JP2002505442A - 生化学セパレーションの品質を評価する品質規準を用いる方法 - Google Patents
生化学セパレーションの品質を評価する品質規準を用いる方法Info
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Abstract
(57)【要約】
生化学試料をセパレーション分析する方法（２００）は、セパレーションランの間に得られたピークデータに基づいて品質規準（２１０）を計算することを含む。品質規準は、品質規準が低品質セパレーションランを示す場合、セパレーションを再度行なうか否かを含め、分析の中で次工程を選択するための基礎となる。好適な実施形態において、品質規準は、データ中の試料ピークのピーク分解能及びデータの信号−ノイズ比に基づいて計算される。コミグレションスタンダードがセパレーションランに含まれる場合、品質規準は上記スタンダードによって得られる参照ピークのミグレーションリニアリティの程度に基づく。その方法は、高スループットキャピラリ分析電気泳動セパレーションにおいてＤＮＡフラグメントを寸法分類し区分けするために実施される。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、概略、生化学的セパレーション（分離）、さらに具体的にいうと、
ＤＮＡフラグメント（断片）のセパレーションの品質を評価するための品質規準
の使用に関する。
ＤＮＡフラグメント（断片）のセパレーションの品質を評価するための品質規準
の使用に関する。
【０００２】 （背景技術） 生化学的セパレーションは、無数の複雑な生物学的、環境学的や産業上の試料
の分析研究において重要な役割を果たす。セパレーション法は、試料中の成分要
素を明らかにし、物の性質や純度を理解することに光明を与える。セパレーショ
ン法は単純なツールであり、これにより複雑な混合物に関して有用な情報量を増
し、その情報の質を高める。最も複雑な混合物、特に生化学的な源の混合物は、
類似の基本構造及び共通の機能的群を含む。そのため、不可能でないとしても、
成分要素が混合物に残留している限り、その成分要素を確認し量を計ることは困
難である。混合物中の成分要素を取り出すことにより、例えば物理的特性（例え
ば、光吸収、大きさ、質量タグ、カラータグの有無）を検出することによって、
それらの確認ができる。
の分析研究において重要な役割を果たす。セパレーション法は、試料中の成分要
素を明らかにし、物の性質や純度を理解することに光明を与える。セパレーショ
ン法は単純なツールであり、これにより複雑な混合物に関して有用な情報量を増
し、その情報の質を高める。最も複雑な混合物、特に生化学的な源の混合物は、
類似の基本構造及び共通の機能的群を含む。そのため、不可能でないとしても、
成分要素が混合物に残留している限り、その成分要素を確認し量を計ることは困
難である。混合物中の成分要素を取り出すことにより、例えば物理的特性（例え
ば、光吸収、大きさ、質量タグ、カラータグの有無）を検出することによって、
それらの確認ができる。
【０００３】 生化学的セパレーション技術は、種々のライフサイエンスや関連産業で利用さ
れる。それらの産業には、蛋白質、脂肪酸含有量、炭水化物含有量に関する食品
の栄養分析；毒素（例えば、バクテリア汚染又は貝類の毒）に関する食品分析；
ゲル電気泳動や蛋白質精製を含む蛋白質分析；炭水化物のセパレーション、オリ
ゴヌクレオチドやヌクレチオド・アミノ酸・糖・生命維持に不可欠なアミン等の
分子のセパレーション；農薬及びその他の合成有機分子のセパレーション及び分
析；薬及び薬品の分析；漿液蛋白質分析糖の医療的プロファイリング；法医学及
び爆発物解析；血清有機酸、シアン化物関連化合物、及び化学的交戦化合物；薬
品代謝産物の尿検査；カテコールアミンやエピネフリン等の神経伝達物質の分析
；リポプロテインのセパレーション分析、ビタミンのセパレーション分析；モノ
クロナル抗体の準備又は精製；及び蛋白質消化シーケンシング又は構造分析があ
る。上述の項目は網羅的なものでなく、セパレーション体系のための多数の適用
及び多様な用途を指摘するものである。
れる。それらの産業には、蛋白質、脂肪酸含有量、炭水化物含有量に関する食品
の栄養分析；毒素（例えば、バクテリア汚染又は貝類の毒）に関する食品分析；
ゲル電気泳動や蛋白質精製を含む蛋白質分析；炭水化物のセパレーション、オリ
ゴヌクレオチドやヌクレチオド・アミノ酸・糖・生命維持に不可欠なアミン等の
分子のセパレーション；農薬及びその他の合成有機分子のセパレーション及び分
析；薬及び薬品の分析；漿液蛋白質分析糖の医療的プロファイリング；法医学及
び爆発物解析；血清有機酸、シアン化物関連化合物、及び化学的交戦化合物；薬
品代謝産物の尿検査；カテコールアミンやエピネフリン等の神経伝達物質の分析
；リポプロテインのセパレーション分析、ビタミンのセパレーション分析；モノ
クロナル抗体の準備又は精製；及び蛋白質消化シーケンシング又は構造分析があ
る。上述の項目は網羅的なものでなく、セパレーション体系のための多数の適用
及び多様な用途を指摘するものである。
【０００４】 セパレーション法から得られたセパレーションデータのマニアル検査は、労力
がかかり時間を消費するものである。プロセスの反復性により誤差を生じやすく
、人間によるデータの主観的な評価の信頼性により一貫性に欠ける結果を生じる
ことがある。これは、データの源（すなわち、データが電気泳動セパレーション
から得られたものであるかクロマトグラフィ法から得られたものであるか）に拘
わらず、また研究されている生化学的分析物の性質に拘わらず、全てのセパレー
ションデータについて等しく言えることである。
がかかり時間を消費するものである。プロセスの反復性により誤差を生じやすく
、人間によるデータの主観的な評価の信頼性により一貫性に欠ける結果を生じる
ことがある。これは、データの源（すなわち、データが電気泳動セパレーション
から得られたものであるかクロマトグラフィ法から得られたものであるか）に拘
わらず、また研究されている生化学的分析物の性質に拘わらず、全てのセパレー
ションデータについて等しく言えることである。
【０００５】 最も一般的な生化学的セパレーションの用途の一つが、ＤＮＡの分析であり、
当該分野で最も大きな事業の一つがヒトゲノムに関する主導権である。遺伝子分
析のプロジェクトは、何千、何百万というＤＮＡ遺伝子型を決定し、分析し、検
査しなければならない。例えば、糖尿病や心臓病などの多数の遺伝子疾患をマッ
ピングするためには、最大百万の遺伝子型が必要とされると推定されている。
当該分野で最も大きな事業の一つがヒトゲノムに関する主導権である。遺伝子分
析のプロジェクトは、何千、何百万というＤＮＡ遺伝子型を決定し、分析し、検
査しなければならない。例えば、糖尿病や心臓病などの多数の遺伝子疾患をマッ
ピングするためには、最大百万の遺伝子型が必要とされると推定されている。
【０００６】 遺伝子上のマッピングは、遺伝子発見の過程で重要な役割を果たす。新規な遺
伝子マーカーやマーカーに身を固め、研究者は急激なペースで新たな遺伝子の位
置付けを行なっている。遺伝子連鎖の分析に採用されている、最も一般的に利用
されている遺伝子マーカーは、極めて啓発的で、シンプル・シーケンス・リピー
ト（ＳＳＲ）多形物（polymorphisms）である。現在、これら２−、３−、及び ４−ベース・ペア（ｂｐ）・リピートが、マニアル検査及びスラブ‐ゲル(slab-
gel)電気泳動装置で作成された電気泳動プロファイルのマニアル検査及びスコア
リングによって遺伝子分類されている。例えば、マンスフィールド等は、研究者
によるセパレーションデータの初期検査に基づいてＤＮＡフラグメント（断片）
の長さを自動的に計算する方法を開示している（デビッド・Ｃ．・マンスフィー
ルド等、「蛍光マイクロサテライトマーカーを用いた遺伝子連鎖分析の自動化」
、「ゲノミックス」、Ｖｏｌ．２４、２２５−２３３頁、１９９４年）。最終分
析はコンピュータで行なわれるが、研究者によって行なわれる初期スクリーニン
グ段階が依然として存在する。
伝子マーカーやマーカーに身を固め、研究者は急激なペースで新たな遺伝子の位
置付けを行なっている。遺伝子連鎖の分析に採用されている、最も一般的に利用
されている遺伝子マーカーは、極めて啓発的で、シンプル・シーケンス・リピー
ト（ＳＳＲ）多形物（polymorphisms）である。現在、これら２−、３−、及び ４−ベース・ペア（ｂｐ）・リピートが、マニアル検査及びスラブ‐ゲル(slab-
gel)電気泳動装置で作成された電気泳動プロファイルのマニアル検査及びスコア
リングによって遺伝子分類されている。例えば、マンスフィールド等は、研究者
