JP2002503099A - ヒトのセマホリンｅおよびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規ポリヌクレオチドおよびそれによりコードされる蛋白を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのセマホリンＥおよびそれをコードするポリヌクレオチド 本願は、１９９６年８月２３日に出願され１９９７年８月５日に米国特許第５ ６５４４７３号として特許付与された特許出願第０８／７０２０８０号の分割出 願である、１９９７年５月１９日出願の第０８／８５８８３４号の一部継続出願 であり、参照によりそれらすべてを本明細書に記載されているものとみなす。 発明の分野 本発明は新規なポリヌクレオチドおよびかかるポリヌクレオチドによりコード される蛋白、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよび蛋白に関する治療的、診 断的および研究的有用性を提供する。 発明の背景 蛋白性因子（例えば、リンホカイン、インターフェロン、ＣＳＦｓおよびイン ターロイキンのごときサイトカインを含む）の発見を目的とした方法はこの１０ 年間に急速に成熟した。現在では常套的なハイブリダイゼーションクローニング および発現クローニング法は、発見された蛋白に直接関連した情報（すなわち、 ハイブリダイゼーションクローニングの場合には蛋白の部分ＤＮＡ／アミノ酸配 列；発現クローニングの場合には蛋白の活性）に依存するという意味において、 新規ポリペプチドを「直接的に」クローン化する。シグナル配列クローニング（ 現在よく認識されている分泌リーダー配列モチーフの存在に基づいてＤＮＡ配列 を単離する）、ならびに種々のＰＣＲによるあるいは低い厳密性によるハイブリ ダイゼーションクローニング法のごとき、より最近の「間接的」クローニング法 は、リーダー配列のクローニングの場合には分泌されるという性質により、ある いはＰＣＲによる方法の場合には細胞または組織源により、生物学的活性を有す ることが知られている蛋白に関する多数のＤＮＡ／アミノ酸配列を使用可能にす ることによって現状を進歩させて きた。本発明はこれらの蛋白およびそれらをコードするポリヌクレオチドに指向 されるものである。 発明の概要 １の具体例において、本発明は、下記のものからなる群より選択される単離ポ リヌクレオチドを含む組成物を提供する： （ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１のヌクレオチド２４５からヌクレオチド２４９７までのヌ クレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：１のヌクレオチド２９９からヌクレオチド２４９７までのヌ クレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：１のヌクレオチド１５４からヌクレオチド４３０までのヌク レオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｅ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｆ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレ オチド； （ｇ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｈ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ オチド； （ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｊ）生物学的活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含 む蛋白をコードしているポリヌクレオチド（該フラグメントは配列番号：２の８ 個の連続したアミノ酸を含む）； （ｋ）上記（ａ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ クレオチド； （ｌ）上記（ｉ）または（ｊ）の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ オチド；および （ｍ）厳密な条件下で（ａ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチドのいずれか１つ にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。 好ましくは、かかるポリヌクレオチドは、配列番号：１のヌクレオチド２４５ からヌクレオチド２４９７までのヌクレオチド配列；配列番号：１のヌクレオチ ド２９９からヌクレオチド２４９７までのヌクレオチド配列；配列番号：１のヌ クレオチド１５４からヌクレオチド４３０までのヌクレオチド配列；受託番号Ａ ＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４の全長蛋白コーディ ング配列のヌクレオチド配列；または受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託さ れたクローンＢＲ５３３ ４の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を 含む。他の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、受託番号ＡＴＣＣ ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４のｃＤＮＡインサートによ りコードされる全長または成熟蛋白をコードする。さらなる他の好ましい具体例 において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸６２までのアミノ 酸配列を含む蛋白をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに好ましい具 体例において、本発明は、生物学的活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列の フラグメントを含む蛋白をコードするポリヌクレオチド（該フラグメントは配列 番号：２の８個（より好ましくは２０個、最も好ましくは３０個）の連続したア ミノ酸を含む）、あるいは配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含む蛋 白をコードするポリヌクレオチド（該フラグメントは配列番号：２のアミノ酸３ ７０からアミノ酸３７９までのアミノ酸配列を含む）を提供する。 他の具体例は配列番号：１のｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子を提供する。 他の具体例において、本発明は、蛋白を含む組成物であって、該蛋白が、 （ａ）配列番号：２のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸６２までのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号：２の８個の連続したアミノ酸を含む、配列番号：２のアミノ 酸配列のフラグメント；および （ｄ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであり、他の哺乳動物蛋白を 実質的に含まないものである組成物を提供する。好ましくは、かかる蛋白は配列 番号：２のアミノ酸配列または配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸６２まで のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい具体例において、本発明は、生物学的活 性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含む蛋白（該フラグメ ントは配列番号：２の８個（より好ましくは２０個、最も好ましくは３０個）の 連続したアミノ酸を含む）、あるいは配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメン トを含む蛋白（該フラグメントは配列番号：２のアミノ酸３７０からアミノ酸３ ７９までのアミノ酸配列を含む）を提供する。 ある種の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは発現調節配列に作動可 能に連結される。本発明はまた、かかるポリヌクレオチド組成物で形質転換され た、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞を包含する宿主細胞を提供する。また 、本明細書開示のポリヌクレオチド配列に対応する遺伝子の、促進、低下、また は修飾された発現を有する生物が本発明により提供される。 さらに、蛋白の製造方法であって、 （ａ）かかるポリヌクレオチド組成物で形質転換された宿主細胞の培養物を適 当な培地にて増殖させ；ついで （ｂ）該培養物から蛋白を精製する ことからなる方法も提供される。かかる方法により産生される蛋白もまた、本発 明により提供されるものである。好ましい具体例として、かかる方法により製造 される蛋白が成熟形態の蛋白であるものが挙げられる。 本発明の蛋白組成物は、さらに医薬上許容される担体を含んでいてもよい。か かる蛋白と特異的に反応する抗体を含む組成物も、本発明により提供される。 本発明の蛋白および医薬上許容される担体を含む治療上有効量の組成物を哺乳 動 物対象に投与することを含む、医学的状態の予防、治療または改善のための方法 も提供される。 図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは、本明細書開示のクローンの寄託に使用した、ｐＥＤ６お よびｐＮＯＴｓベクターをそれぞれ図式的に示したものである。 詳細な説明 単離蛋白およびポリヌクレオチド 本願において開示されているクローンおよび蛋白の各々についてのヌクレオチ ドおよびアミノ酸配列を以下に報告する。既知方法により寄託クローンの配列決 定を行うことにより各クローンの実際のヌクレオチド配列を容易に決定すること ができる。次いで、推定アミノ酸配列（全長ならびに成熟の両方）をかかるヌク レオチド配列から決定することができる。適当な宿主細胞中でクローンを発現さ せ、蛋白を集め、次いで、その配列を決定することにより、個々のクローンによ りコードされる蛋白のアミノ酸配列も決定することができる。開示されている各 蛋白について、出願人は、出願時に利用可能な配列の情報を用いて最もよく同定 できる読み枠であると決定されたものを同定した。 本明細書の用語「分泌」蛋白は、適当な宿主細胞において発現された場合、膜 を通過して輸送されるものをいい、そのアミノ酸配列中のシグナル配列の結果と しての輸送も含まれる。「分泌」蛋白は、発現される細胞から全体的に分泌され る蛋白（例えば、可溶性蛋白）または部分的に分泌される蛋白（例えば、受容体 ）を包含するが、これらに限らない。また「分泌」蛋白は、小胞体の膜を通過し て輸送されるものを包含するが、これに限らない。クローン「ＢＲ５３３ ４」 本発明ポリヌクレオチドはクローンＢＲ５３３ ４として同定されている。 ＢＲ５３３ ４は、分泌蛋白をコードしているｃＤＮＡに選択的な方法(米国特 許 第５５３６６３７号参照)を用いてヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリーから単離 され、あるいはコードされる蛋白のアミノ酸配列のコンピューター分析に基づい て、分泌蛋白または膜貫通蛋白をコードするものと同定された。ＢＲ５３３ ４ は全長クローンであり、分泌蛋白（本明細書で「ＢＲ５３３ ４蛋白」とも称す る）の全コーディング配列を含んでいる。 今回決定されたＢＲ５３３ ４のヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。今 回出願人が、上記ヌクレオチド配列に対応したＢＲ５３３ ４蛋白の正しい読み 枠および推定アミノ酸配列であると考えるものを配列番号：２に示す。アミノ酸 ６から１８までは推定リーダー／シグナル配列であり、推定成熟アミノ酸配列は アミノ酸１９から開始する。 クローンＢＲ５３３ ４を含む寄託物から得ることのできるＥｃｏＲＩ／Ｎｏ ｔＩ制限フラグメントは約２８５０ｂｐの長さのはずである。 本明細書に開示されたＢＲ５３３ ４のヌクレオチド配列を、BLASTN/BLASTX およひTASTA検索プロトコールを用いてGenBankおよびGenSeqヌクレオチド配列デ ータベースに対して検索した。ＢＲ５３３ ４は、AA043044(zk53h08.r1 Soares pregnantuterus NbHPU Homo sapiens cDNA clone 486591 5')、AA160999(zq41d 11.r1 Stratagene hNT neuron（#937233）Homo sapiens cDNA clone 632277 5’ similar to TR G854332 G854332 SEMAPHORIN E)、AB000220(Human mRNA for sem aphorin E.complete vds.)、F14663(S．scrofa mRNA;expressed sequence tag(5 'clone c7b))、N38844(yy80d10.s1 Homo sapiens cDNA clone 279859 3')、Q874 42(Human semaphorin III cDNA)、およびX85994(M．musculus mRNA for semapho rin E.)として同定された配列に対して少なくともある程度の類似性を示した。 ＢＲ５３３４に関する本明細書開示の推定アミノ酸配列を、BLASTX検索プロトコ ールを用いてGenPeptおよびGeneSeqアミノ酸配列データベースに対して検索した 。推定ＢＲ５３３ ４蛋白は、AB00022(1777307（Accession # AB000220）semap horin E[Homo sapiens])、R71380（Accession # R71380）Human semaphorin III protein)、U38276(semaphorin III family homolog[Homo sapiens])、およびX8 5994(MMRNASEME 1 senmaphorin E[Musmusculus])として同定された配列に対して 少なくともある程 度の類似性を示した。セマホリンは、成長中の軸索へのアクセスが不可能なテリ トリーを特定する局所的シグナルを提供しうる分子の広範なファミリーである。 配列類似性に基づけば、ＢＲ５３３ ４蛋白および各類似蛋白またはペプチドは 少なくともある程度活性を共有している可能性がある。TpoPredIIコンピュータ ープログラムによれば、ＢＲ５３３ ４蛋白配列中に２つの潜在的な膜貫通ドメ インが推定され、１つは配列番号：２のアミノ酸３２０を中心とし、もう１つは 配列番号：２のアミノ酸１２０を中心とする。 クローンの寄託 クローンＢＲ５３３ ４はブダペスト条約に基づいて１９９６年８月２２日に American Type Culture Collection（10801 University Boulevard，Manassas， Virginia 20110-2209U.S.A.）に受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託され、 そこからＢＲ５３３ ４クローンが入手可能である。寄託材料の公衆の利用に対 するすべての制限は、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１.８０８（ｂ）の規定を除き、特許付与 により解除されるであろう。各クローンはこの複合体寄託物として別々の細菌細 胞（E.coli）中にトランスフェクションされた。 ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ消化（５’部位、ＥｃｏＲＩ；３’部位、ＮｏｔＩ）を 行うことによりＢＲ５３３ ４クローンを寄託されているベクターから取ること ができる。各クローンを、図１に示すｐＥＤ６またはｐＮｏｔＳベクターのいず れかに入れて寄託した。ｃＤＮＡクローニングを容易にする新たなポリリンカー を挿入することにより、ｐＥＤ６ｄｐｃ２ベクター（ｐＥＤ６）をｐＥＤ６ｄｐ ｃ１から誘導した（Kaufman et al．(1991)．Nucleic Acids Res．19:4485-4490 ）。ＤＨＦＲを欠失させ、新たなポリリンカーを挿入し、Ｍ１３複製開始点をＣ ｌａＩ部位に挿入することによりｐＮＯＴｓベクターをｐＭＴ2(Kaufman et al ．1989．Mol．Cell．Biol．9:1741-1750)から誘導した。いくつかの場合、寄託 クローンは寄託単離物中で「フリップ」（すなわち、逆方向となる）ことがあり うる。そのような場合であっても、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでの消化によりｃ ＤＮＡインサートをやはり単離することができる。しかしながら、その場合、適 当 なベクター中での発現のために正しい方向でｃＤＮＡを配置するために、Ｎｏｔ Ｉは５’部位を生成し、ＥｃｏＲＩは３’部位を生成するであろう。 ｃＤＮＡが寄託されているベクターからｃＤＮＡを発現させてもよい。 個々のクローンを含む細菌細胞を、複合体寄託物から次のようにして得ること ができる： 個々のクローンに関して知られた配列に対するものになるよう、オリゴヌクレ オチドプローブまたはプローブを設計すべきである。この配列は本明細書中の配 列、またはそれらの配列の組み合わせから誘導することができる。各全長クロー ンを単離するために使用されたオリゴヌクレオチドプローブ配列を以下に示すが 、それらは目的クローンの単離において最も信頼できるはずである。クローン プローブ配列 ＢＲ５３３ ４ 配列番号：３ 上に挙げた配列は位置２においてＮを含み、その位置は好ましいプローブ／プ ライマーにおいてヌクレオチドというよりはむしろビオチン化ホスホラミダイト 残基（例えば、ビオチンホスホラミダイト（１−ジメトキシトリチルオキシ−２ −（Ｎ−ビオチニル−４−アミノブチル）−プロピル−３−Ｏ−（２−シアノエ チル）−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト（Glen Researchカ タログ番号10-1953））の使用により得られる）により占められる。 好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの設計はこれらのパラメーターに従 うべきである： （ａ）もしあったとしても、不明確な塩基（Ｎ）が最少である配列の領域とな るように設計すべきである； （ｂ）Ｔｍが約８０℃（ＡまたはＴについては２℃、ＧまたはＣについては４ ℃と仮定）となるように設計すべきである。 好ましくは、オリゴヌクレオチド標識に広く用いられる方法を用い、Ｔ４ポリ ヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドをγ−³²Ｐ−ＡＴＰ(比活性 ６０ ００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ)で標識すべきである。他の標識方法を用いることもでき る。好ましくは、取り込まれなかった標識をゲル濾過または他の確立されている 方法により除去すべきである。プローブ中に取り込まれた放射活性量をシンチレ ーションカウンターで測定することにより定量すべきである。好ましくは、得ら れたプローブの比活性は約４ｅ＋６ｄｐｍ／ｐｍｏｌｅとなるべきである。 好ましくは、全長クローンのプールを含む細菌培養物を融解し、１００μｌの ストックを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２５ｍｌの滅菌Ｌブロス を入れた滅菌培養フラスコへの接種に用いるべきである。好ましくは、培養物を ３７℃で増殖させて飽和状態とすべきであり、好ましくは、飽和培養物を新鮮Ｌ ブロスで希釈すべきである。好ましくは、これらの希釈物の一部をプレーティン グして、１５０ｍｍのペトリ皿中の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１． ５％の寒天を含有するＬブロスを含む固体細菌用培地上で３７℃で一晩増殖させ た場合５０００個の明確な、しかもよく分離したコロニーが生じる希釈率および 体積を決定すべきである。明確な、しかもよく分離したコロニーを得るための他 の既知方法を用いることもできる。 次いで、標準的なコロニーハイブリダイゼーション法を用いてコロニーをニト ロセルロースフィルターに移し、溶解、変性、次いで、焼き付けを行うべきであ る。 次いで、好ましくは、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ、およ び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する６Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘストックは１７５．３ｇＮ ａＣｌ／リットル、８８．２ｇクエン酸ナトリウム、ＮａＯＨでｐＨ７．０とす る）（１５０ｍｍフィルター１枚あたり約１０ｍｌ）中で穏やかに撹拌しながら ６５℃で１時間インキュベーションする。次いで、好ましくはプローブをハイブ リダイゼーションミックスに添加して濃度が１ｅ＋６ｄｐｍ／ｍｌより大または これと等しくなるようにする。次いで、好ましくはフィルターを室温において撹 拌せずに５００ｍｌの２ Ｘ ＳＳＣ／０．５％ ＳＤＳで洗浄し、好ましくはそ の後、室温においておだやかに振盪しながら５００ｍｌの２ Ｘ ＳＳＣ／０．１ ％ ＳＤＳで洗浄する。６５℃、３０分ないし１時間、０．１ Ｘ ＳＳＣ／０． ５％ ＳＤＳでの３回目の洗浄が最適である。次いで、好ましくはフィルターを 乾燥し、 十分時間オートラジオグラフィーに供してＸ線フィルム上に陽性物を可視化させ る。他の既知ハイブリダイゼーション方法を用いることもできる。 陽性コロニーを拾い、培地中で増殖させ、次いで、標準的手順を用いてプラス ミドＤＮＡを単離する。次いで、制限分析、ハイブリダイゼーション分析または ＤＮＡ配列決定によりクローンを証明することができる。 生物学的活性を示すことのできる本発明蛋白のフラグメントも本発明に含まれ る。蛋白のフラグメントは直鎖状であってもよく、あるいは例えばH.U.Saragovi ，et al.，Bio/Technology 10，773-778(1992)およびR.S.McDowell，et al.，J ．Amer．Chem．Soc．114，9245-9253（1992）(参照により両文献を本明細書に記 載されているものとみなす)に記載されたような既知方法を用いて環化させても よい。多くの目的(蛋白結合部位の結合手を増加させることを包含)のために、か かるフラグメントを免疫グロブリンのごとキャリヤ分子に融合させてもよい。例 えば、蛋白のフラグメントを「リンカー」を介して免疫グロブリンのＦｃ部分に 融合させてもよい。２価形態の蛋白については、かかる融合をＩｇＧ分子のＦｃ 部分に対して行うことができる。他の免疫グロブリンイソタイプを用いてかかる 融合物を得てもよい。例えば、蛋白−ＩｇＭ融合物は、１０価形態の本発明蛋白 を生じるであろう。 また本発明は全長および成熟形態の開示蛋白を提供する。かかる蛋白の全長形 態は、開示クローンのヌクレオチド配列の翻訳により配列表において同定されて いる。かかる蛋白の成熟形態を、適当な哺乳動物細胞または他の宿主細胞におい て開示の全長ポリヌクレオチド（好ましくは、ＡＴＣＣに寄託されたもの）を発 現させることにより得てもよい。蛋白の成熟形態の配列を全長形態のアミノ酸配 列から決定してもよい。 また本発明は、本明細書開示のｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子を提供する。「 対応する遺伝子」は、転写されてｍＲＮＡを生じるゲノムの領域であり、そのｍ ＲＮＡからｃＤＮＡが誘導され、かかる遺伝子の調節された発現に必要なゲノム の隣接領域（コーディング配列、５’および３’非翻訳領域を含む）、あるいは スプライシングされたエキソン、イントロン、プロモーター、エンハンサー、な らびにサイレンサーまたはサプレッサーエレメントも包含する。本明細書開示の 配列の 情報を用いて対応遺伝子を単離することができる。本明細書開示の配列の情報を 用いて対応遺伝子を単離することができる。かかる方法は、開示された配列の情 報からプローブまたはプライマーを調製して適当なゲノムライブラリーまたは他 のゲノム材料源中の遺伝子の同定および／または増幅を行うことを包含する。「 単離遺伝子」とは、その遺伝子が単離された生物のゲノム中に存在する隣接コー ディング配列（存在する場合には）から分離された遺伝子である。 本明細書開示のポリヌクレオチド配列に対応する遺伝子の増強、低下、あるい は改変された発現を有する生物が提供される。アンチセンスポリヌクレオチドを 用いることにより、あるいは遺伝子から転写されたｍＲＮＡを結合および／また は開裂させるリボザイムを用いることにより、遺伝子発現の望ましい変化が成し 遂げられる（Albert and Morris，1994，Trends Pharmacol.Sci.15(7):250-254; Lavarosky et al.，1997，Biochem Mol．Med．62(1):11-22;and Hampel，1998， Prog．Nucleic Acid Res．Mol．Biol．58:1-39；これらすべてを参照により本明 細書に記載されているものとみなす）。本明細書開示のポリヌクレオチドに対応 する多コピー遺伝子を有するトランスジェニック動物、好ましくは形質転換細胞 およびそれらの子孫中で安定に維持される遺伝学的構築物を用いて細胞を形質転 換することにより得られるトランスジェニック動物が提供される。遺伝子発現レ ベルを上昇または低下させる、あるいは遺伝子発現の時間的または空間的パター ンを変化させる改変された遺伝学的制御領域を有するトランスジェニック動物も 提供される(European Patent No．0 649 464 B1参照；これらすべてを参照によ り本明細書に記載されているものとみなす）。さらに、外部配列の挿入により、 あるいは対応遺伝子の全部または一部の欠失により、本明細書開示のポリヌクレ オチド配列に対応する遺伝子が不完全または完全に不活性化された生物が提供さ れる。挿入により、好ましくは、転置可能エレメントの不正確な切除後の挿入に より（Plasterk，1992，Bioessays 14(9):629-633;Zwaal et al.，1993，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 90(16):7431-7435;Clark et al.，1994，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 91(2):719-722；これらすべてを参照により本明細書に記載されて いるものとみなす）、あるいは相同組み換えにより、好ましくは陽性／陰性遺伝 学的選択法により検出される相同組み換えによ り（Mansour et al.，1988，Nature 336:348-352;U.S．Patent Nos．5,464,764; 5,487,992;5,627,059;5,631,153;5,614，396;5,616,491;and 5,679,523;これら すべてを参照により本明細書に記載されているものとみなす）、不完全または完 全な遺伝子不活性化を行うことができる。変化した遺伝子発現を有するこれらの 生物は、好ましくは真核生物であり、より好ましくは哺乳動物である。かかる生 物は、対応遺伝子に関連した疾患の研究のための非ヒトモデルの開発に、さらに は対応遺伝子からの蛋白産物と相互作用する分子の同定のためのアッセイ系の開 発に有用である。 本発明蛋白が膜結合（例えば、受容体）である場合、本発明はかかる蛋白の可 溶性形態も提供する。かかる形態において、蛋白の細胞内および膜貫通ドメイン の一部または全体を取り外して、蛋白が発現された宿主から十分に分泌されるよ うにする。本発明蛋白の細胞内および膜貫通ドメインを、配列の情報からかかる ドメインを決定するための既知手法により同定することができる。 本発明蛋白および蛋白フラグメントは、開示蛋白のアミノ酸配列の少なくとも ２５％（より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％） の長さのアミノ酸配列を有し、開示蛋白に対して少なくとも６０％の配列同一性 （より好ましくは少なくとも７５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９０％ または９５％の同一性）を有する蛋白を包含する。配列同一性は、配列のギャッ プを最小にしつつ、重複および同一性を最大にするように配列を並置した場合に 蛋白のアミノ酸配列を比較することにより決定される。いずれの開示蛋白のセグ メントに対しても少なくとも７５％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも ８５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する、好まし くは８個またはそれ以上（より好ましくは２０個またはそれ以上、最も好ましく は３０個またはそれ以上）の連続したアミノ酸を含むセグメントを含有する蛋白 または蛋白フラグメントも本発明に包含される。 開示ポリヌクレオチドおよび蛋白の種相同体も、本発明により提供される。本 明細書の用語「種相同体」は、蛋白またはポリヌクレオチドの起源とは異なる種 に関する蛋白またはポリヌクレオチドであるが、当業者により決定された場合、 有意な 配列類似性を有するものをいう。好ましくは、ポリヌクレオチド種相同体は、特 定のポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７ ５％、最も好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有し、蛋白種相同体は 、特定の蛋白に対して少なくとも３０％（より好ましくは少なくとも４５％、最 も好ましくは少なくとも６０％）の配列同一性を有する。ここに配列同一性は、 重複および同一性が最大となり、配列のギャップが最小となるように並置された ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列または蛋白のアミノ酸配列を比較すること により決定される。本明細書に示す配列から適当なプローブまたはプライマーを 作成し、次いで、所望種由来の適当な核酸源をスクリーニングすることにより種 相同体を単離し同定してもよい。好ましくは、種相同体は哺乳動物種から単離さ れたものである。最も好ましくは、種相同体は、例えば、Pan troglodytes、Gor illa gorilla、Pongo pygmaeus、Hylobates concolor、Macaca mulatta、Papio papio、Papio hamadryas、Cercopithecus aethiops、Cebus capucinus、Aotus t rivirgatus、Sanguinus oedipus、Microcebus murinus、Mus musculus、Rattus norvegicus、Cricetulus griseus、Felis catus、Mustela vison、Canis famili aris、Oryctolagus cuniculus、Bos taurus、Ovisaries、Sus scrofaおよびTquu s caballusのごとき特定の哺乳動物から単離されたものであって、その遺伝学的 地図が作成されていて、１の種における遺伝子のゲノム組織化と別の種における 関連遺伝子のゲノム組織化との間の遺伝子配列順序の関連性の同定が可能なもの である（O'Brien and Seuanez，1988，Ann．