JP2002508761A

JP2002508761A - VODETELLA PERTUSSIS Pili-Containing Vaccination Conjugates and BORDETELLA PERTUSSIS Antigen as Carrier in Oral Vaccines

Info

Publication number: JP2002508761A
Application number: JP50400699A
Authority: JP
Inventors: ヘンリーファラー，グラハム; ヒュージョーンズ，デイビッド
Original assignee: マイクロバイオロジカルリサーチオーソリティ
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-22
Publication date: 2002-03-19
Also published as: AU8119498A; CA2294348A1; GB9713156D0; WO1998058668A3; EP1005367A2; AU731216B2; WO1998058668A2

Abstract

(57)【要約】ワクチン接種結合体は、Bordetella pertussisの線毛、百日咳毒素、百日咳トキソイド、および百日咳69kDタンパク質より選択されるキャリアと結合体化した抗原を含有する。結合体はまた、第１の抗原と異なる第２の抗原を含有し得る。経口ワクチン接種組成物は、Bordetella pertussisの線毛、または線毛−抗原結合体を含有する。 (57) [Summary] The vaccination conjugate contains an antigen conjugated to a carrier selected from Bordetella pertussis pili, pertussis toxin, pertussis toxoid, and pertussis 69 kD protein. The conjugate may also contain a second antigen different from the first antigen. The oral vaccination composition contains Bordetella pertussis pili, or pili-antigen conjugates.

Description

【発明の詳細な説明】 BORDETELLA PERTUSSIS 線毛を含有するワクチン接種結合体および経口ワクチンにおけるキャリアとしてのBORDETELLA PERTUSSIS抗原本発明は、Bordetella pertussis抗原を含有するワクチン、結合体ワクチン、キャリアと免疫成分を結合体化してワクチン結合体を形成する方法、ならびにヒトおよび動物にワクチン接種するための結合体ワクチンの使用、また百日咳に対する経口ワクチンに関する。重篤な侵襲性疾患を引き起こす多くの病原性細菌は、本質的に毒性成分である糖質莢膜を有する。糖質莢膜は、潜在的なワクチン成分である。なぜなら、それらに対して指向する抗体は、補体に媒介される殺菌性活性によって、通常は防御性であるからである。糖質に対して産生された抗体は、糖質が得られた特定の血清型に対して特異的である；Haemophilus influenzaeについての１つの主要な病原性血清型、Neisseria meningitidisについての４つの主要な血清型、およびSt reptococcus pneumoniaeについての80を超える血清型が存在する。莢膜ワクチンの主要な不利な点は、糖質がＴ細胞非依存性の抗原であり、それ故、糖質が引き起こす免疫応答が低く（特に小児において）、持続時間が短く、追加免疫ができず、そして成熟しない親和性を有することである。抗原は、免疫応答を増強するタンパク質との結合体化によってＴ細胞依存性（記憶応答の提供を含む）に変換され得る。 Haemophilus influenzae b型（Hib）の莢膜多糖タンパク質結合体化ワクチンを用いる免疫は、幼児においてHib疾患に対する防御を付与することが実証された。これは、例えば、Neisseria meningitidis、およびStreptococcus pneumoni aeでの小児の感染の制御のために、同様の小児科のワクチン戦略の導入を支持する説得力のある議論である。しかしこれらの新たなワクチンは抗原の複雑な混合物である。Hibワクチン接種の導入の間に有害な抗原の相互作用および処方技術の制限に遭遇した。新たなワクチンが、確立された小児科の免疫プログラムにおいて導入される場合、これらの問題は悪化するにすぎないようである。多糖に対する小児免疫は、Ｔ細胞依存性の機構を介してのみ作動するという事実から問題が生じ、従ってこのタイプのワクチンはキャリアタンパク質との結合体化を必要とする。現在のところ、ヒトでの使用のための利用可能な唯一のキャリアタンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）または遺伝的にトキソイド化されたジフテリア毒素（ＤＴ）である。これらのキャリアの増加する使用は、これらに対する前から存在している免疫（生涯の初期に受動的に移行した母性抗体、または既存のワクチンに対する免疫学的記憶のいずれかを介して生じ得る）が糖質部分に対する免疫応答に悪影響を与え得ることの証拠が存在するので、不可能かもしれない。そのような相互作用は、初期免疫および追加免疫適用のそれぞれのための、現在の多糖結合体ワクチンの有効性を明らかに減少させ得る。従って、既存のトキソイドキャリアの拡大した使用は、ジフテリア／破傷風の過剰負荷を生じ、そしてトキソイドと結合体化した糖質に対する免疫応答を減少させるという問題が存在する。さらに、トキソイドはその免疫学的特徴を変化させ得る解毒を必要とする。キャリアとして産生された外膜タンパク質は、上記の問題を有さないが、それらは特徴付けが難しい複雑な混合物であり、そして混合物間において組成が変化する。別の困難さは、小児科の免疫のためのワクチンの増加する数と複雑さの実用性に関連する。ワクチン製造業者は、１つの注射器から同時に送達され得る小児科ワクチンの組み合わせの産生（従って免疫プログラムの単純化）において成功している。現在の処方物およびアジュバント技術を使用するワクチンの組み合わせ中の成分の範囲を拡大することは、今やますます技術的に困難である。ますます複雑になるワクチン接種プログラムの対応する問題の全てをともなう複数回の注射の再導入の予測は、適切な別の送達系（例えば、粘膜表面）が導入されなければ生じるようである。従って、代わりのキャリアタンパク質が新規のまたは第２世代の結合体ワクチンの導入のために必要とされることが、一般に認識されている。本発明の目的は、今までに遭遇した問題および潜在的問題の改善または減少をともなう、既存のトキソイドベースのワクチンと並行してまたは引き続き使用され得る結合体中の免疫原性糖質の提示のための結合体ワクチンを提供することである。さらなる目的は、結合体ワクチンの製造のための、既存のトキソイドキャリアに代わるキャリアタンパク質を提供することである。なおさらなる目的は、単一のワクチン処方物において１つより多い病原体に対するワクチン接種のために使用され得るワクチンを提供することである。従って、本発明の第１の局面は、(i)Bordetella pertussisの線毛、(ii)百日咳毒素、(iii)百日咳トキソイド、および(iv)百日咳69kDタンパク質から選択されるキャリアと結合体化した抗原を含有する、ワクチンにおける使用のための結合体を提供する。抗原は、適切には、病原性細菌またはウイルスの抗原性成分であり、この文脈において、「抗原」は病原性細菌またはウイルスの抗原性成分の、改変体、誘導体およびフラグメントを含み、その結果、抗原を用いる免疫はその病原性生物体に対する防御免疫を生じることが、理解される。 Bordetella pertussisの線毛は、Bordetella pertussisの培養物から精製され得るか（例えば、EP-A-0231083は、百日咳抗原の精製を記載する）、または組換え技術によって生成され得る。そして結果的に、Bordetella pertussisの線毛に対する論及は、天然の線毛の精製によって得られるか、線毛をコードするＤＮＡの組換え発現によって得られる線毛の論及として理解されるべきであり、そしてまた、論及がBordetella pertussisの線毛の改変体、誘導体またはフラグメントであるとして認識されるにもかかわらず、線毛の改変体、誘導体およびフラグメントを含むことがまた理解される。なぜならそのような改変体、誘導体またはフラグメントでの免疫は、Bordetella pertussisのチャレンジに対する防御的な抗体の誘導をもたらすからである。10μg〜50μgの範囲の線毛の量が代表的なワクチン接種の用量である。 B．pertussisより単離された線毛の精製および特徴付けはまた、ZhangらのInf ection and Immunity，1985年５月、422〜427頁、およびRobinsonらのVaccine、７巻、1989年8月、312頁（前出）によって記載されている。組換え線毛の生成は、Mol．Microbiol.、1990年1月、4(1)巻、39〜47頁、およびInfect．Immun.、1991年5月、59(5)巻、1739〜1746頁において記載される。抗原のキャリアとの結合体化は、従来の手段によって達成される。本発明の実施態様において、キャリアはC6スペーサーを用いて抗原と結合体化され、ここで線毛はまず誘導体化され、そして次に抗原溶液に添加される。また、必要に応じて、抗原はまず誘導体化され、そしてこれは抗原が誘導体化条件（代表的にpHにおける変化を含む）によって損傷を受けやすい場合に有利で有り得る。代表的には、２つをともに連結するように、抗原とタンパク質との結合体化のために二官能性の基が導入される。本発明の使用において、動物は、免疫原性結合体を含有するワクチンを用いて免疫され、そして結合体の抗原性成分が由来する病原性生物体によるチャレンジに対して防御される。この意味において、防御は、病原性生物体の致死用量を用いるチャレンジに対する生存によってか、またはそのような致死用量を用いるチャレンジに対する延長された平均余命によって認められる。防御はまた、百日咳の致死用量を下回るチャレンジに続く、影響の少ない、より病気でない患者によって、認められる。本発明は、Ｔ細胞エピトープと組み合わせた抗原の提示のための免疫原性結合体の調製のための代替的なキャリア分子を提供するにおいて、有利である。本発明の免疫原性結合体に対する免疫応答は、単離された抗原に対する免疫応答と比較して、増強される。従って、抗原単独によるワクチン接種に比べて有効性を改善する。本発明はまた、既存のトキソイドキャリアの代わりを提供し、従って、これらトキソイドを含有するワクチンの拡張されたそして反復する使用にともない生じ得るトキソイド過剰負荷の問題を克服する。結合体の成分として百日咳線毛を使用するさらなる利点は、ワクチン中への取込みの前の解毒を必要としないということである。当該分野で使用されるジフテリアおよび破傷風毒素のために必要とされる解毒は、タンパク質の免疫原性特徴を変化し得る。なおさらなる利点は、Bordetella pertussis由来の線毛はまた、小児科において関連する病原体であるBordetella pertussisに対する突出した免疫性を与えるか、または増強し、従って、線毛を含有する結合体が二重の免疫応答を誘導することである。既存の小児科の免疫プログラムは、DTPワクチンを用いる免疫を含み、これは単一のワクチンにおいてジフテリア、破傷風および百日咳に対する防御を与える。本発明は第４の成分（この第４の成分は、例えば、Haemophilus influenzaeに対する免疫性を与える抗原であり得る）を、百日咳および第４の病原性生物体の両方に対する免疫を与える本発明に従う結合体ワクチンを取り込むことにより、この３成分ワクチン中に取り込む可能性を開く。百日咳トキソイドは、本発明の結合体のさらなる代替的成分であり、先行技術のキャリアを用いて経験される破傷風／ジフテリアトキソイドの過剰負荷の危険性に寄与することなく、抗原キャリアとして作用する潜在能力を提供する。百日咳トキソイドはまた、抗原および百日咳それ自体の両方に対するワクチン接種を提供する。別の代替的キャリアである百日咳毒素は、患者への投与前に非毒性化させるために、必要に応じて変性またはそうでなければ処理される。この工程は、抗原との結合化前か、または結合体化後に行われ得る。あるいは、毒素は低い非毒性用量にて、結合体ワクチンにおいて使用される。別の代替的キャリアである69kDタンパク質は、必要に応じて培養物からの精製によってか、または組換え手段によって精製される。そして69kDタンパク質に対する論及は、インタクトタンパク質の実質的な免疫原性を保持するタンパク質の改変体、誘導体およびフラグメントを含むと理解される。本発明の結合体は、記載したように、抗原を含む。抗原の供給源または性質は、任意の特定のサブグループの抗原に限定されず、そして実際に、単離状態の抗原は免疫原性ではなく、本発明の結合体に組み込まれた抗原のみが免疫原性になることが可能である。適切な抗原としては、糖質、多糖類、単糖類、オリゴ糖類、タンパク質、ペプチド、糖ペプチド、リポ多糖、ならびに類似の分子および関連分子が挙げられる。代表的には、抗原は、細菌またはウイルスの外表面上に現れる細菌またはウイルスの成分(例えば、細菌細胞壁の成分、線毛(fimbria)もしくは線毛(cilia)もしくはべん毛の成分、またはウイルスの外側のエンベロープの成分(この具体的な例は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原である))であるか、またはそれに由来する。例示によって、抗原は、Bordetella bronchiseptica、Clostridium tetani、サイトメガロウイルス、デングウイルス、エプスタイン-バーウイルス、フラビウイルス、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型またはＥ型の肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、JEV、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、Mycobacteria tuberculosis、ロタウイルス、風疹ウイルス、TBE、Vibrio cho lerae、Haemohilus influenzae、Neisseria meningitidis、Streptococcus pneu moniae、Staphylococcus A、B.parapertussis、HIV、HPV、ポリオウイルス、Bru cella、Y.pestis、Helicobacter pylori、B.burgdorfeii、malariaおよびRSVの成分であるか、またはそれらに由来し得るが、本発明はこのサブグループの抗原にのみ限定して解釈されるべきではない。本発明の１つの実施態様において、抗原性結合体は、２つの異なる抗原と結合体化した、本発明のキャリア(例えば、Bordetella pertussisに由来する線毛)を含む。従って、この結合体は、百日咳、および線毛に結合体化した異なる抗原が得られるかまたは由来する２つの異なる病原性生物の各々に対する防御免疫を付与するかまたは増強することにおいて有用である。従って、本発明の免疫原性結合体は、必要に応じて、Meningococcal C多糖類、およびHib夾膜(capsular)糖質の両方が結合体化されたBordetella pertussisの線毛を含む。それゆえ、本発明のこの実施態様を使用して、３つの病原性生物に対する防御免疫を付与し得る。本発明のこの実施態様の利点は、複数の免疫が、単一のワクチン成分を介して付与され得、それによって個々のワクチンの混合物を調製する必要性を回避し、かつわずか１つの生物に対する防御免疫を付与するワクチンを使用して反復されそして複雑なワクチン接種スケジュールについての必要性を減少させる。本発明の実施態様は、抗原が都合良くカップリングされ得る複数位置を含む、長い多量体分子である線毛の物理的構造によって可能になる。本発明の結合体は、経口送達を含む多くの種々の経路を介する送達についての微小粒子への組み込みに適切である。このような微小粒子の調製は、EP-A-02661 19、EP-A-0333523およびEP-A-0706792に記載され、それらの内容は，本明細書中において参考として援用される。多くの異なる型のBordetella線毛が存在することは公知である。