JP2002500050A - 差次的に発現された遺伝子の固相選択 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、差次的に発現された遺伝子をモニターおよび単離するための方法ならびに材料を提供する。本発明の方法に従って、比較される供給源由来の、異なって標識されたＤＮＡ集団が、固相支持体（例えば、微粒子）上のクローン化された参照ＤＮＡを競合的にハイブリダイズされ、差次的な発現ライブラリーを提供する。これは、好ましい実施態様において、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって操作され得る。微粒子上において異なる蛍光標識の相対シグナル強度をモニターすることは、参照ＤＮＡに対する発現レベルの定量的な分析を可能にする。本発明はまた、稀な遺伝子を同定および単離するための方法を提供する。目的の相対シグナル強度を有する微粒子の集団は、ＦＡＣＳによって単離され得、そして付着されたＤＮＡは、配列決定（例えば、大規模並行サイン配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）、または簡便なＤＮＡ配列決定プロトコルを用いて）することによって同定され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９８年８月６日に提出された、同時係属中の米国特許出願番号
０９/１３０,４４６号の一部継続出願であり、米国特許出願番号０９/１３０,４
４６号は、１９９８年１月９日に提出された同時係属中の米国特許出願番号０９
/００５,２２２号の一部継続出願である。これらの出願は、本明細書中で参考と
して援用される。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、一般に、差次的に発現された遺伝子を同定するための方法に関し、
そして、より詳細には、例えば、蛍光活性化フローソーティングによって、物理
的に操作され得る差次的な発現ライブラリーを提供するために、差次的に発現さ
れたＤＮＡと固相支持体上のクローン化された参照ＤＮＡ配列とを競合的にハイ
ブリダイズする方法に関する。

【０００３】 （背景） ヒトゲノムを解読するためならびに疾患および宿主の差次的な遺伝子発現に関
連する他の生理学的状態を支配する遺伝的な根拠を理解するために所望されるこ
とは、ＤＮＡを分析および配列決定するための改良された方法の開発の重要な原
動力になっている。Ａｄａｍｓら、編、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、１９９４）。ヒトゲノムは、約１０⁵の遺伝子を含み、その約１ ５〜３０％−または約２０〜４０メガベース−が、任意の所定の組織において活
性であると推定される。このような大多数の発現された遺伝子は、特に、比較的
低レベルで発現される大多数の遺伝子を参照すると利用可能な技術による発現パ
ターンにおいて変化を追跡することを困難にする：ほとんど３０％のｍＲＮＡは
、各々が全体の０．５％未満で作製され、そして代表的には、細胞あたり１４コ
ピー未満で平均化されている、何千もの別の種からなることが推測される。Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、１９８９）。このような低量のｍＲＮＡ上での発現においてさらなる重要
な変化は、大量の配列の圧倒的な量の存在下において検出することを困難であり
得る。

【０００４】 種々の技術は、広範に異なる遺伝子発現を分析するために利用可能であり、こ
れらの技術は、簡便さ、費用、および感度において広範に異なる。一般的に使用
される低分解能技術は、差次的な表示、指数化、サブトラクションハイブリダイ
ゼーション、および多数のＤＮＡフィンガープリント技術（例えば、Ｖｏｓら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：４４０７〜４４１４（
１９９５）；Ｈｕｂａｎｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
、２２：５６４０〜５６４８（１９９４）；Ｌｉｎｇｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
５７：９６７〜９７１（１９９２）；Ｅｒｌａｎｄｅｒら、国際特許出願 ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９４／１３０４１；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、米国特許第５,４３７,９
７５号；Ｕｎｒａｕら、Ｇｅｎｅ、１４５：１６３〜１６９（１９９４）など）
を含む。高分解能技術は、発現された配列タグ（ＥＳＴ）の分析（例えば、Ａｄ
ａｍｓら、（上記に言及される）；Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｃａｔｅｎ
ａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ （ＳＡＧＥ）、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０
：４８４〜４８６（１９９５）；Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：１２
６８〜１２７２（１９９７）；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ、８８：２４
３〜２５１（１９９７））；および発現された遺伝子から相補的なポリヌクレオ
チドを捕獲するためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの微小アレイ
（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）の使用（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２７０：４６７〜４６９（１９９５）；ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７
８：６８０〜６８６（１９９７）；Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：６１
０〜６１４（１９９６）など）を含む。

【０００５】 後者の２つの高分解能技術は、遺伝子発現を分析するための潜在的な確固とし
たシステムとして見込みがある；しかし、両方のアプローチで注意が向けられる
必要がある技術的問題がまだ存在する。微小アレイ系において、モニターされる
遺伝子は、公知であり、そしてあらかじめ単離されていなければならず、これは
、異なる微小アレイ、または「ＤＮＡチップ」が各々の特殊化された使用のため
、および試験されるあらゆる異なる型の生物または種のために作製されなければ
ならないことを意味する。流動で送達されたｃＤＮＡから構築された微小アレイ
に関しては、有意な可変性の程度（例えば、２〜５倍）は、同じハイブリダイゼ
ーション条件下で生成されるシグナルにおいて存在し（Ａｔｌａｓ^TM ｃＤＮＡ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、１９９８）、そし
てこの系は、容易に再使用可能ではない。合成オリゴヌクレオチドの微小アレイ
に関しては、このようなアレイを作製するための著しい設定費用および高価なチ
ップ読み出し機器は、このようなシステムが多くの潜在的な使用者の財力を越え
ていると推定される。配列タグ系において、特別な機器は必要ないが、高価なＤ
ＮＡシークエンサーの設置ベースが、使用され得、さらに慣用的な発現分析は、
有意な配列決定試行（例えば、数千の配列決定反応またはそれ以上）を必要とし
；ＩＩ型タグ生成酵素の選択が限定され；そして現在のプロトコルにおいて配列
タグの長さ（９つのヌクレオチド）が独特に標識され得るｃＤＮＡの数を厳密に
限定する。大きなセットの遺伝子を発現する生物（例えば、哺乳動物細胞）につ
いて、全発現遺伝子について異なる９つのヌクレオチドタグの可能性が極度に低
いことが、示され得る（例えば、Ｆｅｌｌｅｒ、Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｔｏ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、第Ｉ巻（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）。

【０００６】 任意の供給源由来の既知の遺伝子かまたは未知の遺伝子のいずれかの分析を可
能にする遺伝子発現を分析するための簡便かつ高感度な技術についての必要性が
あることが、上記から明白である。このような技術の利用可能性は、医薬および
科学的研究だけでなく、多数の適用分野（例えば、農作物および家畜の開発、害
虫の管理、薬物の開発、診断薬、疾患管理など）においてもまた、直接の適用が
見出される。

【０００７】 （発明の要旨） 従って、本発明者の発明の目的は、差示的に発現される遺伝子を同定および単
離するための方法を提供すること；異なる光学的シグナルを生成する標識に基づ
いてポリヌクレオチドを同定および単離する方法を提供すること；多くの遺伝子
の遺伝子発現を同時にプロフィールするための方法を提供すること；遺伝子発現
が、任意の所定の条件下で増加するかまたは減少するか否かに従って、その遺伝
子を同定および分離する方法を提供すること；希少遺伝子を同定するための方法
を提供すること；ならびに遺伝子発現によって単離された多くの遺伝子を、大量
に並行サイン（ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列決定する方法を提
供することを含むが、これらに限定されない。

【０００８】 本発明は、遺伝子発現を比較されるべき細胞供給源または組織供給源由来のポ
リヌクレオチドの、差示的に標識された集団を提供することにより、これらの目
的そして他の目的を達成する。遺伝子発現の比較において、複数の集団の差示的
に標識されたポリヌクレオチドは、固相支持体上にクローニングされたの参照Ｄ
ＮＡに、競合的にハイブリダイズする。好ましくは、その固相支持体は、微小粒
子であり、それは、その競合的ハイブリダイゼーション後に、蛍光活性化細胞分
類（ＦＡＣＳ）、またはその微小粒子上の標識ポリヌクレオチドにより生成され
る光学的シグナルに応答性のある他の分類方法により操作され得る、差示的発現
のライブラリーを提供する。微小粒子上の差示的標識の相対的シグナル強度をモ
ニターすることにより、差示的な集団における特定の遺伝子の相対的な発現の定
量化が可能となる。

【０００９】 本発明の１つの局面において、目的の相対的シグナル強度を有する微小粒子の
集団を、ＦＡＣＳにより単離し、そして付着したポリヌクレオチドを配列決定し
て、希少遺伝子または差示的に発現される遺伝子の同定を決定する。

【００１０】 好ましくは、本発明の方法を、以下の工程により実行する：ａ）クローンの亜
集団における別々の固相支持体に付着される核酸配列の参照集団を提供する工程
；ｂ）各々の複数の異なる細胞または組織からの発現される遺伝子のポリヌクレ
オチドの集団を提供する工程で、その異なる細胞または組織からの発現される遺
伝子のポリヌクレオチドは、異なる光生成標識を有する、工程；ｃ）各々の複数
の異なる細胞または組織からの発現される遺伝子のポリヌクレオチドの集団に、
その参照集団を競合的にハイブリダイズし、参照集団の配列と各々の異なる細胞
または組織からのポリヌクレオチドとの間で二重鎖を形成する工程で、すなわち
、そのポリヌクレオチドは、その各々の固相支持体上に、その異なる細胞または
組織におけるそのポリヌクレオチドに対応する遺伝子の相対的な発現に直接的に
関係する比で、二重鎖で存在する、工程。およびｄ）そこに付着される二重鎖の
光生成標識により生成される、相対的な光学的シグナル検出する工程。さらに好
ましくは、その方法は、検出されたその相対的な光学的シグナルに従って、それ
ぞれの固相支持体を分類する工程を含む。好ましくは、核酸の参照集団は、分析
される複数の異なる細胞または組織の遺伝子に由来する。本明細書で使用される
、語句「発現された遺伝子のポリヌクレオチド」は、転写により産生される任意
のＲＮＡ（特にｍＲＮＡを含む）、および任意のＲＮＡの逆転写により産生され
るＤＮＡ（特にｍＲＮＡの逆転写により産生されるｃＤＮＡを含む）を含むこと
が意味される。

【００１１】 本発明は、差示的に発現される遺伝子を、その配列のいずれの以前の分析また
は知識も必要とせずに、分離および同定するための組成物、方法、およびキット
を提供することにより、当該分野における欠点を克服する。本発明はまた、差示
的に調節される遺伝子を、分析用の調節されない遺伝子から分離することを可能
にし、それにより目的の遺伝子についての情報を得るための大多数の調節されな
い遺伝子の分析の必要性を排除する。

【００１２】 （定義） オリゴヌクレオチドタグに関連して、本明細書で使用される「相補体」または
「タグ相補体」とは、オリゴヌクレオチドタグが特異的にハイブリダイズして、
完全に適合される二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特
異的ハイブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施態様において、そのオリゴヌ
クレオチドタグは、二本鎖または一本鎖のいずれであるよう選択され得る。従っ
て、三重鎖が形成される場合、用語「相補体」は、一本鎖オリゴヌクレオチドタ
グの二本鎖相補体か、二本鎖オリゴヌクレオチドタグの一本鎖相補体のいずれか
を含むことを意味される。

【００１３】 本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、天然または改変された
モノマーあるいは連鎖の直鎖状オリゴマーを含み、それらは、モノマー−モノマ
ー相互作用（例えば、ワトソン−クリック型塩基対形成、塩基スタッキング、フ
ーグスティーンまたは逆フーグスティーン型塩基対形成など）の規則的なパター
ンにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、デオキシリボヌクレオシ
ド、リボヌクレオシド、それらのアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを
含む。通常モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結さ
れ、少数（例えば、３〜４）のモノマー単位から、何十（例えば、４０〜６０）
のモノマー単位の大きさに渡るオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオ
チドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字配列により表示される場合はいつも、
そのヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順序であり、そして他に表示がない
場合、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジン、「Ｇ」
はデオキシグアノシン、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが、理解される。通
常、本発明のオリゴヌクレオチドは、４つの天然のヌクレオチドを含むが；しか
し、それらはまた非天然のヌクレオチドアナログを含む。天然または非天然のヌ
クレオチドを有するオリゴヌクレオチドが使用され得る場合（例えば、酵素によ
るプロセッシングが必要な場合）、通常天然ヌクレオチドからなるオリゴヌクレ
オチドが必要とされることは、当業者に明らかである。

【００１４】 二重鎖に関連して「完全に適合される」とは、二重鎖を構成するポリ−または
オリゴヌクレオチド鎖が、他のそれらと、各鎖の全てのヌクレオチドが、もう一
方の鎖におけるヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対形成を起こすように、
二重鎖構造を形成することを意味する。その用語はまた、使用され得るヌクレオ
シドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌク
レオシドなど）の対形成も含む。三重鎖に関して、その用語は、三重鎖が、完全
に適合される二重鎖および全てのヌクレオチドが完全に適合される二重鎖の塩基
対とフーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合を起こす第三の鎖からなる
ことを意味する。逆に、タグとオリゴヌクレオチドとの間の二重鎖における「不
適合」とは、二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチド対または三重体が、ワト
ソン−クリックおよび／またはフーグスティーンおよび／または逆フーグスティ
ーン結合を起こさないことを意味する。

