JP2002500170A

JP2002500170A - サーラム（ｔｈｉｒａｍ）で構成される医薬品組成物

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Publication number: JP2002500170A
Application number: JP2000527218A
Authority: JP
Inventors: マリコブスキイ、モシェ
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1998-01-11
Filing date: 1999-01-11
Publication date: 2002-01-08
Also published as: WO1999034763A2; US6740681B1; IL122891A0; AU1888699A; EP1049441A2; WO1999034763A3

Abstract

(57)【要約】サーラム（テトラメチルチウラムジスルフィド）が血管形成及び炎症或いはそのいずれかを抑制し、新生成など血管形成依存病の治療並びに慢性関節リューマチなど、いくつかの障害及び病気に関連する炎症の抑制、治療及び軽減に使用し得ることを示した。サーラムは、さらに細胞の過増殖及び医療器具に沿って又は医療器具の周辺に凝血塊が生成するのを抑制する用途にも使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の分野）

【０００１】本発明は、血管形成及び炎症或いはそのいずれかの抑制剤として、病気又は障
害に関連する血管形成依存病及び炎症、或いはそのいずれかの治療に有用な医薬
品組成物の調製にサーラムを使用すること、並びに当該障害の治療方法に関する
ものである。

【０００２】（発明の背景）テトラメチルチオペルオキシジカルボン酸ジアミド又はテトラメチルチウラム
ジスルフィド（以後サーラム）は、消毒剤、種子殺菌剤及び動物駆除剤として使
用される殺菌剤及び殺細菌剤である。サーラムは、ゴム加工工業において、ゴム
の加硫促進剤及び加硫剤としても使用される。サーラムは両性的性格を有し、水
にも溶けるが、メタノール、アセトン又はクロロホルムなどの疎水性溶媒にはさ
らに良く溶ける。

【０００３】サーラムは、生体外では酵母グルタチオンレダクターゼ（Elskens,１９９５）及びウマの肝臓ミトコンドリアアルデヒドデヒドロジェナーゼ（Sanny,１９
８７）を、また、ネズミの生体内では脂肪組織のリポタンパク質リパーゼ活性（
Sadurska,１９９３）、アルデヒドデヒドロジェナーゼ及びアルデヒドオキシダーゼ（Freundt,１９７７）など、種々の酵素を抑制することが示されている。

【０００４】サーラムは、生体外において、Ｓ-９ミックスの存在下に、ヒトのリンパ細胞に対して毒性を有することが示されている（Perocco,１９８９）。サーラムは、
これで２年間処理（食餌中０．０５−０．１％）したネズミの体内で発癌性を示
すこと無く、自発的白血病並びに脳下垂体及び甲状腺腫瘍の発生率を低下させる
ことも示されている（Takahashi,１９８３; Hasegawa,１９８８）。４０ｍｇ／Ｋｇ／日で２年間サーラム処理したメスのネズミにおいては、乳房の線維線腫の
自然発生率が低下した（Maita,１９９１）。サーラムは、ネズミの体内において
、N-ニトロソジエチルアミンが誘発する肝臓癌の形成率も低下させた（Klimova,
１９９０）。

【０００５】サーラムは、オスのスイスアルビーノマウスの皮膚（１ｍｇ）内で染色体異
常を起こすこともなく（１００−２００ｍｇ／Ｋｇ）、発癌性も無いことが示さ
れている（George,１９９５）。

【０００６】血管形成及び炎症或いはそのいずれかの抑制剤としてサーラムを使用すること
に関しては、これまでに上記文献の中で述べられたことは無く、また示唆もされ
ていない。

【０００７】（発明の要約）本発明により、今やサーラムが血管形成に対して抑制効果を有し、ヌードマウ
スの皮下で誘発される新血管形成をブロックできることを発見した。さらにサー
ラムが、アジュバント関節炎に罹ったネズミの炎症を低下させることも発見した
。

【０００８】従って本発明は、血管形成及び炎症或いはそのいずれかの抑制剤として有用な
医薬品組成物の調製にサーラムを使用する方法に関するものである。

【０００９】本発明の医薬品組成物は、糖尿病性網膜症、角膜移植新血管形成、新血管形成
緑内障、トラコーマ及び後水晶体線維増殖症としても知られている早期網膜症な
ど眼科的障害；皮膚炎、乾癬及び発熱性肉芽腫などの皮膚科的障害；血管腫、血
管線維腫及び血友病関節などの小児科的障害；偽関節骨折などの整形外科的障害
；動静脈奇形などの神経脳血管障害；白血病及び固形腫瘍などの腫瘍；関節炎及
び強皮症などの結合組織障害；自己免疫病及び肥大症の治療を含む血管形成依存
症の治療に適している。但し、本発明の医薬品組成物が適しているのは、これら
の例に限定されるものではない。

【００１０】本発明に基づきサーラムで治療し得る固形腫瘍の例としては、膀胱、胸、頸、
耳、食道、腎臓、喉頭、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、甲状腺、尿
道及び子宮の癌を挙げることができる。但し、サーラムで治療し得る固形腫瘍の
例は、これらに限定されるものではない。

【００１１】さらに、本発明の医薬品組成物は、例えばリューマチ熱及び慢性関節リューマ
チなどのリューマチ病、結合組織炎、筋炎、神経炎、座骨神経痛、腰痛、糸球体
腎炎、腎炎、脈管炎、アレルギー病及び自己免疫病に関連する炎症症状の抑制、
軽減又は治療にも適している。

【００１２】本発明の医薬品組成物を調製するために、医薬品に使用できる担体及び従来か
らの添加剤とサーラムを混合して、投与に適した単位投与量処方を造る。本発明
では、適切な投与形態ならどんな形態でも使用できるが、その中でも、投与形態
としては経口投与が好ましい。

【００１３】１日当たりのサーラム投与量は、治療を行う障害の程度並びに年齢、体重及び
治療を受ける患者の状態により異なる。しかし、本分野に精通した医師であれば
、容易にこれを決定することができる。ここに、動物を使用した例に基づき、ヒ
トに対する適切な投与量は１−５０ｍｇ／人であると考えられる。