１つの型は、凝集原２を有し、そして約22,500ダルトンの分子量を有し、そして第２の型は、凝集原３を有し、約22,000ダルトンの分子量を有する。これらは、異なる血清型の百日咳において見出される傾向がある：凝集原２は、血清型1.2.0および1.2.3 において見出され、そして凝集原３は、血清型1.0.3および1.2.3において見出される。本発明のさらなる実施態様は、２つの免疫原性結合体の混合物を含み、各結合体は、同一の抗原または異なる抗原に結合体化された異なる型の百日咳線毛を含む。本発明はまた、(i)Bordetella pertussisの線毛、(ii)百日咳毒素、(iii)百日咳トキソイド、および(iv)百日咳69kDタンパク質、から選択されるキャリアと抗原との結合体を調製する方法を提供し、この方法は、キャリアの調製物を抗原調製物と組み合わせて抗原をキャリアに共有結合させる工程、および、その後、この混合物から結合体を取り出す工程を包含する。結合体は、キャリア分子において第１級アミン基に基づくので、抗原とキャリアとの結合体化は、これらのアミン基がキャリアの表面上で利用可能である場合はいつでも可能である。このような基の２つ以上が利用可能である場合、キャリア＋２つの抗原の結合体が可能である。以下の具体的な実施例に記載される方法の１つの実施態様において、凍結乾燥した線毛は、抗原溶液に溶解され、次いで、この溶液は、抗原と線毛との結合体化を可能にするように延長した時間にわたって低下した温度にて維持される。好ましくは、一定量の線毛は、酸性緩衝液に溶解され、安定化され、透析され、次いで凍結乾燥される。この抗原は、適切な緩衝液中で抗原を溶解することによって調製され、次いで、凍結乾燥した線毛は、その緩衝液に添加され、得られる混合物は、延長された時間にわたって透析され、次いで、この混合物は、凍結乾燥され免疫原性結合体が回収される。本発明はまた、本発明の免疫原性結合体の使用に関し、従って、本発明はまた、抗原が得られるかまたはそれに由来する病原性生物に対してハムスターまたは動物のワクチン接種のための医薬品の製造における本発明の結合体の使用を提供する。本発明はまた、本発明の結合体の免疫有効量をヒトまたは動物に投与する工程を包含するヒトまたは動物のワクチン接種方法を提供する。本発明の免疫原性結合体を組み込んでいるワクチンは、当該分野において標準的な技術に従って処方され得る。そしてこのワクチンは、当業者が精通している従来の薬学的に受容可能なキャリアおよび賦形剤を含み得る。本発明は、抗原と線毛とを結合体化する方法を提供している一方で、本発明の免疫原性結合体は、抗原とキャリア分子とを共有結合させるための任意の従来技術に従って調製され得、そして本発明は、これまで記載され、そして以下に例示される結合体化の特定の方法に制限されると解釈されるべきではない。ジフテリア、破傷風、および百日咳に対する免疫を提供するDTPワクチンの注射によって乳児にワクチン接種することは公知である。この経路によってワクチン接種することは、乳児およびその親の両方にとって快適ではなく、注射用処方物は、厳密に無菌であるという必要条件を満たしていなければならないという付随した問題がある。 Jones,D.H.ら、Infection and Immunity，1996年2月、489-494頁によって、B ．pertussis線毛の経口投与が感染を防御することが記載される。線毛は、投与前にマイクロカプセル化される。本発明の別の目的は、百日咳に対して注射されるワクチンの代替を提供することである。従って、本発明の第２の局面は、薬学的に受容可能なキャリア中にBo rdetella pertussisの線毛の経口処方物を含む、百日咳に対するワクチンを提供することである。線毛に対する参照の意義および範囲は、本発明の第１の局面と同様である。驚くべきことに、線毛の経口投与は、百日咳によるチャレンジに対して防御的な抗体の産生を生じ得ることが見出されている。これは、注射ワクチンに付随する問題を回避する。本発明はまた、線毛または線毛-抗原結合体を経口的に投与することによる百日咳に対するワクチン接種方法、および百日咳に対する経口ワクチン接種のための医薬品の製造における線毛または線毛-抗原結合体の使用を提供する。本発明の実施態様において、線毛または線毛-抗原結合体は、特定のキャリアとともに、代表的には、粒子の外側上に吸着されるか、またはそれに結合体化されて、処方される。PLGのようなポリマーおよび無機質粒子が使用され得る。好ましくは、Bordetella pertussis線毛は、直径10ミクロン以下の粒子上に吸着される。特に、直径10ミクロン以下の無機質粒子の懸濁液が適切である。経口投与後、線毛または線毛-抗原結合体を吸着させたこれらの粒子の取り込みは、腸においてパイアー斑を介して生じ得る。本発明の特定の実施態様において、以下でさらに詳細に記載されるように、経口ワクチン接種組成物は、本発明の線毛を吸着させたミョウバンのコロイド性懸濁液を含む。本発明のこれらの実施態様において、経口ワクチンは、線毛または線毛-抗原結合体以外の抗原性成分または免疫成分を実質的に含まなくともよい。ミョウバンは、周知のワクチンアジュバントであり、現在のところ、もっぱら注射によって使用される。本発明者らは、ミョウバン＋線毛が、経口によって与えられた場合、良好な免疫応答が得られることを見出した。生じた抗体応答は、防御を与えるために十分であり、この防御は、血清応答および粘膜応答の両方を含む。ワクチンの全身投与は、良好な血清応答、特にIgGを与えることが当該分野で公知である。本発明の第２の局面による経口ワクチン接種は、IgG応答および同様にIgA応答の両方を与えることが見出された。このことは意義深いことである。なぜなら、IgAは、大部分の病原体についての侵入点である粘膜表面に出現するからである。好ましくは、線毛を含む処方物の投与前またはそれと同時に、患者の胃は、予め中和される。その結果、酸によって活性化されるプロテアーゼは、ワクチン成分を破壊しない。これは、従来の酸を減少させて中和する医薬品を使用して達成され得る。必要に応じて、本発明のワクチンは、胃酸を中和するための有効量の化合物を含むように処方される。本発明の特定の実施態様において、以下に記載されるように、ワクチン接種組成物は、重炭酸緩衝液(特に8.2〜8.5の範囲のpH を有する、強度0.1Mの緩衝液)を使用して処方されるが、他の酸を中和する溶液もまた、本発明の組成物に適切であることが予測される。ワクチン処方物を投与する前に酸を中和する医薬品を投与することは、さらなる選択肢である。本発明のこの局面の使用において、動物は、本発明の処方物を経口的に投与され、必要に応じて、追加免疫量の、本発明の処方物を引き続いて投与される。そしてこのことによって、百日咳に対して防御される。連続的腸内容物試験プロセスの一部として、腸におけるＭ細胞が粒子状物質を取り込み、そしてその内容物はリンパ節を通過し、最終的に免疫応答の基礎を形成するマクロファージに取り込まれると考えられる。ミョウバン粒子は、Ｍ細胞中へと通過するので、免疫応答を導く連鎖に参加すると考えられる；しかし、本出願人らは、この理論に拘束されることは望まない。本発明の実施態様の経口ワクチンは、抗原提示細胞および線毛への通過または他の輸送について適合されるキャリアの懸濁液を含む。ミョウバンがキャリアである場合、注射用に当該分野で現在使用されている処方物は適切である。小児への投与のために、矯味・矯臭剤または甘味剤が、必要に応じて添加される。本発明の第２の局面のワクチンはまた、保存剤、または簡便な、室温保存のためにワクチンを凍結乾燥させることを補助する賦形剤を含む。以下は、図面によって例示された本発明の特定の実施態様の説明である。図１は、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、線毛(Fim)、または線毛-多糖類結合体(Fim Conj)を用いて０日目、14日目、および28日目に、免疫したマウスからの血清抗多糖類抗体応答を示し、そして42日目に特異的な抗多糖類抗体について試験した；図２は、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、線毛(Fim)、または線毛-多糖類結合体(Fim Conj)を用いて免疫したマウスからの血清抗線毛抗体応答を示し、そして 21日目に特異的な抗線毛抗体について試験した；図３は、リン酸緩衝化生理食塩水(未処置)、線毛(Fim)、または線毛-meningoc occal C多糖類結合体(Fim 1Conj)を用いて免疫し、引き続いてB.pertussisの10⁶ cｆｕ用量でチャレンジしたマウスの防御割合を示す；図４は、リン酸緩衝化生理食塩水(1)、線毛(2)、線毛-meningococcal C結合体 (3)またはACワクチン(4)を用いて免疫して35日目にNeisseria meningitidisでチャレンジ後の５匹のマウスの群あたりの生存数を示し、図4aは、10⁶CFUの細菌によるチャレンジ後の結果を示し、図4bは、10⁸cfuの細菌によるチャレンジ後の結果を示す；図５は、コントロール群(1)、および線毛免疫群(2)、線毛-多糖類結合体免疫群(3)および市販のACVaxワクチン(商標)免疫群(4)において10⁶CFU meningitisによるチャレンジ後の生存マウス数を示す；図６は、免疫後のインビトロでの殺菌力価を示す。説明文は、図５と同様；図７は、経口のミョウバンアジュバント化線毛によって惹起された外部分泌における抗線毛応答のグラフを示す：7a−糞便、7b−膣内洗浄物、7c−唾液；図８は、経口的に投与したミョウバンアジュバント化線毛によって惹起された平均防御のグラフを示す：および図９は、腹腔内または経口のミョウバンアジュバント化線毛によって惹起された血清中の抗線毛応答のグラフを示す。実施例１ Neisseria meningitidis血清型Ｃ多糖類の精製。本方法は、本質的にGotschlich，E．（1975）によって記載されるようなものである。群特異的な多糖類の精製、Monogr，Allergy 9，245-258。多糖類はL91 543系統から精製される（C2a P1.2R，Manchester Public Health Laboratoryより入手する）。細菌を、血液寒天プレート上で一晩増殖させ、そして250mlのコニカルフラスコ中の100mlのフランツ培地に接種し、そして７時間振とうしてインキュベートする。次いで、10mlの種培養物を、750mlフランツ培地を含むコニカルフラスコに接種し、37℃で一晩振とうしてインキュベートする。多糖類の精製。１．100mlの10％(w/v)ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTB）を、各々1L遠心ポットに加える。２．遠心ポットを、1Lまで培養物で満たし、室温で１時間静置させる。３．次いで、細菌および沈殿させた多糖類を、遠心分離（RC3B遠心分離機、50 00rpm、30分間）によって収集し、そして上清を捨てる。４．ペレットを約200mlの水で再懸濁し、ホモジナイズして滑面懸濁物を調製し、そして等容量の2M CaCl₂を添加する。これを、１時間攪拌してCTB複合体から多糖類を放出させる。５．無水エタノールを25％（v/v）まで添加してDNAを沈殿させ、そして90分間攪拌する。６．これを、25,000ｇで20分間遠心分離し、そして上清を保持する。７．エタノール濃度を80％（v/v）まで上昇させ、多糖類を沈殿させる。８．次いで、遠心分離（25,000ｇ、10分間）によって沈殿物を回収する。９．沈殿物を、無水エタノールで４回洗浄してCTBを除去し、そしてペレットをフェノール抽出のために準備したPBS中に再懸濁して、夾雑タンパク質を除去する。フェノール抽出。１．90％（w/v）フェノール溶液を、10ml沸騰水を添加し、そして56℃のウォーターバス中で融解することによって90ｇフェノールを溶解することによって調製する。２．PBSおよび90％フェノール中の多糖類を、1:1で混合し、室温で15分間周期的に渦巻きによって混合させる。３．混合物を、卓上遠心分離機で4100rpmで約15分間遠心分離する。４．上部の水相を除去し、4℃で保存する。５．フェノール層を、PBSで再抽出し、そして室温で15分間インキュベートする。上記のように遠心分離し、上部の水層を除去し、そして先の抽出物とともにプールする。６．水性抽出物を、0.1M CaCl₂に対して一晩透析し、残存しているフェノールを除去する。７．透析した多糖類を、100,000ｇで５時間遠心分離し、リポ多糖類をペレット化する。８．上清を保持し、３容量の無水エタノールを添加する。９．沈殿物を、遠心分離によって回収し、そして無水エタノールで洗浄する。１０．最終ペレットを35℃で乾燥させ、そして乾燥重量を記録する。髄膜炎菌の多糖類のBordetella pertussis線毛への結合。第１段階：アビジン酸ジヒドラジド（ADH）でのタンパク質の誘導体化１．10mgの線毛の重量を測定し、そして1mlの0.1Mクエン酸緩衝液、pH4.7中で溶解した。２．35mgのADHの重量を測定し、0.5mlのクエン酸緩衝液pH4.7中で溶解した。３．3.9mgの（1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）（EDC）の重量を測定し、0.5mlのクエン酸緩衝液pH4.7中で溶解した。４．溶液２を、溶液１に添加し、次いで溶液３を添加した。５．混合液を、20℃で３時間、ローラー上に置いた。６．混合液を、10mM炭酸水素アンモニウム緩衝液の数回の交換に対して4℃で7 2時間透析し、そして最終的に凍結乾燥させた。第２段階：多糖類の活性化および誘導体化タンパク質への結合１．HPLCグレードの無水アセトニトリル中で、25mg/mlのCNBr（臭化シアン）溶液を調製した。２．5mgの精製髄膜炎菌Ｃ多糖類の重量を測定し、そして1mlの4mM NaOH中で溶解した。溶液を、4℃で15分間、冷却した。３．20μLのCNBr溶液を多糖類溶液に添加し、そして混合液を4℃で6分間、穏やかに攪拌した。４．1mlの0.5M NaHCO₃を３．に添加し、そして混合液を、3mlの0.5M NaHCO₃に溶解した5mgの誘導体化した線毛に添加した。５．混合液を、4℃で16時間、ローラー上に置き、10mM炭酸水素アンモニウムに対して大規模に透析し、そして凍結乾燥させて、線毛-髄膜炎菌多糖類Ｃ結合体を産生する。多糖類への線毛の結合の方法は、Schneersonら（J．Exp．Med.，152，361-376 頁、1980、「Preparation，Characterisation and Immunogenicity of Haemophi lus Influenzae Type b Polyaaccharide-Protein Conjugates」）の方法から適合され、そして結合に先立ち、C6スペーサーで線毛を誘導体化することによって一貫した結合を達成することが見出された。線毛が誘導体化されることは本質的ではなく、その代わりに多糖類は誘導体化され得、そしてこれは時折、より不安定なタンパク質の過酷な条件（例えば、低 pHから高pH）への曝露を最小化し得る。髄膜炎菌感染のマウス腹腔内チャレンジモデル。成体マウス（6〜8週齢）を、0、14、28日目に多糖類結合体ワクチンで免疫し、次いで35日目に血清型Ｃ N．meningitidisでチャレンジする。チャレンジ用量（0.5ml）を、腹腔内注射によって与え、これは10⁶〜10⁸細菌および鉄デキストラン（2mg）を含む。2mg鉄デキストランのさらなる腹腔内注射をまた、24時間後のチャレンジで与える。各々のグループの生存しているマウスの数を、感染72時間後に記録する。殺菌性抗体アッセイ Neisseria meningitidis血清型Ｃ殺菌性アッセイのために使用される方法は、以下の例外を除いて、疫病管理予防センタープロトコール（Neisseria meningit idis血清型Ａ／Ｃ血清殺菌性アッセイ、Maslankaら、1995 CDC Atlanta，USA）に詳述されるのと本質的に同じである： N．meningitidis株GNを、血清型Ｃ殺菌性抗体の測定に使用する。 0.1％ウシ血清アルブミン（w/v）を有するHanks平衡塩溶液を、緩衝液として使用する。寒天「傾斜」法のみを、細菌の計数のために使用し得る。96ウェルアッセイプレートの各々のウェルから10μlを、BHI＋1％ウマ血清プレートに適用する。リン酸緩衝化生理食塩水、線毛または線毛-多糖類結合体を用いるマウスの免疫の結果を、図１および図２に図示する。図１は、リン酸緩衝化生理食塩水または線毛単独で免疫したマウスにおいて特異的な抗多糖類応答はなく、線毛と多糖類との結合体で免疫したマウスにおいては、有意な抗多糖類応答があり、一方、 IgA抗体は観察されなかったことを示す。