JP2002504819A

JP2002504819A - Diacylglycerol transferase protein

Info

Publication number: JP2002504819A
Application number: JP50288399A
Authority: JP
Inventors: ラーディザバル，キャスリン，デニス; メッツ，ジェームズ，ジョージ; ラッスナー，マイケル，ダブル．; トンプソン，グレゴリー，エー．
Original assignee: カルジーンエルエルシー
Priority date: 1997-06-05
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2002-02-12
Also published as: KR20010013431A; CN1266460A; EP1003882A1; CA2292766A1; WO1998055631A1

Abstract

(57)【要約】本発明により、1,2-ジアシルグリセロールとアシル-CoAとからのトリグリセリドの産生を触媒することができるアシルトランスフェラーゼタンパク質が提供される。本発明には、部分的に精製されたジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DAGAT)が含まれている。このタンパク質は、脂肪酸アシル-CoA基質とジアシルグリセロール基質とからのトリアシルグリセロールの形成に対して活性を有する。特に興味深いものは、約40kDの分子質量を有するMortierella rammaniana DAGATである。このほかに、DAGATタンパク質から得られるアミノ酸配列および核酸配列、ならびに改変されたトリアシルグリセロールレベルを有するトランスジェニック宿主細胞を提供するための、該配列の使用も、本発明の対象である。 (57) [Summary] The present invention provides an acyltransferase protein that can catalyze the production of triglycerides from 1,2-diacylglycerol and acyl-CoA. The present invention includes partially purified diacylglycerol acyltransferase (DAGAT). This protein is active for the formation of triacylglycerols from fatty acyl-CoA substrates and diacylglycerol substrates. Of particular interest is Mortierella rammaniana DAGAT having a molecular mass of about 40 kD. In addition, the amino acid and nucleic acid sequences obtained from the DAGAT protein, and the use of said sequences to provide transgenic host cells with altered triacylglycerol levels are also an object of the invention.

Description

【発明の詳細な説明】ジアシルグリセロールトランスフェラーゼタンパク質本出願は、米国特許出願第60/048,625号の一部継続出願および米国特許第5,67 9,881号の継続出願である。技術分野本発明は、酵素、該酵素を精製して得る方法、該酵素に関連したアミノ酸および核酸の配列、ならびに遺伝子工学用途におけるこれらの組成物の使用方法に関する。序背景植物油は、種々の工業用途および食料用途に使用される。新規な植物油組成物および／または生合成を介したもしくは天然の植物由来の供給源から油組成物を得る改良された手段が必要とされている。油の使用目的にもよるが、多種多様な脂肪酸組成物が望まれる。例えば、ある場合には、所望の油をより低コストで得るために、脂肪種子の油対種子粉質比をより大きくすることが有用であろう。この典型的な例は、高価な油製品であろう。あるいはこのような脂肪種子が動物の優れた飼料になることもあろう。ある場合には、より低カロリーにするために、脂肪種子の油対種子粉質比をより小さくすることが有用であろう。他の用途では、心臓血管系に関わる健康上の理由から、不飽和脂肪酸の含有率のより高い食用植物油が望まれる。また、そのほかに、パーム油、ヤシ油、またはココア油のように飽和分の多い熱帯植物油の代替物として、温帯植物油もまた、種々の工業用途および食品用途に使用されるであろう。このような油および／または改変された脂肪酸組成物を得るとされている手段の１つとして、植物を遺伝子工学的に処理することが考えられる。しかしながら、植物を遺伝子工学的に処理するためには、安定にかつ遺伝しうる形で遺伝子材料を植物中に移入する適切な手段がなければならない。このほか、所望の表現型を生成することのできる核酸配列、このような核酸配列が正しく適用されるように指令することのできる調節領域などがなければならない。更に、所望の表現型を生成するために、グリセロ脂質合成に対するいわゆるケネディー経路を、反応体と該経路を通過する代謝速度との比の調節または変更ができる程度に、変化させる必要があることを理解しなければならない。高等植物は、共通の代謝経路を介して油を合成すると思われる。脂肪酸は、総称して脂肪酸合成酵素(FAS)として知られる酵素により触媒される一連の反応を介してアセチル-CoAからプラスチド中で作製される。プラスチド中で産生された脂肪酸は、細胞のサイトゾル領域に運び出され、補酵素Aにエステル化される。これらのアシル-CoAは、小胞体(ER)中におけるグリセロ脂質合成に対する基質である。グリセロ脂質合成自体は、ホスファチジン酸(PA)およびジアシルグリセロール(DAG)を最初に誘導する一連の反応である。これらの代謝中間体はいずれも、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、またはホスファチジルコリン(PC)ような膜リン脂質に誘導されることもあるし、種子発芽時に使用される保存形態のエネルギーとして種子が利用する植物油の主成分である中性トリアシルグリセロール(TAG)を形成すべく利用されることもある。ジアシルグリセロール(DAG)は、グリセロール-3-ホスフェートおよび脂肪酸アシル-CoAから2段階で合成される。すなわち、逐次的に、グリセロール-3-ホスフェートアシルトランスフェラーゼ(G3PAT)、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(DAGAT)を触媒としてPAが作製され、更に、ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)を触媒とする加水分解ステップでDAGが作製される。ほとんどの細胞中では、DAGを用いて膜リン脂質が作製され、その第1のステップは、CTP-ホスホコリンシチジルトランスフェラーゼを触媒とするPC合成である。貯蔵油を産生する細胞では、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DAGAT)を触媒とする反応においてDAGが第3脂肪酸でアシル化される。全体として、これらの反応は、一般にケネディー経路と呼ばれる経路の一部分を形成する。脂肪酸の位置特異性に関するかぎり、TAGの構造は、脂肪酸アシルCo-A基質およびグリセロールバックボーン基質に対する3つのアシルトランスフェラーゼのそれぞれの特異性によって決まる。従って、例えば、多くの温帯地域種の種子から得られるアシルトランスフェラーゼの場合、sn-1位またはsn-3位には飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸のいずれかが存在可能となるが、sn-2位には不飽和脂肪酸だけが存在可能となる傾向がみられる。sn-2位の不飽和脂肪酸に対する絶対特異性は、DAGAT酵素の基質選択性によって決まる。ココアのようないくつかの種では、sn-1位が飽和脂肪酸でエステル化されている場合にはsn-3位のアシル化は明らかに飽和脂肪酸が優位であるという傾向も見られることがTAG組成物から示唆される。従って、SUS（S=飽和脂肪酸、U=不飽和脂肪酸）型の構造TAGの割合は、 sn-2位に不飽和脂肪酸が結合した脂肪酸組成全体に基づくランダム分布から予測されるものよりも大きい。このことから、DAGATはまた、TAG構造の調節さもなければTAG合成の制御にも重要な役割を果たすことが示唆される。 DAGATに触媒される反応は、グリセロ脂質の生合成において、決定的な分岐点に位置する。このような分岐点の酵素は、代謝調節部位に対する主要な候補になると考えられる。ジアシルグリセロールの合成から始まるTAGおよび膜脂質の合成は、共通のG3PAT、DAGAT、およびPAPを共用する。すべての細胞には膜が存在するので、これらの酵素は間違いなく存在する。油合成をユニークなものにしているのは、DAGAT反応である。DAGAT活性体が存在すると、DAGは膜に入る以外の挙動を呈する。TAG合成が促進されるのはDAGAT酵素が存在するからであり、更に、DAGAT活性体および／またはジアシルグリセロールの濃度は、カスケード制御を介して直接的または間接的に、グリセロ脂質への代謝速度を制御する役割を担うことができると考えるのは理にかなっている。脂肪酸をグリセロールバックボーン中に導入して油を産生する表現型を形成しうる核酸配列を得るには、種々の障害を克服しなければならない可能性がある。こうした障害としては、目的の代謝因子を同定すること、有用な動態特性を有するタンパク質源の選択および特性付けを行うこと、アミノ酸配列を決定できるレベルまで目的のタンパク質を精製すること、アミノ酸配列データを利用して、所望のDNA配列を取り出すためのプローブとして使用できる核酸配列を得ること、構築物を調製すること、得られた植物の形質転換および分析を行うことが挙げられるが、これらに限定されるものではない従って、油の構造および量を改変することのできる酵素ターゲットおよびこのような酵素ターゲットの核酸配列に対する有用な組織源の同定を行うことが必要である。理想的には、酵素ターゲットは、単独で、あるいは油産生の増加／減少、TAG構造、脂肪酸プール中の飽和脂肪酸対不飽和脂肪酸の比、および／または脂肪酸プールを改変した結果として得られる他の新規な油組成物に関与する他の核酸と併用して、1つ以上の用途に使用できるであろう。酵素ターゲットの同定および認定を行った後、配列決定を行うために、多量のタンパク質および精製プロトコルが必要である。最終的には、表現型の改変に必要なエレメントを含む有用な核酸構築物およびこのような構築物を含む植物が必要である。 DAGATに対して推定されたいくつかの単離手順が報告されている。PolokoffおよびBell(1980)は、ラット肝臓ミクロソーム由来のDAGATの可溶化および部分的精製について報告した。この調製物は、活性に関与する特異的タンパク質因子を同定するには純度が不十分である。KwanyuenおよびWilson(1986，1990)は、大豆子葉由来の酵素の精製および特性付けについて報告した。しかしながら、分子質量(1843kDa)から判断して、この調製物は十分に可溶化されず、それに含まれるD AGATタンパク質はいずれも多種のタンパク質の大きな凝集体であったと推定される。Littleら(1993)は、ナタネの小胞子由来の胚から得られたDAGATの可溶化について報告したが、KwanyuenおよびWilsonの場合と同じように、活性を伴う物質の分子質量が非常に大きいので、十分な可溶化は起こらないと思われる。Anders sonら(1994)は、イムノアフィニティークロマトグラフィーを用いた、ラット肝臓由来のDAGATの可溶化および415回の精製について報告した。しかしながら、使用した抗体がDAGATエピトープを認識するという証拠はなく、しかも精製されたタンパク質が本当にDAGATであるという証拠もない。実際上、KwanyuenおよびWil sonの場合と同じように、得られた調製物中のDAGAT活性体は、凝集した膜タンパク質に特有な分子質量を呈した。最後に、Kamisakaら(1993，1994，1996，1997) は、Mortierella rammaniana由来のDAGATの可溶化およびそれに続く精製による均質化について報告している。かれらは、この菌種由来のDAGATの分子質量が53k Daであることを実証した。これは、実際に可溶化された可能性のあるDAGATについて最初に発表された報告である。かれらの研究をわれわれの実験室で再現しようと試みたが（実施例4を参照されたい）、均質な調製物は得られなかった。すなわち、その酵素活性体を53kDaポリペプチドと関連づけることはできなかった。実際上、われわれは、Kamisakaらが提示したポリペプチドであると思われる多量の53kDaポリペプチドが、かれらのプロトコルを用いて得られた画分中のDAGAT活性体との相関を示さないことを明らかにすることができた。関連文献発生ホホバ(jojoba)胚由来の無細胞ホモジネートは、アシル-CoA脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有するとの報告が発表された。この活性は、分画遠心分離にかけて得られた浮遊ワックスパッドと関連づけられた（Pollard et al.，(1979)前掲;Wu et al.，(1981)前掲）。アシル-SCoAトランスアシラーゼ活性を有するEuglena gracilis由来の多酵素複合体の可溶化について、WildnerおよびHallickにより報告されている（The So uthwest Consortium Fifth Annual Meeting，April 122-24，1990，Las Cruces ，NM.の要旨集）。ホホバアシル-CoA：アルコールトランスアシラーゼタンパク質の10回の精製について、Pushnikらにより報告されている（The Southwest Consortium Fourth A nnual Meeting，February 7，1989，Riverside，Ca.の要旨集）。ホホバアシル-CoA：アルコールトランスアシラーゼ活性のアッセイについて、 Garverらにより報告された（Analytical Biochemistry（1992）207:335-340）。 WO 93/10241は、植物脂肪酸アシル-CoA：脂肪アルコールO-アシルトランスフェラーゼに関するものである。ホホバ57kDタンパク質は、ホホバ脂肪酸アシル-C oA：脂肪アルコールO-アシルトランスフェラーゼ（ワックスシンターゼ）として同定されている。本発明者らは、その後で、ホホバ由来のこの57kDタンパク質が、非常に長い鎖の脂肪酸の生合成に関与するβ-ケトアシル-CoAシンターゼであることを報告した（Lassner et al.，The Plant Cell（1996）8:281-292）。アシル-CoA：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼであると考えられる57 kDホホバ種子ポリペプチドの光学的親和性標識についても、Shockeyらにより報告された（Plant Phys．(1995)107:155-160）。 Kamisaka and Nakahara，「油性真菌由来の脂質生体画分中のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性体の特性付け」，J．Biochem．(1994)116: 1295-1301。 Kamisaka and Nakahara，「アニオン性リン脂質による界面活性剤可溶化ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの活性化」，J．Biochem．(1996)11 9:520-523）。 Kamisaka et al.，「油性真菌由来の脂質生体画分中のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性体の精製および特性付け」，J．Biochem．(1997) 121:1107-1114。 WO 93/10241は、植物脂肪酸アシル-CoA：脂肪アルコールO-アシルトランスフェラーゼに関するものである。ホホバ57kDタンパク質は、ホホバ脂肪酸アシル-C oA：脂肪アルコールO-アシルトランスフェラーゼ（ワックスシンターゼ）として同定されている。本発明者らは、その後で、ホホバ由来のこの57kDタンパク質が、非常に長い鎖の脂肪酸の生合成に関与するβ-ケトアシル-CoAシンターゼであることを報告した（Lassner et al.，The Plant Cell（1996）8:281-292）。図面の簡単な説明図1は、第1のワックスシンターゼ精製プロトコルにより得られたカラム画分のワックスシンターゼ活性の分析結果を示している。図1Aは、Blue Aアガロースクロマトグラフィーの結果を示している。図1Bは、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示している。図1Cは、Sephacryl S-100サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示している。図1Dは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示している。図2は、第2のワックスシンターゼ精製プロトコルにより得られたカラム画分のワックスシンターゼ活性の分析結果を示している。図2Aは、Blue Aアガロースクロマトグラフィーの結果を示している。図2Bは、ヒドロキシアノベタイトクロマトグラフィーの結果を示している。図2Cは、Superdex 75サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示している。図3は、図1に示されているワックスシンターゼ精製により得られた精製ワックスシンターゼ調製物に由来する画分のワックスシンターゼ活性およびDAGAT活性の結果を示している。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップによリ得られた画分を用いて得られた結果である。図4は、Yellow 86‐アガロースクロマトグラフィーを利用したDAGAT精製プロトコルにより得られたカラム画分のワックスシンターゼ活性の分析結果を示している。図5は、第2のワックスシンターゼ精製プロトコルにより得られたカラム画分の DAGAT活性の分析結果を示している。図5Aは、HeparinSeparose CL-6Bクロマトグラフィーの結果を示している。図5Bは、ピーク画分のSDS-PAGE分析の結果を示している。図6Aは、Yellow 86‐アガロースクロマトグラフィーによるDAGAT精製の結果を示している。図6Bは、Yellow 86‐アガロースクロマトグラフィーから得られたピーク画分のSDS-PAGE分析の結果を示している。図７は、Yellow 86‐アガロースクロマトグラフィーを利用したMortierella r amanniana由来のDAGATの精製の結果を示している。図8は、第2のワックスシンターゼ精製プロトコルにより得られたカラム画分の DAGAT活性の分析結果を示している。図8Aは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示している。図8Bは、ピーク画分のSDS-PAGE分析の結果を示している。図9は、DAGAT精製プロトコルにより得られたカラム画分のDAGAT活性の分析結果を示している。図9Aは、タンデムYellow 86‐アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示している。図9Bは、タンデムクロマトグラフィーから得られたピーク画分のSDS-PAGE分析の結果を示している。発明の概要本発明により、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（これ以降ではDAGATとも記す）に関連した組成物およびその使用方法が提供される。また、生物学的に活性なDAGATに関連したアミノ酸配列の組成物およびその使用方法も興味深い。特に、比較的高い比活性を有するDAGATタンパク質調製物は、in vitroおよびi n vivoで様々な用途に使用するうえで興味深い。これ以降では、とりわけ、DAGA T活性を有するタンパク質調製物を対象にする。特に興味深いものは、Mortierel la ramannianaから得られるDAGATである。このほかに特に興味深いことは、本発明のホホバワックスシンターゼもまたジアシルグリセロール(DAGAT)活性を呈することである。TAGは、ホホバ中で天然には産生されないため、ワックスシンターゼ酵素がDAG基質に対して活性を有するということは、ワックスシンターゼが、ほとんどの植物種において、特に、高レベルの貯蔵TAGを含む種子を産する脂肪種子作物においてTAGの産生に関与する酵素であるDAGATと関連づけられることを示唆するものである。従って、ホホバワックスシンターゼタンパク質および／またはそれをコードする配列を、DAGATをコードする植物遺伝子の単離に使用することは、本発明の対象になる。記載のホホバおよびMortierella ramanniana DAGATを、膜から精製分離し（すなわち、可溶化し）、可溶化されたDAGAT調製物を種々のクロマトグラフィー分析にかけてDAGAT活性に関連するタンパク質を同定する。このようにして、約40k DAの分子量を有するタンパク質がDAGAT活性に関連することが確認される。カラムクロマトグラフィーおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のような精製法を更に利用すると、アミノ酸配列分析を行うのに十分な純度のDAGATタンパク質が得られる。 DAGATタンパク質の全部または一部分をコードする核酸配列を得るために使用しうる種々の合成オリゴヌクレオチドを設計する際に、DAGATタンパク質由来のペプチド断片を鋳型として使用する。こうして得られたDAGATコード配列を使用すると、DAGATタンパク質をコードする他のDAGAT遺伝子を単離することもできる。従って、本発明には、DAGATペプチドおよびこれらのペプチドに対応するアミノ酸配列が含まれる。このような配列は、特に、DAGAT遺伝子配列の分析および回収を行うべくDAGATコード配列を含むオリゴヌクレオチドの調製に使用される。目的の用途にもよるが、DAGATコード配列は、全部または一部分の配列をコードするものであってよい。こうしたゲノム配列またはcDNA配列の全部または一部分は、本発明の対象になる。特に興味深いものは、DAGAT配列の転写または転写・翻訳（発現）を行う組換えDNA構築物である。特に、植物宿主細胞中で転写または転写・翻訳を行うことのできる構築物が好ましい。このような構築物には、植物種子組織中で優先的に発現される遺伝子から得られる転写開始領域などの種々の調節領域が含まれていてもよい。更に別の態様において、本発明は、構築物を細胞中で発現させることにより、宿主細胞中またはその後代中でDAGATを産生する方法に関する。DAGATコード配列の産生の結果として得られるDAGAT含有細胞もまた、本発明の対象になる。また、本発明は、特に、脂肪種子作物の種子油中のトリグリセリド分子の改変を行うべく、DAGATをコードするDNA配列を使用する方法に関する。このような改変トリグリセリドを含む植物細胞もまた、本発明の対象になる。このほかに本発明の対象になるものとしては、本発明の植物LPAATタンパク質の発現により得られる改変された植物、種子、および油が挙げられる。発明の詳細な説明本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（本明細書中ではDA GATと記す）には、酵素反応条件下で1,2-ジアシルグリセロール-3-ホスフェートおよびアシル-CoA基質からのトリアセチルグリセロールの産生を触媒する能力を呈する細胞源から得られる、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのような任意の配列のアミノ酸が含まれる。「酵素反応条件」とは、酵素を機能させるのに必要な条件（すなわち、温度、pH阻害物質の欠如などの因子）がいずれも満足される環境にあることを意味する。「可溶化」とは、膜に関連しない酵素に特有の挙動が得られるように膜からDA GAT酵素を抽出すること意味する。膜はDAGATタンパク質を膜中に一緒に存在する他のタンパク質に効果的に結合させるので、可溶化は、後述の実施例に記載されているようなDAGATタンパク質の同定および精製を行うための必須要件である。可溶化の試験を行う場合、後述の実施例に詳細に記載されているように、DAGAT 活性体に関して3つの異なる可溶化指標を考慮にいれる。 1）DAGAT活性体は、非常に高スピードの遠心分離を行っても沈降しない。 2）DAGAT活性体は、あたかも膜に関連しない酵素に見られる固有の分子量を有するがごとく、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを移動する。 3）DAGAT調製物中に存在するタンパク質は、少なくとも部分的に、カラムクロマトグラフィーにより互いに分離可能である。上記の判定基準のいずれに対しても個々にあてはまりうる他の解釈が存在する可能性があるため、DAGAT可溶化を保証すべく上記の3つの判定基準すべてが満足されたかを確認することが必要である。例えば、可溶化に使用する溶液の密度が可溶化されない膜の密度と類似しているために非常にゆっくりとした沈降しか起こらない場合、非常に大きなgの力を用いても第1の判定基準は、間違った結果を与える可能性がある。この状況は、後述の実施例に示されている。そこに示されているように、この判定基準だけに基づく文献の可溶化手順は、細胞質膜から実質的に分離されたDAGATを得るためには不適当であることが分かる。第2の判定基準は、可溶化された活性体がもとの膜よりもサイズ排除カラム中をゆっくりと移動することに基づいているが、ただし、膜自体が界面活性剤に暴露された後でカラムに弱く結合し、それによりカラムを通過する界面活性剤の速度が遅くなる場合、第2の判定基準は役に立たない恐れがある。第3の判定基準は、可溶化されたタンパク質がクロマトグラフィーにより分離可能であることに基づいているが、人為的要因または予期せぬ状況により、この基準が満たされなくなる可能性もわずかではあるが存在する。しかしながら、可溶化手順により膜が部分的に分離し、タンパク質の種々の凝集体が放出される可能性がある。その場合には、このような凝集体は、クロマトグラフィーにより互いに分離できる可能性がある。以上のことから、DAGATの可溶化が行われたことを保証するためには、3つの判定基準すべてが満足されなければならない。ホホバ由来の可溶化ワックスシンターゼタンパク質を得た後、基質特異性、補因子要件、および可能性のある活性阻害剤に関して酵素の特性付けを行う更なる実験を行うことが可能であるかが分かる。例えば、本発明のホホバワックスシンターゼは、アシル-ACP分子、アシル-CoA分子などの広範にわたるアシル基質を有することが判明した。更に、アシル基質および脂肪アルコール基質は、炭素鎖の長さに関して広範なサイズ範囲を有していてもよい。例えば、炭素鎖の長さがC1 2〜C14である基質を用いて活性を調べたところ、酵素はこれらすべてに作用することが判明した。このほか、種々の不飽和度を有する脂肪酸および脂肪アルコールに対しても活性を有することが分かった。驚くべきことに、精製ホホバワックスシンターゼはまた、ホホバ植物組織中ではTAGが存在するという報告がないにもかかわらず、ジアシルグリセロール(DAG) 基質および脂肪酸アシル-CoA基質に作用してトリアセチルグリセロール(TAG)を産生することが分かった。従って、ワックスシンターゼには、少なくとも2つのアシルトランスフェラーゼ活性、すなわち、アシル-CoA分子に対する受容体基質がアルコールである場合の活性（脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ）と、受容体基質がジアシルグリセロールである場合の活性（DAGアシルトランスフェラーゼすなわちDAGAT）とがある。ワックスシンターゼ酵素にDAGAT活性が存在することから、ワックスシンターゼタンパク質は他の植物種中のDAGATタンパク質との関連性が強いことが示唆される。次の実施例において、Moortierella DAGATの可溶化について説明する。DAGAT の可溶化は、上記の可溶化の判定基準のそれぞれを調べることにより確認される。 DAGATタンパク質の同定および部分的精製を行うために、Mortierella DAGATの可溶化調製物を種々のクロマトグラフィー実験で利用する。こうすることにより、約40kDaの分子量を有するタンパク質がDAGAT活性に関連するものとして同定される。後述の実施例でより詳細に説明するが、40kDaタンパク質は、Yellow 86‐ アガロースカラムおよびヒドロキシアパタイトカラムを用いたクロマトグラフィーにより部分的に精製する。次に、部分精製DAGAT調製物に対してゲル電気泳動処理およびニトロセルロースへのブロッティング処理を施すことにより、実質的に精製された形態でタンパク質を得る。同定されたバンドを含むニトロセルロースフィルター部分を切り取り、40kDaタンパク質を回収する。次に、精製タンパク質を種々の酵素を用いて消化し、アミノ酸配列を決定するために使用するペプチドを得る。この場合、本明細書中に記載の40kDaタンパク質のトリプシン消化ペプチドは、Mortierella ramanniana DAGATの一部分に対応する。他のMortierella DAGAT ペプチドも同様にして得られ、アミノ酸配列の決定を行うことが可能である。 DAGATをコードする核酸配列を得るためにDAGATペプチド由来のアミノ酸配列を使用することが、本明細書中に記載されている。例えば、DAGATペプチド配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを調製する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、こうしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用すると、DAGAT遺伝子の部分DNA配列が得られる。こうして得られた部分配列をプローブとして使用すると、Mortierella ramanniana組織から調製された遺伝子ライブラリー由来の DAGATクローンが得られる。このほか、特定のDAGATペプチドから、縮重の少ないオリゴヌクレオチドを調製することができる。このようなプローブを直接用いて遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行い、DAGAT遺伝子配列を調べることも可能である。特に、ファージベクター中のcDNAライブラリーのスクリーニングは、より低レベルのバックグラウンドハイブリダイゼーションであるため、このような方法に有用である。本発明のDAGATの核酸配列は、ゲノムDNA、cDNA、mRNAから誘導されるDNA配列またはRNA配列であってもよいし、全部もしくは一部分が合成されたものであってもよい。遺伝子配列は、例えば、適切な供給源由来のゲノムDNAの単離およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた目的配列の増幅とクローニングを行うことにより、クローン化してもよい。このほか、特に、植物に適した配列を提供することが望まれる場合、完全にまたは部分的に遺伝子配列を合成してもよい。この場合、所定の宿主に適したコドンを用いて、所望の構造遺伝子（DAGATタンパク質をコードする遺伝子部分）の全部または一部分を合成してもよい。宿主に適したコドンは、例えば、所望の宿主種中で発現されるタンパク質に最もよく使用されるコドンに基づいて決定してもよい。当業者は、抗体調製物、核酸プローブ（DNAおよびRNA）などを調製して種々の植物源由来の「相同的」または「関連した」DAGATのスクリーニングおよび回収に使用しうることが容易に分かるであろう。相同的配列は、配列が同一である場合に見られるものであり、こうした同一性は、核酸もしくはアミノ酸の配列情報を比較するか、または既知のDAGATと候補供給源との間でハイブリダイゼーョン反応を行うことにより決定してもよい。配列の相同性を決定する場合、 Glu/Asp、Val/Ile、Ser/Thr、Arg/Lys、およびGln/Asnのような保存変化を考慮に入れてもよい。2つの完全成熟タンパク質間の同一性が25%程度であれば、アミノ酸配列は相同的であると考えられる（一般的な解説については、Doolittle，R .F.，OF URFS and ORFS(University Science Books，CA，1986)を参照されたい）。従って、特定の例示されたMortierellaタンパク質調製物および本明細書中に記載の配列から、他のDAGATを得ることも可能である。更に、改変されたアミノ酸配列を含む天然および合成のDAGATならびに合成タンパク質のモデリングを行うための出発物質が、例示されたDAGATからおよびこのような例示された配列を使用して得られるDAGATから得られることは自明であろう。改変アミノ酸配列には、配列の一部分または全部が合成されたものであるか否かにかかわらず、突然変異、末端切断、追加などが行われた配列が含まれる。植物調製物から実際に精製された配列、それと同等な配列、またはそれと同等なタンパク質をコードする配列は、タンパク質または配列を得るために使用した方法に関係なく、同じように天然で誘導されたものとみなされる。典型的には、核酸プローブを用いて得られるDAGAT配列の場合、標的DAGAT配列とプローブとして使用したコード配列との間で、60〜70%の配列同一性が得られるであろう。しかしながら、配列同一性が50〜60%程度に低い長めの配列が得られる可能性もある。核酸プローブは、核酸配列よりも長い断片であってもよいし、短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。より長い核酸断片をプローブとして使用した場合（約100bpより長い）、プローブとして使用した配列とのずれが20〜50%（すなわち、配列同一性50〜80%）である配列が標的サンプルから得られるように、より低いストリンジェンシーでスクリーニングを行ってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、DAGAT酵素をコードする全核酸配列よりもかなリ短くてもよいが、少なくとも約10個、好ましくは少なくとも約15個、より好ましくは少なくとも約20個のヌクレオチドでなければならない。より長い領域に対してより短い領域を使用する場合、配列同一度をより高くすることが望ましい。従って、他の関連するDAGAT遺伝子の検出および回収を行うためにオリゴヌクレオチドプローブを設計するには、保存度の高いアミノ酸配列の領域を同定することが望ましいと思われる。特に、保存度の高い配列の同定が可能である場合、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うのに、より短いプローブがしばしばとりわけ有用になる。（Gould，et al.，PNAS USA（1989）86:1934-1938を参照されたい。）他のDAGATの単離のほかに、DAGATおよび関連核酸配列から得られた配列情報を用いて、他の関連アシルトランスフェラーゼタンパク質に対する遺伝子を得ることも可能であると考えられる。例えば、植物脂質生合成に関与する他のアシルトランスフェラーゼ酵素としては、プラスチドDAGAT、ミトコンドリアDAGAT、リゾホスホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、リゾホスホスファチジルセリンアシルトランスフェラーゼ(LPSAT)、リゾホスホスファチジルエタノールアミンアシルトランスフェラーゼ(LPEAT)、およびリゾホスホスファチジルイノシトールアシルトランスフェラーゼ(LPIAT)が挙げられる。これらの酵素はいずれも、リゾリン脂質のsn-2位が関与するアシルトランスフェラーゼ反応を触媒し、これらの配列をコードする遺伝子は、本発明の植物アシル-Co-A DAGA T配列に関連づけることも可能である。この場合、本明細書に提示されているように、ホホバ由来の脂肪酸アシル-CoA：脂肪アルコールO-アシルトランスフェラーゼ（ワックスシンターゼ）を含む他の関連するアシルトランスフェラーゼをジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼに関連づけすることが可能である。 DAGATシンターゼおよびワックスシンターゼが相同的タンパク質ファミリーのメンバーであることは、油性真菌の1種であるMortierella ramanniana由来のDAG ATの精製によって得られた情報により支持される（実施例を参照されたい）。第 1に、ホホバワックスシンターゼと同様に、真菌性DAGAT活性体は、膜に結合し、界面活性剤を使用することによってのみ可溶化されうる。第2に、ホホバワックスシンターゼの場合と同様に、真菌性DAGATの酵素活性を回復するために、可溶化に続いて、アッセイ混合物中にリン脂質（例えば、ホスファチジン酸）を添加する必要がある。第3に、真菌性DAGATは、精製クロマトグラフィー処理時、ホホバワックスシンターゼと非常に類似した挙動を呈する。特に、両方の酵素種は、ヒドロキシアパタイトカラム中を通過するのにごくわずかな遅れを生じるにすぎず、膜調製物中のほとんどの他のタンパク質種は、カラムマトリックスに結合する（実施例を参照されたい）。実際上、ホホバ酵素を用いた実験から、Mortiere lla ramanniana由来のDAGATの精製にはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが最も重要なステップであることが予測された。真菌性DAGATをうまく精製するために、このステップを加えることが不可欠であることが判明した。また、Ka misakaら(1997)のプロトコルは、DAGAT活性に関連した適切なタンパク質種を同定するのに不十分であるとの結論に達した。最後に、SDS-PAGEにより測定された真菌性DAGATポリペプチドの見掛けの分子量(33kDa)は、SDS-PAGEで得られたホホバワックスシンターゼの見掛けの分子量と同じである（実施例を参照されたい）。所定の配列とのハイブリダイゼーションにより関連遺伝子を単離することができるかを調べるために、典型的には放射能を用いて検出すべく配列を標識化する。ただし、他の方法を利用することも可能である。標識化されたプローブをハイブリダイゼーション溶液に添加し、所望の核酸を含有するフィルターと共にインキュベートする。例えば、ノーザンブロットもしくはサザンブロットまたはスクリーニングの対象となるcDNAまたはゲノムクローンを含有するフィルターを用いる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、目的の配列へのプローブのハイブリダイゼーションを最適化するために変化させてもよい。温度を下げて塩濃度を高くすると、関連性のより少ない配列のハイブリダイゼーションが可能になる（低いストリンジェンシー）。バックグラウンドハイブリダイゼーションが低いストリンジェンシー条件下で問題を生じる場合、特異的にハイブリダイズする配列の検出を改良するために、ハイブリダイゼーションまたは洗浄のいずれかのステップにおける温度の上昇および／または塩含有率の低減を行うことができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度は、Beltz，et al．(Methods in En zymology（1980）100:266-285に記載されているように、プローブの推定融解温度に基づいて調節することができる。有用なプローブならびに適切ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を上述したように決めた後、標識化配列および最適化条件を用いてcDNAまたはゲノムライブラリーのスクリーニングを行う。免疫学的スクリーニングのために、ウサギまたはマウスに精製タンパク質を注射することにより、ヤシDAGATタンパク質に対する抗体を調製することができる。抗体を調製するこのような方法は、当業者に周知である。モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体のいずれも産生可能であるが、遺伝子を単離するには、典型的にはポリクロナール抗体の方がより有用である。ヤシDAGATに対する抗体との交差反応により測定した場合、所望の植物種の粗製抽出物中に関連タンパク質が存在するかを調べるために、ウエスタン分析を行ってもよい。交差反応性が観測された場合、所望の植物種に対応する発現ライブラリーのスクリーニングを行うことにより、関連タンパク質をコードする遺伝子を単離する。発現ライブラリーは、Maniatis，et al．(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed．（1989）Cold Spring Harbor Laboratoy，Cold Spring Harbor，New York) に記載されているように、λgtllなどの種々の市販のベクター中に構築することができる。すべての植物は、膜リン脂質を産生する際にDAGATタンパク質を利用する。従って、任意の所定の植物種が、他のDAGATタンパク質の供給源になると考えられる。種子油中にかなりの量の中鎖脂肪酸を含む植物は、TAGのsn-2位に中鎖脂肪酸を導入できる植物DAGATを得るための好ましい候補である。Cuphea属のいくつかの種、例えば、procumbens、lutea、hookeriana、hyssopifolia、wrightii、およびinflataは、中鎖脂肪酸を含有するトリグリセリドを種子中に蓄積する。中鎖脂肪酸のもう1つの天然植物源は、Lauraceae科の種子である。以上のほかに、California Bay(Umlbellularia californica)、Pisa(Actinodophne hookeri) 、Sweet Bay(Laurus nobilis)、およびCinnamomum camphora(camphor)も、中鎖脂肪酸を蓄積する。他の植物源としては、Ulmaceae(elm)、Palmae、Myristicace ae、Simarubaceae、Vochysiaceae、およびSavadoraceaeが挙げられる。このほかに特に興味深いものは、貯蔵TAG中に異例の長鎖脂肪酸を導入する植物種由来のDAGATである。例えば、nasturtiumおよびmeadowfoamには、種子TAG中に22:1アシル基が含まれ、更に、meadowfoamには、sn-2位に22:1（エルカ酸）脂肪酸アシル基を導入することのできるDAGATが含まれることが実証された。このような活性を有するDAGATは、「トリ‐エルカ酸型」Brassica油の産生に有用であると思われる。この油は、18:1および18:2のような不飽和脂肪酸に対するBras sic週子DAGATの選択性が原因で、これまでに発見されていない。多種多様のin vivo用途において、植物脂質生合成のTAG生合成事象を調べるために、種々の供給源に由来する植物DAGATを使用することができることも特筆すべきで点である。すべての植物は共通の代謝経路を介して脂質を合成すると考えられるため、1つの植物DAGATを異種植物宿主に対して研究および／または適用することは、様々な種で容易に行うことが可能である。他の用途では、in vitroで産生されるかまたは合成されるTAGの生成の促進および／またはその組成の改変を行うために、DAGATのもとの植物源の外部で植物DAGATを使用することができる。植物DAGATタンパク質に関連した核酸配列には、多くの用途があるだろう。例えば、プローブとして使用できる組換え構築物、または宿主細胞中でDAGATタンパク質を発現させて、すぐに利用できる酵素の提供および／または細胞中のトリグリセリドの組成の改変を行う組換え構築物を調製することができる。in vitro またはin vivoのいずれかにおいて宿主細胞が植物宿主細胞である場合、他の有用な用途があるだろう。例えば、植物TAG生合成経路で利用しうる各中鎖選択性D AGATの量を増大させることにより、TAG中の中鎖脂肪酸の含有率を増大させることが可能である。同様にして、いくつかの用途では、アンチセンス法により、植物細胞中で内因的に発現されるDAGATの量を低減させることが望ましいこともある。例えば、挿入される外来DAGATによるsn-2位への中鎖または異例のより長い鎖の脂肪酸アシル基の転移の可能性を増大させるために、もとのBrassica長鎖選択性DAGATの発現を低減させることが望ましいこともある。この場合、目的の用途にもよるが、構築物には、全DAGATタンパク質またはその一部分をコードする配列が含まれていてもよい。例えば、所定のDAGATタンパク質のアンチセンス抑制が望まれる場合、全DAGAT配列は必要でない。更に、DAG AT構築物をプローブとして使用する場合、DAGATの特定の一部分をコードする配列だけ、例えば、保存度の高いDAGAT領域をコードすることが分かっている配列だけを含有する構築物を調製することが有利なこともある。既に述べたように、本発明の植物DAGATをコードする核酸配列には、ゲノム配列、cDNA配列、またはmRNA配列が含まれていてもよい。「コードする」とは、配列が、センス配向またはアンチセンス配向の特定のアミノ酸配列に対応することを意味する。「染色体外」とは、配列が、天然の状態で会合している植物ゲノムの外部に存在することを意味する。「組換え」とは、突然変異、制限酵素などににより遺伝子工学的に処理された改変体が配列に含まれることを意味する。 cDNA配列には、所定の細胞小器官または膜位置へのDAGATタンパク質（例えば、ミトコンドリアDAGAT）の送達を促進するトランジットペプチド配列またはターゲッティング配列のようなプロセッシング前の配列が含まれていてもよいし含まれていなくてもよい。任意のこのような前駆体DAGAT DNA配列を使用することは、植物細胞発現に使用するうえで有用である。ゲノムDAGAT配列には、植物DAG ATの転写および翻訳開始領域、イントロン、および／または転写終結領域が含まれていてもよい。これらの配列は、DAGAT構造遺伝子と併用してまたは併用せずに、様々なDNA構築物に使用することが可能である。このように、本発明の植物D AGATに対応する核酸配列は、特定の細胞小器官または膜位置へのタンパク質送達の指令を行うのに有用なシグナル配列、有用な組織およびタイミングのプロフィルを有する5'側上流非コード調節領域（プロモーター）、転写および翻訳調節領域として有用な3'側下流非コード調節領域を提供してもよい。また、該遺伝子の他の特性を呈するものであってもよい。所望の植物DAGAT核酸配列が得られた後、様々な方法で取り扱うことが可能である。配列に非コードフランキング領域が含まれている場合、該フランキング領域に、切除、突然変異などの処理を施してもよい。このように、天然に存在する配列に対して、トランジション、トランスバージョン、欠失、および挿入を行ってもよい。更に、配列の全部または一部分を合成してもよい。構造遺伝子中の1 つ以上のコドンを改変して改変アミノ酸配列を提供してもよい。また1つ以上のコドンに突然変異を起こして、便宜的な制限部位を提供したり、構築もしくは発現が関与した他の目的に利用してもよい。構造遺伝子は、合成のアダプター、1 つ以上の便宜的な制限部位を導入するためのリンカーなどを利用して、更に改変してもよい。本発明の植物DAGATをコードする核酸配列またはアミノ酸配列は、他の非天然または「異種」の配列と様々な形で併用してもよい。「異種」配列とは、天然の状態では植物DAGATに連結された形で存在しない任意の配列を意味する。例えば、天然の状態では互いに連結された形で存在しない同じ植物由来の核酸配列の組合せが挙げられる。本発明の植物DAGATをコードするDNA配列は、DAGATと通常、関連付けられる遺伝子配列の全部または一部分と併用してもよい。DAGATをコードするDNA配列は、 5'から3'の転写方向に、宿主細胞中での転写および翻訳を促進することのできる転写開始制御領域、植物DAGATをコードするDNA配列、ならびに転写および翻訳終結領域を有するDNA構築物中で、その構成部分として組み合わされる。可能性のある宿主細胞としては、原核細胞および真核細胞の両方が含まれる。使用目的にもよるが、宿主細胞は、単細胞であってもよいし、多細胞の分化もしくは未分化の器官中に見られるものであってもよい。本発明の細胞は、野生型細胞とは異なる植物DAGATを含むことにより、例えば、植物DAGATをコードする組換え核酸構築物を含むことにより、他のものと区別しうる。調節領域は、宿主によって変化するであろう。この領域には、ウイルス、プラスミド、染色体遺伝子などに由来する領域が含まれる。原核または真核微生物中、特に、単細胞宿主中で発現させるために、多種多様な構成的プロモーターまたは調節可能プロモーターを利用してもよい。微生物中で発現させると、すぐに使用できる植物酵素が得られる。これまでに説明した転写開始領域には、E．coil 、B．subtilis、Sacchromyces cerevisiaeのような細菌および酵母宿主由来の領域、例えば、β-ガラクトシダーゼ、T7ポリメラーゼ、トリプトファンEなどのような遺伝子が含まれる。ほとんどの場合、構築物には、植物中で機能する調節領域が含まれるであろう。これにより、植物DAGATの改変産物が得られ、恐らく脂肪酸組成の改変がなされるであろう。植物DAGATまたはその機能的断片をコードするオープンリーディングフレームは、その5'末端で転写開始調節領域に連結される。植物宿主中でDA GATタンパク質を発現することが望ましい実施形態では、完全植物DAGAT遺伝子の全部または一部分を使用することが望ましい。すなわち、5'上流非コード領域（プロモーター）の全部または一部を、構造遺伝子配列および3'下流非コード領域と併用してもよい。対象の植物宿主に特有のプロモーターまたは改変プロモーターのような異なるプロモーターが望まれる場合、すなわち、1つの遺伝子供給源由来の転写開始領域および異なる遺伝子供給源由来の翻訳開始領域を含む場合、構造遺伝子機能の多種多様な構成的または調節可能な（例えば、誘導的な）転写を提供する多数の転写開始領域を利用することができる。このような構造遺伝子に対応する転写／翻訳開始領域は、それぞれの開始コドンの5'側上流のすぐそばに存在する。植物で使用される転写開始領域には、T-DNA構造遺伝子と関連づけられるこのような領域が含まれる。例えば、ノパリンおよびマンノピンシンターゼ、CaMV由来の19 Sおよび35Sプロモーター、ならびにナピン、ACP、SSU、PG、ゼイン、ファセオリンEなどの他の植物遺伝子由来の5'側上流領域が含まれる。DAGAT配列の発現のために、二重35Sのような増強プロモーターを利用することもできる。