によるセパレーションデータの初期検査に基づいてＤＮＡフラグメント（断片）
の長さを自動的に計算する方法を開示している（デビッド・Ｃ．・マンスフィー
ルド等、「蛍光マイクロサテライトマーカーを用いた遺伝子連鎖分析の自動化」
、「ゲノミックス」、Ｖｏｌ．２４、２２５−２３３頁、１９９４年）。最終分
析はコンピュータで行なわれるが、研究者によって行なわれる初期スクリーニン
グ段階が依然として存在する。
【０００７】 初期スクリーニングの目的は、自動分析プロファイルから、ユーザによって受
容できない品質とみなされたランを除去することである。不良なランは、多数の
エラー源の幾つかから発生する。例えば、試料中の不純物又は検出不能なレベル
のＤＮＡが、不良セパレーションデータを生じ得る。遺伝子サンプルが良好であ
る場合、セパレーションランの状態は、不良セパレーション基質又は不適正に制
御された電界の存在等によって相殺されていた。ユーザは、プロファイルを検査
し、当該データをその後の分析に利用できるか否か又は当該ランを繰り返す必要
があるか否かを判断しなければならない。マンスフィールド等の技術は、この工
程を自動的に行なうものでなく、代わりに全てのデータを研究者がマニアルで再
検討するものである。また、良好なセパレーションランの場合、マンスフィール
ド等の技術及び通常に行なわれているその他の方法は、依然として研究者が所定
の情報をセパレーションデータから引き出して当該情報をコンピュータに入力す
ることが必要である。
容できない品質とみなされたランを除去することである。不良なランは、多数の
エラー源の幾つかから発生する。例えば、試料中の不純物又は検出不能なレベル
のＤＮＡが、不良セパレーションデータを生じ得る。遺伝子サンプルが良好であ
る場合、セパレーションランの状態は、不良セパレーション基質又は不適正に制
御された電界の存在等によって相殺されていた。ユーザは、プロファイルを検査
し、当該データをその後の分析に利用できるか否か又は当該ランを繰り返す必要
があるか否かを判断しなければならない。マンスフィールド等の技術は、この工
程を自動的に行なうものでなく、代わりに全てのデータを研究者がマニアルで再
検討するものである。また、良好なセパレーションランの場合、マンスフィール
ド等の技術及び通常に行なわれているその他の方法は、依然として研究者が所定
の情報をセパレーションデータから引き出して当該情報をコンピュータに入力す
ることが必要である。
【０００８】 必要とされているのは、生化学試料の分析における任意の段階で自動的に判断
する方法である。更に具体的にいうと、分析過程において後の行為に関して判断
が行なわれるように、セパレーションデータの分析を自動化することが望ましい
。次の工程に進む前に、セパレーションランの品質を自動的に確かめることが望
ましい。
する方法である。更に具体的にいうと、分析過程において後の行為に関して判断
が行なわれるように、セパレーションデータの分析を自動化することが望ましい
。次の工程に進む前に、セパレーションランの品質を自動的に確かめることが望
ましい。
【０００９】 （発明の概要） 生化学試料（サンプル）のセパレーション分析を行なう方法は、試料のセパレ
ーションランを行なって、セパレーションデータを得ることを含む。そのデータ
は、セパレーションランの品質を示す品質規準を作るために分析される。次に、
この品質規準は、分析中の次工程（すなわち、分析中の次工程に進むか、それと
もセパレーションランを繰り返すか否か）を選択するために利用される。本発明
の好適な実施形態において、品質規準は、データ中のサンプルピークの分解能の
測定及びデータにおける信号−ノイズ比に基づく。これらの場合、サイジングス
タンダードがセパレーションランに含まれている場合、品質規準は更にサイジン
グ標準の共移入の参照ピークのリニアリティの程度の測定に基づく。共移入計量
又は同定基準の実施が、セパレーションに利用され得る。
ーションランを行なって、セパレーションデータを得ることを含む。そのデータ
は、セパレーションランの品質を示す品質規準を作るために分析される。次に、
この品質規準は、分析中の次工程（すなわち、分析中の次工程に進むか、それと
もセパレーションランを繰り返すか否か）を選択するために利用される。本発明
の好適な実施形態において、品質規準は、データ中のサンプルピークの分解能の
測定及びデータにおける信号−ノイズ比に基づく。これらの場合、サイジングス
タンダードがセパレーションランに含まれている場合、品質規準は更にサイジン
グ標準の共移入の参照ピークのリニアリティの程度の測定に基づく。共移入計量
又は同定基準の実施が、セパレーションに利用され得る。
【００１０】 本方法の特定の実施例において、遺伝子分析は、ＤＮＡサンプルの選別及び増
幅を含む。増幅された製品は、関心のあるターゲットシーケンスをマークするた
めにラベルが付される。電気泳動セパレーションランが行なわれ、増幅材料の構
成要素を示す信号を検出する。強度が時間と共に変化する信号（ピーク）の捕捉
は、セパレーションデータを構成する。このデータは、セパレーションランの分
解能（品質）を示す品質規準を得るために後に分析される。
幅を含む。増幅された製品は、関心のあるターゲットシーケンスをマークするた
めにラベルが付される。電気泳動セパレーションランが行なわれ、増幅材料の構
成要素を示す信号を検出する。強度が時間と共に変化する信号（ピーク）の捕捉
は、セパレーションデータを構成する。このデータは、セパレーションランの分
解能（品質）を示す品質規準を得るために後に分析される。
【００１１】 次に、品質規準は、高品質、限界（中位）品質、又は低品質セパレーションを
区別するために設けた２つの閾値と比較される。限界（中位）品質と低い品質の
サンプルとを区別するために、品質規準が第１の閾値よりも低い場合、第１のイ
ンジケータが作られ、同様に、品質規準が第２の閾値よりも低い場合、第２のイ
ンジケータが作られる。第１と第２のインジケータは、それぞれ「失敗（ＦＡＩ
Ｌ）」と「再検討（ＲＥＶＩＥＷ）」のインジケータである。失敗のインジケー
タが作成された場合、サンプルの再ランが行なわれる。再検討のインジケータが
作成された場合、セパレーションデータのマニアル評価が行なわれる。品質規準
が第２の閾値よりも大きい場合、遺伝子分析がプロセスの次工程（通常は、対立
遺伝子コーリング工程）で続行される。
区別するために設けた２つの閾値と比較される。限界（中位）品質と低い品質の
サンプルとを区別するために、品質規準が第１の閾値よりも低い場合、第１のイ
ンジケータが作られ、同様に、品質規準が第２の閾値よりも低い場合、第２のイ
ンジケータが作られる。第１と第２のインジケータは、それぞれ「失敗（ＦＡＩ
Ｌ）」と「再検討（ＲＥＶＩＥＷ）」のインジケータである。失敗のインジケー
タが作成された場合、サンプルの再ランが行なわれる。再検討のインジケータが
作成された場合、セパレーションデータのマニアル評価が行なわれる。品質規準
が第２の閾値よりも大きい場合、遺伝子分析がプロセスの次工程（通常は、対立
遺伝子コーリング工程）で続行される。
【００１２】 （発明を実施する最良の形態） 図１に示すフローチャート１００を参照すると、本発明にかかるセパレーショ
ン分析の作業フローは、以下の工程を有する。生化学試料（サンプル）が得られ
、用意される（ステップ１０２）。次に、試料に対するセパレーション処理が行
なわれる（ステップ１０４）。次に、得られるセパレーションデータは、品質規
準を得るために分析される（ステップ１０６）。次に、品質規準は、セパレーシ
ョン（ステップ１０１）を反復してセパレーションデータを視覚的に検査する（
ステップ１０３）か否か、または試料の分析における次の工程に進む（ステップ
１０８）か否かを判断するために利用される。データの視覚検査が求められた場
合、次に、セパレーションを繰り返すか否か又はセパレーション処理の次の工程
に進む（ステップ１０８）か否かの視覚検査の結果に基づいて別の判断がなされ
る（ステップ１０５）。
ン分析の作業フローは、以下の工程を有する。生化学試料（サンプル）が得られ
、用意される（ステップ１０２）。次に、試料に対するセパレーション処理が行
なわれる（ステップ１０４）。次に、得られるセパレーションデータは、品質規
準を得るために分析される（ステップ１０６）。次に、品質規準は、セパレーシ
ョン（ステップ１０１）を反復してセパレーションデータを視覚的に検査する（
ステップ１０３）か否か、または試料の分析における次の工程に進む（ステップ
１０８）か否かを判断するために利用される。データの視覚検査が求められた場
合、次に、セパレーションを繰り返すか否か又はセパレーション処理の次の工程
