JP2002504382A - 組換えウイルスの形成を指向し得る核酸配列を含む人工染色体構築物 - Google Patents
組換えウイルスの形成を指向し得る核酸配列を含む人工染色体構築物Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、外来の核酸配列（例えば、ウイルス核酸配列）を含む人工染色体構築物、および治療および組換えウイルス産生のためのこれらの人工染色体構築物の使用方法を提供する。
Description
【０００１】 （発明の背景） 本発明は、外来の核酸配列（例えば、ウイルスの核酸配列）を含む人工染色体
構築物、および治療および組換えウイルスの産生のためのこれらの構築物の使用
方法に関する。
構築物、および治療および組換えウイルスの産生のためのこれらの構築物の使用
方法に関する。
【０００２】 人工染色体は、複雑なゲノムマッピングおよびゲノム分析のためのＤＮＡライ
ブラリの構築において広範に用いられている、大きな、ＤＮＡに基づくベクター
である。人工染色体は、酵母（酵母人工染色体：ＹＡＣ）、細菌（細菌の人工染
色体：ＢＡＣ、およびＰ１由来の人工染色体：ＰＡＣ）、および哺乳動物（哺乳
動物の人工染色体：ＭＡＣ）（例えば、ヒト（ヒト人工染色体：ＨＡＣ））由来
である。これらのベクターは、複製および維持を担い、かつ大きなゲノムＤＮＡ
フラグメントを安定して維持し得る染色体由来のエレメントを含む。
ブラリの構築において広範に用いられている、大きな、ＤＮＡに基づくベクター
である。人工染色体は、酵母（酵母人工染色体：ＹＡＣ）、細菌（細菌の人工染
色体：ＢＡＣ、およびＰ１由来の人工染色体：ＰＡＣ）、および哺乳動物（哺乳
動物の人工染色体：ＭＡＣ）（例えば、ヒト（ヒト人工染色体：ＨＡＣ））由来
である。これらのベクターは、複製および維持を担い、かつ大きなゲノムＤＮＡ
フラグメントを安定して維持し得る染色体由来のエレメントを含む。
【０００３】 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、原型ヒトヘルペスウイルスである。ＨＳ
Ｖがヒトの病原体であるという事実にも関わらず、ＨＳＶを治療剤として使用す
る多くの目的が存在する。ＨＳＶゲノムは、配列決定され、そして多くのＨＳＶ
変異体が作製され、そしてこの状況において特異的に使用されている。ＨＳＶ変
異体の作製は、薬物選択によってか、またはプラスミドＤＮＡとの細胞の同時ト
ランスフェクションによって実行され、そのプラスミドＤＮＡは、通常はマーカ
ー遺伝子、およびインタクトなウイルスＤＮＡの挿入によって改変される。変異
体は、薬物の耐性かまたはマーカー遺伝子の組換えおよび発現のいずれかについ
てスクリーニングすることによってか、あるいはプラークハイブリダイゼーショ
ンによって同定される。ヘルペスウイルス変異体を作製するために用いられてい
る他の方法は、まとめると、完全なヘルペスウイルスゲノムを含むコスミドセッ
トの使用を含む。例えば、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、水痘−帯状疱疹ウイ
ルス（ＶＺＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガウイルス（ＣＭ
Ｖ）、およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のゲノム全体を含むコスミ
ドセットが作製されている。これらのコスミドから完全なウイルスゲノムを構築
する際、ウイルス配列は、このコスミドの骨格から放出され、そして細胞にトラ
ンスフェクトされる。ウイルスプラークは、重複したフラグメントの間での組換
えを通じて産生され、これは、ゲノム全体を共に示す。特定の変異は、コスミド
ＤＮＡの操作によってウイルスゲノム中で作製される。
Ｖがヒトの病原体であるという事実にも関わらず、ＨＳＶを治療剤として使用す
る多くの目的が存在する。ＨＳＶゲノムは、配列決定され、そして多くのＨＳＶ
変異体が作製され、そしてこの状況において特異的に使用されている。ＨＳＶ変
異体の作製は、薬物選択によってか、またはプラスミドＤＮＡとの細胞の同時ト
ランスフェクションによって実行され、そのプラスミドＤＮＡは、通常はマーカ
ー遺伝子、およびインタクトなウイルスＤＮＡの挿入によって改変される。変異
体は、薬物の耐性かまたはマーカー遺伝子の組換えおよび発現のいずれかについ
てスクリーニングすることによってか、あるいはプラークハイブリダイゼーショ
ンによって同定される。ヘルペスウイルス変異体を作製するために用いられてい
る他の方法は、まとめると、完全なヘルペスウイルスゲノムを含むコスミドセッ
トの使用を含む。例えば、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、水痘−帯状疱疹ウイ
ルス（ＶＺＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガウイルス（ＣＭ
Ｖ）、およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のゲノム全体を含むコスミ
ドセットが作製されている。これらのコスミドから完全なウイルスゲノムを構築
する際、ウイルス配列は、このコスミドの骨格から放出され、そして細胞にトラ
ンスフェクトされる。ウイルスプラークは、重複したフラグメントの間での組換
えを通じて産生され、これは、ゲノム全体を共に示す。特定の変異は、コスミド
ＤＮＡの操作によってウイルスゲノム中で作製される。
【０００４】 （発明の要旨） 本発明は、外来の核酸配列（例えば、ウイルス核酸配列）を含む人工染色体構
築物、ならびに治療（例えば、遺伝子治療）および組換えウイルス産生のための
これらの人工染色体構築物の使用方法を提供する。
築物、ならびに治療（例えば、遺伝子治療）および組換えウイルス産生のための
これらの人工染色体構築物の使用方法を提供する。
【０００５】 従って、１つの局面において、本発明は、細胞への導入の際に組換えウイルス
（例えば、溶解性ウイルスまたは非溶解性ウイルス）の形成を指向する核酸配列
を含む人工染色体構築物を特徴とする。必要に応じて、人工染色体構築物は、人
工染色体部分かまたは核酸配列部分のいずれかにおいて、例えば、治療用遺伝子
産物（例えば、成長因子、ホルモン、酵素、ワクチン、抗原、細胞毒、免疫調節
タンパク質、アンチセンスＲＮＡ分子、またはリボザイム）をコードする異種核
酸配列をさらに含む。この構築物の人工染色体部分は、細菌の人工染色体由来、
Ｐ１由来の人工染色体由来、酵母の人工染色体由来、または哺乳動物（例えばヒ
ト）の人工染色体由来であり得る。人工染色体構築物中に含まれる核酸配列によ
ってコードされる組換えウイルスは、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペス
ウイルス）であり得る。この核酸配列によってコードされ得る他のウイルスは、
以下に列挙される。
（例えば、溶解性ウイルスまたは非溶解性ウイルス）の形成を指向する核酸配列
を含む人工染色体構築物を特徴とする。必要に応じて、人工染色体構築物は、人
工染色体部分かまたは核酸配列部分のいずれかにおいて、例えば、治療用遺伝子
産物（例えば、成長因子、ホルモン、酵素、ワクチン、抗原、細胞毒、免疫調節
タンパク質、アンチセンスＲＮＡ分子、またはリボザイム）をコードする異種核
酸配列をさらに含む。この構築物の人工染色体部分は、細菌の人工染色体由来、
Ｐ１由来の人工染色体由来、酵母の人工染色体由来、または哺乳動物（例えばヒ
ト）の人工染色体由来であり得る。人工染色体構築物中に含まれる核酸配列によ
ってコードされる組換えウイルスは、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペス
ウイルス）であり得る。この核酸配列によってコードされ得る他のウイルスは、
以下に列挙される。
【０００６】 別の局面において、本発明は、細胞（例えば哺乳動物の細胞）において組換え
ウイルスを産生する方法を特徴とし、ここで、上記のような人工染色体構築物は
細胞に導入される。この方法は、人工染色体構築物の細胞への導入において組換
えビリオンにパッケージングされるアンプリコンを細胞に導入する工程をさらに
含み得る。
ウイルスを産生する方法を特徴とし、ここで、上記のような人工染色体構築物は
細胞に導入される。この方法は、人工染色体構築物の細胞への導入において組換
えビリオンにパッケージングされるアンプリコンを細胞に導入する工程をさらに
含み得る。
【０００７】 本発明はまた、異種の核酸配列を細胞（例えば、哺乳動物の細胞）に導入する
方法を提供し、その方法において、上記のような人工染色体構築物は細胞に導入
される。
方法を提供し、その方法において、上記のような人工染色体構築物は細胞に導入
される。
【０００８】 本発明はまた、細胞（例えば、哺乳動物の細胞（例えば、癌細胞））を殺傷す
る方法を含み、その方法において、上記のような人工染色体構築物は細胞に導入
される。
る方法を含み、その方法において、上記のような人工染色体構築物は細胞に導入
される。
【０００９】 本発明はまた、そのゲノムに安定して組み込まれる人工染色体構築物を有する
細胞を特徴とする。１つの例において、この人工染色体構築物は、前初期遺伝子
が変異または欠失したＨＳＶゲノムをコードする核酸配列を含む（以下を参照の
こと）。本発明はまた、これらの細胞を作製する方法を含む。
細胞を特徴とする。１つの例において、この人工染色体構築物は、前初期遺伝子
が変異または欠失したＨＳＶゲノムをコードする核酸配列を含む（以下を参照の
こと）。本発明はまた、これらの細胞を作製する方法を含む。
【００１０】 本発明は、多くの利点を提供する。例えば、細菌の人工染色体構築物が本発明
において用いられる場合、この構築物は、細菌中で容易にかつ効率良く増殖し得
る。このことは、その構築物が哺乳動物細胞中で増殖される場合に細胞傷害性で
あるウイルス遺伝子を含む構築物の場合、特に有効である。このことはまた、組
換えウイルスの製造において利点である。なぜならば、大規模の細菌の培養方法
が、哺乳動物細胞培養を行う方法よりもむしろ使用され得るからである。本発明
のさらなる利点は、ウイルスの産生のためのコスミドに基づく系（上記参照のこ
と）（これは、完全なウイルスゲノムを再構成するためにいくつかの分子の組換
えに依存する）とは対照に、全ウイルスゲノムが、単一の人工染色体構築物に含
まれ得る。このことは、効率の増大および遺伝的安定性を提供する。さらに以下
に記載されるように、これは、本発明の方法を用いて、組換えウイルスへのアン
プリコンのトランスパッケージングにおいて特に有利である。
において用いられる場合、この構築物は、細菌中で容易にかつ効率良く増殖し得
る。このことは、その構築物が哺乳動物細胞中で増殖される場合に細胞傷害性で
あるウイルス遺伝子を含む構築物の場合、特に有効である。このことはまた、組
換えウイルスの製造において利点である。なぜならば、大規模の細菌の培養方法
が、哺乳動物細胞培養を行う方法よりもむしろ使用され得るからである。本発明
のさらなる利点は、ウイルスの産生のためのコスミドに基づく系（上記参照のこ
と）（これは、完全なウイルスゲノムを再構成するためにいくつかの分子の組換
えに依存する）とは対照に、全ウイルスゲノムが、単一の人工染色体構築物に含
まれ得る。このことは、効率の増大および遺伝的安定性を提供する。さらに以下
に記載されるように、これは、本発明の方法を用いて、組換えウイルスへのアン
プリコンのトランスパッケージングにおいて特に有利である。
【００１１】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の
範囲から明白である。
範囲から明白である。
【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、外来の核酸配列（例えば、ウイルスの核酸配列）を含む人工染色体
構築物を提供する。必要に応じて、人工染色体構築物はまた、異種の核酸配列（
すなわち、人工染色体の非天然的成分である核酸配列またはウイルス核酸配列）
を含む。本発明の人工染色体構築物は、インビボで（例えば、治療方法（例えば
、遺伝子治療方法）において）、またはインビトロで（例えば、組換えウイルス
産生方法においてか、もしくはアンプリコンパッケージングにおいて）、細胞中
の組換えウイルスを産生するための方法において使用され得る。
構築物を提供する。必要に応じて、人工染色体構築物はまた、異種の核酸配列（
すなわち、人工染色体の非天然的成分である核酸配列またはウイルス核酸配列）
を含む。本発明の人工染色体構築物は、インビボで（例えば、治療方法（例えば
、遺伝子治療方法）において）、またはインビトロで（例えば、組換えウイルス
産生方法においてか、もしくはアンプリコンパッケージングにおいて）、細胞中
の組換えウイルスを産生するための方法において使用され得る。
【００１３】 外来の核酸配列が本発明における使用のために挿入され得る人工染色体は、例
えば、細菌の人工染色体（ＢＡＣ、例えば、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１またはｐＢＡ
Ｃ１０８Ｌ；例えば、Ｓｈｉｚｕｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９（１８）：８７９４−８７９７、１９９２；Ｗａｎｇら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３（６）：９９２−９９４、１９９７を参照のこと
）、Ｐ１ベースの人工染色体（ＰＡＣ）、酵母の人工染色体（ＹＡＣ；例えば、
Ｂｕｒｋｅ、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．７（５）：９４−９
９．１９９０を参照のこと）、およびヒトの人工染色体（ＨＡＣ）のような哺乳
動物の人工染色体（ＭＡＣ；例えば、Ｖｏｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１５（１２）：１２５７−１２５９、１９９７；Ａｓｃｅｎｚｉｏｎｉら、Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１１８（２）：１３５−１４２、１９９７を参照のこと）
が挙げられる。
えば、細菌の人工染色体（ＢＡＣ、例えば、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１またはｐＢＡ
Ｃ１０８Ｌ；例えば、Ｓｈｉｚｕｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９（１８）：８７９４−８７９７、１９９２；Ｗａｎｇら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３（６）：９９２−９９４、１９９７を参照のこと
）、Ｐ１ベースの人工染色体（ＰＡＣ）、酵母の人工染色体（ＹＡＣ；例えば、
Ｂｕｒｋｅ、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．７（５）：９４−９
９．１９９０を参照のこと）、およびヒトの人工染色体（ＨＡＣ）のような哺乳
動物の人工染色体（ＭＡＣ；例えば、Ｖｏｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１５（１２）：１２５７−１２５９、１９９７；Ａｓｃｅｎｚｉｏｎｉら、Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１１８（２）：１３５−１４２、１９９７を参照のこと）
が挙げられる。
【００１４】 人工染色体に挿入され、本発明の人工染色体構築物を生成し得るウイルス核酸
配列は、多くの周知の任意のウイルス（例えば、環状複製中間体を含むウイルス
）由来であり得る。例えば、ＤＮＡウイルスファミリー（例えば、ヘルペスウイ
ルス科（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６
またはＨＨＶ７）、アデノウイルス科、ポックスウイルス科、パポーバウイルス
科（例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルス）、パルボウイルス
科、ならびにヘパドナウイルス科のファミリー）のメンバーが使用され得る。Ｒ
ＮＡウイルスファミリーのメンバーであり、標準的な分子技術によってＤＮＡに
生成され得るゲノムがまた使用され得る。例えば、コロナウイルス科、ピコルナ
ウイルス科、レトロウイルス科、カルシウイルス科、トガウイルス科（例えば、
フラビウイルス属）、およびアストロウイルス科ファミリーのメンバー（これら
は、一本鎖の正鎖（ｐｌｕｓ ｓｔｒａｎｄｅｄ）ウイルスである）が使用され
得る。また、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、フィロウイルス
科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、およびブンヤウイルス科ファミリー
のメンバー（これらは、一本鎖の負鎖（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ）
ウイルスである）が使用され得る。二本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レオウイル
ス科のファミリーの二本鎖ＲＮＡウイルス）がまた、本発明において使用され得
る。
配列は、多くの周知の任意のウイルス（例えば、環状複製中間体を含むウイルス
）由来であり得る。例えば、ＤＮＡウイルスファミリー（例えば、ヘルペスウイ
ルス科（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ６
またはＨＨＶ７）、アデノウイルス科、ポックスウイルス科、パポーバウイルス