【００１４】他の側面において、本発明は、哺乳動物特にヒトの体内における血管形成及び
炎症、或いはそのいずれかを抑制する方法に関するものであり、血管形成及び炎
症或いはその何れかの抑制に有効な量のサーラムを、これを必要とする哺乳動物
に対して投与することにより構成される。

【００１５】さらに他の側面において、本発明は、細胞過増殖及びステント、カテーテル、
カニューレ、電極などの医療器具に沿って、又はこれら医療器具の周辺で生成す
る凝血塊の予防にサーラムを使用することに関するものである。一つの態様にお
いては、これらの器具を挿入する患者に対してサーラムを全身投与する。他の態
様においては、当該医療器具を患者に挿入する前に、これをサーラムでコーティ
ングする。本発明では、このようなサーラムコーティングした医療器具も対象とする。

【００１６】（省略語）ＢＣＥ：ウシの毛管内皮細胞；ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞成長因子；ＢＳＭ
Ｃ：ウシの血管平滑筋細胞；ＤＭＥＭ：ダルベッコ社製修正イーグル培地；ＥＧ
Ｆ：上皮成長因子；ＦＣＳ：胎児子牛血清；ＧＰＳ：グルタミン／ペニシリン／
ストレプトマイシン；ＨＢ-ＥＧＦ：ヘパリン結合上皮成長因子

【００１７】（発明の詳細な説明）血管平滑筋細胞及び内皮細胞は、血管壁を構成する２種類の細胞である。既存
の血管から発芽して新しい毛細血管が成長する血管形成過程においては、血管内
皮細胞及び血管平滑筋細胞の成長が必要である。本発明のデータによれば、サー
ラムは血管形成において明らかに有効な抑制剤として働くことが確認されている
。

【００１８】本明細書に示したように、サーラムを経口投与することにより、生体マウスの
皮膚内で新しい血管が誘発される現象に対してサーラムが抑制効果を示し、有効
に作用することが分かった。サーラムが低濃度でウシの培養毛管内皮（ＢＣＥ）
細胞の成長を抑制することは、当該薬剤が直接毛管内皮細胞に作用することを示
唆している。但し、内皮細胞の成長抑制効果は非可逆的であることも認められて
いる。血管壁を構成するもう一つの筋肉であるウシ血管平滑筋（ＢＳＭＣ）の成
長も、低濃度（０．２−０．５μＭ）のサーラムにより抑制されることが認めら
れた。サーラムが毛管内皮細胞中でアポトーシスを誘発し、血管平滑筋細胞、ケ
ラチノサイト（ＭＫ）、線維芽細胞及びＣ６ネズミ神経膠腫細胞のような他の種
類の細胞ではアポトーシスを誘発できないという事実は、サーラムが毛管内皮細
胞に対して何らかの特異性を有することを示している。実際、サーラムを２５−
６０μｇ／マウスという低い投与量で全身投与すると、特に新血管の形成が中断
されるが、他の組織に異常が起きた証拠は認められなかった。投与量をマウスの
体積（３μＭ）に対して計算し直した場合、全身投与を行ったサーラムの濃度は
、特に当該薬剤の体内における代謝処理を考慮した場合、生体外で内皮細胞に対
して使用した範囲（０．１−０．２μＭ）と同程度の低濃度であることが判明し
た。

【００１９】サーラムが毛管内皮細胞及びＢＳＭＣの成長を抑制することから期待されるよ
うに、マウスの全身を生体内で達成可能な濃度のサーラムで処理することにより
、皮膚内の新血管形成も抑制された。生体外においても、Ｃ６ネズミ神経膠腫細
胞の成長がサーラムにより抑制されることも分かった。固形腫瘍が前進的に成長
するには、活発な血管形成が不可欠である (Folkman,１９９０)という事実、及びＣ６神経膠腫の発達が血管形成に依存する (Abramovitch,１９９５;Ikeda,１９９５; Niida, 1995; Plate,１９９２)という事実を一緒にして考えると、Ｃ６
神経膠腫の成長がサーラムにより影響を受けることが期待できよう。事実、サー
ラムを生体外で内皮細胞及びＣ６神経膠腫細胞の両方に対して有効と認められる
濃度と同様の低濃度で全身投与した場合、生体内におけるＣ６腫瘍の発達が著し
く減少した。このことは、Ｃ６神経膠腫の成長に対する抑制作用が、血管形成及
びＣ６神経膠腫細胞の成長抑制作用により誘発されていることを示唆している。
サーラムが生体外又は生体内でその抑制効果を誘発するメカニズムについてはま
だ知られていない。毛管内皮細胞がサーラムに対して他の細胞よりアポトーシス
の誘発に対して敏感である理由も分かっていない。

【００２０】ここに示した結果は、サーラムが毛管内皮細胞及び血管平滑筋細胞の成長に対
して抑制効果を有し、毛管内皮細胞中でアポトーシスを誘発し、マウスの体内に
全身投与するとサーラムが血管形成を抑制し、Ｃ６神経膠腫の成長を減少させる
ことを証明している。このことは、明らかにサーラムを血管形成に対する新しい
抑制剤として定義し、これを新形成など新血管形成が関与する病気などの血管形
成依存症の治療に使用できることを示すものである。

【００２１】アジュバント関節炎は、ある種のネズミの血統において、ヒト結核菌（Mycoba
cterium tuberculosis）の抗原に対して免疫性を与えることにより誘発される実
験的な病気である（Pearson,１９５６）。この病気は、ヒトにおける慢性関節リ
ューマチのモデルと考えられている（Pearson,１９６４）。ネズミにおいて炎症
を軽減し、アジュバント関節炎を抑制することから、いくつかの病気、状態又は
障害に関連する炎症の抑制、治療及び軽減のためにサーラムを使用できることが
分かる。