【００１５】 本明細書で使用される、「ヌクレオシド」は、２’−デオキシ形態および２’
−ヒドロキシ形態（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，
１９９２）に記載されるような）を含む、天然ヌクレオシドを含む。ヌクレオシ
ドに関連して「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変された糖
部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｕ
ｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５
４３−５８４（１９９０）などに記載される）を含み、それらは、特異的なハイ
ブリダイゼーションが可能である条件のみを含む。そのようなアナログは、結合
特性を増強する、複雑性を減少する、特異性を増加するなどのために設計される
合成ヌクレオシドを含む。

【００１６】 ポリヌクレオチドに関連して本明細書で使用される「配列決定」または「ヌク
レオチド配列を決定すること」は、そのポリヌクレオチドの部分的配列ならびに
全長配列の情報の決定を含む。つまり、その用語は、配列比較、フィンガープリ
ンティング、および類似の標的ポリヌクレオチドについての情報のレベル化、な
らびに標的ヌクレオチドにおけるヌクレオシド（通常各ヌクレオチド）の発現同
定および順序付けを含む。その用語はまた、標的ポリヌクレオチド内の４つの型
のヌクレオチドのうち１、２、または３つの同定、順序付け、および位置の決定
を含む。例えば、いくつかの実施態様において、配列決定は、標的ヌクレオチド
「ＣＡＴＣＧＣ」内の単一型のヌクレオチド（例えば、シトシン）の順序および
位置の同定によりもたらされ得、それによって、その配列は、２進法のコード（
例えば、「Ｃ−（非Ｃ）−（非Ｃ）−Ｃ−（非Ｃ）−Ｃ．．．」に対して「１０
０１０１．．．」など）のように表される。

【００１７】 本明細書に使用される、ヌクレオチドの集団に関する用語「複雑性」は、その
集団に存在する異なる種のポリヌクレオチドの数を意味する。

【００１８】 本明細書に使用される、遺伝子に関する用語「相対的な遺伝子発現」または「
相対的発現」とは、異なる細胞型または組織型の同じ遺伝子発現産物（通常、ｍ
ＲＮＡ）の相対的な存在度をいう。

【００１９】 （発明の詳細な説明） 本発明は、目的の単一のまたは複数の細胞型および／または組織型における相
対的な遺伝子発現の分析のための組成物、方法、およびキットを提供する。本発
明の方法は、動物、植物、および真菌、細菌、マイコプラズマ、シアノバクテリ
ア、藻類などのような微生物由来のポリヌクレオチドに適用され得る。好ましく
は、ポリヌクレオチドは、動物、植物、または発酵プロセスに関連する微生物に
由来し、最も好ましくは、脊椎動物および農業植物由来である。複数とは、通常
、疾患の組織型または細胞型および健常な組織型または細胞型のような、または
刺激またはストレス（例えば、栄養素、温度などの変化）に供される細胞型なら
びに組織型および非ストレスまたは非刺激状態下に対応する細胞型または組織型
のような、細胞型または組織型の対を含む。別の実施態様において、複数とは、
異なる生物体由来の細胞および組織のような、相同遺伝子を有する細胞型または
組織型の対を含み得る。複数とはまた、同じ細胞または組織（例えば、候補薬物
に生物体を曝露した後の肝臓細胞、異なる発生状態での試験動物の器官細胞など
）の経時的な発現パターンの比較に必要とされるような、２つ以上の細胞型また
は組織型を含み得る。好ましくは、複数とは、２または３つの細胞型または組織
型；そしてより好ましくは、２つの細胞型または組織型である。

【００２０】 本発明の方法は、代表的にクローンの亜集団における別々の固相支持体に付着
する核酸配列の参照集団を提供する工程、発現される遺伝子のポリヌクレオチド
の少なくとも１つの集団を提供する工程、発現される遺伝子のポリヌクレオチド
の集団に参照核酸集団をハイブリダイズする工程、および固相支持体に付着され
る二重鎖により生成される相対的な光学的シグナルに従って、それぞれの固相支
持体を検出する、そして好ましくは分類する工程を含む。

【００２１】 図１０Ａは、微小粒子上の参照核酸集団を構築するための発明の実施態様を図
示し、そして図１０Ｂは、そのような参照ライブラリーを使用して、２つの細胞
集団の遺伝子発現を比較するための実施態様を図示する。メッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）を、細胞集団（１０００）および（１００２）から、従来のプロト
コールを使用して抽出し（１００４）、それぞれ、ポリヌクレオチド（１００６
）および（１００８）の２つの集団を与える。この抽出反応は、別々に実行され
得るか、または細胞型の混合物に対して実行され得る。好ましくは、その反応は
、別々に実行され、そのため２つの集団由来のｍＲＮＡの相対的な量をより容易
に制御し得る。ｍＲＮＡ（１００６）およびｍＲＮＡ（１００８）の部分が、結
合され（１０１０）、そしてｃＤＮＡライブラリー（１０１２）は、Ｂｒｅｎｎ
ｅｒら、米国特許第５，８４６，７１９号に記載される手順に従って、オリゴヌ
クレオチドタグのレパートリーを保持するベクター内に構築される。好ましくは
、ｍＲＮＡの同量の部分（すなわち等モル量）が、ｍＲＮＡの各集団から取得さ
れる。ライブラリー（１０１２）由来のベクターのサンプルを取得し、そして例
えば、ポリメラーゼ連鎖反応、トランスフェクションおよびクローニングなどに
より増幅し、その後、ベクターに保持されるタグｃＤＮＡ結合体（１０１４）を
切り出すか、またはコピーして（１０１１）、次いで単離する。次いでロードさ
れた微小粒子を形成し、そして以下のような競合的ハイブリダイゼーションでの
使用のために調整した（１０１８）。オリゴヌクレオチドタグａ、ｂ、ｃ、およ
びｄで示される、単離されたタグｃＤＮＡ結合体（１０１４）を、それぞれこれ
らのタグ相補体ａ’、ｂ’、ｃ’、およびｄ’（１０１６）を保持する微小粒子
に特異的にハイブリダイズさせる。タグｃＤＮＡ結合体を、タグ相補体に連結し
、この結果二本鎖タグｃＤＮＡ結合体の少なくとも一本鎖は、微小粒子に共有結
合的に付着される。タグｃＤＮＡ結合体を保持する微小粒子を、タグｃＤＮＡ結
合体を保持しない微小粒子から、好ましくは、蛍光活性化細胞分類装置（ＦＡＣ
Ｓ）、または類似の装置を使用して分離する。非共有結合的に付着された鎖を、
融解除去し、微小粒子から分離して参照核酸集団を保持する微小粒子（１０２０
）を作製する。

【００２２】 図１０ｂに図示されるように、細胞の遺伝子発現（１０５０）を、各細胞型由
来のｍＲＮＡ（１０５６）および（１０５８）を別々に抽出する（１０５４）こ
とにより、細胞（１０５２）の遺伝子発現と、比較し得る。従来のプロトコール
を使用した、ｃＤＮＡライブラリー（１０６２）および（１０６４）の構築後、
一本鎖核酸プローブを、それぞれのｃＤＮＡ集団（１０６２）および（１０６４
）から生成し、好ましくは、そのプローブを、光学的に識別可能な蛍光色素Ｆ（
１０６８）およびＲ（１０６６）（例えば、ローダミンおよびフルオレッセイン
）で標識する。等量の標識ポリヌクレオチドを混合し、そして微小粒子に保持さ
れる相補鎖にハイブリダイズ（１０７２）させて、二重鎖（１０７４）を形成さ
せる。ハイブリダイゼーションが完了後、それによって形成される二重鎖を保持
する微小粒子（１０７４）は、所定の基準（例えば、蛍光比、蛍光強度、および
／またはその類似のもの）により分類され得る（１０７６）。そのような方法で
、目的の亜集団が、単離され得、さらに分析され得る（例えば、そのアップレギ
ュレートされた遺伝子またはダウンレギュレートされた遺伝子に対応する亜集団
）。

【００２３】 本発明に従う分析のために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、従来のプ
ロトコール（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されるよ
うな）を使用して、目的の細胞または組織から抽出する。好ましくは、比較され
るべきｍＲＮＡの集団を、参照ＤＮＡ集団へのハイブリダイゼーションに先立っ
て、従来のプロトコール（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：
４６７−４７０（１９９５）；ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：６８
０−６８６（１９９７）；または類似のもの）を使用して、標識ヌクレオチド三
リン酸の存在下で逆転写により標識ｃＤＮＡの集団に転換する。

【００２４】 本発明の重要な特徴は、発現レベルが変化するか、または試験される他の細胞
または組織の遺伝子の発現レベルと異なる遺伝子が、調節されない遺伝子か、ま
たは研究されるいかなるストレスまたは条件に対する応答においても変化される
別の遺伝子から別々に分析され得ることである。以下に記載のように、好ましい
実施態様において、目的の細胞または組織由来の遺伝子産物を、別々の微小粒子
に対するクローンの亜集団に付着されるＤＮＡ配列からなる参照集団で競合的に
ハイブリダイズする。結果として、差示的な発現を示す比で標識遺伝子産物を保
持する微小粒子は、操作され得、そして発現での変化を示さない比の標識遺伝子
産物（例えば、「ハウスキーピング」遺伝子、構造タンパク質をコードする遺伝
子など）を保持する微小粒子とは別々に分析され得る。

【００２５】 本発明の別の重要な特徴は、分析される核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ転写物などのような遺伝子産物）の正体を、分析の前
に知る必要がないことである。相対的な活性を決定した後、発現される遺伝子に
由来するｃＤＮＡを、多くの異なる配列決定アプローチを使用して、固相支持体
（好ましくは、微小粒子）上で直接的に配列決定することにより同定し得る。同
定のために、ｃＤＮＡの一部のみが配列決定される必要がある。多くの場合、そ
の部分は、９または１０個のヌクレオチドと同じくらい小さくあり得る（例えば
、Ｖｅｌｃｕｅｓｃｕら（上記に引用））。好ましくは、差示的に発現される遺
伝子の全体の亜集団を、ＭＰＳＳ、または同様の並行分析技術を使用して同時に
配列決定する。好ましい実施態様において、これは、各々のＤＮＡ配列がクロー
ンの亜集団における別々の微小粒子に付着されるように、ＤＮＡ配列の参照集団
を提供することにより便利に達成される。本明細書で使用される、語句「クロー
ンの亜集団」とは、目的の集団から選択される単一の種のポリヌクレオチドの複
数のコピーのことをいう（例えば、遺伝子発現が分析される細胞または組織から
抽出されるｍＲＮＡから構築されるｃＤＮＡライブラリー）。そのようなクロー
ンの亜集団は、ポリヌクレオチドの別々の増幅および従来の付着化学（ａｔｔａ
ｃｈｍｅｎｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）による付着を含む、多くの方法で形成
され得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｅｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９６）
）。以下により十分に説明されるように、クローンの亜集団を、好ましくは、Ｂ
ｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６０４，０９７号およびＢｒｅｎｎｅｒら米国特
許第５，８４６，７１９号（本明細書に参考として援用される）に開示される、
いわゆる「固相クローニング」により形成する。要するに、そのようなクローン
の亜集団を、タグＤＮＡ結合体の増幅されたサンプルを、１以上の固相支持体（
例えば、別々の、かつ連結しない微小粒子）上にハイブリダイズすることによっ
て形成し、それにより、個々の微小粒子または大きい支持体の異なる領域は、同
じＤＮＡの複数の付着されたコピーを有する。

【００２６】 タグＤＮＡ結合体のＤＮＡ成分は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡのフラグメント、あるいは合成ＤＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチ
ドのような）であり得る。好ましくは、タグＤＮＡ結合体は、ｃＤＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）のフラグメントである。クローンの亜集団における
ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡのコピー数は、いくつかの因子に依存する異なる実施態
様において広範に変化し得、そのいくつかの因子としては、固相支持体上のタグ
相補体の密度、使用される微小粒子の大きさおよび組成物、ハイブリダイゼーシ
ョン反応の継続時間、タグレパートリーの複雑性、個々のタグの濃度、タグＤＮ
Ａサンプルの大きさ、光学的シグナルの生成のための標識方法、粒子分類方法、
シグナル検出系などが挙げられる。

【００２７】 これらの因子に関連する設計選択を作製するガイダンスは、本明細書に引用さ
れる参照に表示されるような、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、分子生物学
、ハイブリダイゼーション技術、および関連する学問分野の文献において、容易
に利用可能である。好ましくは、クローンの亜集団におけるｃＤＮＡまたはｇＤ
ＮＡのコピー数は、微小粒子のＦＡＣＳ検出および／または分類を可能にするの
に十分であり、ここで蛍光シグナルは、微小粒子に付着されるｃＤＮＡにより保
持される１以上の蛍光色素分子により生成される。代表的に、この数は、フルオ
レッセインのような蛍光分子を使用する場合、数千（例えば、３，０００〜５，
０００）ぐらいに低くあり得、ローダミン６Ｇのようなローダミン色素を使用す
る場合、数百（例えば、８００〜８０００）ぐらいに低くあり得る。より好まし
くは、ロードされた微小粒子がはＦＡＣＳまたは類似の装置により、検出され、
および／または分類される場合、クローンの亜集団は、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ
の少なくとも１０⁴コピーのからなり；最も好ましくは、そのような実施態様に おいて、クローンの亜集団は、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡの少なくとも１０⁵コピ ーのからなる。