科（例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルス）、パルボウイルス
科、ならびにヘパドナウイルス科のファミリー）のメンバーが使用され得る。Ｒ
ＮＡウイルスファミリーのメンバーであり、標準的な分子技術によってＤＮＡに
生成され得るゲノムがまた使用され得る。例えば、コロナウイルス科、ピコルナ
ウイルス科、レトロウイルス科、カルシウイルス科、トガウイルス科（例えば、
フラビウイルス属）、およびアストロウイルス科ファミリーのメンバー（これら
は、一本鎖の正鎖（ｐｌｕｓ ｓｔｒａｎｄｅｄ）ウイルスである）が使用され
得る。また、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、フィロウイルス
科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、およびブンヤウイルス科ファミリー
のメンバー（これらは、一本鎖の負鎖（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ）
ウイルスである）が使用され得る。二本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レオウイル
ス科のファミリーの二本鎖ＲＮＡウイルス）がまた、本発明において使用され得
る。
【００１５】 上記のように、ウイルス核酸配列は、本発明の人工染色体構築物に含まれ、そ
の結果、組換えウイルスは、細胞への導入された構築物から産生される。本発明
のいくつかの適用において、この様式で産生された組換えウイルスが、結果とし
て細胞を殺傷することが所望される。この場合、この人工染色体構築物から産生
されたウイルスは、細胞を殺傷するウイルスであり得、このウイルスは、例えば
細胞の溶解またはアポトーシスを誘導することによって産生される。このことは
、例えば、細胞が癌細胞（例えば、神経系型腫瘍の癌細胞（例えば、神経膠星状
細胞腫、乏希突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽細胞腫、脳室上衣細
胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、または髄芽細胞腫の細胞））である場合、所望
される。本発明に準じた、殺傷され得る他の型の腫瘍細胞には、例えば、黒色腫
、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、線維肉腫、扁平上皮癌、神経
外胚葉（ｎｅｕｒｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）、甲状腺腫瘍、下垂体腫瘍、リンパ腫
、肝細胞癌、中皮腫、および類表皮癌細胞が挙げられる。
の結果、組換えウイルスは、細胞への導入された構築物から産生される。本発明
のいくつかの適用において、この様式で産生された組換えウイルスが、結果とし
て細胞を殺傷することが所望される。この場合、この人工染色体構築物から産生
されたウイルスは、細胞を殺傷するウイルスであり得、このウイルスは、例えば
細胞の溶解またはアポトーシスを誘導することによって産生される。このことは
、例えば、細胞が癌細胞（例えば、神経系型腫瘍の癌細胞（例えば、神経膠星状
細胞腫、乏希突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽細胞腫、脳室上衣細
胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、または髄芽細胞腫の細胞））である場合、所望
される。本発明に準じた、殺傷され得る他の型の腫瘍細胞には、例えば、黒色腫
、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、線維肉腫、扁平上皮癌、神経
外胚葉（ｎｅｕｒｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）、甲状腺腫瘍、下垂体腫瘍、リンパ腫
、肝細胞癌、中皮腫、および類表皮癌細胞が挙げられる。
【００１６】 標的細胞の殺傷が望ましい他の治療的適用は、例えば、いぼの原因であるケラ
チノサイトおよび上皮細胞の切除、過敏反応性の器官（例えば、甲状腺）におけ
る細胞の切除、肥満の患者における脂肪細胞の切除、良性腫瘍（例えば、甲状腺
の良性腫瘍または良性腫瘍前立腺肥大）の切除、先端巨大症を処置するための成
長ホルモン産生腺下垂体細胞の切除、プロラクチンの産生を停止するための乳腺
刺激ホルモン産生細胞の切除、クッシング病（Ｃｕｓｈｉｎｇ’ｓ ｄｉｓｅａ
ｓｅ）を処置するためのＡＣＴＨ産生細胞の切除、褐色細胞腫を処置するための
副腎髄質のエピネフリン産生クロム親和細胞の切除、およびインスリノーマを処
置するためのインスリン産生β島細胞の切除が、挙げられる。
チノサイトおよび上皮細胞の切除、過敏反応性の器官（例えば、甲状腺）におけ
る細胞の切除、肥満の患者における脂肪細胞の切除、良性腫瘍（例えば、甲状腺
の良性腫瘍または良性腫瘍前立腺肥大）の切除、先端巨大症を処置するための成
長ホルモン産生腺下垂体細胞の切除、プロラクチンの産生を停止するための乳腺
刺激ホルモン産生細胞の切除、クッシング病（Ｃｕｓｈｉｎｇ’ｓ ｄｉｓｅａ
ｓｅ）を処置するためのＡＣＴＨ産生細胞の切除、褐色細胞腫を処置するための
副腎髄質のエピネフリン産生クロム親和細胞の切除、およびインスリノーマを処
置するためのインスリン産生β島細胞の切除が、挙げられる。
【００１７】 人工染色体構築物がまた、１つ以上の、例えば、細胞毒、免疫調節タンパク質
（すなわち、抗原に対する宿主免疫応答を増大または抑制のいずれかをするタン
パク質）、または腫瘍抗原をコードする異種の核酸配列を含む場合、この効果は
増大され得る。免疫調節タンパク質の例として、例えば、サイトカイン（例えば
、インターロイキン（例えば、インターロイキン１〜１５の任意のインターロイ
キン）、α−、β−、またはγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激性因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激
性因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒状コロニー刺激性因子（Ｇ−ＣＳＦ））、ケ
モキカイン（例えば、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）、マクロファージ化学
誘引物質および活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、ならびにマクロファー
ジ炎症性ペプチドＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ）、相補成分およびそれらの
レセプター、免疫系アクセサリー分子（例えば、Ｂ７．１およびＢ７．２）、接
着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、２および３）、ならびに接着レセプター分子が
挙げられる。本発明の方法を使用して産生され得る腫瘍抗原の例には、例えば、
ヒトパピローマウイルスのＥ６抗原およびＥ７抗原、ＥＢＶ由来タンパク質（Ｖ
ａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６４
７、１９９１）、ムチン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍ
ｕｎ．４（５）：６２４−６２９、１９９２）（例えば、ＭＵＣ１（Ｂｕｒｃｈ
ｅｌｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４４：６９１−６９６、１９８９））、
黒色腫チロシナーゼ、およびＭＺ２−Ｅ（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、
前出）が挙げられる。（腫瘍抗原またはサイトカインをコードする遺伝子を含む
ためのウイルスベクターの改変のさらなる記載についてＷＯ９４／１６７１６も
また参照のこと）。異種の核酸配列は、構築物の人工染色体部分か、またはこれ
らの任意の実施例における構築物のウイルス部分のいずれかに挿入され得る。
（すなわち、抗原に対する宿主免疫応答を増大または抑制のいずれかをするタン
パク質）、または腫瘍抗原をコードする異種の核酸配列を含む場合、この効果は
増大され得る。免疫調節タンパク質の例として、例えば、サイトカイン（例えば
、インターロイキン（例えば、インターロイキン１〜１５の任意のインターロイ
キン）、α−、β−、またはγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激性因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激
性因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒状コロニー刺激性因子（Ｇ−ＣＳＦ））、ケ
モキカイン（例えば、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）、マクロファージ化学
誘引物質および活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、ならびにマクロファー
ジ炎症性ペプチドＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ）、相補成分およびそれらの
レセプター、免疫系アクセサリー分子（例えば、Ｂ７．１およびＢ７．２）、接
着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、２および３）、ならびに接着レセプター分子が
挙げられる。本発明の方法を使用して産生され得る腫瘍抗原の例には、例えば、
ヒトパピローマウイルスのＥ６抗原およびＥ７抗原、ＥＢＶ由来タンパク質（Ｖ
ａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６４
７、１９９１）、ムチン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍ
ｕｎ．４（５）：６２４−６２９、１９９２）（例えば、ＭＵＣ１（Ｂｕｒｃｈ
ｅｌｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４４：６９１−６９６、１９８９））、
黒色腫チロシナーゼ、およびＭＺ２−Ｅ（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、
前出）が挙げられる。（腫瘍抗原またはサイトカインをコードする遺伝子を含む
ためのウイルスベクターの改変のさらなる記載についてＷＯ９４／１６７１６も
また参照のこと）。異種の核酸配列は、構築物の人工染色体部分か、またはこれ
らの任意の実施例における構築物のウイルス部分のいずれかに挿入され得る。
【００１８】 本発明の方法の他の適用において、本発明の人工染色体構築物の細胞への導入
において産生された組換えウイルスが、その細胞を殺傷しないことが所望される
。これらの適用には、例えば、治療用遺伝子産物（例えば、成長因子、ホルモン
、ワクチン抗原、アンチセンスＲＮＡ分子、またはリボザイム（以下を参照のこ
と））をコードする異種遺伝子を含む人工染色体構築物の使用が挙げられる。こ
れらの適用はまた、人工染色体構築物を使用してその構築物に含まれる核酸配列
によってコードされるウイルスに対して免疫化することが含まれる。これらの適
用において、人工染色体構築物から産生されるウイルスは、減衰されるかまたは
変異し、その結果、ウイルスが複製しない、および／またはウイルスが細胞（例
えば、細胞の溶解もしくはアポトーシスを誘導することによってウイルスが産生
される細胞）を殺傷し得ないことが望まれ得る。これらの特徴を有する多数の適
切な変異ウイルスは、公知であり、そして当業者によって容易に本発明における
使用に適応し得る。例えば、ＨＳＶの場合、Ｇｅｌｌｅｒ（米国特許第５，５０
１，９７９号；ＷＯ ９０／０９４４１；アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＡＴＣＣ登録番号
４０５４４）、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ（ＥＰ ４５３，２４２−Ａ１）、Ｓｐｅ
ｃｋ（ＷＯ ９６／０４３９５）、Ｐｒｅｓｔｏｎら（ＷＯ ９６／０４３９４
）、ＤｅＬｕｃａ（米国特許第５，６５８，７２４号）、およびＭａｒｔｕｚａ
（米国特許第５，５８５，０９６号）のベクターが、これらの方法における使用
に適応し得る。使用され得る減衰したＨＳＶ変異体の特定の例には、ＨＦ（ＡＴ
ＣＣ ＶＲ−２６０）、ＭａｃＩｎｔｙｒｅ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５３９）、ＭＰ
（ＡＴＣＣ ＶＲ−７３５）；ＨＳＶ−２株Ｇ（ＡＴＣＣ ＶＲ−７２４）およ
びＭＳ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５４０）；ならびに以下の遺伝子の１つ以上において
変異を有する変異体：前初期遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２
７およびＩＣＰ４７（米国特許第５，６５８，７２４号）；ウイルスの複製に必
要な遺伝子である、ＶＬ９、ＶＬ５、ＶＬ４２、ＤＮＡｐｏｌ、およびＩＣＰ８
；γ３４．５遺伝子；リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子；ＶＰ１６遺伝子（
すなわち、Ｖｍｗ６５、ＷＯ ９１／０２７８８；ＷＯ ９６／０４３９５；Ｗ
Ｏ ９６／０４３９４）；およびｇＨ、ｇＬ、ｇＤ、またはｇＢ遺伝子（ＷＯ
９２／０５２６３、９４／２１８０７、９４／０３２０７）が挙げられる。
において産生された組換えウイルスが、その細胞を殺傷しないことが所望される
。これらの適用には、例えば、治療用遺伝子産物（例えば、成長因子、ホルモン
、ワクチン抗原、アンチセンスＲＮＡ分子、またはリボザイム（以下を参照のこ
と））をコードする異種遺伝子を含む人工染色体構築物の使用が挙げられる。こ
れらの適用はまた、人工染色体構築物を使用してその構築物に含まれる核酸配列
によってコードされるウイルスに対して免疫化することが含まれる。これらの適
用において、人工染色体構築物から産生されるウイルスは、減衰されるかまたは
変異し、その結果、ウイルスが複製しない、および／またはウイルスが細胞（例
えば、細胞の溶解もしくはアポトーシスを誘導することによってウイルスが産生
される細胞）を殺傷し得ないことが望まれ得る。これらの特徴を有する多数の適
切な変異ウイルスは、公知であり、そして当業者によって容易に本発明における
使用に適応し得る。例えば、ＨＳＶの場合、Ｇｅｌｌｅｒ（米国特許第５，５０
１，９７９号；ＷＯ ９０／０９４４１；アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＡＴＣＣ登録番号
４０５４４）、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ（ＥＰ ４５３，２４２−Ａ１）、Ｓｐｅ
ｃｋ（ＷＯ ９６／０４３９５）、Ｐｒｅｓｔｏｎら（ＷＯ ９６／０４３９４
）、ＤｅＬｕｃａ（米国特許第５，６５８，７２４号）、およびＭａｒｔｕｚａ
（米国特許第５，５８５，０９６号）のベクターが、これらの方法における使用
に適応し得る。使用され得る減衰したＨＳＶ変異体の特定の例には、ＨＦ（ＡＴ
ＣＣ ＶＲ−２６０）、ＭａｃＩｎｔｙｒｅ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５３９）、ＭＰ
（ＡＴＣＣ ＶＲ−７３５）；ＨＳＶ−２株Ｇ（ＡＴＣＣ ＶＲ−７２４）およ
びＭＳ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５４０）；ならびに以下の遺伝子の１つ以上において
変異を有する変異体：前初期遺伝子ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２
７およびＩＣＰ４７（米国特許第５，６５８，７２４号）；ウイルスの複製に必
要な遺伝子である、ＶＬ９、ＶＬ５、ＶＬ４２、ＤＮＡｐｏｌ、およびＩＣＰ８
；γ３４．５遺伝子；リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子；ＶＰ１６遺伝子（
すなわち、Ｖｍｗ６５、ＷＯ ９１／０２７８８；ＷＯ ９６／０４３９５；Ｗ
Ｏ ９６／０４３９４）；およびｇＨ、ｇＬ、ｇＤ、またはｇＢ遺伝子（ＷＯ
９２／０５２６３、９４／２１８０７、９４／０３２０７）が挙げられる。
【００１９】 この型の人工染色体構築物（すなわち、細胞内への導入の際に非溶解性のウイ
ルスの生成を生じる構築物）に含まれる異種核酸配列によりコードされるべき適
切な治療的産物は、所望の結果に依存して、当業者により容易に選択され得る。
例えば、異種遺伝子産物は、成長因子（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ
）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ＶＧＦまたはＶＥＧＦ）、酵素、ホルモン、また
はワクチン抗原のようなタンパク質であり得る。本発明において産生され得るタ
ンパク質遺伝子産物の特定の例としては、例えば、パーキンソン病の処置に使用
され得る、チロシンヒドロキシラーゼ１、２、または３；パーキンソン病の処置