図２は、線毛単独で免疫したマウスにおいて、および線毛と多糖類との結合体で免疫したマウスにおいてもまた、特異的な抗線毛抗体の存在を示す。図３は、pertussis線毛単独または線毛-多糖類結合体を用いる免疫に続いて、Bordetella pertussisによるチャレンジに対する効果的な保護が存在したことを示す。図４は、リン酸緩衝化生理食塩水、線毛、線毛-髄膜炎菌Ｃ多糖類または公知のワクチンを用いて免疫した５匹のマウスの群における生存個体の数を示す。図４ａは、チャレンジ24時間後、線毛-多糖類結合体で免疫した群はすべて生存し、一方リン酸緩衝化生理食塩水または線毛単独で免疫した群からは２匹のみが生存したことを示す。図４ｂにおいて、増加した数の細菌によるチャレンジ後（すなわち、上の表に示す10⁶に比較して10⁸）、リン酸灰分を提供する生理食塩水で、または線毛単独で免疫した群のいずれもが最初の24時間で生存せず、一方、線毛多糖類で免疫した４つの群は、最初の24時間生存したことが示される。実施例２髄膜炎菌Ｃ殺菌性アッセイマウスを、PBS（腹腔内注射）、線毛（10μg腹腔内注射）、線毛-多糖類結合体（10μgタンパク質＋10μg多糖類、腹腔内注射）または市販の髄膜炎菌ワクチン（ACVax、10μg多糖類、筋肉内注射）で免疫した。動物を、0、14、および28 日目に免疫した。動物を、致死量の10⁶cfuのN．meningitidisで35日目にチャレンジした。殺菌性アッセイを、以下のように前チャレンジ血清で行った。殺菌性アッセイプロトコール 96ウェルプレートにおいて、最終容量40μlの殺菌性アッセイ緩衝液（Geys平衡塩溶液中の5％ w/v BSA）中で熱不活化血清の連続希釈を作製する。10μlの8 ×10⁴cfuのN．meningitidisの懸濁液を各々のウェルに添加し、次に10μlの熱不活化幼ウサギ補体を添加する。37℃で1時間インキュベートし、次いで10μlの懸濁液を、各々のウェルから、1％ウマ血液を含むブレインハートインフュージョン寒天プレートにプレーティングする。一晩インキュベートし、そしてコロニーを計数する。殺菌力価を確認するために、適切なコントロールと比較する。これらは、＞50％の特異的補体媒介の細菌コロニーの殺傷を誘発する力価として定義される。結果チャレンジ48時間後までに、すべてのコントロール動物（PBSまたは線毛で免疫された動物）は死んだ。48時間目で、市販の髄膜炎菌ワクチンを与えられた5 匹のマウスのうち1匹が生存し、一方線毛-多糖類実験結合体ワクチンで免疫した 5匹のマウスのうち3匹が生存した（図５）。殺菌性アッセイの結果は、実験結合体ワクチンでのマウスの免疫は、市販のワクチンによって誘発された128の力価と比較して、インビトロ殺菌力価512を誘発することを示す（図６）。実施例３線毛の処方は以下の通りであった。経口投与の場合、線毛の３容量が、市販のミョウバンアジュバントの１容量で希釈される。10μgの線毛（20〜100μL）に等価な容量を、４容量の0.1M炭酸水素緩衝液（500μlの最大容量まで）で希釈され、これは8.2〜8.5のpHを有し、そして経口投与のために酸で中和されるように設計され、そして経口的なチューブによる投与のために適切である。腹腔内投与では、３容量の抗原が、１容量の市販のアジュバントで希釈され、そして10μg の線毛に等価な容量が注射される。線毛-多糖類結合体を含む処方物を、同様に調製した。実施例４実施例３に記載されるようなミョウバン処方物を、pertussis線毛と組み合わせて使用し、そして腹腔内または経口経路を介してマウスに投与し、そして経口の場合、腸の酸の事前の中和が存在した。結果を、図７、８、および９に図示する。図７は、線毛に対する抗体は、糞便（図７ａ）、膣洗浄液（図７ｂ）、および唾液（図７ｃ）においてIgG、IgMおよびIgAのクラスの抗体を含むことが見出された。図８は、線毛の経口投与を介する免疫（10μgの線毛を使用）は、B．pert ussisによるチャレンジからの保護を生じ、そして線毛の腹腔内投与によって提供される保護に匹敵したことを示す。血清における抗線毛応答を図９に示す；量において減少するが、経口投与後の血清応答は、それにもかかわらず顕著であった。実施例５微粒子における線毛および線毛−抗原結合体のカプセル化の方法装置：１）乳化スクリーンに適合した3/4''プローブを備えたSiverson実験室用ミキサー。２）高速遠心分離機。３）通常の実験室のガラス器具、ビーカー、メスシリンダー、スターラーなど。試薬：１）ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLG）溶液−3mlジクロロメタン中に400m g。２）PBS中の線毛溶液（1mg/ml）。３）ポリビニルアルコール（PVA）溶液（水中8％ w/v）方法：１）600μlの線毛溶液を3mlのPLG溶液に添加し、Silversonミキサー中で4000rpm 、２1/2分間乳化させる。２）この乳濁液を100ml PVAに添加し、室温で4000rpm、２1/2分間乳化させる。３）二重乳濁液を1リットルの水に添加して、1分間激しく攪拌する。４）微粒子の懸濁液を遠心容器中で分散させ、10,000×ｇ_avで30分間遠心分離する。５）微粒子ペレットを25mlの水中で再懸濁し、そして手動ホモジナイザーを用いて、広いクリアランス（0.5mm）でホモジナイズして、均質な懸濁液を作製する。200mlの水で希釈し、上記のように再遠心分離する。６）工程５および６を４回繰り返す。７）微粒子ペレットを上記のように25mlの水中で再懸濁し、凍結乾燥に適切な容器に移し、シェル凍結し、そして48時間、凍結乾燥させる。このようにして、経口投与または他のワクチン化組成物への組み込みのための、直径約2〜5μmの微粒子が得られた。本方法はまた、線毛-抗原結合体のカプセル化のために適切である。従って、この結果は、防御免疫がpertussis線毛と髄膜炎菌Ｃ多糖類との結合体を介して、Bordetella pertussisおよびNeisseria meningitidisの両方に対して生成され得ることを示す。本発明は、公知のトキソイド抗原キャリアに対する、さらなるそして代替的なキャリアを提供し、そして広範な免疫適用のための新規な結合体ワクチンの調製に有用である。線毛の経口投与は、pertussisに対する防御免疫を提供し、そして経口ワクチンの産生に適用される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION BORDETELLA PERTUSSIS Vaccination conjugate containing pili and BORDETELLA PERTUSSIS antigen as carrier in oral vaccine The present invention relates to a vaccine containing a Bordetella pertussis antigen, a conjugate vaccine, A method for conjugating a carrier and an immune component to form a vaccine conjugate; Use of conjugate vaccines to vaccinate animals and animals, and Oral vaccine. Many pathogenic bacteria that cause severe invasive disease are inherently toxic components Has a carbohydrate capsule. The carbohydrate capsule is a potential vaccine component. Because it Antibodies directed against them usually protect by complement-mediated bactericidal activity. Because it is sex. Antibodies raised against carbohydrates are specific to the blood from which they were obtained. Specific to the clear form; one major disease for Haemophilus influenzae The primary serotypes, the four major serotypes for Neisseria meningitidis, and St There are more than 80 serotypes for reptococcus pneumoniae. The major disadvantage of capsular vaccines is that carbohydrates are T-cell independent antigens, Therefore, the carbohydrate-induced immune response is low (especially in children), short-lived, No booster immunity and non-mature affinity. Antigen is immune T cell dependence (providing a memory response) by conjugation with a protein that enhances the response ). Haemophilus influenzae type b (Hib) capsular polysaccharide protein conjugate vaccine Has been demonstrated to confer protection against Hib disease in infants Was. This includes, for example, Neisseria meningitidis, and Streptococcus pneumoni Support the introduction of a similar pediatric vaccine strategy for the control of pediatric transmission in ae This is a compelling argument. But these new vaccines have a complex mix of antigens Things. Adverse antigen interactions and formulation techniques during the introduction of Hib vaccination Encountered restrictions. New vaccines are part of established pediatric immunization programs These problems only seem to get worse when introduced. Childhood immunity to polysaccharides only works through a T-cell dependent mechanism Indeed, problems arise, so this type of vaccine binds to carrier proteins Requires incarnation. At present, the only available capacities for human use Rear protein is tetanus toxoid (TT) or genetically toxoidized Diphtheria toxin (DT). The increasing use of these carriers Pre-existing immunity to maternal antibodies that have passively transitioned early in life, Or via any of the immunological memories of existing vaccines) Is there any evidence that it can adversely affect the immune response to the part? Maybe. Such an interaction is dependent on the initial and booster immunization applications, respectively. Can significantly reduce the effectiveness of current polysaccharide conjugate vaccines. Therefore, the expanded use of existing toxoid carriers will increase diphtheria / tetanus Causes overload and reduces the immune response to carbohydrates conjugated to toxoids There is the problem of making it work. In addition, toxoids alter their immunological characteristics Need detoxification. The outer membrane protein produced as a carrier is Having no problems, but they are complex mixtures that are difficult to characterize, and The composition changes between objects. Another difficulty is the practicality of the increasing number and complexity of vaccines for pediatric immunity is connected with. Vaccine manufacturers can deliver pediatrics simultaneously from one syringe Successful in producing vaccine combinations (and thus simplifying the immunization program) ing. Combinations of vaccines using current formulations and adjuvant technology Expanding the range of ingredients in it is now increasingly technically difficult. more and more Multiple injections with all of the corresponding issues of a complex vaccination program Prediction of reintroduction of radiation should be based on the introduction of another suitable delivery system (eg, mucosal surface). Seems to occur. Thus, an alternative carrier protein is a novel or second generation conjugate vaccine. It is generally recognized that this is required for the introduction of the application. It is an object of the present invention to improve or reduce the problems and potential problems encountered so far. With or alongside existing toxoid-based vaccines By providing a conjugate vaccine for the presentation of immunogenic carbohydrates in conjugates is there. A