JP2002501548A

JP2002501548A - 免疫系による生きた被移植細胞の破壊を阻止する方法

Info

Publication number: JP2002501548A
Application number: JP54956799A
Authority: JP
Inventors: ウェバー、コリン・ジェイ; ハグラー、メアリー、ケー; リンスリー、ピーター・エス; カップ、ジュディス、エー; セーフリー、スーザン・エー
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2002-01-15
Also published as: US20040047890A1; WO1999049734A1; EP0984699A1; US7041634B2; CA2290363A1; EP0984699A4; AU3206799A

Abstract

(57)【要約】本発明は、患者に移植した生細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、a)移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生細胞又は生細胞を含む組織を封入することと、b)前記被封入細胞又は組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で、患者を処置すること、を具備する方法を提供する。ある実施態様において、免疫系の協同刺激現象を阻害する該物質はCTLA4である。本発明は、患者の糖尿病を治療する方法であって、a)半透膜を具備する装置内に、生きたインシュリン産生細胞、又は生きたインシュリン産生細胞を含む組織を封入することにより、生きた被封入インシュリン産生細胞を得ることと、b)患者の糖尿病を治療するのに有効な量の、ステップ(a)で得た、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植することと、c)ステップ(b)で得られた相当量の生きた被封入インシュリン産生細胞に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置することを具備する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】免疫系による生きた被移植細胞の破壊を阻止する方法本出願は、米国仮出願第60/004,375号の利益を主張する1995年９月27日に出願されたPCT国際出願PCT/US96/15577の一部継続出願である1998年３月27日出願、米国第09/049,865号の優先権を主張するものであり、これらの内容は参考文献として本明細書に取り込まれる。本明細書において開示される発明は、政府の援助によるNIHグラントRO1-DK390 88とRO1DK53057の下でなされた。従って、米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。本出願を通じて、様々な参考文献が、括弧内に参照されている。本明細書では、参考文献として、これらの文献の開示内容全体を本出願に取り込み、本発明が属する分野の現状をより完全に記載する。これらの参考文献の完全な文献リストは、本出願の最後部、請求の範囲の前に示されている。発明の背景インシュリン依存性糖尿病(IDDM)の合併症を回避するためには、さらに優れたインシュリン補充療法が必要不可欠である。我々の最終目標は、ミクロカプセル化した異種膵島(xenogeneic islet)を移植する技術を開発し、糖尿病患者に、耐久性のある、インシュリンの生理的供給源を提供することである。ミクロカプセルが生体に適合すること、およびストレプトゾトシン(SZN)で誘発された糖尿病を発症したマウスの腹腔内で、ミクロカプセルに含有された異種膵島の移植片が永続的に機能することは以前から実証されてきた。このように、ミクロカプセルは、インビボにおいて損傷を受けず、安定なようであって、長期的な生存および異種膵島の機能に必要とされるであろう因子がアクセスすることができる。ミクロカプセルは、レシピエントのリンパ球とドナーの膵島との間の細胞−細胞間接触を妨げる機械的な障壁として作用する。機械的な障壁は、免疫的な破壊から移植片を保護するというより、主として宿主の感作を妨げる。何故なら、カプセル化した膵島は、膵島のドナー細胞抗原に対して予め感作されたレシピエントによって極めて急速に破壊されるからである。同様に、カプセル化した異種膵島は、NOD マウスによって、(2週間で)拒絶されたが、これはおそらく、NODが膵島抗原に対して予め感作されていることによるものであろう。NODマウス中の拒絶された異種移植片は、IL-1α、TNFα(両者は免疫組織化学によって裏付けられた)を有する多数の活性化されたマクロファージ及び免疫グロブリンに取り囲まれており、 IL-4のmRNAがRT-PCRによって検出された。我々は、カプセル化膵島から分泌又は流出したドナー抗原がNODの拒絶を開始せしめ、宿主APC(antigen presenting ce ll；抗原提示細胞)によるMHC(major histocompatibility complex；主要組織適合性複合体)クラスII経路を介して、ドナー抗原がプロセッシングされると仮定している。これらのAPCは、Th2応答を生じせしめるNOD CD4⁺T細胞を活性化し、ドナー膵島の破壊はサイトカインを介した現象を通じで起こる。我々は、ミクロカプセル化法を改良し、NODマウスの中でさえ、近縁種である( concordant)ラットの異種膵島移植片が長期間生存し得るようにした。さらに、我々は、NODの協同刺激分子(co-stimulatory molecule)をCTLA4Igで阻害すれば、近縁種でない(discordant)ウサギ膵島異種移植片の生存が200日まで、顕著に延びることを見出した。このようにして、我々は、自己免疫性糖尿病レシピエントの中にカプセル化膵島異種移植片を移植する際の諸問題を克服することもできた。インシュリン依存性糖尿病この数年間で、インシュリン依存性糖尿病(IDDM)に対する治療法の効果又はその知識が著しく増大したことは明らかである。糖尿病の制御及び合併症に関する試験(DCCT;Diabetes Control and Complications Trial)によって、集中的インシュリン療法が発病を遅らせ、IDDM患者の網膜障害、腎障害、及び神経障害の進行を緩やかにすることが見出された(1)。残念なことに、集中的インシュリン療法は多くのIDDM患者にとって適切とはいえず、注意深くモニタリングしても、DC CTの患者には重篤な低血糖徴候の増加がみられた(1)。皮肉にも、DCCTの結果は、膵臓移植及び膵島移植の理論が正しいことを支持するものである。膵島移植実験の開始以来、このような移植片は、外来性のインシュリンと比べて、より恒常的にインシュリンを供給し、糖質代謝が「正常に近く」修復されれば、IDDMの二次的な合併症は防止できるかもしれないという期待があった(2)。臨床的な膵臓同種移植(allograft)は、免疫抑制との組み合わせが実現するとともに、結果が向上し、多くの膵臓同種移植及び自己移植で、グルコースのホメオスタシスは正常に近くなる(3)。しかし、ヒト膵臓同種移植の１年目の死亡率は未だに高いので( 10%)、免疫抑制が必要であり、臨床的に実施された膵臓臓器全移植の数は、世界でも極く限られている(2,4,5)。ミクロカプセル化膵島異種移植の理論的裏付け膵臓の外分泌作用に関する問題を避け得るため、IDDM患者にとって、膵島移植は魅力的な治療法である。しかし、ヒト膵島をドナーとする同種移植は、長い間成功せず(3)、旦つヒト膵島の利用度及び供給は限られている。多数の患者に対する治療的な膵島移植には、ほぼ確実に、動物から採取されたドナー膵島(異種移植)が必要となるであろう(2,4)。臨床に用いるのに、最も適切な異種膵島の採取源には議論の余地が残されている。類人霊長類(subhuman primate)から膵島が単離され、免疫抑制を施した糖尿病の齧歯類に異種移植することにより、短期間糖尿病が回復した(6)。しかし、霊長類の使用にはそれを取り巻く重大な倫理的問題が存在する。他の有望な採取源はブタ、ウシ、イヌ及びウサギの膵島であり、これらは移植の拒絶が起こるまで、糖尿病の齧歯類の中で、きわめてよく機能する（すなわち、正常血糖値を維持する）(7-11)。ヒト、ウシ、及びブタ膵島の異種移植が、ヌードマウス及びラットの中で長期間生存することが文献に記載されており、異種のレシピエント中にも、膵島特異的成長因子が十分に存在していることを示唆する(2,12-17)。社会的／倫理的理由で、イヌの膵島は臨床には不適当である。ブタの膵島は、（完全な状態で）単離しづらく、且つインビトロで維持することも困難であるが、将来的な臨床応用には非常に有望である(18-21)。ウシの膵島の単離は、技術的には(ブタ膵島に比べて)容易であり、子ウシの膵島はグルコース応答性である(22) 。最近、ウサギ膵島の大規模な単離が開発された（予備的研究を参照)(23)。ウサキの膵臓は、魅力的な膵島の採取源である。ブタインシュリンのように、ウサキは、ヒトインシュリンと１アミノ酸だけが異なっており、且つウサギ膵島はグルコース応答性である(22,24)。さらに、ヒトの多くは天然の抗ウサギ抗体を保有しておらず、そのため異種移植の拒絶が起こらない可能性が増大するかもしれない(25)。現在では、多数のドナーを使用して、子ウシ、ブタ又はウサギの何れかから、糖尿病のヒトレシピエント当たり100万個のドナー膵島を単離することも考え得る。ヒトIDDMへの膵島異種移植に対する最も重大な障害は、種間移植拒絶を防ぐための、有効な免疫抑制療法が存在しないことである(2,26-28)。最近、抗CD4抗体 (16)若しくはCTLA4Ig(CD28-B7相互作用を阻止する高親和性融合タンパク質)(12) の何れかで処置するか、又は精製された高親和性抗HLA(ab)₂にドナー膵島を晒すことによって処置された(29)SZN−糖尿病マウスの中で、ヒト膵島が長期間生存するであろうという報告がなされた。しかし、これらの研究を除いては、多孔性の機械的障壁の助けを借りずに、膵島異種移植片が永続的に生存することは希であった。血管内装置及び血管外装置が共に開発中である。しかし、出血、凝固、及び生体不適合性のような臨床的に起こり得る合併症のため、現在それらを糖尿病患者に用いることは困難となっている(30,31)。例えば、皮下に配置されたアクリル性共重合体の中空繊維によって、ヒト膵島同種移植片は２週間生存し続けた（1.5cmの繊維当たり50膵島）(65,000M.W.透過性)(32)。しかし、50万個の膵島を移植するためには、これらの中空繊維が150メートル以上必要となり、臨床的には実施不可能である。膵島の封入法の中で最も有望なものの１つは、ポリアミノ酸−アルキネートミクロカプセルである。最近、多くの研究によって、ストレプトゾトシン糖尿病マウス又はラット中へ、カプセル化ラット、イヌ、ブタ、又はヒト膵島を腹腔内異種移植すると、即座に血中グルコースは正常になり、10〜100⁺日間持続することが示された(7、19、33-39)。ミクロカプセル化イヌ膵島の同種移植、ブタ膵島の異種移植によって、高グルコース血症は長期間正常化し、ヒト膵島の同種移植が１例報告された(21,40-42)。ミクロカプセルが、宿主の破壊から膵島異種移植片を保護する機序は、完全には理解されていない。しかし、宿主免疫細胞との細胞 −細胞間接触の阻止が重要であることは示唆されている(30,35)。糖尿病を発症させた齧歯類中の、近縁関係にない(widely unrelated)カプセル化膵島異種移植片が、極めて長持ちしたことにより、自然発症性糖尿病の動物における研究が進んだ。ヒトIDDMのモデルとしての糖尿病自然発症NODマウス肥満でない糖尿病(NOD:Nonobese diabetic)マウスでは、糖尿病が自然に進行し、約12週齢で発症する。幾つかの点で、NODマウスの疾病は、ヒトIDDMに類似しているので、NODマウスは膵島異種移植の実施可能性を研究するための最適なモデルである。膵島へのマクロファージ、樹状細胞、及びリンパ細胞の侵入は、早くも４週齢で検出することができ、明白な高血糖に先立って起こる(43-46)。N ODの糖尿病は、Ｔリンパ球依存性であり(43-45)、(MHC)クラスII遺伝子と関連している(47-50)。NODマウスから、細胞傷害性Ｔ細胞、及びβ細胞又はインシュリン特異的な抗体が同定、特性決定され、クローニングされてきた(44,45,51-55) 。NOD中の膵島抗原に対する免疫寛容を喪失することは、ヒトIDDMにおける主要な自己抗原として報告されてきた因子であるグルタミン酸脱炭酸酵素(5,657)に対するTh1免疫応答の発生と相関している。糖尿病のNODから、CD8⁺T細胞とCD4⁺T 細胞の両者、すなわち両Ｔ細胞クローンを移植することによって、糖尿病でない同系マウスに、該疾病を引き起こすことができる(44,52,55,58)。そして、NODのマクロファージ若しくはCD4⁺Tリンパ球を阻害すれば、又は抗クラスIIモノクローナル抗体で処置すればNODマウスの糖尿病の開始が停止又は遅延する(59,60)。 NODマクロファージ、C5補体、及びNK細胞機能の欠陥が報告されてきた(61)。ヘルパーT細胞はCD8⁺細胞を活性化するように機能し、CD8⁺細胞が直接的な細胞傷害性攻撃によって、β細胞に損傷を与えると推測されてきた。しかし、最近のいくつかの研究によれば、β細胞の損傷には、初期にはCD4⁺細胞が関与するが、既知のβ細胞性毒素であるサイトカイン及び酸素フリーラジカル(特に一酸化窒素) (62-65)を放出する浸潤マクロファージ(infiltrating macrophage)をも含む非特異的な炎症応答から生じる間接的なものであると推測されている。IDDMと類似しているので、NODマウスは、膵島の異種移植を研究するための最良のモデルである。最近、Scid変異をNODバックグラウンドに対して戻し交雑したところ、免疫不全NOD-Scidマウスが得られている(66-69)。Scid変異に対して同種(homologous) であるこれらのマウスは、Ｔ細胞受容体及び免疫グロブリン遺伝子を再配列することができない(66,67)。その結果、Ｔリンパ球及びＢリンパ球が欠落する。これらのマウスは糖尿病を自然発症しないが、低量ストレプトゾトシン処方を繰り返すことによって(MLD-SZN;multiple low dose-streptozotocin)糖尿病を発症させることができ、養子移入実験の最適なモデルとなる(67-69)。