に使用され得る、神経増殖因子（ＮＧＦ、例えば、ＮＧＦβサブユニット）；レ
ッシュ‐ナイハン病の処置に使用され得る、ヒポキサンチン−グアニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ；テイ‐サックス病およびザントホフ病の処置に使用
され得る、β−ヘキソサミニダーゼα−鎖；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の
神経学的症状を処置するために使用され得る、ＨＩＶｎｅｆ、および糖尿病の処
置に使用され得る、インスリンが挙げられる。本発明の方法を使用して生成され
得る他のタンパク質遺伝子産物としては、例えば、シグナル伝達酵素（例えば、
プロテインキナーゼＣ）；転写因子（例えばｃ−ｆｏｓ、ＮＦ−Ｋβ）；オンコ
ジーン（例えば、ｅｒｂＢ、ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ、およびｒａｓ）；神経伝達
因子レセプター（例えば、グルタミン酸レセプター、ドーパミンレセプター、お
よびアデノシンデアミナーゼレセプター（ＷＯ９２／１０５６４、ＷＯ８９／１
２１０９、ＥＰ０４２０９１１）；および嚢胞性線維症タンパク質（ＷＯ９１／
０２７９６、ＷＯ９２／０５２７３、およびＷＯ９４／１２６４９）が挙げられ
る。
ルスの生成を生じる構築物）に含まれる異種核酸配列によりコードされるべき適
切な治療的産物は、所望の結果に依存して、当業者により容易に選択され得る。
例えば、異種遺伝子産物は、成長因子（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ
）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ＶＧＦまたはＶＥＧＦ）、酵素、ホルモン、また
はワクチン抗原のようなタンパク質であり得る。本発明において産生され得るタ
ンパク質遺伝子産物の特定の例としては、例えば、パーキンソン病の処置に使用
され得る、チロシンヒドロキシラーゼ１、２、または３；パーキンソン病の処置
に使用され得る、神経増殖因子（ＮＧＦ、例えば、ＮＧＦβサブユニット）；レ
ッシュ‐ナイハン病の処置に使用され得る、ヒポキサンチン−グアニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ；テイ‐サックス病およびザントホフ病の処置に使用
され得る、β−ヘキソサミニダーゼα−鎖；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の
神経学的症状を処置するために使用され得る、ＨＩＶｎｅｆ、および糖尿病の処
置に使用され得る、インスリンが挙げられる。本発明の方法を使用して生成され
得る他のタンパク質遺伝子産物としては、例えば、シグナル伝達酵素（例えば、
プロテインキナーゼＣ）；転写因子（例えばｃ−ｆｏｓ、ＮＦ−Ｋβ）；オンコ
ジーン（例えば、ｅｒｂＢ、ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ、およびｒａｓ）；神経伝達
因子レセプター（例えば、グルタミン酸レセプター、ドーパミンレセプター、お
よびアデノシンデアミナーゼレセプター（ＷＯ９２／１０５６４、ＷＯ８９／１
２１０９、ＥＰ０４２０９１１）；および嚢胞性線維症タンパク質（ＷＯ９１／
０２７９６、ＷＯ９２／０５２７３、およびＷＯ９４／１２６４９）が挙げられ
る。
【００２０】 治療用産物はまた、アンチセンスＲＮＡ分子のような、ハイブリダイゼーショ
ン相互作用によって、細胞性または病原性ｍＲＮＡの発現をブロックするために
使用され得る、ＲＮＡ分子であり得る。あるいは、そのＲＮＡ分子は、欠損細胞
性ＲＮＡを修復するためか、あるいは所望されない細胞性または病原性をコード
されたＲＮＡを破壊するためのいずれかに設計されたリボザイム（例えば、ハン
マーヘッドまたはヘアピンに基づくリボザイム）であり得る（例えば、Ｓｕｌｌ
ｅｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（５）：２４９−２５３，１９９５；Ｃｚ
ｕｂａｙｋｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（９）：９４３−９４９，１９９７；
Ｒｏｓｓｉ，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：１９５−２０４，１９
９７；Ｊａｍｅｓら、Ｂｌｏｏｄ ９１（２）：３７１−３８２，１９９８；Ｓ
ｕｌｌｅｎｇｅｒ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２（３）：２０１
−２０５，１９９６；Ｈａｍｐｅｌ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．５８：１−３９，１９９８；Ｃｕｒｃｉｏら、Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７４（３）：３１７−３３２，１９９７を参照のこと）
。
ン相互作用によって、細胞性または病原性ｍＲＮＡの発現をブロックするために
使用され得る、ＲＮＡ分子であり得る。あるいは、そのＲＮＡ分子は、欠損細胞
性ＲＮＡを修復するためか、あるいは所望されない細胞性または病原性をコード
されたＲＮＡを破壊するためのいずれかに設計されたリボザイム（例えば、ハン
マーヘッドまたはヘアピンに基づくリボザイム）であり得る（例えば、Ｓｕｌｌ
ｅｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（５）：２４９−２５３，１９９５；Ｃｚ
ｕｂａｙｋｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（９）：９４３−９４９，１９９７；
Ｒｏｓｓｉ，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：１９５−２０４，１９
９７；Ｊａｍｅｓら、Ｂｌｏｏｄ ９１（２）：３７１−３８２，１９９８；Ｓ
ｕｌｌｅｎｇｅｒ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２（３）：２０１
−２０５，１９９６；Ｈａｍｐｅｌ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．５８：１−３９，１９９８；Ｃｕｒｃｉｏら、Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７４（３）：３１７−３３２，１９９７を参照のこと）
。
【００２１】 本発明の人工染色体構築物の成分は、標準的な方法を使用して構築され得る。
例えば、さらに以下に記載のように、ウイルス配列は、（ｉ）ウイルスゲノムの
領域に相同な配列により隣接される、人工染色体を含む構築物、および（ｉｉ）
ウイルスゲノムでの、細胞の同時トランスフェクションにより人工染色体内に挿
入され得、その結果、細胞内で組換えが生じ、その人工染色体を含む組換えウイ
ルスの生成を生じる。また以下にさらに記載されるように、組換えＤＮＡ分子は
、人工染色体構築物およびウイルス核酸配列が同時トランスフェクトされ、相同
組換えにより組換えウイルスの生成を導く細胞から単離され得、そしてその単離
されたＤＮＡ分子は、所望のように、遺伝子を挿入または欠失するために操作さ
れ得る。直接的なクローニング方法（ウイルスゲノムおよび人工染色体に特有の
部位を使用する）をまた使用して、本発明の人工染色体構築物の成分を構築し得
る。
例えば、さらに以下に記載のように、ウイルス配列は、（ｉ）ウイルスゲノムの
領域に相同な配列により隣接される、人工染色体を含む構築物、および（ｉｉ）
ウイルスゲノムでの、細胞の同時トランスフェクションにより人工染色体内に挿
入され得、その結果、細胞内で組換えが生じ、その人工染色体を含む組換えウイ
ルスの生成を生じる。また以下にさらに記載されるように、組換えＤＮＡ分子は
、人工染色体構築物およびウイルス核酸配列が同時トランスフェクトされ、相同
組換えにより組換えウイルスの生成を導く細胞から単離され得、そしてその単離
されたＤＮＡ分子は、所望のように、遺伝子を挿入または欠失するために操作さ
れ得る。直接的なクローニング方法（ウイルスゲノムおよび人工染色体に特有の
部位を使用する）をまた使用して、本発明の人工染色体構築物の成分を構築し得
る。
【００２２】 ウイルスまたは異種核酸配列が挿入される人工染色体内の位置は、例えば、特
定のウイルス機能の破壊が所望されるか否かに依存して変化する。例えば、人工
染色体構築物が、細胞中で複製可能なウイルスの生成を導かないウイルス配列（
上記を参照のこと）を含むことが所望される場合、次いで、その人工染色体およ
びそのウイルス配列は、ウイルス複製に必須である核酸配列が破壊されるように
併用され得る。同様に、異種核酸配列の挿入を使用して、必須のウイルス遺伝子
を破壊し得る。ＨＳＶにおける必須の遺伝子の例は、例えば、上記に記載される
。
定のウイルス機能の破壊が所望されるか否かに依存して変化する。例えば、人工
染色体構築物が、細胞中で複製可能なウイルスの生成を導かないウイルス配列（
上記を参照のこと）を含むことが所望される場合、次いで、その人工染色体およ
びそのウイルス配列は、ウイルス複製に必須である核酸配列が破壊されるように
併用され得る。同様に、異種核酸配列の挿入を使用して、必須のウイルス遺伝子
を破壊し得る。ＨＳＶにおける必須の遺伝子の例は、例えば、上記に記載される
。
【００２３】 あるいは、人工染色体構築物に細胞中で複製可能なウイルス（上記を参照のこ
と）の生成を導くウイルス配列を含ませることが望ましいだろう。この場合、人
工染色他構築物を生成するための人工染色体とウイルス核酸配列との組換え（ま
たは異種核酸配列の導入）は、ウイルスゲノムの非必須領域において実行され得
る。例えば、ＨＳＶの場合、このような挿入は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＵＬ
２３、以下を参照のこと；この挿入は、単独で、または別の挿入と組み合わせて
作製される）において、以下の１以上の任意の遺伝子において：ＲＬ１、ＲＬ２
（すなわち、ＩＥ１１０）、転写に関連する潜伏をコードする遺伝子座、ＵＬ２
（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子）、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ１０、ＵＬ
１１、ＵＬ１３、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２４、ＵＬ４０（リボヌクレオチド
レダクターゼの小サブユニット）、ＵＬ４１（ビリオン宿主シャットオフ（ｓｈ
ｕｔ−ｏｆｆ）因子）、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、
ＵＬ５０、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１（ＩＥ６８）、ＵＳ２、ＵＳ３（プロテ
インキナーゼ遺伝子）、ＵＳ４（糖タンパク質Ｇ遺伝子）、ＵＳ５、ＵＳ７（糖
タンパク質Ｉ遺伝子）、ＵＳ８（糖タンパク質Ｅ遺伝子）、ＵＳ９、ＵＳ１０、
ＵＳ１１、およびＵＳ１２（ＩＥ１２）、または遺伝子間配列においてであり得
る。
と）の生成を導くウイルス配列を含ませることが望ましいだろう。この場合、人
工染色他構築物を生成するための人工染色体とウイルス核酸配列との組換え（ま
たは異種核酸配列の導入）は、ウイルスゲノムの非必須領域において実行され得
る。例えば、ＨＳＶの場合、このような挿入は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＵＬ
２３、以下を参照のこと；この挿入は、単独で、または別の挿入と組み合わせて
作製される）において、以下の１以上の任意の遺伝子において：ＲＬ１、ＲＬ２
（すなわち、ＩＥ１１０）、転写に関連する潜伏をコードする遺伝子座、ＵＬ２
（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子）、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ１０、ＵＬ
１１、ＵＬ１３、ＵＬ１６、ＵＬ２０、ＵＬ２４、ＵＬ４０（リボヌクレオチド
レダクターゼの小サブユニット）、ＵＬ４１（ビリオン宿主シャットオフ（ｓｈ
ｕｔ−ｏｆｆ）因子）、ＵＬ４３、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、
ＵＬ５０、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＵＳ１（ＩＥ６８）、ＵＳ２、ＵＳ３（プロテ
インキナーゼ遺伝子）、ＵＳ４（糖タンパク質Ｇ遺伝子）、ＵＳ５、ＵＳ７（糖
タンパク質Ｉ遺伝子）、ＵＳ８（糖タンパク質Ｅ遺伝子）、ＵＳ９、ＵＳ１０、
ＵＳ１１、およびＵＳ１２（ＩＥ１２）、または遺伝子間配列においてであり得
る。
【００２４】 異種核酸配列は、人工染色体またはウイルス核酸配列の調節配列の制御下にそ
れを与える位置において、人工染色体構築物内に挿入され得る。あるいは、異種
核酸配列は、調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）を含
む発現カセットの一部として挿入され得る。適切な調節エレメントは、例えば、
所望の組織特異性および発現のレベルに基づいて、当業者によって選択され得る
。たとえば、細胞型特異的または腫瘍特異的プロモーターを使用して、特定の細
胞型に対して遺伝子産物の発現を制限し得る。これは、例えば、細胞傷害性遺伝
子産物、免疫調節遺伝子産物、または腫瘍抗原遺伝子産物が、その破壊を容易に
するために腫瘍細胞内で産生されている場合に特に有用である。さらに、組織特
異的プロモーターを使用して、人工染色体構築物の局所投与は、局在された発現
を生じ得る。
れを与える位置において、人工染色体構築物内に挿入され得る。あるいは、異種
核酸配列は、調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）を含
む発現カセットの一部として挿入され得る。適切な調節エレメントは、例えば、
所望の組織特異性および発現のレベルに基づいて、当業者によって選択され得る
。たとえば、細胞型特異的または腫瘍特異的プロモーターを使用して、特定の細
胞型に対して遺伝子産物の発現を制限し得る。これは、例えば、細胞傷害性遺伝
子産物、免疫調節遺伝子産物、または腫瘍抗原遺伝子産物が、その破壊を容易に
するために腫瘍細胞内で産生されている場合に特に有用である。さらに、組織特
異的プロモーターを使用して、人工染色体構築物の局所投与は、局在された発現
を生じ得る。
【００２５】 本発明において使用され得る非組織特異的プロモーターの例としては、初期サ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４，１６８，０６２号
）およびラウス肉種ウイルスプロモーター（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．５：２８１，１９８５）が挙げられる。また、ＨＳＶプロモー
タ（例えば、ＨＳＶ−１ ＩＥおよびＩＥ４／５プロモーター）もまた、使用さ
れ得る。
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４，１６８，０６２号
）およびラウス肉種ウイルスプロモーター（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．５：２８１，１９８５）が挙げられる。また、ＨＳＶプロモー
タ（例えば、ＨＳＶ−１ ＩＥおよびＩＥ４／５プロモーター）もまた、使用さ
れ得る。
【００２６】 本発明において使用され得る組織特異的プロモーターの例としては、例えば、
以下が挙げられる；筋細胞に特異的である、デスミンプロモーター（Ｌｉら、Ｇ
ｅｎｅ ７８：２４３，１９８９；Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：
６５６２，１９９１；Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０４０３，
１９９３）；ニューロンに特異的である、エノラーゼプロモーター（Ｆｏｒｓｓ
−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓ．１６（１）：１４
１−１５６，１９８６）；赤血球細胞に特異的である、β−グロビンプロモータ
ー（Ｔｏｗｎｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：１７１５，１９８５）；赤血球にまた
特異的である、τ−グロビンプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２８３：４９９，１９８０）；下垂体細胞に特異的である、成長ホルモンプロ
モーター（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２：４５３，１９８８
）；膵臓β細胞に特異的である、インスリンプロモーター（Ｓｅｌｄｅｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３２１：５４５，１９８６）；星状細胞に特異的である、グリア繊維
性酸性タンパク質プロモーター（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１
４：１０３０，１９９４）；カテコールアミンの関与するニューロンに特異的で
ある、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６８：１５６８９，１９９３）；ニューロンに特異的である、アミロイ
