JP2002504998A - 標的タンパク質とそのリガンド間の相互作用を検出するための蛍光タンパク質の使用 - Google Patents
標的タンパク質とそのリガンド間の相互作用を検出するための蛍光タンパク質の使用Info
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.GFP又は下記に定義される誘導体の一つ若しくは下記に定義されるフラグ メントの一つでラベルされた標的タンパク質と、 −蛍光タンパク質により発光される光を吸収することができる分子か、 −又は蛍光基質のいずれか よりなるラベルでラベルされたそのリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用 の検出及び定量のための、 刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク 質から選択される蛍光タンパク質の使用であって、 その分子吸光係数は約14,000M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍 光収率は約0.38より大きく、このタンパク質は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によってGFPから誘導 される誘導体(但し、これらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント( 但し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 この検出及び定量が: ● GFP若しくは上に定義された誘導体の一つ、又は上に定義されたフラ グメントの一つと、上述の蛍光基質の間(蛍光基質は、それはGFP若 しくは上述の誘導体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの発光波長 で励起性であるか、あるいはGFP若しくは上述誘導体の一つ、又は上 述のフラグメントの一つの励起波長で発光する)、あるいは ● GFP若しくは上述のその誘導体、又は上に定義されたフラグメントの 一つと、蛍光タンパク質により発光される光を吸収するすることができ る上述の分子との間 での蛍光エネルギー移動によって実施される使用。 2.標的タンパク質と、上述のリガンドの間の非共有結合相互作用の検出及び定 量のための、 −蛍光タンパク質により発光される光を吸収することができる分子、 −又は蛍光基質のいずれか よりなるラベルでラベルされたリガンドの使用であって、 該標的タンパク質が、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘 導される蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質で遺伝学的にラベルされ 、そのモル吸光係数は約14,000M-1cm-1より大きく、かつ定量的な蛍光収 率は約0.38より大きく、そのタンパク質は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導される誘導 体(但し、これらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント(但し、こ れらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 この検出及び定量が: ● GFP若しくは上に定義された誘導体の一つ、又は上に定義されたフ ラグメントの一つと、上述の蛍光物質の間(蛍光物質は、GFP若し くは上述の誘導体、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起 性であるか、あるいはGFP若しくは上述誘導体の一つ、又は上述の フラグメントの一つの励起波長で発光する)、あるいは ● GFP若しくは上に定義されたその誘導体、又は上に定義されたフラ グメントと、蛍光タンパク質により発光される光を吸収するすること ができる上述の分子との間 での蛍光エネルギー移動により実施される使用。 3.蛍光タンパク質が、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP又はEGFP)、 −シアン蛍光タンパク質(CFP又はECFP)、 −イエロー蛍光タンパク質(YFP又はEYFP)若しくは −GFPUV、 又はコドンが、ヒト、微生物若しくは植物細胞での発現に最適化されているそれ らの突然変異体、 又は上で定義したタンパク質に関連するそれらより、高いか若しくは低い、吸光 若しく発光波長を有する、これらの突然変異体から選択されるが、但しこれらの 分子吸光係数は約14,000M-1cm-1より大きく、かつこれらの定量的な蛍光 収率は約0.38より大きい、請求項1記載の使用。 4.リガンドが、 ● 蛍光物質でラベル(このラベル化は、 −化学ルートを経由(このとき、蛍光物質は、化学化合物である)するか、 −又は組換えルートを経由(このとき、蛍光物質は、特に刺胞動物の自動蛍光タ ンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択される蛍光ペ プチド又はタンパク質(No.2)であり、そのモル吸光係数は約14,000M-1 cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38より大きく、この蛍光 物質は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導される誘導 体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント(但し、こ のフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択される)して実施される)さ れるか、 ● 又はバイオレット酸の群[Acid Violet 5,CAS 10130-48-0;Acid Viol et 7,CAS 4321-69-1;Acid Violet 17,CAS4 129-84-4],the Acid R ed group[Acid Red 1.CAS 3734-67-6;Acid Red 8,CAS 4787-93-3;A cid Red 37,CAS 6360-07-2;Acid Red 40,CAS 12167-45-2;Acid Red 106,CAS 6844-74-2;Acid Red 114,CAS 6459-94-5]、アリザリン類 、アルミノン、アゾカルミンB[CAS 25360-72-9]、塩基性フシン[Bas ic Red 9,CAS 569-l-9]、ボルドーR[Acid Red 17,CAS 5858-33-3 ]及びカルミン[CAS 1390-65-4]に属する、非蛍光物質のいずれか でラベルされる、請求項1又は3記載の、蛍光タンパク質(No.1) の使用。 5.標的タンパク質及びリガンドが、遺伝学的にラベルされ、蛍光タンパク及び 蛍光物質が、それぞれ、以下の化合物のペア: GFPUV−EYFP EYFP−GFPUV ECFP−EYFP EYFP−ECFP ECFP−EGFP EGFP−ECFP EGFP−EYFP EYFP−EGFP から選択され、そして特にここで、標的タンパク質がEYFP若しくはEGFP タンパク質でラベルされ、そしてリガンドがECFPタンパク質でラベルされる か、又は標的タンパク質がECFPタンパク質でラベルされ、そしてリガンドが EYFP若しくはEGFPタンパク質でラベルされている、請求項1、3及び4 のいずれか1項記載の蛍光タンパク質の使用。 6.GFP若しくは下記に定義される誘導体の一つ又は下記に定義されるフラグ メントの一つで遺伝学的にラベルされた標的タンパク質と、蛍光基質でラベルさ れたそのリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用の検出及び定量のための、 刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質 から選択される蛍光タンパク質の使用であって、 そのモル吸光係数は約14,000M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍 光収率は約0.38より大きく、そのタンパク質は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導される誘導 体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント(但し、そ れらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 この検出及び定量が: GFP若しくは上に定義された誘導体の一つ、又は上に定義されたフラグメント の一つと、上述の蛍光物質の間(蛍光物質は、それはGFP若しくは上に定義さ れた誘導体、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起性であるか、ある いはGFP若しくは上述誘導体の一つ、又は上述のフラグメントの一つの励起波 長で発光する)の蛍光エネルギー移動により実施される、請求項1記載の使用。 7.蛍光タンパク質が、EGFPであり、ここで −EGFPが、蛍光エネルギー供与体であり、EGFPにより発光され る光を吸収するラベルが蛍光物質又は非蛍光物質であり、マーカーが、特にラベ ルが蛍光物質であるとき、その励起スペクトルがEGFPの発光スペクトルと重 なる物質から選択され、それは4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,4a−ジ アザ−s−インダセン(Bodipy)、エオシン、エリトロシン、テトラメチルローダ ミン、Texas Redの名前でMolecular Probeにより販売されているスルホローダミ ン101及びそれらの誘導体類(一方において、グラフトさせ、かつ他方におい て、EGFPの発光スペクトルと重なる励起スペクトルを有する)から選択され 、 そしてラベルが蛍光物質ではないとき、それは、バイオレット酸の群[Aci d Violet 5,CAS 10130-48-0;Acid Vlolet 7,CAS 4321-69-1;Acid Viole t 17,CAS 4129-84-4],the Acid Red群[Acid Red 1.CAS3734-67-6;Acid Red 8,CAS 4787-93-3;Acid Red 37,CAS 6360-07-2;Acid Red 40,CAS 1 2167-45-2;Acid Red 106,CAS 6844-74-2;AcidRed 114,CAS 6459-94-5] 、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミンB[CAS 25360-72-9]、塩基性 フシン[Basic Red 9,CAS 569-1-9]、ボルドーR[Acid Red 17,CAS 58 58-33-3]及びカルミン[CAS 1390-65-4]から選択されるか、 −又はEGFPは蛍光エネルギー受容体であり、蛍光物質が、蛍光エネル ギー供与体であり、そしてその発光スペクトルがEGFPの励起スペクトルに重 なる物質、特にクマリン類、フルオレスカミン、6−(N−メチルアリニノ)ナ フタレン、(マンシル)及びその誘導体類(一方において、グラフトさせ、他方 において、EGFPの発光スペクトルに重なる励起スペクトルを有する)から選 択されるか、 −又は蛍光タンパク質がECFPであり、そして蛍光エネルギー供与体 であり、そして蛍光物質がエネルギー受容体であり、そしてフルオレセイン及び 7−ニトロ−2−ベンゾキサ−1,3−ジアゾールから選択されるか、 −又は蛍光タンパク質がECFPであり、蛍光エネルギー受容体であり 、そして蛍光物質がエネルギー供与体であり、ピレン及びクマリン又はその誘導 体類(一方において、グラフトさせ、他方において、ECFPの発光スペクトル に重なる励起スペクトルを有する)から選択される、請求項1〜6のいずれか1 項記載の使用。 