NOD-Scidは、疾病の進行に関連したNOD MHC遺伝子及びその他の遺伝子を発現する。それらは、強いマクロファージ応答及び限定的なNK-細胞応答を備えているが、機能的なT- リンパ球及びB-リンパ球は欠損している(69)。糖尿病NODマウスへの膵島異種移植 SZNによって引き起こされた糖尿病に罹患したマウスとは異なり、糖尿病のNOD マウスは非カプセル化膵島異種移植片、同種移植片及び同系移植片を即座に拒絶する(7,8,10,19,33,56,70,71)。従来の免疫抑制処方は、該反応には殆ど効果がない(10,71-73)。CD4⁺ヘルパーTリンパ球に対して誘導したモノクローナル抗体又はFK506で、NODレシピエントを処置すれば、膵島移植が機能する期間が延びるが(5日から25日)(7,8,10,73)、NOD中で膵島移植片が長期間生存するという報告はなされていない。腹腔内のミクロカプセル化(同種及び異種性の)膵島は、非カプセル化対照に比べて、有意に長く機能することが幾つかの研究室から報告されているが、これらも最終的には、自然発症性(自己免疫性)糖尿病を伴いながら、レシピエントによって破壊される(NODマウス又はBBラット)(7,9,19,33,35,70,74-78)。拒絶は、主としてマクロファージ及びリンパ球から構成される強烈な細胞性反応を伴い、これによって、膵島を含有するミクロカプセルが捕捉され(entrap)、NOD及びBBレシピエントとともに、21日以内に高血糖が再発する(7,19,74,76,77)。糖尿病を自然発症する動物によって、カプセル化した膵島が拒絶される機序は完全には理解されていないが、誘導性(SZN)糖尿病のマウスでは、希にしか起こらないという事実は、膵島移植片の破壊に抗膵島自己免疫が関わっているかもしれないということを示唆する。 NODによる、カプセル化膵島異種移植片の破壊機序：マクロファージ、T-細胞、及びサイトカイン他の生体用人工膜装置のように、ミクロカプセルは、(A)ドナー抗原の放出を抑えて、又は最少にして宿主の感作を減少させることにより、及び／又は(B)宿主のエフェクター機構(すなわち、Ｔ細胞の接触、抗移植片抗体の結合、サイトカインの放出)を抑えることにより、又は減少させることにより、異種膵島及び同種膵島の生存を促進することが、幾人かの研究者によって示唆されてきた。ミクロカプセル及び他の膜装置中の膵島の拒絶に関する研究の多くは、エフェクター機構に焦点を当ててきた。例えば、Halle(35)、Darquy及びReach(79)は、ミクロカプセルが、宿主の免疫グロブリン、特にヒト抗膵島抗体及び補体効果から、ドナーの膵島をインビトロで保護することを報告した(79)。補体成分は、非常に大きいので(>>150,000kD)、従来のポリ-L-リジンミクロカプセルに入ることができないが、流出したドナー抗原と抗体が結合して、インビボ(腹腔内)でマクロファージのFcRに結合する複合体を形成し、カプセル化した膵島の破壊を引き起こすサイトカインの放出が開始することはあり得る(80)。補体は、C3b受容体を介して、又はマクロファージの数を増加させ得る化学走性ペプチドの放出によって、マクロファージへの複合体の結合を促進しているのかもしれない。デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin;DSG)(T細胞阻害性免疫抑制剤)(81) でNODのレシピエントを処置すれば、カプセル化したハムスターからNODマウスへのカプセル化膵島異種移植が有意に延長されることを見出したIwataら(81)によって、カプセル化した膵島の拒絶にNOD T-リンパ球が関与していることが提唱されてきた。このデータは、CD4⁺ヘルパーT細胞に対するモノクローナル抗体又はF K-506でNODを処置すれば、ラットからNODへのカプセル化及び非カプセル化膵島移植の機能がともに延長するという、幾つかの研究室による従前の発見と一致しており(7,8,10,73)、これらの発見は、CD4⁺T細胞が異種反応性において主要な役割を果たしているというAuchincloss(27)、Pierson(82)及びGill(83)の観察と同様のものである。 NODマウス及びBBラット中のカプセル化膵島同種移植片及び異種移植片からミクロカプセル周辺部に滲出した液中に、マクロファージ／単球が目立つことが報告されてきた(7,33,36,74,76-78,84)。IL-1及びTNFを含む(62,77,85,86)、マクロファージの産物であることが明らかとなっているサイトカインが、カプセル化した膵島の破壊に関与しているのかもしれない。IL-1及びTNFは、インビトロにおいて、ともにインシュリンの分泌を減少させ、膵島細胞に進行性の損傷を引き起こすことが報告されてきた(58,62-64,85-87)。サイトカインを介した傷害は、腹腔内の炎症応答を活性化させることによって、直接的又は間接的に起こるのかもしれない(30,77)。最近、J Corbett博士によって、各膵島内部に10個ものマクロファージが存在することが報告された(IPITA conf．6/95)。IL-1は、一酸化窒素合成酵素(NOS)を誘導し(63-65)、その結果β細胞中のミトコンドリア及びDNA に損傷を引き起こす一酸化窒素(NO)を生成する(63-65)。その上、該膵島損傷経路はTNFによって、さらに悪化される(88,89)。理論的には、ドナー膵島及び宿主腹腔、又は下部膵島(down islet)中のマクロファージが、サイトカインを介したカプセル化膵島の損傷に関与し得るかもしれない。ハムスターからラット肝臓への膵島異種移植及びブタからマウスへの膵島異種移植のサイトカインメッセンジャーRNAプロフィールの研究により、Th2サイトカイン(IL-4、IL-5、IL-10)が選択的に増加し、II-2は正常のものと不変であることが明らかとなった(11,90)。これらは、拒絶された非カプセル化膵島同種移植片の生検組織中にIL-2メッセンジャーRNAを報告したO'Connellらのもの(91,92) とは明らかに異なっている。Th1活性(93-95)に比べてTh2活性が増加していることは、既知のNOD「Th1」抗膵島免疫応答(56,57,96)と相違する。Th2応答は、外来抗原に対して誘発された抗体応答に特徴的なものであり、カプセル化した異種移植片に対する液性反応が、極めて重要であるかもしれないということを示唆する。さらに、「Th2」応答を喪失させるようにデザインされた戦略により、カプセル化した膵島異種移植片の生存が有意に延びるかもしれない。「Th2」ヘルパーT細胞のサイトカインmRNAプロフィールは、外来抗原に対する抗体応答に特徴的なものである。協同刺激(c0-stimulatory)分子、APC、及びNODマウスによる膵島異種移植片の破壊膵島異種移植片に対する免疫応答にAPCが関与することが、Lenschowら(12)の最近の研究によって示唆されている。彼らは協同刺激分子であるB7を可溶性融合タンパク質であるCTLA4Igで阻害することによって、ヒトからマウスへの膵島異種移植片が、SZN-糖尿病マウス中で長く機能することを見出した。幾つかのインビトロ及びインビボでの研究によって、Ｔ細胞受容体と相互作用する外来分子( ペプチド、特異的抗体、分裂促進因子)自体は、ナイーブＴ細胞を刺激して増殖させることができず(95,97)、抗原特異的なアネルギーを引き起こすかもしれないということが示されてきた。少なくともさらに一つ（協同刺激）が必要であり、それはAPCによって与えられるものである。マウスの場合、このような協同刺激経路の１つに、APC上の２つのリガンド(B7-1及びB7-2)のうちの何れか１つと、Ｔ細胞表面抗原(CD28)との相互作用が含まれる(95,97-102)。しかし、このようなＴ細胞とAPCとの完全な相互作用が一度起これば、その後ペプチド、分裂促進因子等へのＴ細胞の再接触により、協同刺激非存在下で増殖するようになるであろう(95)。 CTLA4は、CD28と密接に関連した細胞表面タンパク質であるが、CD28とは異なり、活性化されたＴ細胞上だけで発現される。B7-1は、CD28よりもCTLA4に対して高い親和性を有する。そして、CTLA4はCD28の機能を調節するかもしれないと推測されてきた(97,103,104)。CTLA4Igは、CTLA4分子の細胞外結合ドメインにIg G₁遺伝子の定常領域を組み合わせた組換え可溶性タンパク質である。ヒト及びマウスCTLA4Igはともに、マウスのＴリンパ球応答を阻害することが示されてきた( 141,142)。マウスにCTLA4Igを投与すれば、（マウスループスモデルにおいて）抗原特異的な非応答性が誘導され(97,99,105)、マウス心臓同種移植片が長期間受容されることが示された(106,107)。さらに、LenschowらはSZN糖尿病マウス中のヒト膵島に免疫寛容を引き起こすことを見出した(12)。CTLA4Igは、NODで糖尿病の発生を減少させることも報告されてきた(108)。NODマウスのような自然発症性糖尿病レシピエント中の膵島移植片の生存に対して、CTLA4Igが有効であるという報告はない。しかし、我々の研究は、CTLA4Igによって、NODレシピエント中のカプセル化ウサギ膵島の生存期間が有意に延長することを示している。さらに、APC-CD40抗原のヘルパーT細胞上のリガンドであるGP39への結合の重要性を認識して、最近の研究ではヘルパーT細胞−APC相互作用が脚光を浴びている(109,110)。ハムスター抗マウスGP39モノクローナル抗体(MR1)はヘルパーT細胞とAPC、マクロファージ、エフェクターT細胞及びＢリンパ球との相互作用を阻害する(109.110)。最近、A Rossini博士は、７日目のB7陰性のドナー脾臓細胞と MR1によって、SZN糖尿病マウス中で同種膵島と異種膵島の両者が長期間生存し得ることを報告した(IPITA conf．6/95)。カプセル化膵島の免疫原性及び移植片破壊の機序空のミクロカプセルは、全く細胞性応答を引き起こさないことが報告されてきた(33,35,36)。これに反して、空のカプセルに対する反応を見出した者もいる(3 0,76,77,111,112)。エンドトキシンによる汚染のような試薬中の不純物又は高濃度のマンヌロネート(mannuronate)が生体不適合性に関与している可能性が最も高い(113)。ポリ-L-リジンミクロカプセル処方には生体適合性を有するものと、そうでないものがあるのは明白である。標準化された試薬が利用可能になるまでは、研究者は、生体適合性が明白な空のミクロカプセル対照も併用しなければ、ミクロカプセル化された膵島による免疫学的な研究を解釈することはできない。最近、de Vosら(114)は、幾つかのミクロカプセルで、膵島のカプセル化が不完全であること、又はミクロカプセル膜から膵島が実際に突出していることを報告し、このような生体機械的な不完全さが、ミクロカプセル崩壊の一つの要因であることが示唆された。ポリ-L-リジンアルギネートミクロカプセル壁の中に膵島及び肝細胞が取り込まれることを見出したChang(115)は、同様の観察を行った。他に、数人の研究者が、明らかにカプセル、壁の中に膵島が没入(entrapment) していることを示すカプセル化した膵島の顕微鏡写真を公開したが、この問題には言及していなかった(35,116,117)。不完全なカプセル化によって、未完成カプセルの亀裂及び宿主細胞に対するドナー膵島の露出が生じると予想されるが、ドナー抗原の露出、感作及び宿主の原因として、このことを分析した報告はない。宿主免疫応答の開始における、ミクロカプセルから放出されたドナー膵島抗原の役割に注目してきた研究は比較的少ない。Rickerら(33)は、NODマウスによるミクロカプセル中のラットインシュリノーマ、肝臓癌及び褐色細胞腫細胞系に対する同様の激しい細胞性反応を報告し、NOD免疫反応は膵島特異的ではないと結論付けた。Horcherら(36)は、ウィスターからルイスへのカプセル化した膵島の同種移植のうち8/10が56日以内に不成功に終わったのと比べて、ルイスラット膵島のカプセル化した同系移植のうち6/7が15週間生存したことを報告した(36)。同系移植片の生検により、膵島が生存していること、カプセルが元通りであること、及びカプセル周辺の免疫反応がないことが示されたが(36)、一方、不成功に終わった同種移植の生検からは、カプセル周辺の細胞性応答、及び膵島の死滅が明らかとなった。これは、カプセル化した膵島同系移植対照を用いた、唯一の文献中の報告である。ルイスラットモデルは、自己免疫性糖尿病を有するモデルではないが、この結果は重要であり、ドナー抗原が、その後の宿主応答に対する刺激であることを示唆している。発明の概要本発明は、患者に移植した生細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a)移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生細胞又は生細胞を含む組織を封入することと、 b)前記被封入細胞又は組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で、患者を処置すること、を具備する方法を提供する。ある実施態様において、免疫系の協同刺激現象を阻害する該物質はCTLA4である。従って、本発明はさらに、患者に移植した生細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a)移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生細胞、又は生細胞を含む組織を封入することと、 b)前記被封入細胞又は組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の CTLA4で患者を処置することを具備してなる方法を提供する。本発明は、また、患者の糖尿病を治療する方法であって、 a)半透膜を具備する装置内に、生きたインシュリン産生細胞、又は生きたインシュリン産生細胞を含む組織を封入することにより、生きた被封入インシュリン産生細胞を得ることと、 b)患者の糖尿病を治療するのに有効な量の、ステップ(a)で得た、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植することと、 c)ステッブ(b)で得られた相当量の生きた被封入インシュリン産生細胞に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置することを具備する方法を提供する。