【００２８】 比較するべき細胞または組織由来の標識ｃＤＮＡまたはＲＮＡを、従来のハイ
ブリダイゼーション条件（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、（上記に引用）；ＤｅＲｉ
ｓｉら（上記に引用）；またはＳｈａｌｏｎ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓタイトル
「ＤＮＡマイクロアレイ」Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５
）に開示されるような）を使用して、参照ＤＮＡ集団のＤＮＡ配列に対して競合
的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、光学的シグナルが、ｃＤ
ＮＡまたはＲＮＡのそれぞれ２つの標識種により生成され、それにより、相対的
光学的シグナルが、それぞれの微小粒子について決定される。好ましくは、その
ような光学的シグナルは、蛍光活性細胞分類装置、または類似の装置で生成され
、そして測定される。それら装置は、微小粒子を分類し、そして、どの相対的な
光学的シグナルが、所定の範囲の値に落ちるかを累算し得る。所望の範囲の相対
的な光学的シグナルを生成するｃＤＮＡまたはＲＮＡでロードされた微小粒子は
単離され得、そしてＭＰＳＳ（以下により詳細に記載される）のような、配列決
定により同定され得る。

【００２９】 好ましくは、ＲＮＡ由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ分子のクローン亜集団は
、図３ａおよび図３ｂに例示されるプロセスを使用して微粒子に付着される。初
めに、図３ａに例示されるように、ｍＲＮＡ（３００）は、目的の細胞または組
織供給源から従来の技法を用いて抽出され、そしてベクター（３１６）中への挿
入に適切な末端を有するｃＤＮＡ（３０９）へ変換される。好ましくは、５’ビ
オチン（３０５）およびポリ（ｄＴ）領域（３０６）を有するプライマー（３０
２）は、ｃＤＮＡ（３０９）の第一鎖が、４つのデオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートの存在下において、逆転写酵素で合成されるために、ｍＲＮＡ鎖（
３００）とアニーリングされる。好ましくは、５−メチルデオキシシチジントリ
ホスフェートは、ｃＤＮＡ（３０９）がプライマー（３０２）に対応する領域を
除いて、半メチル化されるために、第一鎖合成におけるデオキシシトシントリホ
スフェートの代わりに用いられる。これは、プライマー（３０２）が支持体から
ｃＤＮＡを解離するために非メチル化制限部位を含むことを可能にする。プライ
マー（３０２）におけるビオチンの使用は、本発明に重大ではなく、そして他の
分子捕捉技法、または部分（例えば、三重鎖捕捉など）が用いられ得る。プライ
マー（３０２）の領域（３０３）は、好ましくは、ｃＤＮＡ（３０９）の第二鎖
の合成で制限部位ｒ₂（３０４）の形成を生じるヌクレオチドの配列を含む。ス トレプトアビジン支持体（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０（Ｄｙｎａ
ｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）など）にビオチン化ｃＤＮＡを結合することによ
って単離した後、ｃＤＮＡ（３０９）は、好ましくは、（Ｃの）半メチル化には
非感受性で、そして部位ｒ₁（３０７）を認識する制限エンドヌクレアーゼで切 断される。好ましくは、ｒ₁は、実質的に全てのｃＤＮＡが切断されること、お よび同一の規定された末端が全てのｃＤＮＡにおいて生成されることを保証する
４塩基認識部位（例えば、ＤｐｎＩＩなどのような酵素に相当する）である。洗
浄後、次いで、このｃＤＮＡは、ｒ₂を認識する制限エンドヌクレア−ゼを用い て切断され、例えば、エタノール沈殿、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの
標準的な技法を用いて精製されるフラグメント（３０８）を放出する。適切な緩
衝液中に再懸濁後、フラグメント（３０８）は、タグ（３１０）ならびに末端（
３１２）および末端（３１４）を有するクローニング部位を保有するベクター（
３１６）中へ定方向的にライゲーションされる。好ましくは、ベクター（３１６
）は、クローニング部位において「スタッファー（ｓｕｔａｆｆｅｒ）」フラグ
メントを用いて調製され、クローニングのために完全に切断されたベクターの単
離を援助する。

【００３０】 タグ−ｃＤＮＡ結合体の調製は、上記の方法に限定されないが、従来の分子生
物学的技法を用いる多様な方法で、容易に達成され得る。例えば、ｃＤＮＡは、
従来の方法で調製され得、そしてゲル電気泳動によって単離され得る。この方法
は、ある部分ではあまり好ましくない。なぜならば、参照集団（ｒｅｆｅｒｅｎ
ｃｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の大きさの分布を偏らせるからである。このタグ
は、アダプターのライゲーションによってか、オリゴｄＴプライマーおよびラン
ダムプライマーを用いるＰＣＲによってか、またはＲＡＣＥ技法（Ｂｅｒｔｌｉ
ｎｇら（１９９３）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．３：９５−９９；Ｆｒ
ｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８：
３４０−３５６；Ｍａｒａｔｈｏｎ^TMＣＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって付
着され得る。上記に記載のような、ベクターへのクローニングによるタグの付着
は、（代表的にはほんのμｇ量を生成するにすぎないＲＡＣＥに対して）大量の
参照集団を生成する能力、ならびにタグの配列を確認する能力を含む、いくつか
の理由のために好ましい。

【００３１】 タグ−ｃＤＮＡ結合体のライブラリーの形成の後、宿主細胞のサンプルは、培
養培地の単位容積あたりの組換え体の数を決定するために通常プレートされる。
さらなるプロセシングのために得られたサンプルのサイズは、好ましくは、ライ
ブラリー構築物において使用されるタグレパートリーのサイズに依存する。Ｂｒ
ｅｎｎｅｒら、米国特許第５，８４６，７１９号およびＢｒｅｎｎｅｒら、米国
特許第５，６０４，０９７号に教示されるように、サンプルは、好ましくは、「
ダブルス（ｄｏｕｂｌｅｓ）」（すなわち、同一のタグおよび異なるｃＤＮＡを
保有する二つ以上の結合体）の選択を最小化するためにタグレパートリーのサイ
ズの約１％に等しい多くの結合体を含む。したがって、８つの語の最小クロスハ
イブリッド形成セットから選択された８つの４−ヌクレオチド「語」の連鎖から
なるタグレパートリーのために、サイズのレパートリーは、８⁸、または約１． ７×１０⁷タグである。したがって、このようなレパートリーとともに、約１． ７×１０⁵結合体含有ベクターのサンプルは、好ましくは、図３ｂに例示される ような増幅およびさらなるプロセシングのために選択される。

【００３２】 好ましくは、タグ−ｃＤＮＡ結合体は、以下の配列の要素を含むベクター（３
３０）中に保有される：第１のプライマー結合部位（３３２）、制限部位ｒ₃（ ３３４）、オリゴヌクレオチドタグ（３３６）、接合部（３３８）、ｃＤＮＡ （３４０）、制限部位ｒ₄（３４２）、および第２のプライマー結合部位（３４ ４）。タグ−ｃＤＮＡ結合体を含有するベクターのサンプルが得られた後、以下
の工程が実施される：タグ−ｃＤＮＡ結合体が、好ましくは、５−メチルデオキ
シシチジントリホスフェイトの存在下において、ビオチニル化プライマー（３４
８）および標識化プライマー（３４６）を用いることによって、従来のポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でベクター（３３０）から増幅される工程、その後、生
じたアンプリコンが、ストレプトアビジン捕捉によって単離される工程。制限部
位ｒ₃は、好ましくは、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＦｅｓＩ、ＰｍｅＩ、ＳｗａＩな ど、まれな切断をする（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）制限エンドヌクレアーゼに
対応し、これらは捕捉されたアンプリコンを、アンプリコンのｃＤＮＡ内の部位
で生じる切断が最小限の確率で、支持体から遊離されることを可能にする。適切
なＤＮＡポリメラーゼがｄＧＴＰとともに用いられる場合、以下の配列として例
示されるジャンクション（３３８）は、ＤＮＡポリメラーゼ「ストリッピング」
反応を生じ、Ｇトリプレットで停止される。

【００３３】 ５’・・・ＧＧＧＣＣＣ・・・ ３’・・・ＣＣＣＧＧＧ・・・ 簡潔に言えば、「ストリッピング」反応において、ＤＮＡポリメラーゼの３’→
５’エキソヌクレア−ゼ活性（好ましくは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）は、Ｂ
ｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６０４，０９７；およびＫｕｉｊｐｅｒら、Ｇｅ
ｎｅ、１１２：１４７−１５５（１９９２）によって教示されるように、一本鎖
のタグ−ｃＤＮＡ結合体のタグを与えるために用いられる。分類がタグとタグ相
補体との間の二重鎖の形成によって達成される好ましい実施態様において、タグ
−ｃＤＮＡ結合体のタグは、第一に４つの天然のヌクレオチドのうち３つのみを
含む語を選択することにによって、次いで、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エ
キソヌクレア−ゼ活性を有する３’→５’方向においてタグ−ｃＤＮＡ結合体由
来の３つのヌクレオチド型を優先的に消化することによって一本鎖にされる。好
ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドタグは、Ａ、Ｇ、およびＴのみを
含むように設計される；したがって、（二重鎖タグ−ｃＤＮＡ結合体を含む）タ
グ相補体は、Ａ、Ｇ、およびＴのみからなる。遊離したタグ−ｃＤＮＡ結合体が
、ｄＧＴＰの存在下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと処理される場合、タグの相補
鎖は、第一のＧで「ストリッピング」される。この点において、ＤＮＡポリメラ
ーゼによるｄＧの取り込みは、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を
平衡化し、「ストリッピング」反応を効果的に停止する。上記の記載から、当業
者が、同様の目的を行う（すなわち、タグを一本鎖にする）ために、多くの代替
的設計の選択をし得ることは明らかである。このような選択は、異なる酵素、タ
グを作りあげる語の異なる組み合わせなどの選択を含み得る。

【００３４】 「ストリッピング」反応がクエンチされる場合、結果は、一本鎖タグ（３５７
）を有する二重鎖（３５６）である。単離後、工程（３５８）が、実施される：
タグ−ｃＤＮＡ結合体が、微粒子に付着したタグ相補体へハイブリダイズされ、
充填（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応が、タグ−ｃＤＮＡ結合体の相補鎖と微粒子（３６
０）に付着したタグ相補体（３６２）の５’末端との間の任意のギャップを埋め
るために行われ、そしてタグ−ｃＤＮＡ結合体の相補鎖は、リガーゼで処理する
ことによってタグ相補体（３６２）の５’末端（３６３）と共有的に結合される
。この実施態様は、もちろん、（例えば、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼなど
のようなキナーゼによって）タグ相補体の５’末端がリン酸化されることを必要
とする。「ストリッピング」反応が、常には最初のＧで停止しないので、充填反
応が好ましくは実行される。好ましくは、充填反応は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼのような、５’→３’エキソヌクレア−ゼ活性および鎖置換活性を欠失したＤ
ＮＡポリメラーゼを用いる。また好ましくは、Ｇトリプレットを超えて伸長され
る「ストリッピング」に備えて、４つ全てのｄＮＴＰは、充填反応に用いられる
。

【００３５】 以下にさらに説明されるように、タグ−ｃＤＮＡ結合体は、タグ相補体の全て
のレパートリーとハイブリダイズされる。つまり、微粒子の集団の中に、レパー
トリー全体のあらゆるタグ配列を有する微粒子が存在する。従って、タグ−ｃＤ
ＮＡ結合体は、およそ約１％の微粒子上のみのタグ相補体とハイブリダイズする
。タグ−ｃＤＮＡがハイブリダイズされた微粒子は、本明細書中で「ロードされ
た微粒子」といわれる。より大きい有効性のために、ロードされた微粒子は、好
ましくは、さらなるプロセシングのためにロードされていない微粒子から分離さ
れる。このような分離は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）か、または多数
の個々の微粒子の迅速な操作および分類を可能にする同様の機器の使用によって
容易に達成される。図３ｂに例示される実施態様において、蛍光標識物（例えば
、ＦＡＭ（フルオレセイン誘導体、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ，第６版、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，
ＯＲ，１９９６）））が、プライマー（３４６）を経由して付着される。