8.標的タンパク質が、 −Gタンパク質に結合した膜結合レセプター類(特に、Supplement Trend i n Pharmacological Sciences,1997(Receptor and ion Channel Nomenclature) 、 −増殖因子レセプター類(特に、構造的にインスリンレセプター(Yarden,Y .and Ullrich,A.1988,Biochemistry 27:3113-3119)又はインターフェロン γレセプター(Brisco,J.et al.1996,Phylos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol .Sci.351:167-171;Ihle,J.N.1995,Nature 377:591-594)に結合している それら)、 −イオンチャンネルレセプター類(特に、Supplement Trend in Pharmacolo gical Sciences,1997(Receptor and ion Channel Nomenclature))、 −細胞内核レセプター類(特に、構造的にステロイドレセプターに結合して いるそれら(Mangelsdorf et al.1995,Cell,83:835-839;Wurtz,J.L.et al .1996,Nature Struct.Biol.3:206))から選択される、請求項1〜7のいず れか1項記載の使用。 9.標的タンパク質が、Gタンパク質に結合した膜結合レセプター類から選択さ れる、請求項1〜8のいずれか1項記載の使用。 10.標的タンパク質、特にレセプターと、そのリガンドの一つとの間の非共有 結合相互作用を、検出しかつ定量する方法であって、 −標的タンパク質の遺伝子と融合した蛍光タンパク質をコードする遺伝 子を含むDNA配列を含む細胞又は細胞のフラグメントが、調製され、蛍光タン パク質のための遺伝子と上述の標的タンパク質の遺伝子との間の融合が、標的タ ンパク質の特性、特にレセプターの特性が、蛍光タンパク質の存在により改質さ れず、すなわち: ● 標的タンパク質、特にレセプターとリガンドとの間の相互作用が、 改質されず、 ● 応答変換機能が、改質されず、蛍光タンパク質は、刺胞動物 自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択さ れ、そのモル吸光係数は約14,000M-1cm-1より大きく、かつその定量的な 蛍光収率は約0.38より大きく、そのタンパク質は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導さ れる誘導体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント( 但し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 −上述の細胞又は上述の細胞フラグメントは、上述の標的タンパク質、 特に上述のレセプターのためのリガンド(これは、 −蛍光タンパク質により発光された光を吸収することができる分子、 −又は蛍光物質のいずれかからなるラベルでラベルされている)と接触 して配置され、 そして蛍光タンパク質が蛍光エネルギー供与体であり、そしてラベルは 、蛍光エネルギー受容体であるか、又は蛍光タンパク質が蛍光エネルギー受容体 であり、そしてラベルが蛍光エネルギー供与体である蛍光物質であるかのいずれ かであり、そして −照射が、蛍光タンパク質を励起するか、又は蛍光物質を励起するかの いずれかを可能にする波長で実施され、 −接触して配置する上述の工程、及び同時にか又は順次にかのいずれか で実施されるべき照射を可能にするか、あるいは −上述の細胞又は上述の細胞のフラグメントが、上述のタンパク質、特 に上述のレセプターのためのリガンドと接触して配置され、ラベルでラベルされ 、細胞又はリガンドが、接触して配置される前に照射され、 −供与体の発光の大きさの減少及び/又は受容体の発光に特有の発光シ グナル特性のいずれかが、検出されることを特徴とする方法。 11.標的タンパク質、特にレセプターと、そのリガンドの一つとの間の非共有 結合相互作用を、検出かつ定量する方法であって、 −標的タンパク質と融合した蛍光タンパク質(そのタンパク質−リガン ド相互作用を測定することが所望されている)が調製され、蛍光タンパク質と上 述の標的タンパク質との間の融合が、タンパク質の特性、特にレセプターの特性 が、標的タンパク質の存在により改質されず、すなわち: ● 標的タンパク質、特にレセプターとリガンドとの間の相互作用が、改質 されず、 ● 応答変換機能が、改質されず、 蛍光タンパク質が、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導さ れる蛍光タンパク質から選択され、その分子吸光係数は約14,000M-1cm-1よ り大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38より大きく、そのタンパク質 は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導さ れる誘導体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント( 但し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 −標的タンパク質で融合された上述の蛍光タンパク質が、上述の標的タ ンパク質、特に上述のレセプターのためのリガンドと接触して配置され、このリ ガンドが、 −蛍光タンパク質により発光された光を吸収することができる分子、 −又は蛍光物質のいずれかからなるラベルでラベルされ、 そして蛍光タンパク質が蛍光エネルギー供与体であり、そしてラベルが 蛍光エネルギー受容体であるか、又は蛍光タンパク質が蛍光エネルギー受容体で あり、そしてラベルが蛍光エネルギー供与体である蛍光物質であるかのいずれか であり、そして −照射が、蛍光タンパク質を励起するか、又は蛍光物質を励起するかの いずれかを可能にする波長で実施され、 −接触して配置される上述の工程、及び同時にか又は順次にかのいずれ かで実施されるべき照射を可能にするか、又は −標的タンパク質で融合された上述の蛍光タンパク質が、上述のタンパ ク質、特に上述のレセプターのためのリガンドと接触して配置され、このリガン ドが、 −蛍光タンパタ質により発光される光を吸収することができる分子、 −又は蛍光物質のいずれかからなるラベルでラベルされ、 標的タンパク質で融合された蛍光タンパク質、又はリガンドは、接触し て配置される前に照射され、 −供与体の発光の大きさの減少及び/又は受容体の発光の発光シグナル 特性のいずれかが、検出されることを特徴とする方法。 12.−標的タンパク質で融合された蛍光タンパク質及び上述のタンパク質のリ ガンド(リガンドは、ラベルでラベルされている)と接触して配置する工程の前 、後又は同時にか、又は −細胞又は細胞フラグメント及び上述のタンパク質(ラベルでラベルさ れている)と接触して配置する工程の前、後又は同時に、更なる工程を導入し、 この更なる工程が、 −標的タンパク質で融合されている上述の蛍光タンパク質を、上述の非 ラベルリガンドと接触させ、そして上述のラベルされたリガンドと同時接触させ て配置するか、 −又は上述の細胞又は上述の細胞フラグメントを、上述の非ラベルリガ ンド及び上述のラベルしたリガンドと同時に接触させて配置することからなり、 −供与体の発光の大きさの減少及び/又は受容体の発光のシグナル特性 が、ラベルされたリガンドを用いる場合並びにラベルされたリガンド及び非ラベ ルリガンドを同時に用いた場合に、それぞれ検出され、 −そして供与体の発光の大きさの減少及び/又はそれぞれに得られた受 容体の発光シグナルの特性を比較する、請求項10又は11記載の方法。 13.蛍光タンパク質が、EGFPであり、そして −EGFPが蛍光エネルギー供与体であり、ラベルが蛍光エナルギー受 容体であり、そして特にラベルが蛍光物質であるとき、励起スペクトルがEGF Pの発光スペクトルと重なる物質から選択され、4,4−ジフルオロ−4−ボラ −3a,4a−ジアザ−s−インダセン(Bodipy)、エオシン、エリトロシン、テ トラメチルローダミン、Texas Redの名前でMolecular Probeにより販売されてい るスルホローダミン101及びそれらの誘導体類(一方において、グラフトさせ 、かつ他方において、EGFPの放射スペクトルと重なる励起スペクトルを有す る)から選択され、 そしてラベルが蛍光物質ではないとき、それは、バイオレット酸の群[A cid Violet 5,CAS 10130-48-0;Acid Violet 7,CAS 4321-69-1;Acid V iolet 17,CAS 4129-84-4],the Acid Red群[Acid Red 1.CAS3734-67- 6;Acid Red 8,CAS 4787-93-3;Acid Red 37,CAS 6360-07-2;Acid Red 40,CAS 12167-45-2;Acid Red 106,CAS 6844-74-2;Acid Red 114,CAS 6459-94-5]、アリザリン類、アルミノン、アゾカルミンB[CAS 25360-7 2-9]、塩基性フシン[Basic Red 9,CAS569-61-9]、ボルドーR[Acid Re d 17,CAS 5858-33-3]及びカルミン[CAS 1390-65-4]から選択される か、 −又はEGFPが蛍光受容体であり、蛍光物質が蛍光エネルギー供与体であり、 かつその放射スペクトルがEGFPの励起スペクトルに重なる物質、特にクマリ ン類、フルオレスカミン、6−(N−メチルアニリノ)ナフタレン、(マンシル )及びその誘導体類(一方において、グラフトさせ、他方において、EGFPの 放射スペクトルに重なる励起スペクトルを有する)から選択される、請求項12 記載の方法。 14.タンパク質−リガンド相互作用の測定を所望するタンパク質が、 −Gタンパク質に結合した膜結合レセプター類(特に、Supplement Trends i n Pharmacological Sciences,1997(Receptor and ion Channel Nomenclature )中の)、 −増殖因子レセプター類(特に、構造的にインスリンレセプター(Yarden,Y .and Ullrich,A.1988,Biochemistry 27:3113-3119)又はインターフェロン γレセプター(Brisco,J.et al.1996,Phylos.Trans.R.Soc.Lond. B.Biol.Sci.351:167-171;Ihle,J.N.1995,Nature 377:591-594)へ結合して いるそれら)、 −イオンチャンネルレセプター類(特に、Supplement Trends in Pharmacolo gical Sciences,1997(Receptor and ion Channel Nomenclature)中の)、 −細胞内核レセプター類、特に構造的にステロイドレセプターに結合してい るそれら(Mangelsdorf et al.1995,Cell,83:835-839;Wurtz,J.L.et al. 1996,Nature Struct.Biol.3:206)から選択される、請求項10〜13のいず れか1項記載の方法。 