に進む（ステップ１０８）か否かの視覚検査の結果に基づいて別の判断がなされ
る（ステップ１０５）。
【００１３】 セパレーションにおける後の工程の信頼性は、セパレーションランから得られ
たデータの品質に依存するため、セパレーションランの品質は常に重要である。
従来の技術は、コンピュータ解析用にデータを提示する前に、データの人間によ
るスクリーニングを必要とする。品質規準の展開（詳細な計算は後述する。）は
、初期セパレーションランが「良好」か否か即ち品質を判断するための、標準化
された規準を提供する。また、品質規準により、コンピュータによる分析の利用
が、人の介在無しである場合に形成される多数のデータを通じて初めに区分けで
き、それによりデータ解析の処理が自動化される。例えば、ヒトゲノム計画は、
遺伝子シーケンスをマッピングするために必要な、人間のＤＮＡからなる数十億
のベースペア又は数百万の遺伝子型を分析することを含む。
たデータの品質に依存するため、セパレーションランの品質は常に重要である。
従来の技術は、コンピュータ解析用にデータを提示する前に、データの人間によ
るスクリーニングを必要とする。品質規準の展開（詳細な計算は後述する。）は
、初期セパレーションランが「良好」か否か即ち品質を判断するための、標準化
された規準を提供する。また、品質規準により、コンピュータによる分析の利用
が、人の介在無しである場合に形成される多数のデータを通じて初めに区分けで
き、それによりデータ解析の処理が自動化される。例えば、ヒトゲノム計画は、
遺伝子シーケンスをマッピングするために必要な、人間のＤＮＡからなる数十億
のベースペア又は数百万の遺伝子型を分析することを含む。
【００１４】 以上のように、本発明は、セパレーションランの品質を判断して分析プロセス
の作業フローを制御する品質規準を用いることに特徴を有するもので、分析され
る生化学試料の種類は無関係である。例えば、本発明の分析技術は、蛋白質・脂
肪酸・及び炭水化物の含有量に関して食品を分析すること；炭水化物・オリゴヌ
クレオチド・及び個々の分子（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、及び有機
物アミン）をセパレーションすること；農薬及びその他の合成有機分子をセパレ
ーションし分析すること；薬及び医薬品を分析すること；法医学及び爆発性の化
合物を分析すること；血清有機酸、シアン化物及び関連化合物、及び化学的戦争
化合物を分析すること；薬代謝産物の尿検査を行なうこと；などに利用できる。
の作業フローを制御する品質規準を用いることに特徴を有するもので、分析され
る生化学試料の種類は無関係である。例えば、本発明の分析技術は、蛋白質・脂
肪酸・及び炭水化物の含有量に関して食品を分析すること；炭水化物・オリゴヌ
クレオチド・及び個々の分子（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、及び有機
物アミン）をセパレーションすること；農薬及びその他の合成有機分子をセパレ
ーションし分析すること；薬及び医薬品を分析すること；法医学及び爆発性の化
合物を分析すること；血清有機酸、シアン化物及び関連化合物、及び化学的戦争
化合物を分析すること；薬代謝産物の尿検査を行なうこと；などに利用できる。
【００１５】 種々の公知のセパレーション技術によって得られるセパレーションデータは、
内容の点で類似しており、そのためにステップ１０６で容易に処理される。例え
ば、キャピラリー電気泳動セパレーションは、検出された信号（例えば、蛍光ラ
ベル分析物からの放出）を溶出時間の関数として記録するデータを生成する。デ
ータ中の各ピークの発生時間は、対応する分析物の質量に関連する。ゲル−スラ
ブ(gel-slab)電気泳動において、データは、ゲル中のセパレーション通路に沿っ
た分析物の検出を含む。ここで、そのデータは検出された信号を、セパレーショ
ン通路に沿ったゲルのスタート地点からの距離の関数として記録する。この場合
、スタート地点からのピーク値の距離は、対応する分析物にある電荷の大きさに
関係している。一般に、分析物のセパレーションは、分析物のある物理的特性（
分子質量又は電荷）に基づいて生じる。同様に、セパレーション中に検出された
信号は、分析物のある物理的特性に基づく。電気泳動セパレーションの場合、例
えば、検出特性は蛍光発光であり、これは蛍光ラベルの使用によって分析物に与
えられる。
内容の点で類似しており、そのためにステップ１０６で容易に処理される。例え
ば、キャピラリー電気泳動セパレーションは、検出された信号（例えば、蛍光ラ
ベル分析物からの放出）を溶出時間の関数として記録するデータを生成する。デ
ータ中の各ピークの発生時間は、対応する分析物の質量に関連する。ゲル−スラ
ブ(gel-slab)電気泳動において、データは、ゲル中のセパレーション通路に沿っ
た分析物の検出を含む。ここで、そのデータは検出された信号を、セパレーショ
ン通路に沿ったゲルのスタート地点からの距離の関数として記録する。この場合
、スタート地点からのピーク値の距離は、対応する分析物にある電荷の大きさに
関係している。一般に、分析物のセパレーションは、分析物のある物理的特性（
分子質量又は電荷）に基づいて生じる。同様に、セパレーション中に検出された
信号は、分析物のある物理的特性に基づく。電気泳動セパレーションの場合、例
えば、検出特性は蛍光発光であり、これは蛍光ラベルの使用によって分析物に与
えられる。
【００１６】 本発明によれば、判断ステップ１０１及び１０３は、ユーザが適正な次の行為
を判断するのを補助する第１及び第２のインジケータを作成することからなる。
したがって、ステップ１０１では、品質規準が第１の値範囲にあるとき、ＦＡＩ
Ｌ（失敗）インジケータが作成され、特定のランが低品質であるとみなされたこ
とをユーザに通知する。その場合、判断ボックス１０１から伸びている点線によ
って示されるように、ユーザはセパレーションランを再び実行することを選択す
ることになる。同様に、ステップ１０３では、品質規準が第２の値範囲にあると
き、ＲＥＶＩＥＷ（再検討）インジケータが作成され、対応するランのデータを
マニアルで再検討する必要があることをユーザに通知する。ユーザは、通常は電
気泳動図などのグラフのデータを視覚的に検査し、再度セパレーションランを行
なうことが適当か否か判断できる。最後に、品質上許容できるとみなされるラン
に対し、ＰＡＳＳ（通過）インジケータが作成され、データ分析処理の次のステ
ップに分析を進めることができることがユーザに通知される（ステップ１０８）
。
を判断するのを補助する第１及び第２のインジケータを作成することからなる。
したがって、ステップ１０１では、品質規準が第１の値範囲にあるとき、ＦＡＩ
Ｌ（失敗）インジケータが作成され、特定のランが低品質であるとみなされたこ
とをユーザに通知する。その場合、判断ボックス１０１から伸びている点線によ
って示されるように、ユーザはセパレーションランを再び実行することを選択す
ることになる。同様に、ステップ１０３では、品質規準が第２の値範囲にあると
き、ＲＥＶＩＥＷ（再検討）インジケータが作成され、対応するランのデータを
マニアルで再検討する必要があることをユーザに通知する。ユーザは、通常は電
気泳動図などのグラフのデータを視覚的に検査し、再度セパレーションランを行
なうことが適当か否か判断できる。最後に、品質上許容できるとみなされるラン
に対し、ＰＡＳＳ（通過）インジケータが作成され、データ分析処理の次のステ
ップに分析を進めることができることがユーザに通知される（ステップ１０８）
。
【００１７】 品質規準の説明のための事情を説明するために、本発明にかかるセパレーショ
ン分析の特定の実施例を示す。しかし、本発明の実施は、一つの特定のセパレー
ション法に限定されるものでないし、また分析される特定の種類の化合物に限定
されるものでないことに留意すべきである。
ン分析の特定の実施例を示す。しかし、本発明の実施は、一つの特定のセパレー
ション法に限定されるものでないし、また分析される特定の種類の化合物に限定
されるものでないことに留意すべきである。
【００１８】 次に、図２において、遺伝子フラグメント分析の作業フローが、フローチャー
ト２００に示してある。この処理は、遺伝子連鎖マップを作るうえで、人間のＤ
ＮＡの全ての遺伝子を特定するという最終目的の第１段階で利用される。
ト２００に示してある。この処理は、遺伝子連鎖マップを作るうえで、人間のＤ
ＮＡの全ての遺伝子を特定するという最終目的の第１段階で利用される。
【００１９】 まず、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び種々の形のＲＮＡ