【００３６】 このタグ−ｃＤＮＡは、上記で議論された多くの工程を省略するか、または改
変する手順によって微粒子上のタグ相補体へ付着され得る。例えば、ベクター（
３３０）からタグ−ｃＤＮＡを増幅するかわりに、タグ−ｃＤＮＡは、微粒子上
のタグ相補体への直接的な、制限消化、ストリッピング化、およびライゲーショ
ン化によって、ベクターから切断され得る。この手順は、（１）タグ−ｃＤＮＡ
をビオチンおよびＦＡＭで標識する工程、（２）タグ−ｃＤＮＡを増幅する工程
、および（３）ストレプトアビジン捕捉によってアンプリコンを単離する工程、
を省略する。所望される場合、ロードされた微粒子は、ＦＡＭ標識化プライマー
とハイブリダイズすることによって単離され得る。

【００３７】 図３ｃに示すように、ＦＡＣＳ、または類似の分類（３８０）後、ロードされ
た微粒子（３６０）は、単離され、標識（３４５）を除去するために処理され、
そして非共有的に付着した鎖をメルトオフ（ｍｅｌｔ ｏｆｆ）するために処理
される。標識（３４５）は、競合的にハイブリダイズされた鎖の標識と干渉しな
いように、除去されるか、または非活性化される。好ましくは、タグｃＤＮＡ結
合体は、プライマー結合部位（３４４）に隣接するタグ−ｃＤＮＡ結合体を切断
する制限エンドヌクレア−ゼ認識部位ｒ₁（３４２）で処理され、それによって 「ボトム」鎖（すなわち、微粒子にその５’遠位端を有する鎖）によって保有さ
れる標識（３４５）を除去する。 好ましくは、この切断は、突出した鎖（３８５）を有する二重鎖タグ−ｃＤＮＡ
結合体（３８４）を有する微粒子（３６０）を生じる。次いで、３’−標識化ア
ダプター（３８６）は、アニーリングされ、そして突出した鎖（３８５）にライ
ゲーションされる。この後、ロードされた微粒子は、３’−標識によって再分類
され、そして３’−標識を有する鎖はメルトオフされ、差示的に発現される遺伝
子由来の変性ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを受容できるｃＤＮＡ（３９２）の共有的
に付着した一本鎖を解離する。好ましくは、この３’−標識化鎖は、水酸化ナト
リウム処理で、または同様の試薬を用いる処理でメルトオフされる。

【００３８】 ｇＤＮＡのクローン亜集団は、類似の様式で微粒子に付着され得る。第一に、
ゲノムＤＮＡは、目的の細胞または組織供給源から従来の技法を用いて単離され
、そして好ましくは、４塩基認識で認識で切断する少なくとも１つの制限エンド
ヌクレア−ゼ（例えば、ＤｐｎＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＡｃｉＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｆ
ａＩ、ＢｓｔＵＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、Ｍｂ
ｏＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、ＴａｑαＩ、Ｔｓｐ５０
９Ｉなどのような）で切断される。好ましくは、この切断フラグメントは、少な
くとも１つの塩基のオーバーハングを有する。あるいは、ゲノムＤＮＡフラグメ
ントは、単離されたゲノムＤＮＡを剪断するか、または超音波処理するかによっ
て調製され得る。次いで、タグは、タグ配列を含むプライマーを用いるランダム
プライマーＰＣＲ、またはｃＤＮＡ参照集団に関する上記の記載に類似した様式
でのタグを含むベクター中へのクローニングを含む、多くの方法でｇＤＮＡと連
結され得る。ＦＡＭのような標識は、微粒子のローディングをモニターするため
に付着され得る。いくつかの例において、微粒子上への指向性の付着は、例えば
、ＴＡＴＡボックス、または共通配列に相補的な配列のような共通配列を有する
プライマーと共にｇＤＮＡを増幅することによって達成され得る。遺伝子発現を
評価するためにｇＤＮＡ参照集団を用いる場合、ｇＤＮＡライブラリーにおいて
非コード配列およびイントロンを減少することが所望され得る。例えば、約６０
×１０⁶個の微粒子の大きなｇＤＮＡライブラリーは、プローブとしてｃＤＮＡ プールを使用して、選択することによって約３０，０００〜４０，０００へ減少
され得る。

【００３９】 （同定および固相クローニングのためのオリゴヌクレオチドタグ） 本発明の重要な特徴は、固相支持体（好ましくは、微粒子）に付着した参照Ｄ
ＮＡ集団を構築するためのオリゴヌクレオチドの最小クロスハイブリッド形成セ
ットのメンバーであるオリゴヌクレオチドタグを使用することである。最小クロ
スハイブリッド形成セットのオリゴヌクレオチドの配列は、同一のセットのあら
ゆる他のメンバーの配列と、少なくとも２つのヌクレオチドだけ異なる。従って
、このようなセットの各々のメンバーは、２つより少ないミスマッチを有する任
意の他のメンバーの相補体と二重鎖（または三重鎖）を形成し得ない。オリゴヌ
クレオチドタグの相補体（本明細書で「タグ相補体」と言う）は、天然のヌクレ
オチドまたは非天然のヌクレオチドアナログを含み得る。オリゴヌクレオチドタ
グが分類（同様に、参照ＤＮＡ集団の構築）に用いられる場合、タグ相補体は、
好ましくは、固相支持体に付着される。オリゴヌクレオチドタグは、それらの対
応するタグ相補体を用いる場合、分子、特に発現した遺伝子に由来するｃＤＮＡ
またはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドの分類、追跡、または標識のためのハ
イブリダイゼーションの特異性を増強する手段を提供する。

【００４０】 オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補体の最小クロスハイブリッド形成セッ
トは、クロスハイブリッド形成が、最小化されると考えられる所望されたセット
の大きさおよび程度（または言い換えれば、特異性が増大したと考えられる程度
）に依存して組み合わせか、または個別にのいずれかで合成され得る。例えば、
Ｂｒｅｎｎｅｒら、米国特許第５，６０４，０９７号に開示されたように構築し
た場合、最小クロスハイブリッド形成セットは、少なくとも４つのヌクレオチド
によりお互いに区別される個々に合成された１０マー配列のセット（このような
セットは、３３２の最大サイズを有する）からなり得る。あるいは、オリゴヌク
レオチドタグの最小クロスハイブリッド形成セットはまた、それ自身が最小クロ
スハイブリッド形成セットから選択されるサブユニットから、組み合わせて組立
てられ得る。例えば、少なくとも３つのヌクレオチドにより相互に区別される最
小クロスハイブリッド形成１２マーのセットは、３つのヌクレオチドによってお
互いに各々区別される、最小クロスハイブリッド形成４マーのセットから選択さ
れる、３つのサブユニットを組み合わせることによって合成され得る。このよう
な実施態様は、、１２マー、９³（すなわち７２９）の最大サイズセットを与え る。

【００４１】 組み合わせて合成される場合、オリゴヌクレオチドタグは、その長さに沿った
個々の位置でランダム化され得る。しかし、好ましくは、オリゴヌクレオチドタ
グは、複数のサブユニットからなり、各サブユニットは３〜９ヌクレオチド長の
オリゴヌクレオチドからなり、ここで各サブユニットは、同一の最小クロスハイ
ブリット形成セットから選択される。このような実施態様において、利用可能な
オリゴヌクレオチドの数は、１タグあたりのサブユニットの数、およびサブユニ
ットの長さに依存する。オリゴヌクレオチドタグはまた、オリゴヌクレオチドの
どちらか一方の末端にさらなるヌクレオチドを有する複数のサブユニットからな
り得る。さらなるヌクレオチドは、ランダムであり得るかおよび／または制限部
位を含み得る。このような構造は、オリゴヌクレオチドの末端にミスマッチを有
する二重鎖または三重鎖の不安定性を保証する。好ましくは、このオリゴヌクレ
オチドは少なくとも一端において、レア切断制限エンドヌクレア−ゼのための認
識部位を含む。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１つの末端
にＡＴリッチ制限部位（例えば、ＰａｃＩ部位）を含む。Ｂｓｐ１２０部位が、
もう一方の末端に好ましい部位である。

【００４２】 １つ以上の固相支持体に付着したオリゴヌクレオチドタグの相補体は、それぞ
れタグを含有するポリヌクレオチドの混合物からポリヌクレオチドを分類するた
めに用いられる。このようなタグ相補体は、ビーズ（好ましくは、微視的な）の
ような固相支持体の表面上か、または単一支持体の合成位置のアレイ上の特定の
位置で、同一な配列の集団、または実質的に同一な配列の集団が特定の領域で生
成するように、合成される。言い換えれば、ビーズの場合は各支持体の表面、ま
たはアレイの場合は各領域の表面が、特定の配列を有するタグ相補体の１つの型
のみの複製によって体化される。このようなビーズまたは領域の集団は、それぞ
れに異なる配列を有するタグ相補体のレパートリーを含む。オリゴヌクレオチド
タグおよびタグ相補体に関して本明細書中で用いられる場合、用語「レパートリ
ー」とは、固相クローニング（分類）または同定のために使用される、異なるオ
リゴヌクレオチドタグまたはタグ相補体の総数を意味する。レパートリーは、個
別に合成されるオリゴヌクレオチドの最小クロスハイブリット形成セットのセッ
トからなり得るか、または最小クロスハイブリット形成オリゴヌクレオチドの同
一のセットからそれぞれ選択されたオリゴヌクレオチドの連結からなり得る。後
者の場合、レパートリーは、好ましくは、組み合わせて合成される。

【００４３】 好ましくは、タグ相補体は、微粒子上に組み合わせて合成され、そのために各
微粒子は、同一のタグ相補体の多くのコピーに付着された。以下の模範的参考に
開示されたコントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌ
ａｓｓ）（ＣＧＰ）、高クロスリンク化ポリスチレン、アクリルコポリマー、セ
ルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどからで
きた微粒子を含む、広範な種々の微粒子支持体が、本発明で用いられ得る：Ｍｅ
ｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第Ａ節，１１−１４７頁、第４４巻（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）；米国特許第４，６７８，８
１４号；同第４，４１３，０７０号；および同第４，０４６，７２０号；および
Ｐｏｎ、第１９章、Ａｇｒａｗａｌ編中、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻、（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗ
ａ，ＮＪ，１９９３）。さらに、微粒子支持体は、市販のヌクレオシド由来ＧＰ
Ｇ、および（例えば、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔ
ｅｒ，Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能な）ポリスチレンビーズ；磁気ビーズ誘導体
；ポリエチレングリコールとグラフト化したポリスチレン（例えば、Ｔｅｎｔａ
ＧｅｌＴＭ，Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ
）；などを含む。微粒子はまた、Ｎｉｌｓｅｎら、米国特許第５，１７５，２７
０号により開示されるようなデンドリメリック（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）構造
からなり得る。一般的に、微粒子のサイズと形は、重大な意味を持たない；しか
し、微粒子は、直径で数（例えば、１〜２）μｍ〜数百（例えば、２００〜１０
００）μｍのサイズ範囲内が好ましい。なぜならばこれらは、最小限の試薬およ
びサンプルの使用法でオリゴヌクレオチドタグの大きなレパートリーの構築およ
び操作を容易にするからである。好ましくは、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ）から入手可能なグリシダルメタクリレート（ｇｌ
ｙｃｉｄａｌ ｍｅｔａｃｒｙｌａｔｅ）（ＧＭＡ）ビーズは、本発明における
微粒子として用いられる。このような微粒子は、種々のサイズにおいて有用であ
り、そしてタグおよび／またはタグ相補体を合成するための種々の関連群ととも
に入手可能である。より好ましくは、直径５μｍのＧＭＡビーズが使用される。

【００４４】 好ましい実施態様において、分類されるか、または固相支持体上にクローン化
されるべきポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドが異なるタグを有する
ように付着されたオリゴヌクレオチドタグをそれぞれ有する。この状態は、ポリ
ヌクレオチドの集団より実質的に多いタグのレパートリーを使用することによっ
て、およびタグ化ポリヌクレオチドの全集団からタグ化ポリヌクレオチドの十分
に小さいサンプルを得ることによって達成される。このようなサンプリングの後
、支持体およびポリヌクレオチドの集団が、オリゴヌクレオチドタグとそれらの
それぞれの相補体との特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合
される場合、同一のポリヌクレオチドは、特定のビーズまたは領域上で分類する
。もちろん、サンプリングされたタグ−ポリヌクレオチド結合体は、好ましくは
、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、プラスミド中へのクローニング、ＲＮＡ転
写など、によって）増幅され、次の分析のために十分な材料を提供する。

【００４５】 オリゴヌクレオチドタグは、本発明の特定の実施態様における２つの異なる目
的のために使用される：オリゴヌクレオチドタグは、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許
第５，６０４，０９７号；および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９５１３に
記載されたような固相クローニングを実施するために使用される、ここで多数（
例えば、数千から数十万）のポリヌクレオチドは、分析のために混合物から１つ
以上の固相支持体上の同一のポリヌクレオチドのクローン亜集団へ分類され、そ
してそれらは、例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／
０９４７２に開示されるような、数十から数千の数の範囲に達するアダプターを
コードするようなポリヌクレオチドを同定するための標識を送達する（または許
容する）ために使用される。前者の使用に関して、代表的には、多数、またはレ
パートリーのタグが必要とされ、そのために個々のオリゴヌクレオチドタグの合
成は困難である。これらの実施態様において、このタグの組み合わせの合成が好
ましい。他方、例えば、２から数十の範囲における複数の種類または亜集団の（
例えば、アダプターをコードした）ポリヌクレオチドに対する標識を送達するた
めに極端に多くのレパートリーのタグが、必要とされない場合、最小クロスハイ
ブリダイズ形成セットのオリゴヌクレオチドタグは、個別に合成、および組み合
わせで合成され得る。

