JP2002506027A

JP2002506027A - フェナントロフラン誘導体

Info

Publication number: JP2002506027A
Application number: JP2000535334A
Authority: JP
Inventors: ナンダケイ．グラビタ; キャサリンハインツ; ジェームスビー．マクアルパイン; ヒデアキモリシゲ; アンジェラエム．スタッフォード
Original assignee: フィテラインク．
Priority date: 1998-03-11
Filing date: 1999-03-03
Publication date: 2002-02-26
Also published as: US5981574A; WO1999045919A1; CA2322962A1; EP1061912A1; AU2894099A; EP1061912A4

Abstract

(57)【要約】フェナントロフラン誘導体と、脈管形成疾患を治療するためにそれらを用いる方法について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、その性質が抗脈管形成活性を含む、フェナントロフラン誘導体に関
する。

【０００２】脈管形成、または血管新生は、毛細血管の成長の過程である。脈管形成の調節
における障害は、関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、血管腫、ならびに腫瘍の増殖
および転移を含む癌などの脈管形成疾患と関連している。内因性の脈管形成因子
には、塩基性線維芽細胞成長因子（b-FGF）、血管透過因子／血管内皮成長因子、アンジオジェニン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、ヘパリナーゼ、インターロイキン8（IL-8）、血小板由来成長因子（PD-GF）、胎盤成長因子、プロス
タグランジンE1（PGE1）、プロスタグランジンE2（PGE2）、肝細胞成長因子、TG
F-α、TGF-β、TNF-α、およびTNF-βが含まれる。抗脈管形成因子には、アンジ
オスタチン、軟骨由来阻害物質、インターフェロン-α（IFN-α）、インターフェロン-β（IFN-β）、プロタミン、トロンボスポンジン、およびコラーゲン分解酵素阻害物質（TIMP）が含まれる。

【０００３】アジュフォレスチンAは、Ajuga forrestii Dielsの全草から単離された（Wang
ら、Chinese Chem. Lett. 5：125、1994）。Wangらによると、この全草は赤痢、
咽頭炎、ならびに急性および慢性腎炎の治療のための伝統的薬用植物として用い
られる（brightism）。

【０００４】発明の概要本発明は、部分的には下記の式（I）を有する化合物であって、

【化４】式中、Rはメチルであり、且つXおよびYはそれぞれC-OHであるか；またはRはメチ
ルであり、且つXおよびYはそれぞれC=Oである（キノン誘導体）化合物を特徴とする。6個のアステリスクはsp²炭素原子を示す。本発明はまた、式（I）の化合物の一つもしくは複数または化合物アジュフォレスチンA（1,11b-ジヒドロ-7,11
-ジヒドロキシ-3,4,8,11b-テトラメチルフェナントロ[3,2-b]フラン-6(2H)-オン
、アジュフォレスチンAとしても知られている）；あるいは式（I）の化合物の一
つとアジュフォレスチンとの組み合わせを含む薬学的組成物およびパッケージ薬
剤；ならびに脈管形成に影響をおよぼす、例えば、脈管形成疾患を治療するため
に、これらの薬学的組成物を投与する方法も特徴とする。

【０００５】発明の詳細な説明本発明は、部分的には、Ajuga reptans由来の操作された細胞培養物から単離された新規な天然物、およびその薬学的組成物を特徴とする。この産物は下記の
構造（式I）を有する：

【化５】式中、Rはメチルであり、且つXおよびYはそれぞれC-OH（式I-A）である。これら
のA. reptansの細胞培養物は式（I-A）およびアジュフォレスチンAの両方を産生
することが明らかにされている。これらの化合物は、例えば抗脈管形成薬として
有用である。本発明はまた、式（I）、または式（I）を含む薬学的活性化合物の
組み合わせを含む薬学的組成物も特徴とする。式（I）は、式（I-A）と、XおよびYはそれぞれC=Oであり、且つRはメチルである式（I-B）（キノン誘導体）とを
含む。これらの組成物は脈管形成疾患を治療するための方法において有用である
。この方法は、関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、血管腫、および腫瘍の増殖また
は転移を含む癌などの、一つまたは複数の脈管形成疾患を有する患者に、開示さ
れた組成物の薬学的有効量を投与する段階を含む。

【０００６】式（I-A）および（I-B）は下記のように単離して得られた。Ajuga reptans（シソ科）の植物培養細胞を、A. reptansの芽生えを用いて調製した。2,4-ジクロ
ロフェノキシ酢酸（2,4-D）（1mg/L）、キネチン（0.1mg/L）、2％ショ糖、およ
び0.5％ゲルライト（Gelrite）（Duchefa Biochemie BV、オランダ、Haarlem）を含む改良培地を、MurashigeおよびSkoog（Physiol Plant、15：473 1962）に従って調製した。芽生えの表面を、70％エタノールに短時間浸漬し、続いて15％
次亜塩素酸ナトリウムに20分間浸漬することによって滅菌した。滅菌済みの芽生
えを約5mmの長さの小片に刻み、固形カルス誘導培地上においた。開始後2ヶ月で
カルスが確立された。