5'上流非コード領域を、種子の成熟時に調節される他の遺伝子から得る場合にこのような応用を行う場合には、植物胚組織中で優先的に発現される領域、例えば、ACPおよびナピンから誘導される転写開始制御領域が望ましい。このような「種子特異的プロモーター」は、1988年1月25日出願の米国特許出願第07/147,781号（現在、1 990年7月9日出願の米国特許出願第07/550,804号）、および1990年3月16日頃に出願された「種子の発生初期段階に優先的に発現される新規な配列およびそれに関連した方法」と題した米国特許出願第07/494,722号の教示に従って作製および使用してもよい。これらの特許出願は、参照により本明細書に組み入れる。種子組織中で優先的に発現される転写開始領域、すなわち、植物の他の部分では検出されない転写開始領域は、遺伝子産物の破壊的または有害な影響を最小限に抑えるべくTAGの改変を行うために望ましいと考えられる。本発明のDNA構築物中に、調節転写終結領域を配置してもよい。転写終結領域は、植物DAGATをコードするDNA配列、または異なる遺伝子源由来の便宜的転写終結領域、例えば、天然の状態で転写開始領域と関連づけられる転写終結領域により提供され得る。転写終結領域が異なる遺伝子源に由来する場合、転写終結領域は、該終結領域が由来する構造遺伝子の3'側の少なくとも約0.5kb、好ましくは約1〜3kbの配列を含むであろう。発現を増大または低減させるために目的のDNA配列として植物DAGATを含有する植物発現または転写構築物は、様々な植物体、特に食料または工業用として使用される植物油の産生が関係する植物体に利用してもよい。際だって好ましいものは、温帯油糧種子作物である。対象の植物としては、ナタネ（キャノーラおよびエルカ酸含有量の多い変種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、大豆、落花生、ヤシ、ギネアアブラヤシ、およびトウモロコシが挙げられるが、これらに限定されるものではない。組換え構築物を宿主細胞中に導入する方法にもよるが、他のDNA配列が必要な場合がある。重要なことは、本発明が、双子葉植物種および単子葉植物種に対して同じように適用可能であり、新しいおよび／または改良された形質転換法および調節法に容易に適用できると思われる点である。特に興味深いことは、植物種子油中の特定の脂肪酸を産生するように遺伝子操作された植物中で植物DAGAT構築物を使用することである。この場合、遺伝子操作された種に属する非遺伝子操作植物の種子中のTAGには、この特定の脂肪酸は天然の状態では含まれない。従って、ユニークな脂肪酸アシル基をsn-3位に導入するには、植物中で新規なDAGATを発現することが望ましいと考えられる。本発明のDAGATタンパク質の植物遺伝子工学的用途としては、このほかに、TAG 分子上の特定の位置に望ましい脂肪酸アシル基が導入されたTAG分子を含んでなる構造化植物脂質の調製に使用することが挙げられる。このようなトランスジェニック植物を得るための形質転換法は、本発明にとって決定的なものではなく、種々の植物形質転換法が、現在、利用可能である。更に、作物の形質転換を行うためのより新しい方法が利用可能になった場合にも、そうした方法を直接利用できると考えられる。例えば、天然の状態でAgrobacter ium感染を受け易い多くの植物種を、Agrobacterium介形質転換を行う３分節系(t ripartite)またはバイナリーベクター法により、うまく形質転換できる可能性がある。多くの場合、片側または両側にT-DNAボーダーを有する構築物、特に、左および右ボーダーを有する構築物、中でも、左ボーダーを有する構築物が望ましいであろう。このことは、構築物がA．tumefaciensまたはA．rhizogenesを形質転換モードとして使用する場合、特に有用である。ただし、T-DNAボーダーは、他の形質転換モードで使用される可能性がある。更に、種々の単子葉植物種および双子葉植物種の形質転換を可能にするマイクロインジェクション法、DNA粒子衝撃法、およびエレクトロポレーション法が開発されている。通常、DNA構築物中に組み込まれるものとしては、宿主中での発現に必要な調節領域を有するとともに形質転換細胞の選択を可能にする構造遺伝子が挙げられる。該遺伝子は、細胞傷害薬、例えば、抗生物質、重金属、毒素などに対する耐性、栄養要求性宿主に原栄養体を与える補完性、ウイルス免疫性などを提供してもよい。発現構築物またはその成分が導入される異なる宿主細胞種の数にもよるが、異なる宿主に対して異なる選択条件を使用する場合、1種以上のマーカーを利用してもよい。植物細胞形質転換のためにAgrobacteriumを使用する場合、Agrobacterium宿主中に存在するT-DNAまたはTi-もしくはRi-プラスミドを用いて相同的組換えを行うために、Agrobacterium宿主中に導入可能なベクターを使用してもよい。組換え用のT-DNAを含有するTi-もしくはRi-プラスミドは、武装性（えい瘤（gall）形成を誘発することができる）であってもよいし、非武装性（えい瘤形成を誘発することができない）であってもよい。形質転換されたAgrobacterlum宿主中にv ir遺伝子が存在するかぎり、後者は許容される。武装プラスミドは、正常な植物細胞とえい瘤の混合体を生成することができる。宿主植物細胞を形質転換するために媒介体としてAgrobacteriumを使用するいくつかの場合、T-DNAボーダー領域を有する発現または転写構築物は、E．coliおよびAgrobacterium中で複製可能である広域宿主(broad host range)ベクター中に挿入されるであろう。広域宿主ベクターについては文献に記載されている。一般的に使用されるものは、pRK2またはその誘導体である。例えば、Ditta，et al .，(Proc．Nat．Acad．Sci.，U.S.A．(1980)77:7347-7351)およびEPA O 120 515 を参照されたい。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れる。このほか、異なる複製配列（一方はE．coli中でベクターを安定化させ、他方はAgrobacte rium中でベクターを安定化させる）を含有するベクター中に、植物細胞中で発現される配列を挿入してもよい。例えば、McBride and Summerfelt(Plant Mol．Bi ol．(1990)14:269-276)を参照されたい。複製起点pRiHRI(Jouanin，et al.，Mol ．Gen．Genet．(1985)201:370-374)を利用して、宿主Agrobacterium細胞中における植物発現ベクターの安定性を増大させている。発現構築物およびT-DNAと共に組み込まれるものとしては、形質転換されたAgr obacteriumおよび形質転換された植物細胞の選択を可能にする1種以上のマーカーが挙げられる。植物細胞に使用するために、いくつかのマーカーが開発された。例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、アミノグリコシドG418、ハイグロマイシンなどに対する耐性を有するマーカーが挙げられる。使用する特定のマーカーが、本発明にとって決定的なものになることはなく、特定の宿主および構築方法に依存して、好ましいマーカーは変化する。 Agrobacteriumを用いて植物細胞の形質転換を行うために、外植片を、形質転換されたAgrobacteriumと組み合わせ、形質転換させるのに十分な時間をかけてインキュベートして、細菌を殺し、適切な選択培地中で植物細胞を培養してもよい。カルスが生成した後、既知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いてシュートの形成を促進し、更に植物を再生するためにシュートを発根培地に移すことができる。次に、植物を成長させて結実させ、得られた種子を用いて再生を繰り返し、植物油を単離することが可能である。次に、本発明について一般的に説明する。以下の実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解されるであろう。これらの実施例は例示を目的とするものであり、本発明を制限するものではない。実施例実施例1‐ワックスシンターゼアッセイミクロソーム膜調製物または可溶化タンパク質調製物のワックスシンターゼ活性に対するアッセイ方法について説明する。 A. 放射能標識物質ワックスシンターゼアッセイにおいて一般に使用した基質[1-¹⁴C]パルミトイル-CoAは、Amersham(Arlington Heights，IL)から購入したものである。他の鎖長の基質は、鎖長特性を調べる実験を行うために、合成した。長鎖[1-¹⁴C]脂肪酸（比活性51〜56Ci/mole）、すなわち、11-cis-エイコセン酸、13-cis-ドコセン酸、および15-cis-テトラコセン酸は、[¹⁴C]シアン化カリウムと、対応するアルコールメシレートとの反応、それに続く、アルコールニトリルから遊離脂肪酸への塩基加水分解を行って調製する。エーテル性ジアゾメタンを用いて遊離脂肪酸をそのメチルエステルに変換し、分取硝酸銀薄層クロマトグラフィー(TCL)により生成する。脂肪酸メチルエステルは、加水分解して遊離の脂肪酸に戻す。放射化学的純度は、3つのTLC法：順相シリカTRC、硝酸銀TLC、およびC18逆相TLCにより評価する。これらの方法により測定した放射化学的純度は、92〜98%であった。長鎖[1-¹⁴C]アシル‐CoAは、Young & Lynenの方法(J．Bio．Chem．(1969)24 4:377)により、対応する[1-¹⁴C]遊離脂肪酸から調製する。比活性は10Ci/moleである。[1-¹⁴C]ヘキサデカナールは、Pletcher & Tateの方法(Tet．Lett．(1978) 1601-1602)をミクロスケールに変更して、[1-¹⁴C]ヘキサデカン-1-オールのニクロム酸塩酸化により調製する。分取シリカTLCにより生成物を精製し、使用するまで-70℃でヘキサン溶液として保存する。 B. ミクロソーム膜調製物のワックスシンターゼ活性のアッセイミクロソーム膜調製物のワックスシンターゼ活性は、40μM[1-¹⁴C]アシル-CoA （普通は、パルミトイル-CoA、比活性5.1〜5.6mCi/mmol）および200mMオレイルアルコールを、アッセイ対象のサンプルと合わせて合計体積0.25mlとしてインキュベートすることにより測定する。インキュベーション混合物には、このほかに、25mM HEPES（4-[2-ヒドロキシエチル]-1-ピペラジンエタン-スルホン酸）pH7. 5を緩衝剤として、20% w/vグリセロール、1mM DTT、0.5M NaClが含まれるか、または25mMトリシン-NaOHを緩衝剤として、pH7.8、0.28M NaCl、10%グリセロール、2mM β-メルカプトエタノールが含まれる。最初の実験は、第1の緩衝系を用いて行い、その際、アシル-CoAレダクターゼ酵素の要件に合うようにpHを選んだ。その後、膜調製物を変え、ワックスシンターゼのより高い最適pHに合わせて第2 の緩衝系で試験した。基質混合物はガラスバイアル中に調製し、使用する直前にオレイルアルコールを加えてから、サンプルに添加する。インキュベーションは、30℃で最長1時間にわたり行う。アッセイ管を氷上に置き、直ちに0.25mlイソプロパノール：酢酸 (4:1 v/v)を添加することにより、アッセイを終了する。未標識ワックスエステル(0.1mg)およびオレイルアルコール(0.1mg)を、キャリャーとして添加する。Ha ra & Radinのプロトコル(Anal．Biochem．(1978)90:420)をスケールダウンして、[1-¹⁴C]脂質を抽出する。アッセイ終了液に2mlのヘキサン／イソプロパノール(3:2，v/v)を添加する。サンプルを攪拌し、1mlの硫酸ナトリウム水溶液(6.6% w/v)を添加し、再びサンプルを攪拌する。 C. 可溶化ワックスシンターゼ活性のアッセイ 40μM 1-¹⁴C-16:0 CoA（5Ci/mol）、200μM 18:1-OH、0.07%大豆リン脂質（Si gma，P-3644）、0.2% CHAPS、280mM NaCl、25mMトリシン-NaOH、pH7.8、2mM β- ME、および5.6%グリセロールを含有する250μlアッセイ液中で50μlまでのサンプルを用いて、可溶化ワックスシンターゼのアッセイを行う。リン脂質（50mg/m l、0.5% CHAPS中）を、1% CHAPS中のサンプルに直接添加し、次に、残りのアッセイ成分を含有するカクテルで希釈する。ワックスシンターゼをリン脂質ベシクル中に導入することに起因して活性体の再構成か起こる。ワックスシンターゼは、界面活性剤の影響を受け易く、アッセイで最大の活性を得るには、リン脂質(P L)と界面活性剤(CHAPS)の量を2.8/1(CHAPS/PL)に調整する必要がある。限外濾過により濃縮したサンプルのワックスシンターゼ活性のアッセイを行うには、CHAP Sの濃度応じて、アッセイするサンプルの体積を再調整する必要がある。アッセイ液にCHAPSを多く入れ過ぎると、活性が阻害される。限外濾過によりサンプルを濃縮した場合、アッセイするサンプルの最適体積を、少量のサンプルを用いてアッセイ液中の%CHAPSの濃度曲線を作成し、一定の濃度のリン脂質およびNaClでアッセイを行うことにより、設定しなおす。ワックスシンターゼは、CHAPS濃度が変化した場合よりも、PL濃度が変化した場合の方が影響を受けにくい。 D. アッセイ産物の分析ミクロソーム膜調製物のワックスシンターゼアッセイまたは可溶化ワックスシンターゼアッセイの産物を分析するために、2つのプロトコルを作成した。一方のプロトコルは、以下に「詳細なアッセイ（extensive assay）」として記載されているもので、時間はかかるが、より定量的な結果が得られる。他方のプロトコルは、以下に「迅速アッセイ」として記載されているもので、ワックスシンターゼ活性の尺度を与え、より迅速かつ簡便であるが、定量性は低い。 1. 詳細なアッセイ：硫酸ナトリウムの添加およびサンプルの攪拌を行った後、上側の有機相を取り出し、下側の水相を4mlヘキサン／イソプロパノール(7: 2，v/v)で洗浄する。有機相をプールし、窒素下で蒸発乾固させる。脂質残渣を少量のヘキサン中に再懸濁させ、アリコートの放射能を液体シンチレーションカウンターによりアッセイする。残りのサンプルを用いて、標識化したクラスに対してTCL分析を行うことができる。これにより、産生した全ワックスの量が分かる。脂質クラスの分析を行うために、サンプルをシリカTLCプレートに適用し、このプレートをヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸(80:20:1または70:30:2 v/v/v) で展開する。脂質クラス、主に、ワックスエステル、遊離脂肪酸、脂肪アルコール、および原点の極性脂質の放射能の分布を、AMBIS放射分析イメージングシステム(AMBIS Systems Inc.，San Diego，CA)を用いて測定する。必要な場合には、個々の脂質クラスをTLCプレートから回収し、更なる分析にかけることができる。メタノールで展開したC18プレートを用い、逆相TLCシステムも使用して分析を行った。 2. 迅速アッセイ：硫酸ナトリウムの添加およびサンプルの攪拌を行った後、所定量（％）の有機相を取り出し、液体シンチレーションカウンターにより放射能を計数する。ここでの計算を利用して有機相の全計数値を推定する。次に、詳細なアッセイのところで説明したように、有機相の他の部分を取り出し、窒素下で十分に乾燥させ、ヘキサン中に再懸濁し、TLCプレートにスポッティングし、展開し、更にスキャニングを行う。このように、ワックスに組み込まれた全計数値の％を測定する。実施例2-ワックスシンターゼ活性の特性付けを行うための更なる実験 A. 種子の発生およびワックスシンターゼ活性プロフィルカリフォルニア州Davisで5種の植物に対して2夏にわたり胚発生を追跡した。胚の生重量および乾燥重量は、約80日目〜約130日目にわたりかなり安定した速度で増大することが分かった。脂質抽出物を調べたところ、胚の生重量が約300m gに達したときに（約80日目）、脂質重量対乾燥重量の比が最大レベル50%に達することが分かった。実施例1Bに記載したように、発生胚に対してワックスシンターゼ活性を測定した。ホホバ種皮が抑制因子の原因になっていることが判明したので、種皮を除去した後、液体窒素中で胚を凍結させ、-70℃で保存した。無細胞ホモジネートまたは膜画分のいずれかで測定したワックスシンターゼ活性に対する発生プロフィルから、活性に大きな誘導期が存在し、開花後約110〜1 15日目にピークに達することが分かる。酵素学的実験を行うための胚を、開花後約90〜110日目の間で採取した。この期間では、ワックスシンターゼ活性が高く、脂質蓄積量は最大のレベルに達しておらず、種皮は容易に除去される。ワックスシンターゼ活性の最大増加率は、開花後80日目と90日目の間で観測される。ワックスシンターゼタンパク質のシンターゼの割合が恐らく最も高いと思われる開花後約80〜90日目にcDNAライブラリー作製用の胚を採取した。これに応じて、ワックスシンターゼをコードするmRNAのレベルも、この段階で最大になると推定される。 B. ミクロソーム膜調製物胚の含水率（45〜70%）から推定して、開花後約90〜110日目にホホバ胚を採取する。外皮および種皮を除去し、即座に、液体窒素中で子葉を凍結し、後に使用するために-70℃で貯蔵する。最初のタンパク質を調製するために、液体窒素温度で鋼製乳鉢および乳棒で凍結胚を粉砕して粉末にする。典型的な実験では、70 gの胚を処理する。この粉末を、胚70gに対して溶液280mlの比で、次の高塩溶液：3M NaCl、0.3M スクロース、100mM HEPES、2mM DTT、ならびにプロテアーゼ阻害剤、1mM EDTA、 0.7mg/mlロイペプシン、0.5mg/mlペプスタチン、および17mg/ml PMSFに添加する。組織ホモジナイザー（Kinematica，Switzerland;Model PT10/35）を用いて約3 0秒間粉末胚を緩衝液中に分散させ、次に、3層のMiracloth(CalBioChem，LaJoll a，CA)に通して濾過することにより、無細胞ホモジネート（CFH）を調製する。 100,000×gで１時間濾液を遠心分離処理にかける。得られたサンプルは、ペレット、上清、および浮遊脂肪パッドからなる。脂肪パッドを除去し、上清画分を回収し、1M NaCl、100mM HEPES、2mM DTT、および0 .5M EDTAを含有する溶液に対して一晩透析する（緩衝液を３回取りかえる）。20 0,000×gで1.5時間にわたり透析物を速心分離処理し、ペレットDP2にする。 25mM HEPESおよび10%グリセロール中に、ペレットをもとのCFH体積の1/20の量で懸濁させ、ミクロソーム膜調製物を得る。実施例1の記載に従って、活性のアッセイを行う。ワックスシンターゼ活性の回収率は、無細胞ホモジネート中のもとの活性の34%であると推定される。この調製物のワックスシンターゼ活性は、-70℃で貯蔵した場合、安定である。 C. 基質特異性種々の炭素鎖長および不飽和度を有するアシル-CoAおよびアルコール基質を、先に記載したように調製したミクロソーム膜調製物に添加し、ホホバワックスシンターゼにより認識される基質の範囲を調べた。ワックスシンターゼ活性は、実施例1Bに記載したように測定し、アシル特異性は、80mMアシル-CoA基質および10 0mM放射能標識オレイルアルコールを用いて測定した。アルコール特異性は、100 mMアルコール基質および40mM放射能標識エイコセノイル-CoAを用いて測定した。これらの実験の結果は、以下の表1に示されている。上の結果はホホバワックスシンターゼが広範囲の脂肪族アシルCoAおよび脂肪族アルコール基質を利用することを証明している。この外、アシル基質としてパルミトイルCoA、パルミトイルACPおよびN-アセチル-S-パルミトイルシステアミンを使用して、各種のアシルチオエステル基質に対するワックスシンターゼ活性を同様に試験した。アシルCoAについて最大の活性が観察された。アシルACPについては有意な活性（アシルCoAの場合の〜10％）が観察されたが、N-アセチル-S-パルミトイルシステアミン基質については何ら活性が検出できなかった。Ｄ．活性のエフェクターワックスシンターゼ活性に対する影響について、各種のスルフヒドリル薬剤をスクリーニングした。有機水銀化合物が活性を強く阻害することが示された。ヨードアセトアミドおよびN-エチルマレアミドはずっと影響が少なかった。パラヒドロキシ水銀ベンゾエートによる阻害が観察されたが、この阻害はその後のDTT の添加によって復帰させることができた。これらの結果は、パラヒドロキシ水銀ベンゾエートによる阻害には必須のスルフヒドリル基のブロックが関与することを証明している。実施例3-ホホバワックスシンターゼの精製ワックスシンターゼ活性を有するホホバ膜調製物の単離、ワックスシンターゼ活性の可溶化、およびさらにそのワックスシンターゼタンパク質の精製のために使用することができる方法について記載する。Ａ．ミクロソーム膜調製物実施例2に記載した方法の以下の改変を利用して、可溶化した膜からのワックスシンターゼの精製のために有用な、改良された膜画分が供給される。典型的には、抽出用バッファー（40mM Tricine-NaOH、pH7.8、200mM KCl、10m M EDTA、5mMβメルカプトエタノール）400mlにホホバ胚100gを添加し、ブレンダー中で摩砕し、そしてPolytron組織崩壊剤機でホモジナイズする。その後の全ステップを4℃で実施する。Miracloth(CalBioChem)を通してブレンドした材料をろ過する。ろ液の遠心分離（20,000×g；20分）の結果、浮遊するワックス層、混濁した上層画分および暗緑色ペレットが生成した。上層画分を採取して遠心分離（100,000×g；2時間）し、膜ペレットを取得し、次に50％（w/v）ショ糖を含有するバッファーA（25mM Tricine-NaOH、pH7.8、200mM KCl、5mM ED TA、5mMβメルカプトエタノール）40ml中に再懸濁する。このホモジネートをSW2 8遠心チューブ（Beckman）4本に分配し、それぞれに20％ショ糖を含有するバッファーA 10mlを重層し、次にバッファーA 13mlを重層する。遠心分離（28,000rp m；2時間）後、20％／50％ショ糖界面から膜画分を回収し、4倍容積のバッファーAで希釈し、遠心分離（200,000×g；1時間）によって回収する。次に膜を保存用バッファー［25mM Tricine-NaOH、pH7.8、1M NaCl、10％(w/v)グリセロール、 5mMβメルカプトエタノール］10ml中でホモジナイズする。このプロトコルによって調製した膜のタンパク質濃度は典型的には7〜9mg/mlである。タンパク質標準としてBSAを使用して、記載された（Bradford,1976）ようにしてタンパク質濃度を評価する。Ｂ．ワックスシンターゼタンパク質の可溶化保存用バッファー（25mM Tricine-NaOH、pH7.8、1M NaCl、10％グリセロール、5mMβメルカプトエタノール）での希釈によって、膜懸濁物をタンパク質約0.8 3mg／mlに調整する。固体3-([3-コルアミドプロピル]ジメチル-アンモニオ)-1- プロパンスルフェート（CHAPS）を添加して、最終濃度2％(w/v)に、そしてタンパク質に対する界面活性剤の比を24：1にする。氷上で1時間インキュベート後、サンプルを遠心分離（200,000gで1時間）し、上清画分を回収する。Ｃ．ワックスシンターゼ活性体の精製 200,000g上清画分を（0.57％CHAPS、25mM Tricine-NaOH、pH7.8、20％グリセロールで）希釈し、NaClおよびCHAPSの最終濃度をそれぞれ0.3Mおよび1％とする。0.3M NaClを含有するバッファーB（25mM Tricine-NaOH、pH7.8、1％CHAPS、20 ％グリセロール）で平衡化したBlue Aアガロース（Amicon,Inc.,Beverly,MA）カラムにこのサンプルを負荷する。平衡化バッファーで洗浄した後、2M NaClを含有するバッファーBでワックスシンターゼ活性体を溶出させる。Blue Aカラムから溶出した活性体画分をプールし（Blue Pool）、次のクロマトグラフィーに使用する。バンドの同定およびワックスシンターゼタンパク質の次の精製のために、2つの精製プロトコルを使用した。プロトコル1（図1）において、YM30膜（Amicon,Inc.,Beverly,MA）を装着した加圧セル中の限外ろ過によって、Blue P oolを5.4倍に濃縮した。2M NaClを含有するバッファーBで平衡化したCeramic Hy droxyapatite(CHT)カラム（Bio-Scale CHT-2；Bio-Rad,Hercules,CA）に、濃縮物の1／2を適用した。カラムを6カラム容積の平衡化バッファーで洗浄し、結合したタンパク質を0.1Mリン酸二カリウムおよび2M NaClを含有するバッファーBで溶出させた。CHTカラムを再平衡化した後、Blue Pool濃縮物の第2の半分を同様の方法でクロマトグラフした。活性を検出するため、限外ろ過によって濃縮したサンプルのためのプロトコルにしたがって、ワックスシンターゼをアッセイした。CHT-Run 1上で測定したワックスシンターゼ活性は流出液および洗浄液中に見られた。2つのCHT流動操作のタンパク質プロフィルが同一だったので、CHT-Run 2はアッセイしなかった。2つのCHT流動操作からの活性画分を集めて10倍に濃縮し、そして1.0M NaClを含有するバッファーＢ中で平衡化したSephacryl S100 HR カラム（2.5×90cm）に適用した。タンパク質および活性測定を実施し、操作で保持された部分から、最大の活性および最少のタンパク質を示した活性体画分を選択した。S100プール（画分64〜70）を、1M NaClを含有するバッファーB中で平衡化した結晶ヒドロキシルアパタイト(HA)カラム（Bio-Gel HT；Bio-Rad,Hercul es,CA,1×19.3cm）に適用した。やはり、ワックスシンターゼ活性の大部分は流出液および洗浄液中に存在した。結合したタンパク質を0.1Mリン酸二カリウムおよび1M NaClを含有するバッファーBで溶出させた。最終HA流動操作からの画分を SDS-PAGEによって調べた。SDS-PAGE上で33kDに泳動する１個のタンパク質がワックスシンターゼ活性の存在に相関した。第2の調製法（プロトコル2、図2）において、Blue Poolを濃縮せずに、1M NaC lを含有するバッファーB中で平衡化した結晶HAカラム（1×11.7cm）に直接適用した。2つの画分を選択して、次の25mM Tricine-NaOHＭ、pH7.8、1％CHAPS、20 ％グリセロール、1M NaClで平衡化したSuperdex 75 HR 10/30カラム（Bio-Rad,H ercules,CA；サイジング範囲：5000〜75,000ダルトン）上のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。実施例1Cにおいて可溶化サンプルについて記載したプロトコルにしたがって、ワックスシンターゼ活性を測定した。1画分はHAカラム内の流動の初期（画分31）に溶出し、もう一方は洗浄液中（画分 67）に溶出した。2つの画分のタンパク質プロフィルはSDS-PAGE分析基準で異なっていた。両Superdex 75流動処理物を勾配SDS-PAGEによって試験し、クロマトグラフ操作の結果、活性を有する約33kDのタンパク質を同定した。分子量標準を使用し、同一のバッファーおよびカラム条件下でクロマトグラフして、検量線を作製した。ワックスシンターゼ活性のピークの溶出ボリュームをこの標準曲線に対比させて、可溶化酵素の分子量について、48kDaの数値が得られた。プロトコル1からのワックスシンターゼの精製を表す図表（表2）は、可溶化タンパク質画分から酵素が150倍精製されたことを示している。Ｄ．SDS PAGE 分析カラム画分からのサンプルをSDS PAGEサンプルバッファー（１ｘバッファー＝ 2％SDS、250mMβメルカプトエタノール、0.0025％ブロムフェノールブルー）で希釈し、電気泳動によって分析した。Laemmli（Nature(1970)227:680-685）の方法にしたがい、Delepelaire（Proc.Nat.Acad.Sci.(1979)76:111-115）の改変を少し取り入れて、ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動（10−13％）を実施した。上部の滞留バッファーには0.1％のドデシル硫酸ナトリウムを使用したが、下部の滞留バッファーには使用しないで、濃縮用および分離用ゲルとした。濃縮用ゲルには30％アクリルアミド原液（29.2％アクリルアミド、0.8％N,N'-ビス -メチレンアクリルアミド、w/v）から5％、0.06％過硫酸アンモニウム(w/v)および0.1％TEMED(v/v)を含ませた。分離用ゲルには0−10％直線勾配ショ糖によって安定化したアクリルアミド原液から10−13％直線勾配を含ませた。室温、150Ｖの一定電圧で9〜10時間、電気泳動を実施した。Blumら（Electrophoresis（1987 ）8:93-99）の方法にしたがって銀で、またはCoomassie Blue（0.1％ Coomassie Blue R-250、50％メタノール、10％酢酸）で染色することによって、タンパク質を可視化した。ヒドロキシアパタイトカラムによる精製の前は、ワックスシンターゼとして同定された33kDaタンパク質は活性画分の主要成分として現われない。精製プロトコル1（実施例3C）の後に、最終カラム上で活性に相関するタンパク質は33kDaのもののみである。実施例4−ゲル内(In-Gel)消化のためのホホバワックスシンターゼタンパク質の調製Ａ．濃縮によるSDS-PAGE用のサンプルの調製最終HAカラム（プロトコル1）の流出液／洗浄液からの奇数番号の画分をプールし、YM30膜（Amicon,Inc.,Beverly,MA）を装着した加圧セル中での限外ろ過によって、3倍に濃縮した。2つのCentricon-30ユニット（Amicon，Inc.，Beverly ，MA）を使用してサンプルをさらに濃縮して、容積を約50μlとした。各サンプルをSDS Cocktail（20％SDS 4μl、14.3Mβメルカプトエタノール1μl、および0 .1％ブロモフェノールブルー1μl）６μlで処理した。室温で15分静置した後、サンプルを10−13％アクリルアミド勾配ゲル（実施例3D）（16×16cm×厚さ1mm ）に適用し、150Vの定電圧で9.5時間の電気泳動によって、タンパク質を分離した。50％メタノール、10％酢酸中の0.1％Coomassie Blueで15分、ゲルを染色し、その後、50％メタノール、10％酢酸中で2×20分脱色した。ゲルから33kDワックスシンターゼバンドを切り取り、50％エタノール中で3×20分脱色した。レーンの1つがタンパク質の1ストリーク(streak)を含んでおり、これは最終の消化では使用しなかった。Ｂ．沈殿によるSDS-PAGE用のサンプルの調製最終HAカラム（プロトコル1）からの偶数番号の画分のアリコート（0.8ml）をカラムプロフィルについて3つのグループでプールした。プールを1.5mlバイアル中に3等分した。40％TCA 0.2mlの添加によって、タンパク質を沈殿させた。氷上で30分おいた後、サンプルを遠心分離（12,000×g、4℃で15分）して、沈殿したタンパク質をペレット化した。上清を除去し、ペレットを氷冷アセトン0.6mlで2 回洗浄した。サンプルの各プールセットについての最終の3ペレットを、同じSDS サンプルバッファー50μlに、バッファーを1つのバイアルから次に移動させることによって、再懸濁した。すでに再懸濁させて空になったバイアルをサンプルバッファー10μlで洗浄し、各プールサンプルについて合計の再懸濁容積を60μlとした。サンプルを12％アクリルアミドTris／Glycineミニゲル（Novex，San Dieg o,CA,1.5mm×10ウェル）に適用し、150Vの定電圧で20分の電気泳動によって、ゲルの下部から染料を溶出させた後、タンパク質を分離した。ゲルをCoomassie Bl ueで染色し、Gel-Clear（Novex,San Diego,CA）を使用して脱色した。カラムからのピークおよびテーリング画分を表すゲル上の3つの非等価レーンからワックスシンターゼを切り取った。このゲルスライスを1.5mlバイアル中に入れて、50 ％メタノール、10％酢酸1mlで2時間脱色した。脱色溶液を除去しゲルスライスを液体窒素で凍結させ、ゲル内消化のために、Yale UniversityのW M Keck Founda tion Biotechnology Resource Laboratoryに、ドライアイス上で前夜に送った。限外ろ過によって濃縮したサンプルからのゲルスライス1個および沈殿によって濃縮したサンプルからのゲルスライス3個をゲル内トリプシン消化のためにプールした。実施例5−アミノ酸配列の決定 W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory,Yale University において、タンパク質の配列決定を実施した。操作には、ゲルスライスの一部分（10〜15％）の定量およびアミノ酸組成のためのアミノ酸分析、タンパク質分解酵素の1つ（トリプシンまたはリシルエンドペプチダーゼ）によるタンパク質の消化、ならびに逆相HPLCによる生成物の分画、が含まれる。HPLC流動操作から吸収ピークを選別し、レーザー脱着質量分析を実施して、タンパク質の配列決定に先立って、ペプチドの存在、量、および質量を測定する。最も長いペプチドを選択して、マイクロシークエンシングを実施する。トリプシン消化によって得られたホホバワックスシンターゼペプチドのアミノ酸組成を、下記の表3に1文字コードを使用して、示す。 cDNAライブラリーまたばゲノムDNAからのワックスシンターゼ核酸配列の単離について記載する。Ａ．ホホバcDNAライブラリーの構築 Jackson and Larkins（Plant Physiol.(1976)57:5-10）によって最初に記載され、Goldbergら（Developmental Biol.(1981)83:201-217）によって改変されたポリリボソームの単離方法を使用して、開花後80〜90日目に採取したホホバ胚からRNAを単離した。この操作において、特に言及する以外は、全ステップを4℃で実施する。組織10gmを組織が微粉末になるまで、Waring Blenderで液体窒素中で摩砕する。液体窒素が蒸発した後、抽出用バッファー(200mM Tris pH9.0、160mM KCl、25mM EGTA、70mM MgCl₂、1％Triron X-100、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1mMスペルミジン、10mMβメルカプトエタノール、および500mMショ糖） 170mlを添加して、組織を約2分ホモジナイズする。ホモジネートを無菌ミラクロスでろ過し、12,000×gで20分遠心分離する。上清を500ml無菌フラスコ中にデカントし、1／19容積の20％界面活性剤溶液（20％Brij 35、20％Tween 40、20％No idet p-40w/v）を室温で添加する。溶液を4℃で中程度の速度で30分撹拌し、次に上清を12,000×gで30分遠心分離する。 40mM Tris pH9.0、5mM EGTA、200mM KCl、30mM MgCl₂、1.8Mショ糖、5mMβメルカプトエタノールを含有する溶液7mlを下部に入れた無菌Ti 60遠心チューブに上清約30mlを分注する。チューブの上部まで抽出用バッファーで満たし、Ti60ローター中、4℃で4時間、60,000rpmで回転する。遠心分離後、上清を吸引除去し、再懸濁用バッファー（40mM Tris pH9.0、5mM EGTA、200mM KCl、30mM MgCl₂、 5mMβメルカプトエタノール）0.5mlを各チューブに入れる。チューブを氷上に10 分置き、その後ペレットを完全に再懸濁させて、集める。次に上清を120×gで10 分遠心分離して、不溶性物質を除去する。上清に、20mM Tris pH7.6、200mM EDT A、2％N-ラウリル-サルコシネート中の自己消化した1mg/mlプロテイナーゼK1容積を添加して、混合物を室温で30分インキュベートする。酢酸ナトリウム１／10容積およびエタノール2容積の添加によって、RNAを沈殿させる。20℃で数時間後、4℃で30分、12,000×gでの遠心分離によってペレット化する。ペレットをTEバッファー（10mM Tris、1mM EDTA）10ml中に再懸濁し、等容積のTris pH7.5で飽和したフェノールで抽出する。4℃で20分の10,000×gでの遠心分離によって、相を分離させる。水性相を除去し、有機相を1容積のTEバッファーで再抽出する。次に水性相を集め、1容積のクロロホルムで抽出する。遠心分離によって、相を再び分離し、水性相を前述のようにエタノール沈殿させ、ポリリボソームRNAを生成させる。このポリリボソームRNA調製物を高塩バッファー（0.5M NaCl、20mM Tris pH7. 5、１mM EDTA、0.1％SDS）中でセルロースカラム（Sigma-cell 50）に流動させることによって、RNA中の多糖類の混入物を除去する。混入物はカラムに結合し、RNAが溶出液中に回収される。溶出画分を集め、RNAをエタノール沈殿させる。沈殿した全RNAを次にさらに小容積中に再懸濁させ、オリゴd(T)セルロースカラムに適用して、ポリアデニル化RNAを単離する。ポリアデニル化RNAを使用して、市販のクローニングベクター、Bluescribe M1 3-（Stratagene Cloning Systems；San Diego,CA）から誘導し、以下のようにして製造したプラスミドクローニングベクターpCGN1703中のcDNAライブラリーを構築する。Bluescribe M13-のポリリンカーを、BamHIでの消化、マングビーン(mun g bean)エンドヌクレアーゼでの処理、および平滑末端連結によって改造し、Bam HI欠失プラスミド、pCGN1700を作製する。pCGN1700をEcoRIおよび Sst1（隣接する制限部位）で消化し、BamHI、PstI、XbaI、ApaIおよびSmaIのための制限部位、AATTの5'オーバーハング、ならびにTCGAの3'オーバーハングを有する合成リンカーでアニールする。pCGN1700へのリンカーの挿入では、EcoRI部位が削除され、Bluescribe中に見られるSstI（本明細書では「SacI」と称することもある）が再形成され、リンカー中に含まれる新しい制限部位が付加される。生成するプラスミド、pCGN1702をHindIIIで消化し、Klenow酵素で平滑末端化する。この線状DNAをPvuIIで部分的に消化し、希釈溶液中でT4 DNAワックスシンターゼに連結する。lacプロモーター領域を欠失した形質転換物を選択し（pCGN170 3）、プラスミドクローニングベクターとして使用する。簡単に述べると、cDNA合成のためのクローニング法は以下の通りである。プラスミドクローニングベクターをSstIで消化し、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用して、生成する付着末端上にホモポリマーのT-テールを形成させる。オリゴ(dA)-セルロースクロマトグラフィーによって、未消化のまたはテールがつかなかったプラスミドから、テールがついたプラスミドを分離する。生成するベクターは、このベクタープラスミドのいずれかの末端に第１鎖が共有結合で付着する、cDNAの合成のためのプライマーとして作用する。このcDNA-mRN A-ベクター複合体をデオキシグアノシン三リン酸の存在下で末端トランスフェラーゼで処理し、cDNA鎖の末端にG-テールを生成させる。BamHI部位に隣接する過剰のcDNA-mRNA複合体をBamHI消化によって除去すると、一端にBamHI付着末端を有し、他端にG-テールを有するcDNA-mRNA-ベクター複合体が残る。5’BamHI付着末端、制限酵素NotI、EcoRIおよびSstIのための認識配列、ならびに3'C-テール末端を有するアニールした合成環状化リンカーを使用して、この複合体を環状化する。連結および修復後、この環状複合体を大腸菌DH5a株（BRL,Gaithersburg， MD）中に形質転換して、cDNAライブラリーを生成させる。このホホバ胚cDNAバンクはその中に約500塩基対の平均cDNA挿入サイズを有するクローンを約1.5×10⁶ 含有する。その外、クローニングベクター1ZAPII/EcoRI（Stratagene,San Diego,CA）中でcDNAライブラリーを構築するために、ホホバポリアデニル化RNAを使用することもできる。このライブラリーは製造者が提供するプロトコル、DNAおよび細菌株を使用して構築する。Gigapack Goldパッケージングエキストラクト（Stratag ene）を使用し、やはり製造者の推奨法にしたがって、クローンをパッケージする。この方法で構築されるcDNAライブラリーは約400塩基対の平均cDNA挿入サイズを有するクローンを約1×10⁶含有する。Ｂ．合成オリゴヌクレオチド一般的に、mRNAから逆転写された一本鎖DNA鋳型からのPCRプライマーとして使用するためには、ワックスシンターゼペプチドをコードする配列に対応するセンス方向配列を含有するオリゴヌクレオチドを調製する。これらのオリゴヌクレオチドを「順方向(forward)」増幅反応のためのプライマーとして使用して、センス鎖DNAを製造する。非コードDNA鎖の増幅のための「逆方向(reverse)」反応のためには、PCR用のD NA鋳型を調製するために使用するプライマーの一部と同一になるようなオリゴヌクレオチドを設計するとよい。あるいは、ワックスシンターゼペプチドをコードする配列に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドを上記の「順方向」ワックスシンターゼオリゴヌクレオチドプライマーと組合せて使用することができる。ワックスシンターゼペプチド配列が一群の別種のコドンによってコードされ得るアミノ酸を含有する場合は、順方向または逆方向プライマーは「縮重」オリゴヌクレオチド、すなわち、特定のペプチド領域について可能なコード配列の全部またはいくつかの混合物を含有するかも知れない。こうした混合物中に存在する別種のオリゴヌクレオチドの数を減少させるため、PCRプライマーのための合成オリゴヌクレオチドを調製するときに、可能なコード配列の数が最少のペプチド領域を選択するのが好ましい。同様に、合成オリゴヌクレオチドを使用して、ワックスシンターゼ配列のためのライブラリーを直接スクリーニングする場合は、低縮重性オリゴヌクレオチドが好ましい。以下は、ペプチドWSpep29（中央部）ならびにこのペプチドWSpep29をコードし得る順方向（上部）および逆方向（下部）DNA配列の例である。以下は、ペプチドWSpep33（中央部）ならびにこのペプチドWSpep33をコードし得る順方向（上部）および逆方向（下部）DNA配列の例である。以下はワックスシンターゼ配列を取得するために使用することができる合成オリゴヌクレオチドの配列である。このオリゴヌクレオチドの名称は実施例6に列記する特定のワックスシンターゼペプチド断片の数を反映している。オリゴヌクレオチドの名称中の文字「F」はPCR順方向反応プライマーを示す。文字「R」はP CR逆方向反応プライマーを示す。ポリ(A)＋または全RNAからの逆転写のために、オリゴヌクレオチド、TSYNを使用して、PCR鋳型として使用する一本鎖DNAを調製する。mRNAのポリ(A)テールに結合させるポリ(T)領域の外に、このオリゴヌクレオチドはHindIII、PstIおよび SstIのための制限消化配列を含む。TSYNの配列は以下の通りである。オリゴヌクレオチド、TAMPはワックスシンターゼをコードする配列のアンチセンス鎖の増幅のためのPCR逆方向反応において有用である。PCRのための鋳型が mRNAから逆転写された一本鎖DNAの場合は、最初の順方向反応が完結するまでは逆方向反応は起きないことに注意すべきである。第一鎖反応の結果、センス鎖鋳型が生成し、次にこれを使用して、逆方向プライマーからアンチセンスDNA鎖を増幅することができる。TAMPの配列は以下の通りである。上記のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基コードは以下のIUPAC標準に従っている： A＝アデニン T＝チミン Y＝シトシンまたはチミン C＝シトシン U＝ウラシル R＝アデニンまたはグアニン G＝グアニン I＝イノシン O＝イノシンまたはシトシン H＝アデニン、シトシンまたはチミン D＝アデニン、グアニンまたはチミン N＝アデニン、シトシン、グアニンまたはチミン W＝アデニンまたはチミン S＝グアニンまたはシトシン B＝グアニン、シトシンまたはチミン K＝グアニンまたはチミン M＝アデニンまたはシトシンＣ．PCR 反応上記のようにしてホホバ(jojoba)組織から調製した全RNAからポリ(A)＋RNAを単離する。Superscript逆転写酵素(BRL)およびオリゴヌクレオチドプライマーとしてTSYNを使用する逆転写によって、ポリ(A)＋または全RNAから一本鎖cDNAを調製する。反応を37_Cではなく45_Cで実施する以外は、製造者の指示にしたがって、反応を行なう。以下に示すPCR反応1〜12において、このホホバ一本鎖cDNAを使用する。 Perkin Elmer Cetus Gene Amp PCR System 9600 PCR装置で鋳型として逆転写した一本鎖cDNAを使用して、PCRを実施する。製造者の説明書にしたがって、市販のPCR反応用および最適化試薬を使用する。上記のプライマーの3'位置のcDNA の部分を以下の反応において増幅することができる：それ以上の増幅が必要な場合は、-F2と命名されたプライマーを使用する第2ラウンドのPCR反応用に、-F1と命名されたプライマーを含む反応のPCR産物を鋳型として使用することができる。同様に、-R2と命名されたプライマーを使用する第2ラウンドのPCR反応用に、-R1と命名されたプライマーを含む反応のPCR産物を鋳型として使用することができる。あるいは、Marathon cDNA Amplification Kit（Clontech Laboraties Inc.）を使用し、製造者の指示にしたがって、5'および3'RACE（Frohmanら、1988）を使用して、cDNAの全体を増幅することができる。3'RACE反応のためにはプライマー、WSpep29-F1、WSpep29-F1、WSpep33-F1およびWSpep33-F2を使用する。5'RACE 反応のためにはプライマー、WSpep29-R1、WSpep29-R1、WSpep33-R1およびWSpep3 3-R2を使用する。 PCR反応で作製されたDNA断片を製造者のプロトコル（Invitrogen Corp.）にしたがってpCR2.1中にクローン化する。クローン化断片のDNA配列を決定して、このクローン化断片がワックスシンターゼペプチドをコードすることを確認する。Ｄ．ワックスシンターゼ配列のためのライブラリーのスクリーニング PCRによって得られたワックスシンターゼDNA断片を標識して、上記のcDNAライブラリーからのクローンをスクリーニングするためのプローブとして使用する。 DNAライブラリーのスクリーニング技術は当分野の技術者に既知であり、例えばM aniatisら（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Col d Spring Harbor Laboratory Press）に記載がある。この方法によって、ワックスシンターゼ核酸配列が取得され、これを核酸配列について分析し、そして原核および真核の両方の各種の宿主中でのワックスシンターゼの発現のために使用することができる。実施例6−植物発現のためのワックスシンターゼおよびレダクターゼ構築物植物細胞中でのワックスシンターゼおよびレダクターゼ配列の発現をもたらす構築物を以下のようにして調製することができる。例えばWO92/03564に記載されたナピン、Bce4およびACP遺伝子から、種子組織中に優先的に発現される遺伝子の5'および3'調節領域を含む発現カセットを調製することができる。例えば、ワックスシンターゼまたはレダクターゼ遺伝子構築物の発現のために使用することができるナピン発現カセット、pCGN1808がKridlら（Seed Science Research(1991)1:209-219）によって記載されている。別のナピン発現カセット、pCGN3223はアンピシリン耐性バックグラウンド、ならびにpCGN1808に見られるものと本質的に同一の1.725ナピン5'および1.2653'調節配列を含んでいる。その調節領域はHindIII、NotIおよびKpnI制限部位に隣接（すなわちフランキング）し、そしてユニークなSalI、BglII、PstIおよびXhoIクローニング部位が5'および3'非コード領域の間に局在している。オレオシン(oleosin)遺伝子からの5'および3'領域の制御下で転写調節するための配列のクローニング用カセットもまた使用することができる。Brassica nap usオレオシン遺伝子の配列がLeeとHuang（Plant Phys.(1991)96:1395- 1397）によって報告された。オレオシンカセットの1つ、pCGN7636の配列が米国特許第5,445,947号の図4に提供されている。このオレオシンカセットはBssHII、 KpnIおよびXbaI制限部位に隣接し、そしてワックスシンターゼ、レダクターゼまたは目的のその他のDNA配列の挿入のためのSalI、BamHIおよびPstI部位を5'および3'オレオシン領域の間に含んでいる。ワックスシンターゼおよびレダクターゼ遺伝子配列をこれらのカセット中に挿入して、植物形質転換法のための発現構築物を提供することができる。例えば、ナピン遺伝子からの5'および3'調節領域を使用した、植物細胞中でのレダクターゼの発現のための構築物が米国特許第5,445,947号明細書に記載されている。 Holstersら（Mol.Gen.Genet.(1978)163:181-187）の方法によって、バイナリー(blnary)ベクター構築物をEHA101株（Hoodら、J.Bacteriol(1986)168:1291-13 01）などのAgrobacterium細胞中に形質転換して、以下に記載する植物形質転換法において使用する。実施例7−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT）アッセイ非可溶化または可溶化タンパク質調製物中のDAGAT活性のアッセイ方法をMorti erella ramannianaについて記載する。Ａ．非可溶化サンプル Kamisakaら（1993,1994）による記載と同様にして、総容量100μl中、10mMリン酸カリウム（pH7.0）、100〜150mM KCl、および0.1％TX-100(w/v)を含有するバッファー中の3.67μM 1-¹⁴C-18:1-CoenzymeA（53.5-54.5Ci/mole、New Englan d Nuclear,Boston,MA）および1.5mM 1,2-18:1ジアシルグリセロール（DAG）(Sig ma D-0138、2-メトキシエタノール中の150mMストックとして調製)を使用して、D AGAT活性をアッセイする。