【００２２】ここで、本発明を下記の例により説明することとする。但し、これらの例は、
本発明の請求範囲に限定を加えるものではない。

【００２３】（例）材料及び方法（ａ）材料：サーラム（Sigma）及びマウスＥＧＦ（Collaborative Biomedical Products,
Bedford, MA, USA）は購入品をそのまま使用した。遺伝子組み替えｂ-ＦＧＦ及び遺伝子組み替えＨＢ-ＥＧＦは、Gera Neufeld教授及びJudith A. Abraham博士
（Scios Nova Inc., Mountain View, CA）にそれぞれご提供頂いたものを使用し
た。

【００２４】（ｂ）細胞系：Ｃ６ネズミ神経膠腫細胞は、ＤＭＥＭ中で日常培養しているものに、５％ＦＣ
Ｓ（Biological Industries, Israel）、ＧＰＳ（100 U/mlのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン；Biological Industries, Israel）及び２ｍＭのグルタミン（Biolab Ltd., Israel）及び125 μg/mlのフンギゾーネ（Bio
lab Ltd., Israel）をこれに添加して使用した。

【００２５】ウシの脳毛管内皮細胞（ＢＣＥ）及びウシの血管平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）は、
Israel Vlodavsky教授（Hadassah Medical School, Jerusalem, Israel）にご提
供頂いたものを、低グルコースＤＭＥＭ（１ｇ／ｌ）中、３７℃で培養し、これ
に10%の子牛血清（HyClone, Logan, Utah, USA）、無血清補助剤（biogro-1; Be
th Haemek, Israel）及びＧＰＳをこれに添加して使用した。

【００２６】ウシの大動脈血管平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）は、10% ＦＣＳ（HyClone, Logan,
Utah）及びＧＰＳを添加した低グルコースＤＭＥＭ（１ g/l）中でこれを培養し
た。

【００２７】ＢＡＬＢ／ＭＫ内皮ケラチン生成細胞系は、S. Aaronson博士（National Canc
er Institute, Bethesda, MD, USA）にご提供頂き、カルシウムを含まないＭＥＭ（Beth Haemek, Israel）に１０％透析ＦＣＳ及びネズミＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を添加してこれを培養（３７℃、１０％ＣＯ₂湿潤雰囲気中）した。

【００２８】（ｃ）ＤＮＡの合成測定Ｃ６ネズミ神経膠腫細胞を、９６穴プレート（Nunc, Denmark）（１穴当たりの細胞数：５０００個）上で、５％ＦＣＳとともにプレート培養した。６時間後
に細胞を濯ぎ、４８時間血清フリーの培地でインキュベートした。その後、５％
ＦＣＳ又は成長因子を細胞に加えて２４時間インキュベートした（培養数：各３
個）。３Ｈ−メチルチミジン（５μＣｉ／ｍｌ）（Rotem Ind., Israel）を、最
後の１４時間で細胞に添加した。これらの細胞を１００μｌのメタノールで１０
分間濯ぎ、次に２００μｌの５％とリクロル酢酸で濯ぎ、最後に１５０μｌの０
．３ＭＮＡＯＨで濯いで溶解させた。ＤＮＡに組み込んだ放射性チミジンを１
分間かけて３ｍｌのシンチレーション液（ULTIMA GOLD Packard）により、βカウンター中で定量した。ＤＮＡ合成分析は、３回ずつこれを実施した。

【００２９】ウシの毛管内皮細胞（ＢＣＥ）及びウシの大動脈ＢＳＭＣを、２４穴のプレー
ト（１穴当たりの細胞数：６０００個）上、１０％コロラド産子牛血清（ＣＣＳ
）(GIBCO, USA)及びＧＰＳを添加したＤＭＥＭ媒体５００μｌ中でプレート培養
した。２４時間後、培地を飢餓培地（２％ＣＣＳ、０．５％ＢＳＡ、ＧＰＳ）に変更して、さらに２４時間培養を続けた。最後の６時間に3H-メチルチミジン（５μＣｉ／ｍｌ）を添加した。上に述べた方法に従って、ＤＮＡ合成分析を３
回ずつ実施した。ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン生成細胞中で、前に報告された方法（
Marikovsky, 1995）により、ＤＮＡ合成分析を実施した。ＤＮＡ合成量分析は３
回ずつこれを実施した。

【００３０】０．１ｍＭのＤＩＭＳＯ保存液中でサーラムを調製した。適切な濃度のＤＩＭ
ＳＯとともに比較対照サンプルを培養した。その抑制効果を、比較対照サンプル
に対するＤＮＡ合成量の割合として計算した。

【００３１】（ｄ）ヌードマウス中における皮下血管形成直径約１ｍｍの球状アガロースビーズを、血管形成剤としてｂ-ＦＧＦ又はＨ
Ｂ-ＥＧＦを含むＰＢＳ中で、ゲル化温度の低い４%アガロース（Sigma）から成形した。血管形成剤の候補物質（１０μｇ／ビーズ）を滅菌したミクロ試験管に
入れ、これを乾燥浴に漬けて数秒間で４０℃まで温めた。次に、５ μlの血管形
成化合物に１０μｌのアガロース溶液（６％食塩水溶液、４５℃）を加え、２０
μｌピペットの先端を使って氷の上でビーズを形成させた。以前、７５ｍｇ／ｋ
ｇケタミン＋３ｍｇキシラジン（ｉ．ｐ．）をマウスに１回投与して麻痺させ、
このマウスに埋めた多細胞回転楕円面を埋め込んだ例について報告した（Abramo
vitch,１９９５）のと同じ方法で、切開部位から１ cm離して当該ビーズを皮下に埋め込んだ。実験は、オスのＣＤ１ヌードマウスの体内で４日間実施した。各
実験日において、0.1−０．２５ｍＭ（２５−６０μｇ）のサーラムを添加し又は添加しない水溶液１ｍｌを、フィード針を使用して各マウスに導入した。ビー
ズを埋め込んでから３日間処理を続け、その１日後に実験を終了した。実験は各
４匹ずつ実施し、これを３回繰り返した。