）の試料が得られる（ステップ２０２）。次に、試料のコピー（複製）が、増幅
処理（アンプリフィケーション）として知られる処理によって作られる（ステッ
プ２０４）。遺伝子材料のアンプリフィケーションは、多数の技術（生体内クロ
ーニング及びポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を含む。）によって行ない得る。Ｐ
ＣＲのプロセスは短時間で高い収益が得られるので、好適にはこのＰＣＲが利用
される。増幅された製品内の目的のシーケンスは、次に、蛍光的に分類されたプ
ライマー又は基材とＤＮＡの酵素合成物を、ＰＣＲ又は他のアンプリフィケーシ
ョンプロセスを用いて提供することにより、分類される。出来上がった分類され
た増幅製品は、構成要素のサイズに応じて分析される（ステップ２０８）。スラ
ブ‐ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びキャピラリー分析電気泳動を含
む、多数の電気泳動技術が知られている。
）の試料が得られる（ステップ２０２）。次に、試料のコピー（複製）が、増幅
処理（アンプリフィケーション）として知られる処理によって作られる（ステッ
プ２０４）。遺伝子材料のアンプリフィケーションは、多数の技術（生体内クロ
ーニング及びポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を含む。）によって行ない得る。Ｐ
ＣＲのプロセスは短時間で高い収益が得られるので、好適にはこのＰＣＲが利用
される。増幅された製品内の目的のシーケンスは、次に、蛍光的に分類されたプ
ライマー又は基材とＤＮＡの酵素合成物を、ＰＣＲ又は他のアンプリフィケーシ
ョンプロセスを用いて提供することにより、分類される。出来上がった分類され
た増幅製品は、構成要素のサイズに応じて分析される（ステップ２０８）。スラ
ブ‐ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びキャピラリー分析電気泳動を含
む、多数の電気泳動技術が知られている。
【００２０】 分類された試料の各セパレーションランは、公知のサイズのＤＮＡフラグメン
ト（マーカー）を備えた共同移入（co-migrating）サイジングスタンダードを含
む。ＤＮＡサイジングスタンダードにおけるフラグメントを増幅製品の成分から
区別するために、独特なラベルが利用される。一般的な従来の技術は、異なる蛍
光タグ（一つはサイジングスタンダード、一つは増幅製品）を使用することであ
った。材料がキャピラリー又はスラブ‐ゲルを介して移動する際、タグに蛍光発
光を誘導するために、励起源(excitation source)が利用される。発生する放射 は、近くの検出器によって集められ、該検出器が検出された蛍光発光の強度を示
す信号を生成する。また、得られた測定値は、時間の関数として強度変化を表す
セパレーションデータを提供するために、時間を基準として記憶（保管）される
。
ト（マーカー）を備えた共同移入（co-migrating）サイジングスタンダードを含
む。ＤＮＡサイジングスタンダードにおけるフラグメントを増幅製品の成分から
区別するために、独特なラベルが利用される。一般的な従来の技術は、異なる蛍
光タグ（一つはサイジングスタンダード、一つは増幅製品）を使用することであ
った。材料がキャピラリー又はスラブ‐ゲルを介して移動する際、タグに蛍光発
光を誘導するために、励起源(excitation source)が利用される。発生する放射 は、近くの検出器によって集められ、該検出器が検出された蛍光発光の強度を示
す信号を生成する。また、得られた測定値は、時間の関数として強度変化を表す
セパレーションデータを提供するために、時間を基準として記憶（保管）される
。
【００２１】 セパレーションデータより、品質規準Ｑが計算される（ステップ２１０）。品
質規準は、セパレーションランの品質を示し、その後の処理を選択するための定
量的基礎を研究者に提供する。図２から明らかなように、品質規準Ｑは、２組の
範囲と比較される（ステップ２０１、２０３）。本実施例において、特定のラン
に関して計算された規準が０．０〜０．２の範囲内にある場合、そのランはＦＡ
ＩＬ（失敗）インジケータが記録される（ステップ２１２）。計算された規準が
、０．２〜０．５の範囲内にある場合、そのランはＲＥＶＩＥＷ（再検討）イン
ジケータが記録される（ステップ２１４）。計算された規準が０．５以上の場合
、システムはプロセスの次工程に進む。
質規準は、セパレーションランの品質を示し、その後の処理を選択するための定
量的基礎を研究者に提供する。図２から明らかなように、品質規準Ｑは、２組の
範囲と比較される（ステップ２０１、２０３）。本実施例において、特定のラン
に関して計算された規準が０．０〜０．２の範囲内にある場合、そのランはＦＡ
ＩＬ（失敗）インジケータが記録される（ステップ２１２）。計算された規準が
、０．２〜０．５の範囲内にある場合、そのランはＲＥＶＩＥＷ（再検討）イン
ジケータが記録される（ステップ２１４）。計算された規準が０．５以上の場合
、システムはプロセスの次工程に進む。
【００２２】 以下に説明するように、品質規準は０．０〜１０．の間の実数である。そのた
め、ステップ２０１と２０３で使用される範囲は、２つの閾値、すなわち０．２
と０．５によって定義される。第１の閾値０．２未満の計算された品質規準を有
するセパレーションランは、分析された試料が汚染物・不適正な試料の準備・又
は汚染されたセパレーション基質などによって汚染されていることを示す。ラン
がＦＡＩＬインジケータを有する試料は、再試行しなければならないものと思わ
れる。フローチャート２００のステップ２１２から伸びる点線は、新たな試料を
準備しなければならないこと、又は同一試料を単に再度ランすればよいことを示
し、その選択は研究者によって行なわれる。
め、ステップ２０１と２０３で使用される範囲は、２つの閾値、すなわち０．２
と０．５によって定義される。第１の閾値０．２未満の計算された品質規準を有
するセパレーションランは、分析された試料が汚染物・不適正な試料の準備・又
は汚染されたセパレーション基質などによって汚染されていることを示す。ラン
がＦＡＩＬインジケータを有する試料は、再試行しなければならないものと思わ
れる。フローチャート２００のステップ２１２から伸びる点線は、新たな試料を
準備しなければならないこと、又は同一試料を単に再度ランすればよいことを示
し、その選択は研究者によって行なわれる。
【００２３】 品質規準が第２の閾値０．５未満であるが第１の閾値０．２未満でない試料は
、低品質の試料であることを示す。しかし、その規準は、それにも拘わらず、試
料がプロセスの後の工程で遺伝子分類され得る少なくとも少しの座（loci）を含
み得ることを示す。したがって、そのようなランのデータは、再試行が適当か又
はプロセスの次の工程でデータを利用できるか否かを判断する（ステップ２０５
）ために、研究者によってマニアル評価（ステップ２１６）される必要がある。
最後に、第２の閾値よりも上の品質規準は、ＰＡＳＳインジケータを生成し、デ
ータをプロセスの次工程に進めるべく指示する。本発明の特別な利用において、
データは自動的に対立遺伝子分析（ステップ２２０）に送られ、そこで対立遺伝
子がデータから特定される。種々の対立遺伝子コーリングアルゴリズムが知られ
ており、それらの任意のものが本発明と共に利用できる。
、低品質の試料であることを示す。しかし、その規準は、それにも拘わらず、試
料がプロセスの後の工程で遺伝子分類され得る少なくとも少しの座（loci）を含
み得ることを示す。したがって、そのようなランのデータは、再試行が適当か又
はプロセスの次の工程でデータを利用できるか否かを判断する（ステップ２０５
）ために、研究者によってマニアル評価（ステップ２１６）される必要がある。
最後に、第２の閾値よりも上の品質規準は、ＰＡＳＳインジケータを生成し、デ
ータをプロセスの次工程に進めるべく指示する。本発明の特別な利用において、
データは自動的に対立遺伝子分析（ステップ２２０）に送られ、そこで対立遺伝
子がデータから特定される。種々の対立遺伝子コーリングアルゴリズムが知られ
ており、それらの任意のものが本発明と共に利用できる。
【００２４】 閾値はユーザが決め得るもので、必要に応じて研究者によって改変できる。そ
のため、研究者は、任意の所与の実験条件に対し、セパレーションランの品質レ
ベルを作ることができる。
のため、研究者は、任意の所与の実験条件に対し、セパレーションランの品質レ
ベルを作ることができる。