アッセイを30℃で5分実施し、ヘプタン：イソプロパノール：0.5M H₂SO₄（10:40:1、v/v/v）1.5mlの添加によって停止させる。必要ならば、アッセイ中の生成物の形成を直線速度に維持するため、アッセイの前にサンプルをバッファーで希釈してもよい。Ｂ．可溶化サンプル非可溶化サンプルについて記載したアッセイを以下のように変更して実施する：1,2-18:1 DAGの量を0.5mMに減少し、Triron X-100の量を0.2％に増加し、そしてKCl濃度を100〜125mMに維持する。Kamisakaら（1996,1997）による記載のようにして、そのプロトコルをわずかに変更して、界面活性剤による可溶化の後に活性体を回収するため、L-α-ホスファチジン酸（Sigma P-9511、1％ Triron X-10 0(w/v)中の50mMストックとして調製）を含ませることも必要である。500μMではなく300μMホスファチジン酸を使用するとTriron X-100による処理後のDAGAT活性のより高い剌激が得られることがわかった。また、DAGAT活性はアッセイ中100 〜125mMの最適レベルで導入されるKClの量に対して感受性であることもわかった。アッセイを30℃で5〜30分実施し、非可溶化サンプルについて記載したように、停止させる。Ｃ．サンプルアッセイのプロセシングアッセイを停止した後、上記サンプルを後日のプロセシングのために4℃で保存するか、または直後に1M NaHCO₃ 0.1mlの添加の後、抽出のための担体として1 5nmol/mlトリオレインを含有するヘプタン1mlの添加によって、処理することができる。内容物を渦巻き攪拌し、水相と有機相を分離した後、上部の有機相を新しいガラスバイアルに取り出して、1M NaCl 1mlで洗浄する。最終有機相の40％を液体シンチレーション計数のために取り出して、残りの有機相を清浄なバイアルに移して、窒素ガス下で蒸発させて乾燥する。残渣をヘキサン45μl中に再懸濁し、前もって吸着剤が塗布されたゾーン(preadsorbent loading zone)を有するシリカゲル-G、ガラス、薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート（Analtech #3 1011，Newark,Delaware）上にスポットする。このTLCプレートをヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（50:50:1、v/v/v）中で上部まで展開し、次に乾燥して放射線画像分析機（AMBIS 3000,San Diego,CA）によってスキャンして、トリアシルグリセロール中に取り込まれた放射能部分を測定する。活性をpmol/minの単位で報告する。実施例8−Mortierellara ramannian培養物の増殖および収穫組成の明確なグルコース培地（逆浸透によって精製した水IL中、グルコース 30g、(NH₄)₂SO₄ 1.5g、K₂HPO₄ 3g、MgSO₄・7H₂O 0.3g、NaCl 0.1g、CH₃COONa・3H₂ O 5g、FeSO₄・7H₂O 10mg、CaCl₂・2H₂O 1.2mg、CuSO₄・5H₂O 0.2mg、ZnSO₄・7H₂O 1. 0mg、MnCl₂・4H₂O 1.0mg、チアミン-HCl 2mgおよびビオチン0.02mg(pH5.7)）1リッターに1.5〜3×10⁶個の胞子を接種し、30℃、200rpmで振盪しながら、9〜11日インキュベートすることによって、Mortierella ramannianaを培養する。培養物を1層のMiracloth（Calbiochem,La Jolla,CA）でのろ過によって収穫する。過剰の液体を手で絞ることによって除去する。1リッターから収穫された圧縮細胞の平均収量は22.5gである。実施例9−勾配ゲルドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）カラム画分からのサンプルをSDS-PAGEサンプルバッファー（1ｘバッファー＝2 ％SDS、250mMβ−メルカプトエタノール、0.0025％ブロムフェノールブルー）で希釈し、電気泳動によって分析する。Laemmli(1970)の方法に従い、Delepelaire (1979)の改良を少し取り入れて、ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動（10−13 ％）を実施する。上部の貯留バッファーには0.1％のドデシル硫酸ナトリウムを使用するが、下部の貯留バッファーには使用しないで、積層用および分離用ゲルとする。積層用ゲルは30％アクリルアミド原液（アクリルアミド：N,N'-メチレンアクリルアミド、37.5：1、Bio-Rad,Hercules,CA）を5％、0.06％過硫酸アンモニウムおよび0.1％ TEMED(v/v)を含む。分離用ゲルは0-10％直線勾配ショ糖によって安定化した10−13％直線勾配アクリルアミドストックを含む。室温、150V の一定電圧で7〜9時間、電気泳動を実施する。Blumら（1987）の方法にしたがって銀で、またはCoomassie Blue（0.1％ Coomassie Blue R-250、50％メタノール (v/v)、10％酢酸(v/v)）で染色することによって、タンパク質を可視化する。実施例10−Mortierella ramannianaからのDAGATの精製における、Kamisakaら（1 997）が使用したクロマトグラフィーの評価Ａ．脂質体(lipid body)画分の調製以下のステップを4℃で実施する。典型的には、各脂質体調製について湿潤圧縮細胞（-70℃で保存）70〜75gを使用する。使用直前に、細胞を氷上で融解し、バッファーA（10mMリン酸カリウム( pH7.0)、0.15M KCl、0.5Mショ糖および1mM EDTA）150ml中に再懸濁する。以下のプロテアーゼ阻害剤を添加して、タンパク質分解を低下させる：0.1μM Aprotin in、1μM Leupeptin、および100μM Pefabloc（すべてBoehringer Mannheim,Ger many）。細胞を5個の50-mlチューブに分け入れて、Polytron Tissue Homogenize r（Kinematic GmbH,Brinkman Instruments,Switzerland）で、目盛り#7で直径1c mのプローブ(probe)を使用して、7×1分、細胞溶解する。生成するスラリーを遠心チューブ（29×104mm）に移し、1500×g（Beckman Instruments,J2-21,JA-20 ローター、3500rpm）で、4℃で10分回転させることによって、固体の砕片をペレット化する。上清を取り出し、ペレットを別のバッファーA 5mlで洗浄する。遠心分離後、上清分を1つにまとめる。この画分を「S1」と命名する。S1を6本の超遠心チューブ（25×89mm,Beckman Instruments,Fullerton,CA）に分け入れて、それぞれにバッファーB（10mMリン酸カリウムpH7.0、0.15M KCl、0.3Mショ糖および1mM EDTA）5mlを重層する。サンプルを100,000×g（Beckman Instruments,L 8-M,SW-28ローター、21000rpm）で、4℃で3時間遠心分離する。重層の上部に浮遊している脂質体画分（LBF）をスパチュラで回収し、ガラスホモジナイザー（P otter-Elvehjem）に移す。ピペットでバッファーB重層4mlを取り出して、これをホモジナイザー中のLBFに加えることによって、遠心チューブに残留する少量のL BFを回収する。この最後のLBFをバッファーB 40ml中でホモジナイズする。その他の画分を以下のようにして回収する：界面画分（0.3および0.5Mショ糖バッファーの間の界面）、可溶性画分（界面の下の液体分）および膜画分（各チューブの底部の黄褐色／褐色ペレット）。可溶化および以降の精製まで、全部を-70℃ で凍結させて保存する。Ｂ．脂質体画分からのDAGAT活性体の可溶化 LBFを氷上で融解し、Triton X-100（Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany ）を10％(w/v)ストックから最終濃度1.3％(w/v)になるように添加することによって、可溶化を達成する。固体ショ糖(Mallinckrod t,Paris,Kentucky）を添加して、最終濃度0.5Mとする。この界面活性剤で処理したサンプルを4℃で1時間振盪し、次に6本の超遠心チューブ（25×89mm,Beckman Instruments）に分け入れる。各チューブにバッファーB 5mlを重層する。サンプルを100,000×g（Beckman Instruments,L8-M,SW-28ローター、21000rpm）で、4 ℃で3時間遠心分離する。各超遠心チューブの重層部を通って底部まで1cm以内に、細いチユーブを挿入して、上部の（浮遊脂肪層を含む）0.3Mショ糖重層部およびペレットを残したまま、下部の0.5Mショ糖層を軽く吸引して取り出すことによって、「Triton X-100抽出物」と称する、可溶化物質を回収する。 Kamisakaら（1997）によって記載されたプロトコルにおいては、脂質体画分を 0.1％ Triton X-100で可溶化し、さらに100,000×gで遠心するか、または0.2μm フィルターでろ過している。彼らは、DAGAT活性体を第1のカラムに結合させるためには、Triton X-100の濃度を1.5％に増加する必要があることを見出だした。Ｃ．M.ramannianaからのDAGATの精製で使用するクロマトグラフィークロマトグラフィーのために使用するバッファーCは10mMリン酸カリウム(pH7. 0)、0.1％ Triton X-100(w/v)（Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany）、10 ％グリセロール(w/v)、0.1μM Aprotinin、1μM Leupeptin、100μM Pefabloc（すべてBoehringer Mannheim,Mannheim，Germany）、および量を変化させた塩化カリウム（75−500mM）を含む。このバッファーはエチレングリコールをグリセロールに替え、そしてEDTA、DTT、およびPMSFを省き、一方Aprotinin、Leupepti nおよびPefablocを含ませた点で、Kamisakaら（1997）が使用した相当するカラムバッファーとは異なっている。Kamisakaら（1997）によるプロトコルにしたがって、Yellow 86-Agarose（Sigma R-8504,St.Louis,MO）カラムを調製し（1.5cm ×5.8cm）、バッファーC中の150mM KClで平衡化する。我々はTriton X-100抽出物中に存在するDAGAT活性体をこれらの条件下でYellow 86-Agaroseカラムに結合させようと試みたが、大部分のDAGATはこのカラムに結合しないことがわかった。我々は添加するサンプルのKCl濃度を等容積の（KClを含まない）バッファーCで75mMに希釈することによって、DAGAT活性体の有意な割合をカラムに結合することができる。これに一致させて、Yellow 86- AgaroseカラムもまたバッファーC中の75mM KClで平衡化させる。0.56ml/分でのサンプルの添加後、カラムを4カラム容量の平衡化バッファーで洗浄する。カラムに結合したDAGAT活性体およびタンパク質をバッファーC中の500mM KClで溶出させる（図4）。 Yellow 86-Agaroseカラムから溶出したDAGAT活性体（画分17−20）をバッファーCで1：3.33に希釈して、KCl濃度を150mMに低下させる。希釈したプール（103m l）をバッファーC中150mM KClで平衡化したHeparin-Sepharose CL-6Bカラム（Ph armacia,Uppsala,Sweden、0.5cm×4.8cm）に0.2ml/分で添加する。カラムを5倍容量の平衡化バッファーで洗浄し、バッファーC中150−500mM KClの15ml直線勾配でDAGAT活性体およびタンパク質を溶出させる。DAGAT活性体は2つのオーバーラップするピーク中に溶出する。第1のピークはKamisakaら（1997）によって見出されたように勾配中に溶出するが、Kamisakaらによって見出されなかった第2 のピークは勾配の最後にずっと少ないタンパク質量で溶出する（図5A）。 Heparinカラムからの2つのピーク画分の一部（250μl）をバッファーC中150mM KClで平衡化したSuperdex-200カラム（1×30cm、Bio-Rad,Hercules,CA）上の0. 2ml/分でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、さらに精製する。検量化のみのために、Triton X-100をTriton X-100 R（Calblochem,La Jolla,CA）に交換した改変バッファーC中の150mM KClでカラムを平衡化する。このカラムをBio-Ra d Gel Filtration Standardsを使用して検量する。 Heparin-Sepharose CL-6Bからの２つのピークのそれぞれからのDAGAT活性体は99 kDaの分子量推定位置に溶出する。より高い比活性のDAGATを含有していたHeparinカラムからの遅い方の溶出ピークについて、別のクロマトグラフィーを実施する。この場合、Heparinカラムからの第2のピーク（画分36−41）をバッファーCで1：6.6に希釈し、容量46.7mlとする。サンプルをバッファーC中の75mM KClで平衡化させたYellow 86 Agaroseカラム（1.0cm×6.4cm）に0.5ml/分で添加する。5カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、結合したタンパク質およびDAGAT活性体のすべてがバッファーC中の75−500mM KClの40ml直線勾配中に溶出する。DAGAT活性体はただ1 個のピークとして溶出する（図6A）。 Heparinカラムおよび第2のYellow 86カラムからのDAGAT活性体を含有する画分のタンパク質組成を、実施例３のプロトコルに従う勾配SDS-PAGEによって分析する。銀染色によってタンパク質バンドを検出する。これらのカラムから溶出するバンドのパターンを画分毎に対応するDAGAT活性体プロフィルと比較する。DAGAT 活性の存在に相関する多くのタンパク質候補が存在する。この精製プロトコルは DAGAT活性に関係する特定のタンパク質候補1つを同定するには不十分であるというのが、我々の見解である（図5B、6B）。実施例11−Mortierella ramannianaから精製したDAGATタンパク質候補を同定するための新しい精製プロトコルＡ．脂質体画分の調製以下のステップを4℃で実施する。典型的には、各脂質体調製について湿潤圧縮細胞（-70℃で保存）70〜75gを使用する。使用直前に、細胞を氷上で融解し、バッファーA（10mMリン酸カリウム( pH7.0)、0.15M KCl、0.5Mショ糖および1mM EDTA）150ml中に再懸濁する。以下のプロテアーゼ阻害剤を添加して、タンパク質分解を低下させる：0.1μM Aprotin in、1μM Leupeptin、および100μM Pefabloc（すべてBoehringer Mannheim,Ger many）。0.5mmガラスビーズを使用し、細胞破砕機（Bead-Beater,Biospec Produ cts,Bartlesville,OK）でサンプルを細胞溶解する。サンプルチャンバーをガラスビーズ180mlで満たす。湿潤圧縮細胞を氷上で融解し、バッファーA 150ml中に再懸濁する。細胞スラリーをガラスビーズ上に注ぐ。一般的に、適正に機能させるためには、チャンバーをさらにバッファーA 40〜50mlで満たす必要がある。この容量を使用して、当初の容器から細胞スラリーの残りを洗い取って、元のサンプルと併せることも可能である。サンプルの粘性に応じて45〜90秒、細胞を（「ホモジナイズ」目盛りで）破砕する。ガラスビーズを含む細胞スラリーをチューブ（29×104mm）に分注し、500×g（Beckman Instruments,GP遠心分離機、GH 3.7水平ローター、1500rpm）、4℃で遠心分離する。上清を取り出し、ペレットを新たなバッファーA 5mlで洗浄する。遠心分離後、上清分を1つにまとめる。この画分を「S1」と称する。S1を6本の超遠心チューブ（25×89mm、Beckman Instruments）に分け入れて、それぞれに改変バッファーB（10mMリン酸カリウムpH7.0、0.15M KCl、および0.3Mショ糖）5mlを重層する。EDTAはヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーの障害になるので、バッファーBから除外する（実施例4参照）。サンプルを100,000×g（Beckman Instru ments,L8-M,SW-28ローター、21000rpm）で、4℃で3時間遠心分離する。重層の上部に浮遊している脂質体画分（LBF;Lipid Body Fraction）をスパチュラで回収し、ガラスホモジナイザーに移す。ピペットでバッファーB重層4mlを取り出して、これをホモジナイザー中のLBFに加えることによって、遠心チューブに残留する少量のLBFを回収する。この最終のLBFをバッファーB 40ml中でホモジナイズする。残りの画分を以下のようにして回収する：界面画分（0.3および0.5Mショ糖バッファーの間の界面）、可溶性画分（界面の下の液体分）および膜画分（各チューブの底部の黄褐色／褐色ペレット）。可溶化および以降の精製まで、全部を -70℃で凍結させて保存する。Ｂ．脂質体画分からのDAGAT活性体の可溶化可溶化の前に、標準としてウシ血清アルブミンを使用して、Bradfordの方法（ Bio-Rad Reagent,Hercules,CA）によって、脂質体画分のアリコートについて、タンパク質測定を行なう。LBFを氷上で融解し、次にタンパク質濃度1mg/mlに希釈し、界面活性剤：タンパク質比15：1のTriton X-100(w/w、1.3％Triton X-100 と等量）で処理する。固体ショ糖（Mallinckrodt,Paris,Kentucky）を添加して、最終濃度0.5Mとする。この界面活性剤で処理したサンプルを4℃で1時間振盪し、次に６本の超遠心チューブ（25×89mm,Beckman Instruments）に分け入れる。各チューブに改変バッファーB 5mlを重層する。サンプルを100,000×g（Beckman Instruments,L8-M,SW-28ローター、21000rpm）で、4℃で3時間遠心分離する。各超遠心チューブの重層部を通って底部までlcm以内に、細いチューブを挿入して、上部の（浮遊脂肪層を含む）0.3Mショ糖重層部およびペレットを残したまま、下部の0.5Mショ糖層を軽く吸引して取り出すことによって、「Triton X-100抽出物」と称する可溶化物質を回収する。Ｃ．DAGATカラムクロマトグラフィー植物品種からアシルトランスフェラーゼタンパク質を精製する我々の以前の経験をMortierella ramannianaからのDAGATの精製の場合に応用する。我々は、ホホバ（Simmondsia chinensis）由来のワックスシンターゼ（国際特許出願公開第 95/15387号、この全体を参照として本明細書中に組み入れる）およびココナッツ（Cocos nucifera）由来のリソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LP AAT）（米国特許出願第08/231,196号、この全体を参照として本明細書に組み入れる）の精製において、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーを使用して、成功している。この精製ステップをYellow 86-Agaroseカラムの後に導入する。Yellow 86-Agaroseおよびそれに続くヒドロキシルアパタイトでの精製プロトコルは2つの方法で実施する。プロトコルAでは、活性体は第1のカラムに結合し、溶出後、画分を活性についてアッセイする。次に活性画分をプールして第2のカラムに適用する。我々はこれを順次(sequential)流動操作と称する。プロトコルBでは、活性体を第1のカラムに結合させた後、溶出させて、直接第2のカラムに流動させ、この間プールもアッセイもしない。我々はこれを縦列(tandem)流動操作と称する。プロトコルAにおいて、Triton X-100抽出物をバッファーC中75mM KClで平衡化したYellow 86-Agaroseカラム（2.5cm×6.4cm）（実施例4.C）に2ml/分で適用する。このカラムを5カラム容量の平衡化バッファーで洗浄し、次にバッファーC中 500mM KClで0.5ml/分で溶出させる（図7）。溶出した活性体の93％を有する2つの最も活性な画分（64および65）をプールして、バッファーC中500mM KClで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム（Bio-Gel HT,Bio-Rad,1cm×25.5cm）に0. 5ml/分で負荷する。DAGAT活性体はカラムから流出するが、大部分のタンパク質はカラムに結合する。このカラムを3容量の平衡化バッファーで洗浄する。結合したタンパク質をバッファーC中100mMリン酸二カリウムおよび500mM KClで0.5ml /分で溶出させる（図8A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を実施例３に記載した勾配ゲルSDS-PAGEにかける。タンパク質を銀で染色し、バンドのパターンを画分毎に活性プロフィールに対して比較する（図8B）。いくつかのDAGATタンパク質候補が活性に相関する。特に、43kD、36.5kD、33kDa、29kD、28kDおよび27kDに相当する位置に泳動したバンドが注目される。53kD領域においては活性に相関するタンパク質の候補は見られない。プロトコルBにおいて、Triton X-100抽出物をバッファーC中75mM KClで平衡化したYellow 86-Agaroseカラム（1.5cm×5.8cm）に1ml/分で適用する。このカラムを5カラム容量の平衡化バッファーで洗浄する。次に、このYellow 86-Agarose カラムの出口をバッファー500mM KClで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム（1.0cm×26.2cm,Bio-Rad,Hercules,CA）の入り口に接続する。Yellow 86カラムに結合したDAGAT活性体を500mM KClを含有するバッファーC 110mlで溶出させて、直接ヒドロキシルアパタイトカラムを通過させる（0.2ml/分）。最後に、ヒドロキシルアパタイトカラムをYellow 86-Agaroseカラムから離して、ヒドロキシルアパタイトカラムに結合したタンパク質をバッファーC中100mMリン酸二カリウムおよび500mM KClで溶出させる。DAGAT活性は、500mM KClを含有するバッファーC 110mlでの洗浄中にヒドロキシルアパタイトカラムから回収された画分中に見られる。 Triron X-100抽出物中のタンパク質の大部分はYellow 86-Agaroseカラムに結合せず、廃棄される。DAGATを含む小さなサブセットのタンパク質はYellow 86-A garoseカラムに結合し、バッファーC中の500mM KClで溶出する。この溶出液をヒドロキシルアパタイトカラムに適用すると、DAGAT活性体は流出する一方、残りのタンパク質の大部分はこのカラムに結合し、分離される（図9A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を勾配ゲルSDS-PAGEにかけて、銀で染色する。これらのカラムから溶出するバンドのパターンを画分毎にそれぞれのDAGAT活性プロフィールに対して比較する。染色したタンパク質バンドの試験から、33kDaの位置のタンパク質がDAGAT活性に最も相関することが示される（図9B）。実施例 12−ゲル内消化のためのタンパク質の調製Ａ．濃縮によるSDS-PAGE用のサンプルの調製最終HAカラム（プロトコル1）の流出液／洗浄液からの奇数番号の画分をプールし、YM 30膜（Amicon,Inc.,Beverly,MA）を装着した加圧セル中での限外ろ過によって、3倍に濃縮した。2つのCentricon-30ユニット（Amicon,Inc.,Beverly, MA）を使用してサンプルをさらに濃縮して、容量を約50μlとした。各サンプルをSDS Cocktail（20％SDS 4μl、14.3M βメルカプトエタノール1μl、および0. 1％ブロモフェノールブルー1μl）6μlで処理した。室温で15分静置した後、サンプルを10−13％アクリルアミド勾配ゲル（実施例3D）（16×16cm×厚さ1mm）に適用し、150Vの定電圧で9.5時間の電気泳動によって、タンパク質を分離した。50％メタノール、10％酢酸中の0.1％ Coomassie Blueで15分、ゲルを染色し、その後50％メタノール、10％酢酸中で2×20分脱染色した。ゲルから33kDワックスシンターゼバンドを切り取り、50％エタノール中で3×20分脱色した。レーンの1つがタンパク質の筋(streak)を１本含んでおり、これは最後の消化では使用しなかった。Ｂ．沈殿によるSDS-PAGE用のサンプルの調製最終HAカラム（プロトコル1）からの偶数番号の画分のアリコート（0.8ml）をカラムプロフィールについて3つのグループでプールした。プールを1.5mlバイアル中に3等分した。40％TCA 0.2mlの添加によって、タンパク質を沈殿させた。氷上で30分おいた後、サンプルを遠心分離（12,000×g、4℃で15分）して、沈殿したタンパク質をペレット化した。上清を除去し、ペレットを氷冷アセトン0.6ml で2回洗浄した。バッファーを1つのバイアルから次のバイアルに移動させることによって、サンプルのプールされた各セットからの最終の3ペレットを同じSDSサンプルバッファー50μlに再懸濁した。すでに再懸濁させて空になったバイアルをサンプルバッファー10μlで洗浄し、各プールサンプルについて合計の再懸濁容量を60μlとした。サンプルを12％アクリルアミドTris／Glycineミニゲル（No vex,San Diego,CA,1.5mm×10ウェル）に適用し、150Vの定電圧で20分の電気泳動によって、ゲルの下端部から染料を溶出させた後、タンパク質を分離した。ゲルをCoomassie Blueで染色し、Gel-Clear（Novex,San Diego,CA）を使用して脱色した。カラムからのピークおよび末尾(tailing)画分を表すゲル上の3つの非等価レーンからワックスシンターゼを切り取った。このゲルスライスを1.5mlバイアル中に入れて、50％メタノール、10％酢酸1mlで2 時間脱色した。脱色溶液を除去し、ゲルスライスを液体窒素で凍結させ、ゲル内消化のために、ドライアイスに載置し一晩かけてYale UniversityのW M Keck Fo undation Biotechnology Resource Laboratoryに送った。限外ろ過によって濃縮したサンプルからのゲルスライス1個および沈殿によって濃縮したサンプルからのゲルスライス3個をゲル内トリプシン消化のためにプールした。実施例 13−アミノ酸配列の決定 W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory,Yale University において、タンパク質の配列決定を実施した。操作には、ゲルスライスの一部分（10〜15％）の定量およびアミノ酸組成についてのアミノ酸分析、タンパク質分解酵素の1つ（トリプシンまたはリシルエンドペプチダーゼ）によるタンパク質の消化、ならびに逆相HPLCによる生成物の分画、が含まれる。HPLC流動操作から吸収ピークを選別し、レーザー脱着質量分析を実施して、タンパク質の配列決定に先立って、ペプチドの存在、量、および質量を測定する。最も長いペプチドを選択して、マイクロシークエンシングを実施する。実施例14 Mortierella ramanniana DAGAT核酸配列の単離一般的に、mRNAから逆転写された一本鎖DNA鋳型からのPCRプライマーとして使用するためには、DAGATペプチドをコードする配列に対応するセンス方向配列を含有するオリゴヌクレオチドを調製する。これらのオリゴヌクレオチドを「順方向」増幅反応のためのプライマーとして使用して、センス鎖DNAを製造する。非コードDNA鎖の増幅のための「逆方向」反応のためには、PCR用のDNA鋳型を調製するために使用するプライマーの一部と同一になるようにオリゴヌクレオチドを設計することができる。あるいは、DAGATペプチドをコードする配列に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドを上記の「順方向」DAGATオリゴヌクレオチドプライマーと組合せて使用することができる。 DAGATペプチド配列が一群の別種のコドンによってコードされ得るアミノ酸を含有する場合は、順方向または逆方向プライマーは「縮重」オリゴヌクレオチド、すなわち、特定のペプチド領域について可能なコード配列の全部またはいくつかの混合物を含有するかも知れない。こうした混合物中に存在する別種のオリゴヌクレオチドの数を減少させるために、PCRプライマーのための合成オリゴヌクレオチドを調製するときに、可能なコード配列の数が最少のペプチド領域を選択するのが好ましい。同様に、合成オリゴヌクレオチドを使用して、DAGAT配列のためのライブラリーを直接スクリーニングする場合は、低縮重性オリゴヌクレオチドが好ましい。 PCRによって得られたDAGAT DNA断片を標識して、上記のcDNAライブラリーからのクローンをスクリーニングするためのプローブとして使用する。相補的DNAおよびDNAの構築ならびにライブラリーのスクリーニング技術は当分野の技術者に既知であり、例えばManiatisら（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Seco nd Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載がある。この方法によって、DAGAT核酸配列が取得され、これを核酸配列について分析し、そして原核および真核の両方の各種の宿主中でのDAGATの発現のために使用することができる。実施例 15−植物発現のためのMortierella ramanniana DAGAT構築物植物細胞中でのDAGAT配列の発現をもたらす構築物を以下のようにして調製することができる。種子組織中で優先的に発現される遺伝子の5'および3'調節領域を含む発現カセットは、例えばWO 92/03564に記載されるようにナピン、Bce4およびACP遺伝子から調製することができる。例えば、ワックスシンターゼまたはレダクターゼ遺伝子構築物の発現のために使用することができるナピン発現カセット、pCGN1808がKridlら(Seed Science R esearch(1991)1:209-219）によって記載されている。別のナピン発現カセツト、 pCGN3223はアンピシリン耐性バックグラウンド、ならびにpCGN1808に見られるものと本質的に同一の1.725ナピン5'および1.265 3'調節配列を含んでいる。その調節領域はHindIII、NotIおよびKpnI制限部位に隣接し、そしてユニークなSalI 、BglII、PstIおよびXhoIクローニング部位が5'および3'非コード領域間に位置している。オレオシン(oleosin)遺伝子からの5'および3'領域の制御下で転写制御するための配列のクローニング用カセットもまた使用することができる。Brassica nap usオレオシン遺伝子の配列がLeeおよびHuang（Plant Phys.(1991)96:1395-1397 ）によって報告された。オレオシンカセット、pCGN7636の配列が米国特許第5,44 5,947号の図4に提供されている。このオレオシンカセットはBssHII、KpnIおよび XbaI制限部位に隣接し、そしてワックスシンターゼ、レダクターゼまたは目的のその他のDNA配列の挿入のためのSalI、BamHIおよびPstI部位を5'および3'オレオシン領域間に含んでいる。 DAGAT遺伝子配列をこれらのカセット中に挿入して、植物形質転換法のための発現構築物を供給することができる。例えば、ナピン遺伝子からの5'および3'調節領域を使用した、植物細胞中でのレダクターゼの発現のための構築物が米国特許第5,445,947号に記載されている。 Holstersら（Mol.Gen.Genet.(1978)163:181-187）の方法によって、バイナリー(binary)ベクター構築物をEHA101株（Hoodら、J.Bacteriol(1986)168:1291-13 01）などのAgrobacterium細胞中に形質転換して、以下に記載する植物形質転換法において使用する。実施例 16−植物形質転換法および分析目的のDNA配列を植物宿主のゲノム中に挿入し、その配列の転写または転写および翻訳をさせて、表現型の変化をもたらすため、各種の方法が開発された。 Radkeら（Theor.Appl.Genet.(1988)75:685-694；Plant Cell Reports(1992)11 :499-505）によって記載されたように、Agrobacteriumが仲介する形質転換法を使用して、Brassica napusのキャノーラ型変異種、またはReston品種などの高エルカ酸変異種を形質転換することができる。Valverkensら（Proc.Nat.Acad.Sci. (1988)85:5536-5540）によって記載されたように、Agrobacteriumが仲介する形質転換によってトランスジェニックArabidopsis thaliana植物を取得することができる。関連する技術を使用して、その他の植物品種を同様に形質転換することができる。あるいは、本明細書に記載したレダクターゼおよびワックスシンターゼ発現構築物を含む形質転換された植物を取得するために、Kleinら（Bio/Technology 10 :286-291）によって記載されたような、顕微鏡映像ボンバード(microprojectile bombardment)法を使用することもできる。実施例1に記載したDAGATアッセイ法を使用して、形質転換された植物からの種子またはその他の植物物質のDAGAT活性を分析することができる。上記の結果は、脂肪族アシルおよびジアシルグリセロール基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性な、部分的に精製されたDAGATタンパク質を取得する能力を証明している。DAGATタンパク質およびそれらのアミノ酸配列を得る方法を提供する。その上、本明細書に提供されたPCRおよびライブラリースクリーニング方法を使用して、このアミノ酸配列から、DAGAT核酸配列もまた得ることができる。宿主細胞中でこの配列の転写および／またはDAGATタンパク質の発現をするように、これらの核酸配列を操作して、このタンパク質を各種の応用のために使用することができる。このような応用として、宿主細胞中のトリアシルグリセロールレベルおよび組成の改変が含まれる。本明細書中に引用した刊行物および特許出願のすべてを、各刊行物または特許出願が特定されて個々に参照として組み込まれることを意味するものと同程度に、本明細書中に参照として組み込む。前記発明の明確化および理解を目的として、説明図および実施例によってある程度詳細に記載したが、当技術分野の通常の技術を有する者にとって、本発明の教示を参考にすることによって、請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなく、これらにある程度の変更および改変がなされ得ることは、容易に明らかになるはずである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Diacylglycerol transferase protein This application is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 60 / 048,625 and U.S. Patent No. This is a continuation application of 9,881.Technical field The present invention relates to an enzyme, a method for purifying the enzyme, amino acids related to the enzyme, Nucleic acid sequences and methods of using these compositions in genetic engineering applications. I do. Foreword background Vegetable oils are used for various industrial and food applications. New vegetable oil composition And / or oil compositions from biosynthetic or natural plant-derived sources. There is a need for improved means of obtaining. Depending on the intended use of the oil, a wide variety A fatty acid composition is desired. For example, in some cases, to obtain the desired oil at lower cost, It may be useful to increase the seed to flour ratio. This typical example is expensive It would be an oil product. Or such oilseed can be an excellent animal feed There will be. In some cases, oil vs. seed flour in oilseed to reduce calories It may be useful to make the ratio smaller. Other applications include cardiovascular health For health reasons, edible vegetable oils with a higher content of unsaturated fatty acids are desired. Also And other tropical plants with high saturation, such as palm oil, coconut oil, or cocoa oil. As an alternative to natural oils, temperate vegetable oils are also used in various industrial and food applications Will be done. Means to obtain such oils and / or modified fatty acid compositions As one of the methods, it is conceivable to treat plants with genetic engineering. However , In order to treat plants with genetic engineering, it is necessary to use genetic materials in a stable and inheritable form. There must be a suitable means of transferring the plant into the plant. In addition, the desired phenotype Nucleic acid sequences that can be generated, such that such nucleic acid sequences are applied correctly There must be a control area that can be commanded. In addition, the desired phenotype To produce the so-called Kennedy pathway for glycerolipid synthesis, the reactants And the rate of metabolism through the pathway can be adjusted or changed. You have to understand that you need to Higher plants are likely to synthesize oil via a common metabolic pathway. Fatty acids are total A series of reactions catalyzed by an enzyme, also known as fatty acid synthase (FAS) From acetyl-CoA in plastids. Produced in plastid The fatty acids are transported to the cytosolic region of the cell and are esterified to coenzyme A. These acyl-CoAs are substrates for glycerolipid synthesis in the endoplasmic reticulum (ER). is there. Glycerolipid synthesis itself is based on phosphatidic acid (PA) and diacylglycero This is a series of reactions that first induces a DAG. All of these metabolic intermediates , Phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylethanolamine (PE), Or it may be induced by membrane phospholipids such as phosphatidylcholine (PC), The main component of vegetable oil used by seeds as the energy of preservation forms used during germination May be used to form neutral triacylglycerol (TAG) . Diacylglycerol (DAG) is glycerol-3-phosphate and fatty acid Synthesized from syl-CoA in two steps. That is, sequentially, glycerol-3-phosphine Ethyl acyltransferase (G3PAT), lysophosphatidic acid acyltran PA was produced using spherase (DAGAT) as a catalyst. DAG is produced in a hydrolysis step catalyzed by Phatase (PAP). Most In cells, membrane phospholipids are produced using DAG, the first step of which is CTP- PC synthesis using sulfocholine cytidyltransferase as a catalyst. Produce storage oil Living cells are contacted with diacylglycerol acyltransferase (DAGAT). DAG is acylated with a tertiary fatty acid in a reaction using a medium. Overall, these The reaction forms part of a pathway commonly referred to as the Kennedy pathway. As far as the regiospecificity of fatty acids is concerned, the structure of the TAG is the structure of the fatty acyl-Co-A substrate. Of three acyltransferases to glycerol and glycerol backbone substrates It depends on the specificity of each. Thus, for example, the seeds of many temperate regional species In the case of the resulting acyltransferase, a saturated fat is placed at the sn-1 or sn-3 position. Either acid or unsaturated fatty acid can be present, Only tend to be able to exist. Absolute specificity for unsaturated fatty acids at sn-2 position Sex is determined by the substrate selectivity of the DAGAT enzyme. In some species like cocoa Indicates that when the sn-1 position is esterified with a saturated fatty acid, the acylation at the sn-3 position is clear. TAG composition suggests that there is also a tendency for saturated fatty acids to be dominant Is done. Therefore, the ratio of the structure TAG of the SUS (S = saturated fatty acid, U = unsaturated fatty acid) type is Predicted from random distribution based on overall fatty acid composition with unsaturated fatty acids linked to sn-2 position Bigger than what is done. For this reason, DAGAT also has no control over the TAG structure. If so, it is suggested that it plays an important role in the control of TAG synthesis. The reaction catalyzed by DAGAT is a critical branch point in glycerolipid biosynthesis Located in. Such branch point enzymes are prime candidates for metabolic regulatory sites. It is thought that. TAG and membrane lipid synthesis starting with the synthesis of diacylglycerol Naru shares a common G3PAT, DAGAT, and PAP. Every cell has a membrane So these enzymes are definitely present. Make oil synthesis unique What is there is the DAGAT reaction. When DAGAT activator is present, DAG is Exhibits behavior. TAG synthesis is promoted by the presence of the DAGAT enzyme. , DAGAT activator and / or diacylglycerol concentration is cascade controlled Controls the rate of metabolism to glycerolipids directly or indirectly through It makes sense to think that you can. Fatty acids are introduced into the glycerol backbone to form an oil-producing phenotype. Various obstacles may have to be overcome in order to obtain a suitable nucleic acid sequence. These disorders include identifying metabolic factors of interest and having useful kinetic properties The ability to select and characterize protein sources and determine amino acid sequences. Purify the target protein up to the level, and Obtaining a nucleic acid sequence that can be used as a probe to retrieve the desired DNA sequence, Preparing the construct, transforming and analyzing the resulting plant, and the like. But not