Rev．Genet．22:323-351;O'Brien e t al.，1993，Nature Genetics 3:103-112;Johansson et al.，1995，Genomics 25:682-690;Lyons et al.，1997，Nature Genetics 15:47-56;O'Brien et al.， 1997，Trends in Genetics 13(10):393-399;Carver and Stubbs，1997，Genome Research 7:1123-1137（これらすべてを参照により本明細書に記載されているも のとみなす））。 また本発明は、開示ポリヌクレオチドの対立遺伝子変種、すなわち、開示ポリ ヌクレオチドによりコードされている蛋白と同一、相同的またはこれに関連した 蛋白をコードする単離ポリヌクレオチドの自然発生的別形態を包含する。好まし くは、対立遺伝子変種は、特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％（ より好ま しくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％）の同一性を有し、 ここに配列同一性は、重複および同一性が最大となり、配列のギャップが最小と なるように並置されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を比較することによ り決定される。本明細書記載の配列から適当なプローブまたはプライマーを作成 し、適当な種の個体から得られる適当な核酸源をスクリーニングすることにより 対立遺伝子変種を単離し、同定してもよい。 また本発明は、本明細書開示ポリヌクレオチドの配列に相捕的な配列を有する ポリヌクレオチドも包含する。 また本発明は、厳密さを減じた条件下で、より好ましくは厳密な条件下で、最 も好ましくは非常に厳密な条件下で、本明細書記載のポリヌクレオチドにハイブ リダイゼーションしうるポリヌクレオチドも包含する。厳密さの条件の例を下表 に示す。非常に厳密な条件は、例えば、少なくとも条件Ａ〜Ｆと同程度に厳密で あり、厳密な条件は、例えば、少なくとも条件Ｇ〜Ｌと同程度に厳密であり、厳 密さを減じた条件は、例えば、少なくとも条件Ｍ〜Ｒと同程度に厳密である。 ^‡：ハイブリッド長さは、ハイブリダイゼーションしているポリヌクレオチドの ハイブリッドしている領域（複数も可）に関して予想される長さである。ポリヌ クレ オチドを未知配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる場合 、ハイブリッド長さは、ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドの長さと 仮定する。既知配列のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションする場合、ポ リヌクレオチド配列を並置し、最適な配列相補性の領域（複数も可）を同定する ことによりハイブリッド長さを決定することができる。^† ：ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいてＳＳＰＥ（１ Ｘ Ｓ ＳＰＥは０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、および１.２５ｍＭ Ｅ ＤＴＡ，ｐＨ７.４である）をＳＳＣ(１ＸＳＳＣは０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび１ ５ｍＭクエン酸ナトリウムである)に置き換えることができる。ハイブリダイゼ ーション完了後、洗浄を１５分間行う。 *Ｔ_B−Ｔ_R：長さ５０塩基対よりも短いと予想されるハイブリッドについてのハ イブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔ_m）よりも５〜１０ ℃低くすべきである。下記等式によりＴ_mが決定される。長さ１８塩基対未満の ハイブリッドについては、T_m(℃)=2(A+T塩基の数)+4(G+C塩基の数)。長さ１８な いし４９塩基対のハイブリッドについては、 T_m(℃)=81.5+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(%G+C)-(600/N)であり、Ｎはハイブリッド の塩基数であり、ハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオン濃度 である（１ＸＳＳＣについての［Ｎａ⁺］＝０.１６５Ｍ）。 ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのための厳密さの条件のさらなる例 はSambrook，J.，E.F．Fritsch，and T．Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har bor，NY，chapters 9 and 11，and Current Protocols in Molecular Biology， 1995，F.M．Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，sections 2.10 and 6.3-6.4に記載されており、参照により本明細書に記載されているものとみ なす。 好ましくは、かかるハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのそれぞれ が、ハイブリダイゼーションすべき本発明ポリヌクレオチドの少なくとも２５％ （より好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも７５％）の 長さを有 し、ハイブリダイゼーションすべき本発明ポリヌクレオチドに対して少なくとも ６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、最も好まし くは、少なくとも９０％または９５％の同一性）を有する。配列同一性は、配列 のギャップを最小にしつつ、重複および同一性を最大にするように配列を並置し た場合に蛋白のアミノ酸配列を比較することにより決定される。 本発明蛋白をコードしている単離ポリヌクレオチドを、Kaufman et al.，Nucl eic Acids Res．19，4485-4490(1991)に開示のｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクタ ーのごとき発現制御配列に作動可能に連結して、蛋白を組み換え的に製造しても よい。多くの適当な発現制御配列が当該分野において知られている。多くの適当 な発現制御配列が当該分野において知られている。組み換え蛋白発現のための一 般的方法も知られており、R．Kaufman，Methods in Enzymology 185，537-566(1 990)が典型例である。ここで定義する「作動可能に連結」とは、本発明単離ポリ ヌクレオチドおよび発現制御配列がベクターまたは細胞中に置かれ、連結された ポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクション）された宿 主細胞により発現されるようになっていることを意味する。 多くのタイプの細胞は本発明蛋白の発現に適した宿主細胞として作用しうる。 哺乳動物細胞は、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細 胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常２倍体 細胞、一次組織のインビトロ培養から得られる細胞株、一次エクスプラント、Ｈ ｅＬａ細胞、マウス細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７ＨａＫまたはJurkat細 胞を包含する。 別法として、酵母のごとき下等真核細胞または細菌のごとき原核細胞において 蛋白を製造することが可能である。潜在的に適当な酵母株は、Saccharomyces ce revisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candida）または異 種蛋白を発現可能な酵母株を包含する。潜在的に適当な細菌株は、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、または異種蛋白を発現可 能な細菌株を包含する。蛋白が酵母または細菌において生成される場合、その中 で生成され た蛋白を、例えば適当部位のリン酸化またはグリコシレーションにより修飾して 機能的蛋白を得る必要があるかもしれない。既知化学的または酵素的方法を用い てかかる共有結合を行ってもよい。 本発明単離ポリヌクレオチドを１種またはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適 当な制御配列に作動可能に連結し、昆虫発現系を用いることにより蛋白を得ても よい。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えばIn vitrogen，San Diego，California，USAからのキット形態（MaxBac^Rキット）で 市販されており、かかる方法は当該分野においてよく知られており、Summersお よびSmith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No．1555(1987) （参照により本明細書に記載されているものとみなす）に記載のようなものがあ る。本明細書で用いるように、本発明ポリヌクレオチドを発現可能な昆虫細胞は 「形質転換」されている。 組み換え蛋白の発現に適した培養条件下で形質転換宿主細胞を培養することに より本発明蛋白を製造してもよい。次いで、得られた発現蛋白を、ゲル濾過およ びイオン交換クロマトグラフィーのごとき既知精製プロセスを用いてかかる培養 物（すなわち、培地または細胞抽出物）から精製してもよい。また、蛋白の精製 は、蛋白に結合するであろう作用剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナ バリンＡ−アガロース、ヘパリンートヨパール^RまたはCibacrom blue 3GAセファ ロース^Rのごときアフィニティーカラムによる１またはそれ以上のカラム工程； フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのごとき樹脂を用 いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる１またはそれ以上の工程；ある いは免疫アフィニティークロマトグラフィーを包含する。 別法として、本発明蛋白を精製容易形態として発現させてもよい。例えば、マ ルトース結合蛋白（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トンスフェラーゼ（ＧＳＴ） またはチオレドキシン（ＴＲＸ）との融合蛋白のごとき融合蛋白として発現させ てもよい。かかる融合蛋白の発現および精製のためのキットは、それぞれNew En glan BioLab(Beverly，MA)、Pharmacia(Piscataway，NJ)およびInVitrogenから 市販されている。蛋白にエピトープでタグを付し、次いで、かかるエピトープに 指向された特異的抗体を用いることにより精製することもできる。１のかかるエ ピトープ(「フラッ グ」)はKodak(New Haeven，CT)から市販されている。 最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば懸垂メチルまたは他の脂肪族基を 有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィ ー(Ｒｐ−ＰＬＣ)工程を用いてさらに蛋白を精製することができる。いくつかま たはすべての上記精製工程を種々組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換 え蛋白を得ることもできる。かくして精製された蛋白は他の咄乳動物蛋白を実質 的に含まず、本発明において「単離蛋白」と定義される。 本発明蛋白をトランスジェニック動物の生産物として、例えば、蛋白をコード しているヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴づけられるト ランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジの乳の成分として発現させて もよい。 既知の慣用的化学合成により蛋白を製造してもよい。合成的手段による本発明 蛋白の構築方法は当業者に知られている。合成的に構築された蛋白配列は、一次 、二次または三次構造および／またはコンホーメーション特性を共有することに よって、蛋白活性をはじめとする共通の生物学的特性を有する可能性がある。よ って、それらを、治療化合物のスクリーニングおよび抗体の生成のための免疫学 的プロセスにおいて、天然の精製蛋白の生物学的活性または免疫学的置換物とし て使用してもよい。 本明細書に示す蛋白は、精製蛋白のアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列によ り特徴づけられるが、その中に自然にあるいは誘導体化によって修飾されていて もよい。例えば、ペプチドまたはＤＮＡ配列の修飾は既知方法を用いて当業者に より行われうる。蛋白配列中の目的とされる修飾は、コーディング配列中の選択 アミノ酸残基の変化、置換、交換、挿入または欠失を包含する。例えば、１個ま たはそれ以上のシステイン残基を欠失させ、あるいは別のアミノ酸と交換して分 子のコンホーメーションを変化させてもよい。かかる変化、置換、交換、挿入ま たは欠失のための方法は当業者によく知られている（例えば、米国特許第４１５ ８５８４号参照）。好ましくは、かかる変化、置換、交換、挿入または欠失は蛋 白の所望活性を保持するものである。 全体的または部分的に蛋白活性を保持すると期待され、かくしてスクリーニン グ または他の免疫学的方法に有用でありうる蛋白配列の他のフラグメントおよび誘 導体も、本明細書の開示から当業者により作成されうる。かかる修飾は本発明に より包含されると確信される。用途および生物学的活性 本発明ポリヌクレオチドおよび蛋白は、下記の１またはそれ以上の用途または 生物学的活性（本明細書に引用されたアッセイに関連するものも含む）を示すと 考えられる。本発明蛋白に関して説明された用途または活性は、かかる蛋白の投 与または使用により、あるいはかかる蛋白をコードしているポリヌクレオチドの 投与または使用（例えば、遺伝子治療またはＤＮＡ導入に適したベクターのごと き）により提供されうる。研究用途および有用性 本発明により提供されるポリヌクレオチドは、研究集団によって種々の目的に 使用されうる。分析用に、特徴づけまたは治療用途に、対応蛋白が優先的に発現 される(構成的に、または組織分化もしくは発達の特定段階において、または疾 病状態において発現される)組織のマーカーとして、さらにはサザンゲルの分子 量マーカーとして、染色体の同定または関連遺伝子位置のマッピングのための染 色体マーカーまたはタグとして（標識された場合）、患者の内在性ＤＮＡと比較 して潜在的な遺伝病の同定を行うために、ハイブリダイゼーションするプローブ として用いて新規な関連ＤＮＡ配列を発見するために、遺伝学的フィンガープリ ンティングのためのＰＣＲプライマーを得るための情報源として、他の新規ポリ ヌクレオチドを発見するプロセスにおいて既知配列を差し引くためのプローブと して、「遺伝子チップ」または他の支持体に結合させるためにオリゴマーを選択 し作成するために、発現パターンの試験のために、ＤＮＡ免疫法を用いて抗蛋白 抗体を生成させるために、ならびに抗ＤＮＡ抗体を生成させ、あるいはさらなる 免疫応答を誘導するための抗原として、ポリヌクレオチドを使用することができ る。