【００３２】（ｅ）Ｃ６神経膠腫の成長Ｃ６神経膠腫細胞（１０⁶）をＣＤ１ヌードマウスの頸の後ろに皮下注入した。３日後、０．１−０．５ｍＭ（２５−１２０μｇ）のサーラムを添加し又は添
加しない水溶液１ｍｌを各マウスにフィード針を使って導入した。また１週間に
３度、マウスに経口投与した。Ｃ６細胞を注入してから３０日後に腫瘍を切除し
、これを秤量し、干渉ホルマリン中で固定し、組織学的断面を調製した。各実験
グループには８匹のマウスが含まれており、実験は２回繰り返して実施した。

【００３３】（ｆ）ＦＡＣＳによるアポトーシス細胞の分析上記の方法により、４０−５０％の合流率に達するまで、成長媒体の存在下に
、プラスチック製の組織培養皿の中で細胞を４８時間培養した。次に20時間かけ
てサーラムを細胞に添加した。ＥＤＴＡ-トリプシンでこの細胞をプレートから取り出し、氷冷した−２０℃の７０％エタノール（BioLab, Israel）の中で２時
間−１晩放置して固定した。この固定細胞（２−５ｘ１０⁶）をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳＳ）で１度洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮＡseＨ（Boehringer
Mannheim）とともにインキュベートした。その後、この細胞を５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Sigma）を含むＨＢＳＳ中に再懸濁させ、次にＬｙｓｉｓ IIソフトウェアを使用して、ＦＡＣSortフローシトメーター（Beckton Dicki
nson）で分析した。分析では、各サンプルから10,000個の細胞を採取して調べ、
ハイポジプロイド細胞の割合を測定した（Darzynkiewics,１９９２; Afanasyev,
１９９３）。細胞サイクルの各段階に従って、この細胞サイクルヒストグラムを４つの領域に分けた。即ち、Ａｐ：アポトーシス細胞、Ｇ₁：ジプロイド細胞、Ｓ：中間細胞、Ｇ₂/Ｍ：テトラプロイド細胞である。

【００３４】（ｇ）アポトーシス用ＴＵＮＥＬ分析成長媒体の存在下に、上記の方法で細胞を顕微鏡のスライド上で４８時間培養
し、４０−５０％の合流率を得た。次に、６時間又はＢＡＬＢ／ＭＫ角質生成細
胞の場合には２０時間かけてサーラムを細胞に添加し、４％パラホルムアルデヒ
ドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。上記の方法により、その場でＴＵＮＥＬ染
色してアポトーシスを分析した（Wride,１９９４）。簡単に述べれば、顕微鏡ス
ライドを60 ℃で15分間、2ｘＳＳＣ緩衝液中で培養し、ＤＤＷで洗浄し、２０μ
ｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Boehringer Mannheim）とともに室温で15分間インキュベートした。ＤＤＷで洗浄した後、スライドをＰＢＳＴ（０．０５％のTw
een２０を含むＰＢＳ）中で２％Ｈ₂Ｏ₂とともに１０分間、室温でインキュベートすることにより、内因性過酸化物を不活性化した。次にスライドをＴｄＴ緩衝
液（Boehringer Mannheim）中で５分間、室温でインキュベートし、次に５ｘＴｄＴ緩衝液及び１μｌのビオチン−２１−ｄＵＴＰ（Clontech,１ｍＭ保存溶液）及び８単位のＴｄＴ酵素（Boehringer Mannheim）を含む反応混合物（合計体積：５０μｌ）を添加した。この反応は、３７℃で１．５時間、湿度の高い部屋
の中で実施した。このスライドを２ｘＳＳＣ及びＤＤＷで洗浄し、最後にＰＢＳ
で洗浄して、スキムミルクのＰＢＳＴ１０％溶液でこれを覆った。このスキムミ
ルクを除去した後、各部分をＡＢＣキット（Vector Laboratories, Inc.）のＡＢＣ液とともに３０分間室温でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＡＥＣ法（
Sigma）で染色した。このスライドを、次にＤＤＷで３回洗浄し、３０秒間かけてヘマトキシリンで染色し、カイザーのグリセリンゼラチン（Merck）で接着し
てスライドに取りつけた。

【００３５】（ｈ）ルイス肺癌性腫瘍の成長Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊ（Ｈ-２^b）マウスの体内で自然発生するルイス肺癌（３Ｌ
Ｌ）は、自然発生的肺転移を造りだす悪性腫瘍である。ここでは、Lea Eisenbac
h教授（Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel）にご提供頂いた転移クローンＤ１２２を、組織培養及び生体内実験に使用した。細胞カルチャーは
、熱不活性化１０％ＦＣＳ、グルタミン、抗体、ピルビン酸ナトリウム及び非必
須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ中で保存した。

【００３６】転移点から採取した腫瘍の発達程度を測定するために、前に述べた生体内モデ
ル（Eisenbach,１９８３）を使用した。簡単に言えば、ＰＢＳ中のＤ１２２細胞
（５x１０⁵）をオスのＣ５７／Ｂ１マウスの尾に生体内注入し、２４日後にマウ
スに２０μｇ／マウスのキシラジン（ｉ．ｐ．）を注射して殺し、その肺を秤量
した。Ｄ１２２腫瘍細胞を注入してから３日後から週に３回、マウスを１匹ずつ
サーラム又は食塩水で処理した。各実験グループには８匹ずつのマウスが居た。
実験は２度繰り返した。

【００３７】（ｉ）ネズミにおけるアジュバント関節炎の抑制ヒト結核菌（ＭＴ）Ｈ３７ＲＡを、週齢９−10週のメスのルイスネズミの尾に注射してアジュバント関節炎を誘発させた。二重ブラインドテストを行って４本の脚で炎症を起こした関節の数を数え、炎症の程度を評価し、０（関節炎が
全く認められない場合）−１６（全ての関節で関節炎を起こしている場合）のス
ケールで採点した。ＭＴ注入を行ってから３日後に、サーラム量１４０又は２８
０μｇ／ネズミにおいて週に３回ネズミを処理し、ＭＴ注入を行ってから１３日
後に炎症度の評価を開始した。

【００３８】（例１：生体内における新血管形成のサーラムによる抑制）上記「材料及び方法」第（ｄ）節で述べた方法により、血管形成因子ｂＦＧＦ
（１０μｇ／ビーズ）を含むガロースビーズをＣＤ１ヌードマウスの皮下に埋め込んだ。その結果を図１に示す。４日後、ｂＦＧＦを含むビーズの周辺及び内
部で、新しい血管が明らかに発達した（図１Ｂ）。これに対して、食塩水だけを
含む比較対照ビーズは透明に見え、ビーズの周辺及び内部に新しい血管の形成は
認められなかった（図１Ａ）。しかし、３日間に亘り毎日マウスに１ｍｌ（０．
１−０．２５ｍＭ）のサーラム水溶液（Ｄ）（２５−６０μｇ／マウス/日）を与えたところ、ｂＦＧＦを含むビーズ周辺の血管形成は、明らかに抑制された（
図１Ｃ）。

【００３９】（例２：サーラムによる毛管内皮細胞増殖の抑制効果）サーラムが、生体内において血管形成反応の発達に関与する可能性のあるマク
ロファージ及びマスト細胞などの付属細胞ではなく、内皮細胞に直接に作用する
のかどうかを調べる目的で、当該薬剤がＢＣＦ細胞の成長にどんな効果を与える
かを、上記「材料及び方法」第（ｃ）節で述べた方法により生体外で調べた。サ
ーラムの濃度を次第に増加させ、当該細胞とともに24時間インキュベートして、
ＢＣＥ細胞内におけるＤＮＡ合成量を測定した。その結果を図２に示す。５０ｎ
Ｍ−０．５μＭの濃度範囲において、サーラムはその投与量に依存してＢＣＥ細
胞中におけるＤＮＡ合成を抑制することができた。完全な抑制効果はサーラム濃
度０．５μＭにおいて達成された（図２Ａ）。サーラムの抑制作用に対して、Ｂ
ＣＥ細胞は、ＢＡＬＢ／ＭＫ角質生成細胞（図２Ｃ）、Ｃ６ネズミ神経膠腫細胞
（図２Ｄ）又はウシ大動脈血管平滑筋（ＢＳＭＣ）（図２Ｂ）のような他の細胞
より敏感であることが示されている。ＢＳＭＣに対する最大の抑制作用（８０％
）はサーラム濃度０．５−１μＭで得られたが、これに対して、Ｃ６神経膠腫細
胞又はＢＡＬＢ／ＭＫ角質生成細胞に対する最大の抑制作用は、内皮細胞の場合
（０．２μＭ）と比較して１０倍も高い（２−３μＭ）濃度で達成された。これ
より高い濃度（＞１０μＭ）においては、サーラムの抑制効果は、調査した全種
類の細胞（これらの結果は示されていない）で減少した。

【００４０】サーラムによる効果の経時変化及び当該効果が可逆的であるかどうかを調べる
ために、細胞をサーラムとともに種々の時間（１、２、４及び２４時間）インキ
ュベートし、次にこれを洗浄し、ＤＮＡ合成量を定量した。１−４時間サーラム
に暴露すれば、ＢＣＥ細胞の０．５μＭ（図３Ａ）からＢＡＬＢ／ＭＫ角質生成
細胞（図３Ｃ）及びＣ６神経膠腫細胞（図３Ｄ）の５μＭに到る濃度範囲におい
て、充分に最大抑制効果を誘発させることができた。すでに示したように、ＢＣ
Ｅ、ＭＫ及びＣ６の神経膠腫細胞に対しては、当該薬剤に短時間暴露してから２
４時間経っても、当該抑制効果は維持されているように思われた。その中でＢＣ
Ｅ細胞は最も敏感であった。即ち、１−２時間０．５μＭのような低濃度サーラ
ムとともにインキュベートしても、ＤＮＡ合成に対してほぼ最大の抑制効果を充
分に誘発することができた（図３Ａ）。１μＭのサーラムとともにインキュベー
トした場合、経時変化的にはＢＳＭＣはこれより鈍感であった。１μＭのサーラ
ムとともにインキュベートした４時間後においても、ＢＳＭＣ中におけるＤＮＡ
合成の抑制効果はやっと５０％に到達しただけであった（図３Ｂ）。ここに示し
たデータは、毛管内皮細胞の損傷が１−２時間の短時間インキュベートにより最
大となり、且つ少なくとも２４時間くらいの時間範囲内においては、この損傷が
非可逆的であったことを示している。

【００４１】（例３：アポトーシスを経由する内皮細胞増殖のサーラムによる抑制効果）毛管内皮細胞の当該非可逆抑制効果が、予めプログラムされた細胞死経路によ
り誘発されたものであるかどうかを判定するために、ＦＡＣＳ分析及びＴＵＮＥ
Ｌ法により、ＢＣＥ細胞内のアポトーシス量を調べた。

【００４２】４８時間かけてＢＣＥ細胞を４０−５０％の合流度まで成長させた。次に、上
記「材料及び方法」第（ｆ）節に述べた方法により、この細胞に２０時間かけて
サーラムを添加した。その結果を図４に示す。０．５−５μＭのサーラムととも
にインキュベートしたＢＣＥ細胞のＤＮＡ含有量をＦＡＣＳ分析し、その結果、
細胞の準二倍体のアポトーシス集団が現れることが分かった。アポトーシス細胞
の出現量は投与量に依存した。これとは対照的に、比較対照の未処理内皮細胞に
は、このＤＮＡ崩壊プロセスが現れず、大部分の細胞がＧ₀/Ｇ₁相に、あるものはＳ及びＧ２／Ｍ相に存在した。ＢＣＥ細胞と異なり、４μＭのサーラムで処理
し、ＦＡＣＳで分析したＢＡＬＢ／ＭＫ角質生成細胞には、アポトーシスの誘発
が認められなかった（ここには示されていない）。アポトーシスを受ける細胞に
良く見られるように、サーラムで処理した内皮細胞は速やかに丸い形に変わった
。これとは対照的に、それぞれ１μＭ、２μＭ又は５μＭのサーラムで処理した
３Ｔ３線維芽細胞、Ｃ６神経膠腫細胞又はＢＳＭＣが丸い形になることは無かっ
た。