limited to Therefore, an enzyme target capable of modifying the structure and amount of oil Need to identify useful tissue sources for nucleic acid sequences of such enzyme targets It is. Ideally, the enzyme target alone or with increased / decreased oil production TAG structure, the ratio of saturated to unsaturated fatty acids in the fatty acid pool, and / or Others involved in other novel oil compositions resulting from modifying the fatty acid pool It could be used in one or more applications in combination with nucleic acids. Identification of enzyme targets After certification and qualification, large amounts of protein and purification You need a protocol. Ultimately, it contains elements necessary for phenotypic modification. There is a need for nucleic acid constructs and plants containing such constructs. Several putative isolation procedures have been reported for DAGAT. Polokoff And Bell (1980) dissolve and partially solubilize DAGAT from rat liver microsomes. Purification was reported. This preparation contains specific protein factors involved in the activity. Insufficient purity for identification. Kwanyuen and Wilson (1986, 1990) The purification and characterization of the cotyledon-derived enzyme was reported. However, molecular Judging by the amount (1843 kDa), this preparation was not sufficiently solubilized and contained D It is estimated that all AGAT proteins were large aggregates of various proteins. You. Little et al. (1993) reported on the solubilization of DAGAT obtained from rape-spore-derived embryos. As reported in Kwanyuen and Wilson, substances with activity Since the molecular mass of is very large, it is unlikely that sufficient solubilization will occur. Anders son et al. (1994) reported that immunoaffinity chromatography Solubilization and 415 rounds of purification of DAGAT from the gut were reported. However, No evidence that the antibody used recognizes the DAGAT epitope, and it was purified There is no evidence that the protein is really DAGAT. Effectively, Kwanyuen and Wil As in the case of son, the DAGAT activator in the resulting preparation was It exhibited a molecular mass unique to the matrix. Finally, Kamisaka et al. (1993, 1994, 1996, 1997) Is due to the solubilization and subsequent purification of DAGAT from Mortierella rammaniana It reports on homogenization. They found that the molecular mass of DAGAT from this strain was 53k. Prove that it is Da. This may have actually solubilized This is the first report published on DAGAT. Our research on our research Attempted to reproduce in a laboratory (see Example 4), but a homogeneous preparation was obtained. Did not. That is, associating the enzyme active with the 53 kDa polypeptide is could not. In fact, we are the polypeptide presented by Kamisaka et al. Large amounts of the likely 53kDa polypeptide were obtained using their protocol It could be shown that there was no correlation with the DAGAT activator in the fraction.Related literature Cell-free homogenates from developing jojoba embryos are acyl-CoA fatty alcohols. A report was published that it has luacyltransferase activity. This activity Associated with the floating wax pad obtained by differential centrifugation (Pollard et al., (1979) supra; Wu et al., (1981) supra). Multiple enzymes from Euglena gracilis with acyl-SCoA transacylase activity Complex solubilization has been reported by Wildner and Hallick (The So uthwest Consortium Fifth Annual Meeting, April 122-24, 1990, Las Cruces , NM. Abstracts). Jojoba acyl-CoA: For 10 times purification of alcohol transacylase protein And reported by Pushnik et al. (The Southwest Consortium Fourth A nnual Meeting, February 7, 1989, Riverside, Ca. For an assay of jojoba acyl-CoA: alcohol transacylase activity, (Analytical Biochemistry (1992) 207: 335-340). WO 93/10241 discloses plant fatty acyl-CoA: fatty alcohol O-acyltransf It is related to Erase. Jojoba 57kD protein is a jojoba fatty acyl-C oA: As fatty alcohol O-acyltransferase (wax synthase) Have been identified. We later discovered that this 57 kD protein from jojoba was Is a β-ketoacyl-CoA synthase involved in the biosynthesis of very long chain fatty acids. (Lassner et al., The Plant Cell (1996) 8: 281-292). Acyl-CoA: thought to be a fatty alcohol acyltransferase57 The optical affinity labeling of kD jojoba seed polypeptide was also described by Shockey et al. (Plant Phys. (1995) 107: 155-160). Kamisaka and Nakahara, “Diacylglyceres in lipid biofractions from oleaginous fungi. Characterization of Roll Acyltransferase Activators ", J. Biol. Biochem. (1994) 116: 1295-1301. Kamisaka and Nakahara, “Surfactant solubilized dia with anionic phospholipids. Activation of silglycerol acyltransferase, ”J. Am. Biochem. (1996) 11 9: 520-523). Kamisaka et al., “Diacylglycerol in lipid biofractions from oleaginous fungi. Purification and Characterization of Acyltransferase Actives ", J. Am. Biochem. (1997) 121: 1107-1114. WO 93/10241 discloses plant fatty acyl-CoA: fatty alcohol O-acyltransf It is related to Erase. Jojoba 57kD protein is a jojoba fatty acyl-C oA: As fatty alcohol O-acyltransferase (wax synthase) Have been identified. We later discovered that this 57 kD protein from jojoba was Is a β-ketoacyl-CoA synthase involved in the biosynthesis of very long chain fatty acids. (Lassner et al., The Plant Cell (1996) 8: 281-292). BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows the column fractions obtained by the first wax synthase purification protocol. The analysis result of a wax synthase activity is shown. Figure 1A shows Blue A agarosek The result of a chromatogram is shown. Figure 1B shows a ceramic hydroxyapatite. 3 shows the results of chromatography. Figure 1C shows Sephacryl S-100 size waste 4 shows the results of dechromatography. Figure 1D shows hydroxyapatite chroma The results of the chromatography are shown. FIG. 2 shows the column fractions obtained by the second wax synthase purification protocol. The analysis result of a wax synthase activity is shown. Figure 2A shows Blue A agarosek The result of a chromatogram is shown. FIG.2B shows hydroxy anobetite chroma The results of the torography are shown. Figure 2C shows Superdex 75 size exclusion chromatography. The results of Raffy are shown. FIG. 3 shows the purified wax obtained by the wax synthase purification shown in FIG. Wax synthase and DAGAT activities of fractions derived from synthase preparations Shows the results. Hydroxyapatite chromatography step It is the result obtained using the obtained fraction. Figure 4 shows a DAGAT purification procedure using Yellow 86-agarose chromatography. Analysis results of the wax synthase activity of the column fraction obtained by Tokor I have. FIG. 5 shows the column fractions obtained by the second wax synthase purification protocol. The analysis result of DAGAT activity is shown. FIG.5A shows HeparinSeparose CL-6B chromatog The results of Raffy are shown. FIG.5B shows the result of SDS-PAGE analysis of the peak fraction. ing. FIG.6A shows the results of DAGAT purification by Yellow 86-agarose chromatography. Is shown. FIG.6B was obtained from Yellow 86-agarose chromatography. The result of SDS-PAGE analysis of the peak fraction is shown. FIG. 7 shows Mortierella r using Yellow 86-agarose chromatography. The result of purification of DAGAT derived from Amanniana is shown. FIG. 8 shows column fractions obtained by the second wax synthase purification protocol. The analysis result of DAGAT activity is shown. FIG.8A shows hydroxyapatite chromatog The results of Raffy are shown. FIG.8B shows the result of SDS-PAGE analysis of the peak fraction. ing. Figure 9 shows the analytical results of the DAGAT activity of the column fraction obtained by the DAGAT purification protocol. The result is shown. FIG. 9A shows a tandem Yellow 86-agarose / hydroxyapata. 3 shows the results of site chromatography. FIG. 9B shows a tandem chromatograph. 3 shows the results of SDS-PAGE analysis of the peak fraction obtained from the sample. Summary of the Invention According to the present invention, diacylglycerol acyltransferase (hereinafter referred to as Are also referred to as DAGATs) and methods of using the same. Also, Compositions of biologically active DAGAT-related amino acid sequences and methods of use thereof Interesting. In particular, DAGAT protein preparations with relatively high specific activity are useful in vitro and i Interesting for use in a variety of applications in vivo. After this, among others, DAGA For protein preparations with T activity. Of particular interest is Mortierel DAGAT obtained from la ramanniana. Of particular interest, the jojoba wax synthase of the present invention is also It exhibits acylglycerol (DAGAT) activity. TAG naturally in jojoba Is not produced, so the wax synthase enzyme is active on DAG substrates This means that wax synthase is particularly high in most plant species. Yeast involved in TAG production in oilseed crops producing seeds containing bell-stored TAG It suggests that it is associated with the elementary DAGAT. Therefore, Johobawa Dsag synthase protein and / or its encoding sequence It is an object of the present invention to use it for the isolation of an encoding plant gene. The described jojoba and Mortierella ramanniana DAGAT were purified and separated from the membrane. (Ie, solubilized), and the solubilized DAGAT preparation was subjected to various chromatographic runs. Analysis will identify proteins associated with DAGAT activity. In this way, about 40k It is confirmed that a protein having a molecular weight of DA is related to DAGAT activity. Kara Purification methods such as chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis In addition, DAGAT proteins of sufficient purity to perform amino acid sequence analysis can get. Used to obtain nucleic acid sequences encoding all or part of the DAGAT protein When designing various synthetic oligonucleotides that can be The peptide fragment is used as a template. Using the DAGAT coding sequence thus obtained Then you can also isolate other DAGAT genes encoding DAGAT protein . Therefore, the present invention includes DAGAT peptides and amino acids corresponding to these peptides. Noic acid sequences are included. Such sequences are particularly useful for analysis of DAGAT gene sequences and Used to prepare oligonucleotides containing the DAGAT coding sequence for recovery . Depending on the intended use, the DAGAT coding sequence encodes all or part of the sequence. May be used. All or part of such a genomic or cDNA sequence Minute Is an object of the present invention. Of particular interest are recombinants that transcribe or transcribe / translate (express) DAGAT sequences A DNA construct. In particular, transcription or transcription / translation in plant host cells Preferred constructs are: Such constructs are preferentially included in plant seed tissue. Contains various regulatory regions such as the transcription initiation region obtained from the expressed gene. You may. In yet another aspect, the invention provides for expressing the construct in a cell, A method for producing DAGAT in a host cell or progeny thereof. DAGAT code sequence DAGAT-containing cells resulting from the production of are also an object of the present invention. In addition, the present invention particularly relates to the modification of triglyceride molecules in seed oil of oilseed crops. To use a DNA sequence encoding DAGAT to perform Such breaks Plant cells containing the modified triglycerides are also an object of the present invention. Other objects of the present invention include the plant LPAAT protein of the present invention. And modified plants, seeds and oils obtained by the expression of Detailed description of the invention The diacylglycerol acyltransferase of the present invention (here, DA GAT) includes 1,2-diacylglycerol-3-phosphate under enzymatic reaction conditions. Ability to catalyze the production of triacetylglycerol from acetyl and acyl-CoA substrates As a protein, polypeptide, or peptide obtained from a source of cells Amino acids of any sequence. "Enzyme reaction conditions" means that enzymes function Conditions (ie, factors such as temperature, lack of pH inhibitors, etc.) It means that you are in an added environment. “Solubilization” refers to the use of DA It means extracting GAT enzyme. Membrane co-presents DAGAT protein in membrane Solubilization is described in the Examples below, since it effectively binds to other proteins. It is an essential requirement to identify and purify such DAGAT proteins. When performing solubilization studies, DAGAT is used as described in detail in the Examples below. For the activator, three different solubilization indicators are taken into account. 1) DAGAT activity does not settle even after very high speed centrifugation. 2) DAGAT activators have the unique molecular weight found in enzymes that are not associated with membranes. Move the size exclusion chromatography column as you do. 3) The protein present in the DAGAT preparation is at least partially They can be separated from one another by means of chromatography. There are other interpretations that may apply individually to any of the above criteria All three criteria are met to ensure DAGAT solubilization It is necessary to confirm that it has been done. For example, the density of the solution used for solubilization Very slow sedimentation due to similarity of density of unsolubilized membrane If this is not the case, the first criterion will give the wrong result, even with very large g forces. May give. This situation is shown in the embodiment described later. Shown there As described above, a literature solubilization procedure based solely on this criterion was performed from the plasma membrane. It turns out to be unsuitable for obtaining qualitatively separated DAGAT. Second criterion Normally, the solubilized actives move more slowly through the size exclusion column than the original membrane. Movement, but only after the membrane itself has been exposed to the surfactant. If it binds weakly to the ram, thereby slowing the surfactant through the column In that case, the second criterion may not be useful. The third criterion was solubilized Based on the fact that proteins can be separated by chromatography, It is possible that this criterion may not be met due to human factors or unforeseen circumstances. Although it is a little, it exists. However, the membrane was partially separated by the solubilization procedure. Various aggregates of the protein may be released. In that case, this Such aggregates may be able to be separated from one another by chromatography. that's all Therefore, to ensure that DAGAT was solubilized, three criteria were used: Everything must be satisfied. After obtaining the jojoba-derived solubilized wax synthase protein, Further characterization of the enzyme with respect to factor requirements and potential activity inhibitors It turns out that it is possible to carry out experiments. For example, the jojoba wax thin of the present invention It has a wide range of acyl substrates, such as acyl-ACP molecules and acyl-CoA molecules. It turned out to be. In addition, acyl and fatty alcohol substrates are It may have a wide size range with respect to length. For example, if the carbon chain length is C1 Enzyme acts on all of these when tested for activity using substrates that are 2-C14 It has been found. In addition, fatty acids and fatty alcohols having various degrees of unsaturation It was also found to have activity against Surprisingly, purified jojoba wax synthase is also found in jojoba plant tissue. Does not report the presence of TAG, despite the fact that diacylglycerol (DAG) Triacetylglycerol (TAG) acting on substrates and fatty acyl-CoA substrates It was found to produce. Therefore, wax synthase has at least two Acyltransferase activity, a receptor substrate for acyl-CoA molecules Is an alcohol (fatty alcohol acyltransferase) Activity when the acceptor substrate is diacylglycerol (DAG acyltransfer (DAGAT). DAGAT activity present in wax synthase enzyme Therefore, wax synthase protein is a DAGAT protein found in other plant species. This suggests a strong relationship with quality. The following example describes the solubilization of Moortierella DAGAT. DAGAT Is determined by examining each of the above solubilization criteria. . To identify and partially purify the DAGAT protein, Mortierella DAGAT The solubilized preparation is utilized in various chromatography experiments. By doing this , A protein with a molecular weight of approximately 40 kDa has been identified as associated with DAGAT activity It is. As will be described in more detail in the examples below, the 40 kDa protein is Yellow 86- Chromatography using agarose and hydroxyapatite columns Partially purified by Next, gel electrophoresis was performed on the partially purified DAGAT preparation. Treatment and blotting treatment on nitrocellulose To obtain the protein in a purified form. Nitrocellulose containing the identified band Cut off the filter and collect the 40kDa protein. Next, the purified protein is digested with various enzymes, and the amino acid sequence is determined. Obtain the peptide to be used for In this case, the tryptic peptide of the 40 kDa protein described herein is , Corresponding to a part of Mortierella ramanniana DAGAT. Other Mortierella DAGAT Pe The peptide can be obtained in the same manner, and the amino acid sequence can be determined. To obtain the nucleic acid sequence encoding DAGAT, the amino acid sequence derived from the DAGAT peptide was The use is described herein. For example, the DAGAT peptide sequence Prepare the corresponding synthetic oligonucleotide. Polymerase chain reaction (PCR) When these oligonucleotides are used as primers, the DAGAT gene A partial DNA sequence of the offspring is obtained. Use the partial sequence thus obtained as a probe Then, the gene library derived from Mortierella ramanniana tissue A DAGAT clone is obtained. In addition, from a specific DAGAT peptide, less degenerate Oligonucleotides can be prepared. Using such a probe directly Screening of gene library to examine DAGAT gene sequence It is possible. In particular, screening a cDNA library in a phage vector Because of lower levels of background hybridization. Useful for such methods. The DAGAT nucleic acid sequence of the present invention is a DNA sequence derived from genomic DNA, cDNA, or mRNA. Alternatively, it may be an RNA sequence, or it may be a wholly or partially synthesized one. You may. Gene sequences can be determined, for example, by isolating genomic DNA from appropriate sources and Amplification and cloning of target sequence using polymerase chain reaction (PCR) May be cloned. In addition, to provide sequences especially suitable for plants If desired, the gene sequence may be completely or partially synthesized. this In this case, the desired structural gene (DAGAT protein) All or part of the gene encoding the quality) may be synthesized. Suitable for the host Codons are most commonly used for proteins expressed in the desired host species, for example. May be determined based on the codons Those skilled in the art prepare antibody preparations, nucleic acid probes (DNA and RNA), etc. Screening and recovery of "homologous" or "related" DAGAT from plant sources It will be readily apparent that the method can be used for Homologous sequences are sequences where the sequences are identical This identity is the identity of nucleic acid or amino acid sequence information. Or hybridize between a known DAGAT and a candidate source It may be determined by performing a reaction. When determining sequence homology, Consider conservative changes like Glu / Asp, Val / Ile, Ser / Thr, Arg / Lys, and Gln / Asn You may put in. If the identity between the two fully mature proteins is around 25%, The acid sequences are considered homologous (for a general comment, see Doolittle, R . F. , OF URFS and ORFS (University Science Books, CA, 1986) ). Accordingly, certain exemplified Mortierella protein preparations and Other DAGATs can be obtained from the described sequences. In addition, modified amino Model natural and synthetic DAGATs and synthetic proteins containing acid sequences The starting material for the transfer of the exemplified sequence from DAGAT and such an exemplified sequence It will be obvious that it can be obtained from DAGAT obtained using. Modified amino acid sequence Suddenly, regardless of whether some or all of the sequence is synthetic Includes sequences that have been mutated, truncated, added, etc. Practically refined from plant preparations Encodes a manufactured sequence, an equivalent sequence, or an equivalent protein Sequences are similar, regardless of the method used to obtain the protein or sequence. Is considered to be naturally derived. Typically, in the case of a DAGAT sequence obtained using a nucleic acid probe, the target DAGAT sequence Between 60 and 70% sequence identity between the Will be. However, longer sequences with sequence identity as low as 50-60% were obtained. There is a possibility that it will be. The nucleic acid probe may be a fragment longer than the nucleic acid sequence. Alternatively, it may be a short oligonucleotide probe. Probe longer nucleic acid fragments When used as a probe (longer than about 100 bp), Sequences with 20-50% deviation (ie, 50-80% sequence identity) from the target sample Screening may be performed at lower stringency as obtained . Oligonucleotide probes are better than the entire nucleic acid sequence encoding the DAGAT enzyme It may be short, but at least about 10, preferably at least about 15, more preferably Preferably it should be at least about 20 nucleotides. For longer areas If shorter regions are used, higher sequence identity is desirable . Therefore, oligonucleotides may be used to detect and recover other related DAGAT genes. Identify regions of highly conserved amino acid sequences to design leotide probes This And seems to be desirable. In particular, if it is possible to identify highly conserved sequences, Shorter probes are often especially useful for performing the remelase chain reaction (PCR). Be useful. (Gould, et al. , PNAS USA (1989) 86: 1934-1938. ) In addition to isolating other DAGATs, the sequence information obtained from DAGATs and related nucleic acid sequences To obtain genes for other related acyltransferase proteins. It is considered possible. For example, other acyls involved in plant lipid biosynthesis The transferase enzymes include plastid DAGAT, mitochondrial DAGAT, and lysozyme. Phosphophosphatidylcholine acyltransferase (LPCAT), lysophospho Apatidylserine acyltransferase (LPSAT), lysophosphosfatidyle Tanolamine acyltransferase (LPEAT), and lysophosphophosphatids Diluinositol acyltransferase (LPIAT). These yeasts All reactions are acyltransferase reactions involving the sn-2 position of lysophospholipids. And the genes encoding these sequences are the plant acyl-Co-A DAGA of the present invention. It is also possible to associate with the T sequence. In this case, it is presented here. Sea urchin-derived fatty acyl-CoA: fatty alcohol O-acyltransferase Other related acyltransferases, including Can be linked to acylglycerol acyltransferase . DAGAT synthase and wax synthase are homologous protein families Being a member is a DAG from Mortierella ramanniana, one of the oleaginous fungi Supported by information obtained by purification of AT (see Examples). No. First, like jojoba wax synthase, the fungal DAGAT activator binds to the membrane, It can only be solubilized by using surfactants. Second, Jojobawak As in the case of synthase, to restore fungal DAGAT enzyme activity, Phospholipid (eg, phosphatidic acid) is added to the assay mixture following There is a need to. Third, fungal DAGAT can be used during purification chromatography. It behaves very similar to bawax synthase. In particular, both enzyme species Causes very little delay through the hydroxyapatite column Most other protein species in the membrane preparation bind to the column matrix. (See Examples). In fact, from experiments using jojoba enzymes, Mortiere Hydroxyapatite chromatography for purification of DAGAT from lla ramanniana Was predicted to be the most important step. Successful purification of fungal DAGAT It turned out that adding this step was essential. Also, Ka The protocol of misaka et al. (1997) identifies the appropriate protein species associated with DAGAT activity. Was determined to be insufficient to determine. Finally, measured by SDS-PAGE The apparent molecular weight (33 kDa) of the fungal DAGAT polypeptide was determined by Same as the apparent molecular weight of bawax synthase (see Examples) . Related genes can be isolated by hybridization to a predetermined sequence. Label the sequence for detection, typically using radioactivity to determine . However, other methods can be used. Highly labeled probe Add to the hybridization solution and inject with the filter containing the desired nucleic acid. Cubate. For example, Northern or Southern blots or screens Use filters containing cDNA or genomic clones to be cleaned You. Hybridization and washing conditions are based on the ability of the probe to target sequence. Variations may be made to optimize hybridization. Lower the temperature and salt Higher degrees allow for the hybridization of less relevant sequences. (Low stringency). Low background hybridization Hybridizes specifically when problems occur under high stringency conditions Either hybridization or washing to improve sequence detection Increase in temperature and / or reduction of salt content in the step can be performed . Hybridization and washing temperatures are described in Beltz, et al. (Methods in En The estimated melting temperature of the probe as described in zymology (1980) 100: 266-285. Can be adjusted based on degree. Useful probes and appropriate hybridization After determining the conditions for the incubation and washing as described above, the labeling sequence and optimal The cDNA or genomic library is screened using the activating conditions. Inject rabbit or mouse with purified protein for immunological screening By irradiation, an antibody against palm DAGAT protein can be prepared . Such methods for preparing antibodies are well known to those skilled in the art. Monoclonal antibody Or polyclonal antibodies can be produced, but to isolate genes , Typically polyclonal antibodies are more useful. Anti- against palm DAGAT The relevant protein is present in the crude extract of the desired plant species as measured by cross-reactivity with the body. Western analysis may be performed to determine if any proteins are present. Cross reactivity If expression is observed, screening of an expression library corresponding to the desired plant species Is performed to isolate a gene encoding a related protein. Expression live Rally, Maniatis, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratoy, Cold Spring Harbor, New York) Construction in various commercially available vectors, such as λgtll, as described in Can be. All plants utilize the DAGAT protein in producing membrane phospholipids. Obedience Therefore, any given plant species could be a source of other DAGAT proteins. You. Plants that contain significant amounts of medium-chain fatty acids in the seed oil have medium-chain fats at sn-2 of the TAG. It is a preferred candidate for obtaining a plant DAGAT into which an acid can be introduced. Some of the genus Cuphea Species such as procumbens, lutea, hookeriana, hyssopifolia, wrightii, And inflata accumulate triglycerides containing medium chain fatty acids in seeds. Another natural plant source of medium chain fatty acids is the seeds of the family Lauraceae. In addition to the above , California Bay (Umlbellularia californica), Pisa (Actinodophne hookeri) , Sweet Bay (Laurus nobilis), and Cinnamomum camphora (camphor) are also medium-chain Accumulate fatty acids. Other plant sources include Ulmaceae (elm), Palmae, Myristicace ae, Simarubaceae, Vochysiaceae, and Savadoraceae. Of particular interest are plants that introduce unusual long-chain fatty acids into storage TAGs. DAGAT derived from species. For example, nasturtium and meadowfoam have Contains a 22: 1 acyl group, and the meadowfoam contains a 22: 1 (erucic acid) oil at the sn-2 position. It was demonstrated that DAGAT capable of introducing a fatty acyl group was included. this DAGAT with such activity is useful for the production of "tri-erucic acid type" Brassica oil. It appears to be. This oil is used for Brass against unsaturated fatty acids such as 18: 1 and 18: 2 Due to the selectivity of sic DAGAT, it has not been found so far. To investigate TAG biosynthesis events of plant lipid biosynthesis in a variety of in vivo applications It should also be noted that plant DAGAT from various sources can be used for this purpose. Should be a point. All plants believe that lipids are synthesized through a common metabolic pathway To study and / or apply one plant DAGAT to a heterologous plant host. Can be easily done with various species. In other applications, in vitro Promote the production of produced or synthesized TAG and / or modify its composition Plant DAGAT can be used outside of the original plant source of DAGAT to do . Nucleic acid sequences related to plant DAGAT proteins may have many uses. An example For example, recombinant constructs that can be used as probes, or DAGAT proteins in host cells. Providing a ready-to-use enzyme that expresses protein and / or Recombinant constructs that alter the composition of glycerides can be prepared. in vitro Or if the host cell is a plant host cell, either in vivo or There will be useful uses. For example, each medium-chain selectivity D available in the plant TAG biosynthesis pathway Increasing the amount of AGAT can increase the content of medium-chain fatty acids in TAG. And it is possible. Similarly, in some applications, antisense methods are used to plant It may be desirable to reduce the amount of DAGAT that is endogenously expressed in target cells. You. For example, medium chain or unusual longer to sn-2 position due to foreign DAGAT being inserted The original Brassica long-chain selection to increase the possibility of transfer of the fatty acyl group of the chain It may be desirable to reduce the expression of selective DAGAT. In this case, depending on the intended use, the construct may include the entire DAGAT protein or its protein. May be included. For example, given DAGAT tamper If antisense suppression of a protein is desired, the entire DAGAT sequence is not required. Furthermore, DAG If the AT construct is used as a probe, a sequence encoding a particular portion of DAGAT Sequence only, for example, a sequence known to encode a highly conserved DAGAT region It may be advantageous to prepare a construct containing only. As described above, the nucleic acid sequence encoding the plant DAGAT of the present invention contains a genomic sequence. A sequence, cDNA sequence, or mRNA sequence may be included. "Code" means The sequence corresponds to a specific amino acid sequence in sense or antisense orientation Means "Extrachromosomal" refers to the plant genome whose sequence is naturally associated Means that it exists outside of "Recombination" refers to mutations, restriction enzymes, etc. Means that the sequence includes a genetically engineered variant. The cDNA sequence contains a DAGAT protein (eg, Transit peptide sequence or mitochondrial DAGAT) -Sequences before processing such as targeting sequences may or may not be included. It doesn't have to be rare. Using any such precursor DAGAT DNA sequence Is useful for expression in plant cells. Genomic DAGAT sequence contains plant DAG Contains AT transcription and translation initiation, intron, and / or transcription termination regions It may be. These sequences are used with or without the DAGAT structural gene. In addition, it can be used for various DNA constructs. Thus, the plant D of the present invention The nucleic acid sequence corresponding to AGAT is used for protein delivery to specific organelles or membrane locations Signal sequences, useful tissue and timing profiles 5 'upstream non-coding regulatory region (promoter), transcription and translation regulatory region A 3 ′ downstream non-coding regulatory region useful as a region may be provided. In addition, the gene Other characteristics may be exhibited. Once the desired plant DAGAT nucleic acid sequence is obtained, it can be handled in a variety of ways. is there. If the sequence contains a non-coding flanking region, The region may be subjected to treatment such as excision or mutation. Thus, naturally occurring Perform transitions, transversions, deletions, and insertions on the sequence You may. Further, all or part of the sequence may be synthesized. 1 in structural gene One or more codons may be modified to provide a modified amino acid sequence. Also one or more Mutation of codons to provide convenient restriction sites or to construct or generate It may be used for other purposes related to the present. Structural genes are synthetic adapters, 1 Further modification using linkers to introduce one or more convenient restriction sites May be. The nucleic acid or amino acid sequence encoding the plant DAGAT of the present invention may be other unnatural Alternatively, they may be used in various forms with "heterologous" sequences. A "heterologous" sequence is By state is meant any sequence not present in linked form to the plant DAGAT. For example A set of nucleic acid sequences from the same plant that do not exist in linked form in the natural state Matching. The DNA sequence encoding the plant DAGAT of the present invention is a DNA sequence normally associated with DAGAT. It may be used in combination with all or a part of the gene sequence. The DNA sequence encoding DAGAT is Can promote transcription and translation in host cells in the 5 'to 3' direction of transcription Transcription initiation control region, DNA sequence encoding plant DAGAT, and transcription and translation termination In a DNA construct having a ligated region, it is combined as a component thereof. Potential host cells include both prokaryotic and eukaryotic cells. Depending on the purpose of use, the host cell may be a single cell or may be multicellular. Or may be found in undifferentiated organs. The cells of the present invention are wild-type cells. By including a plant DAGAT different from the vesicle, for example, a recombinant encoding a plant DAGAT By including a nucleic acid construct, it can be distinguished from others. Regulatory regions will vary from host to host. This area contains viruses, Regions derived from smids, chromosomal genes and the like are included. In prokaryotic or eukaryotic microorganisms In particular, for expression in a single cell host, a wide variety of constitutive promoters or May utilize a regulatable promoter. Once expressed in microorganisms, A usable plant enzyme is obtained. The transcription initiation region described so far includes E. coli. coil , B. regions from bacterial and yeast hosts such as subtilis and Sacchromyces cerevisiae Region, for example, β-galactosidase, T7 polymerase, tryptophan E, etc. Such genes are included. In most cases, the construct will contain regulatory regions that function in plants . This results in a modified product of the plant DAGAT, possibly without modification of the fatty acid composition. Will be. Open ready encoding plant DAGAT or a functional fragment thereof The coding frame is linked at its 5 'end to a transcription initiation regulatory region. DA in plant host In embodiments where it is desirable to express the GAT protein, the complete plant DAGAT gene It is desirable to use all or part. That is, the 5 'upstream non-coding region ( Promoter or the 3 ′ downstream non-coding region You may use together. Different, such as a promoter or modified promoter specific to the plant host of interest If a promoter is desired, i.e., the transcription initiation region from one gene source Regions and translation initiation regions from different gene sources, Numerous that provide a wide variety of constitutive or regulatable (eg, inducible) transcription A transcription initiation region can be used. Transcription corresponding to such a structural gene / The translation initiation region is located immediately adjacent to the 5 'upstream of each start codon. plant The transcription initiation region used in Region is included. For example, nopaline and mannopine synthase, 19 from CaMV S and 35S promoters, and napin, ACP, SSU, PG, zein, phaseoli 5 'upstream region derived from other plant genes such as E. Expression of DAGAT sequence For this purpose, an enhanced promoter such as the dual 35S can be used. 5 'upstream Such regions are obtained when the seed region is obtained from other genes that are regulated during seed maturation. When used, regions preferentially expressed in plant embryo tissue, such as ACP and And a transcription initiation control region derived from napin. Such "seed-specific "Promoter" is described in U.S. Patent Application No. 07 / 147,781, filed January 25, 1988, U.S. Patent Application Serial No. 07 / 550,804 filed July 9, 990) and issued around March 16, 1990. The new “sequences that are preferentially expressed in the early stages of seed development and related No. 07 / 494,722 entitled "Continuous Method". May be used. These patent applications are incorporated herein by reference. Seed group Transcription initiation regions that are preferentially expressed in the weave, i.e. Transcription initiation region minimizes destructive or detrimental effects of gene products It is considered that it is desirable to modify the TAG as much as possible. A regulatory transcription termination region may be located in the DNA construct of the present invention. Transcription termination region Is the DNA sequence encoding plant DAGAT, or a convenient transcription terminator from a different gene source. A termination region, e.g., a transcription termination region that is naturally associated with a transcription initiation region. Can be provided. If the transcription termination region is from a different gene source, the transcription termination region Is at least about 0,3 'of the structural gene from which the termination region is derived. 5kb, preferably It will contain about 1-3 kb of sequence. Contains plant DAGAT as DNA sequence of interest to increase or decrease expression Plant expression or transcription constructs are used for various plants, especially for food or industrial use It may be used for plants involved in the production of vegetable oils. Extremely favorable Is a temperate oilseed crop. The target plants are rape (canola and Varieties with high erucic acid content), sunflower, safflower, cotton, soy, peanut, palm, Guinea oil palm, and corn, including but not limited to Not. Depending on the method by which the recombinant construct is introduced into the host cell, other DNA Columns may be required. Importantly, the present invention relates to dicot and monocot plant species. New and / or improved traits that are equally applicable to species It seems that it can be easily applied to the conversion method and the adjustment method. Of particular interest is genetic engineering to produce certain fatty acids in plant seed oils. The use of the plant DAGAT construct in the produced plant. In this case, genetic manipulation TAGs in the seeds of non-genetically engineered plants belonging to the species produced show that this particular fatty acid Not included in its natural state. Therefore, a unique fatty acyl group is introduced at the sn-3 position Therefore, it is desirable to express a novel DAGAT in a plant. Plant genetic engineering uses of the DAGAT protein of the present invention include, in addition, TAG Do not include TAG molecules with desired fatty acyl groups introduced at specific positions on the molecule. Used in the preparation of structured plant lipids. The transformation method for obtaining such a transgenic plant is according to the present invention. Various non-critical plant transformation methods are currently available. Change In the event that newer methods for transforming crops become available, It is thought that such a method can be used directly. For example, Agrobacter in its natural state Agrobacterium-mediated transformation of many plant species susceptible to ium infection into a three-segment system (t ripartite) or binary vector method is there. Often, constructs with T-DNA borders on one or both sides, especially on the left And constructs with a right border, especially those with a left border Would be. This indicates that the construct is A. tumefaciens or A. Traits rhizogenes It is particularly useful when used as a conversion mode. However, the T-DNA border is It may be used in other transformation modes. In addition, various monocot species and Microinjection enables transformation of dicotyledonous plant species Methods, DNA particle bombardment, and electroporation have been developed. Usually incorporated into a DNA construct include those necessary for expression in the host. Structural genes that have a nodal region and allow selection of transformed cells You. The gene is resistant to cytotoxic drugs such as antibiotics, heavy metals, toxins, etc. To provide prototrophy to auxotrophic hosts, to provide viral immunity, etc. Is also good. Depending on the number of different host cell types into which the expression construct or its components are introduced However, if different selection conditions are used for different hosts, one or more markers May be used. When using Agrobacterium for plant cell transformation, the Agrobacterium host Homologous recombination using T-DNA or Ti- or Ri-plasmids For this purpose, a vector that can be introduced into an Agrobacterium host may be used. Recombination Ti- or Ri-plasmids containing T-DNA for transfer are armed (gall) Be able to induce the formation) or demilitarized (induce the formation of umbilical veins) Can not). V in transformed Agrobacterlum hosts The latter is acceptable as long as the ir gene is present. Armed plasmid is a normal plant A mixture of cells and nodules can be produced. Use Agrobacterium as a vehicle to transform host plant cells In some cases, expression or transcription constructs having a T-DNA border region are described in E. coli. coli In a broad host range vector that is replicable in Agrobacterium and Agrobacterium Will be inserted. Broad host vectors have been described in the literature. one One commonly used is pRK2 or a derivative thereof. For example, Ditta, et al . , (Proc. Nat. Acad. Sci. , U. S. A. (1980) 77: 7347-7351) and EPA O 120 515 Please refer to. These documents are incorporated herein by reference. other than this , Different replication sequences (one is E. coli). stabilize the vector in E. coli, while Agrobacte expression in plant cells in a vector containing May be inserted. For example, McBride and Summerfelt (Plant Mol. Bi ol. (1990) 14: 269-276). Replication origin pRiHRI (Jouanin, et al. , Mol . Gen. Genet. (1985) 201: 370-374). To increase the stability of plant expression vectors. Included with the expression construct and T-DNA are transformed Agr One or more markers that allow selection of bacterium and transformed plant cells -. Several markers have been developed for use in plant cells . For example, chloramphenicol, kanamycin, aminoglycoside G418, high Markers having resistance to glomycin and the like can be mentioned. Specific to use Markers are not critical to the invention and may vary depending on the particular host and Depending on the method of construction, the preferred marker will vary. Transform explants to transform plant cells using Agrobacterium Take enough time to combine with the transformed Agrobacterium and transform Incubate to kill bacteria and grow plant cells in a suitable selection medium. No. After the callus is formed, it is shuffled with the appropriate plant hormones according to known methods. Transfer shoots to rooting medium to promote plant formation and regenerate plants Can be. Next, the plants are grown and fruited, and regeneration is repeated using the seeds obtained. In turn, it is possible to isolate the vegetable oil. Next, the present invention will be generally described. By referring to the following examples The present invention will be more easily understood. These examples are for illustrative purposes. It is not intended to limit the present invention. Example Example 1-Wax Synthase Assay Wax synthase activity of microsomal membrane preparations or solubilized protein preparations An assay method for sex will be described. A. Radioactive labeling substance Substrates commonly used in wax synthase assays [1-¹⁴C] Palmitoy Le-CoA was purchased from Amersham (Arlington Heights, IL). Other chains Long substrates were synthesized to perform experiments examining chain length properties. Long chain [1-¹⁴C] Fat Acid (specific activity 51-56 Ci / mole), ie, 11-cis-eicosenoic acid, 13-cis-docose Acid, and 15-cis-tetracosenoic acid are [¹⁴C] potassium cyanide and the corresponding Reaction with alcohol mesylate, followed by free fatty acids from alcohol nitrile It is prepared by performing base hydrolysis to Free fat using ethereal diazomethane The acid is converted to its methyl ester for preparative silver nitrate thin-layer chromatography (TCL). Generate more. Fatty acid methyl esters are hydrolyzed back to free fatty acids. Release Electrochemical purity was determined by three TLC methods: normal phase silica TRC, silver nitrate TLC, and C18 reverse phase TLC. More to evaluate. The radiochemical purity measured by these methods is 92-98%. Was. Long chain [1-¹⁴[C] Acyl-CoA was prepared according to the method of Young & Lynen (J. Bio. Chem. (1969) 24). 