図の簡単な記述図１：未処置の糖尿病NOD H&Eに異種移植してから150日後の、カプセル化したルイスラットの膵島（×250）。該ミクロカプセルは、「二重壁」ミクロカプセルである。図２：膵島異種移植の生存、「二重壁」ミクロカプセル。図３：100,000Kdの透過性を有するミクロカプセル中でのカプセル化ウサキ膵島の生存と、70,000Kdまでの透過性を有するミクロカプセル中でのカプセル化ウサキ膵島の生存との比較。図４：ルイスラット脾臓細胞に対する感作が、ルイスラットからNODへのミクロカプセル化膵島移植に対して及ぼす影響。図５：ルイスラット膵島に対する感作が、ルイスラットからNODへのカプセル化膵島移植に対して及ぼす影響。図６：80日目にGk1.5.で処置したNODマウスの腹腔から得た、ミクロカプセル化イヌ膵島。H&E（×250）図７：86日目に生検した、CTLA4Igで処置したNODマウスの腹腔から得た、機能中のカプセル化ウサギ膵島。NOD細胞応答がなく、カプセル内に生きた膵島が存在していることに注目されたい。H&E（×400）図８：膵島異種移植に対する、CTLA4Ig処置と組み合わせた膵島のミクロカプセル化の影響。図９：NODに移植した、ミクロカプセル化マウスINS−CTLA4膵島の生存。これらの膵島はCTLA4を発現する。図10：ストレプトゾトシンSZN−糖尿病NOD−Scidマウスへの、ラット膵島の移植の影響。図11：ストレプトゾトシン（SZN）−糖尿病NOD−Scidマウスへの、ウサギ膵島の移植の影響。図12：ストレプトゾトシン（SZN）−糖尿病NOD−Scidマウスへの、ミクロカプセル化ウサキ膵島の移植の影響。図13：86日目にCTLA4Igで処置したNODマウスの腹腔から生検した、機能中のカプセル化ウサギ膵島。NOD細胞応答がなく、カプセル内に生きた膵島がないことに注目されたい。H&E（×400）。矢印はカプセル壁の外側を示す。図14：ブタ新生児の膵臓からの膵島の収量（全膵島の数）。図15：非カプセル化（N）およびカプセル化（E）ブタ新生児膵島（μU／1000膵島／24hr）からの、インビトロでのインシュリンの放出。図16：組織培養における、分散したブタ新生児の「膵島」、５日日。抗インシュリン免疫組織化学は5−10%のβ細胞を示している。約400×。図17：SZN−糖尿病NOD−Scidマウスから、103日目に生検したミクロカプセル中の新生児の膵島。抗インシュリン免疫組織化学は、膵島の約80%を占める、強インシュリン陽性β細胞を示している。約400×。矢印はミクロカプセル膜の外側表面を示す。図18：ストレプトゾトシン糖尿病NOD−Scidマウスの脾臓／門脈中の、非カプセル化新生児ブタ膵島異種移植。生検（示されていない）によって、肝臓および脾臓実質中ともに生きたブタ膵島が確認された。 N＝1 T＝移植 S＝脾臓および肝臓生検のために屠殺図19：ストレプトゾトシン糖尿病NOD−Scidマウスの腹腔内への、ミクロカプセル化ブタ新生児膵島の異種移植。103日目に生検（図20参照） N＝1 T＝移植 S＝屠殺図20：SZN−糖尿病NOD−Scidマウスへの異種移植後103日目に生検した、ミクロカプセル中のブタ新生児の膵島。H&E、×400。矢印は、ミクロカプセル膜の内部表面を示す。図21：200μgのCTLA4Ig（i.p.,Q.O.D.）で処置した、NOD中のカプセル化ブタ新生児膵島の異種移植（N＝5）、×20日。101日目に、NOD 880を生検した（図22参照）。 S＝生検のために屠殺（−−−）＝移植不成功図22：自然発症性糖尿病NODマウスの腹腔内に異種移植してから101日目に生検した、ミクロカプセル化新生児ブタ膵島。CTLA4Ig,200μ g.p．Q.O.D.、0−21日。矢印は、全く変化していないミクロカプセル内壁を指している。カプセル周辺の NOD細胞応答はない。H&E×200。図23：隣接した同一生検組織切片の抗インシュリン免疫細胞化学によって、多くの細胞がインシュリン陽性β細胞であることが示されている。×400。図24：CTLA4Ig*で処置したNODマウス腹腔中のミクロカプセル化ブタ新生児膵島異種移植片は、補体を結合しない。図25：抗原非存在下において、96穴プレート中で、脾臓細胞を2×10⁶細胞／mLで培養した。10個は空のカプセル、10個はブタ新生児の膵島（放射線照射されていない、又は2000Rで放射線照射した、4×10³のブタ新生児の膵島）を含むカプセル。脾臓細胞は、正常NODマウス（パネルA）、糖尿病NODマウス（パネルB）から得た。糖尿病NODマウスは、図24に記載されているように、ブタ新生児のカプセル化膵島を移植され、CLTA4Igを投与されるか（パネルC）、又は変異型CTLA4Ig* (パネルD)を投与された。48時間インキュベーションした後、³H−TdRを添加し、 18時間後に細胞を採取した。結果は３つの培養の平均±SDで表されている。図26：図24に記載されているマウスから得た脾臓細胞の培養液中のリンホカイン産生をELISAで測定した。図24で記載したような放射線未放射のブタ新生児膵島とともに、正常または糖尿病NODマウスからの脾臓細胞を培養した。24時間インキュベーションした後に、上清の液体を採取し、サンドウィッチELISA、および適切な組換えサイトカインを標準として用いて、IL-4、IL-10およびIFN−γのアッセイを行った。図27：自己免疫性NODマウスによる、ミクロカプセル化した異種膵島に対する免疫応答のモデル。分泌されたインシュリンは、明らかに二重壁のミクロカプセル膜を透過して、移植を受けたマウスのグルコースレベルを制御した。 1）：膵島から流出または分泌された100,000mw（AgX）未満の、他のドナータンパク質またはタンパク質断片が、ミクロカプセルから拡散し、樹状細胞の細胞内に取り込まれた可能性がある。 2）：樹状細胞はMHCクラスII経路を介してタンパク質のプロセシングを行い、クラスIIおよび協同刺激分子と複合体を形成したペプチドXをCD4⁺T細胞に提示する。適切なサイトカインの存在下、CD4⁺T細胞は活性化され、CD40L（GP39）を発現するTh2細胞になる。AgXを結合するIgMを表面上に有するB細胞は、AgXを細胞内に取り込んで、B細胞表面上に発現されているMHCクラスIIと結合するペプチドにプロセシングする。クラスIIと複合体化したTh2特異的ペプチドXはB細胞と結合し、CD40L（GP39）とCD40の相互作用がB細胞の活性化を引き起こす。 3）Th2リンホカインに誘導されて、活性化されたB細胞は形質細胞へと成熟する。 4）形質細胞は、AgXと複合体を形成する特異的抗体を分泌する。 5）複合体がFcRに結合するとマクロファージが活性化され、IL-1、TNF αおよび一酸化窒素（NO）を含む様々な伝達物質が分泌される。これらは全て、膵島に対する毒性効果を有し、且つ非常に小さいので二重壁ミクロカプセルを透過し得る。図28 A-B：(A)103日目に、SZN糖尿病NOD-Scidマウスの腹腔から生検したミクロカプセル中の新生児膵島(H&E)(約240X)。矢印は、ミクロカプセル膜の外側表面を指している。(B)(A)と同じ生検、隣接した切片。膵島の約80％を占める強度にインシュリン陽性なβ細胞を示す抗インシュリン免疫組織化学（約240X）。矢印は、ミクロカプセル膜の外則表面を指している。図29A-B：(A)21日間CTLA4-Igで処置したNODマウスの腹腔から101日目に生検した、機能しているカプセル化新生児ブタ膵島。膜の外側、及びカプセル中の生きた膵島に対するNOD細胞応答がないことに注目されたい(H&E)(×240)。矢印は、カプセル壁の外側を指している。(B)(A)と同じ生検。大部分がインシュリン陽性な細胞であることを示す隣接した切片。抗インシュリン免疫組織化学（×240)。図30：機能している（正常血糖の）移植組織から自然発症性糖尿病NODマウスへのミクロカプセル化ブタ膵島異種移植片の生検、移植から239日後。ミクロカプセル中の生きた膵島細胞に注目されたい。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)、X 400。移植後21日間だけ、CTLA4Igで処置したNOD。図31：図29と同じ生検；元通りのミクロカプセル内のブタ膵島「β」細胞の細胞質中に存在するインシュリン（濃い茶色）顆粒を示す、抗インシュリン免疫組織化学染色。ミクロカプセル膜の外側に宿主NOD細胞反応がないことに注目されたい(X400)。図32：CTLA4Ig処置したNODマウスへの移植成功から83日後に生検したミクロカプセル化ブタ膵島異種移植片。元通りの「二重膜」ミクロカプセル膜、生きたブタ膵島細胞、及び膜の外側にNOD細胞反応が存在しないことに注目されたい(H&E、X 400)。図33：ODマウスへの移植成功から180日後に生検したミクロカプセル化ブタ膵島異種移植片。移植片へのNOD反応が存在しないことに注目されたい（きれいな、元通りのカプセル膜）。21日間だけCTLA4Igで処置したNOD(X400、H&E)。図34：21日間CTLA4-Ig処置した糖尿病NODマウスへのミクロカプセル化新生児ブタ膵島移植。図35：21日間変異型CTLA4-Ig処置した糖尿病NODマウスへのミクロカプセル化新生児ブタ膵島移植。図36：NODマウス中の新生児ブタ膵島異種移植片:CTLA4-Igとミクロカプセル化の効果。図37：移植片を拒絶した、又は移植片が機能しているNODから得た脾臓細胞(SPC) による膵島特異的な増殖。図38：移植片を拒絶した、又は移植片が機能しているNODから得た脾臓細胞(SPC) による自発的な増殖。図39：(A)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-2、移植を受けたNOD。(B)屠殺日 (sac)の腹腔液中に存在するIL-2、移植を受けていないマウス。図40A-B：(A)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIL-2、移植を受けたNOD−拒絶していない。(B)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIL-2、移植を受けたNOD−拒絶している。図41A-B：(A)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIFN-γ、移植を受けたNOD。(B) 屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIFN-γ、移植を受けていないマウス。図42A-B：(A)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIFN-γ、移植を受けたNOD−拒絶していない。(B)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によるI FN-γの分泌、移植を受けたNOD−拒絶している。図43A-B：(A)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-4、移植を受けたNOD。(B)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-4、移植を受けていないマウス。図44A-B：(A)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIL-4、移稙を受けたNOD−拒絶していない。(B)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIL-4、移植を受けたNOD−拒絶している。図45A-B：(A)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-5、移植を受けたNOD。(B)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-5、移植を受けていないマウス。図46A-B：(A)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-10、移植を受けたN0D。(B)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-10、移植を受けていないマウス。図47A-B：(A)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIL-10、移植を受けたNOD−拒絶していない。(B)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIL-10、移植を受けたNOD−拒絶している。図48A-B：(A)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-12、移植を受けたNOD。(B)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するIL-12、移植を受けていないマウス。図49A-B：(A)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIL-12、移植を受けたNOD−拒絶していない。(B)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたIL-12、移植を受けたNOD−拒絶している。図50A-B：(A)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するTNF-α、移植を受けたNOD。(B) 屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するTNF-α、移植を受けていないマウス。図51A-B：(A)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたTNF-α、移植を受けたNOD−拒絶していない。(B)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたTNF-α、移植を受けたNOD−拒絶している。図52A-B：(A)屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するTGF-β、移植を受けたNOD。(B) 屠殺日(sac)の腹腔液中に存在するTGF-β、移植を受けていないマウス。