【００４６】 数百から数千（またはさらに数万）のオリゴヌクレオチドを含むセットは、例
えば、Ｆｒａｎｋら米国特許第４，６８９，４０５号；Ｆｒａｎｋら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：４３６５−４３７７（１９８３
）；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４：１１０−１１６（
１９９５）；Ｆｏｄｏｒら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４１４５；Ｐｅ
ａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：５０２２−５０２
６（１９９４）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５
：２１７−２２７（１９９４）、Ｂｒｅｎｎａｎ、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９
４／０５８９６；Ｌａｓｈｋａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．，９２：７９１２−７９１５（１９９５）；などに開示されるような種々の並
行合成のアプローチによって直接合成され得る。

【００４７】 好ましくは、混合物におけるタグ相補体は（組み合わせで合成されていようと
、個別に合成されていようと）、お互いに類似した二重鎖または三重鎖安定性を
有するように選択される。従って完全にマッチしたハイブリットは、類似したま
たは実質的に一致した融点温度を有する。これは、ミスマッチタグ相補鎖が、ハ
イブリダイゼーション工程において（例えば、ストリンジェントな条件下の洗浄
によって）完全にマッチしたタグ相補鎖からもっと容易に識別されることを可能
にする。組み合わせで合成されたタグ相補体のために、最小クロスハイブリダイ
ズ形成セットは、このセットにおける全ての他のサブユニットのように二重鎖安
定性へほぼ同等に寄与するサブユニットから構築され得る。このような選択を実
行するための手引きは、最適なＰＣＲプライマーの選択および二重鎖安定性の算
出に関する公開された技法によって提供される（例えば、Ｒｙｃｈｌｉｋら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：８５４３−８５５１（１
９８９）および１８：６４０９−６４１２（１９９０）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：３７４６−３７５０（１９
８６）；Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．，２６：２２７−２５９（１９９１）；など）。オリゴヌクレオチドの最小ク
ロスハイブリダイズ形成セットは、ＧＣ含有量、ミスマッチの分布、理論的融点
温度などのようなさらなる基準によってスクリーニングされ得、最小クロスハイ
ブリット形成セットでもあるサブセットを形成する。

【００４８】 本発明のオリゴヌクレオチドタグおよびそれらの相補体は、自動ＤＮＡ合成機
（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成機）で、ホスホロアミダイト化学（例えば、以下の参考に開示される：Ｂｅａ
ｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３−２３１
１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら、米国特許第４，９８０，４６０号、Ｋｏｓｔｅ
ｒら、米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４
，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７
９号；など）のような標準的な化学を用いて、容易に合成される。

【００４９】 分類のためのオリゴヌクレオチドタグは、１２から６０ヌクレオチドまたは塩
基対の長さの範囲であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、１８か
ら４０ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲であり得る。より好ましくは、オ
リゴヌクレオチドタグは、２５から４０ヌクレオチドまたは塩基対の長さの範囲
であり得る。サブユニットの好ましいおよびより好ましい数に関して、それらの
範囲は、以下に表され得る：

【００５０】

【表１２】 最も好ましくは、分類のためのオリゴヌクレオチドタグは、一本鎖であり、ワト
ソン−クリック対合を介してタグ相補体と特異的にハイブリダイゼーションを生
じる。

【００５１】 好ましくは、選別するための一本鎖オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは
、少なくとも１００のメンバーを含み；より好ましくは、このようなタグのレパ
ートリーは、少なくとも１０００のメンバーを含み；そして最も好ましくは、こ
のようなタグのレパートリーは、少なくとも１０，０００のメンバーを含む。

【００５２】 好ましくは、標識を送達するための一本鎖タグ相補物の長さは、８と２０との
間である。より好ましくは、この長さは、９と１５との間である。

【００５３】 特異的なハイブリダイゼーションが三重鎖形成を介して生じる実施態様におい
て、タグ配列のコードは、二重鎖形成タグと同じ原理に従う；しかし、サブユニ
ット配列の選択にはさらなる制約が存在する。一般に、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の
結合を介する第３の鎖の会合は、二本鎖標的におけるホモピリミジン−ホモプリ
ントラック（ｔｒａｃｋ）に沿って最も安定である。通常、塩基三本鎖は、Ｔ−
Ａ^*ＴまたはＣ−Ｇ^*Ｃモチーフにおいて形成する（ここで、「−」は、ワトソン
／クリック対形成を示し、そして「^*」はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を示す） ；しかし、他のモチーフもまた、可能である。例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基
対形成は、条件および鎖の組成に依存して、第３の鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖）
と第３の鎖が結合するプリンに富んだ二重鎖との間での平行および逆平行の配向
を許容する。特定の実施態様で所望されるような三重鎖の安定性を最大化するか
、さもなければ調節するために、適切な配列、配向、条件、ヌクレオシド型（例
えば、リボースヌクレオシドを用いるかまたはデオキシリボースヌクレオシドを
用いるか）、塩基改変（例えば、メチル化シトシンなど）を選択することについ
ては、参考文献中に広範なガイダンスが存在する。一本鎖または二重鎖タグをそ
れらの一本鎖の相補物または二重鎖の相補物にアニーリングするための条件は、
周知である（例えば、Ｊｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：１３２３〜１３２８
（１９９３）；Ｃａｎｔｏｒら、米国特許第５，４８２，８３６号など）。選別
する際の三重鎖タグの使用は、その相補物にアニーリングするためにタグを曝露
する、ポリメラーゼを伴なう「ストリッピング」反応を必要としない利点を有す
る。

【００５４】 選別するための例示的なタグライブライリーを以下（配列番号１）に示す。

【００５５】

【化１】 オリゴヌクレオチドタグのフランキング領域を操作し、上記で例示されるように
、都合のよいクローニングベクターへの挿入またはクローニングベクターからの
除去のための制限部位を含み得る。必要に応じて、左または右のプライマーを、
ビオチンを付着するように合成し（従来の試薬を使用、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡから入手可能）、増
幅および／または切断後の精製を容易にし得る。好ましくは、タグ−フラグメン
ト結合体を作製するために、上記のライブラリーを従来のクローニングベクター
（例えば、ｐＵＣ１９など）に挿入する。必要に応じて、タグライブラリーを含
むベクターは、例えば、ＢａｍＨＩおよびＢｂｓＩで完全に消化されたフラグメ
ントの単離を容易にする、「スタッファー」領域（「ＸＸＸ・・・ＸＸＸ」）を
含み得る。

【００５６】 本発明の重要な局面は、各微小粒子または各領域が、実質的に、１つの種類の
付着した配列のみを有するような；すなわち、ＤＮＡ配列が、クローンの亜集団
中に存在するような、例えば、ｃＤＮＡライブラリーから固相支持体上の微小粒
子または別々の領域への、ＤＮＡ配列の集団の選別および付着である。この目的
は、実質的に全ての異なるＤＮＡ配列が、付着した異なるタグを有することを保
証することにより達成される。この条件は、次々に、分析のために十分な全体の
タグ−ＤＮＡ配列の結合体のサンプルのみを採取することによりもたらされる（
同一ＤＮＡ配列が異なるタグを有することが認容される。なぜなら、それは、単
に、同じＤＮＡ配列が、作動中であるかまたは２回分析されることを生じるから
である）。このようなサンプル採取は、このタグがＤＮＡ配列に付着された後、
明白に実行され得るか（例えば、より大きい混合物から少量を採取することによ
って）；それは、ＤＮＡ配列およびタグをプロセスするために使用される技術の
二次効果として固有に実行され得るか；またはサンプル採取は、明白およびプロ
セスシング工程の固有部としての両方で実行され得るかのいずれかである。

【００５７】 ｎ個のタグ−ＤＮＡ配列結合体のサンプルを、反応混合物から無作為に抽出す
る場合（サンプル容量を採取することによって作用し得るように）、同じタグを
有する結合体を抽出する確率は、ポワソン分布（Ｐ（ｒ）＝ｅ^-λ（λ）ｒ／ｒ 、ここで、ｒは同じタグを有する結合体の数であり、そしてλ＝ｎｐ、ここで
ｐは、所定のタグが選択される確率である）により記載される。ｎ＝１０⁶かつ ｐ＝１／（１．６７×１０⁷）の場合（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒらに記載される ８個の４塩基のワードをタグとして用いた場合）、λ＝０．０１４９およびＰ（
２）＝１．１３×１０^-4である。従って、１００万個の分子のサンプルは、好ま
しい十分の範囲内で二本鎖の期待される数を生じる。このようなサンプルは、タ
グ−フラグメント結合体を含む混合物の系列希釈により容易に得られる。

【００５８】 本明細書中で使用されるように、タグを分子、特にポリヌクレオチドに付着す
ることに関する、用語「実質的に全て」は、本質的に二重鎖がないタグ−分子結
合体の集団を得るために用いられるサンプル採取の手順の統計学的性質を反映す
ることを意味する。好ましくは、少なくとも９５％のＤＮＡ配列が、唯一の付着
したタグを有する。

【００５９】 好ましくは、ＤＮＡ配列は、タグライブラリーを保有する従来のクローニング
ベクター中にこの配列を挿入することによってオリゴヌクレオチドタグに結合す
る。例えば、それらの５’末端にＢｓｐ１２０Ｉ部位を有するｃＤＮＡを構築し
、そしてＢｓｐ１２０Ｉおよび別の酵素（例えば、Ｓａｕ３ＡまたはＤｐｎ Ｉ
Ｉ）での消化後、式Ｉのタグを保有するｐＵＣ１９に定方向で挿入し、あらゆる
可能なタグ−ｃＤＮＡ対形成を含む、タグ−ｃＤＮＡライブラリーを形成し得る
。サンプルを、増幅および選別のためにこのライブラリーから採取する。サンプ
ル採取を、このライブラリーの系列希釈によってか、またはコロニーからプラス
ミド含有細菌宿主を単純に採集することによって達成し得る。増幅後、このタグ
−ｃＤＮＡ結合体をプラスミドから切り出し得る。

【００６０】 オリゴヌクレオチドタグを、例えば、上記のように一本鎖にすることによって
、特異的ハイブリダイゼーションのために調製した後、このポリヌクレオチドを
、タグとそれらの相補物との間の完全に適合した二重鎖の形成に好ましい条件下
で、このタグの相補的な配列を含む微小粒子と混合する。これらの条件を作製す
るために参考文献中に広範なガイダンスが存在する。このようなガイダンスを提
供する例示的な参考文献は、Ｗｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、２６：２２７〜２５９（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、１９８９）などを含む。好ましくは、このハイブリダイゼーション条件は
、完全に適合した配列のみが安定な二重鎖を形成するように十分にストリンジェ
ントである。このような条件下で、それらのタグを介して特異的にハイブリダイ
ズされるポリヌクレオチドが、微小粒子に付着された相補的な配列に連結され得
る。最終的に、この微小粒子を、非連結性および／または非適合性タグを有する
ポリヌクレオチドを除去するために洗浄する。

【００６１】 タグのそれらの相補物に対するハイブリダイゼーションの特異性は、サンプル
中の高いパーセントのタグが唯一であり、かつサンプル中の実質的に全てのタグ
の最も近接する隣接物が、少なくとも２ワードで異なる程度に十分に小さいサン
プルを採取することによって、増強され得る。この後者の条件は、用いられてい
るレパートリーの約０．１％以下のサイズである、多数のタグ−ポリヌクレオチ
ド結合体を含むサンプルを採取することによって満たされ得る。例えば、タグが
８つのワードで構築される場合、８⁸または約１．６７×１０⁷のタグおよびタグ
相補物のレパートリーが産生される。上記のようなタグ−ＤＮＡ配列結合体のラ
イブラリーにおいて、０．１％のサンプルは、約１６，７００の異なるタグが存
在することを意味する。これを、微小粒子のレパートリー等価物、またはこの例
においては、１．６７×１０⁷微小粒子のサンプル上に直接充填した場合、サン プルにされた微小粒子のほんの低密度なサブセットが充填される。好ましくは、
充填された微小粒子を、ＤＮＡ配列を蛍光的に標識し、そして変性した後に、従
来のプロトコルを使用して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）機器によ
って充填されていない微小粒子から分離し得る。充填し、そしてＦＡＣＳ分離し
た後、この標識を、この付着したＤＮＡ配列の使用または他の分析の前に切断し
得る。