15.蛍光タンパク質がEGFPであり、そしてラベルされた物質がBodipyであ り、そしてEGFPの発光の大きさの減少又はエネルギー移動からもたらされる Bodipyの発光シグナルが検出され、照射波長がEGFPの励起波長に相当する、 請求項10〜14のいずれか1項記載の方法。 16.蛍光タンパク質がEGFPであり、ラベルされた物質が、クマリンであり 、そしてクマリンの大きさの減少又はエネルギー移動からもたらされるEGFP の発光シグナルのいずれかが検出され、照射の波長がクマリンの励起波長に相当 する、請求項10〜15のいずれか1項記載の方法。 17.蛍光タンパク質が、N末端側で融合し、そして標的タンパク質、特にレセ プターが、C末端側で融合する、請求項10〜16のいずれか1項記載の方法。 18.蛍光タンパク質が、C末端側で融合し、そして標的タンパク質、特にレセ プターが、N末端側で融合する、請求項10〜17のいずれか1項記載の方法。 19.特にGタンパク質へ結合されたレセプターの場合に、蛍光タンパク質が、 標的タンパク質−リガンド結合部位に相当しない位置で標的タンパク質に挿入さ れ、この挿入がレセプターの第一又は第三の細胞内ループで起るが、但し挿入が 、レセプターの特性又は蛍光タンパク質の蛍光のいずれかを破壊しない、請求項 10〜18のいずれか1項記載の方法。 20.細胞が、哺乳動物の細胞、特に付着性又は浮遊のHEK293細胞、CH O細胞、COS細胞、リンパ球系、繊維芽細胞など、又は酵母細胞、pichia pas torisのようなpichia、saccharomy cescerevisia、saccharomyces kluyveriのよ うなsaccaromyces、Hansenula polymorphaのようなHansenula又は baculovirusのようなウイルスに感染された昆虫の細胞、特にTNI又はsf9 細胞、又はfungi、特にAspergillusの株(A.oryzae,A.nidulans,A.niger)、 Neurospora、Fusarium又はTrichodermaである、請求項10〜19のいずれか1 項記載の方法。 21.シグナルが、慣用の蛍光分光装置、又は供与体と受容体を混合した後に、 蛍光を検出するためのシステムを備えた急速混合装置中で検出することができ、 かつ同じ製薬学的特異性の非蛍光物質の添加により消すことができ、特にシグナ ル/ノイズ比が約2より大きい、請求項10〜20のいずれか1項記載の方法。 22.レセプターに関して生物学的に活性であり、かつ該レセプターと可逆的な 、非共有結合相互作用を形成することができる分子を同定するために、Gタンパ ク質に結合したリセプターからなる標的タンパク質とGタンパク質との間の非共 有結合相互作用の検出及び定量のための、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得 られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質の使用 であり、その分子吸光係数は約14,000M-1cm-1より大きく、かつ定量的な 蛍光収率は約0.38より大きく、そのタンパク質が、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導さ れる誘導体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント( 但し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 該レセプターが、遺伝子的に蛍光タンパク質でラベルされ、そしてGタンパク 質が、 −蛍光タンパク質により発光される光を吸収し得る分子か、 −又は特に刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導さ れる蛍光タンパク質から選択される蛍光物質のいずれか よりなるラベルでラベルされ、その分子吸光係数は約14,000M-1cm-1より 大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38より大きく、そのタンパク質は 、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導さ れる誘導体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント(但 し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 この検出及び定量化が: ● GFP若しくは上に定義された誘導体の一つ、又は上に定義されたフラ グメントの一つと、上述の蛍光物質の間(蛍光物質は、それはGFP若 しくは上述の誘導体、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起 性であるか、あるいはGFP若しくは上述の誘導体の一つ、又は上述の フラグメントの一つの励起波長で発光するようである)、あるいは ● GFP若しくは上述の誘導体、又は上述のフラグメントと、蛍光タンパ ク質により発光される光を吸収するすることができる上述の分子との間 での蛍光エネルギー移動により実施される使用。 23.