図53A-B：(A)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたTGF-β、移植を受けたNOD−拒絶していない。(B)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって分泌されたTGF-β、移植を受けたNOD−拒絶している。図54A-B：(A)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって産生されたNO₂、移植を受けたNOD−拒絶していない。(B)ブタ膵島と培養した脾臓細胞(SPC)によって産生されたNO₂、移植を受けたNOD−拒絶している。図55A-B：(A)腹腔滲出細胞(PEC；peritoneal exudate cell)によって、すなわち「腹部」から産生されたNO₂、元のカプセル化ブタ膵島と培養して96時間後、移植を受けたNOD−拒絶していない。(B)腹腔滲出細胞(PEC)産生されたNO₂、元のカプセル化ブタ膵島と培養して96時間後、移植を受けたNOD−拒絶している。図56：ブタ膵島又はインシュリンに対するNOD#1335由来の脾臓細胞(SPC)の増殖( Expt 288)。図57：(A)インビトロでの、ブタ膵島細胞に対するNOD#1335由来の脾臓細胞(SPC) の増殖(Expt 288)。(A)NOD#1335由来の脾臓細胞(SPC)の増殖(Expt 288)。図58：NOD#1335由来の細胞によるNO₂の産生(Expt 288)。発明の詳細な記述本発明は、患者に移植した生細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a)移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生細胞又は生細胞を含む組織を封入することと、 b)前記被封入細胞又は組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で、患者を処置すること、を具備する方法を提供する。本明細書で用いられる、「免疫系協同刺激現象」とは、APC表面上のMHCに結合した抗原が、T細胞受容体に結合するときに必要とされる、APCとT細胞間の相互作用である。免疫系協同刺激現象には、T細胞上の特異的リガンドと（MHCに結合した抗原以外の）APC細胞表面分子との特異的な結合が全て含まれる。このような特異的結合には、T細胞表面上のCTLA4受容体すなわちCD28受容体への（APCの表面上に存在する）B7分子の結合、および（T細胞表面上の）GP39への（APC の表面上に存在する）CD40分子の結合が含まれるが、これらに限定されない。免疫系協同刺激現象を阻害する物質は当業者に公知であり、MR1（T細胞表面上に発現されたGP39に、APC表面上に発現されたCD40が結合するのを遮断する）のようなT細胞またはAPC細胞表面分子の類縁体、またはCTLA4（CD28受容体すなわちCTLA4受容体へのB7分子の結合を遮断する）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載した、生きた移植細胞の破壊を阻止するための方法の実施態様の１つにおいて、免疫系協同刺激現象を阻害する物質はCTLA4である。本発明において用いるCTLA4なる語は、CTLA4受容体のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、またはCTLA4受容体のアミノ酸配列と十分な同一性を有するアミノ酸配列を具備するタンパク質性構築物（proteinaceous construct）であって、該タンパク質性構築物がB7分子に結合することができ、それによってB7分子とT細胞上のCTL A4受容体との結合を遮断するような任意のタンパク質性構築物を指すものとする。タンパク質性構築物は当業者に周知であり、ペプチド、ポリペプチド、およびペプチドおよび／またはペプチドサブユニットを具備する分子を含む、互いにペプチド結合によって連結されたアミノ酸部分を具備する任意の分子を指す。このように、CTLA4なる語には、遺伝子工学的に作出した細胞の中で、CTLA4受容体の B7−結合部位をコードする遺伝子によって発現された分子、CTLA4受容体のB7− 結合部位をコードする遺伝子の変異体によって発現された分子であって、B7分子を結合することができる分子、およびCTLA4受容体のアミノ酸配列と同−のアミノ酸配列、またはCTLA4受容体のアミノ酸配列と十分に同一であり、B7を結合し得るようなアミノ酸配列を有する合成アミノ酸鎖が含まれるが、これらに限定されない。CTLA4には、CTLA4Igのような、CTLA4受答体の細胞外結合ドメインを具備する可溶性CTLA4も含まれる。それ故、本発明において用いるCTLA4なる語には、CTLA4Ig、すなわちIgG₁の定常領域とCTLA4受容体の細胞外結合ドメインとを組み合わせた、組換え可溶性融合タンパク質も含まれる。本発明の実施態様において、免疫系協同刺激現象を阻害する物質は患者のサイトカインプロフィールも変化させて、被封入細胞または組織を患者の免疫系から保護する。「サイトカインプロフィール」なる語は、ある時刻に、患者の中で産生されたサイトカインの種頚および各種サイトカインの量を意味する。サイトカインは白血球によって放出される、免疫効果を有するタンパク質である。サイトカインの例には、（γ−インターフェロンのような）インターフェロン、腫瘍壌死因子、インターロイキン(IL)1、IL-2、IL-4、IL-6、およびIL-10が含まれるが、これらには限定されない。例えば、該物質は患者のγ−インターフェロンの産生を増加させる物質であり得る。患者のサイトカインプロフィールを変化させて、患者に移植した、被封入細胞または組織を保護する物質の例はCTLA4Igである。別の実施態様では、免疫系協同刺激現象を阻害する物質は補体を結合する。補体を結合する物質は、患者に移植した被封入細胞または組織の生存を長引かせる。補体を結合する物質の例は、CTLA4Igである。本発明の実施態様において、免疫系協同刺激現象を阻害する物質は患者のサイトカインプロフィールも変化させず、被封入細胞または組織を患者の免疫系から保護する。「サイトカインプロフィール」なる語は、ある時刻に、患者の中で産生されたサイトカインの種類および各種サイトカインの量を意味する。サイトカインは白血球によって放出され、免疫効果を有するタンパク質である。サイトカインの例には、（γ−インターフェロンのような）インターフェロン、腫瘍壌死因子、インターロイキン(IL)1、IL-2、IL-4、IL-6、およびIL-10が含まれるが、これらには限定されない。例えば、該物質は患者のγ−インターフェロン及びIL-2 の産生を増加させる物質であり得る。患者のサイトカインプロフィールを変化させず、患者に移植した、被封入細胞または組織を保護する物質の例はCTLA4Igである。別の実施態様では、該物質と、半透性膜を具備する装置内部の生細胞の含有物（containing）が患者の宿主免疫細胞増殖を阻止する。上述した方法のある態様では、半透膜を具備する装置は、中空の、繊維、円盤、又は球体である。上述した方法のある態様では、半透膜を具備する装置はミクロカプセルである。本発明はさらに、患者に移植した生細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a)移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生細胞、又は生細胞を含む組織を封入することと、 b)前記被封入細胞又は組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の CTLA4で患者を処置することを具備してなる方法も提供する。生細胞または組織の移植に有用な半透膜を具備する装置は当業者に周知であり、このような装置は全て、本発明に用いることができる。本発明に有用な装置は、様々な素材から構成され、様々な形状にすることができ、このような素材および形状は当業者に周知である。本発明に適用する装置は、患者と素材との生体適合性、移植部位、移植が血管内または血管外の何れであるのか、移植法、入手可能性、および経済性を含む要素に基づいて選択し得るが任意の装置であるが、選択要素はこれらに限定されない。装置に適した形状の例には、中空の繊縫、円盤および球体が含まれるが、これらに限定されない。適切な素材には、アガロースハイドロゲル、プラスチック、重合体、およびポリアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。装置は、一以上の素材から構成されていてもよい。本発明の好適な実施態様において、該装置はミクロカプセルである。本明細書において用いられる、「ミクロカプセル」なる語は、任意のポリアミノ酸球体カプセルを意味する。本発明書において定義したミクロカプセルおよびそれらの製造方法は当業者に周知であり、単層、二重層、または多層ポリアミノ酸球体の他に、一層以上のアルギネートを具備するポリアミノ酸球体が含まれるが、これらに限定されない。前述した本発明の方法中において、生細胞、または生細胞を具備する組織は、任意の生細胞源から得ることができる。ある実施態様では、生細胞又は組織は異種のドナー、すなわち生細胞または組織を移植する患者とは種が異なる対象から得られる。別の実施態様では、生細胞、または生細胞を具備する組織は、同種のドナー、すなわち生細胞または組織を移植する患者と種が同じ対象から得られる。さらなる実施態様において、生細胞、または生細胞を具備する組織は、それらを移植した患者から得られる。すなわち、とりわけそれらは患者から採取された後、装置の中に封入され、移植によって患者に戻される。例えば、採取した後、患者に移植して戻す前に、患者から採取された生細胞に遺伝子工学的操作を行ってもよい。生細胞、または生細胞を具備する組織は、どのようなドナーから採取してもよい。ある実施態様では、ドナーは哺乳類である。例えば、このような哺乳類ドナーは子ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、マウスまたはヒトであってもよい。生細胞、または生細胞を具備する組織は、ブタの新生児のような哺乳類の新生児から採取してもよい。本明細書に記載した、本発明の方法の患者は、生細胞を移植することが望まれる患者であれば、どのような患者であってもよい。ある実施態様では、患者はヒトである。もし患者がヒトであれば、ある実施態様においては、生細胞またはそれらを含有する組織は、哺乳類、例えばヒトから得られる。他の実施態様では、患者は家畜である。本明細書において用いられる、家畜とはヒトの支配が及ぶ任意の動物である。例えば、家畜には、ヒトによって飼育され、ヒトが消費するための産物を得るための手段として用いられる農業用動物が含まれる。このような産物には、肉、ミルク、および皮が含まれるが、これらに限定されない。家畜の例には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマおよびニワトリが含まれるが、これらに限定されない。本発明を適用する上で有用な家畜は、成熟動物、未成熟な動物、またはその他の任意の発達段階にある家畜であり得る。患者が家畜である場合における、ある実施態様では、生細胞には家畜の成長を促すホルモンを分泌する細胞が含まれる。このようなホルモンは、当業者には周知であり、成長ホルモンおよびインシュリンのようなホルモンが含まれる。ある実施態様においては、このようなホルモンを分泌する生細胞は、遺伝子工学的にホルモンを分泌するように改変される。すなわち、それらはホルモンをコードする遺伝子を含むように遺伝子工学を施され、該遺伝子を発現することができる。前述した、本発明の方法では、ある実施態様における生細胞は、生物学的に活性な物質を分泌する細胞を具備する。本明細書で用いられる「生物学的に活性な物質」とは、患者に生理的な応答を生じせしめ得る任意の物質を意味する。生物学的に活性な物質は、該物質を産生する細胞が移植される患者に応答を生じせしめ得る。生物学的に活性な物質を分泌する細胞は当業者に周知であり、そのような細胞は全て本発明において用い得る。ある実施態様では、生物学的に活性な物質を分泌する細胞は内分泌細胞である。内分泌細胞は当業者に周知であり、インシュリン産生細胞、肝細胞、上皮小体細胞、および下垂体細胞が含まれるが、これらに限定されない。別の実施態様においては、生物学的に活性な物質を分泌する細胞は、神経外胚葉細胞（neuroectod ermal Cells）である。神経外胚葉細胞は当業者に周知であり、副腎細胞およびリンパ球が含まれるが、これらに限定されない。ある実施態様においては、細胞は、生物学的に活性な物質を分泌するように遺伝子工学的に改変される。例えば、細胞を移植された患者を治療するのに有用な生物学的に活性な物質を分泌するように、細胞に遺伝子工学的処理を行ってもよい。このように、本方法は癌およびHIV感染を含む症状（ただし、これらには限定されない）を患者を治療するための、新規、有用且つ有利な薬物供給システムを提供する。患者が癌を患っている場合には、移植される生細胞は、例えば、インターロイキン−2、サイトカイン、またはリンホカインを分泌するように、遺伝子工学的処理がなされる。患者がHIVに感染している場合には、移植される生細胞は、例えば、T細胞成長因子またはHIV T細胞受容体のような、患者内でリンパ球産生を刺激する物質を分泌するように遺伝予工学的に改変される。本発明の方法においては、装置の半透膜の透過性は当業者に周知の因子、例えば封入される細胞または組織のサイズ、膜を透過して細胞または組織を維持するために必要な任意の物質のサイズ、および装置を透過することが望まれる、細胞によって分泌される生物学的に活性な任意の物質のサイズに基づいて決定される。ある実施態様では、半透膜はリンパ球を透過させない。別の実施態様では、半透膜はリンパ球および免疫グロブリンを透過させない。免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させない半透膜を用いれば、患者の免疫グロブリンおよび／またはリンパ球と生きた被封入細胞との接触を阻害し、それによって、そのような接触によって生じるかもしれない、被封入細胞の破壊を阻害する。本発明においては、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置するためには、任意の適切な処置法を用いてもよく、そのような方法は当業者に周知である。例えば、薬学的に許容される組成物の形態で、注射によって該物質を患者に投与しても良い。もし該物質が、CTLA4であれば、CTLA4Igを直接患者に投与してもよく、または別の実施態様では、CTLA4を分泌するように、遺伝子工学的に改変された細胞、すなわちB7分子に結合し得る分子をコードする遺伝子を含有し、該分子を発現するように遺伝子工学的処理を行った細胞を患者に移植してもよい。本発明の別の実施態様では、物質による患者の処置は、物質を分泌するように遺伝子工学的処理を行った細胞を患者に移植することを含む。物質を分泌するように遺伝子工学的に改変された細胞を患者に移植する揚合には、移植の前に、半透膜を具備する装置の中にこのような細胞自体を封入してもよい。別の実施態様では、物質を分泌する細胞を含有する装置の半透膜は、免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させず、このようにしなければ、このような接触によって生じたであろうこれらの細胞の破壊を阻害する。前述の実施態様において、物質による処置は、生細胞または組織の移植の前、後、または同時に行ってもよい。本発明の別の実施態様において、物質による患者の処置は、移植の前に、生細胞または組織を含有する装置の中に、物質を分泌するように遺伝子工学的に改変された細胞を封入することを具備する。本発明のさらなる実施態様において、物質による患者の処置は、患者に移植される生細胞に、移植の前に、該物質を分泌するように遺伝子工学的な改変を行うことを具備する。患者の免疫系が前記被封入細胞または組織に応答するのを阻害するのに有効な量の物質は、患者に移植する生細胞または組織の量、および患者の大きさおよび体重を含む、当業者に周知の困子によって決定されるが、これらに限定されない。本発明の方法によって、生きた被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を阻害することには、患者の免疫グロブリン産生を阻害すること、および患者のマクロファージの活性化を阻害することが含まれる。そうでなければ、このような免疫グロブリンおよび活性化されたマクロファージは、生きた被封入細胞または組織と反応し、該生きた被封入紬胞または破壊してしまうかもしれない。本発明はまた、患者の糖尿病を治療する方法であって、 a）生きた被封入インシュリン産生細胞を得るために、半透膜を具備する装置内に生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織を封入することと、 b）患者の糖尿病を治療するのに有効な量の、ステップ（a）で得た、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植することと、 c）ステップ（b）で得られた、相当量の生きた被封入インシュリン産生細胞に対する患者の免疫系の応答を有効に阻害する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置することを具備する方法を提供する。免疫系協同刺激現象を阻害する物質は当業者に公知であり、このような物質は全て、本明細書に記載した糖尿病治療法において使用し得る。本糖尿病治療法に用い得る免疫系協同刺激現象を阻害する物質は、上述されている。ある実施態様では、該物質はCTLA4である。生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織は、任意の既知のインシュリン産生細胞源から、またはインシュリン産生細胞を具備する組織源から得ることができる。本発明のある実施態様では、生きたインシュリン産生細胞は、膵臓の膵島組織から得られる。別の実施態様では、生きたインシュリン産生細胞は、移植の前に、インシュリンを分泌するように、遺伝子工学的に改変された細胞を具備する。該生細胞または組織は、異種のドナー、同種のドナー、または移植前の患者から得ることができる。細胞を患者から得る場合、ある実施態様においては、患者から取り出した後、移植によって患者に戻す前までに、該細胞に遺伝子工学的な改変を行って、インシュリンを産生させる。膵臓の膵島組織のような生きたインシュリン産生紬胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織は、任意のドナーから採取してもよい。ある実施態様では、ドナーは哺乳類である。このような哺乳類のドナーは、例えば、子ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、またはヒトであってもよい。膵臓の膵島組織のような生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織は、ブタの新生児のような哺乳類の新生児から採取してもよい。ある実施態様では、本発明に用いられる生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織はブタ新生児の膵臓細胞を含む。本明細書に記載した、本発明の方法の患者は、生細胞を移植することが望まれる患者であれば、どのような患者であってもよい。ある実施態様では、患者はヒトである。もし患者がヒトであれば、ある実施態様においては、生細胞またはそれらを含有する組織は、哺乳類、例えばヒトから得られる。上述したように、半透膜を具備する装置は当業者に周知であり、このような装置は全て、本糖尿病治療法に用い得る。該方法の別の実施態様では、装置は中空の繊維、円盤および球体である。本方法の別の実施態様において、上述したように装置はミクロカプセルである。本発明書に記載された糖尿病治療法は、糖尿病治療が望まれている任意の患者に適用し得る。本発明による患者の糖尿病治療法の実施態様の１つにおいて、該患者はインシュリン依存性糖尿病（IDDM）を患っている。該方法の別の実施態様では、患者は哺乳類、例えばヒトである。患者の糖尿病を治療するのに有効な、患者に移植した、生きた被封入インシュリン産生細胞の量は、患者の体重、および糖尿病の程度のような、当業者に既知の要素に依存するが、要素はこれらに限定されない。本糖尿病治療法における装置の半透膜の透過性は、上述した透過性を決定するための諸因子を含めた、当業者に公知の因子によって決定される。該方法の別の実施態様では、半透膜は免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させない。本糖尿病治療法における、免疫系協同刺激現象を阻害する物質による患者の処置には、上述の処置法が含まれる。もし、該物質がCTLA4であれば、該処置は、例えば患者にCTLA4Igを注射することによって、患者にCTLA4Igを投与することを含む。上述したように、物質を用いた処置には、該物質を分泌するように遺伝子工学的に改変された細胞を患者に移植することが含まれる。移植の前に、このような遺伝子工学的に改変された細胞自体を、半透膜を具備する装置内に封入してもよい。物質による処置が、半透膜を具備する装置内に封入され、該物質を分泌するように遺伝子工学的に改変した細胞を患者に移植することを含むのであれば、別の実施態様において、該装置は免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させない。 CTLA4のような、免疫系協同刺激現象を阻害し得る物質で患者を処置する前述の方法においては、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植する前、後、または同時に処置を行ってもよい。本糖尿病治療法の別の実施態様においては、免疫系協同刺激現象を阻害し得る物質で患者を処置することには、移植の前に、生きたインシュリン産生細胞または組織を含有する装置の中に、該物質を分泌するように遺伝子工学的な処理を行った細胞を封入することが含まれる。本糖尿病治療法の別の実施態様においては、物質で患者を処置することには、移植の前に、該物質を分泌するように、生きたインシュリン産生細胞に遺伝子工学的に改変することが含まれる。本糖尿病治療法によって、患者の免疫系が、生きた被封入インシュリン産生細胞又は組織に対して応答するのを阻害することには、患者内での免疫グロブリン産生の阻害、およびマクロファージの活性化の阻害が含まれ、さもなければ生きたインシュリン産生細胞または組織と反応して、これらは破壊されるかもしれない。本発明は、以下のセクションの「実験の詳細」からさらに良く理解されるであろう。しかし、当業者であれば、そこに議論された具体的な方法および結果は、さらにその後に続く請求の範囲においてさらに完全に記載されている本発明を限定する意図ではなく、むしろ単に説明を加えるものであることが容易に理解されよう。実験の詳細ミクロカプセルデザインの改良自然発症性糖尿病NODマウス中のラット膵島をほぼ永久的に生存させることができる、改良されたポリ−L−リジン−アルギネートミクロカプセル化処方は、「二重壁」ミクロカプセルである（図１および2）。該二重壁ミクロカプセルは、従来のミクロカプセルに比べて、耐久性があり、カプセル壁の損傷が少なく、測定した膜の透過性はおよそ100,000Kdであり、（IgGおよび148,000OKdの蛍光性デキストランを透過させる従来デザインのカプセルとは異なり）(9,19,20,118)I gGを排除する。これらのデータは、IDDMのヒトの中で永久的に使用するのに、カプセル化膵島異種移植が適切であることを支持する。ポリ−L−リジン（PLL）濃度は、PLL−アルギネートミクロカプセルの透過性を変化させるミクロカプセル化した膵島異種移植片の生存が、ミクロカプセルの透過性によって影響を受けるであろうと推測された。我々は、ミクロカプセル処方中のPLL （ポリ−L−リジン）濃度を増加または減少させることによって、ミクロカプセルの透過性が変化するかもしれないということを見出した。エアジェットシステムを介して、赤血球細胞をアルギネート中にカプセル化し、続いてPLLを含む様々なポリアミノ酸とともにインキュベートした。次に、該赤血球細胞を溶解させて、同時に処置した対照とともに、480nmで、ヘモグロビン（MW64,500）の流出を分光光度的に経時測定した。透過性係数は、以下の式：（2.303^*Cf^*Vt^*S）／（Ci^*At）（ここで、CLおよびCfは、開始時および終了時のヘモグロビン濃度、V tおよびAtは、各々カプセルの総容積および総面積、S＝In（Ct−Cf）／（Ci−Ct ）の傾きである）（119）に従って計算した。PLLの置換（ポリ−L−オルニチン、アラニン、アスパラギン酸、およびヒスチジン）では生きたカプセルは得られなかった。PLLの分子量の変化は、透過性に影響を与えなかった。PLLの濃度は、カプセルの拡散を変化させる、最も重要な因子であった。これらの結果は、他の研究者による最近の発見によって支持される（119）。PLL濃度を４倍増加させたカプセルから生じるヘモグロビンの流出は13分の１に減少した（表１参照）。実験では、100,000Kdの透過性のミクロカプセルに対して、70,000Kd未満の透過性のミクロカプセルを用いると、NOD中のカプセル化したウサギ膵島の生存が延長する（図３参照）。表１ PLL濃度を増加させれば、ヘモグロビンに対するミクロカプセルの透過性が減少するミクロカプセルは、宿主の感作を阻害または遅延させるミクロカプセルが、ラット異種膵島を長期間保護する機序を明らかにするために、１組の糖尿病NODを生理的食塩水またはルイスラット膵島（腹腔内に200個）または10⁶個のルイスラット脾臓細胞（腹腔内）で前処理した実験を行った。14 日後、予め感作させたNODおよび対照NODに、カプセル化ルイス膵島を異種移植した。図４および５に示されているように、膵島の前処理および脾臓細胞の前処理によって、移植片はすぐに拒絶されたが、予め感作させなかったNODはカプセル化膵島異種移植片を長期間受容した。これらのデータは、ミクロカプセルの主要な機能は、応答のエフェクターアーム（arm）から移植片を保護するというより、むしろ宿主の感作を阻害することであることを示唆している。このように、膵島の免疫原性を減少させる方策は、膵島のカプセル化と協働効果を示すかもしれない。 NOD中での、カプセル化膵島同系、同種および異種移植片の生存の比較ミクロカプセル化によって、拒絶時と同様にNOD細胞がミクロカプセル周囲へ集まりながら、NOD中の膵島異種移植片が、ルイスラット膵島の場合79±15日（N ＝8）（X±SE）、ウサキ膵島の場合20±2日（N＝7）、イヌ膵島の楊合14±4日（ N＝3）生存することを我々は明らかにした（表2）。またNODは、カプセル化した Balb／c同種膵島を73±31日（N＝4）で拒絶し、カプセル化したNOD同系膵島を44 ±7日（N＝4）で拒絶した（表2）。しかし、これらの同種および同系移植片の生検により、拒絶時において、宿主のマクロファージがミクロカプセルに殆ど付着しておらず、遊離の腹腔細胞（今のところ特定されていない）が存在することが示された。このように、カプセル化膵島異種移植の拒絶は、このモデルにおいては、同系および同種移植の拒絶とは区別される。表２ NODマウスにおける膵島同系移植、同種移植、および異種移植我々は、脾臓内に投与した、非カプセル化膵島の生存と比較して、ミクロカプセルが、NOD中の膵島異種移植片を機能的に、より長期間生存させることも見出した。同じことが、NODへの膵島の同種および同系移植片に当てはまる（表3）。表３ NODマウス中の膵島同系、同種および異種移植片の生存に対する、「二重壁」ミクロカプセル化の有益な効果移植後4−50日目に、糖尿病を自然発症したNODマウス腹腔の移植部位から、機能しているカプセル化異種移植片および拒絶されたカプセル化異種移植片を生検した。対照には、正常なマウス腹腔液、および空のカプセルまたは機能しているラット膵島を入れたカプセルを有するNODマウス（正常血糖値のレシピエントからの腹腔液を含めた（20,74）、しかし、14日および50日目の拒絶時に、細胞数は劇的に増加した。生検したカプセルをピペッティングすることによって、接着した細胞を遊離させた。フローサイトメトリー分析によって、非接着性腹腔細胞のうち20−50%がB220⁺（B細胞）であり、遊離の腹腔細胞およびミクロカプセルに接着した細胞の大部分が、Mac1⁺であることが明らかとなった（20,74）。CD4⁺ およびCD8⁺の腹腔細胞のパーセントは低かった（4−9%）。FACS分析によって、ミクロカプセル中の異種膵島が拒絶される間に、腹腔Macl細胞の表現型が、大多数を占めていたGranl^-からGranl⁺に移行した(vs.