【０００７】懸濁培養物を確立するために、確立されたカルスの一部を、GamborgのB5配合表（Exp. Cell Res.、50：148 1968）に従って2,4-D（5mg/L）および2％ショ糖を含むよう改良した液体B39培地20mLに置いた。懸濁培地を7〜14日間隔で補充し
た。2ヶ月後、確立された懸濁培養物を250mLの三角フラスコ（エルレンマイヤー
フラスコ）において、通常の方法で維持した。14日目の懸濁培養物16mLを100mL の新鮮なB39培地に移すことによる。培養物を持続的低照度、25℃、140rpmで浸透して培養した。

【０００８】式（I-A）および（I-B）を、下記の細胞培養操作によって産生した。750mLの産生培地B49（GamborgのB5、5％ショ糖、ホルモンなし）を含む2リットルのフラ
スコに、14日目の懸濁培養物132mLを播種した。7日間増殖させた後、フィルター
滅菌したメチルジャスモネート（最終濃度250uM）およびオートクレーブにかけたカンジダ-アルビカンス調製物（最終濃度50mg/L）を加えた。さらに4〜6日後、細胞培養物を減圧濾過によって回収した。C.アルビカンス調製物は、4EPD（酵
母抽出物1％、酵母ペプトン2％、グルコース2％）上でATCC28516の培養物を細胞
密度が最大になるまで増殖させ、全酵母培養物を2回オートクレーブにかけることによって得られ、その後、植物培養物に加えた。

【０００９】回収後、分離した細胞を凍結乾燥し、その後抽出した。残りの培地は、HP-20 （Mitsubishi Chemical Industries）またはXAD-4（Rohm and Haas）などの固相
ポリスチレン樹脂による抽出を行うまでの間、凍結した。凍結乾燥した細胞を、
水と、続いて塩化メチレン／メタノール（1：1）で抽出した。有機抽出物（1.66
g）をRP-18に予め吸着させた。直径6.8cm、高さ5cmの焼結漏斗にRP-18を充填し、事前に吸着させた物質を1cmの層になるよう導入した。カラムを減圧下、下記の溶媒で溶出した：水（200mL）、75％水／メタノール（200mL）、50％水／メタ
ノール（200mL）、25％水／メタノール（200mL）、100％メタノール（400mL）、
50％メタノール／塩化メチレン（400mL）および塩化メチレン（100mL）。100％メタノール溶出物（474.1mg）をLH-20カラム（52cm×2.5cm）上、メタノールでクロマトグラフィにかけ、コラーゲンチューブアッセイ法に基づき約14mgの活性
分画（#7）を得た。11ミリグラムを、265mLコイルのItoマルチコイル向流装置上
で、ヘプタン：酢酸エチル：メタノール：水＝5：5：5：2を用い、上相を流動相
として、精製した。2つの化合物、式（I-A）（5.1mg）とアジュフォレスチンA（
4.1mg）が単離された。

【００１０】また、式（I-A）をWaters Prep-Nova PACK HR C18（3.9×300nm）上で、下記の条件で精製することもできる。すなわち、溶媒40％水／60％アセトニトリル、
流速1mL／分である。化合物を338nm、290nm、または254nm、好ましくは338nmのU
Vで検出する。最低検出限界は1回の注入につき0.1マイクログラムである。濃度は1回の注入につき0.1〜1マイクログラム、好ましくは1回の注入につき1マイクログラムである。

【００１１】式（I-A）に関して、下記の分析スペクトルデータが得られた。

【００１２】アジュフォレスチンAの構造を確証する、下記の分析スペクトルデータが得られた。ネガティブエレクトロスプレー質量分析法m/z 307 [M-CH₄-H]^-

【００１３】アジュフォレスチンAは、Wangらの方法によっても得ることができる。

【００１４】キノンである式（I-B）の単離スキーム細胞および培地を38LのAjuga reptansの培養物から分離した。培地をHP-20樹脂を通過させた。乾燥した樹脂をCH₃CNで溶出し、溶出物を濃縮乾固した（44.2g
）。乾燥した溶出物を酢酸エチル／アセトン／水（700mL／125mL／700mL）で分配し、酢酸エチル層を分離した。残りの水層を酢酸エチル（2×700mL）でさらに
抽出した。3つの有機層を合わせて濃縮乾固し（525mg）、Ito向流クロマトグラフィ装置で前述の方法を用いて分画した。分画を集め、そのTLC上の特徴と色に従って合わせた。14の合わせた分画が得られた。合わせた分画3〜5はアジュフォ
レスチンAを含んでいたが、分画6（19mg）は式（I-A）を含んでいた。分画10（8
.1mg）を小さいHP-20カラム（26×1.5cm）でメタノール／塩化メチレンを用いて
さらに精製し、純粋な式（I-B）を得た（6.8mg）。キノン（式I-B）に関して、下記の分析データが得られた：