別の蛋白に結合または潜在的に結合（例えば、受容体−リガンド相互作用に おけるように）する蛋白をコードし ている場合、結合する他の蛋白を同定し、あるいは、または結合相互作用の阻害 剤を同定するための相互作用トラップアッセイ（例えば、Gyuris et al.，Cell 75:791-803(1993)に記載されたような）においてポリヌクレオチドを使用するこ とができる。 本発明により提供される蛋白は、高処理量スクリーニングのための一群の多数 の蛋白を含む、生物学的活性を決定するためのアッセイに；抗体の生成または他 の免疫応答を誘導するために；生物学的液体中の蛋白（またはその受容体）のレ ベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（標識試薬を包 含）として；対応蛋白が優先的に発現される（構成的に、または組織分化もしく は発達の特定段階において、または疾病状態において発現される）組織のマーカ ーとして；ならびに、もちろん関連受容体またはリガンドを単離するために用い てもよい。蛋白がもう１つの蛋白に結合または潜在的に結合する場合、結合する 他の蛋白を同定し、あるいは、または結合相互作用の阻害剤を同定するために蛋 白を使用することができる。これらの結合相互作用に関与する蛋白を用いて、結 合相互作用に関するペプチドまたは小型分子状阻害剤またはアゴニストのスクリ ーニングを行うこともできる。 これらの研究用途のいずれかまたはすべては、研究用製品として商品化するた めに試薬グレードまたはキットのフォーマットへと発展させることができる。 上記使用を実行するための方法は当業者によく知られている。かかる方法を開 示する文献は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，2nd ed.，Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F．Fritsch and T．Maniatis eds.，1989，および"Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Tech niques"，Academic Press，Berger，S.L．and A.R．Kimmel eds.，1987を包含す るが、これらに限らない。 栄養としての用途 本発明ポリヌクレオチドおよび蛋白を栄養源または添加物として使用すること ができる。かかる用途は、蛋白またはアミノ酸添加物としての用途、炭素源とし ての 用途、窒素源としての用途および炭水化物源としての用途を包含するが、これら に限らない。かかる場合、本発明蛋白またはポリヌクレオチドを特定の生物のエ サとして添加してもよく、あるいは粉末、ピル、溶液、懸濁液またはカプセルの 形態のごとき別個の個体または液体調合物として投与することもできる。微生物 の場合、微生物が培養される培地に本発明蛋白またはポリヌクレオチドを添加す ることができる。 サイトカインおよび細胞増殖／分化活性 本発明蛋白はサイトカイン活性、細胞増殖活性（誘導もしくは阻害）または細 胞分化活性（誘導もしくは阻害）を示しうるか、またはある種の細胞集団におい て他のサイトカインの産生を誘導しうる。今日まで見いだされてきた多くの蛋白 性因子（すべての既知サイトカインを包含）は、１またはそれ以上の因子依存的 細胞増殖アッセイにおいて活性を示しており、よって、アッセイはサイトカイン 活性の便利な確認法として役立つ。本発明蛋白の活性は、細胞系（３２Ｄ、ＤＡ ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒ ｅＢＭ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを包含するが、これらに限らない）のため の多くの常套的な因子依存的細胞増殖アッセイのいずれかにより確認される。 本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい： Ｔ細胞または胸腺細胞の増殖についてのアッセイは、Current Protocols in I mmunology，Ed by J．E．Coligan，A.M．Kruisbeek，D.H．Margulies，E.M．She vach，W Strober，Pub．Greene Publishing Associates and Wiley-Interscienc e(Chapter 3，In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19;Chap ter 7，Immunologic studies in Humans);Takai et al.，J．Immunol．137:3494 -3500，1986;Bertagnolli et al.，J．Immunol．145:1706-1712，1990;Bertagno lli et al.，Cellular Immunology 133:327-341，1991;Bertagnolli，et al.，J ．Immunol．149:3778-3783，1992;Bowman et al.，J．Immunol．152:1756-1761 ，1994に記載されたものを包含するが、これらに限らない。 脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン生成および／または増 殖に関するアッセイは、Polyclonal T cell stimulation，Kruisbeek，A.M．and Shevach，E.M．In Current Protocols in Immunology．J.E.e.a．Coligan eds ．Vol 1 pp．3.12.1-3.12.14，John Wiley and Sons，Toronto．1994;and Measu rement of mouse and human Interferon γ，Schreiber，R.D．In Current Prot ocols in Immunology．J.E.e.a．Coliganeds．Vol 1 pp．6.8.1-6.8.8，John Wi ley and Sons，Toronto．1994に記載されたものを包含するが、これらに限らな い。 造血およびリンパ生成細胞の増殖および分化についてのアッセイは、Measurem ent of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4，Bottomly，K.，D avis，L.S．and Lipsky，P.E．In Current Protocols in Imlunology．J.E.e.a ．Coligan eds．Vol 1 pp．6.3.1-6.3.12，John Wiley and Sons，Toronto．199 1;deVries et al.，J．Exp．Med．173:1205-1211，1991;Moreau et al.，Nature 336:690-692，1988;Greenberger et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80: 2931-2938，1983;Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan，R． In Current Protocols in Immunoloy J.E.e.a．Coligan eds．Vol 1 pp．6.6.1- 6.6.5，John Wiley and Sons，Toronto．1991;Smith et al.，Proc．Natl．Acad ．Sci．U.S.A．83:1857-1861，1986;Measurement of human Interleukin 11-Ben nett，F.，Giannotti，J.，Clark，S.C．and Turner，K．J．In Current Protoc ols in Immunology．J.E.e.a．Coligan eds．Vol 1 pp．6.15.1 John Wiley and Sons，Toronto．1991;Measurement of mouse and human Interleukin 9-Ciarle tta，A.，Giannotti，J.，Clark，S.C．and Turner，K.J．In Current Protocol s in Immunology．J.E.e.a．Coligan eds．Vol 1 pp．6.13.1，John Wiley and Sons，Toronto．1991に記載されたものを包含するが、これらに限らない。 抗原に対するＴ細胞クローンの応答についてのアッセイ（特に、増殖およびサ イトカイン産生を測定することによりＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用ならびに直接的な Ｔ細胞の効果を同定する）は、Current Protocols in Immunology，Ed by J．E ．Coligan，A.M．Kruisbeek，D.H．Margulies，E.M．Shevach，W Strober，Pub ．Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitr o assays for Mouse Lymphocyte Function;Chapter 6，Cytokines and their cellular recept ors;Chapter 7，Immunologic studies in Humans)；Weinberger et al.，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 77:6091-6095，1980;Weinberger et al.，Eur．J．Immun ．11:405-411，1981;Takai et al.，J．Immunol．137:3494-3500，1986;Takai e t al.，J．Immunol．140:508-512，1988に記載されたものを包含するが、これら に限らない。 免疫刺激または抑制活性 また本発明蛋白は、本明細書記載のアッセイにおける活性（これらに限らない ）を包含する免疫刺激または免疫抑制活性を示すものであってもよい。蛋白は、 種々の欠乏症および障害（重症の免疫欠乏合併症（ＳＣＩＤ）を包含）において 有用である可能性があり、例えば、Ｔおよび／またはＢリンパ球の増殖をアップ レギュレーションまたはダウンレギュレーションすることにおいて、ならびにＮ Ｋ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性を有効ならしめることにおいて有用で ありうる。これらの免疫欠乏症は遺伝的なものであってもよく、またウイルス（ 例えば、ＨＩＶ）ならびに細菌または真菌感染により引き起こされるものであっ てもよく、あるいは自己免疫疾患により引き起こされるものであってもよい。よ り詳細には、ウイルス、細菌、真菌または他の感染物質により引き起こされる感 染性疾患、例えば、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア 、レシュマニア、マラリアおよびカンジダ種のごとき種々の真菌感染症を、本発 明蛋白を用いて治療可能である。もちろん、この点において、免疫系に対するブ ーストが必要な場合、すなわち、癌の治療において、本発明蛋白を用いてよい。 本発明蛋白を用いて治療してもよレ哨己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症、 全身性の深在性エリトマーデス、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、Guilla in-Barre症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症 、対宿主移植片疾患および自己免疫性の炎症性の目の疾患を包含する。本発明の かかる蛋白を、喘息または他の呼吸器系の疾患のごときアレルギー性反応および 症状の治療に用いてもよい。免疫抑制が望まれる他の症状（例えば、喘息（特に アレルギー性喘息）および関連呼吸器系の問題を包含）を本発明蛋白を用いて治 療し てもよい。免疫抑制が望まれる他の状態（例えば、器官移植を包含）を、本発明 蛋白を用いて治療してもよい。 本発明蛋白を用いて、多くのやり方で免疫応答を可能にすることもできる。ダ ウンレギュレーションは、すでに進行中の免疫応答を阻害またはブロックする形 態のものであってもよく、あるいは免疫応答の誘導を妨害することを含むもので あってもよい。Ｔ細胞応答を抑制することにより、あるいはＴ細胞中に特異的な 耐性を誘導することにより、あるいはその両方により活性化Ｔ細胞の機能を阻害 してもよい。一般的には、Ｔ細胞応答の免疫抑制は活性のある、非抗原特異的な プロセスであり、Ｔ細胞を抑制剤に連続的に曝露することを必要とする。耐性と は、Ｔ細胞における非応答性またはアネルギーを意味し、一般的には抗原特異的 であり耐性化剤への曝露を止めた後も持続するという点で免疫抑制とは異なる。 操作上は、耐性化剤の不存在下で特異的抗原に曝露した際のＴ細胞応答の欠如に より耐性が示されうる。 １またはそれ以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えばＢ７のごとき）を 包含するが、これに限らない）をダウンレギュレーションすることまたは妨害す ること、例えば、活性化Ｔ細胞による高レベルのリンホカイン合成の妨害は、組 織、皮膚および器官の移植および対宿主移植片疾患（ＧＶＨＤ）において有用で あろう。例えば、Ｔ細胞機能のブロックは組織移植における組織破壊を減少させ るはずである。典型的には、組織移植において、移植片の拒絶反応は、組織片が Ｔ細胞により外来のものと認識されることにより開始され、次いで、移植片を破 壊する免疫反応が起こる。免疫細胞上でのＢ７リンパ球抗原とその本来的なリガ ンドとの相互作用を阻害またはブロックする分子（別のＢリンパ球抗原（例えば 、Ｂ７−１、Ｂ７−３）の活性を有するモノマー形態のペプチドと混合された、 あるいは単独の、Ｂ７−２活性を有する可溶性でモノマー形態のペプチド）の移 植前の投与は、応答的な同時刺激シグナルを伝達することなく免疫細胞上の本来 のリガンドへの分子の結合を誘導する可能性がある。この点においてＢリンパ球 抗原機能をブロックすることは、Ｔ細胞のごとき免疫細胞によるサイトカイン合 成を妨害し、かくして、免疫抑制剤として作用する。そのうえ、同時刺激の欠如 はＴ細胞の反応を失わせるのに十分でありうる。Ｂリンパ球抗原ブロッキング試 薬による長期の耐性の誘導により、 これらのブロッキング試薬の繰り返し投与の必要性が回避されうる。対象におい て十分な免疫抑制または耐性を達成するためには、Ｂリンパ球抗原の組み合わせ の機能をブロックすることも必要かもしれない。 器官移植拒絶反応またはＧＶＨＤを妨害することにおける個々のブロッキング 試薬の有効性を、ヒトにおける有効性を推定しうる動物モデルを用いて評価する ことができる。使用可能な適当な系の例は、ラットにおける同種心臓移植片およ びマウスにおける異種膵臓島細胞移植片を包含し、それらは両方ともインビボで のＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白の免疫抑制効果を試験するために使用された(Lenscho w et al.，Science 257:789-792(1992)およびTurka et al.，Proc Natl．Acad． Sci．USA，89:11102-11105(1992)に記載されている)。さらに、ＧＶＨＤのネズ ミモデル(Paul ed.，Fundamental Immunology，Ravan Press，New York，1989， pp.846-847参照)を用いて、インビボでの当該疾患の進行に対するＢリンパ球抗 原機能のブロッキング効果を決定することができる。 また、抗原機能をブロックすることは自己免疫疾患の治療にとり治療的に有用 でありうる。