【００６２】 参照ＤＮＡ集団は、異なる試験集団における頻度が比較されるべきである、任
意のセットのＤＮＡ配列からなり得る。好ましくは、複数の細胞中または組織中
の遺伝子発現の分析における使用のための参照ＤＮＡ集団は、遺伝子発現が比較
されている、細胞または組織の各々に由来するｃＤＮＡライブラリーを生成する
ことによって構築される。これは、種々の細胞および／または組織から抽出され
るｍＲＮＡをプールすることによって達成され得るか、あるいは別々に構築され
たｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡをプールすることによって達成され得るかの
いずれかである。あるいは、参照ＤＮＡ集団は、ゲノムＤＮＡから構築され得る
。この目的は、分析されている任意の細胞中または組織中に可能に発現され得る
全ての配列を含むＤＮＡ配列の１セットを得ることである。一旦、参照ＤＮＡ集
団を構成するＤＮＡ配列が得られると、それらは、固相クローニングのためにオ
リゴヌクレオチドタグに結合しなければならない。好ましくは、このＤＮＡ配列
は、上記のように、適切なタグのレパートリーを保有するベクターに挿入され、
タグ−ＤＮＡ配列結合体のライブラリーを形成し得るように調製される。結合体
のサンプルを、このライブラリーから採取し、増幅し、そして微小粒子上に充填
する。このサンプルは、全ての異なる型のＤＮＡ配列が充填された微小粒子上に
表される確率が高いように十分に大きいことが重要である。例えば、比較されて
いる複数の細胞の中で、全体で約２５，０００個の遺伝子を発現する場合、この
数の約５倍のサンプル、すなわち約１２５，０００個のタグ−ＤＮＡ配列結合体
は、全ての可能なＤＮＡ配列が約９９％の確率で充填された微小粒子中に表され
ることを保証するように採取されるべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
上記））。

【００６３】 別の実施態様において、参照集団は、細胞周期タンパク質、シグナル伝達経路
タンパク質、癌遺伝子産物、腫瘍サプレッサー、キナーゼ、ホスファターゼ、転
写因子、増殖因子レセプター、増殖因子、細胞外マトリックスタンパク質、プロ
テアーゼ、細胞骨格タンパク質、膜レセプター、Ｒｂ経路タンパク質、ｐ５３経
路タンパク質、代謝に関与するタンパク質、ストレスに対する細胞応答に関与す
るタンパク質、サイトカイン、ＤＮＡ損傷および修復に関与するタンパク質、な
らびにアポトーシスに関与するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質
の特定のセット（単数）またはセット（複数）をコードするポリヌクレオチドの
１セットを含み得る。このようなポリヌクレオチドは、代表的には、固体支持体
当たりに唯一の配列を有するオリゴヌクレオチドを介して固相支持体に付着され
るが、このようなポリヌクレオチドはまた、各固相支持体に共通である配列（例
えば、ポリアデニル化オリゴヌクレオチド）を有するオリゴヌクレオチドを介し
て固相支持体に付着され得る。

【００６４】 好ましくは、タグ−ＤＮＡ配列結合体をサンプルにした後、Ｂｒｅｎｎｅｒら
（上記）に開示されるように、それらを、蛍光的に標識されたプライマーを使用
してＰＣＲにより増幅し、微小粒子のタグ相補物上に充填するために有意な材料
を提供し、そして充填されていない微小粒子から充填された微小粒子を区別する
手段を提供する。好ましくは、このＰＣＲプライマーはまた、この蛍光標識が、
研究されている細胞または組織由来の標識されたＤＮＡ鎖の競合的なハイブリダ
イゼーションの前に、ｃＤＮＡの末端から切断され得るように、二本鎖産物中に
おいてレアカッティング（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）制限エンドヌクレアーゼ
（例えば、ＰａｃＩ）の制限部位の生成を可能にする配列を含む。このような充
填の後、特異的にハイブリダイズしたタグ−ＤＮＡ配列結合体を、タグ相補物に
連結し、そしてこの充填された微小粒子を、ＦＡＣＳによって充填されていない
微小粒子から分離する。この蛍光標識を、充填された微小粒子のＤＮＡ鎖から切
断し、そして非共有結合で付着した鎖を、従来のプロトコルを使用して、熱、ホ
ルムアミド、ＮａＯＨ、および／または同様の手段を用いて変性することによっ
て除去する。次いで、この微小粒子は、競合的ハイブリダイゼーションのために
用意される。

【００６５】 （競合的ハイブリダイゼーションおよび光生成標識） 分析されている細胞および／または組織由来の遺伝子発現産物（例えば、ｍＲ
ＮＡまたはｃＤＮＡ）を単離する。この発現産物を、供給源を区別するために標
識する。好ましくは、各供給源由来の産物は、任意の他の供給源の産物（例えば
、唯一および区別可能な発光頻度を有する各々）により含まれる標識とは異なる
標識を含む。あるいは、１つの供給源の産物は、未標識のままおかれ得る。この
発現産物を、従来の技術（例えば、ＤｅＲｉｓｉら（上記）など）によって標識
し得る。好ましくは、光生成標識を、抽出されたｍＲＮＡから逆転写されたｃＤ
ＮＡに組込み、またはオリゴヌクレオチドタグを、同定のために標識されたタグ
相補物を提供するために付着する。蛍光標識、比色定量標識、化学発光標識、お
よび電気発光標識を含む、多数の光生成標識が入手可能である。一般に、このよ
うな標識は、吸収頻度、発光頻度、強度、シグナル寿命、またはこのような特徴
の組合せを含み得る光学シグナルを生じる。好ましくは、蛍光標識を、蛍光的に
標識されたヌクレオシド三リン酸の直接的な組込みによってか、あるいは捕捉部
分（例えば、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸またはオリゴヌクレオチドタグ）
の組込みによる間接的な適用によってのいずれかで、続いて蛍光シグナルを生成
し得る部分（例えば、ストレプトアビジン−蛍光色素結合体または蛍光的に標識
されたタグ相補物）と複合体化することによって用いる。好ましくは、蛍光標識
から検出される光学シグナルは、１つ以上の特徴的な発光頻度での強度である。
蛍光色素およびＤＮＡ鎖にそれらを付着させるかまたは組み込むための手段の選
択は、周知である。例えば、ＤｅＲｉｓｉら（上記）、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１６９巻、１〜２５頁（１９８８）；Ｈａｕｇｌ
ａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａ
ｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２）；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、
ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、１９９３）；ならびにＥｃｋｓｔｅｉｎ、編集者、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１）；Ｗｅｔｍｕｒ、
Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２６：２２７〜２５９（１９９１）；
Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９２：４３４７〜４３５１
（１９９５）ならびにＪｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２：２４６〜
２４９（１９９６）など。

【００６６】 好ましくは、光生成標識は、それらの各光学シグナルが存在する標識されたＤ
ＮＡ鎖の量と関連し得るように、そして異なる光生成標識により生成されたこの
光学シグナルが比較され得るように、選択される。蛍光標識の発光強度の測定は
、この設計目的を満たす好ましい手段である。蛍光色素の所定の選択について、
それらの発光強度を標識されたＤＮＡ鎖のそれぞれの量と関連付けることは、異
なる色素、量子収率、発光バンド幅、吸収極大、吸収バンド幅、励起光源の性質
などを含む、いくつかの因子の考慮を必要とする。蛍光強度測定を作製するため
の、そしてそれらを分析物の量に関連付けるためのガイダンスは、化学および分
子分析に関する参考文献中で入手可能である。例えば、Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、編
集者、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、第２版（Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０）；Ｐｅｓｃｅら、編集者、Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅ
ｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅ
ｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７０）など。本明細書中で使用され
るように、用語「相対的な光学シグナル」とは、相補的な参照ＤＮＡ鎖と二重鎖
を形成する、同一な配列、または実質的に同一な配列の、異なって標識されたＤ
ＮＡ鎖の比率に関連し得る、異なる光生成標識からのシグナルの比率を意味する
。好ましくは、相対的な光学シグナルは、２つ以上の異なる蛍光色素の蛍光強度
の比率である。

【００６７】 多数の細胞または組織由来の標識されたＤＮＡ鎖の間の競合的ハイブリダイゼ
ーションは、従来のハイブリダイゼーション反応において、各々の供給源由来の
等量の標識されたＤＮＡ鎖を参照ＤＮＡ集団で充填された微小粒子に適用するこ
とによって実行される。競合的ハイブリダイゼーション反応に加えられた特定量
の標識されたＤＮＡ鎖は、本発明の実施態様に依存して広範に変動する。このよ
うな量の選択に影響する因子は、使用される微小粒子量、使用される微小粒子型
、微小粒子上の参照ＤＮＡ鎖の充填、標識されたＤＮＡ鎖集団の複雑性などを含
む。ハイブリダイゼーションは、同一または実質的に同一である配列を有する、
異なって標識されたＤＮＡ鎖が、同じ相補的な参照ＤＮＡ鎖にハイブリダイズす
るように競合するという点で競合的である。競合的ハイブリダイゼーション条件
は、相補的な参照ＤＮＡ鎖と二重鎖を形成する標識されたＤＮＡ鎖の割合が、そ
れらの各集団中の同一配列の競合するＤＮＡ鎖の量と比較したその集団中のＤＮ
Ａ鎖の量を反映し、そして好ましくは、正比例するように選択される。従って、
同一配列を有する第１および第２の異なって標識されたＤＮＡ鎖は、例えば、第
１の標識されたＤＮＡ鎖が１ｎｇ／μｌの濃度で、そして第２の標識されたＤＮ
Ａ鎖が２ｎｇ／μｌの濃度であるように、相補的な参照ＤＮＡ鎖とのハイブリダ
イゼーションで競合している場合、平衡状態では、参照ＤＮＡと形成された二重
鎖の１／３が第１の標識されたＤＮＡ鎖を含み、そして二重鎖の２／３が第２の
標識されたＤＮＡ鎖を含むことが期待される。ハイブリダイゼーション条件を選
択するためのガイダンスは、ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ（上記）；Ｗｅｔｍ
ｕｒ、（上記）；Ｈａｍｅｓら、編集者、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５）などを含む、多数の参考文献中で提供され
る。

【００６８】 本発明の別の局面は、微小粒子の混合物を含む、差示的に発現された遺伝子を
分析するためのキットである。ここで、各々の微小粒子は、それに付着された同
一な一本鎖の核酸分子の集団を有し、この一本鎖核酸分子は、各微小粒子で異な
っており、そして少なくとも１つの細胞または組織供給源のｍＲＮＡに由来する
ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、上記核酸分子の各々は、さらに、上記ポ
リヌクレオチドと並置して、そして上記微小粒子と上記ポリヌクレオチドとの間
に位置したオリゴヌクレオチドタグを含む。このキットは、さらに、上記細胞ま
たは組織供給源の少なくとも１つ由来のｃＤＮＡ分子の集団、ｃＤＮＡ集団を標
識するための試薬、競合的ハイブリダイゼーションを実施するための試薬などを
含む。所望される場合、キット中のｃＤＮＡ分子を、蛍光的な標識型で提供する
。このキットは、競合的ハイブリダイゼーションを実施するためのさらなる成分
（例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液、ＰＣＲ緩衝液、および標準物質など
）を含み得る。このキットは、さらに、各々の成分に対する少なくとも１つの容
器またはいくつかの容器を含み得、そして差示的に発現された遺伝子を分析する
際の使用のための印刷された取扱説明書を含み得る。

【００６９】 本発明はまた、それに付着されたオリゴヌクレオチドタグ相補物を有する複数
の微小粒子を含む、参照集団を調製するためのキットを提供し、ここで上記オリ
ゴヌクレオチドタグ相補物の配列は、各微小粒子で異なっている。このキットは
、さらに、タグ相補物に相補的な配列を有するタグのライブラリーを含む複数の
ベクターを含み得る。このキットは、さらに、少なくとも１つの細胞または組織
供給源、好ましくはｃＤＮＡ由来のポリヌクレオチドの集団を含み得る。ポリヌ
クレオチドの集団が含まれる場合、好ましくは、ポリヌクレオチドの集団は、上
記複数の微小粒子から分離された容器中に含まれる。このキットはまた、参照集
団を調製するための試薬、例えば、アダプター、標識、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ
、標識ｄＮＴＰ、ＰＣＲ緩衝液など、ならびに参照集団を調製するための印刷さ
れた取扱説明書を含み得る。