【００４３】上記「材料及び方法」第（ｇ）節で述べた方法により、ＴＵＮＥＬ法を使用し
てアポトーシスを受ける細胞核に標識を付けた。その結果を図５に示す。１μＭ
のサーラムとともに６時間インキュベートした毛管内皮（ＢＣＥ）細胞は、アポ
トーシスを誘発した（図５Ａ、一番下）。これとは対照的に、サーラムは、６時
間インキュベートしてＴＵＮＥＬ法により測定した場合、ＢＳＭＣ（１μＭ）（
図５Ｂ、一番上）、ＢＡＬＢ／ＭＫ角質生成細胞（５μＭ、図５Ｂ、中央）及び
Ｃ６ネズミ神経膠腫細胞（５μＭ）（図５Ｂ、一番下）にアポトーシスを誘発す
ることは無かった。このように、サーラム誘発アポトーシスに対する見かけ上の
敏感さにおいて、毛管内皮細胞は他の細胞とは異なっている。

【００４４】（例４：Ｃ６神経膠腫の生体内成長に対するサーラムの抑制効果）サーラムが、生体内の新血管形成並びに生体外のＣ６神経膠腫細胞に対して効
果的な抑制剤であることが分かったので、当該薬剤により全身治療を行うことに
より腫瘍の発達速度を抑え得ることが期待された。固形腫瘍が数ミリメートルの
直径を越えて前進的に成長するためには、活発な血管生成が不可欠だからである
（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９０）。生体内における血管形成に対して抑制効果があ
ることが判明している濃度を使用し、ＣＤ１ヌードマウスにおけるＣ６ネズミ神
経膠腫モデルにおいて、サーラムの抑制効果を調べた。週に３回サーラム（Ｔ）
を全身投与したマウスから腫瘍を採取し、Ｃ６ネズミ神経膠腫細胞をＣＤ１ヌー
ドマウスに投与してから３０日後に、この腫瘍の重さを測定した。サーラムで全
身治療を行うことにより、腫瘍の成長速度は著しく遅延された。水だけを与えた
比較対象と比較して、サーラム処理を行ったマウスから採取した腫瘍は著しく小
さかった。実験は２度繰り返して行った（ｎ＝８）。

【００４５】表１に示すように、サーラム濃度２５−１２０μｇ／マウスにおいて、腫瘍の
発達は５８−４２％それぞれ遅延した。面白いことに、最も有効な濃度は低い方
の濃度であった。生体外成長におけるサーラムの抑制効果が、サーラム濃度が高
い場合に低下するという観察結果（示されていない）があるが、この事実はこの
観察結果と一致している。マウスの生体内及び生体外において、Ｃ６神経膠腫細
胞の中でサーラムが血管生成を抑制する。従って、サーラムで観察された腫瘍の
成長抑制は、二重の作用、即ち一つは当該腫瘍の新血管形成に対する作用であり
、もう一つはＣ６神経膠腫細胞に対する作用により、その抑制効果を発現するも
のと考えることができる。種々の組織（腎臓、肝臓、胃、肺及び脾臓）を病理学
的に調べた結果、これらの組織から調製した組織学的部分を含め、サーラム処理
したマウスの体内において、これらの組織には影響が無いことが明らかになった
。さらに試験を行った結果、これら組織中の血管にも影響が無いことが判明した
。

【表１】

【００４６】（例５：生体内モデルにおけるルイス肺転移のサーラムによる抑制効果）転移点からの腫瘍の発達をサーラムが抑制する効果について調べるために、上
記「材料及び方法」の第（ｈ）節で述べた生体内モデルを使用した。Ｄ１２２細
胞を生体内注入してから３日後に、濃度１３−４０μｇ／マウスのサーラムを当
該マウス１匹につき週に３回投与した。図６に示すように、サーラムは肺内転移
点の発達を70−83%抑制した。生体内モデルにおいてサーラムが肺転移に対して高度の抑制効果を有するという事実は、その抑制効果が転移点の発達過程で起こ
ることを示している。

【００４７】（例６：アジュバント関節炎モデルにおける炎症のサーラムによる軽減効果
）炎症には通常血管形成の増加が伴うので、血管形成を抑制できる薬剤が、炎症
も軽減してくれるであろうと考えた。アジュバント関節炎（ＡＡ）モデルを選ん
で、炎症反応の程度に対するサーラムの効果を調べた。「材料及び方法」の第（
ｉ）節で述べた方法により、アジュバント関節炎をルイスネズミに誘発させた。ＭＴ注入の３日後に開始して、１匹のネズミに対して濃度１４０−２８０μｇ
／ネズミのサーラムを週に３回ずつ投与した。その結果を図７に示す。１４０μ
ｇサーラム/ネズミで処理したネズミの炎症反応は、試験期間中に、未処理ネズミと比較して大幅な減少を示した。

【００４８】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ−１Ｃは、サーラム（Ｔ）がヌードマウスの体内において、新血管形成
を抑制する様子を示したものである。血管形成化合物ｂＦＧＦ（１０μｇ／ビー
ズ）を含むアガロースビーズをヌードマウスの皮下に埋め込み、皮膚試験片中に
おけるｂＦＧＦの埋め込み４日後の生体内血管形成ポテンシャルを示した（図１
Ｂ）。食塩水（負の比較対照）がビーズ周辺に新血管形成を誘発することは無か
った（図１Ａ）。６０μｇ／マウスのサーラム（Ｔ）を全身投与したところ、ビ
ーズの内部及び周辺で、ほぼ完全にｂＦＧＦによる新血管形成を抑制することが
認められた（図１Ｃ）。バーの長さは１ mmである。