レセプターに関して生物学的に活性であり、かつ該レセプターと可逆的な 、非共有結合相互作用を形成することができる分子を同定するために、Gタンパ ク質に結合したリセプターからなる標的タンパク質とGタンパク質との間の非共 有結合相互作用の検出及び定量のための、 −蛍光タンパク質により発光された光を吸収することができる分子 −又は刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される 蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質の使用であり、その分子吸光係数 は約14,000M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38 より大きく、そのタンパク質が、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導さ れる誘導体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント(但 し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 該レセプターが、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導さ れる蛍光タンパク質から選択される蛍光タンパク質のいずれかよりなるラベルで ラベルされ、その分子吸光係数は約14,000M-1cm-1より大きく、かつその 定量的な蛍光収率は約0.38より大きく、そのタンパク質は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導さ れる誘導体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント(但し、 それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 この検出及び定量が: ● GFP若しくは上に定義された誘導体の一つ、又は上に定義されたフラ グメントの一つと、上述の蛍光物質の間(蛍光物質は、それはGFP若 しくは上述の誘導体、又は上述のフラグメントの一つの発光波長で励起 性であるか、あるいはGFP若しくは上述の誘導体の一つ、又は上述の フラグメントの一つの励起波長で発光する)、あるいは ● GFP若しくは上述の誘導体、又は上述のフラグメントと、蛍光タンパ ク質により発光される光を吸収するすることができる上述の分子との間 での蛍光エネルギー移動により実施される使用。 24.蛍光タンパク質が、EGFP、ECFP及びEYFP、又はそれらの突然 変異体から選択され、その分子吸光係数が、約14,000M-1cm-1より大きく 、かつその定量的な蛍光収率が、約0.38より大きい、請求項22又は23記 載の使用。 25.レセプターが、 −Gタンパク質に結合したレセプター、特に、Supplement Trends in Pha rmacological Sciences,1997(Receptor and ion Channel Nomenclature)に記載 されているそれら、 −これらのレセプターに関連して生物学的に活性な分子が同定されてい る想定上のGタンパク質に結合したレセプターをコードする配列(この配列は特 にGenbank及びEMBL配列ライブラリー及び提携ライブラリーで入手し得る孤 児(オーファン)レセプター配列から選択される)から選択される、請求項22 又は24記載の使用。 26.Gタンパク質が、Jounal of Receptor Research,vol 13,pp.19-26,199 3又はAngewandte Chemie,ed.Engl.Vol.34,pp.1406-1419,1995に記載されて いるGタンパクから選択される、請求項23記載の使用。 27.レセプターに関して生物学的に活性であり、かつ該レセプターと可逆的な 、非共有結合相互作用を形成することができる分子を同定するために、Gタンパ ク質に結合されたレセプターからなる標的タンパク質と、Gタンパク質の非共有 結合相互作用を検出しかつ定量するための方法であって、 −Gタンパク質に結合されたレセプターのための遺伝子と融合された蛍 光タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA配列を発現する、細胞又は細胞の フラグメントが調製され、蛍光タンパク質をコードする遺伝子と、上述のレセプ ターの間の融合は、レセプターの特性が蛍光タンパク質の存在により改質されず 、すなわち: ● レセプターとGタンパク質との間の相互作用が、改質されず、 ● レセプターと生物学的に活性な分子との間の相互作用が、改質されず、 ● 応答形質導入機能が、改質されず、蛍光タンパク質が、刺胞動物の自動 蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タンパク質から選択され、 その分子吸光係数は約14,000M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光 収率は約0.38より大きく、そのタンパク質は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導さ れる誘導体(但し、それらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント(但 し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持する)から選択され、 −Gタンパク質が、 −蛍光タンパク質により発光された光を吸収することができる分子、 −又は蛍光物質のいずれかからなるラベルでラベルされ、 −蛍光タンパク質及び上述のラベルは、それらが一つから他へエネルギ ーを移動し、蛍光タンパク質はエネルギー供与体であることが可能であるか、又 は上述のラベルはエネルギー受容体であることができ、 蛍光タンパク質でラベルされたレセプターと上に定義されたラベルでラ ベルされたGタンパク質との間の相互作用が、蛍光エネルギー移動により検出さ れることを特徴とする方法。 