4: 377), the corresponding [1-¹⁴C] Prepared from free fatty acids. Specific activity is 10 Ci / mole is there. [1-¹⁴[C] hexadecanal was prepared according to the method of Pletcher & Tate (Tet. Lett. (1978) 1601-1602) to the micro scale, and [1-¹⁴C] Hexadecane-1-ol Prepared by romate oxidation. Purify the product by preparative silica TLC and use Store at -70 ° C as a hexane solution until. B.Assay of wax synthase activity in microsomal membrane preparations The microsomal membrane preparation had a wax synthase activity of 40 μM [1-¹⁴C] Acyl-CoA (Usually palmitoyl-CoA, specific activity 5.1-5.6 mCi / mmol) and 200 mM oleyl Alcohol is combined with the sample to be assayed to a total volume of 0.25 ml. The measurement is performed by performing In addition to the incubation mixture, , 25 mM HEPES (4- [2-hydroxyethyl] -1-piperazineethane-sulfonic acid) pH 7. 5 contains 20% w / v glycerol, 1 mM DTT, 0.5 M NaCl, or Or 25 mM Tricine-NaOH as a buffer, pH 7.8, 0.28 M NaCl, 10% glycerol , 2 mM β-mercaptoethanol. The first experiment used the first buffer system PH was chosen to meet the requirements of the acyl-CoA reductase enzyme. The membrane preparation was then changed to a second pH for the higher optimal pH of the wax synthase. Was tested in a buffer system. The substrate mixture is prepared in glass vials and oleyl alcohol is used immediately before use. And then to the sample. Incubation up to 1 hour at 30 ° C Over. Place the assay tube on ice and immediately add 0.25 ml isopropanol: acetic acid The assay is terminated by adding (4: 1 v / v). Unlabeled wax esthetic (0.1 mg) and oleyl alcohol (0.1 mg) are added as carriers. Ha ra & Radin protocol (Anal. Biochem. (1978) 90: 420) And [1-¹⁴C] Extract lipids. Add 2 ml of hexane / isopropanol to the assay end solution (3: 2, v / v). Stir the sample and add 1 ml aqueous sodium sulfate (6.6% w / v) and the sample is again agitated. C.Assay for solubilized wax synthase activity 40μM 1-¹⁴C-16: 0 CoA (5Ci / mol), 200μM 18: 1-OH, 0.07% soybean phospholipid (Si gma, P-3644), 0.2% CHAPS, 280 mM NaCl, 25 mM Tricine-NaOH, pH 7.8, 2 mM β- Up to 50 μl in a 250 μl assay containing ME and 5.6% glycerol. The solubilized wax synthase is assayed using the pull. Phospholipid (50mg / m l, in 0.5% CHAPS) directly to the sample in 1% CHAPS, then add the remaining Dilute with a cocktail containing the sey component. Wax synthase to phospholipid vesic Reconstitution of the active occurs due to introduction into the reactor. Wax synthase In order to obtain the maximum activity in the assay, the It is necessary to adjust the amount of L) and surfactant (CHAPS) to 2.8 / 1 (CHAPS / PL). Ultrafiltration To assay for wax synthase activity in samples enriched by Depending on the concentration of S, the volume of the sample to be assayed needs to be readjusted. Asse If too much CHAPS is added to solution A, the activity is inhibited. Sample by ultrafiltration Concentration, the optimal volume of the sample to be assayed Create a concentration curve of% CHAPS in the assay solution and use a constant concentration of phospholipid and NaCl. Reset by performing the assay. Wax synthase, CHAPS concentration Is less affected when the PL concentration changes than when it changes. D.Analysis of assay products Wax synthase assay or solubilized wax solution of microsomal membrane preparations Two protocols were developed to analyze the products of the intase assay. on the other hand Protocol is described below as an “extensive assay”. It takes longer, but gives more quantitative results. The other prototype Col, described below as a “rapid assay”, Gives a measure of protease activity and is faster and more convenient, but less quantitative. 1. Detailed assay: Addition of sodium sulfate and agitation of sample Thereafter, the upper organic phase was taken out, and the lower aqueous phase was subjected to 4 ml of hexane / isopropanol (7: 2. Wash with v / v). The organic phases are pooled and evaporated to dryness under nitrogen. Lipid residue Resuspend in a small amount of hexane and aliquot radioactivity in liquid scintillation Assay by counter. Use the remaining sample to address the labeled class. To perform TCL analysis. This allows us to determine the total amount of wax produced. You. Samples are applied to silica TLC plates and analyzed for lipid class analysis. Hexane / diethyl ether / acetic acid (80: 20: 1 or 70: 30: 2 v / v / v) Expand with Lipid class, mainly wax esters, free fatty acids, fatty alcohols Distribution of polar lipids and the origin of polar lipids using an AMBIS radiometric imaging system. It is measured using a system (AMBIS Systems Inc., San Diego, CA). If necessary Individual lipid classes can be recovered from TLC plates for further analysis. You. Analyze using reversed-phase TLC system using C18 plate developed with methanol Was done. 2. Rapid assay: After adding sodium sulfate and stirring the sample, Take out a predetermined amount (%) of the organic phase and emit with a liquid scintillation counter Count Noh. The calculation here is used to estimate the total count value of the organic phase. Next, Remove the other portion of the organic phase as described under the Dry well, resuspend in hexane, spot on TLC plate, Unfold and scan further. Thus, the total count built into the wax Measure% of value. Example 2-Further experiments to characterize wax synthase activity A.Seed development and wax synthase activity profile Embryogenesis was followed over two summers on five species in Davis, California. The embryo's raw and dry weights were fairly stable and fast from about day 80 to about day 130. It was found to increase in degrees. When examining the lipid extract, the fresh weight of the embryo was about 300 m g (approximately day 80) when lipid to dry weight ratio reaches a maximum level of 50% I found out. As described in Example 1B, wax synthase activity was measured on developing embryos. Was. Jojoba seed coat was found to be the cause of the inhibitor, so remove the seed coat After that, the embryos were frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C. Wax synthase activity measured in either cell-free homogenate or membrane fraction From the developmental profile for sex, there is a large lag phase in activity, about 110-1 after flowering It can be seen that the peak reaches the 15th day. After flowering, embryos for enzymatic experiments Collected between about 90-110 days. During this period, wax synthase activity is high. However, lipid accumulation has not reached the maximum level and the seed coat is easily removed. Wack The maximum increase in synthase activity is observed between days 80 and 90 after flowering. Wa Open synthase protein, probably the highest synthase ratio Approximately 80 to 90 days after the flower, embryos for preparing a cDNA library were collected. In response, The level of mRNA encoding ox synthase is also estimated to be greatest at this stage. It is. B.Microsomal membrane preparation Collect jojoba embryos about 90-110 days after flowering, as estimated from embryonic water content (45-70%) I do. Removes coat and seed coat and immediately freezes cotyledons in liquid nitrogen for later use To store at -70 ° C. Liquid nitrogen temperature to prepare protein first Crush the frozen embryos with a steel mortar and pestle to a degree. In a typical experiment, 70 g embryo processing. This powder was mixed with the following high salt solution: 3M NaCl, 0.3M Sucrose, 100 mM HEPES, 2 mM DTT, and protease inhibitor, 1 mM EDTA, Add to 0.7mg / ml leupepsin, 0.5mg / ml pepstatin, and 17mg / ml PMSF . Use a tissue homogenizer (Kinematica, Switzerland; Model PT10 / 35) for about 3 Disperse the powdered embryos in buffer for 0 seconds, then add three layers of Miracloth (CalBioChem, LaJoll a, CA) to prepare a cell-free homogenate (CFH). The filtrate is centrifuged at 100,000 xg for 1 hour. The resulting sample consists of a pellet, supernatant, and a floating fat pad. fat The pad was removed, the supernatant fraction was collected, 1 M NaCl, 100 mM HEPES, 2 mM DTT, and Dialyze overnight against solution containing .5M EDTA (change buffer 3 times). 20 The dialysate is subjected to rapid centrifugal separation at 000 × g for 1.5 hours to obtain a pellet DP2. Pellet in 25 mM HEPES and 10% glycerol at 1 / 20th of the original CFH volume Suspend to obtain a microsomal membrane preparation. An assay for activity is performed as described in Example 1. Wax synthase activity Recovery is estimated to be 34% of the original activity in the cell-free homogenate. this The wax synthase activity of the preparation is stable when stored at -70 ° C. C.Substrate specificity Acyl-CoA and alcohol substrates with different carbon chain lengths and degrees of unsaturation Add to the microsomal membrane preparation prepared as described above, The range of substrates recognized by Intase was examined. Wax synthase activity Acyl specificity was determined as described in Example 1B, and was determined to be 80 mM acyl-CoA substrate and 10 mM. The measurement was performed using 0 mM radiolabeled oleyl alcohol. Alcohol specificity is 100 The measurement was performed using mM alcohol substrate and 40 mM radiolabeled eicosenoyl-CoA. The results of these experiments are shown in Table 1 below. The above results show that jojoba wax synthase has a wide range of fatty acyl-CoA and fat. The use of aliphatic alcohol substrates has been demonstrated. In addition, palmitoyl-CoA, palmitoyl-ACP and N-acetyl -S-palmitoyl cysteamine to various acylthioester substrates The wax synthase activity was similarly tested. The greatest activity about acyl-CoA Sex was observed. Significant activity for acyl ACP (~ 10% for acyl CoA) Was observed, but for the N-acetyl-S-palmitoyl cysteamine substrate No activity could be detected. D.Active effector Various sulfhydryl drugs were tested for their effect on wax synthase activity. Screened. Organic mercury compounds were shown to strongly inhibit activity. Yo Docecetamide and N-ethylmaleamide had much less effect. Parahi Inhibition by droxymercury benzoate was observed, but this inhibition was Could be restored by the addition of These results indicate that parahydroxymercury Benzoate inhibition involves blocking the essential sulfhydryl group Prove that. Example 3-Purification of jojoba wax synthase Isolation of jojoba membrane preparations with wax synthase activity, wax synthase For solubilizing activity and further purifying its wax synthase protein Describes the methods that can be used. A.Microsomal membrane preparation Using the following modification of the method described in Example 2, wake from solubilized membranes An improved membrane fraction is provided that is useful for synthase purification. Typically, an extraction buffer (40 mM Tricine-NaOH, pH 7.8, 200 mM KCl, 10 mM MEDTA, 5 mM β-mercaptoethanol) Add 400 g of jojoba embryo to 400 ml, blender Triturate in a homogenizer and homogenize in a Polytron tissue disintegrator. All subsequent Steps are performed at 4 ° C. Filter the blended material through Miracloth (CalBioChem) Spend. As a result of centrifugation of the filtrate (20,000 xg; 20 minutes), a floating wax layer A cloudy upper fraction and a dark green pellet formed. Collect upper layer fraction and centrifuge (100,000 × g; 2 hours) to obtain a membrane pellet, then 50% (w / v) Buffer A containing sucrose (25 mM Tricine-NaOH, pH 7.8, 200 mM KCl, 5 mM ED (TA, 5 mM β-mercaptoethanol). This homogenate is replaced with SW2 8 Dispense into four centrifuge tubes (Beckman), each containing 20% sucrose Overlay 10 ml of Far A, then over 13 ml of Buffer A. Centrifugation (28,000rp m; 2 hours), collect the membrane fraction from the 20% / 50% sucrose interface, and add 4 volumes of buffer Dilute with -A and collect by centrifugation (200,000 xg; 1 hour). Then save the membrane Buffer [25 mM Tricine-NaOH, pH 7.8, 1 M NaCl, 10% (w / v) glycerol, [5 mM β-mercaptoethanol] in 10 ml. According to this protocol The protein concentration of the prepared membrane is typically 7-9 mg / ml. Protein marker Protein concentration as described (Bradford, 1976) using BSA as standard. Evaluate the degree. B.Solubilization of wax synthase protein Storage buffer (25 mM Tricine-NaOH, pH 7.8, 1 M NaCl, 10% glycerol , 5 mM β-mercaptoethanol) to bring the membrane suspension to about 0.8 protein. Adjust to 3 mg / ml. Solid 3-([3-coramidopropyl] dimethyl-ammonio) -1- Add propane sulfate (CHAPS) to a final concentration of 2% (w / v), and add The ratio of surfactant to protein is 24: 1. After incubating for 1 hour on ice, Centrifuge the sample (200,000 g for 1 hour) and collect the supernatant fraction. C.Purification of active wax synthase 200,000 g supernatant fraction (0.57% CHAPS, 25 mM Tricine-NaOH, pH 7.8, 20% glycerol Dilution) to a final concentration of 0.3M and 1% NaCl and CHAPS, respectively. . Buffer B containing 0.3 M NaCl (25 mM Tricine-NaOH, pH 7.8, 1% CHAPS, 20 % Aglycose (Amicon, Inc., Beverly, MA) equilibrated with Load the ram with this sample. After washing with equilibration buffer, add 2M NaCl The wax synthase activity is eluted with buffer B. Blue A column? Active fractions eluted from the pool were pooled (Blue Pool) and used for the next chromatography. To use. Two were used for band identification and subsequent purification of the wax synthase protein. Purification protocol was used. In Protocol 1 (Figure 1), the YM30 membrane (Amicon, Inc., Beverly, MA) by ultrafiltration in a pressurized cell. ool was concentrated 5.4-fold. Ceramic Hy equilibrated with buffer B containing 2M NaCl Concentrate on droxyapatite (CHT) column (Bio-Scale CHT-2; Bio-Rad, Hercules, CA) 1/2 of the object was applied. Wash column with 6 column volumes of equilibration buffer and bind Protein in buffer B containing 0.1 M dipotassium phosphate and 2 M NaCl. Eluted. After re-equilibrating the CHT column, repeat the second half of the Blue Pool concentrate Chromatographed in the manner described above. Concentrated by ultrafiltration to detect activity Wax synthase was assayed according to the protocol for the sample . Wax synthase activity measured on CHT-Run 1 was found in the effluent and washings. Was done. Since the protein profiles of the two CHT flow operations were identical, CHT-Run 2 was not assayed. Collect active fractions from two CHT flow operations and concentrate 10-fold Sephacryl S100 HR, and equilibrated in buffer B containing 1.0 M NaCl Applied to a column (2.5 × 90 cm). Perform protein and activity measurements and manipulate From the retained part, the active fraction showing maximum activity and minimum protein Selected. Pool S100 (fractions 64-70) in buffer B containing 1M NaCl. Equilibrated crystalline hydroxylapatite (HA) column (Bio-Gel HT; Bio-Rad, Hercul es, CA, 1 × 19.3 cm). After all, most of the wax synthase activity Present in drainage and washings. Bound protein is 0.1M dipotassium phosphate and And eluted with buffer B containing 1M NaCl. Fractions from the final HA flow operation Checked by SDS-PAGE. One protein running at 33 kD on SDS-PAGE Correlated with the presence of cousin synthase activity. In a second preparation (Protocol 2, FIG. 2), the Blue Pool was not concentrated and 1M NaC Direct application to crystalline HA columns (1 x 11.7 cm) equilibrated in buffer B containing l did. Select two fractions and add the following 25 mM Tricine-NaOHM, pH 7.8, 1% CHAPS, 20 % Glycerol, Superdex 75 HR 10/30 column equilibrated with 1 M NaCl (Bio-Rad, H ercules, CA; size exclusion chromatography over sizing range: 5000-75,000 daltons) Purified by chromatography. The solubilized sample is described in Example 1C. Wax synthase activity was measured according to the protocol described. One fraction is HA Elution occurs at the beginning of the flow in the ram (fraction 31), and the other elutes in the washing solution (fraction 31). 67). The protein profiles of the two fractions differ by SDS-PAGE I was Both Superdex 75 flow-throughs were tested by gradient SDS-PAGE and chromatographed. As a result of the graph operation, an active protein of about 33 kD was identified. Molecular weight standards Use the same buffer and column conditions to chromatograph Produced. The elution volume of the wax synthase activity peak is plotted on this standard curve. In comparison, a value of 48 kDa was obtained for the molecular weight of the solubilized enzyme. The diagram representing the purification of wax synthase from Protocol 1 (Table 2) is shown in This indicates that the enzyme was purified 150-fold from the protein fraction. D.SDS-PAGE analysis The sample from the column fraction is transferred to SDS PAGE sample buffer (1x buffer = 2% SDS, 250 mM β-mercaptoethanol, 0.0025% bromophenol blue) Diluted and analyzed by electrophoresis. Laemmli (Nature (1970) 227: 680-685) Modification of Delepelaire (Proc. Nat. Acad. Sci. (1979) 76: 111-115) Performed polyacrylamide gradient gel electrophoresis (10-13%) with a small amount did. The upper retention buffer used was 0.1% sodium dodecyl sulfate. The gel for concentration and separation was not used for the lower retention buffer. Dark 30% acrylamide stock solution (29.2% acrylamide, 0.8% N, N'-bis -Methyleneacrylamide (w / v) to 5%, 0.06% ammonium persulfate (w / v) and And 0.1% TEMED (v / v). Separation gel with 0-10% linear gradient sucrose A 10-13% linear gradient from the stabilized acrylamide stock was included. Room temperature, 150V The electrophoresis was performed at a constant voltage of 9 to 10 hours. Blum et al. (Electrophoresis (1987 ) In silver or Coomassie Blue (0.1% Coomassie) according to the method of 8: 93-99) Blue R-250, 50% methanol, 10% acetic acid) Quality was visualized. Before purification on a hydroxyapatite column, 33 kDa protein identified as an enzyme does not appear as a major component of the active fraction No. After purification protocol 1 (Example 3C), the activity-related The protein is only 33 kDa. Example 4-Jojoba wax synthase protein for in-gel digestion Preparation A.Preparation of samples for SDS-PAGE by concentration Pool the odd numbered fractions from the effluent / wash from the final HA column (Protocol 1) For ultrafiltration in a pressurized cell equipped with a YM30 membrane (Amicon, Inc., Beverly, MA). Therefore, it was concentrated three times. Two Centricon-30 units (Amicon, Inc., Beverly , MA) to further concentrate the sample to a volume of about 50 μl. Each sump Of the SDS Cocktail (4 μl of 20% SDS, 1 μl of 14.3 M β-mercaptoethanol, and 0 (1 μl of 1% bromophenol blue). After standing at room temperature for 15 minutes, Samples were run on a 10-13% acrylamide gradient gel (Example 3D) (16 × 16 cm × 1 mm thick) ) And separate the proteins by electrophoresis at a constant voltage of 150V for 9.5 hours. Was. Stain the gel for 15 minutes with 0.1% Coomassie Blue in 50% methanol, 10% acetic acid After that, decolorization was performed in 50% methanol and 10% acetic acid for 2 × 20 minutes. 33kD waist from gel The kus synthase band was excised and destained in 50% ethanol for 3 × 20 minutes. Leh One of them contains one streak of protein, which Not used in final digestion. B.Preparation of samples for SDS-PAGE by precipitation Aliquot (0.8 ml) of the even numbered fraction from the final HA column (protocol 1) Column profiles were pooled in three groups. 1.5ml vial for pool Divided into three equal parts. The protein was precipitated by the addition of 0.2 ml of 40% TCA. On ice After 30 minutes at, the sample was centrifuged (12,000 xg, 15 minutes at 4 ° C) to precipitate. The protein was pelleted. Remove the supernatant and pellet the pellet with 0.6 ml of ice-cold acetone. Washed twice. For the final 3 pellets for each pool set of samples, use the same SDS Transfer the buffer from one vial to the next in 50 μl of sample buffer. And resuspended. Empty vials that have already been resuspended Wash with 10 μl buffer and bring the total resuspension volume to 60 μl for each pool sample. did. Samples were 12% acrylamide Tris / Glycine mini gels (Novex, San Dieg o, CA, 1.5 mm × 10 wells) and electrophoresis at a constant voltage of 150 V for 20 minutes. After eluting the dye from the bottom of the protein, the protein was separated. Coomassie Bl Gel ue and destained using Gel-Clear (Novex, San Diego, CA). Column Wacks from three non-equivalent lanes on the gel representing these peaks and tailing fractions The synthase was cut off. Place this gel slice in a 1.5 ml vial and add 50 The mixture was decolorized with 1 ml of 10% methanol and 10% acetic acid for 2 hours. Remove destaining solution and remove gel slice Freeze in liquid nitrogen and use WM Keck Founda at Yale University for in-gel digestion. was sent to the Biotechnology Resource Laboratory on dry ice the night before. By one gel slice and precipitate from a sample concentrated by ultrafiltration Three gel slices from the concentrated sample are pooled for in-gel trypsin digestion. I did. Example 5-Determination of amino acid sequence W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University In, protein sequencing was performed. For operation, a part of the gel slice Amino acid analysis for quantification (10-15%) and amino acid composition, proteolysis Protein by one of the enzymes (trypsin or lysyl endopeptidase) Quality digestion, as well as product fractionation by reverse phase HPLC. HPLC flow operation Protein peaks, and perform laser desorption mass spectrometry for protein sequencing. Prior to determination, the presence, amount, and mass of the peptide are determined. Longest peptide To perform microsequencing. Amino acid of jojoba wax synthase peptide obtained by trypsin digestion The acid composition is shown in Table 3 below using the one-letter code. Isolation of wax synthase nucleic acid sequences from cDNA libraries or genomic DNA Is described. A.Construction of jojoba cDNA library First described by Jackson and Larkins (Plant Physiol. (1976) 57: 5-10) And modified by Goldberg et al. (Developmental Biol. (1981) 83: 201-217). Jojoba embryos collected 80-90 days after flowering using polyribosome isolation methods RNA was isolated from them. In this procedure, all steps were performed at 4 ° C except where noted. carry out. 10 gm of tissue in liquid nitrogen with Waring Blender until the tissue becomes fine powder Grind. After the liquid nitrogen has evaporated, the extraction buffer (200 mM Tris pH 9.0, 160 mM KCl, 25mM EGTA, 70mM MgCl_Two, 1% Triron X-100, 0.5% sodium deoxycholate Lium, 1 mM spermidine, 10 mM β-mercaptoethanol, and 500 mM sucrose) Add 170 ml and homogenize the tissue for about 2 minutes. Transfer the homogenate to sterile Miraclo And centrifuged at 12,000 xg for 20 minutes. Decant the supernatant into a 500 ml sterile flask. 