空のカプセル)。(20,74.120)。これらの知見は、免疫細胞化学によって確認した（20,74）。さらに、免疫組織化学は、IgGおよびIgMがミクロカプセル周囲に存在し、並びにIL-1およびTNF α がミクロカプセル周囲と内部の両者に存在することを明らかにした（20,74）。 NODから得たカプセル化膵島異種移植片の生検試料中のサイトカインメッセンジャーRNA（mRNA）の分析 NODによってカプセル化膵島が破壊される病因を明らかにするために、レシピエントNODの腹腔細胞からmRNAを抽出して、以前記述したように（121）、IL-2、 IL-4、およびIL-10のmRNAの発現をRT−PCRによって調べた。ノーザントランスファー、およびβアクチンの3'未翻訳領域に対するプローブとのハイブリダイゼーションを検査することによって、RNAサンプルの統一性を評価した（121）。拒絶されている異種移植片の大多数で、IL-4が検出された。IL-10の発現は、一定していなかった（表4）。自己免疫によってNOD同系移植片（および１つの同種移植片）が崩壊する間、IL-2が検出されたが、拒絶されている異種移植片では極めて希にしか検出されなかった。これらのデータは、拒絶されたカプセル化膵島異種移植中の一次的T細胞応答が「Th2様（Th2−Like）」であることを示している。この解釈は、活性化された、多数のマクロファージおよび免疫グロブリンが、NOD 中の拒絶されたカプセル化膵島異種移植片と会合しているという観察と一致するものである。このように、宿主のAPCによって、クラスII経路を介して加工された、可溶性の（すなわち流出した）異種抗原によって、カプセル化膵島異種移植片の拒絶が始まることはあり得る。次に、これらのAPCはB7／CD28依存性の機構を介して、Th2細胞を活性化する。腹腔中の抗原−抗体複合体の形成によって、マクロファージを活性化し、カプセル化膵島に対して直接的に有害なサイトカインが放出されると我々は仮定する。表４ NOD マウス中のカプセル化異種膵島の生検試料中のサイトカインmRNA NOD−MHCが、カプセル化膵島移植片の拒絶に必要である子を発現している）は、ともにカプセル化ラット膵島を拒絶したが、NOD.H−2^b マウス（MHCに連関していない糖尿病感受性遺伝子を全て発現している）は（B10 対照と同様に）＞100日間以上カプセル化ラット膵島を受容した（75）。ので、このことから糖尿病感受性とは異なる、カプセル化膵島に対する破壊的な応答に、NOD−MHCが寄与しているかもしれないと推測される（20，75）。SZNによるB10.H−297マウスの処置が、自己免疫応答を開始させたかもしれないというル化ラット膵島を拒絶した（生検の組織検査による、第60日）（75）。 CD8＋の除去は、NOD中のカプセル化膵島異種移植を防御しないカプセル化ウサギ膵島のNODレシピエントをモノクローナル抗体53.6.7、（5日目に10μ4g、その後週に２回、腹腔内）（抗−CD8）またはサイクロスポリンA（ CyA）（毎日30mg／kg、皮下）の何れかで処置したが、移植片の生存には全く影響がないことが分かった（表2）。CD8＋細胞の除去は、NODの脾臓およひ腹腔細胞のフローサイトメトリーによって確認された。失敗した移植片の生検によって、強烈な宿主の細胞応答、および元通りのミクロカプセル中で死滅した細胞が見出された。これらのデータは、非カプセル化膵島異種移植の拒絶において、(CD8 ＋ではなく)CD4＋T細胞が主要な役割を果たしているという以前の観察と一致している（83）。これらは、Th2NODによるカプセル化膵島異種移植片の拒絶機構ともほぼ一致している。協同刺激の阻害により糖尿病NOD中のカプセル化膵島異種移植片の寿命が延びる糖尿病NODレシピエントにモノクローナル抗体GK1.5を投与することによって、 CD4＋ヘルパーT細胞を阻害すると、カプセル化ラット膵島およびイヌ膵島の生存が、ともに顕著に増大する（＞100日）ことが以前示された（7,84）（図6）。本明細書の実験は、CTLA4Ig（0日目に腹腔内へ200μgおよび90日目までQOD）でNOD マウスを処置すれば、カプセル化ウサギ膵島の生存が、20±2日から98日±25日まで（P＜.05）有意に延びることを示している（表２および図7，8参照）。このことは、カプセル化膵島異種移植片に対するNODの応答においては、抗原提示の「間接的」経路が優勢であることを示唆している。SZN糖尿病マウスにヒト膵島を移植したときの発見とは異なり（12）、CTLA4Igだけでは、NOD中(脾臓または腎臓被膜下)の非カプセル化ウサギまたはラット膵島の生存は増大せす(表 2)、移植片の生存を延ばすためには、カプセル化とCTLA4Igが、ともに必要であったことを示唆している。さらに、本明細書の実験は、β細胞のインシュリンプロモーター上でCTLA4を発現しているINSCTLA4マウス（雌）からのカプセル化膵島は、NOD中で長期間機能することを示している（図９参照）。非カプセル化INSCTLA4膵島は、6−7日で NODによって拒絶された。これらのデータは、ドナー膵島のカプセル化と限定的な宿主免疫の修飾を組み合わせることによって、近縁関係にない膵島異種移植片が永続的に生存するかもしれないということを示唆している。これらのデータは、ドナー抗原がミクロカプセルから流出して、B7／CD28依律性の機構を介して、 CD4＋T細胞を活性化するAPCによってプロセッシングされるという作業仮説をも支持している。このモデルでは、CTLA4−トランスジェニックマウスは、インシュリンとともにCTLA4を分泌し、CTLA4が抗原提示を阻害する。興味深いことに、このトランスジェニックモデルでは、雌マウスに比べて雌マウスの方がCTLA4を多く分泌する（pers．comm．）。 NOD−Scidマウスは、ラットおよびウサギ膵島異種移植片を長期間受容するこれらの実験は、NOD−ScidマウスはMLD−SZN糖尿病（30mg／kg毎日５回）に対して感受性があることを実証し、ラットおよびウサギの非カプセル化およびカプセル化膵島の異種移植によって、NOD−Scid糖尿病が50日間以上回復することを明らかにしている（図10、11、および12、および表２参照）。このように、NO D−Scidマウスは、カプセル化膵島が拒絶される機構を研究するために、抗体および／またはT細胞を導入するための適切なレシピエントモデルとなるであろう。我々は、51、68、および70日目に、ミクロカプセル化ウサギ膵島を与えられた４匹のNOD−Scidのうち３匹で、高血糖が再発することに気付いた。同時に行った、空のミクロカプセル対照にでは、50日目に３つのミクロカプセルのうちの１つが破損し、２つが元のままであることが示されたので、技術的な理由により崩壊したカプセルおよび細胞の最小限の破壊が明らかとなる CTLAIgを用いた協同刺激の阻害方法：管を注入し、コラーゲナーゼで消化することによって、成熟ニュージーランドウサギの膵島を単離した。ウサギ膵島（約2000個）を２重壁、ポリ−L−リジンアルキネートミクロカプセル中にカプセル化し、以前に報告したように（7,20） NODの腹腔内に異種移植した。対照には、以前に記載したように（7,20）、脾臓または腎臓の被膜下に巽種移植した約2000個の芽カプセル化ウサギ膵島を与えた。ブリストル−マイヤーズ−スクイブ、シアトル、ワシントン州(Bristol−Myer s−Squibb，Seattle，WA)から購入したマウスCTLA4Igを１日目に200μ腹腔内投与し、続いて14もしくは92日間または移植が拒絶されるまでQ.O.D.で投与した。同様にカプセル化したウサギの膵島を与えられ（腹腔内）、他には処置を受けなかったNOD、１日目およびそれ以後毎日30mg／kgのサイクロスポリン（皮下）を与えられたNOD、または５日前、２日目およびそれ以後毎週100μg（腹腔内）の抗CD8モノクローナル抗体＃53.6.7.7（A.T.C.C.）を与えられたNODが、対照に含まれる。メタファン（metafane）麻酔および無菌技術を用いて、長期間機能している腹腔ミクロカプセルの生検を定期的に行った。100−200のミクロカプセルを採取すれば、移植による正常な血糖を変化させずに、組織学的な光学顕微鏡による研究が可能であった。カプセル化ウサギ膵島の異種移植が成功してから180日後に、長期間機能しており、生検で確認を行った、１匹のCTLA4Ig処置NODに脾臓除去手術を施した。これらの脾臓細胞を（107）を２匹のナイーブ糖尿病NODの腹腔に、受動的に（pass ively）導入し、その後脾臓細胞導入後10−14日後に、同様にカプセル化した、新鮮なウサギ膵島（ドナータイプ、ニュージーランド、非近親交配）を腹腔内に与えた。グループ間の統計的な差は、スチューデントのt検定およびANOVAを用いて評価した。結果 CTLA41gでNODを処置することにより、膵島をミクロカプセル化しただけのもの、または宿主をCTLA4Igで処置しただけのものと比べて、ポリ−L−アルギネートでミクロカプセル化した、自然発症性糖尿病NOD腹膣中のドナーウサギ膵島異種移植片の生存期間が延びた（CAP／I.P.）。最も長期間機能した移植片は、92日間CTLA4IgKを処置したNOD中のものであったが、平均移植生存期間は、CTLA4Ig を14日間だけ与えたNODの生存期間と有意な差はなかった（表５参照）。対照的に、サイクロスポリンA（CyA）、CD8特異的なモノクローナル抗体（53.6.7.7）、またはCTL4IgだけでレシピエントNODを処置しても効果がなかった（表５参照）。長期間生存しているカプセル化ウサギ膵島をNODから生検することにより、ミクロカプセルが元通りであること、ドナー膵島が生きていること、およびカプセル周囲（per−capsnlar）にNOD細胞応答が存在しないことが裏付けられた（図 13参照）。 CTLA4Ig処置した、不成功のカプセル化ウサギ膵島異種移植片を生検すると、殆どが崩壊した（破壊した）ミクロカプセルがであり、生きているドナヒ膵島は殆どなく、カプセル周囲の細胞反応が最少であることが示された。拒絶時に脾臓内のウサキ膵島を生検すると、核および細胞質の損傷、並びに死亡した膵島が示された。腹腔内カプセル化ウサギ膵島を与えられた対照、さらにCyAまたは53.6. 7.7処置されたレシピエント、または全く処置されなかったものから、移植後12 −52日目の拒絶時に生検することによって、以前記載したように（143,3,144）、全て一様に、カプセル周囲にマクロファージ、好中球、およびリンパ球が顕薯に集まっていることが示された。受動的な導入から10−14日後のカプセル化ウサギ膵島、または長期問血糖値が正常なNODの脾臓細胞（107個）を与えられたNODはともに、10−12日目に移植片を拒絶し（90日間CTLA4Ig処置を中止した、機能しているカプセル化ウサギ膵島を有する）、移植片の生検組織は未処置の対照NODと区別できなかった。NODの全実験群の膵島を生検することによって、すべて一様に膵島が消失し、血管周囲領域にリンパ球が時折集積していることが示された。表５糟尿病NODマウス中のカプセル化ウサギ膵島異種移植片の生存に対するCTL A4Ig、CyA、および抗−CD8モノクローナル抗体の影響新生児ブタ膵島の大規模な単離我々は、ブタの新生児が、最も有望な異種のドナー膵島の採取源であると考えている。ブタの新生児ドナーから、生きた機能的膵島を多数、再現的に単離する方法が開発されてきた（146，147）。この手法を用いることにより、各ブタのドナーから30,000−100,000個の膵島が得られるであろう（図14）。ブタ新生児の膵島細胞は、ミクロカプセル化後、インビトロでインシュリンを分泌し続ける( 図15)。これらのブタ新生児の膵島は、ブタ新生児の膵島細胞を実際に分散させたものであるが、該細胞は再び集まって、約5−10％のβ細胞を有する「膵島」様の楕円体を形成する（図16）。これは、成熱ブタの膵島中のβ細胞濃度である 1−2％に比べて有意に高い。さらに、異種移植から100日経過した後、これらの「膵島」を生検すると、インシュリン強陽性膵島細胞の数が増大していることが分かる（図17）。これらのブタ新生児の膵島は、移植後ミクロカプセル中で分化、増殖するように思われるという点で、成熟膵島に比べて、さらに利点がある。カプセル化および非カプセル化ブタ新生児膵島はともに、NOD−ScidマウスのSZN −糖尿病を回復させる最近、Scld変異がNODバックグラウンドに対して、戻し交雑され、免疫不全NOD −Scidマウスが得られた（66,67,68,69）。これらのマウスは、Scid変異に関してはホモ接合体であり、T細胞受容体および免疫グロブリン遺伝子を配列し直すことができない（48，79）。その結果、これらのマウスはTリンパ球およびBリンパ球を欠く。NOD−Scidマウスは、糖尿病を自然発症しないが、低量のストレプトゾトシンを繰り返すことにより（MLD−SZN）、糖尿病にすることができるよう（67,68,69）。NOD−Scidは、糖尿病NODからのリンパ球導入時に、糖尿病の発症に必要とされるNODMHC遺伝子およびその他の遺伝子を発現する。ブタ新生児膵島が機能的に生存していることを証明するために、我々はSZN糖尿病にそれらを異種移植したところ、ストレプトゾトシン糖尿病NOD−Scidマウスの高血糖が100日以上正常化した（図18，19，20）。このデータは、免疫的な攻撃の非存在下、種が異なるレシピエント中で、ブタ新生児の膵島が生き続け、生理的に機能する期間が延びることを示している。我々は、NODレシピエント中のカプセル化ウサギおよびブタ膵島の生存期間がC TLA4Igによって有意に延びるが、CTLA4Ig単独では、NODマウス中の非カプセル化膵島異種移植片が保護されないことを見出した（表６および図21）。表６NODマウス中のミクロカプセル化(MC)成熟ウサギおよび新生児ブタ膵島の生存：CTLA4IgによるNODの処置効果長期間機能しているカプセル化ブタ新生児膵島異種移植片の生検により、元通りのミクロカプセルの中で、ブタ膵島が生きていることが示され、長期間血糖値が正常であるNODの生検組織には、宿主NODのカプセル周囲の反応がないことが観察された（図22および23）。このモデルにおいて考えられる、CTLA4Igの作用機構を分析するために、我々は、補体を結合しないCTLA4Igの変異体（CtLa4Ig*）を最近考案して、代わりに用いた（145）。図24に示されているように、我々の研究により、CTLA4Ig*は、カプセル単独のもの以上には、移植片の生存期間を延ばさないことが明らかとなった。