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性があり、疾病の病 理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するＴ細胞の不適当な活 性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化を妨害することは疾病の徴候を減 少または除去しうる。Ｂリンパ球抗原の受容体：リガンド相互作用を破壊するこ とによりＴ細胞の同時刺激をブロックする試薬の投与を用いてＴ細胞活性化を阻 害し、疾病プロセスに関与しうる自己抗体またはＴ細胞由来のサイトカインの産 生を妨害することができる。さらに、ブロッキング試薬は、疾病の長期の寛解を 導く可能性のある自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的耐性を誘導しうる。自己免疫疾 患の予防または改善におけるブロッキング試薬の有効性を、ヒトの自己免疫疾患 についての十分に特徴づけられた多くの動物モデルを用いて決定することができ る。例は、ネズミの実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ１ｐｒ／１ｐｒマウスまたはＮ ＺＢハイブリッドマウスにおける全身性深在性エリトマトーデス、ネズミ自己免 疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、およびネ ズミの実験的重症筋無力症（Paul ed.，Fundamental Immunology，Raven Press ，New York，1989，pp.840-856）を包含する。 免疫応答をアップレギュレーションするための手段としての抗原機能（好まし くは、Ｂリンパ球抗原機能）のアップレギュレーションは治療に有用でもある。 免疫応答のアップレギュレーションは存在している免疫応答を促進する形態また は最初の免疫応答を除去する形態であってよい。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を 刺激することによる免疫応答の促進は、ウイルス感染の場合に有用でありうる。 さらに、インフルエンザ、通常のかぜ、および脳炎のごとき全身的なウイルス性 疾患を、刺激性形態のＢリンパ球抗原を全身投与することにより改善してもよい 。 別法として、Ｔ細胞を患者から取り、本発明ペプチドを発現するＡＣＰｓを付 加したウイルス抗原とともにインビトロにおいてＴ細胞を同時刺激するか、また は刺激性形態の本発明可溶性ペプチドと一緒にし、次いで、インビトロで活性化 されたＴ細胞を患者体内に再導入することにより、感染患者における抗ウイルス 免疫応答を促進してもよい。抗ウイルス免疫応答を促進するもう１つの方法は、 感染細胞を患者から取り、本明細書記載の本発明蛋白をコードする核酸をそれら にトランスフェクションして細胞がその表面に蛋白全体または一部を発現するよ うにし、次いで、トランスフェクション細胞を患者体内に再導入することであろ う。すると、感染細胞はインビボにおいて同時刺激シグナルをＴ細胞に伝えるこ とができ、そのことによりＴ細胞を活性化することができよう。 もう１つの適用例において、抗原機能(好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能)のア ップレギュレーションまたは促進は腫瘍免疫性の誘導において有用でありうる。 本発明の少なくとも１種のペプチドをコードする核酸でトランスフェクションさ れた腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫 ）を対象に投与して対象中の腫瘍特異的耐性を克服することができる。所望なら ば、腫瘍細胞をトランスフェクションしてペプチドの組み合わせを発現させるこ とができる。例えば、患者から得た腫瘍細胞を、Ｂ７−２様活性を有するペプチ ドのみ、またはＢ７−１様活性および／またはＢ７−３様活性を有するペプチド と組み合わせて発現することを指令する発現ベクターで、エクスビボにおいてト ランスフェクシションすることができる。トランスフェクションされた腫瘍細胞 を患者に戻して、トラン スフェクションされた細胞の表面上にペプチドを発現させる。別法として、遺伝 子治療法を用いてインビボでのトランスフェクションのために腫瘍細胞を標的化 することができる。 腫瘍細胞表面上におけるＢリンパ球抗原の活性を有する本発明ペプチドの存在 は、Ｔ細胞に必要な同時刺激シグナルを提供して、Ｔ細胞により媒介されるトラ ンスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。さらに、ＭＨＣ クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠く腫瘍細胞、あるいは十分量のＭＨＣ クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現できない腫瘍細胞を、ＭＨＣクラ スＩα鎖蛋白およびβ₂マイクログロブリン蛋白またはＭＨＣクラスＩＩα鎖お よびＭＨＣクラスＩＩβ鎖蛋白の全体または一部（例えば、末端切断蛋白の細胞 質ドメイン）をコードしている核酸でトランスフェクションして、そのことによ りクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ蛋白を細胞表面上に発現させることができる 。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペ プチドと組み合わせた適当なクラスＩまたはクラスＩＩ ＨＭＣの発現は、Ｔ細 胞により媒介されるトランスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘 導する。所望により、不変鎖のごとき、ＭＨＣクラスＩＩ結合蛋白の発現をブロ ックするアンチセンス構築物をコードしている遺伝子を、Ｂリンパ球抗原の活性 を有するペプチドをコードしているＤＮＡとともに同時トランスフェクションし て腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘導こともできる。よって 、ヒト対象におけるＴ細胞により媒介される免疫応答の誘導は、対象における腫 瘍特異的耐性を克服するに十分でありうる。 本発明蛋白の活性を、特に、下記方法により測定してもよい： 胸腺細胞または脾臓細胞の細胞毒性に適したアッセイは、Current Protocols in Immunology，Ed by J．E．Coligan，A.M．Kruisbeek，D.H．Margulies，E.M ．Shevach，W Strober，Pub．Greene Publishing Associates and Wiley-Inters cience(Chapter 3，In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19 ;Chapter 7，Immunologic studies in Humans);Herrmann et al.，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 78:2488-2492，1981;Herrmann et al.，J．Immunol．128:1968- 1974，1982;Handa et al.，J．Immunol．135:1564-1572，1985;Takai et al.，J ．Immunol．137: 3494-3500，1986;Takai et al.，J．Immunol．140:508-512，1988;Herrmann et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2488-2492，1981;Herrmann et al.，J．I mmunol．128:1968-1974，1982;Handa et al.，J．Immunol．135:1564-1572，198 5;Takai et al.，J．Immunol．137:3494-3500，1986;Bowman et al.，J．Virolo gy 61:1992-1998;Takai et al.，J．Immunol．140:508-512，1988;Bertagnolli et al.，Cellular Immunology 133:327-341，1991;Brown et al.，J．Immunol． 153:3079-3092，1994に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。 Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびイソタイプスイッチングのためのアッ セイ（特に、Ｔ細胞依存性抗体応答を転調させ、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロフィールに 影響する蛋白を同定する）は、Maliazewski,J.Immunol.144:3028-3033,1990に記 載されているアッセイを包含するが、これに限らず、さらにＢ細胞の機能のアッ セイは、In vitro antibody production,Mond,J.J.and Brunswick,M.In Current Protocols in Immunology J.E.Coligan eds.Val 1 pp.3.8.1-3.8.16,John Wile y and Sons,Tronto 1994に記載のアッセイを包含する。 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（特に、主としてＴｈ１およびＣＴＬ応 答を発生させる蛋白を同定する）は、Current Protocols in Immunology，Ed by J．E．Coligan，A.M．Kruisbeek，D.H．Margulies，E.M．Shevach，W Strober ，Pub．Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitroassays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19;Chapter 7，Immunolog ic studies in Humans);Takai et al.，J．Immunol．137:3494-3500，1986;Taka i et al.，J．Immunol．140:508-512，1988;Bertagnolli et al.，J．Immunol． 149:3778-3783，1992に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。 樹枝状細胞依存的アッセイ（特に、無処理のＴ細胞を活性化する樹枝状細胞に より発現される蛋白を同定する）は、Guery et al.，J．Immunol．134:536-544 ，1995;Inaba et al.，Journal of Experimental Medicine 173:549-559，1991; Macatonia et al.，Journal of Immunology 154:5071-5079，1995;Porgador et al.，Journal of Experimental Medicine 182:255-260，1995;Nair et al.，Jou rnal of Virology 67:4062-4069，1993;Huang et al.，Science 264:961-965，1 994;Macatonia et al.，Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264，1989;Bhardwaj et al .，Journal of Clinical Investigation 94:797-807，1994;and Inaba et al.， Journal of Experimental Medicine 172:631-640，1990 に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。 リンパ球生存／アポトーシスのアッセイ（特に、超抗体誘導後のアポトーシス を防止する蛋白、ならびにリンパ球のホメオスタシスを調節する蛋白を同定する ）は、Darzynkiewicz et al.，Cytometry 13:795-808，1992;Gorczyca et al.， Leukemia 7:659-670，1993;Gorczyca et al.，Cancer Research 53:1945-1951， 1993;Itoh et al.，Cell 66:233-243，1991;Zacharchuk，Journal of Immunolog y 145:4037-4045，1990;Zamai et al.，Cytometry 14:891-897，1993;Gorczyca et al.，International Journal of Oncology 1:639-648，1992に記載のアッセ イを包含するが、これらに限らない。 初期段階のＴ細胞のコミットメント(commitment)および発達のアッセイは、An tica et al.,Blood 84:111-117,1994;Fine et al.,Cellular Immunology 155:11 1-122,1994;Galy et al.,Blood 85:2770-2778，1995;Toki et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 88:7548-7551，1991に記載のアッセイを包含するが、これら に限らない。 造血調節活性 本発明蛋白は、造血の調節において有用であり、それゆえ、骨髄およびリンパ 球欠乏症の治療において有用である。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系 を支持する最低限の生物学的活性でさえも、造血の調節への関与を示している。 例えば、赤血球系前駆細胞のみの増殖を支持すること、あるいは他のサイトカイ ンと組み合わされて、例えば種々の貧血の治療に有用性を示すこと、あるいは放 射線療法／化学療法と組み合わされて赤芽前駆細胞および／または赤芽細胞の産 生を刺激すること；顆粒球のごとき骨髄細胞および単球／マクロファージの増殖 を支持すること(すなわち、伝統的なＣＳＦ活性)、例えば、化学療法と組み合わ されて、引き続き起こる骨髄抑制を防止することに有用であり；巨核細胞の増殖 、次いで、血小板の増殖を支持すること、またそれにより血小板減少症のごとき 種々の血小板疾患を予防 または治療することに有用であり、また一般的には血小板輸液の代わりにあるい はそれと相補的に使用され；さらに／あるいは造血幹細胞（成熟して上記のすべ ての造血細胞となり、それゆえ、種々の幹細胞疾患（通常には、移植により治療 される疾患であり、例えば、再生不良性貧血および発作性の夜間ヘモグロビン尿 症）において有用性がわかる）の増殖を支持することに有用であり、さらにはイ ンビボまたはエクスビボでの放射線／化学療法後（すなわち、骨髄移植と組み合 わされる）、あるいは遺伝子治療のために遺伝子操作された後の幹細胞コンパー トメントの正常細胞としての再増殖においても有用である。 本発明蛋白の活性を、特に、下記方法測定してもよい。 種々の造血細胞系の増殖および分化に適したアッセイはすでに引用されている 。 胚の幹細胞の分化のアッセイ（特に、胚の分化造血に影響する蛋白を同定する ）は、Johansson et al．Cellular Biology 15:141-151，1995;Keller et al.， Molecular and Cellular Biology 13:473-486，1993;McClanahan et al.，Blood 81:2903-2915，1993に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。 