further objective is to use existing toxoid carriers for the production of conjugate vaccines. The purpose is to provide a carrier protein that replaces the rear. Yet a further purpose is For vaccination against more than one pathogen in a single vaccine formulation Is to provide a vaccine that can be used for Therefore, the first aspect of the present invention relates to (i) Bordetella pertussis fimbria, (ii) pertussis Selected from cough toxin, (iii) pertussis toxoid, and (iv) pertussis 69 kD protein For use in a vaccine containing an antigen conjugated to a carrier to be Provide coalescence. An antigen is suitably an antigenic component of a pathogenic bacterium or virus, in this context Wherein the "antigen" is a variant, derivative of an antigenic component of a pathogenic bacterium or virus Immunity with an antigen may be associated with the pathogenic organism It is understood that this results in protective immunity against Bordetella pertussis pili are purified from cultures of Bordetella pertussis. Obtain (eg, EP-A-0231083 describes purification of pertussis antigen) or recombinant It can be generated by different technologies. And, consequently, Bordetella pertussis An argument for this is obtained by purification of natural pili or DNA encoding pili. Should be understood as a reference to pili obtained by recombinant expression of In addition, a modified, derivative or fragment of a pilus of Bordetella pertussis Variants, derivatives and fragments of pilus, despite being recognized as It is also understood to include Because such variants, derivatives or Immunity with fragments provides a protective defense against Bordetella pertussis challenge This is because it induces the body. Typical amounts of pili in the range of 10 μg to 50 μg This is the dose of chin inoculation. B. Purification and characterization of pili isolated from pertussis is also described by Zhang et al., Inf. Section and Immunity, May 1985, pp. 422-427, and Robinson et al., Vaccine, 7, August 1989, p. 312 (supra). The production of recombinant fimbria is described in Mol. Microbiol., January 1990, 4 (1), pp. 39-47, and And Infect. Immun., May 1991, 59 (5), pp. 1739-1746. Conjugation of the antigen to the carrier is accomplished by conventional means. The present invention In embodiments, the carrier is conjugated to the antigen using a C6 spacer, wherein The pili are first derivatized and then added to the antigen solution. Also as needed Thus, the antigen is first derivatized, and this is because the antigen is derivatized under conditions (typically pH (Including changes in the dynamics). Typically Is a dual agent for conjugation of the antigen and the protein so that the two are linked together. A functional group is introduced. In the use of the present invention, animals are immunized with a vaccine containing the immunogenic conjugate. Challenge by a pathogenic organism immunized and from which the antigenic component of the conjugate is derived Protected against In this sense, protection uses a lethal dose of the pathogenic organism. Or by using such a lethal dose Recognized by prolonged life expectancy for a challenge. Defense is also pertussis For less influential, less ill patients following a sublethal challenge It is recognized. The present invention relates to immunogenic binding for presentation of antigen in combination with T cell epitopes It is advantageous to provide alternative carrier molecules for body preparation. Departure The immune response to the bright immunogenic conjugate is comparable to the immune response to the isolated antigen. In comparison. Therefore, efficacy is improved compared to vaccination with antigen alone. To improve. The present invention also provides an alternative to existing toxoid carriers, thus With the extended and repeated use of vaccines containing these toxoids Overcome the problem of possible toxoid overload. A further advantage of using pertussis pili as a component of the conjugate is the incorporation into vaccines. Does not require detoxification prior to ingestion. Gifte used in the field Detoxification required for rear and tetanus toxins is an immunogenic feature of the protein Can be changed. A still further advantage is that pili from Bordetella pertussis also Outstanding immunity to Bordetella pertussis, a related pathogen in pediatrics Conjugates that confer or enhance epidemiology and, thus, contain fimbriae To elicit the answer. Existing pediatric immunization programs include immunization with the DTP vaccine, which Provides protection against diphtheria, tetanus and pertussis in a single vaccine . The present invention relates to a fourth component (the fourth component is, for example, Haemophilus influenzae). Antigens that confer immunity), both pertussis and the fourth pathogenic organism By incorporating a conjugate vaccine according to the invention that confers immunity against Open the possibility of incorporation into a three component vaccine. Pertussis toxoid is a further alternative component of the conjugates of the present invention and Risk of tetanus / diphtheria toxoid overload experienced with different carriers Provides the potential to act as an antigen carrier without contributing to gender. One hundred days Cough toxoids may also be vaccinated against both the antigen and pertussis itself. provide. Another alternative carrier, pertussis toxin, is to render it non-toxic prior to administration to patients. To be modified or otherwise treated as necessary. This step involves the Can be performed prior to conjugation or after conjugation. Alternatively, toxins are for low non-toxicity Used in conjugate vaccines in quantities. Another alternative carrier, the 69 kD protein, can be purified from culture as needed. Or by recombinant means. And for the 69kD protein The implications of a protein that retains the substantial immunogenicity of an intact protein It is understood to include variants, derivatives and fragments. The conjugates of the invention include an antigen, as described. The source or nature of the antigen Is not limited to any particular subgroup of antigens, and in fact, The antigen is not immunogenic, only the antigen incorporated in the conjugate of the invention becomes immunogenic. It is possible to Suitable antigens include carbohydrates, polysaccharides, monosaccharides, oligosaccharides, proteins, pep Includes tides, glycopeptides, lipopolysaccharides, and similar and related molecules . Typically, the antigen is a bacterium or virus that appears on the outer surface of the bacterium or virus. Russ components (e.g., bacterial cell wall components, fimbria or cilia) Or the components of the flagella or the outer envelope of the virus (this An example is the surface antigen of hepatitis B virus))) or derived therefrom. . By way of example, the antigen may be Bordetella bronchiseptica, Clostridium tetani, Cytomegalovirus, dengue virus, Epstein-Barr virus, flavi C Virus, hepatitis virus of type A, B, C, D or E, herpes simplex Rus, influenza virus, JEV, measles virus, mumps virus , Mycobacteria tuberculosis, rotavirus, rubella virus, TBE, Vibrio cho lerae, Haemohilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneu moniae, Staphylococcus A, B. parapertussis, HIV, HPV, poliovirus, Bru cella, Y.pestis, Helicobacter pylori, B.burgdorfeii, malaria