【００２５】 セパレーション分析の基本工程の概要が図１に示してあり、この図は品質規準
の使用が容易にプロセスに組み入れられることを示す。図２は、品質規準の遺伝
子分析への一般的な適用を示す。以下、品質規準そのものを説明する。
の使用が容易にプロセスに組み入れられることを示す。図２は、品質規準の遺伝
子分析への一般的な適用を示す。以下、品質規準そのものを説明する。
【００２６】 図３において、品質規準はセパレーションデータから導かれたタームからなる
ことが分かる。まず最初はピーク分解能のタームは、セパレーションランの間に
検出された試料ピークの全分解能の基準である。次のものは、セパレーションラ
ンからの検出信号の信号−ノイズ（Ｓ／Ｎ）比率である。最後に、サイジングス
タンダードがそのランに含まれている場合、上記スタンダードによって作られた
参照ピークに対するミグレーションリニアリティ(migration linearity)（イン デックス）が計算される。それらのタームは後に組み合わされ、品質規準Ｑが生
成される。
ことが分かる。まず最初はピーク分解能のタームは、セパレーションランの間に
検出された試料ピークの全分解能の基準である。次のものは、セパレーションラ
ンからの検出信号の信号−ノイズ（Ｓ／Ｎ）比率である。最後に、サイジングス
タンダードがそのランに含まれている場合、上記スタンダードによって作られた
参照ピークに対するミグレーションリニアリティ(migration linearity)（イン デックス）が計算される。それらのタームは後に組み合わされ、品質規準Ｑが生
成される。
【００２７】 まず、図４を参照してピーク解像度の期間を説明する。この図４は、電気泳動
図を示し、説明を容易にするために特性が強調されている。４つのピークＡ−Ｄ
は、試料ピークで、それぞれピーク強度Ｉ2，Ｉ4，Ｉ1及びＩ3と検出時刻ｔ1− ｔ4をそれぞれ有する。図４はまた、各ピークの最大値の半分の強度で測定され た帯域幅Ｗ1−Ｗ4を示す。
図を示し、説明を容易にするために特性が強調されている。４つのピークＡ−Ｄ
は、試料ピークで、それぞれピーク強度Ｉ2，Ｉ4，Ｉ1及びＩ3と検出時刻ｔ1− ｔ4をそれぞれ有する。図４はまた、各ピークの最大値の半分の強度で測定され た帯域幅Ｗ1−Ｗ4を示す。
【００２８】 本発明によれば、ピーク解像度の期間は、各内側のピークに対する解像度規準
（すなわち、端部のピーク（ピークＡとＤ）以外のピーク）を計算することによ
って計算される。本発明における解像度規準は、内側ピークに隣接する２つのピ
ークを考慮した測定値である。比較すると、従来の解像度は、２つのピークの間
の解像度の測定値である。したがって、各内側のピークについて、解像度規準は
、そのピークからその右側のピーク及びそのピークからその左側のピークまでの
データを含む。一般式は、以下の通りである。 従って、内側のピークＢとＣに関連した解像度規準ＲBとＲCは、以下の通りで
ある。 端部のピークＡとＤに関し、規準解像度の計算が利用される。
（すなわち、端部のピーク（ピークＡとＤ）以外のピーク）を計算することによ
って計算される。本発明における解像度規準は、内側ピークに隣接する２つのピ
ークを考慮した測定値である。比較すると、従来の解像度は、２つのピークの間
の解像度の測定値である。したがって、各内側のピークについて、解像度規準は
、そのピークからその右側のピーク及びそのピークからその左側のピークまでの
データを含む。一般式は、以下の通りである。 従って、内側のピークＢとＣに関連した解像度規準ＲBとＲCは、以下の通りで
ある。 端部のピークＡとＤに関し、規準解像度の計算が利用される。
【００２９】 最後に、ピーク分解能のタームは、個々の解像度計算値の平均（すなわち、（
ＲA＋ＲB＋ＲC＋ＲD）／４）をとることによって計算される。
ＲA＋ＲB＋ＲC＋ＲD）／４）をとることによって計算される。
【００３０】 品質規準の次の要素、信号−ノイズ比率（Ｓ／Ｎ）、について、図５Ａと図５
Ｂを参照して説明する。図４と同様に、図５Ａは、試料のセパレーションランに
対するデータの誇張された特性を示す電気泳動図の概略を示す。この計算は２つ
の部分、試料に対するセパレーションデータ中の「ノイズレベル」を計算する部
分と、データの「信号レベル」を計算する部分を有する。
Ｂを参照して説明する。図４と同様に、図５Ａは、試料のセパレーションランに
対するデータの誇張された特性を示す電気泳動図の概略を示す。この計算は２つ
の部分、試料に対するセパレーションデータ中の「ノイズレベル」を計算する部
分と、データの「信号レベル」を計算する部分を有する。
【００３１】 ノイズレベルの計算を最初に説明する。セパレーションデータがまず、ハイパ
スフィルタによってデジタル的に前処理され、ベースラインを平坦化（単純化）
する（すなわち、信号における低周波数の変動を除く。）。
スフィルタによってデジタル的に前処理され、ベースラインを平坦化（単純化）
する（すなわち、信号における低周波数の変動を除く。）。
【００３２】 次に、ローパスフィルタのアルゴリズムを用いてノイズ（ノイズレベル）が増
幅される。一般に、この処理はセパレーションデータにおける信号の振幅のパー
セント分布を観察することを含む。各パーセントランク（値）におけるそのよう
なピークの数に対する各ピークのパーセントランクの点が、プロットされている
。出来上がった曲線は、低強度信号（すなわち、ノイズ）の直線領域と高強度信
号（すなわち所望信号）の狭い領域との間に著しい違いを示している。直線ノイ
ズ領域に接する線は、パーセントスケールに交叉するように伸ばしてある。交点
におけるパーセントランクに関連した振幅は、品質規準の計算に使用するセパレ
ーションデータ中で観察されるノイズの振幅を示す。
幅される。一般に、この処理はセパレーションデータにおける信号の振幅のパー
セント分布を観察することを含む。各パーセントランク（値）におけるそのよう
なピークの数に対する各ピークのパーセントランクの点が、プロットされている
。出来上がった曲線は、低強度信号（すなわち、ノイズ）の直線領域と高強度信
号（すなわち所望信号）の狭い領域との間に著しい違いを示している。直線ノイ
ズ領域に接する線は、パーセントスケールに交叉するように伸ばしてある。交点
におけるパーセントランクに関連した振幅は、品質規準の計算に使用するセパレ
ーションデータ中で観察されるノイズの振幅を示す。
【００３３】 具体的に、図５Ａにおいて、データからの最大ピーク値（すなわち、強度Ｉｍ
ａｘを有するピークＡ２）が求められる。ゼロからＩｍａｘまでのデータ中の強
度スケールは、Ｎ個のインターバルに分割される。各インターバルｉに対し、上
限はＩｍａｘ*（Ｎ−ｉ＋１／Ｎ）で、下限はＩｍａｘ*（Ｎ−ｉ）／Ｎである。
Ｎは図５Ａに示す例の７に等しいが、Ｎは１００のオーダ又は一般にユーザによ
って特定されかつ後に修正され得る。
ａｘを有するピークＡ２）が求められる。ゼロからＩｍａｘまでのデータ中の強
度スケールは、Ｎ個のインターバルに分割される。各インターバルｉに対し、上
限はＩｍａｘ*（Ｎ−ｉ＋１／Ｎ）で、下限はＩｍａｘ*（Ｎ−ｉ）／Ｎである。
Ｎは図５Ａに示す例の７に等しいが、Ｎは１００のオーダ又は一般にユーザによ
って特定されかつ後に修正され得る。
【００３４】 図５Ｂにおいて、各インターバルにおけるピークの数は、インターバルの数の
関数として求められる。したがって、インターバル１は、ＩｍａｘからＩｍａｘ * （Ｎ−１）／Ｎの強度範囲を扱い、二つのピークＡ１とＡ２を含む。第２のイ ンターバルは、Ｉｍａｘ*（Ｎ−１）／ＮからＩｍａｘ*（Ｎ−２）／Ｎの強度範
囲を扱い、二つのピークＢ１とＢ２を含む。インターバル数３は、一つのピーク
（Ｃ）を含み、インターバル数４は４個のピーク（Ｄ１−Ｄ４）を含む。
関数として求められる。したがって、インターバル１は、ＩｍａｘからＩｍａｘ * （Ｎ−１）／Ｎの強度範囲を扱い、二つのピークＡ１とＡ２を含む。第２のイ ンターバルは、Ｉｍａｘ*（Ｎ−１）／ＮからＩｍａｘ*（Ｎ−２）／Ｎの強度範
囲を扱い、二つのピークＢ１とＢ２を含む。インターバル数３は、一つのピーク
（Ｃ）を含み、インターバル数４は４個のピーク（Ｄ１−Ｄ４）を含む。
【００３５】 図５Ｂに示すプトット点のようなピーク数対インターバル数のプロット点は、
あるインターバルＫで数えたピークの数が急激に増加していることを示す。これ
は、特にピークがノイズによって生じる場所におけるセパレーションデータ中の
ある領域を示す。Ｋは、ピーク数対インターバルのプロットの変曲点を示す。曲
線の最大第１導関数である。
あるインターバルＫで数えたピークの数が急激に増加していることを示す。これ
は、特にピークがノイズによって生じる場所におけるセパレーションデータ中の
