＳ
と共有結合する請求項１記載の複合体ワクチン。
【請求項９】リンカー化合物が、アジピン酸ジヒドラジド、ε−アミノヘ
キサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトンお
よびｐ−ニトロフェニルエチルアミンから成る群から選択される請求項８記載の
複合体ワクチン。
【請求項１０】リンカー化合物がアジピン酸ジヒドラジドである請求項８
記載の複合体ワクチン。
【請求項１１】モラクセラカタラリスから単離され、それからエステル
結合脂肪酸を除去することにより解毒されたリポオリゴ糖。
【請求項１２】リポオリゴ糖が単離されるモラクセラカタラリスが、モ
ラクセラカタラリスの精製菌株である請求項１１記載のリポオリゴ糖。
【請求項１３】モラクセラカタラリスから単離され、それからリピドＡ
を除去することにより解毒されたリポオリゴ糖。
【請求項１４】哺乳動物においてモラクセラカタラリスの感染により引
き起こされる中耳炎の予防方法であって、モラクセラカタラリスから得られる
単離されたリポオリゴ糖から得られる解毒化されたリポオリゴ糖（ｄＬＯＳ）ま
たはオリゴ糖（ＯＳ）、ならびにｄＬＯＳと共有結合した免疫原性担体を含む有
効免疫防御量の複合体ワクチンを哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１５】哺乳動物がヒトである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】複合体ワクチンが非経口的に投与される請求項１４記載の
方法。
【請求項１７】複合体ワクチンが筋肉内注射、皮下注射により、または鼻
腔内粘膜上に沈着することにより、あるいはそれらの組合せにより投与される請
求項１６記載の方法。
【請求項１８】有効免疫防御量が約１０μｇ〜約５０μｇ／用量である請
求項１４記載の方法。
【請求項１９】さらに約１０μｇ〜約２５μｇの複合体の追加注射を含む
請求項１４記載の方法。
【請求項２０】投与工程が約１〜約５０μｇの複合体ワクチンの第１の用
量を投与し、次に第１の用量の約２ヶ月後に約１０μｇ〜約２５μｇの複合体ワ
クチンの第２の用量を投与し、第２の用量の約２ヶ月後に約１０μｇ〜約２５μ
ｇの第３の用量を投与し、そして第３の用量の約１２ヶ月後に約１０μｇ〜約２
５μｇの第４の用量を投与することを含む請求項１４記載の方法。
【請求項２１】単離されたＬＯＳからエステル結合脂肪酸を除去すること
を含む、モラクセラカタラリスから単離されたリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を解毒
する方法。
【請求項２２】エステル結合脂肪酸がヒドラジンまたは緩アルカリ性試薬
によるＬＯＳの処理により除去される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】モラクセラカタラリスに対する複合体ワクチンの製造方
法であって、以下の：モラクセラカタラリスから単離されるリポオリゴ糖（ＬＯＳ）からエス
テル結合脂肪酸を除去して解毒化されたＬＯＳ（ｄＬＯＳ）を生成し、そしてｄＬＯＳを免疫原性担体と共有結合させる工程を含む方法。
【請求項２４】除去工程がＬＯＳをヒドラジンまたは緩アルカリ性試薬で
処理することを含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】結合工程がｄＬＯＳをリンカー化合物と結合させ、そして
リンカー化合物を免疫原性担体と結合させることを含む請求項２３記載の方法。
【請求項２６】リンカー化合物が、アジピン酸ジヒドラジド、ε−アミノ
ヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトン
またはｐ−ニトロフェニルエチルアミンである請求項２５記載の方法。
【請求項２７】リンカー化合物がアジピン酸ジヒドラジドである請求項２
５記載の方法。
【請求項２８】アジュバントを免疫原性担体に結合されたｄＬＯＳに加え
ることをさらに含む請求項２３記載の方法。
【請求項２９】モラクセラカタラリスに対する複合体ワクチンの製造方
法であって、以下の：Ｍ．カタラリスから単離されたリポオリゴ糖（ＬＯＳ）からリピドＡを除
去してオリゴ糖（ＯＳ）を生成し、そしてＯＳを免疫原性担体と共有結合させる工程を含む方法。
【請求項３０】除去工程がＬＯＳを酸性試薬で処理することを含む請求項
２９記載の方法。
【請求項３１】結合工程がＯＳをリンカー化合物と結合させ、そしてリン
カー化合物を免疫原性担体と結合させることを含む請求項２９記載の方法。
【請求項３２】リンカー化合物が、アジピン酸ジヒドラジド、ε−アミノ
ヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトン
またはｐ−ニトロフェニルエチルアミンである請求項３１記載の方法。
【請求項３３】リンカー化合物がアジピン酸ジヒドラジドである請求項３
２記載の方法。
【請求項３４】アジュバントを免疫原性担体に結合されたＯＳに加えるこ
とをさらに含む請求項２９記載の方法。
【請求項３５】哺乳動物におけるＭ．カタラリスの感染により引き起こさ
れる中耳炎を予防するのに用いるための、Ｍ．カタラリスから単離され、そして
エステル化脂肪酸を除去して解毒化ＬＯＳ（ｄＬＯＳ）を生成するよう処理する
ことにより、またはリピドＡを除去してオリゴ糖（ＯＳ）を生成するよう処理す
ることにより解毒されたリポオリゴ糖（ＬＯＳ）、およびそれと共有結合した免
疫原性担体を含む複合体ワクチン。
【請求項３６】免疫原性担体がタンパク質である請求項３５記載のワクチ
ン。
【請求項３７】免疫原性担体タンパク質がＭ．カタラリスから単離された
ＵｓｐＡ、Ｍ．カタラリスから単離されたＣＤ、破傷風毒素／トキソイド、分類
不可能なヘモフィルスインフルエンザ(Haemophilus influenzae)から単離され
た高分子量タンパク質（ＨＭＰ）、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒化Ｐ．ア
エルギノサ（P. aeruginosa）毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、クロストリジウムパーフリンゲンス(Clostridium perfringens) 外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ
７タンパク質、ＣＲＭ、ＣＲＭ₁₉₇、ＣＲＭ₃₂₀₁および呼吸器シンシチウムウイルスＦおよびＧタンパク質から成る群から選択される請求項３６記載のワクチン
。
【請求項３８】免疫原性担体タンパク質が破傷風トキソイドまたはＨＭＰ
である請求項３７記載のワクチン。