and RSV The present invention is directed to antigens of this subgroup, which may be Should not be construed as limiting only to In one embodiment of the invention, the antigenic conjugate binds to two different antigens Embody, the carrier of the present invention (for example, pili derived from Bordetella pertussis) Including. Thus, this conjugate will have pertussis, and different antigens conjugated to pili Protective immunity against each of two different pathogenic organisms obtained or derived Useful in providing or enhancing. Accordingly, the immunogenic results of the present invention Coalescence is optionally with Meningococcal C polysaccharide and Hib capsular carbohydrate Both contain conjugated Bordetella pertussis pili. Therefore, the present invention Can be used to confer protective immunity against three pathogenic organisms. An advantage of this embodiment of the present invention is that multiple immunizations are delivered via a single vaccine component. And thereby avoid the need to prepare mixtures of individual vaccines, Repeated using a vaccine that confers protective immunity to just one organism And reduce the need for complex vaccination schedules. Of the present invention Embodiments include long multimers comprising multiple positions to which antigens can be conveniently coupled. This is made possible by the physical structure of the pili, which is a molecule. The conjugates of the invention can be used for delivery via many different routes, including oral delivery. Suitable for incorporation into microparticles. The preparation of such microparticles is described in EP-A-02661. 19, EP-A-0333523 and EP-A-0706792, the contents of which are described herein. Incorporated as a reference. It is known that there are many different types of Bordetella pili. One type is Having an agglutinogen 2 and a molecular weight of about 22,500 daltons, and a second type comprising: It has an agglutinogen 3 and a molecular weight of about 22,000 daltons. These are different serotypes Tend to be found in pertussis: Agglutinin 2 is serotype 1.2.0 and 1.2.3 And agglutinin 3 was found in serotypes 1.0.3 and 1.2.3. It is. A further embodiment of the invention comprises a mixture of two immunogenic conjugates, each comprising Conjugates are different types of pertussis pili conjugated to the same or different antigens including. The invention also relates to (i) Bordetella pertussis pili, (ii) pertussis toxin, (iii) pertussis A carrier selected from cough toxoid, and (iv) pertussis 69 kD protein, A method for preparing a conjugate with a drug is provided, wherein the method comprises preparing a carrier preparation from an antigen. Covalently attaching the antigen to the carrier in combination with the product, and then Removing the conjugate from the mixture. The conjugate is attached to the carrier molecule Conjugates between the antigen and the carrier, these amino groups are based on primary amine groups. It is possible whenever a functional group is available on the surface of the carrier. like this When two or more of the groups are available, a conjugate of the carrier + two antigens is possible is there. In one embodiment of the method described in the specific examples below, The pilus is dissolved in an antigen solution, and then the solution is And maintained at a reduced temperature for an extended period of time to allow for Good Preferably, a certain amount of pili is dissolved in an acidic buffer, stabilized, dialyzed, and And freeze-dried. This antigen is obtained by dissolving the antigen in a suitable buffer. Prepared and then freeze-dried pili are added to the buffer and the resulting mixture The mixture is dialyzed for an extended period of time and then the mixture is lyophilized The immunogenic conjugate is recovered. The present invention also relates to the use of the immunogenic conjugates of the invention, so that the invention also relates to Hamster or against pathogenic organisms from which the antigen is obtained or derived Provided is the use of a conjugate of the invention in the manufacture of a medicament for vaccination of an animal. I do. The present invention also provides administering to a human or animal an immunologically effective amount of a conjugate of the invention. A method of vaccinating a human or animal is provided. Vaccines incorporating the immunogenic conjugates of the invention are standard in the art. May be prescribed according to standard techniques. And this vaccine is familiar to those skilled in the art It can include conventional pharmaceutically acceptable carriers and excipients. The present invention provides a method for conjugating an antigen and pili, while Immunogenic conjugates are any conventional technique for covalently linking an antigen and a carrier molecule. The present invention has been described and illustrated below. It should not be construed as limited to the particular method of conjugation performed. DTP vaccine injection provides immunity to diphtheria, tetanus, and pertussis It is known to vaccinate infants by shooting. Wakuchi by this route Immunization is not comfortable for both infants and their parents, The material must meet the requirements of being strictly sterile. There is a problem. B. By Jones, D.H. et al., Infection and Immunity, February 1996, pp. 489-494. . It is described that oral administration of pertussis pili protects against infection. Fimbria is administered Before microencapsulation. Another object of the present invention is to provide an alternative to vaccines injected against pertussis. And Accordingly, a second aspect of the present invention relates to a method for preparing Bo in a pharmaceutically acceptable carrier. Provides vaccine for pertussis, including oral formulation of rdetella pertussis fimbria It is to be. The significance and scope of the reference to fimbria depends on the first aspect of the invention and The same is true. Surprisingly, oral administration of fimbria is protective against pertussis challenge It has been found that this can result in the production of different antibodies. This is associated with injectable vaccines. Work around the problem. The present invention also provides for administering pili or pilus-antigen conjugate orally Vaccination method for pertussis by Use of pili or pili-antigen conjugates in the manufacture of a medicament for inoculation of Kuching provide. In an embodiment of the present invention, the pili or pilin-antigen conjugate is a specific carrier. Together with, or typically adsorbed on, or conjugated to, the outside of the particle. To be prescribed. Polymers such as PLG and inorganic particles can be used. Good Preferably, Bordetella pertussis pili are adsorbed on particles less than 10 microns in diameter. It is. In particular, a suspension of inorganic particles having a diameter of 10 microns or less is suitable. Oral administration Later, the uptake of these particles, which have adsorbed pili or pili-antigen conjugates, is Can occur through Peyer's patches. In certain embodiments of the invention, As described in more detail, the oral vaccination composition absorbs the pili of the present invention. Includes colloidal suspension of alum. In these embodiments of the present invention, Oral vaccines contain antigenic components or