28.生物学的に活性な、非蛍光分子が、細胞又は細胞のフラグメント(蛍光タ ンパク質でラベルされたレセプター及びラベルでラベルされたGタンパクをコー ドするDNAを発現する)に加えられることによる、レセプターと該レセプター に関して生物学的に活性であり、かつ該レセプターと可逆的な、非共有結合相互 作用を形成することができる非蛍光分子との相互作用を検出しかつ可能ならば定 量するための、請求項27記載の方法であって、 −アゴニストであり、かつ生物学的に活性な非蛍光分子が、蛍光タンパ ク質でラベルされたレセプターとラベルでラベルされたGタンパク質との間のエ ネルギー移動での変化により検出されるシグナル変換を誘発し、 −アンタゴニストであり、生物学的に活性な非蛍光分子が、アゴニスト によりもたらされ、蛍光タンパク質でラベルされたレセプターとラベルでラベル されたGタンパク質との間の蛍光エネルギーの移動での変化により検出されるシ グナル変換を阻害することを特徴とする方法。 29.標的タンパク質の遺伝子で融合され蛍光タンパク質をコードする遺伝子を 含むDNA配列を含む、細胞又は細胞のフラグメントであって、 蛍光タンパク質は、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導 される蛍光タンパク質から選択され、その分子吸光係数は約14,000M-1cm- 1 より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38より大きく、蛍光タンパ ク質の遺伝子と上述の標的タンパク質との融合が、 ● 標的タンパク質の特性は、蛍光タンパク質の存在により改質されず、 いわば ● 標的タンパク質とリガンドの間の相互作用は改質されず、 ● 応答変換機能は改質されないが、 但し、 ● 標的タンパク質が、N末端位で、6個のヒスチジンを含む精製配列、 ヘマトグルチニンエピトープ及び蛍光タンパクで、連続的に融合さ れる、ラットのグリココルチコイドレセプターであり、細胞株147 1.1中で発現するとき、蛍光タンパク質は、GFP(突然変異S6 5Tを有するプラスミドTU65の768塩基対)以外であり、 ● 標的タンパク質が、SalI及びBamHI部位での蛍光タンパク質 のC末端で融合した、その初めの131アミノ酸の先端を切ったヒト のグリココルチコイドレセプターであり、そして細胞Cos−1で発 現するとき、該蛍光タンパク質は、Inouye S及びTsujl,F.I 1994 F ebs Letters,341:277-280の論文に記載されているように、GFP以 外であり、 ● 標的タンパク質が、C末端で、蛍光タンパク質で融合されているHE K293細胞で発現されたラットのNMDA R1サブユニットであ るとき、蛍光タンパク質は野生型GFPのアミノ酸2−238からな るもの以外であり、 ● 標的タンパク質が、分子内の第二のメッセンジャーのための、レセプ ターのフラグメントであるとき、蛍光タンパク質は、そのGFP及び その誘導体以外であるを含むDNA配列を含む、細胞又は細胞のフラ グメントである ようである、細胞又は細胞のフラグメント。 30.標的タンパク質の遺伝子で融合された蛍光タンパク質をコードする遺伝子 を含むDNA配列を含む細胞又は細胞のフラグメントであって、 蛍光タンパク質は、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導 される蛍光タンパク質から選択され、その分子吸光係数は約14,000M-1cm- 1 より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38より大きく、蛍光タンパ ク質の遺伝子と上述の標的タンパク質との融合が、 ● リガンドの特性は、蛍光物質の存在により改質されず、いわば ● 標的タンパク質とリガンドの間の相互作用は改質されず、 ● 応答変換機能は改質されない ようである、細胞又は細胞のフラグメント。 31.一刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導される蛍光タ ンパク質から選択される蛍光物質(その分子吸光係数は約14,000M-1cm-1 より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38より大きい)で融合された Gタンパク質から構成されるリガンドをコードする遺伝子、 −及び場合により、レセプターからなる標的タンパク質のための遺伝子 で融合されている蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA配列を含む、 細胞又は細胞のフラグメントであって、 蛍光タンパク質が、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、又は誘導 される蛍光タンパク質から選択され、その分子吸光係数は約14,000M-1cm- 1 より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38より大きく、 −蛍光タンパク質の遺伝子と、上述の標的タンパク質との間の融合及び 場合により蛍光タンパク質の遺伝子と、レセプターの遺伝子との間の融合が、 ● Gタンパク質の特性は、蛍光物質の存在で改質されず、 ● レセプターの特性は、蛍光タンパク質の存在で改質されず、いわば ● 標的タンパク質とリガンドとの間の相互作用は、改質されず、 ● 応答変換機能は改質されず、但し ● 標的タンパク質が、N末端位で、6個のヒスチジンを含む精製配列、 ヘマトグルチニンエピトープ及び蛍光タンパクで連続的に融合される 、ラットのグリココルチコイドレセプターであり、細胞株1471. 