幹細胞生存および分化のアッセイ（特に、リンパ−造血を調節する蛋白を同定 する）は、Methylcellulose colony forming assays，Freshney，M.G．In Cultu re of Hematopoietic Cells．R.I．Freshney，et al．eds．Vol pp．265-268，W iley-Liss，Inc.，New York，NY．1994;Hirayama et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 89:5907-5911，1992;Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferativ epotential，McNiece，I.K．and Briddell，R.A．In C ulture of Hematopoietic Cells．R.I．Freshney，et al．eds．Vol pp．23-39 ，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY．1994;Neben et al.，Experimental Hemato logy 22:353-359，1994;Cobblestone area forming cell assay，Ploemacher，R .E．In Culture of Hematopoietic Cells．R.I．Freshney，et al．eds．Vol pp ．1-21，Wiley-Liss，Inc..，New York，NY．1994;Long term bone marrow cult ures in the presence of stromal cells，Spooncer，E.，Dexter，M．and Alle n，T．In Culture of Hematopoietic Cells．R.I．Freshney，et al．eds．Vol pp．163-179，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY．1994;Long term culture init iating cell assay，Sutherland， H.J．In Culture of Hematopoietic Cell.5．R.I．Freshney，et al．eds．Vol pp．139-162，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY．1994に記載されたアッセイを 包含するが、これらに限らない。 組織増殖活性 本発明蛋白は、骨、軟骨、鍵、靭帯および／または神経組織の成長または再生 、ならびに傷の治癒および組織修復に用いる組成物において、さらに熱傷、裂傷 および潰瘍の治療において有用性を有する。 骨が正常に形成されない環境において軟骨および／または骨の成長誘導する本 発明蛋白は、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨損傷または欠損の治癒 における用途がある。本発明蛋白を用いるかかる調合物は、閉鎖性骨折ならびに 解放性骨折の軽減に有用であり、また人工関節の固定の改善にも有用である。骨 形成剤により誘導されるデノボ骨形成は、先天性の、外傷による、あるいは腫瘍 学的切除により誘発される脳顔面頭蓋の欠損の修復に貢献し、さらに美容整形外 科手術においても有用である。 本発明蛋白を歯周病の治療および他の歯の修復プロセスに用いてもよい。かか る作用剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、 あるいは骨形成細胞前駆体の分化を誘導しうる。本発明蛋白は、例えば、骨およ び／または軟骨修復の刺激により、あるいは炎症または炎症プロセスにより媒介 される組織破壊のプロセス（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性等）をブロックす ることにより、骨粗穀症または骨関節炎の治療においても有用でありうる。 本発明蛋白によるものとしてもよい組織発生活性のもう１つのカテゴリーは鍵 ／靭帯の形成である。鍵／靭帯様組織または他の組織が正常に形成されない環境 におけるかかる組織の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の動物におけ る鍵または靭帯の裂傷、変形および他の鍵または靭帯の欠損の治癒、に適用され る。鍵／靭帯様組織誘導蛋白を用いるかかる調合物は、鍵または靭帯組織に対す るダメージの予防ならびに鍵または靭帯の骨または他の組織への固定の改善に用 いてもよい。本発明組成物により誘導されるデノボ鍵／靭帯様組織形成は、先天 性の、外傷によ る、あるいは腫瘍学的切除により誘発される脳顔面頭蓋の欠損の修復に貢献し、 さらに鍵または靭帯の付着または修復のための美容整形外科手術においても有用 である。本発明組成物は、鍵−または靭帯−形成細胞を誘引するための環境を提 供し、鍵−または靭帯−形成細胞の増殖を刺激し、鍵−または靭帯−形成細胞の 前駆体の分化を誘導し、あるいはインビボに戻した場合に組織修復を行うように エクスビボでの鍵／靭帯細胞または前駆体の増殖を誘導しうる。本発明組成物は 、鍵炎、手根骨トンネル症候群および他の鍵または靭帯の欠損にも有用である。 本発明組成物は、適当なマトリックスおよび／または当該分野でよく知られた担 体のごとき隔離剤を含んでいてもよい。 本発明蛋白は、神経細胞の増殖ならびに神経および脳組織の再生に、すなわち 、中枢および末梢神経系疾患およびニューロパシーならびに機械的疾患および外 傷性疾患（神経細胞または神経組織に対する変性、死もしくは外傷を包含）の治 療にも有用でありうる。より詳細には、末梢神経傷害、末梢ニューロパシーおよ び局在化ニューロパシーのごとき末梢神経系の疾病、ならびにアルツハイマー病 、パーキンソン病、ハンチントン病、筋委縮性外側脊髄硬化症およびShy-Drager 症候群のごとき中枢神経系の疾病の治療に蛋白を使用してもよい。本発明により 治療してもよいさらなる症状は、脊髄疾患のごとき機械的疾患および外傷性疾患 、頭部外傷ならびに卒中のごとき脳血管系の疾患を包含する。化学療法または他 の医学的療法により引き起こされる末梢ニューロパシーは、本発明蛋白を用いて 治療可能である。 また本発明蛋白は、圧迫性潰瘍、血管機能不全に関連した潰瘍、外科的および 外傷による創傷等（これらに限らない）を包含する非治癒性創傷のより好ましく 迅速な閉口の促進にも有用でありうる。 また本発明蛋白は、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を包含 ）、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）、および血管（血管内皮を包含）組織の ごとき他の組織の発生、あるいはかかる組織を構成している細胞の増殖促進のた めの活性を示しうる。望ましい効果の一部は、線維症性瘢痕を抑制することによ る正常組織の再生であってもよい。本発明蛋白は脈管形成活性も示しうる。 本発明蛋白は、腸の保護または再生、および肺または肝臓の線維症、種々の組 織 の再潅流傷害、および全身的なサイトカインのダメージにより生じる症状の治療 にも有用でありうる。 本発明蛋白は、前駆体組織または細胞からの上記組織の分化促進または抑制； あるいは上記組織の増殖抑制にも有用でありうる。 本発明蛋白の活性は、とりわけ、以下の方法により測定してもよい： 組織再生活性のアッセイは、国際公開ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、鍵） ；国際公開ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）；国際公開ＷＯ９１／０ ７４９１（皮膚、内皮）に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない 。 創傷治癒活性のアッセイは、Winter，Epidermal Wound Healing，pps．71-112 (Maibach，HI and Rovee，DT，eds.)，Year Book Medical Publishers，Inc.，C hicago(Eaglstein and Mertz，J．Invest．Dermatol 71:382-384(1978)により修 飾されている）に記載されたものを包含するが、これらに限らない。 アクチビン／インヒビン活性 また、本発明蛋白はアクチビン−またはインヒビン−関連活性を示しうる。イ ンヒビン類は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出抑制能により特徴づけられ、 アクチビン類は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出刺激能により特徴づけられ る。よって、本発明蛋白は、単独であるいはインヒビンαファミリーのメンバー とのヘテロダイマーの形態で、メスの哺乳動物の繁殖力を減少させ、オスの哺乳 動物の精子形成減少させるインヒビンの能力に基づく不妊薬として有用でありう る。十分な量の他のインヒビンの投与により、これらの哺乳動物において不妊を 誘導することができる。別法として、本発明蛋白は、ホモダイマーとしてあるい はインヒビン−βグループの他の蛋白のサブユニットとのヘテロダイマーとして 、下垂体前葉細胞からのＦＳＨ放出の刺激におけるアクチビン分子の能力に基づ いて、繁殖力を誘導する治療薬として有用でありうる。例えば、米国特許第４７ ９８８８５号参照。また本発明蛋白は、性的に未成熟な哺乳動物における繁殖の 向上に有用である可能性があり、その結果、ウシ、ヒツジおよびブタのごとき家 畜の生存期間中の繁殖力が増大する。 本発明蛋白の活性は、とりわけ、下記方法により測定してもよい： アクチビン／インヒビン活性のアッセイは、Vale et al.，Endocrinology 91: 562-572，1972;Ling et al.，Nature 321:779-782，1986;Vale et al.，Nature 321:776-779，1986;Mason et al.，Nature 318:659-663,1985;Forage et al.，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 83:3091-3095,1986に記載のアッセイを包含するが 、これらに限らない。 化学走性／ケモキネシス活性 本発明蛋白は、哺乳動物細胞、例えば単球、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸 球および／または内皮細胞の化学走性またはケモキネシス活性（例えば、ケモカ インとして作用）を有する可能性がある。化学走性およびケモキネシス蛋白を用 いて所望細胞集団を所望作用部位に動員または誘引することができる。化学走性 またはケモキネシス蛋白は、組織に対する傷害および他の外傷の治療ならびに局 所的な感染の治療に特に有利である。例えば、リンパ球、単球または好中球の腫 瘍または感染部位への誘引は、腫瘍または感染因子に対する免疫応答を改善しう る。 特定の蛋白またはペプチドは特定の細胞集団に対して化学走性活性を有してお り、刺激可能な場合には、直接的または間接的にかかる細胞集団の方向または運 動を指令する。好ましくは、蛋白またはペプチドは、細胞の方向づけられた運動 を直接的に刺激する能力を有する。特定の蛋白が細胞集団に対する化学走性活性 を有するかどうかを、かかる蛋白またはペプチドを細胞化学走性の既知アッセイ に用いることにより容易に決定することができる。 本発明蛋白の活性は、とりわけ、下記方法により測定してもよい： 化学走性活性のアッセイ（化学走性を誘導または妨害する蛋白を同定するアッ セイ）は、細胞の膜を越えた移動を誘導する蛋白の能力ならびに１の細胞集団の 他の細胞集団への付着を誘導する蛋白の能力を測定するアッセイを含む。移動お よび付着に適したアッセイは、Current Protocols in Immunology，Ed by J.E． Coligan，A.M．Kruisbeek，D.H．Margulies，E.M．Shevach，W.Strober，Pub．G reene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 6.12，Measure ment of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6．12.28;Taub et al．J．Clin．Invest．9 5:1370-1376，1995;Lind et al．APMIS 103:140-146，1995;Muller et al Eur． J．Immunol．25:1744-1748;Gruber et al．J．of Immunol．152:5860-5867，199 4;Johnston et al．J．of Immunol．153:1762-1768，1994に記載のアッセイを包 含するが、これらに限らない。 止血および血栓溶解活性 また、本発明蛋白は、止血または血栓溶解活性を示す可能性がある。結果とし て、かかる蛋白は、種々の凝血疾患（血友病のごとき遺伝性疾患を包含）の治療 に有用であり、あるいは外傷、手術または他の原因により生じた傷害の治療にお ける凝血および他の止血を促進しうる。本発明蛋白は、血栓の溶解または血栓形 成阻害ならびにそれらにより生じる症状（例えば、心筋梗塞および中枢神経系血 管の梗塞（例えば、卒中）のごとき）の治療および予防に有用でありうる。 本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい： 止血および血栓溶解活性のアッセイは、Linet et al.，J．Clin．Pharmacol． 26:131-140,1986;Burdick et al.，Thrombosis Res．45:413-419，1987;Humphre y et al.，Fibrinolysis 5:71-79(1991);Schaub，Prostaglandins 35:467-474， 1988に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。 受容体／リガンド活性 また、本発明蛋白は、受容体、受容体リガンドまたは受容体／リガンド相互作 用の阻害剤もしくはアゴニストとしての活性を示しうる。かかる受容体およびリ ガンドの例は、サイトカイン受容体およびそれらのリガンド、受容体キナーゼお よびそれらのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそれらのリガンド、細胞− 細胞相互作用に関与する受容体およびそれらのリガンド（細胞付着分子（セレク チン、インテグリンおよびそれらのリガンドのごとき）ならびに抗原提示、抗原 認識、細胞性および体液性免疫応答の発生に関与する受容体／リガンド対などを 包含）を包含するがこれらに限らない。受容体およびリガンドは、関連する受容 体／リガンド相互 作用に対する潜在的なペプチドまたは小型分子阻害剤のスクリーニングにも有用 である。本発明蛋白（受容体およびリガンドのフラグメントを包含するが、これ らに限らない）は、それ自体、受容体／リガンド相互作用の阻害剤として有用で ありうる。 本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい： 受容体−リガンド活性の適当なアッセイは、Current Protocols in Immunolog y，Ed by J．E．Coligan，A．M．Kruisbeek，D．H．Margulies，E．M．Shevach ，W．Strober，Pub．Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(C hapter 7.28，Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7. 