ド前駆体タンパク質プロモーター（Ｓａｌｂａｕｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．７：２８
０７，１９８８）；ノルアドレナリン作用性およびアドレナリン作用性ニューロ
ンに特異的である、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター（Ｈｏｙｌｅ
ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：２４５５，１９９４）；セロトニン／松果体
細胞に特異的である、トリプトファンヒドロキシラーゼプロモーター（Ｂｏｕｌ
ａｒａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３７５７，１９９５）；コリ
ン作用性ニューロンに特異的である、コリンアセチルトランスフェラーゼプロモ
ーター（Ｈｅｒｓｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６１：３０６，１９９３）；
カテコールアミン作用性／５−ＨＴ／Ｄ−型細胞に特異的である、芳香族Ｌ−ア
ミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター（Ｔｈａｉら、Ｍｏｌ．Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓ．１７：２２７，１９９３）；ニューロン性／精子形成精巣上
体細胞に特異的である、プロエンケファリンプロモーター（Ｂｏｒｓｏｏｋら、
Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：１５０２，１９９２）；結腸腫瘍および直
腸腫瘍、ならびに膵臓細胞および腎臓細胞に特異的である、レグ（ｒｅｇ）（膵
石タンパク質）プロモーター（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６５：７４３２，１９９０）；および肝臓腫瘍および盲腸腫瘍、ならびに神経
鞘腫細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、および副腎細胞に特異的である、副甲状腺ホル
モン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）プロモーター（Ｃａｍｐｏｓら、Ｍｏｌ．Ｒｎ
ｆｏｖｔｉｎｏｌ．６：１６４２，１９９２）。
以下が挙げられる；筋細胞に特異的である、デスミンプロモーター（Ｌｉら、Ｇ
ｅｎｅ ７８：２４３，１９８９；Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：
６５６２，１９９１；Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０４０３，
１９９３）；ニューロンに特異的である、エノラーゼプロモーター（Ｆｏｒｓｓ
−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓ．１６（１）：１４
１−１５６，１９８６）；赤血球細胞に特異的である、β−グロビンプロモータ
ー（Ｔｏｗｎｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：１７１５，１９８５）；赤血球にまた
特異的である、τ−グロビンプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２８３：４９９，１９８０）；下垂体細胞に特異的である、成長ホルモンプロ
モーター（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２：４５３，１９８８
）；膵臓β細胞に特異的である、インスリンプロモーター（Ｓｅｌｄｅｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３２１：５４５，１９８６）；星状細胞に特異的である、グリア繊維
性酸性タンパク質プロモーター（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１
４：１０３０，１９９４）；カテコールアミンの関与するニューロンに特異的で
ある、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６８：１５６８９，１９９３）；ニューロンに特異的である、アミロイ
ド前駆体タンパク質プロモーター（Ｓａｌｂａｕｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．７：２８
０７，１９８８）；ノルアドレナリン作用性およびアドレナリン作用性ニューロ
ンに特異的である、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター（Ｈｏｙｌｅ
ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：２４５５，１９９４）；セロトニン／松果体
細胞に特異的である、トリプトファンヒドロキシラーゼプロモーター（Ｂｏｕｌ
ａｒａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３７５７，１９９５）；コリ
ン作用性ニューロンに特異的である、コリンアセチルトランスフェラーゼプロモ
ーター（Ｈｅｒｓｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６１：３０６，１９９３）；
カテコールアミン作用性／５−ＨＴ／Ｄ−型細胞に特異的である、芳香族Ｌ−ア
ミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター（Ｔｈａｉら、Ｍｏｌ．Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓ．１７：２２７，１９９３）；ニューロン性／精子形成精巣上
体細胞に特異的である、プロエンケファリンプロモーター（Ｂｏｒｓｏｏｋら、
Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：１５０２，１９９２）；結腸腫瘍および直
腸腫瘍、ならびに膵臓細胞および腎臓細胞に特異的である、レグ（ｒｅｇ）（膵
石タンパク質）プロモーター（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６５：７４３２，１９９０）；および肝臓腫瘍および盲腸腫瘍、ならびに神経
鞘腫細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、および副腎細胞に特異的である、副甲状腺ホル
モン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）プロモーター（Ｃａｍｐｏｓら、Ｍｏｌ．Ｒｎ
ｆｏｖｔｉｎｏｌ．６：１６４２，１９９２）。
【００２７】 腫瘍細胞に特異的に機能するプロモーターの例としては、以下が挙げられる；
乳癌細胞に特異的である、ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）３プロモ
ーター（Ｂａｓｓｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：６９９，１９９０）；非小細
胞肺癌細胞に特異的であるサーファクタントタンパク質Ａプロモーター（Ｓｍｉ
ｔｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：２９−３５，１９９４）；ＳＬＰＩ
発現癌腫に特異的である、分泌ロイコプロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）プ
ロモーター（Ｇａｒｖｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：４６−５０，１９９４
）；黒色腫細胞に特異的である、チロシナーゼプロモーター（Ｖｉｌｅら、Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：３０７，１９９４；ＷＯ９４／１６５５７；ＷＯ９
３／ＧＢ１７３０）；線維肉腫／腫瘍化細胞に特異的である、ストレス誘導性ｇ
ｒｐ７８／ＢｉＰプロモーター（Ｇａｚｉｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（
８）：１６６０，１９９５）；脂肪細胞に特異的である、ＡＰ２脂肪エンハンサ
ー（Ｇｒａｖｅｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：２１９，１９９２）
；肝細胞に特異的である、α−１抗トリプシントランスサイレチンプロモーター
（Ｇｒａｙｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：７８６，１９８８）：神経膠芽
細胞腫多形細胞に特異的である、インターロイキン−１０プロモーター（Ｎｉｔ
ｔａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６４９：１２２，１９９４）；膵臓細胞、乳房細
胞、胃細胞、卵巣細胞、および非小細胞肺細胞に特異的である、ｃ−ｅｒｂＢ−
２プロモーター（Ｈａｒｒｉｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１７０，１９９４
）；脳腫瘍細胞に特異的である、α−Ｂ−クリスタリン／熱ショックタンパク質
２７プロモーター（Ａｏｙａｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５５：７６０
，１９９３）；神経膠芽腫および髄膜腫細胞に特異的である、塩基性線維芽細胞
成長因子プロモーター（Ｓｈｉｂａｔａら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ．４：２７
７，１９９１）；扁平上皮細胞癌腫細胞、神経膠芽腫細胞、および乳房腫瘍細胞
に特異的である、上皮成長因子レセプタープロモーター（Ｉｓｈｉｉら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８２，１９９３）；乳癌腫
細胞に特異的である、ムチン様糖タンパク質（ＤＦ３、ＭＵＣ１）プロモーター
（Ａｂｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８２，
１９９３）；転移性腫瘍に特異的である、ｍｔｓ１プロモーター（Ｔｕｌｃｈｉ
ｎｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９１４６
，１９９２）；小細胞肺癌細胞に特異的である、ＮＳＥプロモーター（Ｆｏｒｓ
ｓ−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ ５：１８７，１９９０）；小細胞肺癌細胞
に特異的である、ソマトスタチンレセプタープロモーター（Ｂｏｍｂａｒｄｉｅ
ｒｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３１Ａ：１８４，１９９５；Ｋｏｈら、Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：８４３，１９９５）；乳癌細胞に特異的である
、ｃ−ｅｒｂＢ−３プロモーターおよびｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター（Ｑｕｉ
ｎら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５：２４７，１９９４）；乳癌細胞お
よび胃癌細胞に特異的である、ｃ−ｅｒｂＢ４プロモーター（Ｒａｊｋｕｍａｒ
ら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ２９：３，１９９４
）；甲状腺癌腫細胞に特異的である、サイログロビンプロモーター（Ｍａｒｉｏ
ｔｔｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８０：４６８，１
９９５）；血腫細胞に特異的である、α−フェトプロテインプロモーター（Ｚｕ
ｉｂｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．１６２：３６，１９９５）；胃癌細胞に
特異的である、ビリンプロモーター（Ｏｓｂｏｒｎら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒ
ｃｈ．Ａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．４１３：３０３
，１９９８８）；および血腫細胞に特異的である、アルブミンプロモーター（Ｈ
ｕｂｅｒ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０９９，
１９９１）。
乳癌細胞に特異的である、ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）３プロモ
ーター（Ｂａｓｓｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：６９９，１９９０）；非小細
胞肺癌細胞に特異的であるサーファクタントタンパク質Ａプロモーター（Ｓｍｉ
ｔｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：２９−３５，１９９４）；ＳＬＰＩ
発現癌腫に特異的である、分泌ロイコプロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）プ
ロモーター（Ｇａｒｖｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：４６−５０，１９９４
）；黒色腫細胞に特異的である、チロシナーゼプロモーター（Ｖｉｌｅら、Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：３０７，１９９４；ＷＯ９４／１６５５７；ＷＯ９
３／ＧＢ１７３０）；線維肉腫／腫瘍化細胞に特異的である、ストレス誘導性ｇ
ｒｐ７８／ＢｉＰプロモーター（Ｇａｚｉｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（
８）：１６６０，１９９５）；脂肪細胞に特異的である、ＡＰ２脂肪エンハンサ
ー（Ｇｒａｖｅｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：２１９，１９９２）
；肝細胞に特異的である、α−１抗トリプシントランスサイレチンプロモーター
（Ｇｒａｙｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：７８６，１９８８）：神経膠芽
細胞腫多形細胞に特異的である、インターロイキン−１０プロモーター（Ｎｉｔ
ｔａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６４９：１２２，１９９４）；膵臓細胞、乳房細
胞、胃細胞、卵巣細胞、および非小細胞肺細胞に特異的である、ｃ−ｅｒｂＢ−
２プロモーター（Ｈａｒｒｉｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１７０，１９９４
）；脳腫瘍細胞に特異的である、α−Ｂ−クリスタリン／熱ショックタンパク質
２７プロモーター（Ａｏｙａｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５５：７６０
，１９９３）；神経膠芽腫および髄膜腫細胞に特異的である、塩基性線維芽細胞
成長因子プロモーター（Ｓｈｉｂａｔａら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ．４：２７
７，１９９１）；扁平上皮細胞癌腫細胞、神経膠芽腫細胞、および乳房腫瘍細胞
に特異的である、上皮成長因子レセプタープロモーター（Ｉｓｈｉｉら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８２，１９９３）；乳癌腫
細胞に特異的である、ムチン様糖タンパク質（ＤＦ３、ＭＵＣ１）プロモーター
（Ａｂｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８２，
１９９３）；転移性腫瘍に特異的である、ｍｔｓ１プロモーター（Ｔｕｌｃｈｉ
ｎｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９１４６
，１９９２）；小細胞肺癌細胞に特異的である、ＮＳＥプロモーター（Ｆｏｒｓ
ｓ−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ ５：１８７，１９９０）；小細胞肺癌細胞
に特異的である、ソマトスタチンレセプタープロモーター（Ｂｏｍｂａｒｄｉｅ
ｒｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３１Ａ：１８４，１９９５；Ｋｏｈら、Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：８４３，１９９５）；乳癌細胞に特異的である
、ｃ−ｅｒｂＢ−３プロモーターおよびｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター（Ｑｕｉ
ｎら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５：２４７，１９９４）；乳癌細胞お
よび胃癌細胞に特異的である、ｃ−ｅｒｂＢ４プロモーター（Ｒａｊｋｕｍａｒ