ある領域を示す。Ｋは、ピーク数対インターバルのプロットの変曲点を示す。曲
線の最大第１導関数である。
【００３６】 インターバルＫが決まると、ノイズレベルは次式で計算される。 次に、１からＫまでのインターバルにおけるピークの数が求められ、以下のよう
に、ピーク閾値Ｍと比較される。 ここで、Ｐｉは、インターバルｉにおけるピークの数である。
に、ピーク閾値Ｍと比較される。 ここで、Ｐｉは、インターバルｉにおけるピークの数である。
【００３７】 ピーク閾値Ｍは、ピーク（信号）に係る最小信号を示し、ノイズの高振幅に係
るものでない。ピーク閾値は、ユーザによって選択されるもので、ユーザの要求
に応じて改変可能である。
るものでない。ピーク閾値は、ユーザによって選択されるもので、ユーザの要求
に応じて改変可能である。
【００３８】 インターバル１からＫの中で生じるピークの全数がピーク閾値Ｍ未満の場合、
プロセスはインターバルＫからＮに関して反復される。これは、Ｉｍａｘ＊（Ｎ
−Ｋ＋１／Ｎ）からゼロまでの範囲のデータをＮ個のインターバルに分割するこ
とに等しい。本繰り返しにおける各インターバルは、上限値と下限値〔それぞれ
Ｉ’ｍａｘ*（Ｎ−Ｋ＋１）／ＮとＩ’ｍａｘ*（Ｎ−Ｋ）／Ｎ〕によって規定さ
れる。ここで、Ｉ’ｍａｘ*はインターバルＫの上限、すなわちとＩｍａｘ*（Ｎ
−Ｋ＋１）／Ｎに等しい。
プロセスはインターバルＫからＮに関して反復される。これは、Ｉｍａｘ＊（Ｎ
−Ｋ＋１／Ｎ）からゼロまでの範囲のデータをＮ個のインターバルに分割するこ
とに等しい。本繰り返しにおける各インターバルは、上限値と下限値〔それぞれ
Ｉ’ｍａｘ*（Ｎ−Ｋ＋１）／ＮとＩ’ｍａｘ*（Ｎ−Ｋ）／Ｎ〕によって規定さ
れる。ここで、Ｉ’ｍａｘ*はインターバルＫの上限、すなわちとＩｍａｘ*（Ｎ
−Ｋ＋１）／Ｎに等しい。
【００３９】 ピーク数対インターバル数の別の演算がなされ、新たなインターバルＫ’が、Ｋ
を選択するための上述の基準に基づいて選択される。ノイズレベルは、以下のよ
うに再計算される。
を選択するための上述の基準に基づいて選択される。ノイズレベルは、以下のよ
うに再計算される。
【００４０】 ピーク閾値Ｍはまた、インターバル１と新たなインターバルＫ’との間のピー
ク数と比較される。式５の関係が維持される場合、細分割のプロセスが再び繰り
返され、式５の関係が最早正しくなくなる（Ｓ／Ｎ値の計算で使用される「ノイ
ズレベル」に達する）まで継続される。
ク数と比較される。式５の関係が維持される場合、細分割のプロセスが再び繰り
返され、式５の関係が最早正しくなくなる（Ｓ／Ｎ値の計算で使用される「ノイ
ズレベル」に達する）まで継続される。
【００４１】 Ｓ／Ｎ比の計算で使用される第２のタームは「信号レベル」である。この信号
レベルは、ノイズレベルＦ*（Ｆはノイズ閾値）よりも大きなセパレーションデ ータのピークの平均ピーク高さと定義される。
レベルは、ノイズレベルＦ*（Ｆはノイズ閾値）よりも大きなセパレーションデ ータのピークの平均ピーク高さと定義される。
【００４２】 Ｆは、ノイズからピークをセパレーションするための、ユーザによって選択可
能な閾値で、Ｆ＞２である。このカットオフ閾値は、ピーク分析において検出限
界は一般にＳ／Ｎ＞２のピークとして定義されることから、２を越える値でなけ
ればならない。
能な閾値で、Ｆ＞２である。このカットオフ閾値は、ピーク分析において検出限
界は一般にＳ／Ｎ＞２のピークとして定義されることから、２を越える値でなけ
ればならない。
【００４３】 最後に、観測された平均ピーク信号は、以下の式により計算される。 ここで、Ｈｉは、信号レベルの用語の中で用いられるピークのピーク高さであり
、ｎはそのようなピークの数である。
、ｎはそのようなピークの数である。
【００４４】 品質規準の第３の要素は、サイジングスタンダードの直線性指数（リニアリテ
ィインデックス）である。サイジングスタンダードは、サンプルピークのピーク
検出回数を対応するサイズの測定（例えば、ベースペアの数又はセパレーション
量）に変換する基礎を提供するものである。例えば、ポリヌクレオチドの電気泳
動セパレーションにおいて、サイジングスタンダードは、長さにおいて１００個
のベースペア、２００個のベースペア、及び４００個のベースペアを有するマー
カーピークを含む。これらのマーカーの溶出時間は、それぞれ１０分、２０分、
及び４０分である。３０分にピークを有する共移入（co-migrating）試料は、サ
イジングスタンダードの２０分と４０分のピークのフランキングマーカーを補間
することによって、３００個のベースペアの長さを有するものと推定される。補
間の精度は、サイジングスタンダードのサイズ‐時間の関係の三次曲線に対する
直線性又はフィティングに依存する。なお、すべてのセパレーションが直線であ
るわけでなく、二次・三次・又は高次の曲線により正確にフィッティングされ得
ることがある。したがって、サイジングスタンダードの直線指標は、直線性の程
度の値、又はサイズ／時間関係の三次オーダの曲線へのフィッティング精度とし
て役立ち、以下の方法により得られる。
ィインデックス）である。サイジングスタンダードは、サンプルピークのピーク
検出回数を対応するサイズの測定（例えば、ベースペアの数又はセパレーション
量）に変換する基礎を提供するものである。例えば、ポリヌクレオチドの電気泳
動セパレーションにおいて、サイジングスタンダードは、長さにおいて１００個
のベースペア、２００個のベースペア、及び４００個のベースペアを有するマー
カーピークを含む。これらのマーカーの溶出時間は、それぞれ１０分、２０分、
及び４０分である。３０分にピークを有する共移入（co-migrating）試料は、サ
イジングスタンダードの２０分と４０分のピークのフランキングマーカーを補間
することによって、３００個のベースペアの長さを有するものと推定される。補
間の精度は、サイジングスタンダードのサイズ‐時間の関係の三次曲線に対する
直線性又はフィティングに依存する。なお、すべてのセパレーションが直線であ
るわけでなく、二次・三次・又は高次の曲線により正確にフィッティングされ得
ることがある。したがって、サイジングスタンダードの直線指標は、直線性の程
度の値、又はサイズ／時間関係の三次オーダの曲線へのフィッティング精度とし
て役立ち、以下の方法により得られる。
【００４５】 まず、サイジングスタンダードにおける構成要素のマーカーの大きさ及び対応
する溶出時間が得られる。スタンダードに対するデータ中の第１のピークは、最
も小さなマーカーが最初に溶出されることから、その最も小さなマーカーの検出
に対応している。その最も小さなマーカーのサイズ（すなわち、ベースペアの数
）は、第１のピークの発生時間に対応している。同様に、スタンダードにおける
次のより大きなマーカーが、第２のピークの発生時間に対応する時間に現れる。
この関係のグラフが図６に示してあり、そこではベースペアの長さ（ＢＰi）が 溶出時間（ｔi）の関数としてプロットされている。例えば遺伝子分析において 、基準はヌクレオチドマーカーフラグメントを集めたもので、各フラグメントの
「サイズ」はベースペアの用語を用いて表現される。その他のセパレーション分
析に関し、基準中の構成要素の「サイズ」は、セパレーション量等の構成要素の
他の幾つかの物理的特性を表すものである。
する溶出時間が得られる。スタンダードに対するデータ中の第１のピークは、最
も小さなマーカーが最初に溶出されることから、その最も小さなマーカーの検出
に対応している。その最も小さなマーカーのサイズ（すなわち、ベースペアの数
）は、第１のピークの発生時間に対応している。同様に、スタンダードにおける
次のより大きなマーカーが、第２のピークの発生時間に対応する時間に現れる。
この関係のグラフが図６に示してあり、そこではベースペアの長さ（ＢＰi）が 溶出時間（ｔi）の関数としてプロットされている。例えば遺伝子分析において 、基準はヌクレオチドマーカーフラグメントを集めたもので、各フラグメントの
「サイズ」はベースペアの用語を用いて表現される。その他のセパレーション分
析に関し、基準中の構成要素の「サイズ」は、セパレーション量等の構成要素の
他の幾つかの物理的特性を表すものである。
【００４６】 次に、最小二乗法を用い、データからの複数のポイントが、三次多項式によっ
て近似される。他の補間法を利用することもできるが、サイジングスタンダード
における全範囲のサイズ（ベースペア）に対して三次曲線が最も良好な結果を示
すことが確認されている。更に具体的には、三次多項式ｙ（ｔi）は、 が最小となるように選択される。
て近似される。他の補間法を利用することもできるが、サイジングスタンダード