該データは、従来のCTLA4Igまたは変異CTLA4Ig*の何れかによって、顕著に延びるという、マウス異種移植片を用いた観察とは異なっている。これらの結果は、CTLA4Ig*によって移植片の生存期間が延びた機序は、同種膵島移植と異種膵島移植の揚合とでは異なるかもしれないということを示唆している。該結果は、患者中のサイトカインプロフィールが、移植片を防御する方策に変化し得ることを示唆する。該実験で調べたシステムでは、従来のCTLA4Igは、宿主中のγ− インターフェロン産生を増加させることによって、移植庁を保護するようにサイトカインの産生を変化させた。逆に、調べた該システムでは、CTLA4Ig中処置によって引き起こされたIL-10産生の増加は、移植を拒絶する方向に作用した。我々は、同一パッチのカプセル化ブタ新生児膵島を移植したが、CTLA4Igまたは非補体結合性CTLA4Ig*の何れかで処置した糖尿病NODマウスのマッチングペアからの脾臓細胞による増殖応答も測定した（図25）。この実験では、ブタ新生児の膵島によって刺激されたとき（パネルAおよびB）、正常NODマウスまたは糖尿病NODマウスは増殖しなかった。移植されなかったNODマウスの応答が一貫していない理由は、まだ分からないが、現在調査中である。空のカプセルは、どの脾臓細胞の増殖をも引き起こさなかったが、T細胞によって認識された膵島およびカプセル化膵島は、非常に小さいのでミクロカプセルから流出する。しかし、さらに多くの実験によって、このような解釈が確認されるであろう。通常のように、移植片を拒絶しているマウスからの脾臓細胞のバックグラウンド応答は（パネル D）、移植片を拒絶していないマウスからのもの（パネルC）より高かった。これらの結果は、カプセル化膵島を移植された両マウスからの脾臓細胞がインビボで感作されていることを示唆するが、CTLA4Igを与えたマウスが拒絶の徴侯を全く示さなかったという事実が得られて幾分驚かされた。これらの結果は、EL ISAによるリンホカインのためのブタ新生児膵島で刺激した培養液から、別の一液体が存在したという可能性を示していなかった（図26）。これらの結果は、ブタ新生児の膵島を移植されたマウスによってのみ、リンホカインが産生されることを示している。さらに重要なことには、その移植を長期間受容したマウス（CT LA4Igで処置した）からの脾臓細胞は、主としてINF γを産生し、低レベルのIL- 10を産生した。これらの結果は、CTLA4Igが、INF γを産生するT細胞を伴う、新生児のブタ膵島に対して長期間免疫寛容を引き起こしたことを示唆する。リンホカインがIL-10に移行したとき、膵島異種移植片の拒絶が起こった。このように、移植片の生存にはTh1様の応答が関与するが、移植片の拒絶にはTh2様の応答が関与する。これらの発見は、我々の作業モデルと一致する（図27）。これらの結果は、IL-4が顕著であった、カプセル化した異種膵島を拒絶したマウス中の拒絶部位のmRNAレベルを分析することによって得られた様子とは幾分異なっている。考察我々のデータに基づいて、NODマウスによる、すなわち自己免疫によるミクロカプセル化異種膵島の拒絶に関与していると、我々が考える機構を記述するモデルを我々は提出する（図27）。明らかに、分泌されたインシュリンは２重壁ミクロカプセルの膜を透過し、移植されたマウスのグルコースレベルを調節する。膵島から流出または分泌された100,000mw（AgX）未満の他のドナータンパク質またはタンパク質断片がミクロカプセルから拡散し、樹上細胞内に取り込まれる可能性がある。樹上細胞は、MHCクラスII経路を介して、タンパク質をプロセシングし、クラスIIとペプチドXの複合体および協同刺激分子をCD4＋T細胞に提示する。適当なサイトカインの律在下で、CD4＋T細胞は活性化され、CD40Lを発現するT h2細胞になる。AgXを結合するIgMを表面上に有するB細胞は、AgXを細胞内に取り込んで、B細胞表面上に発現されているMHCクラスIIと結合するペプチドにプロセシングする。クラスIIと複合体化したTh2特異的ペプチドXはB細胞と結合し、CD4 0LとCD40の楴互作用がB細胞の活性化を引き起こす。Th2リンホカインに誘導されて、活性化されたB細胞は形質細胞へと成熟する。形質細胞は、AgXと複合体を形成する特異的抗体を分泌する。抗体は、極めて大きいのでカプセル内に入ることはできず、カプセル化した膵島を直接損傷を与えることはできない。しかし、カプセル化した膵島異種移植片を拒絶しているNODの腹腔内における主要な群であるマクロファージを補強および活性することに、抗体が関与していることはあり得る。腹腔内の特異的抗体は、カプセルから流出または分泌された抗原と複合体を形成することができるであろう。このような抗原−抗体複合体は、腹腔マクロファージの表面上に発現されているFcRに、効率的に結合する。複合体のFcRへの結合によって、マクロファージは活性化されて、IL-1，TNF αおよび一酸化窒素（NO）を含む種々の情報伝達物質を分泌し（122，123）、これらは全て膵島に有害な影響を与え、且つ非常に小さいので二重壁ミクロカプセルを透過する。抗原複合体による補体（c）の活性化によって、エフェクターアームはさらに増強され得るであろう。複合体に結合したC3bは、C3b受容体を介した複合体の結合を増加させることによってマクロファージの活性化を増強せしめ（124）、補体活性化の間に放出された、C3bのような小ペプチドは、局所的炎症応答を引き起こし、それによって、さらに多くのマクロファージを腹腔に引き寄せる（125）。我々はドナー膵島のミクロカプセル化とNODのCTLA4Igによる処置が、膵島異種移植片の生存を延長させるという相乗効果を実証した。我々のデーダは、生検によって確認された、NODへの、近縁関係にない膵島異種移植片の生存期間としては、これまでの報告のなかで最長であることを示している。CTLA4Ig単独またはカプセル化単独では、何れも有効でなかった。さらに、移植が長期間上手く機能したレシピエントからの脾臓細胞は、ドナー特異的な非応答性をもたらさなかった。抗CD−8抗体およびCyA療法の効果がないことは、このモデルにおける応答が主としてTh2タイプであるという我々の仮説と一致する。異種認識は（同種認識と異なり）、主としていわゆる「間接的」抗原提示経路を介して起こり、それによって宿主のAPCは、（ドナーの）細胞外タンパク質から捕捉したペプチドを宿主のヘルパーT細胞に提示するということにはかなりの証拠がある（27,137,29,138）。NODのカプセル化膵島異種移植片の拒絶には、宿主のMHCが必須であるという我々の最近のレポート（75）、およびヘルパーＴ細胞がこの応答に不可欠であるという我々の以前の観察（7）はどちらも「間接的」経路と一致する。「直接的」経路は、「近縁関係にある」ドナー組織に対する反応の方を加速すると思われるので、「近縁関係にない」カプセル化膵島（イヌ、ウサギ、ウシ、ブタ）は、「近縁関係の」膵島（ラット）に比べて早く崩壊するという我々の以前の発見も（20）、この仮説を支持する。さらに、我々の最新データからは、カプセル化膵島異種移植の該モデルにおいて、「間接的」抗原提示はCTLA4Igによって阻害され得ると推測される。結論として、我々は、ミクロカプセル単独またはCTLA4Ig単独では、ともにNODによるウサギ膵島の破壊を防げないということを見出した。しかし、我々は、NODレシピェントのCTLA4Ig処置とカプセル化との相乗効果により、近縁関係にない膵島異種移植片の生存が顕著に延びることを観察した。第二の実験本研究のゴールは、ヒトのインシュリン依存性糖尿病(IDDM)の使用し得る最良のモデルである自然発症性糖尿病NODマウスによるミクロカプセル化膵島異種移植片の崩壊機序を明らかにすることであった。我々は、カプセル化膵島の破壊にはNODのヘルパーT細胞とMHCの両者が必要であることを見出し(30,31)、空のミクロカプセルはNODマウスの体内で生体適合的であることを報告した(27-29,31)。N ODマウスでの拒絶時に生検されたカプセル化膵島異種移植片は、IL-1、TNF α、とIL-4メッセンジャーRNAと共に、カプセル周辺に多数のマクロファージと免疫グロブリンを含有していた(13,28,29)。それ故、我々は、NODの拒絶は、カプセル化膵島から分泌されたドナー抗原によって開始され、宿主APCによるMHCクラス ii経路を介してプロセッシングされると推定した。その後、NOD CD4+T細胞は、T h2応答を促進し、サイトカインを介した現象を通じてドナー膵島の破壊が起こる。膵島異種移植片に対する免疫応答にAPCが関与していることは、協同刺激分子B 7を可溶性融合タンパク質CTLA4-Igで阻害すると、SZN糖尿病マウス中でのヒトからマウスへの膵島異種移植片の生存が延長することを見出したLenschowら(15)の最近の研究によって示唆された。インビトロ及びインビボでの幾つかの研究は、 T細胞と相互作用する外来分子は、単独でナイーブT細胞を刺激して増殖せしめ、抗原特異的なアネルギーを引き起こすかもしれないということを示した。少なくともさらに一つ（協同刺激）が必要であり、それはAPCによって与えられるものである。マウスの場合、このような協同刺激経路の１つに、APC上の２つのリガンド(B7-1及びB7-2)のうちの何れか１つと、T細胞表面抗原(CD28)との相互作用が含まれる(4,7,8,10,11,17,22)。しかし、このようなT細胞とAPCとの完全な相互作用が一度起これば、その後ペプチド、分裂促進因子等へのT細胞の再接触により、協同刺激非存在下で増殖するようになるであろう(10)。 CTLA4は、CD28に頸似する細胞表面タンパク質であるが、CD28とは異なり、活性化されたT細胞上だけで発現される。B7-1は、CD28よりもCTLA4に対して高い親和性を有する。そして、CTLA4はCD28の機能を調節するかもしれないと推測されてきた(5,6,11)。CTLA4-Igは、CTLA4分子の細胞外結合ドメインにIgG1遺伝子の定常領域を組み合わせた組換え可溶性タンパク質である。ヒト及びマウスCTLA 4Igはともに、マウスのTリンパ球応答を阻害することが示されてきた(9,14)。マウスにCTLA4Igを投与すれば、抗原特異的な非応答性が誘導され(7,11,25)、マウス心臓同種移植片が長期間受容されることが示された(3,21)。さらにCTLA4-Igは、NODマウスでの糖尿病の発症を減少することが報告されている(16)。我々は、最近、マウスCTLA4-IgがNODマウス中のカプセル化成体ウサギ膵島の生存を延長することを見出した(26)。物質と方法白色ランドレースブタから単離した新生児ブタ膵島を単離し、以前に記載したとおりに組織を培養した(12)。ニ重壁ポリ-L-リジン-アルギネートミクロカプセル中に、約8000の膵島を封入し、以前報告したとおりに、NOD又はNOD-SCIDマウスの腹腔中に移植した(29,31)。対照は、脾臓又は腎臓皮膜下に約8000の非カプセル化新生児膵島の移植を受けた。ブリストル・マイヤーズ。スクイブ(P.S.L)、シアトル、ワシントン州から購入したマウスのCTLA4-Igを、第０日目に腹腔内に200μg投与し、続いて21日間、又は21日目までに拒絶が起こるまで、Q.O.D.で投与した。２週間、その後は毎週ランダムな血糖値を測定することによって、移植片の機能を毎日モニターした(3 1)。２日続けて、ランダムな血糖値が250mg/dLを超えた場合を、移植片の拒絶と定義した。メタファン麻酔および無菌技術を用いて、長期間機能している腹腔ミクロカプセルの生検を定期的に行った。100−200のミクロカプセルを採取すれば、移植による正常な血糖を変化させずに、組織学的な光学顕微鏡研究とインシュリン免疫組織化学研究が可能であった(31)。群間の統計学的な有意差は、スチューデントのt検定とANOVAによって評価した。結果新生児ブタ膵島は、組織培養中で再凝集して、約5〜10%のβ細胞と「膵島」様ブタ新生児の膵島は、ブタ新生児の膵臓細胞を実際に分散させたものであるが、該細胞は再凝集して、約5−10％のβ細胞を有する「膵島」様の楕円体を形成する（図16参照）。これは、成熱ブタの膵臓中のβ細胞濃度である1−2％に比べて有意に高い。各2〜5日齢新生児ドナーブタから、約30,000〜100,000の膵島を得た(図14参照)。新生児ブタ膵島細胞は、ミクロカプセル化後にインビトロでインシュリンを分泌した(図15参照)。ストレプトゾトシン糖尿病NOD-Scidマウスへの移植から100日以上経過した後、これらの「膵島」の生検を行うことによって、多くの細胞凝集中に極めてインシュリン陽性な膵島細胞の数が増大していることが明らかとなった(図28)。このように、新生児ブタ膵島は、移植期間中に分化及び分裂するようである。 NODマウスをCTLA4-Igで処置すると、自然発症性糖尿病NODマウスの腹腔中のポリ-L-リジン-アルギネートミクロカプセル化されたドナー新生児ブタ膵島異種移植片(CAP/I.P.)の生存期間は、膵島ミクロカプセル化又はNOD CTLA4-Ig処置のみの場合と比べて、有意に延長した(表7)。CTLA4-Ig処置したNODマウスから得た長期間機能しているカプセル化新生児ブタ膵島を生検すると、多くのインシュリン陽性β細胞を有する生きたドナー膵島を含有する元通りのミクロカプセルが実証された(図29)。CTLA4-Ig処置なしで、腹腔内にカプセル化ブタ膵島を与えられた NOD対照の生検によって、以前記載したように、−様に、カプセル周辺にマクロファージ、好中球、及びリンパ球が集積していることが示された(2,20,24)。全ての実験群のNODマウスから膵臓を生検することによって、β細胞が存在しておらず、時折、血管周辺域にリンパ球が集積していることが示された。表７ NODマウス中でのミクロカプセル化(MC)新生児ブタ膵島の生存：CTLA4-IgによるN OD処置の効果考察本発明の最も重要な発見は、ドナー膵島ミクロカプセルとNOD CTLA4-Ig処置を併用すると、新生児ブタ膵島異種移植片の生存が延長することである。CTLA4-Ig 単独、カプセル化単独では何れも無効であった。異種認識(recoanition)は、（同種認識とは異なり）、主として、いわゆる「間接的な」抗原提示経路を介して（該経路によって、宿主APCは、細胞外（ドナー）タンパク質からスカベンジされたペプチドを酒主のヘルパーT細胞に提示する）起こるという証拠がある(1,18 ,19,23)。宿主MHCがカプセル化膵島異種移植片のNODによる拒絶に不可欠であるという出願人の最近の報告(30)、及び、ヘルパーNOD T細胞が該応答に不可欠であるという出願人の従前の観察(31)は、ともに「間接的な」経路と一致するものである。