1/19 volume of 20% surfactant solution (20% Brij 35, 20% Tween 40, 20% No. idet p-40w / v) is added at room temperature. The solution was stirred at 4 ° C. for 30 minutes at medium speed, then Centrifuge the supernatant at 12,000 xg for 30 minutes. 40mM Tris pH9.0, 5mM EGTA, 200mM KCl, 30mM MgCl_Two, 1.8M sucrose, 5mM β-medium Place 7 ml of the solution containing rucaptoethanol in a sterile Ti 60 centrifuge tube at the bottom Dispense about 30 ml of the supernatant. Fill up to the top of the tube with extraction buffer, Spin at 60,000 rpm in a rotor at 4 ° C for 4 hours. After centrifugation, remove the supernatant by suction. , Resuspension buffer (40 mM Tris pH 9.0, 5 mM EGTA, 200 mM KCl, 30 mM MgCl_Two, 0.5 ml of 5 mM β-mercaptoethanol) is placed in each tube. Tube 10 on ice Aliquot and then completely resuspend the pellet and collect. Then, the supernatant was Centrifuge for minutes to remove insoluble material. Add 20 mM Tris pH7.6, 200 mM EDT to the supernatant. A, autolyzed 1 mg / ml proteinase K1 volume in 2% N-lauryl-sarcosinate The volume is added and the mixture is incubated at room temperature for 30 minutes. Precipitate RNA by adding 1/10 volume of sodium acetate and 2 volumes of ethanol Let it. After several hours at 20 ° C, pellet by centrifugation at 12,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. Become Resuspend the pellet in 10 ml of TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) Extract with an equal volume of phenol saturated with Tris pH 7.5. 10,000 × g at 20 ℃ at 4 ℃ The phases are separated by centrifugation. The aqueous phase is removed and the organic phase is Re-extract with buffer. The aqueous phase is then collected and extracted with one volume of chloroform. The phases are separated again by centrifugation and the aqueous phase is ethanol precipitated as described above. , To produce polyribosomal RNA. This polyribosomal RNA preparation is transferred to a high salt buffer (0.5 M NaCl, 20 mM Tris pH 7. 5, flow through a cellulose column (Sigma-cell 50) in 1 mM EDTA, 0.1% SDS This removes polysaccharide contaminants in the RNA. Contaminants bind to the column RNA is recovered in the eluate. Collect the eluted fractions and ethanol precipitate the RNA. The precipitated total RNA is then resuspended in a smaller volume and the oligo d (T) cellulose color To apply polyadenylation RNA. Using polyadenylated RNA, a commercially available cloning vector, Bluescribe M1 3- (Stratagene Cloning Systems; San Diego, CA) Construct the cDNA library in the plasmid cloning vector pCGN1703 Build. Bluescribe M13-polylinker was digested with BamHI, Mung Bean (mun g bean) remodeled by treatment with endonuclease and blunt end ligation, Create an HI deletion plasmid, pCGN1700. EcoRI and pCGN1700 Digested with Sst1 (adjacent restriction site) and digested with BamHI, PstI, XbaI, ApaI and SmaI. Restriction site, 5 'overhang of AATT, and 3' overhang of TCGA Anneal with a synthetic linker. In the insertion of the linker into pCGN1700, the EcoRI The position is deleted and the SstI found in Bluescribe (referred to herein as “SacI”). ) And a new restriction site contained in the linker is added. The resulting plasmid, pCGN1702, is digested with HindIII and blunt-ended with Klenow enzyme. You. This linear DNA was partially digested with PvuII, and T4 DNA wax Lie to A transformant lacking the lac promoter region was selected (pCGN170 3), used as a plasmid cloning vector. Briefly, the cloning method for cDNA synthesis is as follows. Plastic The Smid cloning vector is digested with SstI and the terminal deoxynucleotide trans Use spherases to form homopolymeric T-tails on the resulting cohesive ends Let it. Undigested or by oligo (dA) -cellulose chromatography The tailed plasmid is separated from the non-tailed plasmid. The resulting vector has a first strand shared at either end of this vector plasmid. Acts as a primer for the synthesis of cDNA, which is attached by binding. This cDNA-mRN Terminal transfer of A-vector complex in the presence of deoxyguanosine triphosphate And generate a G-tail at the end of the cDNA strand. BamHI site When the excess cDNA-mRNA complex is removed by BamHI digestion, a BamHI cohesive end is added at one end. A cDNA-mRNA-vector complex having a G-tail at the other end remains. 5 ’BamHI attachment Ends, recognition sequences for restriction enzymes NotI, EcoRI and SstI, and 3'C-tail Cyclize this complex using an annealed synthetic cyclization linker with termini I do. After ligation and repair, the cyclic complex was transformed into E. coli strain DH5a (BRL, Gaithersburg, MD) to generate a cDNA library. This jojoba embryo cDNA van The clone contains about 1.5 × 10 clones having an average cDNA insert size of about 500 base pairs.⁶ contains. In addition, in the cloning vector 1ZAPII / EcoRI (Stratagene, San Diego, CA) Use jojoba polyadenylation RNA to construct cDNA libraries in Can also be. This library contains protocols, DNA and bacteria provided by the manufacturer. Build using strains. Gigapack Gold Packaging Extract (Stratag ene) and package the clone, again according to the manufacturer's recommendations. You. A cDNA library constructed in this manner has an average cDNA insertion site of about 400 base pairs. About 1 × 10⁶contains. B.Synthetic oligonucleotides Generally used as a PCR primer from a single-stranded DNA template reverse transcribed from mRNA. In order to use, the sensor corresponding to the sequence encoding the wax synthase peptide An oligonucleotide containing a directional sequence is prepared. These oligonucleotides Using the peptide as a primer for a `` forward '' amplification reaction, Produces strand DNA. For a "reverse" reaction for amplification of non-coding DNA strands, the D Oligonucleotides that are identical to some of the primers used to prepare the NA template It is good to design nucleotides. Alternatively, encode the wax synthase peptide Oligonucleotide containing a sequence complementary to the sequence to be Can be used in combination with glycine synthase oligonucleotide primers . Wax synthase peptide sequence can be encoded by a group of different codons Forward or reverse primers may contain “degenerate” oligos Nucleotides, i.e. all of the possible coding sequences for a particular peptide region Or it may contain some mixtures. Present in such a mixture Synthesis for PCR primers to reduce the number of different oligonucleotides When preparing oligonucleotides, peptides with the least number of possible coding sequences Preferably, a region is selected. Similarly, using synthetic oligonucleotides, If you want to directly screen a library for x-synthase sequences, Low degeneracy oligonucleotides are preferred. The following encodes the peptide WSpep29 (middle part) and this peptide WSpep29 It is an example of the resulting forward (top) and reverse (bottom) DNA sequences. The following encodes the peptide WSpep33 (middle part) and this peptide WSpep33 It is an example of the resulting forward (top) and reverse (bottom) DNA sequences. The following is a synthetic method that can be used to obtain a wax synthase sequence. It is a sequence of a lignonucleotide. The name of this oligonucleotide is listed in Example 6. It reflects the number of specific wax synthase peptide fragments described. Oligonuk The letter "F" in the name of Reotide indicates a PCR forward reaction primer. The letter "R" is P Shows CR reverse reaction primers. Use oligonucleotide, TSYN for reverse transcription from poly (A) + or total RNA. To prepare single-stranded DNA to be used as a PCR template. In the poly (A) tail of mRNA In addition to the poly (T) region to be linked, this oligonucleotide is HindIII, PstI and Contains the restriction digest sequence for SstI. The sequence of TSYN is as follows. Oligonucleotide, TAMP, is an antisequence of the sequence encoding wax synthase. Useful in PCR reverse reactions for amplification of the sense strand. Template for PCR In the case of single-stranded DNA reverse transcribed from mRNA, until the first forward reaction is completed It should be noted that no reverse reaction occurs. First strand reaction results in sense strand casting A mold is generated, which is then used to remove the antisense DNA strand from the reverse primer. Can be amplified. The sequence of TAMP is as follows. The nucleotide base code of the above oligonucleotides follows the IUPAC standard below. ing: A = adenine T = thymine Y = cytosine or thymine C = cytosine U = uracil R = adenine or guanine G = guanine I = inosine O = inosine or cytosine H = adenine, cytosine or thymine D = adenine, guanine or thymine N = adenine, cytosine, guanine or thymine W = adenine or thymine S = guanine or cytosine B = guanine, cytosine or thymine K = guanine or thymine M = adenine or cytosine C.PCR reaction Poly (A) + RNA was prepared from total RNA prepared from jojoba tissue as described above. Isolate. Superscript reverse transcriptase (BRL) and oligonucleotide primers To prepare single-stranded cDNA from poly (A) + or total RNA by reverse transcription using TSYN To make. Follow the manufacturer's instructions except that the reaction is performed at 45_C instead of 37_C. And perform the reaction. This jojoba single-stranded cDNA was used in PCR reactions 1 to 12 shown below. To use. Reverse transcription as template on Perkin Elmer Cetus Gene Amp PCR System 9600 PCR instrument PCR is performed using the obtained single-stranded cDNA. City according to the manufacturer's instructions Use commercial PCR reaction and optimization reagents. CDNA at the 3 'position of the above primer Can be amplified in the following reactions: If further amplification is required, a second primer using the primer named -F2 For the round PCR reaction, use the PCR product of the reaction containing the primer named -F1 as a template. Can be used as Similarly, use a primer named -R2 For the second round of the PCR reaction, use the PCR product of the reaction containing the primer named -R1. Can be used as a template. Alternatively, Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech Laboraties Inc.) And 5 'and 3' RACE (Frohman et al., 1988) according to the manufacturer's instructions. Can be used to amplify the entire cDNA. Primers for 3'RACE reactions Use WSpep29-F1, WSpep29-F1, WSpep33-F1 and WSpep33-F2. 5'RACE For the reaction, primers, WSpep29-R1, WSpep29-R1, WSpep33-R1 and WSpep3 Use 3-R2. The DNA fragment generated by the PCR reaction was used according to the manufacturer's protocol (Invitrogen Corp.). It is cloned into pCR2.1. Determine the DNA sequence of the cloned fragment, Confirm that this cloned fragment encodes a wax synthase peptide . D.Screening libraries for wax synthase sequences The wax synthase DNA fragment obtained by PCR is labeled, and Used as a probe to screen clones from the library. Techniques for screening DNA libraries are known to those skilled in the art and include, for example, M aniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Col d Spring Harbor Laboratory Press). By this method, Wack A synthase nucleic acid sequence is obtained, which is analyzed for the nucleic acid sequence, and Used for the expression of wax synthase in various host types, both eukaryotic and eukaryotic. Can be Example 6-Wax Synthase and Reductase Constructs for Plant Expression Causes expression of wax synthase and reductase sequences in plant cells The construct can be prepared as follows. For example, from napin, Bce4 and ACP genes described in WO92 / 03564, seed tissues Of an expression cassette containing the 5 'and 3' regulatory regions of genes preferentially expressed in can do. For example, for expression of a wax synthase or reductase gene construct A napin expression cassette that can be used, pCGN1808, is described in Kridl et al. (Seed Science Research (1991) 1: 209-219). Another napin expression cassette , PCGN3223 is found in ampicillin-resistant background, as well as in pCGN1808 It contains 1.725 napin 5 'and 1.2653' regulatory sequences essentially identical to those. That Regulatory region flanked by HindIII, NotI and KpnI restriction sites (ie flanking) And unique SalI, BglII, PstI and XhoI cloning sites are 5 'and And 3 'non-coding region. It regulates transcription under the control of 5 'and 3' regions from the oleosin gene Cassettes for the cloning of the sequence can also be used. Brassica nap The sequence of the us oleosin gene is Lee and Huang (Plant Phys. (1991) 96: 1395- 1397). Sequence of pCGN7636, one of the oleosin cassettes, is in the US It is provided in FIG. 4 of US Pat. No. 5,445,947. This oleosin cassette is BssHII, Flanked by KpnI and XbaI restriction sites and wax synthase, reductase or Or the SalI, BamHI and PstI sites for insertion of other DNA sequences of interest And between the 3 'oleosin regions. Insert the wax synthase and reductase gene sequences into these cassettes. To provide an expression construct for plant transformation methods. For example, Reductor in plant cells using 5 'and 3' regulatory regions from napin gene Constructs for expression of zea are described in US Patent No. 5,445,947. By the method of Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. (1978) 163: 181-187), the binary -(Blnary) vector construct was transformed into the EHA101 strain (Hood et al., J. Bacteriol (1986) 168: 1291-13). 01) etc. to transform the plant as described below. Used in law. Example 7-Diacylglycerol acyltransferase (DAGAT) assay Morti provides a method for assaying DAGAT activity in unsolubilized or solubilized protein preparations. erella ramanniana is described. A. Non-solubilized sample As described by Kamisaka et al. (1993, 1994), a 10 mM solution was used in a total volume of 100 μl. Contains potassium nitrate (pH 7.0), 100-150 mM KCl, and 0.1% TX-100 (w / v) 3.67 μM in buffer 1-¹⁴C-18: 1-CoenzymeA (53.5-54.5Ci / mole, New Englan d Nuclear, Boston, MA) and 1.5 mM 1,2-18: 1 diacylglycerol (DAG) (Sig ma D-0138, prepared as a 150 mM stock in 2-methoxyethanol). Assay for AGAT activity. The assay was performed at 30 ° C. for 5 minutes and heptane: isopropa Knoll: 0.5M H_TwoSO_Four(10: 40: 1, v / v / v) Stop by adding 1.5 ml. necessary Therefore, to maintain product formation during the assay at a linear rate, The sample may be diluted with a buffer. B. Solubilized sample Perform the assay described for unsolubilized samples with the following modifications: : Reduce the amount of 1,2-18: 1 DAG to 0.5 mM, increase the amount of Triron X-100 to 0.2%, and To maintain the KCl concentration between 100 and 125 mM. As described by Kamisaka et al. (1996, 1997) And slightly modified the protocol to activate after detergent solubilization. To recover the isomer, use L-α-phosphatidic acid (Sigma P-9511, 1% Triron X-10). (Prepared as a 50 mM stock in 0 (w / v)). At 500 μM DAGAT activity after treatment with Triron X-100 using 300 μM phosphatidic acid It was found that higher sexual stimulation was obtained. DAGAT activity was 100 during the assay. It was also found to be sensitive to the amount of KCl introduced at an optimal level of ~ 125 mM . Assays were performed at 30 ° C. for 5-30 minutes, and as described for unsolubilized samples And stop. C. Processing sample assays After stopping the assay, store the sample at 4 ° C for later processing. Or immediately after 1M NaHCO_Three After addition of 0.1 ml, 1 as carrier for extraction Treatment can be carried out by adding 1 ml of heptane containing 5 nmol / ml triolein. it can. After vortexing the contents and separating the aqueous and organic phases, the upper organic phase is renewed. Remove into a fresh glass vial and wash with 1 ml of 1M NaCl. 40% of final organic phase Remove for liquid scintillation counting and remove remaining organic phase to clean vial. And evaporated to dryness under nitrogen gas. Resuspend the residue in 45 μl hexane Cloudy, has a pre-adsorbent loading zone Silica-G, glass, thin layer chromatography (TLC) plates (Analtech # 3 1011, Newark, Delaware). Put this TLC plate in hexane: die Chill ether: spread to the top in acetic acid (50: 50: 1, v / v / v), then dry and emit Scan with a line image analyzer (AMBIS 3000, San Diego, CA) The radioactive fraction incorporated in glycerol is measured. Activity in units of pmol / min Report. Example 8-Growth and Harvest of Mortierellara ramannian Culture Defined glucose medium (in water IL purified by reverse osmosis, glucose 30 g, (NH_Four)_TwoSO_Four 1.5g, K_TwoHPO_Four 3g, MgSO_Four・ 7H_TwoO 0.3g, NaCl 0.1g, CH_ThreeCOONa ・ 3H_Two O 5g, FeSO_Four・ 7H_TwoO 10mg, CaCl_Two・ 2H_TwoO 1.2mg, CuSO_Four・ 5H_TwoO 0.2mg, ZnSO_Four・ 7H_TwoO 1. 0mg, MnCl_Two・ 4H_TwoO 1.0 mg, thiamine-HCl 2 mg and biotin 0.02 mg (pH 5.7) 1.5 to 3 × 10⁶Inoculate individual spores and shake at 200 rpm at 30 ° C. for 9-11 days The Mortierella ramanniana is cultured by incubating. Culture Is harvested by filtration through one layer of Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA). excess Of the liquid by hand squeezing. Of compressed cells harvested from one liter The average yield is 22.5g. Example 9-Gradient sodium geldodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) The sample from the column fraction is transferred to SDS-PAGE sample buffer (1x buffer = 2 % SDS, 250 mM β-mercaptoethanol, 0.0025% bromophenol blue) Dilute and analyze by electrophoresis. Following the method of Laemmli (1970), Delepelaire (1979), with some modifications, polyacrylamide gradient gel electrophoresis (10-13 %). 0.1% sodium dodecyl sulfate in the upper storage buffer Use but do not use the lower storage buffer. And Gel for lamination is 30% acrylamide stock solution (acrylamide: N, N'-methyl Acrylamide, 37.5: 1, Bio-Rad, Hercules, CA) 5%, 0.06% Includes monium and 0.1% TEMED (v / v). Separation gel is 0-10% linear gradient sucrose Thus, it contains a stabilized 10-13% linear gradient acrylamide stock. Room temperature, 150V Perform electrophoresis at a constant voltage of 7 to 9 hours. According to the method of Blum et al. (1987) In silver or Coomassie Blue (0.1% Coomassie Blue R-250, 50% methanol (v / v), 10% acetic acid (v / v)) to visualize the protein. Example 10-In the purification of DAGAT from Mortierella ramanniana, Kamisaka et al. 997) Evaluation of the chromatography used A. Preparation of lipid body fraction The following steps are performed at 4 ° C. Typically, use 70-75 g of wet compressed cells (stored at -70 ° C) for each lipid body preparation. To use. Immediately before use, cells are thawed on ice and buffer A (10 mM potassium phosphate ( pH 7.0), 0.15 M KCl, 0.5 M sucrose and 1 mM EDTA). below Reduce protease degradation by adding protease inhibitors: 0.1 μM Aprotin in, 1 μM Leupeptin, and 100 μM Pefabloc (all from Boehringer Mannheim, Ger many). Divide cells into five 50-ml tubes and use Polytron Tissue Homogenize r (Kinematic GmbH, Brinkman Instruments, Switzerland) with scale # 7 and diameter 1c Lyse cells 7x1 min using m probe. Generate slurry Transfer to a heart tube (29 × 104mm), 1500 × g (Beckman Instruments, J2-21, JA-20 Pellet the solid debris by rotating at 4 ° C for 10 minutes on a rotor, 3500 rpm). To make Remove the supernatant and wash the pellet with another 5 ml of Buffer A. Far After centrifugation, combine the supernatant into one. This fraction is named "S1". S1 over 6 Separate into centrifuge tubes (25 x 89 mm, Beckman Instruments, Fullerton, CA) Buffer B (10 mM potassium phosphate pH 7.0, 0.15 M KCl, 0.3 M sucrose and And 1 mM EDTA). 100,000 × g sample (Beckman Instruments, L Centrifuge for 3 hours at 4 ° C in an 8-M, SW-28 rotor, 21000 rpm). Floating at the top of the layer The free lipid body fraction (LBF) is collected with a spatula, and collected using a glass homogenizer (P otter-Elvehjem). Take out 4 ml of Buffer B overlay with a pipette, Add a small amount of L remaining in the centrifuge tube by adding to the LBF in the homogenizer. Collect BF. Homogenize this last LBF in 40 ml of buffer B. That Other fractions are collected as follows: Interfacial fraction (0.3 and 0.5M sucrose buffer) Interface, the soluble fraction (the liquid below the interface) and the membrane fraction (each tube). Tan / brown pellet at the bottom of the bottom). All at -70 ° C until solubilization and subsequent purification Freeze and store. B. Solubilization of DAGAT active from lipid body fraction Thaw LBF on ice and use Triton X-100 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) ) From 10% (w / v) stock to final concentration of 1.3% (w / v) The solubilization is achieved by adding as much as possible. Solid sucrose (Mallinckrod t, Paris, Kentucky) to a final concentration of 0.5M. Treated with this surfactant The sample was shaken at 4 ° C for 1 hour, and then 6 ultracentrifuge tubes (25 x 89 mm, Beckman Instruments). Overlay each tube with 5 ml of buffer B. Sump At 100,000 xg (Beckman Instruments, L8-M, SW-28 rotor, 21000 rpm) Centrifuge at ℃ for 3 hours. Within 1 cm to the bottom through the layer of each ultracentrifuge tube , Insert a thin tube into the upper 0.3M sucrose overlay (including the floating fat layer) and Gently aspirate the lower 0.5M sucrose layer while removing the Thus, a solubilized substance called "Triton X-100 extract" is recovered. In the protocol described by Kamisaka et al. (1997), the lipid body fraction was Solubilize with 0.1% Triton X-100 and centrifuge at 100,000 xg or 0.2 μm Filtered with a filter. They were able to bind the DAGAT activator to the first column. It was found that the concentration of Triton X-100 had to be increased to 1.5% in order to achieve this. C. Chromatography used in the purification of DAGAT from M. ramanniana Buffer C used for chromatography is 10 mM potassium phosphate (pH 7. 