における全範囲のサイズ（ベースペア）に対して三次曲線が最も良好な結果を示
すことが確認されている。更に具体的には、三次多項式ｙ（ｔi）は、 が最小となるように選択される。
【００４７】 直線指標（リニアリティインデックス）は、以下のように計算される。 ここで、 Ｎは、基準中の構成要素の数である。
【００４８】 最後に、品質規準Ｑは、以下のように計算される。 ここで、 ａは２から１０の範囲、 ｂは０．１から１．０の範囲、 ｃは０．５から２．０の範囲
【００４９】 スケール定数ａ，ｂ，ｃはユーザが選択可能であり、キャピラリセパレーショ
ン用のデフォルト値はａ＝５、ｂ＝０．２、ｃ＝１．０である。その範囲及びデ
フォルト値は、どの信号強度及び解像度がプロセス中で観測されるかに応じて多
の形式のセパレーション用に調整され得る。
ン用のデフォルト値はａ＝５、ｂ＝０．２、ｃ＝１．０である。その範囲及びデ
フォルト値は、どの信号強度及び解像度がプロセス中で観測されるかに応じて多
の形式のセパレーション用に調整され得る。
【００５０】 以上の説明はキャピラリー電気泳動（ＣＥ）セパレーション法に焦点を当てて
いるが、その方法は他の種類のセパレーション分析にも同様に適用可能である。
例えば、ゲルセパレーションは、ピーク検出が時間に基づくものでなく距離に基
づくものである場合のデータを作成する。しかし、ゲルイメージデータは、距離
測定が時間測定に置き換えられる点を除き、電気泳動と同様に分析される。ＣＥ
セパレーション法と同様に、クロマトフラフィセパレーション法では、分析物は
固定された検出器を通り、信号強度対時間が測定される。
いるが、その方法は他の種類のセパレーション分析にも同様に適用可能である。
例えば、ゲルセパレーションは、ピーク検出が時間に基づくものでなく距離に基
づくものである場合のデータを作成する。しかし、ゲルイメージデータは、距離
測定が時間測定に置き換えられる点を除き、電気泳動と同様に分析される。ＣＥ
セパレーション法と同様に、クロマトフラフィセパレーション法では、分析物は
固定された検出器を通り、信号強度対時間が測定される。
【００５１】 本発明の方法は、コンピュータシステム上で動作するソフトウェアの形で容易
に実施され、図７Ａ及び図７Ｂに示す工程及び方法で実施される。９６個のキャ
ピラリーのランにおいて、同一量のＤＮＡがセパレーションされた。セパレーシ
ョンの殆どは、最もＱ規準（図７Ａ）を有する４個のキャピラリーによって示さ
れるように、高品質であった。低品質セパレーションは、最も低いＱ規準を有す
る複数のキャピラリーにおいて明らかにされるように、幅が広く、弱いピークを
生じる（図７Ｂ）。そのソフトウェアの実施は、通常の技術を有する平均的プロ
グラマーの範囲内にあるものである。また、そのソフトウェアは、試料を準備し
てセパレーションランを実行するためのロボットマニピュレータを使用する半自
動システムに組み入れることができる。ＰＡＳＳ、ＦＡＩＬ、およびＲＥＶＩＥ
Ｗのインジケータは、本発明に基づき、種々の作業を実行するためマニピュレー
タを操作するためのロボット制御部に伝送される信号からなるものである。した
がって、ＦＡＩＬランを有する試料は、自動的に再度実行され、ＲＥＶＩＥＷが
与えられた試料のランはマニアル検査用に研究者に送られる。
に実施され、図７Ａ及び図７Ｂに示す工程及び方法で実施される。９６個のキャ
ピラリーのランにおいて、同一量のＤＮＡがセパレーションされた。セパレーシ
ョンの殆どは、最もＱ規準（図７Ａ）を有する４個のキャピラリーによって示さ
れるように、高品質であった。低品質セパレーションは、最も低いＱ規準を有す
る複数のキャピラリーにおいて明らかにされるように、幅が広く、弱いピークを
生じる（図７Ｂ）。そのソフトウェアの実施は、通常の技術を有する平均的プロ
グラマーの範囲内にあるものである。また、そのソフトウェアは、試料を準備し
てセパレーションランを実行するためのロボットマニピュレータを使用する半自
動システムに組み入れることができる。ＰＡＳＳ、ＦＡＩＬ、およびＲＥＶＩＥ
Ｗのインジケータは、本発明に基づき、種々の作業を実行するためマニピュレー
タを操作するためのロボット制御部に伝送される信号からなるものである。した
がって、ＦＡＩＬランを有する試料は、自動的に再度実行され、ＲＥＶＩＥＷが
与えられた試料のランはマニアル検査用に研究者に送られる。
【００５２】 上述した特定の計算は、本発明者によって予期された、発明を実行する最良の
形態を記載したものである。しかし、セパレーションデータは、本発明の範囲及
び精神から逸脱することなく、セパレーションの品質を示す他の分析、及びセパ
レーションランの後の行為を管理するために用いることができる他の分析にかけ
てもよい。
形態を記載したものである。しかし、セパレーションデータは、本発明の範囲及
び精神から逸脱することなく、セパレーションの品質を示す他の分析、及びセパ
レーションランの後の行為を管理するために用いることができる他の分析にかけ
てもよい。
【図１】 本発明にかかるセパレーション分析の工程を示すフローチャート
である。
である。
【図２】 本発明の実施形態における工程のフローチャートである。
【図３】 品質規準を含む用語を示す。
【図４】 一般的な電気泳動図の図で、ピーク分解能の計算方法を示す。
【図５Ａ】 Ｓ／Ｎ比の計算方法を示す。
【図５Ｂ】 Ｓ／Ｎ比の計算方法を示す。
【図６】 サイジングスタンダードのグラフを示し、直線インデックスを求
めるための情報の使用方法を示す。
めるための情報の使用方法を示す。
【図７Ａ】 ＤＮＡフラグメントセパレーションの分析で実施された発明を
示し、高品質セパレーションが高いＱスコアを得ることを示す。
示し、高品質セパレーションが高いＱスコアを得ることを示す。
【図７Ｂ】 ＤＮＡフラグメントセパレーションの分析で実施された発明を
示し、低品質のサンプルが低スコアに基づいて保存されることを示す。
示し、低品質のサンプルが低スコアに基づいて保存されることを示す。
【手続補正書】特許協力条約第１９条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年５月２６日（１９９９．５．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/86 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３５Ｆ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ ３２５Ｄ (72)発明者 リアン−シェ・ツァオ アメリカ合衆国94538カリフォルニア州フ レモント、ビッドウェル・ドライブ・ナン バー6211、4425番 (72)発明者 マリナ・ベイナー アメリカ合衆国94539カリフォルニア州フ レモント、インディアン・ヒル・プレイス 475番 (72)発明者 カーティス・アール・カウツァー アメリカ合衆国95124カリフォルニア州サ ンノゼ、ミナ・ウェイ1957番
Claims (27)
- 【請求項１】 生化学試料を分析する方法であって、 セパレーションランにおいて、上記試料を複数の構成要素にセパレートし、上
記構成要素に関連した物理的特性を示す信号の検出を示すセパレーションデータ
を、時間又はセパレーション通路に沿った距離のいずれかの関数として作成し、
上記セパレーションデータは複数のサンプルピークを有する工程と、 上記セパレーションデータに基づき、上記セパレーションランの品質を示す品
質規準を計算する工程と、 上記品質規準に基づき、上記試料を分析するか又は上記セパレーションランを
繰り返す次の工程を有する処理の一つを選択する工程とを有する方法。 - 【請求項２】 品質規準を計算する工程は、上記セパレーションデータにお
ける上記試料ピークの分解能を示す値を計算する工程を含む請求項１の方法。 - 【請求項３】 上記品質規準を計算する工程は、上記セパレーションデータ
における信号‐ノイズ比を示す値を計算する工程を含む請求項２の方法。 - 【請求項４】 公知の物理的特定の構成要素を有する共移入スタンダードを
セパレーションし、上記セパレーションデータに参照ピークを導入する工程を有
し、上記品質規準を計算する工程は上記規準ピークのミグレーションリニアリテ
ィの程度を求める工程を有する請求項１の方法。 - 【請求項５】 上記品質規準を第１の閾値と比較する工程と、 上記品質規準が上記第１の閾値未満の場合、第１のインジケータを作成する工
程と、 上記品質規準が上記第１の閾値以上の場合、上記品質規準と第２の閾値とを比
較する工程と、 上記品質規準が上記第２の閾値未満の場合、第２のインジケータを作成する工