【００１５】抗脈管形成活性は、以下の実施例に記載の方法などの、当業者には周知のいく
つかの任意の方法のよっても示すことができる。また、当技術分野において周知
のネズミ背気嚢、ウサギ眼、および鶏卵モデルもある。

【００１６】実施例実施例１抗脈管形成活性：コラーゲンチューブヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC；Kurabo Industries, Ltd.、日本、大阪）を10％
PBS、bFGF（15ng/mL；PeproTech EC, Ltd.、ニュージャージー州プリンストン）
および上皮成長因子（EGF）（15ng/mL；Upstate Biotechnology Inc.、ニューヨ
ーク州レークプラシッド）を含むM-199培地（Gibco、メリーランド州ガイザース
バーグ）と、融合するまで培養した。すべての実験は、少なくとも5回継代培養した細胞を用いて実施した。体積比1：1の10X M-199培地および再構成緩衝液（0
.5N NaOH、200mM HEPES、および260mM NaHCO₃）に、それぞれの体積の8倍のI型コラーゲン溶液（Nitta Gelatin Inc.、日本、大阪）を混合した。

【００１７】コラーゲンゲル（300μL/ウェル）を24穴培養プレート（NUNC）に入れ、1.5時
間インキュベートした。HUVEC（1.4×10⁵/0.5mL）をコラーゲンでコーティングしたプレートに播種し、37℃で2時間培養した。50マイクロリットルの試料を加えた。コラーゲンゲルを再注入（300μL/ウェル）し、混合物を1.5時間培養した
。10％PBS、30ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含むM-199培地350マ
イクロリットルを加え、混合物を20時間培養した。各ウェル1視野を位相差顕微鏡を用いて撮影し、チューブ構造の長さを、マッキントッシュコンピューターで
、パブリックドメインのNIH画像プログラムを用いて測定した（結果については表１を参照されたい）。エルブスタチンを脈管形成阻害の陽性対照として用いた
。100％を超える阻害が認められれば、試験化合物がbFGFを加えない対照培養物で観察された阻害に比べてより高度に脈管形成を阻害したことになる。

【００１８】

【表１】チューブ形成アッセイ法における抗脈管形成活性

【００１９】他の態様本発明の本質的特徴および利点は、本明細書における開示より明らかである。
特許請求の精神および範囲から逸脱することなく、本発明は他の用法および条件
に容易に適合させることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ (72)発明者マクアルパインジェームスビー．アメリカ合衆国マサチューセッツ州ボルトンケトルホールロード 180 (72)発明者モリシゲヒデアキ日本国茨城県土浦市中1300−62 (72)発明者スタッフォードアンジェラエム．英国シェーフィールドキャッスルトンレーンサイドスクウェアーズレーンＦターム(参考） 4C037 XA03 4C086 AA01 AA02 AA03 BA05 ZA33 ZA36 ZA89 ZA96 ZB26 ZC35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の式（I）を有する化合物：【化１】式中、Rはメチルであり、且つXおよびYはそれぞれC-OHであるか；またはRはメチ
ルであり、且つXおよびYはそれぞれC=Oであって；6個のアステリスクはsp²炭素原子を示す。
【請求項２】 Rがメチルであり、且つXおよびYがそれぞれC-OHである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】 Rがメチルであり、且つXおよびYがそれぞれC=Oである、請求
項１記載の化合物。
【請求項４】下記の式（I）の化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物：【化２】式中、Rはメチルであり、且つXおよびYはそれぞれC-OHであるか；またはRはメチ
ルであり、且つXおよびYはそれぞれC=Oであって；6個のアステリスクはsp²炭素原子を示す。
【請求項５】下記の式（I）を有する化合物または脈管形成疾患治療のための医薬品製剤中のアジュフォレスチンAである該化合物の使用：【化３】式中、Rはメチルであり、且つXおよびYはそれぞれC-OHであるか；もしくはRはメ
チルであり、且つXおよびYはそれぞれC=Oであって；6個のアステリスクはsp²炭素原子を示す。
【請求項６】疾患が関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、血管腫、および癌か
ら選択される、請求項５記載の使用。
【請求項７】疾患が糖尿病性網膜症である、請求項６記載の使用。
【請求項８】疾患が癌であって該癌が腫瘍の増殖または転移を含む、請求
項６記載の使用。
【請求項９】組成物が、Rがメチルであり、XおよびYがそれぞれC-OHである式（I）の化合物を含む、請求項５記載の使用。
【請求項１０】組成物がアジュフォレスチンAを含む、請求項５記載の使用。
【請求項１１】アジュフォレスチンAと薬学的に許容される担体とを含む抗脈管形成性の薬学的組成物であって、脈管形成疾患治療のための説明書と共に
包装されている組成物。
【請求項１２】式Iの化合物と薬学的に許容される担体とを含む抗脈管形成性の薬学的組成物であって、脈管形成疾患治療のための説明書と共に包装され
ている組成物。