immunity other than pili or pilus-antigen conjugates. It does not have to contain substantially the epidemic component. Alum is a well-known vaccine adjuvant and, at present, exclusively Used by injection. The present inventors have found that alum + pili are orally administered. When obtained, it was found that a good immune response was obtained. The resulting antibody response is Is sufficient to provide protection, which protects both serum and mucosal responses. Including. Systemic administration of vaccines is known in the art to provide a good serum response, especially IgG. It is known. Oral vaccination according to the second aspect of the invention will Were found to give both IgA responses. This is significant . Because IgA appears on the mucosal surface, the entry point for most pathogens This is because that. Preferably, prior to or concurrent with the administration of the formulation comprising pili, the stomach of the patient is Is neutralized. As a result, acid-activated proteases are Do not destroy the minute. This is achieved using conventional acid-reducing and neutralizing medicines Can be done. Optionally, the vaccine of the present invention comprises an effective amount of a neutralizing gastric acid. Formulated to include a compound. In certain embodiments of the invention, described below As described above, the vaccination composition comprises a bicarbonate buffer (particularly a pH ranging from 8.2 to 8.5). Solution with a strength of 0.1M buffer), but neutralize other acids Are also expected to be suitable for the compositions of the present invention. Administer vaccine formulation Administering a drug that neutralizes the acid before doing so is a further option. In the use of this aspect of the invention, the animal is administered the formulation of the invention orally. And optionally, a booster dose of a formulation of the invention is subsequently administered. So This protects against whooping cough. As part of the continuous intestinal content testing process, M cells in the intestine Uptake, and its contents pass through the lymph nodes, ultimately forming the basis of the immune response It is thought that it is taken up by macrophages that form. Alum particles are M cells Because it passes through, it is thought to participate in the chain that leads to the immune response; Applicants do not wish to be bound by this theory. Oral vaccines according to embodiments of the present invention may be passed through antigen presenting cells and pili or Includes a suspension of carriers adapted for other transports. Alum is a career In some cases, the formulations currently used in the art for injection are suitable. To children A flavoring agent or a sweetening agent may be added, if necessary, for the administration of. Departure The vaccine of the second aspect of the invention may also be a preservative or a vaccine for convenient, room temperature storage. Includes excipients that assist in lyophilizing the cutin. The following is a description of specific embodiments of the present invention, illustrated by way of example in the drawings. Figure 1 shows phosphate buffered saline (PBS), pilus (Fim), or pilus-polysaccharide binding On days 0, 14, and 28 using the body (Fim Conj), Show a serum anti-polysaccharide antibody response and test for specific anti-polysaccharide antibodies on day 42 Tested; FIG. 2 shows phosphate buffered saline (PBS), pilus (Fim), or pilus-polysaccharide binding Showing serum anti-pilus antibody response from mice immunized with the body (Fim Conj), and Tested for specific anti-pilus antibodies on day 21; FIG. 3 shows phosphate buffered saline (untreated), pili (Fim), or pili-meningoc. immunized with occal C polysaccharide conjugate (Fim 1 Conj), followed by B. pertussis 10⁶ Shows the protection percentage of mice challenged with the cfu dose; FIG. 4 shows phosphate buffered saline (1), pilus (2), pilus-meningococcal C conjugate Immunize with (3) or AC vaccine (4) and use Neisseria meningitidis on day 35. The number of survivors per group of 5 mice after challenge is shown in FIG.⁶CFU bacteria FIG. 4b shows the results after⁸Cfu after bacterial challenge Show fruit; FIG. 5 shows the control group (1) and the pilus immunity group (2), pilus-polysaccharide conjugate immunity. In group (3) and the commercial ACVax VaccineTM immunization group (4)⁶CFU meningitis Shows the number of surviving mice after challenge with FIG. 6 shows the in vitro bactericidal titers after immunization. The description is the same as in FIG. 5; FIG. 7 shows the external secretion induced by oral alum-adjuvanted pili. Shown are graphs of anti-ciliary response in: 7a-feces, 7b-vaginal lavage, 7c-saliva; FIG. 8 was triggered by alum-adjuvanted pili administered orally. Show graphs of average defense: and FIG. 9 shows evoked by intraperitoneal or oral alum-adjuvanted pili. 3 shows a graph of the anti-piliary response in the diluted serum.Example 1 Purification of Neisseria meningitidis serotype C polysaccharide. The method is essentially as described by Gotschlich, E. et al. As described by (1975) It is. Purification of group-specific polysaccharides, Monogr, Allergy 9, 245-258. The polysaccharide is L91 Purified from strain 543 (C2a P1.2R, Manchester Public Health Laboratory To obtain). Bacteria are grown overnight on blood agar plates and 250 ml of conical Inoculate 100 ml of Franz's medium in the medium and incubate for 7 hours with shaking I do. The 10 ml seed culture was then transferred to a conical flask containing 750 ml Franz medium. And incubate overnight at 37 ° C with shaking. Purification of polysaccharides. 1. 100 ml of 10% (w / v) hexadecyltrimethylammonium bromide (CTB) To each 1 L centrifuge pot. 2. The centrifuge pot is filled to 1 L with culture and allowed to stand at room temperature for 1 hour. 3. The bacteria and the precipitated polysaccharide are then centrifuged (RC3B centrifuge, 50 (00 rpm, 30 minutes) and discard the supernatant. 4. Resuspend the pellet in approximately 200 ml of water and homogenize to prepare a smooth suspension And an equal volume of 2M CaCl_TwoIs added. Stir this for 1 hour to remove the CTB complex. Release polysaccharides. 5. Precipitate the DNA by adding absolute ethanol to 25% (v / v) and for 90 minutes Stir. 6. This is centrifuged at 25,000 g for 20 minutes and the supernatant is retained. 7. Increase the ethanol concentration to 80% (v / v) and precipitate the polysaccharide. 8. The precipitate is then collected by centrifugation (25,000 g, 10 minutes). 9. The precipitate is washed four times with absolute ethanol to remove CTB and pelleted Is resuspended in PBS prepared for phenol extraction to remove contaminating proteins I do. Phenol extraction. 1. Add 90% (w / v) phenol solution, 10 ml boiling water and add 56 ° C water. Prepared by dissolving 90 g phenol by melting in a water bath To make. 2. Mix polysaccharides in PBS and 90% phenol 1: 1 and cycle at room temperature for 15 minutes Mix by swirling. 3. The mixture is centrifuged for about 15 minutes at 4100 rpm in a tabletop centrifuge. 4. Remove the upper aqueous phase and store at 4 ° C. 5. The phenol layer is re-extracted with PBS and incubated at room temperature for 15 minutes You. Centrifuge as above, remove upper aqueous layer, and with previous extract To pool. 6. The aqueous extract was washed with 0.1 M CaCl_TwoDialyzed overnight against residual phenol Is removed. 