【００７０】 （上方制御された遺伝子産物および／または下方制御された遺伝子産物を有す
る微小粒子のフローソーティング） 標識されたポリヌクレオチドを、微小粒子上の参照集団に競合的にハイブリダ
イズした後、この微小粒子を、微小粒子および付着された配列の化学的および／
または物理的性質に依存する多数の方法で分析および／または選別し得る。例え
ば、目的の微小粒子を、微小マニュピレータにより機械的に分離し得、磁気微小
粒子は、磁場を調節するかまたは操作することによって選別し得、荷電した微小
粒子を、電気泳動などによって操作し得る。以下の参考文献は、微小粒子を分析
および／または分類する手段を選択するためのガイダンスを提供する：Ｐａｃｅ
、米国特許第４，９０８，１１２号；Ｓａｕｒら、米国特許第４，７１０，４７
２号；Ｓｅｎｙｅｉら、米国特許第４，２３０，６８５号；Ｗｉｌｄｉｎｇら、
米国特許第５，６３７，４６９号；Ｐｅｎｎｉｍａｎら、米国特許第４，６６１
，２２５号、Ｋａｒｎａｕｋｈｏｖら、米国特許第４，３５４，１１４号；Ａｂ
ｂｏｔｔら、米国特許第５，１０４，７９１号；Ｇａｖｉｎら、ＰＣＴ公開ＷＯ
９７／４０３８３など。好ましくは、蛍光的に標識されたＤＮＡ鎖を含む微小粒
子を、市販のＦＡＣＳ機器（例えば、Ｖａｎ Ｄｉｌｌａら、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔ
ｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５）；Ｆ
ｕｌｗｙｌｅｒら、米国特許第３，７１０，９３３号；Ｇｒａｙら、米国特許第
４，３６１，４００号；Ｄｏｌｂｅａｒｅら、米国特許第４，８１２，３９４号
など）によって、都合よく区別し、そして選別する。参照の鎖に競合的にハイブ
リダイズした蛍光的に標識されたＤＮＡ鎖について、好ましくは、このＦＡＣＳ
機器は、複数の蛍光チャネル能力を有する。好ましくは、１つ以上の高い強度の
光源（例えば、レーザー、水銀アークランプなど）での励起では、各微小粒子は
、微小粒子により運ばれる各細胞または組織タイプ由来の標識されたＤＮＡ鎖の
量に関連した、蛍光シグナル、通常、蛍光強度を生成する。実施例１の図１ａに
示されるように、各微小粒子の蛍光強度を、二次元グラフにプロットする場合、
等しい発現レベルを示す微小粒子は、グラフの対角線（１００）上かまたはその
近傍である。上方制御および下方制御された遺伝子は、対角線から離れた領域（
ｏｆｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）に出現する。このような微小粒子は
、図１ｂに示されるように一方または両方の対角線から離れた領域（１１２）を
囲むようにソーティングパラメーターをグラフ規定することによって、市販のＦ
ＡＣＳ機器によって容易に選別される。従って、微小粒子は、それらの相対的な
光学シグナルに従い分類され得、そして所望される場合、異なる細胞または組織
供給源中での遺伝子発現における差異に対応する、所定の範囲の値内で、シグナ
ルを生成するそれらの微小粒子を蓄積することによって、さらなる分析のために
収集され得る。

【００７１】 （ポリヌクレオチドが由来する核酸配列の存在比に従う微粒子のフローソーテ
ィング） 蛍光標識されたＤＮＡ鎖を含む微粒子はまた、それらが由来する遺伝子産物の
存在比に従って分類および識別され得る。核酸配列の存在比は、関連する遺伝子
発現を決定するために、上記に記載される方法によって決定され得、そして微粒
子に結合されたポリヌクレオチドによって生成された光学的なシグナルの強度レ
ベルと相関され得る。より低い強度は、より珍しい核酸配列の指標である（例え
ば、珍しい遺伝子産物）。珍しい遺伝子は、ｍＲＮＡをコードする遺伝子であり
、これは、１細胞あたり約１００コピー以下で存在し、より好ましくは約５０コ
ピー未満から約２５コピー未満まで、最も好ましくは細胞あたり約１０コピー未
満である。珍しい遺伝子は、実施例９および１０に示される、低い蛍光強度を有
する微粒子を収集することによって単離され得る。収集された微粒子は、代表的
には、総微粒子の約５％未満、より好ましくは約２．５％、１％、〜０．５％以
内、最も好ましくは約０．１％未満を含む。

【００７２】 あるいは、ハイブリダイゼーション速度は、核酸配列の存在比に比例するので
、より少ない存在比の核酸配列は、細胞または組織供給源においてより低い存在
比で存在する核酸配列が、ハイブリダイズされない状態で残存するハイブリダイ
ゼーション条件を設定することによって単離され得る。適切なハイブリダイゼー
ション条件は、規格化されたｃＤＮＡライブラリーを産生するために使用される
条件を含む（Ｐａｔａｎｊａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８８：１９４３−１９４７（１９９１））。例えば、大量なＤＮＡ種の
ハイブリダイゼーションに最大期間を許容した後、ハイブリダイズしていないＤ
ＮＡを収集することによって、珍しい遺伝子を単離し得る。

【００７３】 反復配列は、マッピングおよび多型分析をしばしば複雑にする。反復配列は、
トランスポゾン、レトロトランスポゾン、レトロウイルス、Ａｌｕ配列のような
短散在反復エレメント（ＳＩＮＥ）、サテライトＤＮＡ，ミニサテライトＤＮＡ
、メガサテライトＤＮＡなどのゲノムにおける存在に起因して存在する。反復配
列は、上記に記載したように、より遅くハイブリダイズするＤＮＡ種から迅速に
ハイブリダイズするＤＮＡ種を識別することによって、ＤＮＡ集団から除去され
得る。好ましくは、ハイブリダイズしない集団は、非反復核酸配列に由来するポ
リヌクレオチド中に実質的に富化される。

【００７４】 本発明の別の局面は、上記に記載および使用のための印刷された指示書ように
調製された微粒子を含む核酸配列の存在比について、核酸配列を分析および／ま
たは単離するためのキットである。

【００７５】 （大規模並行サイン配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉ
ｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ））によって識別された遺伝
子の同定） 発現された遺伝子は、ＭＰＳＳによって並列して同定され得る。ＭＰＳＳは、
以下の２つの技術の組み合わせである：並列処理のためにＤＮＡフラグメントを
タグ化し、そして識別するための技術（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら、国際特許出
願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９５１３号）、およびＤＮＡフラグメント末端を段階的
に配列決定するための別の技術（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，５９
９，６７５号およびＡｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０９
４７２）。標的ポリヌクレオチドの第１の制限エンドヌクレアーゼでの初期消化
の後、制限フラグメントを、以下およびＢｒｅｎｎｅｒら、国際特許出願ＰＣＴ
／ＵＳ９６／０９５１３に記載されるようにオリゴヌクレオチドタグに連結し、
その結果、得られたタグフラグメント結合体をサンプリングし、増幅し、そして
オリゴヌクレオチドタグの、それらのタグ相補体との特異的なハイブリダイゼー
ションによって別個の固相支持体上で識別し得る。

【００７６】 一旦、ＤＮＡフラグメントの増幅サンプルが、固相支持体上で識別され、実質
的に同一なフラグメントの均一集団を形成すると、フラグメントの末端は、好ま
しくは、アダプターに基づいた方法（連結、同定、および切断の反復サイクルを
含むＤＮＡ配列決定（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，５９９，６７５
号に記載される方法））を用いて配列決定される。さらに好ましくは、配列決定
方法に使用されるアダプターの各々は、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許出願ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９７／０９４７２に教示されるように、突出鎖（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ
ｓｔｒａｎｄ）、およびオリゴヌクレオチドの最小の交差ハイブリダイズする
セットから選択されたオリゴヌクレオチドタグを有する。このようなアダプター
は、本明細書中で「コード化アダプター（ｅｎｃｏｄｅｄ ａｄａｐｔｏｒ）」
と呼ばれる。コード化アダプターの突出鎖がフラグメントの相補的突出鎖と完全
に一致した二重鎖を形成するコード化アダプターが、リガンドである。連結後、
突出鎖のヌクレオチドの同一性および順序が決定されるか、あるいは標識化され
たタグ相補体または連結されたアダプター上の対応タグに対する「デコーダー（
ｄｅ−ｃｏｄｅｒ）」と特異的にハイブリダイズすることによって「解読」され
る。

【００７７】 好ましい配列決定方法は、以下からなる工程で行われる：（ａ）コード化アダ
プターをフラグメントの末端に連結する工程であって、このコード化アダプター
は、ヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位を有し、その切断部位は、その認識部
位から分離している、工程；（ｂ）フラグメントの末端に連結されたコード化ア
ダプターの同一性によって、フラグメントの末端の１つ以上のヌクレオチドを同
定する工程；（ｃ）フラグメントが１つ以上のヌクレオチド程度短縮されるよう
に、コード化アダプターのヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼでフラ
グメントを切断する工程；および（ｄ）フラグメントの末端の上記ヌクレオチド
配列が決定されるまで、上記工程（ａ）から（ｃ）を繰り返す工程。この同定工
程において、タグ相補体の連続的なセット、あるいは「デコーダー」は、フラグ
メントの末端に連結されたコード化アダプターに保有される各タグに特異的にハ
イブリダイズされる。ポリヌクレオチドの突出鎖におけるヌクレオチドの型およ
び配列は、以下に記載されるように、特異的にハイブリダイズされるデコーダー
に保有される標識およびデコーダーに由来するセットによって同定される。

【００７８】 （従来の配列決定による識別された遺伝子の同定） 微粒子によって保有される遺伝子産物は、従来のＤＮＡ配列決定プロトコルを
使用して識別後（例えば、ＦＡＣＳによって）、同定され得る。このような配列
決定のための適切なテンプレートは、差示的に発現された遺伝子産物を保有する
識別された微粒子から開始するいくつかの異なる方法において生成され得る。例
えば、単離された微粒子に付着された参照ＤＮＡは、サイクル配列決定（ｃｙｃ
ｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって標識された伸長産物を生成するために使
用され得る（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２６
７８によって教示されるように）。この実施態様において、プライマー結合部位
（４００）は、（図４ａに示されるように）参照ＤＮＡ（４０２）中にタグ相補
体（４０６）に対して遠位に操作される。例えば、別のマイクロタイターウェル
などに分類することによって微粒子を単離した後、差示発現された鎖を溶解する
。プライマー（４０４）を加え、そして標識された伸長産物を形成するように、
従来のサンガー配列決定反応を実行する。次いで、これらの産物は、配列決定に
ために、電気泳動などの技術よって分離される。同様の実施態様において、配列
決定のテンプレートは、個々の微粒子を識別することなく産生され得る。プライ
マー結合部位（４００）および（４２０）は、プライマー（４０４）および（４
２２）を使用するＰＣＲによってテンプレートを生成するために使用され得る。
次いで、このテンプレートを含む、得られた単位複製配列は、従来の配列決定ベ
クター（例えば、Ｍ１３）中にクローン化される。形質移入の後、宿主をプレー
トし、そして配列決定のために個々のクローンを選択する。

【００７９】 別の実施態様において、図４ｂに例証されるように、プライマー結合部位（４
１２）は、競合的にハイブリダイズされた鎖（４１０）中に操作され得る。この
部位は、参照ＤＮＡ（４０２）中に相補鎖を有する必要はない。識別の後、参照
配列（４０２）の競合的にハイブリダイズされた鎖（４１０）は溶解され、そし
ては、プライマー（４１４）および（４１６）を使用して、例えば、ＰＣＲによ
って増幅され、この参照配列（４０２）は、より容易な操作のため、ビオチンで
標識化および／または誘導体化され得る。次いで、この溶解されそして増幅され
た鎖は従来の配列決定ベクター（例えば、Ｍ１３）にクローン化され、これは宿
主をトランスフェクトするために使用され、順々にプレートされる。個々のコロ
ニーが、配列決定のために選ばれる。

【００８０】 （実施例１：タグ化ｃＤＮＡライブラリーの構築、サンプリング、およびタグ
化ｃＤＮＡの微粒子上へのローディング） この実施例において、微粒子上にロードするためのタグ化参照ＤＮＡを調製す
るための好ましいプロトコルが、記載される。手短には、目的の各細胞または目
的の各組織からのｃＤＮＡを調製し、そして式１のタグエレメントを含むベクタ
ーに直接的にクローン化する。好ましくは、このような細胞または組織から抽出
されたｍＲＮＡを、通常同じ比率で、第１鎖合成より先に組み合わせる。ｍＲＮ
Ａを標準的なプロトコルを使用して得、この後、第１鎖および第２鎖の合成を例
示されるように実行し、そして得たｃＤＮＡを、式１のタグエレメントまたは同
様のタグエレメントを含むベクターに挿入する。次いで、このタグｃＤＮＡ結合
体を含むベクターを使用して、適切な宿主（代表的には、従来の細菌宿主）に形
質転換し、その後、宿主培養物からの細胞サンプルをさらに拡張し、そしてベク
ターＤＮＡを抽出する。好ましくは、このタグｃＤＮＡ結合体をＰＣＲによって
ベクターから増幅し、そしてタグ相補体で誘導される微粒子上にロードするため
に、以下に記載されるように処理する。非共有結合的に付着した鎖を溶解した後
、ｃＤＮＡを含む微粒子を、競合的にハイブリダイズされる遺伝子産物を受容す
るように、本発明に従って用意する。示した工程に関連する特定の手引きは、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら（上記に引用される）；Ａｕｓｂｅｌら、編者、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｉｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５）；および分子
生物学技術についての同様の手引きにおいて利用可能である。

【００８１】 約５μｇのｍＲＮＡのペレットを、１０μｌの５×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ緩
衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、お
よび１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（または同様の逆転写酵素 緩衝液）、５μｌの０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５μｌの３ｄ
ＮＴＰ／メチル−ｄＣＴＰ混合物（１０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
、および５−メチル−ｄＣＴＰ、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
から入手可能）、１μｌ ＲＮａｓｉｎ、１２μｌの以下に示される０．２５μ
ｇ／μｌの逆転写酵素プライマー、および１４．５μｌのＨ₂Ｏからなる、４５ μｌ（最終容量）の第１鎖プレミックス（ｐｒｅ−ｍｉｘ）中に再懸濁する。