1中で発現するとき、蛍光タンパク質は、GFP(突然変異S65T を有するプラスミドTU65の768塩基対)以外であり、 ● 標的タンパク質が、SalI及びBamHI部位での蛍光タンパク質 のC末端で融合した、その初めの131アミノ酸の先端を切ったヒト のグリココルチコイドレセプターであり、そして細胞Cos−1で発 現するとき、該蛍光タンパク質は、Inouye S及びTsujl,F.I 1994 F ebs Letters,341:277-280の論文に記載されているように、GFP以 外であり、 ● 標的タンパク質が、C末端で、蛍光タンパク質で融合されている HEK293細胞で発現されたラットのNMDA R1サブユニット であるとき、蛍光タンパク質は野生型GFPのアミノ酸2−238か らなるもの以外であり、 ● 標的タンパク質が、細胞内の第二のメッセンジャーのための、レセプ ター又はレセプターのフラグメントであるとき、蛍光タンパク質は、 そのGFP及びその誘導体以外であるようである、細胞又は細胞のフ ラグメント。 32.蛍光タンパク質でラベルされた標的タンパク質と、 −蛍光タンパク質により発光された光を吸収することができる分子、 −又は蛍光物質のいずれか からなるラベルでラベルされているリガンドの一つとの間の非共有結合相互作用 を検出し及び定量するための、キット又は用具であって、 この蛍光タンパク質は、刺胞動物の自動蛍光タンパク質から得られるか、 又は誘導される蛍光タンパク質から選択され、その分子吸光係数は約14,00 0M-1cm-1より大きく、かつその定量的な蛍光収率は約0.38より大きく、こ のタンパク質は、特に、 −グリーン蛍光タンパク質(GFP)、又は −1個以上のアミノ酸の、付加、欠失又は置換によりGFPから誘導さ れる誘導体(但し、これらの誘導体は、蛍光特性を保持する)、 −又はGFPのフラグメント、若しくは上述の誘導体のフラグメント(但 し、それらのフラグメントは、蛍光特性を保持し、そのリガンドは蛍光物質でラ ベルされる)から選択され、該キットは、 −蛍光タンパク質で融合された標的タンパク質又は安定細胞株(それは、上 で定義されている蛍光タンパク質で融合された該標的タンパク質をコードする、 蛍光タンパク質で融合されているタンパク質又は核酸配列を含むプラスミドを発 現することができる)、 −上述のラベルでラベルされたリガンド、並びに −上述タンパク質と、上述のリガンドとの間のエネルギー移動のために必要 とする緩衝物及び媒体を含む、キット又は用具。 33.蛍光タンパク質(No.1)でラベルされた標的タンパク質と、蛍光タンパ ク質(No.2)に相当する蛍光物質でラベルされているそのリガンドの一つとの 間の非共有結合相互作用を検出し及び定量するためのキット又は用具であって、 蛍光タンパク質(No.1)が、蛍光タンパク質、EYFP若しくはEGFPか ら選択され、そしてリガンドが、蛍光タンパク質(No.2)、ECFPでラベルさ れているか、又は蛍光タンパク質(No.1)が、EGFPであり、そしてリガン ドが、蛍光タンパク質(No.2)、EYFP若しくはEGFPでラベルされており 、該キットは、 −蛍光タンパク質(No.1)で融合された標的タンパク質をコードする核酸 配列を含むプラスミド、及び ● 蛍光タンパク質(No.2)で融合されたリガンドをコードする核酸配列 を含むプラスミド、上述のラベルでラベルされたリガンド、又は ● 組換えルートを介して得られ、かつ精製された蛍光タンパク質(No.2 )で融合されたリガンド、 −又は蛍光タンパク質(No.1)で融合された標的タンパク質を発現するこ とができる安定な細胞株、及び ● 蛍光タンパク質(No.2)で融合されたリガンドを発現することができ る安定な細胞株、又は ● 組換えルートを介して得られ、かつ精製された蛍光タンパク質(No.2 )で融合されたリガンド、並びに −上述タンパク質と、上述のリガンドとの間のエネルギー移動のために必要 とする緩衝物及び媒体を含む、キット又は用具。 34.蛍光タンパク質(No.1)でラベルされたGタンパク質に結合したレセプ ターからなる標的タンパク質と、蛍光タンパク質(No.2)に相当する蛍光物質 でラベルされているGタンパク質との間の非共有結合相互作用を検出し及び定量 するためのキット又は用具であって、 蛍光タンパク質(No.1)が、蛍光タンパク質、EYFP若しくはEGFPか ら選択され、そしてGタンパク質が、蛍光タンパク質(No.2)、ECFPでラベ ルされているか、又は蛍光タンパク質(No.1)が、ECFPであり、そしてG タンパク質が、蛍光タンパク質(No.2)、EYFP若しくはEGFPでラベルさ れており、該キットは、 −蛍光タンパク質(No.1)で融合されたレセプターをコードする核酸配列 を含むプラスミド、及び ● 蛍光タンパク質(No.2)で融合されたGタンパク質をコードする核酸 配列を含むプラスミド又は ● 組換えルートを介して得られ、かつ精製された蛍光タンパク質(No.2 )で融合されたGタンパク質、 −又は蛍光タンパク質(No.1)で融合されたレセプターを発現することが できる安定な細胞株、及び ● 蛍光タンパク質(No.2)で融合されたGタンパク質を発現することが できる安定な細胞株、又は ● 組換えルートを介して得られ、かつ精製された蛍光タンパク質(No.2 )で融合されたGタンパク質、並びに −上述のレセプターと上述のGタンパク質との間のエネルギー移動のために 必要とする緩衝物及び媒体を含む、キット又は用具。
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