ら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ２９：３，１９９４
）；甲状腺癌腫細胞に特異的である、サイログロビンプロモーター（Ｍａｒｉｏ
ｔｔｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８０：４６８，１
９９５）；血腫細胞に特異的である、α−フェトプロテインプロモーター（Ｚｕ
ｉｂｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．１６２：３６，１９９５）；胃癌細胞に
特異的である、ビリンプロモーター（Ｏｓｂｏｒｎら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒ
ｃｈ．Ａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．４１３：３０３
，１９９８８）；および血腫細胞に特異的である、アルブミンプロモーター（Ｈ
ｕｂｅｒ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０９９，
１９９１）。
【００２８】 上記に示したように、本発明の人工染色体構築物は、例えば、細胞内への治療
用遺伝子産物の導入のために、あるいは、細胞を直接的にか、または間接的に溶
解性ウイルス中間体を介して殺傷するためのインビボでの方法に使用され得る。
これらの方法を実施するために、その人工染色体構築物は、医学で使用される任
意の従来の経路により投与され得る。一般的なガイダンスとして、本発明の人工
染色体構築物は、効果（例えば、発現）が所望される組織内へ、例えば、直接注
射または外科的方法（例えば、脳腫瘍内への定位的注射；Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，６７−９０，１９７１））
によって直接的に投与され得る。人工染色体構築物を脳内へ投与するために使用
され得る、さらなる方法は、Ｂｏｂｏら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６−２０８０，１９９４）およびＭｏｒｒｉｓｏｎら
（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２−３０５，１９９４）により記載
される対流方法である。腫瘍の処置の場合、直接的な腫瘍への注射に代わるもの
として、手術がその腫瘍を除去するために行われ得、そして本発明の人工染色体
構築物は、任意の残存腫瘍細胞の破壊を確実にするために、切除された腫瘍床に
接種され得る。
用遺伝子産物の導入のために、あるいは、細胞を直接的にか、または間接的に溶
解性ウイルス中間体を介して殺傷するためのインビボでの方法に使用され得る。
これらの方法を実施するために、その人工染色体構築物は、医学で使用される任
意の従来の経路により投与され得る。一般的なガイダンスとして、本発明の人工
染色体構築物は、効果（例えば、発現）が所望される組織内へ、例えば、直接注
射または外科的方法（例えば、脳腫瘍内への定位的注射；Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，６７−９０，１９７１））
によって直接的に投与され得る。人工染色体構築物を脳内へ投与するために使用
され得る、さらなる方法は、Ｂｏｂｏら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６−２０８０，１９９４）およびＭｏｒｒｉｓｏｎら
（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２−３０５，１９９４）により記載
される対流方法である。腫瘍の処置の場合、直接的な腫瘍への注射に代わるもの
として、手術がその腫瘍を除去するために行われ得、そして本発明の人工染色体
構築物は、任意の残存腫瘍細胞の破壊を確実にするために、切除された腫瘍床に
接種され得る。
【００２９】 あるいは、構築物は、非経口経路を介して（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、
経皮、表皮内、または筋内経路）、あるいは粘膜表面（例えば、眼球表面、鼻内
表面、肺表面、口腔表面、腸表面、直腸表面、膣表面、または尿路表面）を介し
て、投与され得る。ブピバカインと共に処方される人工染色体構築物（下記参照
のこと）は、筋肉組織内に有利に投与される。中性または陰イオン性リポソーム
あるいは陽イオン性脂質（例えばＤＯＴＭＡまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ（下記参照の
こと））が使用される場合、処方物は、静脈内経路、鼻内経路（エアロゾル化）
、筋内経路、経皮経路、または皮内経路を経て有利に注射され得る。裸の形態の
人工染色体構築物は、筋内経路、経皮経路、または皮内経路を経て、有利に投与
され得る。
経皮、表皮内、または筋内経路）、あるいは粘膜表面（例えば、眼球表面、鼻内
表面、肺表面、口腔表面、腸表面、直腸表面、膣表面、または尿路表面）を介し
て、投与され得る。ブピバカインと共に処方される人工染色体構築物（下記参照
のこと）は、筋肉組織内に有利に投与される。中性または陰イオン性リポソーム
あるいは陽イオン性脂質（例えばＤＯＴＭＡまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ（下記参照の
こと））が使用される場合、処方物は、静脈内経路、鼻内経路（エアロゾル化）
、筋内経路、経皮経路、または皮内経路を経て有利に注射され得る。裸の形態の
人工染色体構築物は、筋内経路、経皮経路、または皮内経路を経て、有利に投与
され得る。
【００３０】 哺乳動物において核酸分子の細胞内への導入のための、多くの周知の処方物の
いずれかが、本発明において使用され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎ
ａｒｏ編、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ
，ＰＡを参照のこと）。例えば、人工染色体構築物は、任意のパッケージングビ
ヒクルまたは送達ビヒクルを伴わない、裸の形態で使用され得る。人工染色体構
築物は、キャリアを伴いまたは伴なわず、生理学的に受容な溶液（例えば、滅菌
生理食塩水または滅菌緩衝化生理食塩水）に簡単に希釈され得る。人工染色体構
築物はまた、リン酸カルシウム溶液中で投与され得る。
いずれかが、本発明において使用され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎ
ａｒｏ編、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ
，ＰＡを参照のこと）。例えば、人工染色体構築物は、任意のパッケージングビ
ヒクルまたは送達ビヒクルを伴わない、裸の形態で使用され得る。人工染色体構
築物は、キャリアを伴いまたは伴なわず、生理学的に受容な溶液（例えば、滅菌
生理食塩水または滅菌緩衝化生理食塩水）に簡単に希釈され得る。人工染色体構
築物はまた、リン酸カルシウム溶液中で投与され得る。
【００３１】 人工染色体構築物はまた、核酸分子の細胞の取り込みを容易にする薬剤と会合
され得る。例えば、人工染色体構築物は、細胞透過性（例えば、ブピバカイン（
例えば、ＷＯ９４／１６７３７を参照のこと）を改変する化学薬剤で補足され得
るか、リポソーム内にカプセル化され得るか、あるいは陽イオン性脂質またはシ
リカ、金、またはタングステン微粒子と会合され得る。
され得る。例えば、人工染色体構築物は、細胞透過性（例えば、ブピバカイン（
例えば、ＷＯ９４／１６７３７を参照のこと）を改変する化学薬剤で補足され得
るか、リポソーム内にカプセル化され得るか、あるいは陽イオン性脂質またはシ
リカ、金、またはタングステン微粒子と会合され得る。
【００３２】 陰イオン性および中性リポソームは、当該分野で周知であり（例えば、リポソ
ームを作製するための方法の詳細な記載については、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＲＰＣ Ｎｅｗ Ｅｄ，ＩＲＬ ｐｒ
ｅｓｓ（１９９０）を参照のこと）、そして核酸分子を含む広範の産物の送達に
有用である。陽イオン脂質もまた、周知であり、そして遺伝子送達に一般に使用
される。このような脂質としては、以下が挙げられる；ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM （ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）としてもまた公知である）、ＤＯＴＡ
Ｐ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン
）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジ
オクタデシルアミドログリコシルスペルミン）およびコレステロール誘導体（例
えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カ
ルバモイル）コレステロール）。これらの陽イオン性脂質の記載は、ＥＰ１８７
，７０２、ＷＯ９０／１１０９２、米国特許第５，２８３，１８５号、ＷＯ９１
／１５５０１、ＷＯ９５／２６３５６、および米国特許第５，５２７，９２８号
に見出され得る。遺伝子送達のための陽イオン性脂質は、好ましくは、例えば、
ＷＯ９０／１１０９２に記載されるような、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジ
ルエタノールアミン）のような中性脂質と共に使用され得る。
ームを作製するための方法の詳細な記載については、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＲＰＣ Ｎｅｗ Ｅｄ，ＩＲＬ ｐｒ
ｅｓｓ（１９９０）を参照のこと）、そして核酸分子を含む広範の産物の送達に
有用である。陽イオン脂質もまた、周知であり、そして遺伝子送達に一般に使用
される。このような脂質としては、以下が挙げられる；ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM （ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）としてもまた公知である）、ＤＯＴＡ
Ｐ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン
）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジ
オクタデシルアミドログリコシルスペルミン）およびコレステロール誘導体（例
えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カ
ルバモイル）コレステロール）。これらの陽イオン性脂質の記載は、ＥＰ１８７
，７０２、ＷＯ９０／１１０９２、米国特許第５，２８３，１８５号、ＷＯ９１
／１５５０１、ＷＯ９５／２６３５６、および米国特許第５，５２７，９２８号
に見出され得る。遺伝子送達のための陽イオン性脂質は、好ましくは、例えば、
ＷＯ９０／１１０９２に記載されるような、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジ
ルエタノールアミン）のような中性脂質と共に使用され得る。
【００３３】 他のトランスフェクション促進化合物は、陽イオン性リポソームを含む処方物
に添加され得る。これらの化合物の多くは、例えば、ＷＯ９３／１８７５９、Ｗ
Ｏ９３／１９７６８、ＷＯ９４／２５６０８、およびＷＯ９５／２３９７に記載
される。これらとしては、例えば、核膜を通るＤＮＡの輸送を促進するために有
用なスペルミン誘導体（例えば、ＷＯ９３／１８７５９を参照のこと）、ならび
にＧＡＬＡ、グラミシジンＳおよび陽イオン性胆汁酸塩（例えば、ＷＯ９３／１
９７６８を参照のこと）のような、膜透過性化合物が挙げられる。
に添加され得る。これらの化合物の多くは、例えば、ＷＯ９３／１８７５９、Ｗ
Ｏ９３／１９７６８、ＷＯ９４／２５６０８、およびＷＯ９５／２３９７に記載
される。これらとしては、例えば、核膜を通るＤＮＡの輸送を促進するために有
用なスペルミン誘導体（例えば、ＷＯ９３／１８７５９を参照のこと）、ならび
にＧＡＬＡ、グラミシジンＳおよび陽イオン性胆汁酸塩（例えば、ＷＯ９３／１
９７６８を参照のこと）のような、膜透過性化合物が挙げられる。
【００３４】 金またはタングステン微粒子はまた、ＷＯ９１／３５９、ＷＯ９３／１７７０
６、およびＴａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２，１９９２）に記載され
るように、遺伝子送達のために使用され得る。この場合、微粒子コートされた核
酸分子は、注射針を伴なわない注射デバイス（「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ」
）を使用して、皮内経路または表皮内経路を経て注射され得る（例えば、米国特
許第４，９４５，０５０号、米国特許第、５，０１５，５８０号、およびＷＯ９
４／２４２６３に記載されるデバイス）。
６、およびＴａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２，１９９２）に記載され
るように、遺伝子送達のために使用され得る。この場合、微粒子コートされた核
酸分子は、注射針を伴なわない注射デバイス（「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ」
）を使用して、皮内経路または表皮内経路を経て注射され得る（例えば、米国特
許第４，９４５，０５０号、米国特許第、５，０１５，５８０号、およびＷＯ９
４／２４２６３に記載されるデバイス）。
【００３５】 投与されるべき人工染色体構築物の量は、例えば、達成されるべき特定の目標
、その構築物で使用される任意のプロモーターの強さ、投与が意図される哺乳動
物の状態（例えば、その哺乳動物の体重、年齢、そして一般的な健康状態）、投
与の形態、および処方物の型に依存する。一般に、例えば、約１ｎｇ〜約１ｍｇ
、好ましくは約１０μｇ〜約８００μｇの治療有効用量または予防的有効用量が
、ヒト成人に投与される。投与は、単一用量で達成され得るか、または間隔をお
いて繰り返され得る。
、その構築物で使用される任意のプロモーターの強さ、投与が意図される哺乳動
物の状態（例えば、その哺乳動物の体重、年齢、そして一般的な健康状態）、投
与の形態、および処方物の型に依存する。一般に、例えば、約１ｎｇ〜約１ｍｇ
、好ましくは約１０μｇ〜約８００μｇの治療有効用量または予防的有効用量が
、ヒト成人に投与される。投与は、単一用量で達成され得るか、または間隔をお
いて繰り返され得る。
【００３６】 治療的方法において使用され得ることに加え、本発明の人工染色体構築物を使
用して、インビトロで組換えウイルスを安価にかつ効率的に産生し得る。以前に
記載されたように、先行のウイルス産生方法は、細胞内への導入の際に完全なウ
イルスゲノムを生成するために組換えられるウイルスゲノムの部分を含むコスミ
ドのセットを使用していた。この方法は、ウイルスゲノムの不安定性を生じ得る
。本発明の人工染色体構築物は、複数のコスミドの間の組換えの必要性を回避し
て、産生されたウイルスゲノムの安定性の増強を導く。さらに、本発明の人工染
色体構築物（例えば、ＢＡＣを含む構築物）は、宿主系（例えば、細菌）内で増
殖され得、これは、哺乳動物細胞に対して有害であるウイルス遺伝子の存在によ
り不利に影響されない。このような構築物内への変異の導入のために、または組
換えウイルスベクターに含まれべき異種遺伝子の導入のために、標準的な方法が
使用され得る。
用して、インビトロで組換えウイルスを安価にかつ効率的に産生し得る。以前に
記載されたように、先行のウイルス産生方法は、細胞内への導入の際に完全なウ
イルスゲノムを生成するために組換えられるウイルスゲノムの部分を含むコスミ
ドのセットを使用していた。この方法は、ウイルスゲノムの不安定性を生じ得る
。本発明の人工染色体構築物は、複数のコスミドの間の組換えの必要性を回避し
て、産生されたウイルスゲノムの安定性の増強を導く。さらに、本発明の人工染
色体構築物（例えば、ＢＡＣを含む構築物）は、宿主系（例えば、細菌）内で増
殖され得、これは、哺乳動物細胞に対して有害であるウイルス遺伝子の存在によ
り不利に影響されない。このような構築物内への変異の導入のために、または組
換えウイルスベクターに含まれべき異種遺伝子の導入のために、標準的な方法が
使用され得る。
【００３７】 本発明の人工染色体構築物はまた、アンプリコンの組換えウイルス粒子への有
効なパッケージングを可能にし得る（例えば、ＷＯ９７／０５２６３を参照のこ
と）。アンプリコンは、調節配列（例えば、上述の任意のプロモーターまたはエ
ンハンサーのいずれか、および必要に応じてポリアデニル化配列のようなｍＲＮ
Ａのプロセシングを指向する配列）、ウイルスの複製起点、およびウイルスのパ
ッケージングシグナルの制御下の遺伝子（例えば、上述の異種の核酸配列のいず
れか）を含むプラスミドである。さらにＨＳＶに関して以下に記載されるように
、アンプリコンが、本発明の人工染色体構築物（これは細胞中に導入される際に
組換えウイルス形成を生じるウイルスＤＮＡを含む）とともに細胞に同時トラン
スフェクトされる場合、このアンプリコンは、ビリオン中にパッケージングされ
、従って有効な遺伝子送達ベクターを提供する。これらの方法を使用して生成さ
れる組換えウイルスは、例えば治療のためのウイルスベクター（例えば、遺伝子
治療）として使用され得る。
効なパッケージングを可能にし得る（例えば、ＷＯ９７／０５２６３を参照のこ