【図２】図２Ａ−２Ｄは、それぞれＢＣＥ、ＢＳＭＣ、ＢＬＢ／ＭＫ及びＣ６ネズミの
神経膠腫細胞の中で、サーラムが生体外におけるＤＮＡ合成（細胞中へ³Ｈ−チミジンを導入することにより測定）を、その投与量に依存して抑制することを示
している。実験は３度ずつ実施し、抑制効果は未処理比較対照に対するＤＮＡ合
成量の割合として計算した。

【図３】図３Ａ−３Ｄは、時間を変化させ（１、２、４及び24時間）、それぞれＢＣＥ
、ＢＳＭＣ、ＢＡＬＢ／ＭＫ及びＣ６ネズミ神経膠腫細胞中で³H-チミジンを細胞に導入して測定した場合、サーラムが非可逆的にＤＮＡ合成を抑制する様子を
示している。実験は３回ずつ実施し、抑制効果は、未処理比較対照に対するＤＮ
Ａ合成の割合として計算した。

【図４】サーラムが内皮細胞中でアポトーシスを誘発する様子を示している。ＢＣＥ細
胞を０．５−５μＭのサーラム（Ｔ）とともに20時間インキュベートし、ＦＡＣ
Ｓにより細胞中のＤＮＡ含有量を分析した。サーラムは、内皮細胞の準二倍体ア
ポトーシス集団の生成を投与量に依存して誘発した。この現象は、比較対照によ
り処理した細胞では認められなかった。実験は３匹ずつ２回繰り返した。

【図５】図５Ａ−５Ｂは、ここに示した濃度のサーラム（Ｔ）とともにインキュベート
（ＢＣＥ、ＢＳＭＣ及びＣ６神経膠腫細胞で６時間、ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞で20時
間）してＴＵＮＥＬ法で分析した場合、サーラムがＢＣＥ、ＢＳＭＣ、Ｃ６神経
膠腫及びＢＡＬＢ／ＭＫ細胞中でアポトーシスを誘発する様子を示している。サ
ーラムで処理したＢＣＥ細胞の核（図５Ａ、一番下）はＴＵＮＥＬ染色法で標識
した。これに対して、サーラムで処理した比較対照のＢＣＥ（図５Ａ、一番上）
及びＢＳＭＣ（図５Ｂ、一番上）の核、ＭＫ（図５Ｂ、中央）及びＣ６神経膠腫
細胞（図５Ｂ、一番下）は、ＴＵＮＥＬ染色法による標識は行わなかった。実験
は３匹ずつ２回繰り返した。

【図６】ルイス肺腫瘍が生体内モデルでマウスの肺に転移するのを、サーラムが抑制す
る様子を示している。週に３回サーラム（１３−４０μｇ）を全身投与したＣ５
７／ＢＬマウスから肺を採取し、Ｄ１２２腫瘍細胞を生体内注入してから２４日
後にこの肺を秤量した。転移肺の重量から正常マウスの肺の重量を差し引いて計
算を行った。水だけを与えた比較対照と比較すると、サーラムで処理したマウス
の肺においては転移量は著しく小さかった（ｎ＝６；ｐ＝０．０１９−０．０６
９）。濃度１３μｇ／マウスにおいて、サーラムは肺転移量を６分の１に減少さ
せた。実験は２回ずつ繰り返した。