出願人の本データは、カプセル化膵島異種移植の該モデルにおいて、「間接的な」抗原提示が、CTLA4-Igによって阻害され得るということを示唆している。表８新生児ブタ膵島ミクロカプセルとCTLA4Igによる異種NODマウスレシピエント処置の相乗作用ブタc-ペプチド(ng/mL) HamのF10培地………………………………………………… 0.225 24時間上清−空カプセル…………………………………… 0.677 24時間上清−新しいカプセル化ブタ膵島………………… 13.469 24時間上清−腹部洗浄、CTLA4-Ig*処置、 239日、機能しているカプセル化ブタ膵島………………… 10.603 24時間上清、腹部洗浄、拒絶されたブタ膵島移植片…… 0.082 結論 CTLA4Ig、ミクロカプセル、及びNOD中の新生児ブタ膵島異種移植片 21日のCTLA4Igだけに、長期間の効果が見られた。野生型CTLA4Igと変異型CTLA 4Ig*(Y100F)(補体を結合しない)はともに、有効であった(図34-35参照)。レシピエントに対する毒性はなかった。移植片が長期間機能している生検による証明がある(図30-33参照)。長期間移植片が機能しているというさらなる証明は、急速に分解される分泌されたブタのインシュリン（ブタＣ−ペプチド）(表９参照）を測定するためにラジオイムノアッセイを用いることによって与えられる。インシュリンは、ブタに特異的なインシュリン細胞によって放出される（ブタインシュリンは、cペプチドのテールの存在によって検出される）。移植片中にcペプチドのテールが存在することは、例えば239日の長期間の移植ごとく、移植片が生存し、且つ機能していることを示している(図30-31も参照)。結論としては、出願人は、ミクロカプセル化単独、又はCTLA4-Ig単独では、何れもブタ新生児膵島のNODによる破壊を防げないことを見出した。しかし、出願人は、NODレシピエントのCTLA4-Ig処理と膵島カプセル化との相乗作用により、近縁関係にない膵島異種移植の生存期間が有意に延長することを観察した(表７及び８参照)。大量のブタ膵島を利用でき、ミクロカプセル及びCTLA4-Igが生体に許容性を有しているため、該アプローチは、（ヒトへの）臨床に適しているであろう。第三の実験カプセル化ブタ膵島を移植した糖尿病NODマウスにおけるT細胞の増殖とサイトカインの産生これらの実験のゴールは、糖尿病患者への耐久性のある生理的インシュリン源として、ミクロカプセル化異種膵島を移植するための手法を開発することであった。自然発症性糖尿病NODマウスでは、カプセル化新生児ブタ膵島とCTLA4-Igを組み合わせることによって、100日以上糖尿病が回復したが、CTLA4-Igなしのカプセル化膵島は、約２週間、非カプセル化膵島は１週間で拒絶された(図36参照) 。カプセル化ブタ膵島を移植したNODマウスのT細胞の増殖及びサイトカイン応答を比較した（図37〜58参照）。拒絶しているNODから採取した脾臓細胞(SPC)は、インビトロで自発的に増殖したのに対して、移植片が機能しているマウス又は移植を受けなかったNODから採取したSPCは増殖しなかった。膵島細胞は、正常なNO DのSPC又は移植を受けたNODのSPCの何れによっても、バックグラウンドを超えて増殖を誘導しなかった。しかし、ブタ膵島で刺激した後にサイトカイン分泌は検出された（図39A〜53B）。拒絶しているマウス、拒絶していないマウスのSPCは共に、膵島で刺激したときに、IFN γ、IL-10、及びTGF β、低レベルのIL-2、I L-12、及びIL-4を分泌した。さらに、腹腔（カプセル化膵島が移植された部位）から得た体液は、IFN γ、NO₂、IL-12、及び高レベルのTGF-βを含有していた（図41A、52A、及び58；48A；及び52A）を含有していた。対照的に、対照NODマウスの細胞によっては、ブタ膵島はサイトカインの分泌を刺激されなかった（図41 B、48B、50B、51B参照）。移植片を拒絶したNODマウスと移植片を受容したNODマウスとの間で、膵島によって誘導された増殖又はサイトカインに有意な差が見られなかったことは驚きであった。それ故、移植片が拒絶されたNOD中に存在し得るが、移植片が機能しているNODには存在しない別のサイトカイン（例えば、IL-1及びTNF α）をテストする予定である。要約屠殺日の腹腔液中のサイトカイン移植を受けた全てのNODの腹腔液は、比較的高レベルのIFN-γ(500〜2500pg/mL )、比較的高レベルのIL-12(50〜1000pg/mL)、これより少量のIL-5、IL-10、及び TNF-α(<200pg/mL)、これより少量のIL-2、IL-4、及びTGF β(<100pg/mL)を含んでいた。拒絶した被移植NOOと拒絶しなかったNODの腹腔液のサイトカインには、１つを除いて、有意な差は見られなかった。CTLA4-Ig未処置の拒絶したNODは、極めて高レベルのTNF-α(1400mg/mL)を有していた。様々なCTLA4-Ig処置（なし、変異型、又は野生型(WT)）を受けたマウスのサイトカインには、有意な差は見られなかった。移植を受けなかったマウス（糖尿病又は正常のNOD及びBALB/c）の腹腔液は、有意なレベルのサイトカインを含有していなかった。腹腔液は、他のサイトカイン、例えばIL-1についてテストする予定である。インビトロの一酸化窒素テストした全ての動物の「腹部洗浄(belly wash)」培養（移植を受けたマウスの腹腔から得たPEC及びカプセル化膵島）で、一酸化窒素が産生された。ブタ膵島とともに、移植を受けたマウスの脾臓細胞を培養すると、バックグラウンド以上の一酸化窒素の産生が誘導された。移植受けたNODのうち、拒絶していないものについてのみ、一酸化窒素をテストした。拒絶したNOD、正常なNOD、糖尿病NOD、及びBALB/cマウスについても、S PCとPECによる一酸化窒素の産生を分析しなければならない。脾臓細胞によるリンフォカインの産生ブタ膵島によって、対照動物（移植を受けていない正常NOD、糖尿病NOD、又は BALB/cマウス）の脾臓細胞を刺激しても、リンフォカインは誘導されなかった。しかしながら、CoonAによって対照マウスの脾臓細胞を刺激すると、高レベルのIFN-γとIL-2、少量のIL-10が誘導され、IL-4、IL-5、又はTNA-αは誘導されなかった。テストした移植を受けたマウスの50%以上で(10/17)、ブタ膵島は、インビトロでの脾臓細胞によるIFN-γの分泌を刺激した。４匹のマウス(2匹は拒絶、２匹は非拒絶）が、比較的高いIFN-γ(>1000pg/mL)を産生した。ブタ膵島は、より低いレベルのIL-4、IL-10、及びTGF-β(100〜500pg/mL)を刺激した。17匹のうち２匹で（ともに、非拒絶）、100pg/mLを超えるIL-4が刺激された。17匹のうち５匹で、100pg/mLを超えるIL-10が刺激された(2匹は非拒絶;3 匹は拒絶)。17匹のうち２匹で、100pg/mLを超えるTGF-βが刺激された（ともに、非拒絶）。ブタ膵島は、17匹の移植を受けたマウスのうち１匹（非拒絶）の脾臓細胞によるIL-12分泌を刺激した。ブタ膵島は、17匹の移植を受けたマウスのうち１匹(非拒絶)で、バックグラウンドを超えるIL-2分泌を刺激した。ブタ膵島は、移植を受けた全てのマウスの脾臓細胞によるTNF-α分泌を刺激しなかった。移植拒絶と明確な関連するリンフォカインは同定されなかった。様々なCTLA4- Ig処置(なし、変異型、又はWT)を受けたマウスのリンフォカインには、顕著な差は見られなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者ウェバー、コリン・ジェイアメリカ合衆国、ジョージア州 30339、アトランタ、ビニングス・フォレスト・ウェイ 3028 (72)発明者ハグラー、メアリー、ケーアメリカ合衆国、ジョージア州 30249、ローガンビル、バニー・コート・エス・ダブリュ 1193 (72)発明者リンスリー、ピーター・エスアメリカ合衆国、ワシントン州 98118、シアトル、ナインス・アベニュー・ウエスト 2430 (72)発明者カップ、ジュディス、エーアメリカ合衆国、ジョージア州 30308、アトランタ、チェルシー・サークル 411 (72)発明者セーフリー、スーザン・エーアメリカ合衆国、ジョージア州 30033、ディケーター、ウイリビー・ドライブ 638

Claims

【特許請求の範囲】１．患者に移植した生細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a)移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生細胞又は生細胞を含む組織を封入することと、 b)前記被封入細胞又は組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で、患者を処置すること、を具備する方法。２．物質がCTLA4である請求項１の方法。３．装置が中空繊維、円盤、又は球体である請求項１の方法。４．装置がミクロカプセルである請求項１の方法。５．生細胞又は生細胞を含む組織が異種ドナーから得られる請求項１の方法。６．生細胞又は生細胞を含む組織が同種ドナーから得られる請求項１の方法。７．生細胞又は生細胞を含む組織が患者から得られる請求項１の方法。８．患者に移植する前に、生細胞を遺伝子工学によって改変する請求項７の方法。９．患者がヒトである請求項１の方法。１０．生細胞が哺乳類由来である請求項１の方法。１１．哺乳類がヒトである請求項１０の方法。１２．患者が家畜である請求項１の方法。１３．家畜が、ウシ、子ウシ、ブタ、ヒツジ、子ヒツジ、ウマ、又はニワトリである請求項１２の方法。１４．生細胞が家畜の成長を促進するホルモンを分泌する細胞を含む請求項１２の方法。１５．生細胞が生物学的に活性な物質を分泌する細胞を含む請求項１の方法。１６．生物学的に活性な物質を分泌する細胞が内分泌細胞である請求項１５の方法。１７．内分泌細胞がインシュリン産生細胞、肝細胞、上皮小体細胞、又は下垂体細胞である請求項１６の方法。１８．生物学的に活性な物質を分泌する細胞が神経外胚葉細胞である請求項１５の方法。１９．神経外胚葉細胞が副腎細胞又はリンパ球である請求項１８の方法。２０．半透膜が免疫グロブリン及び／又はリンパ球を通過させない請求項１の方法。２１．CTLA4による患者の処置が、患者に可溶性CTLA4を投与することを具備する請求項２の方法。２２．可溶性CTLA4がCTLA4Igである請求項２１の方法。２３．前記被封入細胞又は組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止することが、生細胞又は組織と反応し得る免疫グロブリンの産生及び活性化されたマクロファージを阻害することを含む請求項１の方法。２４．患者の糖尿病を治療する方法であって、 a)半透膜を具備する装置内に、生きたインシュリン産生細胞、又は生きたインシュリン産生細胞を含む組織を封入することにより、生きた被封入インシュリン産生細胞を得ることと、 b)患者の糖尿病を治療するのに有効な量の、ステップ(a)で得た、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植することと、 c)ステップ(b)で得られた相当量の生きた被封入インシュリン産生細胞に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置することを具備する方法。２５．免疫系協同刺激現象を阻害する物質がCTLA4である請求項24の方法。２６．生きたインシュリン産生細胞を含む組織が膵臓の膵島組織を具備する請求項２４の方法。２７．生きたインシュリン細胞が、移植前にインシュリンを分泌するように遺伝子工学によって改変されあ細胞を含む請求項24の方法。２８．装置が中空繊維、円盤、又は球体である請求項24の方法。２９．装置がミクロカプセルである請求項24の方法。３０．生きたインシュリン産生細胞又は生きたインシュリン産生細胞を含む組織が異種ドナーから得られる請求項２４の方法。３１．生きたインシュリン産生細胞又は生きたインシュリン産生細胞を含む組織が同種ドナーから得られる請求項２４の方法。３２．生きたインシュリン産生細胞又は生きたインシュリン産生細胞を含む組織が患者から得られる請求項２４の方法。３３．生きたインシュリン細胞が、患者に移植される前に、インシュリンを分泌するように遺伝子工学的に改変されている請求項３２の方法。３４．患者が、インシュリン依存性糖尿病に罹患している請求項２４の方法。３５．患者が哺乳類である請求項３４の方法。３６．患者がヒトである請求項３５の方法。３７．患者が哺乳類である請求項２４の方法。３８．患者がヒトである請求項３７の方法。３９．半透膜が免疫グロブリン及び／又はリンパ球を通過させない請求項２４の方法。４０．CTLA4による患者の処置が、患者に可溶性CTLA4を投与することを具備する請求項２５の方法。４１．可溶性CTLA4がCTLA4Igである請求項２１の方法。４２．前記生きた被封入インシュリン産生細胞又は組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止することが、生きたインシュリン産生細胞又は組織と反応し得る免疫グロブリンの産生及び活性化されたマクロファージを阻害することを含む請求項２４の方法。４３．免疫系協同刺激現象を阻害する物質が、患者のサイトカインプロフィルも変化させて、患者の免疫系から被封入細胞又は組織を保護する請求項１の方法。４４．物質が患者のγ−インターフェロンの産生を増大させる請求項４３の方法。４５．物質がCTLA4Igである請求項４３の方法。４６．補体を結合する免疫系協同刺激現象を阻害する物質が補体を結合する請求項１の方法。４７．物質がCTLA4Igである請求項４６の方法。４８．免疫系協同刺激現象を阻害する物質が、患者のサイトカインプロフィールを変化させず、患者の免疫から被封入細胞又は組織を保護する請求項１の方法。４９．物質が患者のγ−インターフェロン及びIL-2の産生を増加させる請求項４８の方法。５０．物質がCTLA4Igである請求項４８の方法。５１．半透膜を具備する装置内の物質及び生細胞の含有物が、患者における宿主の免疫細胞増殖を阻害する請求項４８の方法。５２．半透膜を具備する装置が、中級繊維、円盤、又は球体である請求項４８の方法。５３．半透膜を具備する装置が、ミクロカプセルである請求項４８の方法。