と）。アンプリコンは、調節配列（例えば、上述の任意のプロモーターまたはエ
ンハンサーのいずれか、および必要に応じてポリアデニル化配列のようなｍＲＮ
Ａのプロセシングを指向する配列）、ウイルスの複製起点、およびウイルスのパ
ッケージングシグナルの制御下の遺伝子（例えば、上述の異種の核酸配列のいず
れか）を含むプラスミドである。さらにＨＳＶに関して以下に記載されるように
、アンプリコンが、本発明の人工染色体構築物（これは細胞中に導入される際に
組換えウイルス形成を生じるウイルスＤＮＡを含む）とともに細胞に同時トラン
スフェクトされる場合、このアンプリコンは、ビリオン中にパッケージングされ
、従って有効な遺伝子送達ベクターを提供する。これらの方法を使用して生成さ
れる組換えウイルスは、例えば治療のためのウイルスベクター（例えば、遺伝子
治療）として使用され得る。
【００３８】 本発明の人工染色体構築物もまた、例えば、ウイルス産生のために使用し得る
細胞株を生成するための方法において用いられ得る。特定の例としては、ＨＳＶ
−ＢＡＣ構築物が作製され、ここにおいて、前初期遺伝子（すなわち、ＩＣＰ０
、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７およびＩＣＰ４７）の任意の一つまたは任
意の組み合わせが、上述のような標準的な方法を用いて改変されるかまたは欠失
されて作製され得る。必要に応じて、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシ
ン耐性遺伝子）のような選択マーカーをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムの
非必須領域（上述を参照のこと）またはＢＡＣに挿入し得る。次いで、この構築
物は、標準的な方法を用いて細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、上述を参照のこと）
にトランスフェクトされ得、そして挿入されたＨＳＶを含むクローンが、例えば
、抗生物質の存在下で細胞を培養することにより選択され得る。この様式におい
て産生される細胞は、不足している前初期遺伝子のために、さらなる操作なしで
はウイルスを産生しない。従って、細胞は、ウイルス産生に関連し得る細胞毒性
の非存在下で培養され得る。これらの細胞においてウイルス産生の誘導が所望さ
れる場合、不足している前初期遺伝子は、トランスフェクションによって、細胞
に導入され得る。
細胞株を生成するための方法において用いられ得る。特定の例としては、ＨＳＶ
−ＢＡＣ構築物が作製され、ここにおいて、前初期遺伝子（すなわち、ＩＣＰ０
、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７およびＩＣＰ４７）の任意の一つまたは任
意の組み合わせが、上述のような標準的な方法を用いて改変されるかまたは欠失
されて作製され得る。必要に応じて、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシ
ン耐性遺伝子）のような選択マーカーをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムの
非必須領域（上述を参照のこと）またはＢＡＣに挿入し得る。次いで、この構築
物は、標準的な方法を用いて細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、上述を参照のこと）
にトランスフェクトされ得、そして挿入されたＨＳＶを含むクローンが、例えば
、抗生物質の存在下で細胞を培養することにより選択され得る。この様式におい
て産生される細胞は、不足している前初期遺伝子のために、さらなる操作なしで
はウイルスを産生しない。従って、細胞は、ウイルス産生に関連し得る細胞毒性
の非存在下で培養され得る。これらの細胞においてウイルス産生の誘導が所望さ
れる場合、不足している前初期遺伝子は、トランスフェクションによって、細胞
に導入され得る。
【００３９】 これらの方法は、先行の方法（単一の細胞中に複数の、大きなプラスミドの同
時導入を必要とすることによって、効率が悪くそして高価である）よりも有意な
利点を提供する。さらに、例えば、本発明の細菌性の人工染色体構築物を使用す
る場合、細菌中で増殖された遺伝子の欠失または改変を実行させることを容易に
することが可能である。対照的に、細胞株を使用してこのことを達成する試みは
、不可能ではないが、極めて困難であった。最終的に、上記は、ＨＳＶ−ＢＡＣ
に関して記載されたが、これらの方法は、上述の人工染色体構築物のいずれかの
使用を利用して容易に適用され得る。
時導入を必要とすることによって、効率が悪くそして高価である）よりも有意な
利点を提供する。さらに、例えば、本発明の細菌性の人工染色体構築物を使用す
る場合、細菌中で増殖された遺伝子の欠失または改変を実行させることを容易に
することが可能である。対照的に、細胞株を使用してこのことを達成する試みは
、不可能ではないが、極めて困難であった。最終的に、上記は、ＨＳＶ−ＢＡＣ
に関して記載されたが、これらの方法は、上述の人工染色体構築物のいずれかの
使用を利用して容易に適用され得る。
【００４０】 （実験の結果） （組換えウイルスおよびＢＡＣプラスミドの生成） 本発明者らは、完全なＨＳＶゲノムのクローニングのために細菌性人工染色体
（ＢＡＣ）技術を使用した。プラスミドＢＡＣ−ＴＫを、細菌の染色体維持に必
要なシグナルおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子に隣接するウイルス性のｔ
ｋ配列とともに構築した（図１）。このプラスミドは、直線化され、そしてＶｅ
ｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）中にＨＳＶ−１感染性ＤＮＡとともに
同時トランスフェクトされた。得られたウイルスストックを１００μＭのアシク
ロビル（ＡＣＶ）を用いてスクリーニングし、そして耐性ウイルスを単離し、そ
してプラークを精製した。サザンブロット分析およびＰＣＲ分析で、ＢＡＣの挿
入およびｔｋ座を有するクロラムフェニコール配列を確認した。組換えウイルス
を、ＨＳＶ−ＶＡＣ−ＴＫと命名した。
（ＢＡＣ）技術を使用した。プラスミドＢＡＣ−ＴＫを、細菌の染色体維持に必
要なシグナルおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子に隣接するウイルス性のｔ
ｋ配列とともに構築した（図１）。このプラスミドは、直線化され、そしてＶｅ
ｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）中にＨＳＶ−１感染性ＤＮＡとともに
同時トランスフェクトされた。得られたウイルスストックを１００μＭのアシク
ロビル（ＡＣＶ）を用いてスクリーニングし、そして耐性ウイルスを単離し、そ
してプラークを精製した。サザンブロット分析およびＰＣＲ分析で、ＢＡＣの挿
入およびｔｋ座を有するクロラムフェニコール配列を確認した。組換えウイルス
を、ＨＳＶ−ＶＡＣ−ＴＫと命名した。
【００４１】 Ｖｅｒｏ細胞を３の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＨＳＶ−ＢＡＣ−ＴＫとと
もに２時間感染させ、収集し、そしてＤＮＡを以下の材料および方法に記載され
るように抽出した。単離した環状ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ中にエレクトロポレー
ションし、そして組換えコロニーを、クロラムフェニコールに対する耐性につい
てスクリーニングした。抗生物質に対して耐性である細菌をさらなる分析に供し
た。手短に言えば、ＤＮＡを１１のコロニーから抽出し、そしてＨＳＶ遺伝子Ｕ
Ｓ６、ＵＬ１０、ＵＬ３０およびＵＬ４０に対応するプライマーセットを用いる
ＰＣＲ分析に供した。試験した１１クローンの全ては、４つのプライマーセット
全てに対して陽性であった。ＤＮＡを、１１のクローンの８つから抽出し、そし
てＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この結果は、ＨＳ
Ｖの全てのゲノムがクローニングされたことを示した。
もに２時間感染させ、収集し、そしてＤＮＡを以下の材料および方法に記載され
るように抽出した。単離した環状ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ中にエレクトロポレー
ションし、そして組換えコロニーを、クロラムフェニコールに対する耐性につい
てスクリーニングした。抗生物質に対して耐性である細菌をさらなる分析に供し
た。手短に言えば、ＤＮＡを１１のコロニーから抽出し、そしてＨＳＶ遺伝子Ｕ
Ｓ６、ＵＬ１０、ＵＬ３０およびＵＬ４０に対応するプライマーセットを用いる
ＰＣＲ分析に供した。試験した１１クローンの全ては、４つのプライマーセット
全てに対して陽性であった。ＤＮＡを、１１のクローンの８つから抽出し、そし
てＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この結果は、ＨＳ
Ｖの全てのゲノムがクローニングされたことを示した。
【００４２】 （ＨＳＶ−ＢＡＣクローン由来の感染性ウイルス子孫のレスキュー） 元々の８、ｐ２５およびｐ２６由来の２つのクローンをさらなる分析のために
選択した。これらのＢＡＣプラスミドのトランスフェクションにより、プラーク
形成が２日後に生じた。レスキューしたウイルスを増幅し、そしてウイルスＤＮ
Ａを抽出し、そして制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した。レスキューした
ウイルスｒ２５およびｒ２６の制限エンドヌクレアーゼパターンは、ｐ２５、ｐ
２６およびＨＳＶ−ＢＡＣ−ＴＫのパターンと同一であった。レスキューしたウ
イルスが、親のウイルスと同様に振る舞うかどうかを決定するために、３つ全て
のウイルスを、増殖曲線の１つの工程において試験した（図２）。この結果は、
親の投入ウイルスの増殖率および長時間にわたるウイルスのレスキューにおいて
違いがほとんどあるいは全く存在しないことを示す。
選択した。これらのＢＡＣプラスミドのトランスフェクションにより、プラーク
形成が２日後に生じた。レスキューしたウイルスを増幅し、そしてウイルスＤＮ
Ａを抽出し、そして制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した。レスキューした
ウイルスｒ２５およびｒ２６の制限エンドヌクレアーゼパターンは、ｐ２５、ｐ
２６およびＨＳＶ−ＢＡＣ−ＴＫのパターンと同一であった。レスキューしたウ
イルスが、親のウイルスと同様に振る舞うかどうかを決定するために、３つ全て
のウイルスを、増殖曲線の１つの工程において試験した（図２）。この結果は、
親の投入ウイルスの増殖率および長時間にわたるウイルスのレスキューにおいて
違いがほとんどあるいは全く存在しないことを示す。
【００４３】 （ＨＳＶ ＵＬ５４変異体の構築および特徴づけ） ＨＳＶ変異体の構築において細菌性の遺伝能力を例示するために、必須ＨＳＶ
遺伝子であるＵＬ５４を、以下のように欠失させ得る。（図３Ａおよび３Ｂを参
照のこと）。ＵＬ５４遺伝子の遺伝子産物であるＩＣＰ２７は、ＨＳＶ感染にお
いて多くの役割を果たす。ウイルスの増殖に必須のこのタンパク質が、核におい
て広く見出され、ここでこれは、プレｍＲＮＡスプライシングを阻害し、宿主細
胞の小核リボヌクレオタンパク質粒子と相互作用し、ＲＮＡに結合し、イントロ
ン含有ｍＲＮＡの核原形質輸送を阻害し、そして後期ウイルスＲＮＡの輸出を促
進することにより、後期遺伝子タンパク質合成を調節する。
遺伝子であるＵＬ５４を、以下のように欠失させ得る。（図３Ａおよび３Ｂを参
照のこと）。ＵＬ５４遺伝子の遺伝子産物であるＩＣＰ２７は、ＨＳＶ感染にお
いて多くの役割を果たす。ウイルスの増殖に必須のこのタンパク質が、核におい
て広く見出され、ここでこれは、プレｍＲＮＡスプライシングを阻害し、宿主細
胞の小核リボヌクレオタンパク質粒子と相互作用し、ＲＮＡに結合し、イントロ
ン含有ｍＲＮＡの核原形質輸送を阻害し、そして後期ウイルスＲＮＡの輸出を促
進することにより、後期遺伝子タンパク質合成を調節する。
【００４４】 相同組換えのための隣接配列のクローニングのために、２つのプライマーセッ
トを使用し得る。１つのセットは、ＵＬ５４コード配列のすぐ上流に位置する配
列およびこの部位より約１ｋｂ上流（すなわち、ＵＬ５３遺伝子内）の配列に結
合する。第２のセットは、ＵＬ５４終止コドンのすぐ３’側の配列、およびこの
部位より約１ｋｂ下流（すなわち、ＵＬ５５遺伝子内）の配列に結合する。これ
らのプライマーを用いて生成されるＰＣＲフラグメントを、ｐｌａｃｉ中にクロ
ーニングし得、ｐ５３−ｌａｃｉ−５５を生成する。カナマイシンコード配列を
、ＰＣＲにより増幅し得、そしてｐ５３−ｌａｃｉ−ｋａｎ−ＵＬ５５を生成す
るために、ｐ５３−ｐｌａｃｉ−５５のα相補性ｌａｃＺ配列と共にインフレー
ムにクローニングし得る。このプラスミドとＢＡＣ ＤＮＡとの間の相同組換え
は、ＨＳＶ ＵＬ５４コード配列の、α相補性ｌａｃＺ／カナマイシン融合配列
を駆動するｌａｃｉプロモーターとの置換を生じる。ｐ５３−ｐｌａｃｉ−ｋａ
ｎ−５５配列は、プラスミドバックボーンから放出され得、ゲル精製され、そし
てｐ２５を含有するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換され得る。次いで
、組換えを、カナマイシンプレート、ＩＰＴＧプレートおよびクロラムフェニコ
ールプレートにおけるそれらの増殖能力についてスクリーニングし得る。サザン
ハイブリダイゼーションを用いて、変異の存在を確認し得る。
トを使用し得る。１つのセットは、ＵＬ５４コード配列のすぐ上流に位置する配
列およびこの部位より約１ｋｂ上流（すなわち、ＵＬ５３遺伝子内）の配列に結
合する。第２のセットは、ＵＬ５４終止コドンのすぐ３’側の配列、およびこの
部位より約１ｋｂ下流（すなわち、ＵＬ５５遺伝子内）の配列に結合する。これ
らのプライマーを用いて生成されるＰＣＲフラグメントを、ｐｌａｃｉ中にクロ
ーニングし得、ｐ５３−ｌａｃｉ−５５を生成する。カナマイシンコード配列を
、ＰＣＲにより増幅し得、そしてｐ５３−ｌａｃｉ−ｋａｎ−ＵＬ５５を生成す
るために、ｐ５３−ｐｌａｃｉ−５５のα相補性ｌａｃＺ配列と共にインフレー
ムにクローニングし得る。このプラスミドとＢＡＣ ＤＮＡとの間の相同組換え
は、ＨＳＶ ＵＬ５４コード配列の、α相補性ｌａｃＺ／カナマイシン融合配列
を駆動するｌａｃｉプロモーターとの置換を生じる。ｐ５３−ｐｌａｃｉ−ｋａ
ｎ−５５配列は、プラスミドバックボーンから放出され得、ゲル精製され、そし
てｐ２５を含有するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換され得る。次いで
、組換えを、カナマイシンプレート、ＩＰＴＧプレートおよびクロラムフェニコ
ールプレートにおけるそれらの増殖能力についてスクリーニングし得る。サザン
ハイブリダイゼーションを用いて、変異の存在を確認し得る。
【００４５】 ｐΔＵＬ５４と命名され得る正しい変異を有するクローンを、以下のようにさ
らに分析し得る。ｒΔＵＬ５４、ｐΔＵＬ５４からレスキューしたウイルス、ｒ
２５、ＨＳＶ−ＢＡＣ−ＴＫおよび野生型ＨＳＶのＦ株の増殖動力学を、２−２
およびＶｅｒｏ細胞において比較し得る。２−２細胞は、ＩＣＰ２７を恒常的に
発現する安定な細胞株であり、従って、ＵＬ５４欠損を補足し得る。４つ全ての
ウイルスは、２−２細胞において野生型のレベルに複製されることが予期された
が、ｒΔＵＬ５４は、Ｖｅｒｏ細胞において増殖することが予期されなかった。
レスキューした変異ウイルスまたは挿入プラスミドＤＮＡから抽出したＤＮＡの
制限エンドヌクレアーゼパターンは、変異誘発手順の間、安定を維持するＢＡＣ
プラスミドを確認するために実行し得る。
らに分析し得る。ｒΔＵＬ５４、ｐΔＵＬ５４からレスキューしたウイルス、ｒ
２５、ＨＳＶ−ＢＡＣ−ＴＫおよび野生型ＨＳＶのＦ株の増殖動力学を、２−２
およびＶｅｒｏ細胞において比較し得る。２−２細胞は、ＩＣＰ２７を恒常的に
発現する安定な細胞株であり、従って、ＵＬ５４欠損を補足し得る。４つ全ての
ウイルスは、２−２細胞において野生型のレベルに複製されることが予期された
が、ｒΔＵＬ５４は、Ｖｅｒｏ細胞において増殖することが予期されなかった。
レスキューした変異ウイルスまたは挿入プラスミドＤＮＡから抽出したＤＮＡの
制限エンドヌクレアーゼパターンは、変異誘発手順の間、安定を維持するＢＡＣ
プラスミドを確認するために実行し得る。
【００４６】 （アンプリコンをパッケージングするＨＳＶ−ＢＡＣ ＤＮＡ） ＨＳＶに基づくベクターが、遺伝子転移に広範に使用されている。ＨＳＶプラ
スミドベクター（アンプリコン）は、真核生物発現カセットおよび複製およびパ
ッケージングのためのＨＳＶシグナルを含む。アンプリコンベクターは、ヘルパ
ーウイルスと、野生型ウイルス、複製欠損ウイルス、またはＨＳＶコスミドから
生成されたウイルスのいずれかとを同時増殖する場合、ビリオン中で複製および
パッケージングされる。実際に、改変されたコスミドセットを用いて、夾雑する
ヘルパーウイルスを含まないアンプリコンの調製物が生成されている（Ｆｒａｅ
ｆｅｌら、前出）。しかし、ヘルペスウイルスコスミドは、欠失および再構成し
がちであり、そしてさらに、しばしば天然において不均質である。ＨＳＶのＢＡ
Ｃクローンは、これらの問題を克服する。
スミドベクター（アンプリコン）は、真核生物発現カセットおよび複製およびパ
ッケージングのためのＨＳＶシグナルを含む。アンプリコンベクターは、ヘルパ
ーウイルスと、野生型ウイルス、複製欠損ウイルス、またはＨＳＶコスミドから
生成されたウイルスのいずれかとを同時増殖する場合、ビリオン中で複製および