7. The dialyzed polysaccharide is centrifuged at 100,000 g for 5 hours to remove lipopolysaccharide. To 8. Keep the supernatant and add 3 volumes of absolute ethanol. 9. The precipitate is collected by centrifugation and washed with absolute ethanol. 10. Dry the final pellet at 35 ° C. and record the dry weight. Binding of meningococcal polysaccharide to Bordetella pertussis pili. First step: derivatization of proteins with avidinic dihydrazide (ADH) 1. Weigh 10 mg pili and in 1 ml 0.1 M citrate buffer, pH 4.7 Dissolved. 2. 35 mg ADH was weighed and dissolved in 0.5 ml citrate buffer pH 4.7. 3.3.9 mg of (1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride ) (EDC) was weighed and dissolved in 0.5 ml citrate buffer pH 4.7. 4. Solution 2 was added to solution 1 and then solution 3 was added. 5. The mixture was placed on a roller at 20 ° C. for 3 hours. 6. Mix the mixture at 4 ° C. for several changes of 10 mM ammonium bicarbonate buffer. Dialyzed for 2 hours and finally lyophilized. Stage 2: Activating Polysaccharides and Binding to Derivatized Proteins 1. 25 mg / ml CNBr (cyan bromide) in anhydrous HPLC grade acetonitrile A solution was prepared. 2.5 mg of purified meningococcal C polysaccharide was weighed and dissolved in 1 ml of 4 mM NaOH. I understand. The solution was cooled at 4 ° C. for 15 minutes. 3. Add 20 μL of the CNBr solution to the polysaccharide solution and gently mix the mixture at 4 ° C. for 6 minutes. Stirred quickly. 4. 1 ml of 0.5 M NaHCO_Three3. And add 3 ml of 0.5 M NaHCO_ThreeTo Added to 5 mg of dissolved derivatized pili. 5. Place the mixture on rollers at 4 ° C. for 16 hours and add 10 mM ammonium bicarbonate Dialyzed against and extensively lyophilized against pilus-meningococcal polysaccharide C binding Produce the body. Methods for coupling pili to polysaccharides are described in Schneerson et al. (J. Exp. Med., 152, 361-376). Page, 1980, "Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophi lus Influenzae Type b Polyaaccharide-Protein Conjugates ”) By derivatizing the pili with a C6 spacer prior to binding It has been found that a consistent bond is achieved. It is not essential that the pili are derivatized, instead the polysaccharide is derivatized And this can sometimes be due to the harsh conditions (eg, low exposure from pH to high pH) can be minimized. Mouse intraperitoneal challenge model of meningococcal infection. Adult mice (6-8 weeks old) were immunized on days 0, 14, and 28 with the polysaccharide conjugate vaccine. And then on day 35, serotype CN. Challenge with meningitidis. Challenge dose (0.5 ml) was given by intraperitoneal injection, which⁶~Ten⁸Bacteria and iron dext Contains orchid (2 mg). A further intraperitoneal injection of 2 mg iron dextran was also given 24 hours later Give in the challenge. The number of surviving mice in each group was Record shortly after. Bactericidal antibody assay The method used for the Neisseria meningitidis serotype C bactericidal assay comprises: Center for Disease Control and Prevention Protocol (Neisseria meningit idis serotype A / C serum bactericidal assay, Maslanka et al., 1995 CDC Atlanta, USA) Is essentially the same as detailed in: N. The meningitidis strain GN is used for measuring serotype C bactericidal antibodies. Hanks balanced salt solution with 0.1% bovine serum albumin (w / v) was used as buffer. To use. Only the agar "tilt" method can be used for bacterial counting. 96-well assay Apply 10 μl from each well of the rate to a BHI + 1% horse serum plate. Immunization of mice using phosphate buffered saline, pilus or pilus-polysaccharide conjugate The results of the epidemics are illustrated in FIGS. 1 and 2. FIG. 1 shows phosphate buffered saline or Shows no specific antipolysaccharide response in mice immunized with pili alone, In mice immunized with conjugates of the class, there was a significant anti-polysaccharide response, while This indicates that no IgA antibody was observed. Figure 2 shows that mice immunized with pili alone And also in mice immunized with conjugates of pili and polysaccharides 1 shows the presence of a typical anti-pilus antibody. Figure 3 shows pertussis pilus alone or pilus-polysaccharide binding Following immunization with coalescence, efficacy against Bordetella pertussis challenge Indicates that effective protection was present. FIG. 4 shows phosphate buffered saline, pili, pili-meningococcal C polysaccharide or known. 2 shows the number of surviving individuals in a group of 5 mice immunized with the vaccine of Figure 4a shows that all groups immunized with pilus-polysaccharide conjugate survived 24 hours after challenge On the other hand, from the group immunized with phosphate buffered saline or fimbria alone, only two live Indicates that there was In FIG. 4b, after challenge with an increased number of bacteria That is, 10 shown in the table above⁶10 compared to⁸), With physiological saline to provide phosphate ash , Or neither group immunized with fimbria alone survived in the first 24 hours, while The four groups immunized with the hair polysaccharide are shown to have survived the first 24 hours.Example 2 Meningococcal C bactericidal assay Mice were treated with PBS (intraperitoneal injection), pili (10 μg intraperitoneal injection), pili-polysaccharide conjugate Body (10μg protein + 10μg polysaccharide, intraperitoneal injection) or commercially available meningococcal vaccine (ACVax, 10 μg polysaccharide, intramuscular injection). Animals, 0, 14, and 28 Immunized on the day. Animals with a lethal dose of 10⁶cfu N. 35 days at meningitidis I did. Bactericidal assays were performed on pre-challenge sera as follows. Bactericidal assay protocol In a 96-well plate, a final volume of 40 μl bactericidal assay buffer (Geys plate) Make serial dilutions of heat-inactivated serum in 5% w / v BSA in balanced salt solution). 10 μl 8 × 10^Fourcfu N. Meningitidis suspension is added to each well, then 10 μl heat Activated young rabbit complement is added. Incubate at 37 ° C for 1 hour, then add 10 μl The turbid solution was removed from each well using Brain Heart Infusion containing 1% horse blood. Plate on agar plate. Incubate overnight and colony Is counted. Compare to appropriate controls to confirm bactericidal titer. this Define as titers that induce> 50% specific complement-mediated killing of bacterial colonies Is done. result By 48 hours post-challenge, all control animals (immunized with PBS or pili) (Animals) have died. At 48 hours, she was given a commercial meningococcal vaccine5 One of the mice survived while immunized with the pilus-polysaccharide experimental conjugate vaccine Three of the five mice survived (FIG. 5). The results of the bactericidal assay are Immunization of mice with the body vaccine yielded a titer of 128 induced by a commercial vaccine Elicits an in vitro bactericidal titer of 512 compared to (FIG. 6).Example 3 The formula for the pili was as follows. In the case of oral administration, three volumes of pili are Dilute with one volume of alum adjuvant. For 10μg fimbria (20-100μL) Dilute an equivalent volume with 4 volumes of 0.1 M bicarbonate buffer (up to a maximum volume of 500 μl). Which has a pH of 8.2-8.5 and is neutralized with acid for oral administration Designed and