【図７】サーラムがネズミの生体内において、アジュバント関節炎（ＡＡ）による炎症
反応を減少させる様子を示したものである。１匹ずつ週に３回サーラムを１４０
（黒丸）及び２８０（＋印）μｇ／ネズミの濃度で投与した。１４０μｇ／ネズ
ミのサーラムでこれらのネズミを処理したところ、ネズミの炎症反応は試験期間
中に著しく減少した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/04 Ａ６１Ｐ 19/08 19/08 27/02 27/02 27/06 27/06 29/00 29/00 １０１１０１ 35/00 35/00 35/02 35/02 35/04 35/04 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 １０５ 43/00 １０５Ａ６１Ｌ 33/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4C081 AC06 AC08 EA06 4C206 AA01 AA02 JA72 MA05 MA72 NA14 ZA33 ZA81 ZA89 ZA96 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サーラムと医薬品に使用可能な担体で構成され、血管形成及
び／又は炎症の抑制のための医薬品組成物。
【請求項２】血管形成依存病治療のための請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項３】当該血管形成依存病が眼科的、皮膚科的、小児科的、整形外
科的、結合組織的又は神経脳血管的障害、腫瘍、或いは肥大症である請求項２記
載の医薬品組成物。
【請求項４】当該眼科的障害が糖尿病性網膜症、角膜移植新血管形成、新
血管形成緑内障、トラコーマ、又は後水晶体線維増殖症である請求項３記載の医
薬品組成物。
【請求項５】当該皮膚科的障害が皮膚炎又は発熱性肉芽腫である請求項３
記載の医薬品組成物。
【請求項６】当該小児科的障害が血管腫、血管線維腫、又は血友病関節で
ある請求項３記載の医薬品組成物。
【請求項７】当該整形外科的障害が偽関節骨折である請求項３記載の医薬
品組成物。
【請求項８】当該結合組織障害が強皮症である請求項３記載の医薬品組成
物。
【請求項９】当該神経脳血管障害が動静脈奇形である請求項３記載の医薬
品組成物。
【請求項１０】当該腫瘍が白血病或いは膀胱、胸、頸、耳、食道、腎臓、
咽頭、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、甲状腺、尿道及び子宮の癌か
ら選ばれた固形腫瘍である請求項３記載の医薬品組成物。
【請求項１１】転移予防のための請求項１０記載の医薬品組成物。
【請求項１２】リューマチ病に関連する炎症症状の制御、軽減又は治療の
ための請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項１３】リューマチ熱及び慢性関節リューマチに関連する炎症症状
の抑制、軽減又は治療のための請求項１２記載の医薬品組成物。
【請求項１４】結合組織炎、筋炎、神経炎、座骨神経痛、腰痛、糸球体腎
炎、腎炎、脈管炎、アレルギー病及び自己免疫病に関連する炎症症状の抑制、軽
減又は治療のための請求項１記載の医薬品組成物。
【請求項１５】経口投与するための請求項１−１４のいずれか一項に記載
の医薬品組成物。
【請求項１６】血管形成及び／又は炎症を抑制するために有用な医薬品組
成物を調製するためのサーラムの使用。
【請求項１７】血管形成依存病の治療のための請求項１６記載の使用。
【請求項１８】眼科的、皮膚科的、小児科的、整形外科的、結合組織的又
は神経脳血管障害的障害、腫瘍、或いは肥大傷から選ばれる血管形成依存病の治
療のための請求項１７記載の使用。
【請求項１９】当該眼科的障害が糖尿病性網膜症、角膜移植新血管形成、
新血管形成緑内障、トラコーマ、又は後水晶体線維増殖症である請求項１８記載
の使用。
【請求項２０】当該皮膚科的障害が皮膚炎又は発熱性肉芽腫である請求項
１８記載の使用。
【請求項２１】当該小児科的障害が血管腫、血管線維腫又は血友病関節で
ある請求項１８記載の使用。
【請求項２２】当該整形外科的障害が偽関節骨折である請求項１８記載の
使用。
【請求項２３】当該結合組織障害が強皮症である請求項１８記載の使用。
【請求項２４】当該神経脳血管障害が動静脈奇形である請求項１８記載の
使用。
【請求項２５】当該腫瘍が白血病或いは膀胱、胸、頸、耳、食道、腎臓、
喉頭、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、甲状腺、尿道及び子宮の癌か
ら選ばれた固形腫瘍である請求項１８記載の使用。
【請求項２６】腫瘍の転移予防のための請求項２５記載の使用。
【請求項２７】リューマチ病に関連する炎症症状の抑制、軽減又は治療の
ための請求項１６記載の使用。
【請求項２８】リューマチ熱及び慢性関節リューマチに関連する炎症症状
の抑制、軽減又は治療のための請求項２７記載の使用。
【請求項２９】結合組織炎、筋炎、神経炎、座骨神経痛、腰痛、糸球体腎
炎、腎炎、脈管炎、アレルギー病及び自己免疫病に関連する炎症症状の抑制、軽
減又は治療のための請求項１６記載の使用。
【請求項３０】当該医薬品組成物が経口投与に適した請求項１６−２９の
いずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】個人の血管形成及び／又は炎症を抑制する方法であって、
それを必要とする個人に血管形成及び／又は炎症を抑制するのに有効な量のサー
ラムを投与することで構成される方法。
【請求項３２】血管形成依存病の治療を行う請求項３１記載の方法。
【請求項３３】当該血管形成依存病が眼科的、皮膚科的、小児科的、整形
外科的、結合組織的又は神経脳血管障害、腫瘍、及び肥大傷で構成されるグルー
プから選ばれる請求項３２記載の方法。
【請求項３４】当該整形外科的障害が糖尿病性網膜症、角膜移植新血管形
成、新血管形成緑内障、トラコーマ、又は後水晶体線維増殖症である請求項３３
記載の方法。
【請求項３５】当該皮膚科的障害が皮膚炎又は発熱性肉芽腫である請求項
３３記載の方法。
【請求項３６】当該小児科的障害が血管腫、血管線維腫又は血友病関節で
ある請求項３３記載の方法。
【請求項３７】当該整形外科的障害が偽関節骨折である請求項３３記載の
方法。
【請求項３８】当該結合組織障害が強皮症である請求項３３記載の方法。
【請求項３９】当該神経脳血管障害が動静脈奇形である請求項３３記載の
方法。
【請求項４０】当該腫瘍が白血病或いは膀胱、胸、頸、耳、食道、腎臓、
喉頭、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、甲状腺、尿道及び子宮の癌か
ら選ばれた固形腫瘍である請求項３３記載の方法。
【請求項４１】リューマチ病に関連する炎症症状の抑制、軽減又は治療の
ための請求項３１記載の方法。
【請求項４２】リューマチ熱及び慢性関節リューマチに関連する炎症症状
の抑制、軽減又は治療のための請求項４１記載の方法。
【請求項４３】結合組織炎、筋炎、神経炎、座骨神経痛、腰痛、糸球体腎
炎、腎炎、脈管炎、アレルギー病及び自己免疫病に関連する炎症症状の抑制、軽
減又は治療のための請求項３１記載の方法。
【請求項４４】サーラムを経口投与する請求項３１−４３のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項４５】医療器具に沿って又は医療器具の周辺で細胞が過増殖し、
凝血塊が生成するのを防止するためのサーラムの使用。
【請求項４６】当該医療器具がステント、カテーテル、カニューレ、又は
電極である請求項４５記載の使用。
【請求項４７】当該器具を挿入した患者にサーラムを全身投与する請求項
４５又は４６記載の使用。
【請求項４８】当該医療器具を患者に挿入する前にサーラムでコーティン
グする請求項４５又は４６記載の使用。
【請求項４９】医療器具に沿って又は医療装置の周辺で細胞が過増殖し、
凝血塊が生成するのを防止する方法であって、当該医療器具を患者の体内に挿入
する前にサーラムでコーティングする上記方法。
【請求項５０】当該医療器具がステント、カテーテル、カニューレ、又は
電極である請求項４９記載の方法。
【請求項５１】サーラムでコーティングした医療器具。
【請求項５２】当該医療器具がステント、カテーテル、カニューレ、又は
電極である請求項５１記載のサーラムコーティング医療器具。