程と、 上記品質規準が上記第２の閾値以上の場合、第３のインジケータを作成する工
程とを有する請求項１の方法。 - 【請求項６】 上記第１のインジケータが作成された場合、上記セパレーシ
ョンランを繰り返す工程を有する請求項５の方法。 - 【請求項７】 上記第２のインジケータが作成された場合、上記セパレーシ
ョンデータをマニアル検査し、上記セパレーションデータをマニアル検査する工
程からの結果に基づいて上記セパレーションランを繰り返す工程を有する請求項
６の方法。 - 【請求項８】 上記第３のインジケータが作成された場合、上記分析におけ
る次の工程に進む工程を有する請求項７の方法。 - 【請求項９】 上記生化学試料は、アミノ酸・ヌクレオチド・及び糖を含む
生化学モノマーと、ＤＮＡ・ＲＮＡ・ペプチド及び炭水化物を含む生化学ポリマ
ーを含み、上記試料のセパレーション工程は、電気泳動セパレーション・コラム
クロマトグラフィ、高性能液体クロマトグラフィ、及び等電点電気泳動の一つを
含む請求項１の方法。 - 【請求項１０】 ポリヌクレオチドを分析する方法であって、 上記ポリヌクレオチドの試料の複製を作り、増幅製品を製造する工程と、 上記増幅製品の中で目的のシーケンスを区別する工程と、 セパレーションランにおいて、上記増幅製品の構成要素を示す信号を検出する
ことと、検出された信号における変化を示すデータを時間又はセパレーション通
路の長さに沿った距離のいずれかの関数として示すことを含む、上記増幅製品を
セパレーションする工程と、 上記セパレーションランの品質を示す品質規準を上記データの関数として計算
するする工程と、 上記品質規準の値に基づき、上記品質規準が第１の閾値未満の場合に第１のイ
ンジケータを作成し、上記品質規準が上記第１の閾値より大きくかつ第２の閾値
未満の場合、第２のインジケータを作成する工程とを有する方法。 - 【請求項１１】 上記品質規準を計算する工程は、上記データ中のピーク値
の分解能を計算する工程と、上記データの信号−ノイズ比を計算する工程を有す
る請求項１０の方法。 - 【請求項１２】 上記データが複数の規準ピークを含むように、上記セパレ
ーションランの前に、サイジングスタンダードと上記増幅製品とを混合する工程
を有し、上記品質規準を計算する工程は上記参照ピークのミグレーションリニア
リティの程度を求める工程を有する請求項１１の方法。 - 【請求項１３】 上記第１のインジケータが作成された場合、上記セパレー
ションランを繰り返し、上記第２のインジケータが作成された場合、上記セパレ
ーションランを繰り返すか否かを判断するために上記データをマニアル評価する
工程を含む請求項１０の方法。 - 【請求項１４】 上記品質規準が上記第２の閾値よりも大きい場合、第３の
インジケータを作成する工程を含む請求項１０の方法。 - 【請求項１５】 上記ポリヌクレオチドが遺伝子材料を構成し、上記第３の
インジケータが作られた場合、上記方法は上記データから対立遺伝子を確認する
工程を有する請求項１４の方法。 - 【請求項１６】 上記セパレーション工程は、キャピラリ電気泳動セパレー
ション又はキャピラリ分析電気泳動セパレーションのいずれかであり、上記デー
タは電気泳動図である請求項１０の方法。 - 【請求項１７】 上記セパレーション工程はスラブ−ゲル電気泳動セパレー
ションを含み、上記データはゲルイメージから得られたデータである請求項１０
の方法。 - 【請求項１８】 上記増幅の工程は、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され
る工程である請求項１０の方法。 - 【請求項１９】 遺伝子材料のセパレーション分析法において、 増幅製品を作るために上記遺伝子材料を増幅し標識化する工程と、 サイジングスタンダードを上記増幅製品と混合する工程と、 セパレーションランにおいて、上記増幅製品と上記サイジングスタンダードを
電気泳動によりセパレーションして、その構成要素をセパレーションする工程と
、 構成要素を示す信号を検出し、検出された信号対時間における変化を示すセパ
レーションデータを作成し、上記セパレーションデータは上記構成要素のサイズ
に対応したピーク値を含む工程と、 上記セパレーションランの品質を示す品質規準を計算し、上記ピーク値の分解
能を計算することと上記セパレーションデータの信号−ノイズ比を計算すること
を含む工程と、 上記品質規準の上記値に基づき、（ｉ）上記分析の次工程に進む、（ｉｉ）上
記セパレーションランを繰り返すか否かを判断するために上記セパレーションデ
ータをマニアル評価する、又は（ｉｉｉ）上記セパレーションランを繰り返す工
程とを有する方法。 - 【請求項２０】 上記セパレーションデータが参照ピークを含み、上記品質
規準を計算する工程が上記参照ピークのミグレーションリニアリティの程度を求
める工程を含む請求項１９の方法。 - 【請求項２１】 上記次工程が、上記セパレーションデータから対立遺伝子
を特定する工程である請求項１９の方法。 - 【請求項２２】 上記品質規準が第１の値範囲にある場合、上記セパレーシ
ョンランを繰り返す請求項１９の方法。 - 【請求項２３】 上記品質規準が第２の値範囲にある場合、上記セパレーシ
ョンランを繰り返すか否かを判断するために上記セパレーションデータをマニア
ル評価する請求項２２の方法。 - 【請求項２４】 上記品規準が第３の値範囲にある場合、上記セパレーショ
ンデータから対立遺伝子を特定する請求項２３の方法。 - 【請求項２５】 上記セパレーション工程は、スラブ−ゲル電気泳動セパレ
ーション・キャピラリ電気泳動セパレーション・及びキャピラリ分析電気泳動セ
パレーションの一つを含み、上記セパレーションデータは電気泳動図である請求
項１９の方法。 - 【請求項２６】 上記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応によって上記遺伝
子材料の選択された部分を増幅する工程である請求項１９の方法。 - 【請求項２７】 上記増幅工程は、上記遺伝子材料の選択された部分をクロ
ーニングする工程である請求項１９の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/036,767 | 1998-03-06 | ||
| US09/036,767 US6019896A (en) | 1998-03-06 | 1998-03-06 | Method for using a quality metric to assess the quality of biochemical separations |
| PCT/US1999/004246 WO1999045148A1 (en) | 1998-03-06 | 1999-02-25 | Method for using a quality metric to assess the quality of biochemical separations |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002505442A true JP2002505442A (ja) | 2002-02-19 |
| JP2002505442A5 JP2002505442A5 (ja) | 2009-04-23 |
| JP4360479B2 JP4360479B2 (ja) | 2009-11-11 |
Family
ID=21890529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (6)
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|---|---|
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| EP (1) | EP1070142B1 (ja) |
| JP (1) | JP4360479B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69938296T2 (ja) |
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-
1999
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- 1999-02-25 DE DE69938296T patent/DE69938296T2/de not_active Expired - Lifetime
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