suitable for oral tube administration. Intraperitoneal administration In 3 volumes of antigen are diluted with 1 volume of commercial adjuvant and 10 μg An equivalent volume is injected into the pilus. Formulations containing pilus-polysaccharide conjugates are similarly Prepared.Example 4 Combining an alum formulation as described in Example 3 with pertussis pili And administered to mice via the intraperitoneal or oral route, and In cases where there was prior neutralization of intestinal acids. The results are illustrated in FIGS. 7, 8, and 9. You. FIG. 7 shows that antibodies to fimbriae include feces (FIG. 7a), vaginal lavage (FIG. 7b), and It was found to contain antibodies of the IgG, IgM and IgA classes in saliva (FIG. 7c). Was. FIG. 8 shows that immunization via oral administration of pili (using 10 μg of pili) was not pert produces protection from challenge by ussis and is provided by intraperitoneal administration of pili. Indicates that the protection provided was comparable. The anti-ciliary response in serum is shown in FIG. 9; But the serum response after oral administration was nonetheless significant. Was.Example 5 Methods of encapsulating pili and pili-antigen conjugates in microparticles apparatus: 1) Siverson laboratory mixer with 3/4 '' probe compatible with emulsifying screen - 2) High speed centrifuge. 3) Normal laboratory glassware, beakers, graduated cylinders, stirrers, etc. reagent: 1) Poly (lactide-co-glycolide) (PLG) solution-400 ml in 3 ml dichloromethane g. 2) Pili solution in PBS (1 mg / ml). 3) Polyvinyl alcohol (PVA) solution (8% w / v in water) Method: 1) Add 600 μl of pilus solution to 3 ml of PLG solution and 4,000 rpm in Silverson mixer Emulsify for 21/2 minutes. 2) Add this emulsion to 100 ml PVA and emulsify at room temperature at 4000 rpm for 21/2 minutes. 3) Add the double emulsion to 1 liter of water and shake vigorously for 1 minute. 4) Disperse the suspension of fine particles in a centrifuge container and_avCentrifuge for 30 minutes at You. 5) Resuspend the microparticle pellet in 25 ml of water and use a manual homogenizer And homogenize with a wide clearance (0.5mm) to produce a homogeneous suspension . Dilute with 200 ml of water and re-centrifuge as above. 6) Repeat steps 5 and 6 four times. 7) Resuspend the microparticle pellet in 25 ml of water as described above, and Transfer to a vessel, shell freeze, and lyophilize for 48 hours. Thus, for oral administration or for incorporation into other vaccination compositions. Fine particles having a diameter of about 2 to 5 μm were obtained. The method also includes capsulation of the pili-antigen conjugate. It is appropriate for conversion. Therefore, this result indicates that protective immunity is associated with the binding of pertussis pili to meningococcal C polysaccharide. Through the body, against both Bordetella pertussis and Neisseria meningitidis It can be generated by The present invention relates to known toxoid antigen carriers. Provide additional and alternative carriers, and provide new Useful for the preparation of regular conjugate vaccines. Oral administration of fimbria to pertussis Provides protective immunity and is applied to the production of oral vaccines.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｋ 47/42 (72)発明者ジョーンズ，デイビッドヒューイギリス国エスピー４０ジェイジーウィルトシャー，サリスバリー，ポートンダウン（番地なし），シーエイエムアール────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification FI FI Theme Court ゛ (Reference) A61K 47/42 A61K 47/42 (72) Inventor Jones, David Hugh England SP 40 J.J. Wiltshire, Salisbury, Porton Down (no address), CMA

Claims

[Claims] 1. A conjugate comprising: (A) an antigen conjugated to (b), (B) (i) Bordetella pertussis pilus protein, (ii) Bordetella pertussis Fimbria, and (iii) a carrier selected from pertussis 69 kD protein, A conjugate comprising: 2. The conjugate according to claim 1, wherein: (A) a first antigen; and (B) a second antigen different from the first antigen; the first and second antigens are both (c) Combined with (C) the carrier, A conjugate comprising: 3. 3. A conjugate according to claim 1 or 2, wherein the carrier is Bordetel. Conjugate, a pilus protein of la pertussis. 4. A composition comprising fine particles and the conjugate according to any one of claims 1 to 3. Wherein the conjugate is inside the microparticle and the microparticle has a diameter of 10 A composition that is sub-micron. 5. 5. The composition of claim 4, wherein the microparticles comprise (i) lactide-containing Polymer (ii) glycolide-containing polymer (iii), and lactide and glycolide Consisting of a polymer selected from polymers containing both A composition comprising: 6. The conjugate according to any one of claims 1 to 3, or any one of claims 4 to 5. A vaccine comprising the composition according to claim 1. 7. A method of conjugating an antigen to a carrier, comprising: (A) dissolving Bordetella pertussis pilus protein in an antigen solution; (B) derivatizing the pili protein or (ii) derivatizing the antigen Any of the steps; and (C) allowing the resulting solution to conjugate the antigen to the pili The process of maintaining A method comprising: 8. 8. The method according to claim 7, wherein: Dialysis of the resulting solution; Lyophilizing the dialyzed solution; and Recovering the lyophilized conjugate, A method comprising: 9. Use of a carrier, the carrier comprising: (i) Bor detella pertussis pilus protein, (ii) Bordetella pertussis pilus, And (iii) a use selected from the whooping cough 69 kD protein. 10. 10. Use according to claim 9, wherein the carrier is Bordetella pertu. Use, which is ssis pilus protein. 11. A method of vaccination, which comprises administering an effective amount of a conjugate. Wherein the conjugate is: (A) an antigen conjugated to (b), (B) (i) Bordetella pertussis pilus protein, (ii) Bordetella pertussis Fimbria, and (iii) a carrier selected from pertussis 69 kD protein, A method comprising: 12. 12. The method of claim 11, wherein the carrier is Bordetella per. A method comprising tussis pilus protein. 13. An oral vaccination composition, wherein the composition comprises particles having a diameter of 10 microns or less. A composition comprising Bordetella pertussis pilus protein adsorbed on offspring. 14． 14. The oral vaccination composition of claim 13, wherein the composition is a mineralocera. A composition comprising a suspension of microparticles. 15. An oral vaccination composition according to claim 13 or 14, wherein said composition is A composition wherein the object comprises alum particles. 16. An oral vaccination composition, wherein the composition is a pharmaceutically acceptable carrier. Contains Bordetella pertussis pilus protein and is microencapsulated A composition that does not contain a modified pilus protein. 17． An oral vaccination composition according to any one of claims 13 to 16. Wherein the composition further comprises a component for neutralizing gastrointestinal acid. 18. For the manufacture of compositions for oral vaccination against Bordetella pertussis Of Bordetella pertussis adsorbed on particles less than 10 microns in diameter Use of hair protein. 19. For the manufacture of compositions for oral vaccination against Bordetella pertussis Wherein the composition is free of microencapsulated pilus protein, Bo Use of the pilus protein of rdetella pertussis.