パッケージングされる。実際に、改変されたコスミドセットを用いて、夾雑する
ヘルパーウイルスを含まないアンプリコンの調製物が生成されている（Ｆｒａｅ
ｆｅｌら、前出）。しかし、ヘルペスウイルスコスミドは、欠失および再構成し
がちであり、そしてさらに、しばしば天然において不均質である。ＨＳＶのＢＡ
Ｃクローンは、これらの問題を克服する。
【００４７】 ＨＳＶ−ＢＡＣクローンの安定性を評価するために、ＨＳＶコスミドクローン
と比較する場合、本発明者らは、１、３、または７日間のいずれかで連続的に増
殖させた細菌培養物から単離したＤＮＡを精製および消化した（１および７日目
に採取したサンプルから得た結果を図４に示す）。ｐ２５の制限エンドヌクレア
ーゼパターンは、この期間を通して非電荷を維持したが、コスミド１４（Ｃｕｎ
ｎｉｎｇｈａｍら、前出）の制限エンドヌクレアーゼパターンは、激しく変化し
ていた。細菌集団における不均一性を、ｐ２５またはコスミド４８（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍら、前出）のいずれかを含むＥ．ｃｏｌｉをストリーキングアウトす
るとおよび５つのクローンそれぞれをミニプレップすることによって評価した。
この結果は、コスミドクローンを含むＥ．ｃｏｌｉが、天然においては、不均質
であるが、ＢＡＣクローンを含むＥ．ｃｏｌｉは、均質であることを示した。従
って、ＢＡＣにおけるＨＳＶ配列の維持は、治療目的のための均質な感染性のウ
イルスＤＮＡの産生に好ましい。
と比較する場合、本発明者らは、１、３、または７日間のいずれかで連続的に増
殖させた細菌培養物から単離したＤＮＡを精製および消化した（１および７日目
に採取したサンプルから得た結果を図４に示す）。ｐ２５の制限エンドヌクレア
ーゼパターンは、この期間を通して非電荷を維持したが、コスミド１４（Ｃｕｎ
ｎｉｎｇｈａｍら、前出）の制限エンドヌクレアーゼパターンは、激しく変化し
ていた。細菌集団における不均一性を、ｐ２５またはコスミド４８（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍら、前出）のいずれかを含むＥ．ｃｏｌｉをストリーキングアウトす
るとおよび５つのクローンそれぞれをミニプレップすることによって評価した。
この結果は、コスミドクローンを含むＥ．ｃｏｌｉが、天然においては、不均質
であるが、ＢＡＣクローンを含むＥ．ｃｏｌｉは、均質であることを示した。従
って、ＢＡＣにおけるＨＳＶ配列の維持は、治療目的のための均質な感染性のウ
イルスＤＮＡの産生に好ましい。
【００４８】 トランス機能を、アンプリコンプラスミドＤＮＡをパッケージングするために
ＨＳＶ−ＢＡＣ ＤＮＡの能力を決定することにより試験した。ＩＥ４／５プロ
モーターの制御下にある緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むアンプリコ
ンプラスミド、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（ｐＨＳＶＬ
ａｃ）の制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を含むアンプリコンプラスミドを、トラン
スフェクトしたｐ２５、ＨＳＶコスミドＤＮＡ（６、２８、１４、５６、および
４８；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、前出）、または感染性のＦ株ウイルスＤＮＡ（
ＡＴＣＣ ＶＲ−７３３）のいずれかと共に同時増殖させた。４日後に細胞を収
穫し、そして感染性粒子を、新鮮な単一層に感染させ、そして緑色細胞、または
青色細胞のいずれかのプラークを数えることにより力価決定した（表２）。この
結果は、ＨＳＶ−ＢＡＣ ＤＮＡが、コスミドＤＮＡおよび感染性ウイルスＤＮ
Ａよりも、より効率的にアンプリコンをパッケージングし得ることを示した。こ
れらのデータは、適切な改変を有するＨＳＶ−ＢＡＣが、遺伝子転移の強力なベ
クターとして使用され得ることを示す。
ＨＳＶ−ＢＡＣ ＤＮＡの能力を決定することにより試験した。ＩＥ４／５プロ
モーターの制御下にある緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含むアンプリコ
ンプラスミド、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（ｐＨＳＶＬ
ａｃ）の制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を含むアンプリコンプラスミドを、トラン
スフェクトしたｐ２５、ＨＳＶコスミドＤＮＡ（６、２８、１４、５６、および
４８；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、前出）、または感染性のＦ株ウイルスＤＮＡ（
ＡＴＣＣ ＶＲ−７３３）のいずれかと共に同時増殖させた。４日後に細胞を収
穫し、そして感染性粒子を、新鮮な単一層に感染させ、そして緑色細胞、または
青色細胞のいずれかのプラークを数えることにより力価決定した（表２）。この
結果は、ＨＳＶ−ＢＡＣ ＤＮＡが、コスミドＤＮＡおよび感染性ウイルスＤＮ
Ａよりも、より効率的にアンプリコンをパッケージングし得ることを示した。こ
れらのデータは、適切な改変を有するＨＳＶ−ＢＡＣが、遺伝子転移の強力なベ
クターとして使用され得ることを示す。
【００４９】 （材料および方法） （ウイルスおよび細胞） Ｖｅｒｏ細胞およびＶｅｒｏ２−２細胞を増殖させ、そしてＣｏｅｎら（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ １６８：２２１−２３１、１９８９）により記載されるようにし
て、薬物感受性についてアッセイした。ウイルスの力価を、Ｖｅｒｏ細胞につい
て三連で決定した。組換えウイルスを２回プラーク精製し、そして改変をサザン
ブロットハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ分析により確認した。
ｒｏｌｏｇｙ １６８：２２１−２３１、１９８９）により記載されるようにし
て、薬物感受性についてアッセイした。ウイルスの力価を、Ｖｅｒｏ細胞につい
て三連で決定した。組換えウイルスを２回プラーク精製し、そして改変をサザン
ブロットハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ分析により確認した。
【００５０】 （プラスミド） プラスミドｐＴＫ−ＡＢを、ｐＸｈｏＩｆ（プラスミドｐＡＴ１５３中にクロ
ーン化されたＨＳＶ−１株１７のＸｈｏＩ Ｆフラグメント）由来のＢｇｌＩＩ
／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＳＶｌａｃのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位へサ
ブクローニングすることにより作製した（Ｇｅｌｌｅｒら、前出）。ｔｋ−含有
プラスミド、ＢＨ１３（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、Ｃｅｌｌ ８６（６）：９４９
−９５９、１９９６）を、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｔｋ遺伝子の３’
末端を放出し、そしてこのフラグメントをｐＳＣ１１８０のＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ
部位にサブクローニングし、プラスミドＴＫ−ＣＤを作製した。プラスミドＴＫ
−ＡＢおよびＴＫ−ＣＤを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＭｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ／
ＳａｌＩでそれぞれ消化し、そして得られたフラグメントをｐＢｅｌｏＢＡＣ（
Ｄｒ．Ｈ．ＳｈｉｚｕｙａおよびＤｒ．Ｍ．Ｓｉｍｏｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）のＨｐａＩ／ＳａｌＩ部位に
サブクローニングし、プラスミドｐＢＡＣ−ＴＫを作製した（図１）。
ーン化されたＨＳＶ−１株１７のＸｈｏＩ Ｆフラグメント）由来のＢｇｌＩＩ
／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＳＶｌａｃのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位へサ
ブクローニングすることにより作製した（Ｇｅｌｌｅｒら、前出）。ｔｋ−含有
プラスミド、ＢＨ１３（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、Ｃｅｌｌ ８６（６）：９４９
−９５９、１９９６）を、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｔｋ遺伝子の３’
末端を放出し、そしてこのフラグメントをｐＳＣ１１８０のＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ
部位にサブクローニングし、プラスミドＴＫ−ＣＤを作製した。プラスミドＴＫ
−ＡＢおよびＴＫ−ＣＤを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＭｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ／
ＳａｌＩでそれぞれ消化し、そして得られたフラグメントをｐＢｅｌｏＢＡＣ（
Ｄｒ．Ｈ．ＳｈｉｚｕｙａおよびＤｒ．Ｍ．Ｓｉｍｏｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）のＨｐａＩ／ＳａｌＩ部位に
サブクローニングし、プラスミドｐＢＡＣ−ＴＫを作製した（図１）。
【００５１】 ｐＬａｃｉを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＳ
ａｃＩおよびＮａｅＩを用いて消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑
末端にし、そして再連結することにより生成した。ＵＬ５３、ＵＬ５５およびカ
ナマイシン配列を、それぞれ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＫｐｎＩ／
ＸｈｏＩ部位を含むプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した（表１）。ＵＬ５
３フラグメントをＰｖｕＩＩを用いて消化し、そしてｐＬａｃｉに特有のＰｖｕ
ＩＩ部位にクローニングし、ＵＬ５３−ｐＬａｃｉを作製した。フラグメントの
配向を、制限酵素消化により確認した。同様に、ＵＬ５５フラグメントをＨｉｎ
ｄＩＩＩを用いて消化し、そしてＵＬ５３−ｐＬａｃｉのＨｉｎｄＩＩＩ部位に
クローニングし、ＵＬ５３−ｐＬａｃｉ−ＵＬ５５を作製した。この配向を制限
酵素消化により確認した。カナマイシンフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＸｈｏ
Ｉを用いて消化し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩで消化したＵＬ５３−ｐＬａｃｉ−ＵＬ
５４にクローニングした。これは、ｌａｃＺ α相補体およびカナマイシン配列
のインフレーム融合を生じる。このプラスミドを、ＵＬ−５３−ｐＬａｃｉ−ｋ
ａｎ−ＵＬ５５と命名した。ｐＨＳＶ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を、ｐＨ
ＳＶＬａｃ（Ｇｅｌｌｅｒ、前出）中のｌａｃＺ配列をＧＦＰ配列と置換するこ
とにより構築した。
ａｃＩおよびＮａｅＩを用いて消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑
末端にし、そして再連結することにより生成した。ＵＬ５３、ＵＬ５５およびカ
ナマイシン配列を、それぞれ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＫｐｎＩ／
ＸｈｏＩ部位を含むプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した（表１）。ＵＬ５
３フラグメントをＰｖｕＩＩを用いて消化し、そしてｐＬａｃｉに特有のＰｖｕ
ＩＩ部位にクローニングし、ＵＬ５３−ｐＬａｃｉを作製した。フラグメントの
配向を、制限酵素消化により確認した。同様に、ＵＬ５５フラグメントをＨｉｎ
ｄＩＩＩを用いて消化し、そしてＵＬ５３−ｐＬａｃｉのＨｉｎｄＩＩＩ部位に
クローニングし、ＵＬ５３−ｐＬａｃｉ−ＵＬ５５を作製した。この配向を制限
酵素消化により確認した。カナマイシンフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＸｈｏ
Ｉを用いて消化し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩで消化したＵＬ５３−ｐＬａｃｉ−ＵＬ
５４にクローニングした。これは、ｌａｃＺ α相補体およびカナマイシン配列
のインフレーム融合を生じる。このプラスミドを、ＵＬ−５３−ｐＬａｃｉ−ｋ
ａｎ−ＵＬ５５と命名した。ｐＨＳＶ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を、ｐＨ
ＳＶＬａｃ（Ｇｅｌｌｅｒ、前出）中のｌａｃＺ配列をＧＦＰ配列と置換するこ
とにより構築した。
【００５２】 （ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）） ＰＣＲ−増幅フラグメントを、テンプレートとしてウイルスゲノムＤＮＡまた
はプラスミドＤＮＡを使用して得、そしてこのオリゴヌクレオチドをプライマー
として表１に列挙した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い
て、目的の領域を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）の推奨に従って増幅し、そして３０サイ
クル（９５℃、１分間、５５℃、１分間、７２℃、１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００にて実行した。
はプラスミドＤＮＡを使用して得、そしてこのオリゴヌクレオチドをプライマー
として表１に列挙した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い
て、目的の領域を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）の推奨に従って増幅し、そして３０サイ
クル（９５℃、１分間、５５℃、１分間、７２℃、１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００にて実行した。
【００５３】 （ウイルス構築物） プラスミドＢＡＣ−ＴＫを、Ｃｈｉｏｕら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４５（２）
：２１３−２２６、１９８５）によって記載されるように、ＨｉｎｄＩＩＩを用
いて消化し、そして感染性ＨＳＶ−１のＦ株ＤＮＡとともにＶｅｒｏ細胞に同時
トランスフェクトした。１００μＭのアシクロビル（ＡＣＶ）に対して耐性であ
るプラーク由来のＤＮＡを、クロラムフェニコール配列（表１）に対応するプラ
イマーを用いてＰＣＲによりスクリーニングした。２つの独立したトランスフェ
クションの各々から、１つの組換えウイルスを２回プラーク精製し、そして変異
をサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。このウイルスを、Ｈ
ＳＶ−ＢＡＣと命名した。
：２１３−２２６、１９８５）によって記載されるように、ＨｉｎｄＩＩＩを用
いて消化し、そして感染性ＨＳＶ−１のＦ株ＤＮＡとともにＶｅｒｏ細胞に同時
トランスフェクトした。１００μＭのアシクロビル（ＡＣＶ）に対して耐性であ
るプラーク由来のＤＮＡを、クロラムフェニコール配列（表１）に対応するプラ
イマーを用いてＰＣＲによりスクリーニングした。２つの独立したトランスフェ
クションの各々から、１つの組換えウイルスを２回プラーク精製し、そして変異
をサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。このウイルスを、Ｈ
ＳＶ−ＢＡＣと命名した。
【００５４】 （ＨＳＶ−ＢＡＣ ＤＮＡおよびＢＡＣプラスミドの単離） コンフルエントなＶｅｒｏ細胞の１００ｍｍ皿を、３の感染多重度でＨＳＶ−
ＢＡＣを用いて感染させた。感染を２時間の間行い、この上清を取り除き、そし
て１ｍｌのＤＮＡｚｏｌｅ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。製造者のプロトコルに従
う細胞溶解物から得たＤＮＡを、１００μｌのＴＥに再懸濁した。１μｌのＤＮ
Ａを等量の水に添加し、そして２５μｌのエレクトロ−コンピテントなＥ．ｃｏ
ｌｉ（ＤＨ１０Ｂ株（Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２
０４：６３−１１３、１９９１））に、細胞ポレーター（ｃｅｌｌ−ｐｏｒａｔ
ｏｒ）（Ｇｉｂｃｏ）を用い、そして製造者により推奨される条件でエレクトロ
ポレーションした。この細菌を、ＬＢ培養液中で３７℃にてインキュベートする
ことにより回収し得、クロラムフェニコール（１２．５ｎｇ／ｍｌ）を含むＬＢ
寒天培地上にプレートし、そして３７℃にて一晩インキュベートした。ＢＡＣプ