28.1-7.28.22),Takai et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:6864-6868，198 7;Bierer et al.，J．Exp．Med．168:1145-1156，1988;Rosenstein et al.，J． Exp．Med．169:149-160 1989;Stoltenborg et al.，J．Immunol．Methods 175： 59-68，1994;Stitt et al.，Cell 80:661-670，1995に記載のアッセイを包含す るが、これらに限らない。 抗炎症活性 本発明蛋白は抗炎症活性を示しうる。抗炎症活性は、刺激応答に関与している 細胞に刺激を与えることにより、細胞−細胞相互作用（例えば、付着のごとき） を阻害または促進することにより、炎症プロセスに関与している細胞の化学走性 を阻害または促進することにより、細胞溢出を阻害または促進することにより、 あるいは炎症応答をより直接的に阻害または促進する他の因子の産生を刺激また は抑制することにより発揮される。かかる活性を示す蛋白を用いて炎症の症状（ 慢性もしくは急性症状を包含、感染に関連した炎症（敗血性ショック、敗血症も しくは全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）のごとき）、虚血−再潅流傷害、エン ドトキシンによる致命的傷害、関節炎、補体により媒介される超急性拒否反応、 腎炎、サイトカインもしくはケモカインにより誘導される肺の傷害、炎症性腸疾 患、クローン病またはＴＮＦもしくはＩＬ−１のごときサイトカインの過剰産生 から生じる疾病を包含するがこれらに限らない）を治療することができる。本発 明蛋白は、アナフィラキシー および抗原性物質もしくは材料に対する過敏症の治療にも有用でありうる。 カドヘリン／腫瘍侵入抑制活性 カドヘリン（cadherin）はカルシウム依存性付着分子であり、発達中において 、詳細には特定の細胞タイプを決定することにおいて主要な役割を果たしている と思われる。正常なカドヘリン発現の損失または変化は、腫瘍増殖および転移に 関連した細胞付着特性への変化を誘導しうる。カドヘリンの機能失調は、尋常性 天疱瘡および落葉状天疱瘡（自己免疫性の皮膚水泡疾患）、クローン病、および いくつかの発達異常のごときヒトの他の疾病にも関与している。 カドヘリンスーパーファミリーは４０余りのメンバーを包含し、それぞれが異 なる発現パターンを有している。当該スーパーファミリーのすべてのメンバーは 、共通の保存された細胞外リピート（カドヘリンドメイン）を有するが、分子の 他の部分において構造の相違が見られる。カドヘリンドメインはカルシウムに結 合してそれらの三次構造を形成するので、カルシウムはそれらの付着に必要であ る。第１のカドヘリンドメインにおける少数のアミノ酸は同種親和性付着のため の基礎を提供するので、この認識部位の修飾はカドヘリンの特異性を変化させる 可能性があり、その結果、自分自身だけを認識するのではなく、変異分子も異な るカドヘリンに結合できるようになる。さらに、いくつかのカドヘリンは他のカ ドヘリンとの異種親和性付着にも関与している。 カドヘリンスーパーファミリーのメンバーの１つであるＥ−カドヘリンは上皮 細胞タイプにおいて発現される。病理学的には、Ｅ−カドヘリン発現が腫瘍にお いて失われる場合、悪性細胞は侵入性となり、癌が転移する。Ｅ−カドヘドリン を発現するポリヌクレオチドを癌細胞系にトランスフェクションすることは、変 化した細胞形態を元に戻し、細胞相互および他の基質への付着性を回復させ、細 胞増殖速度を低下させ、足場依存性細胞の増殖を劇的に減少させることにより、 癌に関連した変化を回復させた。よって、Ｅ−カドヘドリン発現を再導入するこ とは、癌腫をより進行していない段階に戻す。他のカドヘドリンも、他の組織タ イプ由来の癌腫において同じ侵入抑制的役割を有している可能性がある。それゆ え、カドヘドリン活 性を有する本発明蛋白、およびかかる蛋白をコードする本発明ポリヌクレオチド を用いて癌を治療することができる。かかる蛋白またはポリヌクレオチドを癌細 胞に導入することは、正常なカドヘドリン発現を提供することにより、これらの 細胞において観察される癌性の変化を減少または除去しうる。 癌細胞は、本来のものとは異なる組織タイプのカドヘリンを発現することも知 られており、それゆえこれらの癌細胞は異なる組織に侵入でき、転移できる。カ ドヘリン活性を有する本発明蛋白、およびかかる蛋白をコードする本発明ポリヌ クレオチドは、これらの細胞において不適切に発現されたカドヘドリンと置換し 、正常な細胞付着特性を回復させ、細胞の転移傾向を減少させ、あるいは除去し うる。 さらに、カドヘリン活性を有する本発明蛋白、およびかかる蛋白をコードする 本発明ポリヌクレオチドを用いてカドヘリンを認識しこれに結合するする抗体を 得ることもできる。かかる抗体を用いて不適切に発現された腫瘍細胞カドヘドリ ンの付着をブロックし、細胞が他の場所で腫瘍を形成しないようにすることもで きる。かかる抗−カドヘドリン抗体を、癌の等級、病理学的タイプ、および予後 のためのマーカーとして使用できる。すなわち、癌が進行すると、カドヘドリン 発現は低下し、カドヘドリン結合抗体を用いることによりこのカドヘドリン発現 の低下を検出することができる。 カドヘドリン活性を有する本発明蛋白のフラグメント、好ましくはカドヘドリ ン認識部位のデカペプチド、およびかかる蛋白フラグメントをコードする本発明 ポリヌクレオチドを用いて、カドヘリンに結合させ、望ましくない効果を生じる カドヘリンの結合を妨げることにより、カドヘリン機能をブロックすることもで きる。さらに、カドヘリン活性を有する本発明蛋白のフラグメント、好ましくは 癌患者の循環系において安定であることがわかっている末端切断された可溶性カ ドヘドリンフラグメント、およびかかる蛋白フラグメントをコードするポリヌク レオチドを用いて正しい細胞−細胞付着を混乱させることもできる。 カドヘドリンの付着および侵入抑制活性のアッセイは、Hortsch et al．J Bio l Chem 270(32):18809-18817，1995;Miyaki et al．Oncogene 11:2547-2552，19 95;Ozawa et al．Cell 63:1033-1038，1990.に記載されたものを包含するが、こ れらに限ら ない。 腫瘍阻害活性 腫瘍の免疫学的治療または予防に関する上記活性のほかに、本発明蛋白は他の 抗腫瘍活性を示しうる。ある蛋白は腫瘍増殖を直接的または間接的に（例えば、 ＡＤＣＣを介して）阻害しうる。ある蛋白は、腫瘍組織または腫瘍前駆体組織に 作用して、腫瘍増殖を支持するに必要な組織の形成を阻害し（例えば、脈管形成 を阻害することにより）、腫瘍増殖を阻害する他の因子、作用剤または細胞タイ プの産生を引き起こすことにより、あるいは腫瘍増殖を促進する因子、作用剤ま たは細胞タイプを除去または阻害することにより腫瘍阻害活性を示しうる。他の活性 本発明蛋白は、下記のさらなる活性または効果の１つまたはそれ以上を示しう る：細菌、ウイルス、真菌および他の寄生虫（これらに限らず）を包含する感染 性因子の殺傷；身長、体重、体毛の色、目の色、皮膚または他の組織の色素沈着 、または器官または身体部分のサイズまたは形態（例えば、豊胸またはその逆） を包含する身体特性への影響（抑制または促進）；摂食した脂肪、蛋白または炭 水化物の消化への影響；食欲、性欲、ストレス、認識（認識の疾患を包含）、鬱 （鬱病性疾患を包含）および暴力的行為（これらに限らず）を包含する行動特性 への影響；鎮痛効果または他の痛み軽減効果の提供；造血系以外の系統における 胚の幹細胞の分化および増殖の促進；ホルモンまたは内分泌活性；酵素の場合、 酵素欠乏の修正および関連疾患の治療；過剰増殖性疾患（例えば、乾癬のごとき ）の治療；免疫グロブリン様活性（例えば、抗体または補体に結合する能力）； ならびにワクチン組成物において抗原として作用してかかる蛋白またはかかる蛋 白と交差反応する他の物質もしくは存在に対する免疫応答を生じさせる能力。投与および用量 本発明蛋白（どのような源からであってもよく、組み換え法および非組み換え 法 によるものを包含するが、これらに限らない）を、医薬上許容される担体と混合 して医薬組成物中に用いてもよい。かかる組成物は（蛋白および担体のほかに） 、希釈剤、充填剤、塩類、バッファー、安定化剤、可溶化剤、および当該分野で よく知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、有 効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒の物質を意味する。担体の特性 は投与経路に依存する。本発明医薬組成物は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮ Ｆ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７ 、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｉ Ｌ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、 Ｍｅｇ−ＣＳＦ、スロンボポイエチン、幹細胞因子、およびエリスロポイエチン のごときサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子を含有していてもよ い。医薬組成物はさらに、蛋白活性を増強し、あるいは治療においてその活性ま たは有用性を補う他の作用剤を含有していてもよい。かかるさらなる因子および ／または作用剤を医薬組成物に含有させて、本発明蛋白との相乗効果を発揮させ 、あるいは副作用を最小化してもよい。逆に、特定のサイトカイン、リンホカイ ン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の処方に本 発明蛋白を含有させて、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解 因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小化してもよい。 本発明蛋白は、多量体（例えば、ヘテロダイマーまたはホモダイマー）または それ自体もしくは他の蛋白との複合体となって活性でありうる。結果的に、本発 明医薬組成物は、かかる多量体または複合体形態の本発明蛋白を含むものであっ てもよい。 本発明医薬組成物は、本発明蛋白と蛋白もしくはペプチド抗原との複合体の形 態であってもよい。蛋白および／またはペプチド抗原は、Ｂリンパ球ならびにＴ リンパ球に対して刺激シグナルを送達するであろう。Ｂリンパ球はその表面免疫 グロブリン受容体を通して抗原に応答するであろう。Ｔリンパ球は、ＭＨＣ蛋白 による抗原提示後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通して抗原に応答するであろう。 ＭＨＣならびに宿主細胞のクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ遺伝子によりコー ドされたもの を包含する構造上関連した蛋白は、Ｔリンパ球に対するペプチド抗原の提示に役 立つであろう。抗原成分は、精製ＭＨＣ−ペプチド複合体のみとして、または直 接Ｔ細胞にシグナルを送ることのできる同時刺激分子とともに供給されうる。あ るいはまた、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンならびにＴ細胞上のＴＣＲおよび他 の分子に結合しうる抗体を、本発明医薬組成物と混合することもできる。 本発明医薬組成物はリポソーム形態であってもよく、その中で本発明蛋白はさ らに他の医薬上許容される担体、脂質のごとき両親媒性作用剤（水溶液中でミセ ルのような凝集体形態、不溶性単層、液状結晶またはラメラ層として存在）と混 合されている。リポソーム処方に適する脂質は、モノグリセリド、ジグリセリド 、スルファチジド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を包含するが 、これらに限らない。かかるリポソーム処方の製造は当業者のレベルの範囲内で あり、例えば、米国特許第４２３５８７１、４５０１７２８、４８３７０２８、 および４７３７３２３号（参照によりそれらすべてを本明細書に記載されている ものとみなす）に記載されたようなものである。 本明細書の用語「治療上有効量」とは、有意な患者の利益、例えば、かかる症 状の徴候の改善、治癒、治癒速度の増大を示すに十分な医薬組成物または方法の 各有効成分の合計量を意味する。単独で投与される個々の有効成分について用い る場合、該用語は当該成分のみをいう。有効成分の組み合わせに用いる場合、逐 次投与あるいは同時投与にかかわらず治療効果を生じる有効成分量の合計量をい う。 本発明の治療方法の実施において、治療上有効量の本発明蛋白を治療すべき症 状を有する哺乳動物に投与する。本発明方法に従って、単独またはサイトカイン 、リンホカインもしくは他の造血因子のごとき他の治療薬とともに本発明蛋白を 投与してもよい。１種またはそれ以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の 造血因子と共投与する場合、本発明蛋白をサイトカイン、リンホカイン、他の造 血因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓因子と同時または逐次投与してもよい。逐 次投与する場合、担当医師は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血 栓溶解因子もしくは抗血栓因子と本発明蛋白との組み合わせにおける適切な投与 順序を決定するであろう。 本発明医薬組成物中または本発明の実施に用いる本発明蛋白の投与を種々の慣 用的方法、例えば、経口的摂食、吸入、または皮内、皮下、または静脈注射で行 うことができる。患者への静脈注射が好ましい。 治療上有効量の本発明蛋白を経口投与する場合、本発明蛋白は錠剤、カプセル 、粉末、溶液またはエリキシルの形態であろう。錠剤形態で投与する場合、本発 明医薬組成物はゼラチンのごとき固体担体またはアジュバントをさらに含有して いてもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約５ないし９５％の本発明蛋白、 好ましくは約２５ないし９０％の本発明蛋白を含有する。液体形態で投与する場 合、水、ペトロレウム、動物または植物起源の油脂、例えばピーナッツ油、鉱油 、大豆油、またはゴマ油、または合成油脂を添加してもよい。液体形態の医薬組 成物は、生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはグリコール 類（例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレング リコール）をさらに含有していてもよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物 は、約０．５ないし９０重量％の本発明蛋白、好ましくは約１ないし５０％の本 発明蛋白を含有する。 治療上有効量の本発明蛋白を静脈、皮内または皮下注射により投与する場合、 本発明蛋白はパイロジェン不含で、非経口的に許容される水溶液の形態であろう 。適切なｐＨ、等張性、安定性を有するかかる非経口的に許容される蛋白溶液の 調製は、当業者の範囲内である。静脈、皮内、または皮下注射用の好ましい医薬 組成物は、本発明蛋白のほかに、注射用塩化ナトリウム、リンゲル溶液、注射用 デキストロース、注射用デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、注射用乳酸 含有リンゲル溶液、または当該分野で知られている他の担体を含有すべきである 。本発明医薬組成物は、安定化剤、保存料、バッファー、抗酸化剤、または当業 者に知られた他の添加物を含んでいてもよい。 本発明医薬組成物中の本発明蛋白の量は、治療すべき症状の性質および重さ、 ならびに患者がすでに受けていた治療の性質による。最終的には、担当医師が、 各患者を治療すべき本発明蛋白量を決定するであろう。