0), 0.1% Triton X-100 (w / v) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 10 % Glycerol (w / v), 0.1 μM Aprotinin, 1 μM Leupeptin, 100 μM Pefabloc ( All Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), and varying amounts of chloride Contains potassium (75-500 mM). This buffer converts ethylene glycol into glycemic Switch to rolls and omit EDTA, DTT, and PMSF, while Aprotinin, Leupepti n and Pefabloc, the corresponding color used by Kamisaka et al. (1997). It is different from the system buffer. According to the protocol by Kamisaka et al. (1997) To prepare a Yellow 86-Agarose (Sigma R-8504, St. Louis, MO) column (1.5 cm X 5.8 cm), equilibrate with 150 mM KCl in buffer C. We extract Triton X-100 Activated DAGAT bound to Yellow 86-Agarose column under these conditions Attempted to make most DAGATs not bind to this column . We make the KCl concentration of the sample DAGAT activator by diluting to 75 mM with buffer C (without KCl) Can be bound to the column. To match this, Yellow 86- The Agarose column is also equilibrated with 75 mM KCl in buffer C. At 0.56ml / min After sample addition, the column is washed with 4 column volumes of equilibration buffer. Kara Elution of DAGAT activity and protein bound to the buffer with 500 mM KCl in buffer C (Fig. 4). Buffer the DAGAT activity (fractions 17-20) eluted from the Yellow 86-Agarose column Dilute 1: 3.33 with C to reduce the KCl concentration to 150 mM. Diluted pool (103m l) was equilibrated with 150 mM KCl in buffer C to a Heparin-Sepharose CL-6B column (Ph armacia, Uppsala, Sweden, 0.5 cm × 4.8 cm) at 0.2 ml / min. 5x column Wash with volume of equilibration buffer and add 15-ml linear gradient of 150-500 mM KCl in buffer C. Elution of DAGAT activator and protein. DAGAT activator has 2 overs Eluting in wrapping peaks. The first peak was viewed by Kamisaka et al. (1997). Eluting in the gradient as issued, but not found by Kamisaka et al. Peak elutes with much less protein at the end of the gradient (FIG. 5A). Aliquots (250 μl) of the two peak fractions from the Heparin column were added to 150 mM buffer C 0.1 on a Superdex-200 column (1 x 30 cm, Bio-Rad, Hercules, CA) equilibrated with KCl. Further purification by size exclusion chromatography at 2 ml / min. Calibration Replace Triton X-100 with Triton X-100 R (Calblochem, La Jolla, CA) Equilibrate the column with 150 mM KCl in modified buffer C. Use this column for Bio-Ra d Calibrate using Gel Filtration Standards. DAGAT activity from each of the two peaks from Heparin-Sepharose CL-6B was 99 Elution occurs at the estimated molecular weight of kDa. Late elution peak from Heparin column containing higher specific activity DAGAT Another chromatography is performed on the gel. In this case, the Heparin column These second peaks (fractions 36-41) were diluted 1: 6.6 with buffer C to a volume of 46.7 ml. I do. Yellow 86 Agarose cartridge equilibrated with 75 mM KCl in buffer C Add to ram (1.0 cm x 6.4 cm) at 0.5 ml / min. 5 column volume equilibration After washing with buffer, all bound proteins and DAGAT Elute in a 40 ml linear gradient of 75-500 mM KCl in Buffer C. Only one DAGAT active Eluting as a single peak (FIG. 6A). Fractions containing DAGAT activity from Heparin column and second Yellow 86 column Is analyzed by gradient SDS-PAGE according to the protocol of Example 3. You. Protein bands are detected by silver staining. Elute from these columns The band pattern is compared for each fraction with the corresponding DAGAT activator profile. DAGAT There are many protein candidates that correlate with the presence of activity. This purification protocol Insufficient to identify one specific candidate protein associated with DAGAT activity That is our view (Figures 5B and 6B). Example 11-Identification of candidate DAGAT proteins purified from Mortierella ramanniana New purification protocol for A. Preparation of lipid body fraction The following steps are performed at 4 ° C. Typically, use 70-75 g of wet compressed cells (stored at -70 ° C) for each lipid body preparation. To use. Immediately before use, cells are thawed on ice and buffer A (10 mM potassium phosphate ( pH 7.0), 0.15 M KCl, 0.5 M sucrose and 1 mM EDTA). below Reduce protease degradation by adding protease inhibitors: 0.1 μM Aprotin in, 1 μM Leupeptin, and 100 μM Pefabloc (all from Boehringer Mannheim, Ger many). Using 0.5mm glass beads, a cell disrupter (Bead-Beater, Biospec Produ Lyse the sample with cts, Bartlesville, OK). Gara the sample chamber Fill with 180ml of beads. Thaw wet compressed cells on ice and place in 150 ml Buffer A Resuspend. Pour the cell slurry onto the glass beads. In general, let it function properly In order to do so, the chamber must be further filled with 40-50 ml of Buffer A. This Wash the rest of the cell slurry from the original container using the volume of It is also possible to combine with pull. For 45 to 90 seconds, depending on the viscosity of the sample, Crush (on a "homogenize" scale). Tubing cell slurry containing glass beads Pipette (29 × 104mm) and 500 × g (Beckman Instruments, GP centrifuge, GH 3.7 horizontal rotor, 1500 rpm), centrifuge at 4 ° C You. Remove the supernatant and wash the pellet with 5 ml of fresh buffer A. Centrifugation Thereafter, the supernatant is combined into one. This fraction is called "S1". S1 with 6 ultracentrifuge tubes (25 x 89 mm, Beckman Instruments), each with a modified buffer 5 ml of B (10 mM potassium phosphate pH 7.0, 0.15 M KCl, and 0.3 M sucrose). You. Since EDTA interferes with hydroxylapatite chromatography, Exclude from fur B (see Example 4). 100,000 × g sample (Beckman Instru ments, L8-M, SW-28 rotor, 21000 rpm) at 4 ° C for 3 hours. Above the layers Of lipid body fraction (LBF) suspended in the head with a spatula And transfer to a glass homogenizer. Remove 4 ml of Buffer B overlay with a pipette This is added to the LBF in the homogenizer to leave the residue in the centrifuge tube. Collect a small amount of LBF. Homogenize this final LBF in 40 ml of buffer B. You. The remaining fractions are collected as follows: interface fractions (0.3 and 0.5M sucrose) Interface between buffers), soluble fraction (liquid below the interface) and membrane fraction (each Tan / brown pellet at the bottom of the tube). Everything until solubilization and subsequent purification Store frozen at -70 ° C. B. Solubilization of DAGAT active from lipid body fraction Prior to solubilization, the method of Bradford (bovine serum albumin was used as a standard) Bio-Rad Reagent, Hercules, CA) Perform protein measurement. Thaw LBF on ice and then dilute to a protein concentration of 1 mg / ml. After dilution, Triton X-100 (w / w, 1.3% Triton X-100) with a surfactant: protein ratio of 15: 1 And equivalent). Add solid sucrose (Mallinckrodt, Paris, Kentucky) To a final concentration of 0.5M. Shake the sample treated with this surfactant at 4 ° C for 1 hour. Then, split into 6 ultracentrifuge tubes (25 × 89 mm, Beckman Instruments). Overlay each tube with 5 ml of modified buffer B. 100,000 xg sample (Beckman Instruments, L8-M, SW-28 rotor, 21000 rpm) at 4 ° C for 3 hours. Insert a thin tube within 1 cm of the bottom of each ultracentrifuge tube through the overlay to the bottom. And leave the upper 0.3M sucrose overlay (including the floating fat layer) and the pellet , Gently aspirate the lower 0.5M sucrose layer to remove The solubilized material called "Triton X-100 extract" is recovered. C. DAGAT column chromatography Our previous process of purifying acyltransferase proteins from plant varieties The experiment is applied in the case of purification of DAGAT from Mortierella ramanniana. We are Wax Synthase from Hova (Simmondsia chinensis) (International Patent Application Publication No. No. 95/15387, which is incorporated herein by reference in its entirety) and coconut Lysophosphatidic acid acyltransferase (Cocos nucifera) AAT) (US patent application Ser. No. 08 / 231,196, incorporated herein by reference in its entirety). Using hydroxyapatite chromatography in the purification of Have been successful. Introduce this purification step after the Yellow 86-Agarose column . Purification protocol on Yellow 86-Agarose followed by hydroxylapatite Col is implemented in two ways. In Protocol A, the activator binds to the first column After elution, fractions are assayed for activity. The active fractions are then pooled and a second Apply to column. We refer to this as a sequential flow operation. Protoco In case B, the active substance is bound to the first column, then eluted, and directly During which no pooling or assays are performed. We call this a tandem flow Called operation. In Protocol A, equilibrate Triton X-100 extract with 75 mM KCl in buffer C Applied to a prepared Yellow 86-Agarose column (2.5 cm x 6.4 cm) (Example 4.C) at 2 ml / min. You. The column is washed with 5 column volumes of equilibration buffer, then in buffer C Elute with 500 mM KCl at 0.5 ml / min (FIG. 7). 2 with 93% of eluted active Of the most active fractions (64 and 65) are pooled and equilibrated with 500 mM KCl in buffer C To a hydroxylated apatite column (Bio-Gel HT, Bio-Rad, 1 cm x 25.5 cm). Load at 5 ml / min. DAGAT activity elutes from the column, but most of the protein Binds to the column. Wash the column with 3 volumes of equilibration buffer. Join 0.5 ml of the diluted protein with 100 mM dipotassium phosphate and 500 mM KCl in buffer C Per minute (FIG. 8A). A portion of the fraction containing the DAGAT activity peak is described in Example 3. Apply to the gradient gel SDS-PAGE as described. Protein is stained with silver and band putter To the activity profile for each fraction And compare (FIG. 8B). Several DAGAT protein candidates correlate with activity. In particular , 43 kD, 36.5 kD, 33 kDa, 29 kD, 28 kD and vans migrated at positions corresponding to 27 kD. Is noticed. No protein candidate correlated with activity in the 53kD region Absent. Equilibrate Triton X-100 extract with 75 mM KCl in buffer C in protocol B Apply to a yellow 86-Agarose column (1.5 cm x 5.8 cm) at 1 ml / min. This color Wash the column with 5 column volumes of equilibration buffer. Next, this Yellow 86-Agarose Hydroxyapatite column equilibrated with 500 mM KCl buffer at the column outlet (1.0 cm x 26.2 cm, Bio-Rad, Hercules, CA). Yellow 86 color The DAGAT activity bound to the buffer was eluted with 110 ml of buffer C containing 500 mM KCl. Directly through a hydroxylapatite column (0.2 ml / min). Finally, Separate the droxyl apatite column from the Yellow 86-Agarose column and Transfer the protein bound to the silapatite column to 100 mM And 500 mM KCl. DAGAT activity was measured using a buffer containing 500 mM KCl. In the fraction recovered from the hydroxylapatite column during the washing with 110 ml Seen in Most of the protein in the Triron X-100 extract is bound to a Yellow 86-Agarose column. Not combined and discarded. A small subset of proteins, including DAGAT, is Yellow 86-A Bind to garose column and elute with 500 mM KCl in buffer C. This eluate is When applied to a droxyl apatite column, the DAGAT activity elutes while the remaining Most of these proteins bind to this column and are separated (FIG. 9A). DAGAT activity A portion of the fraction containing the peak is subjected to gradient gel SDS-PAGE and stained with silver. this The pattern of bands eluted from these columns is analyzed for each DAGAT activity profile for each fraction. Compare to feel. Examination of the stained protein band revealed a position of 33 kDa. Are shown to be most correlated with DAGAT activity (FIG. 9B). Example 12-Preparation of proteins for in-gel digestion A.Preparation of samples for SDS-PAGE by concentration Pool the odd numbered fractions from the effluent / wash from the final HA column (Protocol 1) And ultrafiltration in a pressure cell fitted with a YM 30 membrane (Amicon, Inc., Beverly, MA) Concentrated 3 fold. Two Centricon-30 units (Amicon, Inc., Beverly, The sample was further concentrated using MA) to a volume of about 50 μl. Each sample With the SDS Cocktail (4 μl of 20% SDS, 1 μl of 14.3 M β-mercaptoethanol, and Treatment was performed with 6 μl of 1% bromophenol blue (1 μl). After standing at room temperature for 15 minutes, 10-13% acrylamide gradient gel (Example 3D) (16 × 16 cm × 1 mm thick) And proteins were separated by electrophoresis at a constant voltage of 150 V for 9.5 hours. . Stain the gel for 15 minutes with 0.1% Coomassie Blue in 50% methanol, 10% acetic acid, Thereafter, the cells were destained in 50% methanol and 10% acetic acid for 2 × 20 minutes. 33kD Wack from gel The synthase band was excised and destained in 50% ethanol for 3 × 20 minutes. lane One contains a protein streak, which is used in the last digestion Did not. B.Preparation of samples for SDS-PAGE by precipitation Aliquot (0.8 ml) of the even numbered fraction from the final HA column (protocol 1) The column profiles were pooled in three groups. 1.5ml vial pool Into three equal parts. The protein was precipitated by the addition of 0.2 ml of 40% TCA. ice After 30 minutes above, the sample was centrifuged (12,000 xg, 15 minutes at 4 ° C) to settle. The protein was pelleted. Remove the supernatant and pellet the ice-cold acetone 0.6 ml And washed twice. Moving buffers from one vial to the next The final 3 pellets from each pooled set of samples into the same SDS sample. Resuspended in 50 μl of sample buffer. Empty vials already resuspended Washes with 10 μl of sample buffer and total resuspension for each pool sample The volume was 60 μl. Samples were run on a 12% acrylamide Tris / Glycine mini gel (No. vex, San Diego, CA, 1.5 mm x 10 wells) and electrophoresis for 20 minutes at a constant voltage of 150V The protein was separated after eluting the dye from the lower end of the gel. gel Stained with Coomassie Blue and decolorized using Gel-Clear (Novex, San Diego, CA) did. Three non-equivalents on the gel representing peaks and tailing fractions from the column Wax synthase was cut from the lane. 1.5 ml vial of this gel slice In 50% methanol, 10% acetic acid Decolorized for hours. Remove the decolorization solution, freeze the gel slice in liquid nitrogen, and Place on dry ice for digestion and overnight at Yale University's W M Keck Fo Sent to undation Biotechnology Resource Laboratory. Concentrated by ultrafiltration One gel slice from the isolated sample and the sample concentrated by precipitation Of the gel slices were pooled for in-gel trypsin digestion. Example 13-Determination of amino acid sequence W.M.Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University In, protein sequencing was performed. For operation, a part of the gel slice (10-15%) quantification and amino acid analysis for amino acid composition, protein content Protein by one of the enzymes (trypsin or lysyl endopeptidase) As well as fractionation of the product by reverse phase HPLC. From HPLC flow operations Select absorption peaks and perform laser desorption mass spectrometry to sequence proteins Prior to the determination of the presence, amount and mass of the peptide. The longest peptide Select and perform microsequencing. Example 14 Isolation of Mortierella ramanniana DAGAT nucleic acid sequence Generally used as a PCR primer from a single-stranded DNA template reverse transcribed from mRNA. To use it, the sense orientation sequence corresponding to the sequence encoding the DAGAT peptide must be Prepare the containing oligonucleotide. These oligonucleotides are A sense strand DNA is produced using as a primer for the "amplification" amplification reaction. For a “reverse” reaction for amplification of non-coding DNA strands, use a DNA template for PCR. Oligonucleotides should be identical to some of the primers used to prepare Can be designed. Alternatively, complementary to the sequence encoding the DAGAT peptide Oligonucleotides containing the specific sequence are ligated to the "forward" DAGAT oligonucleotides described above. It can be used in combination with an otide primer. Amino acids whose DAGAT peptide sequence can be encoded by a group of different codons If present, the forward or reverse primer is a "degenerate" oligonucleotide. Code, i.e., all or all possible coding sequences for a particular peptide region. May contain some mixtures. The different types of olives present in these mixtures Synthetic oligonucleotides for PCR primers to reduce the number of oligonucleotides When preparing nucleotides, select peptide regions that have the fewest possible coding sequences. Is preferred. Similarly, using synthetic oligonucleotides, the DAGAT sequence When directly screening libraries for Otides are preferred. Label the DAGAT DNA fragment obtained by PCR and Used as a probe for screening clones. Complementary DNA and Technology for DNA and DNA construction and library screening Known, for example, Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seco nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). this The method yields a DAGAT nucleic acid sequence, which is analyzed for the nucleic acid sequence and Used for the expression of DAGAT in various prokaryotic and eukaryotic hosts. Can be. Example 15-Mortierella ramanniana DAGAT construct for plant expression Prepare a construct that results in expression of the DAGAT sequence in plant cells as follows Can be Expression cassette containing 5 'and 3' regulatory regions of genes preferentially expressed in seed tissue The kits are for example the napin, Bce4 and ACP genes as described in WO 92/03564. Can be prepared. For example, for expression of a wax synthase or reductase gene construct A napin expression cassette that can be used, pCGN1808, is described in Kridl et al. (Seed Science R esearch (1991) 1: 209-219). Another napin expression cassette, pCGN3223 is found in the ampicillin-resistant background, as well as in pCGN1808. It contains the 1.725 napin 5 'and 1.265 3' regulatory sequences essentially identical to That The regulatory region is flanked by HindIII, NotI and KpnI restriction sites and has a unique SalI , BglII, PstI and XhoI cloning sites are 5 ′ and 3 ′ non-co Located between the card regions. Regulates transcription under the control of 5 'and 3' regions from the oleosin gene Cassettes for the cloning of the sequence can also be used. Brassica nap The sequence of the us oleosin gene is Lee and Huang (Plant Phys. (1991) 96: 1395-1397 ). The sequence of the oleosin cassette, pCGN7636, is described in U.S. Pat. No. 5,947, FIG. 4 is provided. This oleosin cassette contains BssHII, KpnI and Flanked by XbaI restriction sites and wax synthase, reductase or SalI, BamHI and PstI sites for insertion of other DNA sequences at 5 'and 3' oleos Included between thin regions. The DAGAT gene sequence was inserted into these cassettes and used for plant transformation methods. An expression construct can be provided. For example, 5 'and 3' signatures from the napin gene A construct for the expression of reductase in plant cells using a nodal region is No. 5,445,947. By the method of Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. (1978) 163: 181-187), the binary -(Binary) vector construct was transformed into EHA101 strain (Hood et al., J. Bacteriol (1986) 168: 1291-13). 01) etc. to transform the plant as described below. Used in law. Example 16-Plant transformation method and analysis Insert the DNA sequence of interest into the genome of the plant host and transcribe or Various methods have been developed to effect translation and phenotypic changes. Radke et al. (Theor. Appl. Genet. (1988) 75: 685-694; Plant Cell Reports (1992) 11 : 499-505), using Agrobacterium-mediated transformation methods. Can be used to produce high canola such as Brassica napus canola or Reston varieties. Lucic acid variants can be transformed. Valverkens et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85: 5536-5540), as described by Agrobacterium. Transgenic Arabidopsis thaliana plants can be obtained by transversion it can. Transform other plant varieties similarly, using relevant techniques Can be. Alternatively, the reductase and wax synthase expression systems described herein To obtain transgenic plants, including architectural structures, Klein et al. (Bio / Technology 10 : 286-291), microprojectile bombardment (microprojectile bombardment) method can also be used. Seeds from transformed plants using the DAGAT assay described in Example 1. Offspring or other plant material can be assayed for DAGAT activity. The above results indicate that triacyl groups from aliphatic acyl and diacylglycerol substrates Partially purified DAGAT protein active in the formation of luglycerol Prove your ability to get. DAGAT proteins and their amino acid sequences Provides a way to get: Additionally, the PCR and libraries provided herein From this amino acid sequence, the DAGAT nucleic acid sequence was also obtained using a cleaning method. Can be Transcription of this sequence and / or DAGAT protein in the host cell By manipulating these nucleic acid sequences to achieve expression of Can be used for Such applications include tria in host cells. Alterations in silglycerol levels and composition are included. All publications and patent applications cited herein are referred to in their respective publications or patents. To the same extent that an application is identified and individually incorporated by reference , Incorporated herein by reference. For the purpose of clarification and understanding of the invention, there are drawings and examples. Although described in some detail, those skilled in the art will appreciate that Without departing from the spirit and scope of the appended claims, reference will be made to the teachings. It is readily apparent that certain changes and modifications can be made to these. Should be.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラッスナー，マイケル，ダブル. アメリカ合衆国 95616 カリフォルニア州，デイビス，ファルコンアベニュー 721 (72)発明者トンプソン，グレゴリー，エー. アメリカ合衆国 95616 カリフォルニア州，デイビス，コーウェルブルヴァード 5127────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (72) Inventor Rasner, Michael, double. United States 95616 California Falcon Avenue, Davis, Oregon 721 (72) Inventor Thompson, Gregory, A. United States 95616 California State, Davis, Cowell Boulevard 5127

Claims

[Claims] 1. TAG formation from diacylglycerol substrates and fatty acyl-CoA substrates Substantially purified acyltransferase having active activity. 2. The acyltransfer according to claim 1, which has activity against 10 / 10-DAG. -Se. 3. The apparent molecular mass as determined by SDS-PAGE is about 33 kD, Substantially separated and purified from membranes and other proteins, Can catalyze the production of triglycerides from lyserol and acyl-CoA. Acryl transferase protein. 4. The diacid according to claim 3, which has activity on an 18: 1 fatty acid acyl-CoA substrate. Luglycerol acyltransferase. 5. The diacylglycero according to claim 4, which is obtained from Mortierella rammaniana. Acyltransferase.