ラスミドをアルカリ溶解手順を用いてＥ．ｃｏｌｉから単離し、そしてＰＣＲに
よりスクリーニングした。４セットのプライマーを用いて、ＵＳ６、ＵＬ１０、
ＵＬ３０およびＵＬ４０の配列（表１）を増幅した。全てのプライマーセットに
陽性であるクローン由来の２μｇのＤＮＡを、１８μｌのリポフェクトアミン（
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いて１００ｍｍの皿のＶｅｒｏ細胞にトラン
スフェクトし、そして３４℃にてインキュベートした。ウイルスプラークをトラ
ンスフェクション後、２日間観察した。
ＢＡＣを用いて感染させた。感染を２時間の間行い、この上清を取り除き、そし
て１ｍｌのＤＮＡｚｏｌｅ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。製造者のプロトコルに従
う細胞溶解物から得たＤＮＡを、１００μｌのＴＥに再懸濁した。１μｌのＤＮ
Ａを等量の水に添加し、そして２５μｌのエレクトロ−コンピテントなＥ．ｃｏ
ｌｉ（ＤＨ１０Ｂ株（Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２
０４：６３−１１３、１９９１））に、細胞ポレーター（ｃｅｌｌ−ｐｏｒａｔ
ｏｒ）（Ｇｉｂｃｏ）を用い、そして製造者により推奨される条件でエレクトロ
ポレーションした。この細菌を、ＬＢ培養液中で３７℃にてインキュベートする
ことにより回収し得、クロラムフェニコール（１２．５ｎｇ／ｍｌ）を含むＬＢ
寒天培地上にプレートし、そして３７℃にて一晩インキュベートした。ＢＡＣプ
ラスミドをアルカリ溶解手順を用いてＥ．ｃｏｌｉから単離し、そしてＰＣＲに
よりスクリーニングした。４セットのプライマーを用いて、ＵＳ６、ＵＬ１０、
ＵＬ３０およびＵＬ４０の配列（表１）を増幅した。全てのプライマーセットに
陽性であるクローン由来の２μｇのＤＮＡを、１８μｌのリポフェクトアミン（
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いて１００ｍｍの皿のＶｅｒｏ細胞にトラン
スフェクトし、そして３４℃にてインキュベートした。ウイルスプラークをトラ
ンスフェクション後、２日間観察した。
【００５５】 （ＢＡＣ変異原性） ｐ２５含有細菌を、ＣａＣｌ2処理によりコンピテントにした。ｐＵＬ５３− ｐＬａｃｉ−ｋａｎ−ＵＬ５５を、ＸｂａＩ、ＭｌｕＩおよびＳｃａＩを用いて
消化し、そしてＵＬ５３−ｐＬａｃｉ−ｋａｎ−ＵＬ５５配列をゲル精製し、そ
してコンピテントなｐ２５ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。この細菌を１ｍＭ
のＩＰＴＧ存在下で３７℃にて２時間回復させ、次いで、カナマイシン／ＩＰＴ
Ｇプレート（それぞれ、５ｍｇ／ｍｌおよび１ｍＭ）上にプレートアウトした。
変異をＰＣＲおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。改
変ウイルスを、２−２細胞およびＶｅｒｏ細胞での増殖について試験した。
消化し、そしてＵＬ５３−ｐＬａｃｉ−ｋａｎ−ＵＬ５５配列をゲル精製し、そ
してコンピテントなｐ２５ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。この細菌を１ｍＭ
のＩＰＴＧ存在下で３７℃にて２時間回復させ、次いで、カナマイシン／ＩＰＴ
Ｇプレート（それぞれ、５ｍｇ／ｍｌおよび１ｍＭ）上にプレートアウトした。
変異をＰＣＲおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。改
変ウイルスを、２−２細胞およびＶｅｒｏ細胞での増殖について試験した。
【００５６】 （アンプリコンの生成） ２−２細胞を、Ｆｒａｅｆｅｌら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１０）：７１９０
−７１９７、１９９６）によって記載されるように、ｐ２５、ＨＳＶコスミドセ
ット６、２８、１４、５６および４８（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、前出）、また
は感染性ＨＳＶ Ｆ株のＤＮＡのいずれかの１、２、または４μｇ、ならびに１
ｇのｐＨＳＶ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。細胞を、４日後に収穫し
、凍結および解凍を３回行い、この細胞細片を遠心分離により取り除き、そして
この上清を用いて新鮮な単一層に感染させた。力価をウイルスプラークおよび形
質導入された緑色細胞を計数することにより算出した。
−７１９７、１９９６）によって記載されるように、ｐ２５、ＨＳＶコスミドセ
ット６、２８、１４、５６および４８（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、前出）、また
は感染性ＨＳＶ Ｆ株のＤＮＡのいずれかの１、２、または４μｇ、ならびに１
ｇのｐＨＳＶ−ＧＦＰを用いてトランスフェクトした。細胞を、４日後に収穫し
、凍結および解凍を３回行い、この細胞細片を遠心分離により取り除き、そして
この上清を用いて新鮮な単一層に感染させた。力価をウイルスプラークおよび形
質導入された緑色細胞を計数することにより算出した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】 本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が参考として援用される
。他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内である。
。他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】 図１は、プラスミドＢＡＣ−ＴＫのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの概略図であ
る。フラグメントＡＢおよびＣＤは、それぞれＨＳＶ−１系統第１７ゲノムの、
ヌクレオチド４７８６０−４７１５０および４７０５７−４５５８２に対応する
（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ１４１１２、Ｏ００３１７、Ｏ００３７４、および
Ｓ４０５９３）。「Ｈ」は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を示し、そして「ｃｍ」お
よび「ｔｋ」は、それぞれクロラムフェニコールコード配列およびチミジンキナ
ーゼコード配列を示す。
る。フラグメントＡＢおよびＣＤは、それぞれＨＳＶ−１系統第１７ゲノムの、
ヌクレオチド４７８６０−４７１５０および４７０５７−４５５８２に対応する
（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ１４１１２、Ｏ００３１７、Ｏ００３７４、および
Ｓ４０５９３）。「Ｈ」は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を示し、そして「ｃｍ」お
よび「ｔｋ」は、それぞれクロラムフェニコールコード配列およびチミジンキナ
ーゼコード配列を示す。
【図２】 図２は、ＨＳＶ−ＢＡＣ、ｒ２５、およびｒ２６の一段階増殖曲線を示すグラ
フである（実験結果は以下を参照のこと）。
フである（実験結果は以下を参照のこと）。
【図３Ａ】 図３Ａは、ＨＳＶ−ＢＡＣ変異誘発を実行するための方法の概略図である。手
短には、相同組換えが、ＨＳＶ−ＢＡＣと、（ｉ）ＵＬ５３に対して相補的な配
列（「５３ｓｅｑ」）、（ｉｉ）カナマイシン遺伝子（「ｋａｎ」）、および（
ｉｉｉ）ＵＬ５５に対して相補的な配列（「５５ｓｅｑ」）を含む構築物との間
で実行され、ＵＬ５４遺伝子において生じる（ＵＬ５４遺伝子は、ＨＳＶゲノム
中のＵＬ５３遺伝子とＵＬ５５遺伝子との間に存在し、カナマイシン遺伝子によ
って置換されている）。
短には、相同組換えが、ＨＳＶ−ＢＡＣと、（ｉ）ＵＬ５３に対して相補的な配
列（「５３ｓｅｑ」）、（ｉｉ）カナマイシン遺伝子（「ｋａｎ」）、および（
ｉｉｉ）ＵＬ５５に対して相補的な配列（「５５ｓｅｑ」）を含む構築物との間
で実行され、ＵＬ５４遺伝子において生じる（ＵＬ５４遺伝子は、ＨＳＶゲノム
中のＵＬ５３遺伝子とＵＬ５５遺伝子との間に存在し、カナマイシン遺伝子によ
って置換されている）。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、図３Ａに対する参照において上記の相同組換えの事象が生じるクロ
ーンを特徴付けるために使用され得るＰＣＲ分析の概略図である。
ーンを特徴付けるために使用され得るＰＣＲ分析の概略図である。
【図４】 図４は、ＢＡＣプラスミドｐ２５の安定性をコスミド１４の安定性と比較した
実験（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７（１）：１１６−１
２４、１９９３）の結果を示すゲルの写真である。
実験（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７（１）：１１６−１
２４、１９９３）の結果を示すゲルの写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 39/00 Ａ６１Ｋ 37/02 48/00 37/24 (72)発明者 クイアン， ドン カナダ国 ブイ６エス １エックス４ ブ リティッシュ コロンビア， バンクーバ ー， アケイディアン 311−2730 (72)発明者 トゥファロ， フランシス カナダ国 ブイ６エス １エックス４ ブ リティッシュ コロンビア， バンクーバ ー， ウエスト 30ティーエイチ アベニ ュー 4027 (72)発明者 オストロブ， ジェフリー カナダ国 ブイ７ダブリュー ２エス１ ブリティッシュ コロンビア， ウエスト バンクーバー， マリン ドライブ 5825 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA02 DA02 EA02 EA04 GA11 HA17 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA02 CA44 4C084 AA13 AA14 BA44 CA01 CA59 DA01 DA12 DA21 DA25 DA32 DB01 DB52 DC01 NA14 ZA702 ZA812 ZA892 ZB022 ZB072 ZB212 ZB261 ZC032 ZC042 ZC062 ZC082 4C085 AA03 BB01 DD62 DD63 4C087 AA01 AA03 BC83 CA12 NA14 ZA70 ZA81 ZA89 ZB02 ZB07 ZB21 ZB26 ZC03 ZC04 ZC06 ZC08
Claims (20)
- 【請求項１】 細胞に導入する際に組換えウイルスの形成を指向する核酸配
列を含む、人工染色体構築物。 - 【請求項２】 前記組換えウイルスが溶解性ウイルスである、請求項１に記
載の人工染色体構築物。 - 【請求項３】 前記組換えウイルスが非溶解性ウイルスである、請求項１に
記載の人工染色体構築物。 - 【請求項４】 前記人工染色体または前記核酸配列が異種核酸配列をさらに
含む、請求項１に記載の人工染色体構築物。 - 【請求項５】 前記異種核酸配列が治療用遺伝子産物をコードする、請求項
４に記載の人工染色体構築物。 - 【請求項６】 前記治療用遺伝子産物が、成長因子、ホルモン、酵素、ワク
チン抗原、細胞毒、免疫調節タンパク質、アンチセンスＲＮＡ分子、およびリボ
ザイムからなる群より選択される、請求項５に記載の人工染色体構築物。 - 【請求項７】 前記人工染色体が、細菌の人工染色体、Ｐ１由来の人工染色
体、酵母の人工染色体、および哺乳動物の人工染色体からなる群より選択される
、請求項１に記載の人工染色体構築物。 - 【請求項８】 前記人工染色体が細菌の人工染色体である、請求項５に記載
の人工染色体構築物。 - 【請求項９】 前記組換えウイルスがヘルペスウイルスである、請求項１に
記載の人工染色体構築物。 - 【請求項１０】 前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請
求項９に記載の人工染色体構築物。 - 【請求項１１】 組換えウイルスを細胞内で産生する方法であって、該方法
は、請求項１に記載の人工染色体構築物を該細胞に導入する工程を包含する、方
法。 - 【請求項１２】 前記細胞が哺乳動物中にある、請求項１１に記載の方法。
- 【請求項１３】 異種核酸配列を細胞に導入する方法であって、該方法は、
請求項４に記載の人工染色体構築物を該細胞に導入する工程を包含する、方法。 - 【請求項１４】 前記細胞が哺乳動物中にある、請求項１３に記載の方法。
- 【請求項１５】 細胞を殺傷する方法であって、該方法は、請求項２に記載
の人工染色体構築物を該細胞に導入する工程を包含する、方法。 - 【請求項１６】 前記細胞が哺乳動物中にある、請求項１５に記載の方法。
- 【請求項１７】 前記細胞が癌細胞である、請求項１５に記載の方法。
- 【請求項１８】 請求項１１に記載の方法であって、該方法が、前記人工染
色体構築物の前記細胞への導入において、組換えビリオン内にパッケージングさ
れたアンプリコンを該細胞内に導入する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項１９】 ゲノム内に安定に組み込まれる人工染色体構築物を含む、
細胞。 - 【請求項２０】 請求項１９に記載の細胞であって、ここで、前記人工染色
体構築物が、前初期遺伝子が変異を含むＨＳＶゲノムをコードする核酸配列を含
む、細胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/031,006 | 1998-02-26 | ||
| US09/031,006 US6277621B1 (en) | 1998-02-26 | 1998-02-26 | Artificial chromosome constructs containing foreign nucleic acid sequences |
| PCT/IB1999/000285 WO1999043842A1 (en) | 1998-02-26 | 1999-01-29 | Artificial chromosome constructs containing nucleic acid sequences capable of directing the formation of a recombinant virus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002504382A true JP2002504382A (ja) | 2002-02-12 |
Family
ID=21857171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000533581A Pending JP2002504382A (ja) | 1998-02-26 | 1999-01-29 | 組換えウイルスの形成を指向し得る核酸配列を含む人工染色体構築物 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1056878B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002504382A (ja) |
| AT (1) | ATE335086T1 (ja) |
| AU (1) | AU765521B2 (ja) |
| CA (1) | CA2321964C (ja) |
| DE (1) | DE69932599T2 (ja) |
| ES (1) | ES2270580T3 (ja) |
| WO (1) | WO1999043842A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009284857A (ja) * | 2008-05-30 | 2009-12-10 | Univ Of Tokyo | 組換えウイルス、これを保持する大腸菌およびその製造法 |
| WO2010038904A1 (ja) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | 国立大学法人鳥取大学 | 外来性核初期化因子またはそれをコードするｄｎａを含まない人工多能性幹細胞およびその作製方法 |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19733364A1 (de) * | 1997-08-01 | 1999-02-04 | Koszinowski Ulrich H Prof | Verfahren zur Klonierung eines großen Virusgenoms |
| US6277621B1 (en) * | 1998-02-26 | 2001-08-21 | Medigene, Inc. | Artificial chromosome constructs containing foreign nucleic acid sequences |
| WO2000034497A2 (en) * | 1998-12-09 | 2000-06-15 | The General Hospital Corporation | Enhanced packaging of herpes virus amplicons and generation of recombinant virus vectors |
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