まず、担当医師は、低用 量の本発明蛋白を投与し、患者の応答を観察する。最適治療効果が得られるまで 、より高用量の本発明蛋白を投与してもよく、最適治療効果が得られた時点で用 量をさらに 増加させない。本発明方法を実施するための種々の医薬組成物は、体重１ｋｇあ たり約０．０１μｇないし約１００ｍｇの本発明蛋白（好ましくは、体重１ｋｇ あたり約０．１μｇないし約１０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり０．１ μｇないし約１ｍｇの本発明蛋白を含有すべきである。 本発明組成物を用いる静脈投与による治療の期間は、治療すべき疾病の重さな らびに各患者の状態および応答により変化させられるであろう。本発明蛋白の各 適用期間は、連続静脈投与の場合１２ないし２４時間の範囲であると考えられる 。最終的には、担当医師が、本発明医薬組成物を用いる静脈投与による治療の期 間を決定するであろう。 本発明蛋白を用いて動物を免役して、本発明蛋白と特異的に反応するポリクロ ーナルおよびモノクローナル抗体を得てもよい。蛋白全体またはそのフラグメン トを免疫原として用いてかかる抗体を得てもよい。ペプチド免疫源はカルボキシ 末端にシステイン残基をさらに含んでいてもよく、キーホールリムペット・ヘモ シアニン（ＫＬＨ）のごときハプテンに結合する。かかるペプチドを合成する方 法は当該分野において知られており、例えば、R．P．Merrifield，J．Amer．Che m．Soc．85，2149-2154(1963)；J．L．Krstenansky，et．al.，FEBS Lett．211 ，10(1987)に記載のごときものがある。本発明蛋白に結合するモノクローナル抗 体は、本発明蛋白の免疫検出用の有用な診断薬でありうる。本発明蛋白に結合す る中和抗体は、本発明蛋白に関連した症状の治療薬として有用でありうるし、さ らに本発明蛋白の異常発現が関与しているいくつかの形態の癌の治療におけるあ る種の腫瘍の治療において有用でありうる。癌細胞または白血球細胞の場合、本 発明蛋白に対する中和モノクローナル抗体は、本発明蛋白により媒介されうる癌 細胞の転移蔓延の検出および予防に有用でありうる。 骨、軟骨、腱または靭帯の再生に有用な本発明組成物に関して、治療方法は、 組成物を局所的、全身的、またはインプラントもしくはデバイスのごとく局部的 に投与することを包含する。投与する場合、本発明に使用する治療組成物は、も ちろん、パイロジェン不含の生理学的に許容される形態である。さらに、望まし くは、組成物をカプセル封入するかまたは粘性形態として注射して骨、軟骨また は組織ダメー ジ部位に送達してもよい。局所投与は傷の治癒および組織修復に適する。上記組 成物中に含有されていてもよい本発明蛋白以外の治療上有用な作用剤を、代替的 または付加的に、本発明方法における組成物と同時または逐次投与してもよい。 好ましくは、骨および／または軟骨形成のためには、組成物は、蛋白含有組成物 を骨および／または軟骨ダメージ部位に送達し、骨および軟骨の発生のための構 造を提供し、さらに最適には体内に吸収されうるマトリックスを含有するであろ う。かかるマトリックスは、他の移植される医学的器具に現在使用されている材 料からできていてもよい。 マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外 観および界面特性に基づく。組成物の特別な適用により適当な処方が決定されよ う。組成物用として可能なマトリックスは生分解性で、化学的に知られた硫酸カ ルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコ ール酸およびポリ無水物であってもよい。他の使用可能な材料は生分解性で、生 物学的によく知られたもの、例えば、骨または皮膚のコラーゲンである。さらに マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリックス成分を含んでいてもよい。 他の可能なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミ ネート、または他のセラミックスのごとき生分解性でなく、化学的に知られたも のである。マトリックスは上記タイプの材料の組み合わせ、例えばポリ乳酸およ びヒドロキシアパタイトあるいはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムを含んで いてもよい。バイオセラミックスを、組成物中、例えばカルシウム−アルミネー ト−ホスフェート中において変更してもよく、加工して孔サイズ、粒子サイズ、 粒子形状および生分解性を変化させてもよい。 １５０ないし８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔性粒子形態の乳酸およ びグリコール酸の５０：５０（モル重量）のコポリマーが現在のところ好ましい 。いくつかの適用例においては、カルボキシメチルセルロースまたは自己由来の 血餅のごとき隔離剤を用いてマトリックスからの蛋白組成物の解離を防止するこ とが有用であろう。 隔離剤の好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒド ロ キシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメ チルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを包含するアルキルセルロ ース（ヒドロキシアルキルセルロースを包含）のごときセルロース性材料であり 、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン性の塩が最も好ましい。他 の好ましい隔離剤は、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレング リコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよびポ リ（ビニルアルコール）を包含する。本発明に有用な隔離剤の量は、全処方重量 に対して０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、この量は、ポ リマーマトリックスからの蛋白の脱離を防止し、組成物の適切な取り扱いを可能 にする量であるが、前駆細胞がマトリックスから浸潤し、そのことにより前駆細 胞の骨形成活性を促進する機会を蛋白に付与するようにするには、あまり多くな いようにする。 さらなる組成物において、本発明蛋白が骨および／または軟骨の欠損、傷、ま たは組織の治療に有益な他の作用剤と混合されていてもよい。これらの作用剤は 、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因 子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を 包含する。 また、目下のところ、治療組成物は獣医学的用途にも価値がある。詳細には、 ヒトのほかに、家畜およびサラブレッドのウマが本発明蛋白を用いるかかる治療 に望ましい患者である。 組織の再生に使用される蛋白含有医薬組成物の投与規則は、蛋白の作用を変化 させる種々の要因、例えば形成が望まれる組織重量、ダメージ部位、ダメージを 受けた組織の状態、傷のサイズ、必要な組織のタイプ（例えば、骨）、患者の年 齢、性別、および食事、感染の重さ、投与期間、ならびに他の臨床的要因を考慮 して医師が決定するであろう。用量は、復元に使用するマトリックスのタイプお よび医薬組成物中の他の蛋白の含有に応じて変更されてもよい。例えば、ＩＧＦ Ｉ(インスリン様増殖因子Ｉ)のごとき他の既知増殖因子の最終組成物への添加 も用量に影響しうる。組織／骨の増殖および／または修復を、例えばＸ線、組織 形態学的調査およびテトラサイクリン標識により定期的に評価することにより経 過をモニターすることができる。 本発明ポリヌクレオチドを遺伝子治療に用いることもできる。かかるポリヌク レオチドをインビボまたはエクスビボで細胞に導入して哺乳動物対象中で発現さ せることができる。核酸を細胞または生物に導入するための他の知られた方法に より本発明ポリヌクレオチドを投与してもよい（ウイルスベクターに入れて、あ るいは裸のＤＮＡの形態として等があるが、これらに限らない）。 本発明蛋白存在下で細胞をエクスビボにおいて培養して増殖させ、あるいはか かる細胞に対する所望効果を生じさせ、あるいはかかる細胞中に所望活性を生じ させてもよい。次いで、処理された細胞を、治療目的で、インビボにおいて導入 することができる。 本明細書に引用した特許および文献を、参照により全体が本明細書に記載され ているものとみなす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マッコイ，ジョン・エム アメリカ合衆国01867マサチューセッツ州 リーディング、ハワード・ストリート56 番 (72)発明者 ラバリー，エドワード・アール アメリカ合衆国01451マサチューセッツ州 ハーバード、アン・リー・ロード113番 (72)発明者 レイシー，リサ・エイ アメリカ合衆国01720マサチューセッツ州 アクトン、スクール・ストリート124番 (72)発明者 マーバーグ，デイビッド アメリカ合衆国01720マサチューセッツ州 アクトン、オーチャード・ドライブ２番 (72)発明者 トレーシー，モーリス アメリカ合衆国02167マサチューセッツ州 チェスナット・ヒル、ウォルコット・ロ ード93番 (72)発明者 スパルディング，ビッキー アメリカ合衆国01821マサチューセッツ州 ビラリカ、メドーバンク・ロード11番 (72)発明者 アゴスティノ，マイケル・ジェイ アメリカ合衆国01810マサチューセッツ州 アンドーバー、ウォルコット・アベニュ ー26番 (72)発明者 ハウズ，スティーブン・エイチ アメリカ合衆国02144マサチューセッツ州 スモーアビル、チェスター・ストリート 44番、アパートメント２ (72)発明者 フェチテル，キム アメリカ合衆国02174マサチューセッツ州 アーリントン、マリオン・ロード46番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１のヌクレオチド２４５からヌクレオチド２４９７までのヌ クレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：１のヌクレオチド２９９からヌクレオチド２４９７までのヌ クレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：１のヌクレオチド１５４からヌクレオチド４３０までのヌク レオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｅ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｆ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコードしているポリヌクレ オチド； （ｇ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｈ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしているポリヌクレ オチド； （ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしているポリヌクレオ チド； （ｊ）生物学的活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含 む蛋白をコードしているポリヌクレオチド（該フラグメントは配列番号：２の８ 個の連続したアミノ酸を含む）； （ｋ）上記（ａ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドの対立遺伝子変種であるポリヌ クレオチド； （ｌ）上記（ｉ）または（ｊ）の蛋白の種相同体をコードしているポリヌクレ オチド；および （ｍ）厳密な条件下で（ａ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチドのいずれか１つ にハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。 ２．少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されている請求項１のポ リヌクレオチド。 ３．請求項２のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。 ４．該細胞が哺乳動物細胞である請求項３の宿主細胞。 ５．（ａ）請求項３の宿主細胞の培養物を適当な培地中で増殖させ；ついで （ｂ）培養物から蛋白を精製する ことを含む、請求項２のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白の製造方法。 ６．請求項５の方法により製造される蛋白。 ７．（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸62までのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号：２の８個の連続したアミノ酸を含む、配列番号：２のアミノ 酸配列のフラグメント；および （ｄ）受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む蛋白であって、他の哺乳動物蛋白 を実質的に含まない蛋白。 ８．配列番号：２のアミノ酸配列を含む請求項７の蛋白。 ９．配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸６２までのアミノ酸配列を含む請 求項７の蛋白。 １０．請求項７の蛋白および医薬上許容される担体を含む組成物。 １１．治療上有効量の請求項１０の組成物を哺乳動物対象に投与することを含 む、医学的状態の予防、治療または改善方法。 １２．配列番号：１のｃＤＮＡ配列に対応する単離遺伝子。 １３．配列番号：１のヌクレオチド２４５からヌクレオチド２４９７までのヌ クレオチド配列を含む請求項１のポリヌクレオチド。 １４．受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ の全長蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む請求項１のポリヌクレオ チド。 １５．受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされる全長蛋白をコードしている請求項１の ポリヌクレオチド。 １６．受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ の成熟蛋白コーディング配列のヌクレオチド配列を含む請求項１のポリヌクレオ チド。 １７．受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされる成熟蛋白をコードしている請求項１の ポリヌクレオチド。 １８．配列番号：２のアミノ酸配列を含む蛋白をコードしている請求項１のポ リヌクレオチド。 １９．生物学的活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含 む蛋白をコードしている請求項１のポリヌクレオチド（該フラグメントは配列番 号：２の８個の連続したアミノ酸を含む）。 ２０．生物学的活性を有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含 む請求項７の蛋白(該フラグメントは配列番号：２の８個の連続したアミノ酸を 含む)。 ２１．受託番号ＡＴＣＣ９８１４６として寄託されたクローンＢＲ５３３ ４ のｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列を含む請求項７の蛋白。 ２２．配列番号：１のヌクレオチド２９９からヌクレオチド２４９７までのヌ クレオチド配列を含む請求項１のポリヌクレオチド。