【００８２】

【化２】 逆転写プライマー（配列番号２） 室温下で１５分間のインキュベートした後、５ｍｌの２００Ｕ／μｌ Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔを添加し、そしてこの混合液を４２℃で１時間インキュベート
した。1時間のインキュベートの後、上記の混合液（総量約５０μｌ）を、氷上 で、８０μｌの５×第２鎖緩衝液（９４ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．９）、
４５３ｍＭ ＫＣｌ、２３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および５０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ）からなる、第２鎖プレミックス（容量３３６μｌ）に添加し、約３８６μｌの
総反応容量を得る。別に、４μｌの０．８Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｈ（３．２ユ
ニット）および１０μｌの１０ｕｎｉｔ／μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（１００ユニット）を組み合わせ、そしてこの組み合わせた酵素混合液を
、上記の第２鎖反応混合液に添加する。その後、総反応容量を５秒間、微量遠心
し、次いで１６℃で１時間および室温で１時間インキュベートし、以下の二重鎖
ｃＤＮＡ（配列番号３）を得る：

【００８３】

【化３】 ここでＸは、ｃＤＮＡ中のヌクレオチドを示し、ＶはＡ、Ｃ、またはＧを表し、
そしてＢはＣ、Ｇ、またはＴを表す。逆転写プライマー配列は、ｃＤＮＡ中にＢ
ｓｍ ＢＩ部位を与えるために選択され、この酵素は、Ｂｓｍ ＢＩでの消化に
５’−ＧＣＡＴオーバーハングを生じることに留意のこと。

【００８４】 フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、このｃＤＮＡをＤ
ｐｎ ＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｓｂｓ，Ｂｅｖｅｒｅｌｙ，Ｍ
Ａ）で消化するために、製造者の推奨緩衝液中に再懸濁し、次いで、アビジン化
ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）上でビオチン化フラグメントを
捕獲する。洗浄後、この捕獲されたフラグメントを、Ｂｓｍ ＢＩで消化し、以
下のｃＤＮＡ（配列番号４）を放出し、これをエタノールで沈殿する。

【００８５】

【化４】 従来のクローニングベクター（例えば、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｐＢＣな
ど（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ
、ＣＡ））を操作し、以下のエレメントの配列（配列番号５）を有する（これら
は式１で示される配列である）。

【００８６】

【化５】 Ｂｂｓ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化した後、このベクターを電気泳動によって
精製し、連結のためにｃＤＮＡと合わせる。Ｂｂｓ Ｉ消化が、ｃＤＮＡのＢｓ
ｍ ＢＩ−消化末端と適合する末端を生じるようにベクターを操作していること
に注意のこと。連結後、適切な宿主細菌を形質転換し、そして後に使用するため
に培養を拡張する。

【００８７】 拡大された培養物からの宿主細胞サンプルを、挿入されたｃＤＮＡを有するベ
クターを保有する画分を決定するためにプレートする。その後、約１．７×１０ ⁵ の挿入物含有細胞に一致する培養物のアリコートを回収し、そして別々に培養 中で拡大する。これは、式Ｉに示される型のタグの約１％の貯蔵量を示す。

【００８８】 好ましくは、このタグ−ｃＤＮＡ結合体を、以下のような従来のプロトコルを
使用して、ＰＣＲによってベクターから増幅する。８つの複製ＰＣＲの各々につ
いて、以下の反応成分を組み合わせる：１μｌのベクターＤＮＡ（１つのライブ
ラリーについて１２５ｎｇ／μｌ、単一クローンについて１０⁹コピー）；１０ μｌの１０×Ｋｌｅｎｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；０．２５μｌビオチン化２０マー
「正方向」ＰＣＲプライマー（１ｎｍｏｌ／μｌ）；０．２５μｌのＦＡＭ標識
２０マー「逆方向」ＰＣＲプライマー（１ｎｍｏｌ／μｌ）；１μｌの２５ｍＭ
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および５−メチル−ｄＣＴＰ（総ｄＮＴＰ濃
度１００ｍＭ）；５μｌのＤＭＳＯ；２μｌの５０×Ｋｌｅｎｔａｑ酵素；およ
び８０．５μｌのＨ₂Ｏ（総容量１００μｌについて）。ＰＣＲを、ＭＪＲ Ｄ ＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ Ｒｅｓｅｒｃｈ）または同様の熱サイクラーにおい
て以下のプロトコルで行う：１）９４℃、４分間；２）９４℃、３０秒；３）６
７℃、３分間；４）工程２および３の８サイクル；５）９４℃、３０秒；６）６
４℃、３分間；７）工程５および６の２２サイクル；８）６７℃、３分間；およ
び９）４℃で保持。

【００８９】 ８つのＰＣＲ混合液をプールし、そして室温で７００μｌのフェノールを加え
る。その後、組み合わせた混合溶液を２０〜３０秒間ボルテックスし、次いで、
高速（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機などの機器において１４，０００
ｒｐｍ）で３分間遠心分離する。この上清を除去し、そして新しいチューブ中で
７００μｌのクロロホルム（２４：１のクロロホルム：イソ−アミルアルコール
の混合物）と合わせ、２０〜３０秒間ボルテックスし、そして１分間遠心分離す
る。その後、この上清を新しいチューブに移し、そして８０μｌの３Ｍ酢酸ナト
リウムおよび５８０μｌのイソプロパノールと組み合わせる。２０分間の遠心分
離の後、この上清を除去し、そして１ｍｌの７０％エタノールを加える。この混
合液を５〜１０分間遠心分離し、その後、このエタノールを除去し、沈殿したＤ
ＮＡをスピードバック（ｓｐｅｅｄ ｂａｃｋ）で真空乾燥する。

【００９０】 再懸濁の後、このｃＤＮＡを、製造者の推奨プロトコルを使用して、アビジン
化磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）で精製し、そしてまた製造者の推奨プロトコル（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍｔ）を使用して、
Ｐａｃ Ｉ（１μｇのＤＮＡあたり１ユニットの酵素）で消化する。この切断さ
れたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、次いでエタノール沈殿する。
タグ−ｃＤＮＡ結合体のタグを、１μｇのストレプトアビジン−精製ＤＮＡあた
り２ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）を組み合わせることによって、一本鎖を生じる。１５０μｇのストレプ
トアビジン−精製ＤＮＡを２００μｌのＨ₂Ｏに再懸濁し、以下の反応成分と組 み合わせる。最終反応容量を３００μｌにする：３０μｌの１０ＮＥＢ緩衝液、
番号２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；９μｌの１００ｍＭ ｄ
ＧＴＰ；３０μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（１０ユニット／μｌ）；および
３１μｌのＨ₂Ｏ。１時間、３７℃インキュベートした後、この反応溶液を、２ ０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加することによって停止し、そして２０分間、
７５℃でこの反応溶液をインキュベートすることによって、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを不活性化する。タグ−ｃＤＮＡ結合体をフェノール／クロロホルム抽出法
で精製し、そしてエタノール沈殿する。

【００９１】 タグ相補体を有する５μｍのＧＭＡビーズを、自動化ＤＮＡ合成機（Ｇｅｎｅ
Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｓｐｅｃｉａｌ／４ Ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｊｏｒｋｇａｔａｎ、Ｓｗｅｄｅｎまたは同様の装置
）で、従来のホスホルアミダイド化学を使用する組み合わせ合成（ｃｏｍｂｉｎ
ａｔｏｒｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって調製した。ここで、核酸を３’
から５’の方に縮合する。好ましい実施態様において、２８ヌクレオチド「スペ
ーサー」配列を合成し、次いでタグ相補体配列（タグ相補体中の全３２ヌクレオ
チドについて各４ヌクレオチドの８「ワード」）、および３つのＣ’ｓ配列を合
成する。従って、このビーズを６３マーのオリゴヌクレオチドで誘導体化する。
この「スペーサー」配列の長さは重要ではない；しかし、このビーズ表面の近傍
は、タグ相補体または捕獲配列を処置するために使用される酵素の活性に影響し
得る。従って、このようなプロセシングを使用する場合、このような表面効果を
避けるのに十分な長さのスペーサーが望ましい。好ましくは、このスペーサーは
１０〜３０ヌクレオチドである。Ｐａｃ Ｉ部位を含む以下の配列（配列番号６
）は、本発明の実施態様に使用される。

【００９２】

【化６】 好ましくは、タグ−ｃＤＮＡ結合体は、少なくともタグ相補体の完全なレパー
トリーに一致する番号のビーズ上でタグ相補体にハイブリダイズする。本発明の
実施態様の場合、これは８⁸、または約１．６×１０⁷ビーズである。所定の容量
におけるビーズの番号は、血球計算板器を用いて容易に推定される。

【００９３】 タグ−ｃＤＮＡ結合体のハイブリダイゼーションの前に、このタグ相補体の５
’末端を、好ましくは、ポリヌクレオチドキナーゼ処置によってリン酸化する。
手短には、１００μｌのＨ₂Ｏ中に懸濁された２．５×１０⁸のビーズを、１００
μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、１０μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、１μｌの１０％
Ｔｗｅｅｎ ２０、１７μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／
μｌ）、および７２２μｌのＨ₂Ｏと組み合わせ、最終容量を１０００μｌにす る。ボルテックスしながら、２時間、３７℃でインキュベートした後、ボルテッ
クスを続けたまま、２０分間温度を６５℃に上昇し、キナーゼを不活性化する。
インキュベートの後、ビーズを遠心沈降およびそれらを０．０１％ Ｔｗｅｅｎ
２０を含む１ｍｌのＴＥ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）中に再懸濁することによって、２回洗浄する。

【００９４】 タグ−ｃＤＮＡ結合体のタグ相補体へのハイブリダイゼーションのために、上
記のように調製したタグ−ｃＤＮＡ結合体を、５０μｌのＨ₂Ｏ中に懸濁し、得 られた混合液を４０μｌの２．５×ハイブリダイゼーション緩衝液と組み合わせ
る。その後、この組み合わせた混合液を、従来のプロトコルを使用してＳ−Ｘス
ピンカラム（０．２２μｍ）を通して濾過し、タグ−ｃＤＮＡ結合体を含む濾液
を得る（１．２５ｍｌの０．１Ｍ ＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、１．２５ｍｌの ５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５ｍｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１．５０ｍｌの２
５％硫酸デキストラン、および０．７５ｍｌのＨ₂Ｏからなる５ｍｌの２．５× ハイブリダイゼーション緩衝液）。１０μｌのＴＥ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液（０．０
１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＥ）中の約１．８×１０⁷のビーズを遠心分離し 、その結果、ビーズをペレット化し、そしてＴＥ／Ｔｗｅｅｎを除去する。この
ビーズに、２５μｌの１×ハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭのＮａＰＯ ₄ （ｐＨ７．２）、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、３％ 硫酸デキストラン）を加え、この混合液をボルテックスし、ビーズを十分に再懸
濁する。その後、この混合液を遠心分離し、その結果、ビーズをペレット化し、
そして上清を除去する。

【００９５】 上記の濾液中のタグ−ｃＤＮＡ結合体を７５℃で３分間インキュベートし、ビ
ーズと組み合わせる。その後、この混合液をボルテックスし、このビーズを十分
に再懸濁する。得られた混合液を、約３日間（６０時間）ボルテックスしながら
７５℃でさらにインキュベートする。ハイブリダイゼーションの後、この混合液
を２分間遠心分離し、そして上清を除去する。その後、このビーズを、５００μ
ｌのＴＥ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、そして０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
、５００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液、番号２中に再懸濁する。このビーズをこの溶
液中で６４℃、３０分間インキュベートする。その後、この混合液を遠心分離し
、その結果、ビーズをペレット化し、そして上清を除去し、そしてこのビーズを
５００μｌのＴＥ／Ｔｗｅｅｎに再懸濁する。

【００９６】 ロードされたビーズを、高速セルソーター、好ましくは、４８８ｎｍで作動す
るアルゴンイオンレーザーを装備するＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｃｙｔ
ｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎ，ＣＯ）、または同様の装置を
使用して、ロードされていないビーズから識別する。識別の後、このロードされ
たビーズを、以下の反応成分と合わせることによってフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉ
ｎ）反応に供する：１０μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、０．４μｌの２５
ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの１％Ｔｗｅｅｎ ２０、２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（１０ユニット／ｍｌ）、および８６．６μｌのＨ₂Ｏ、最終反応容量１ ００μｌ。ボルテックスしながら１２℃で３０分間インキュベートした後、この
反応混合液を遠心分離し、その結果ビーズをペレット化し、そして上清を除去す
る。ペレット化されたビーズを、１５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、１．
５μｌの１％Ｔｗｅｅｎ ２０、１．５μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、１μｌのＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／１ｍｌ）、および１３１μｌのＨ₂Ｏか らなる連結緩衝液中に再懸濁し、最終反応容量１５０μｌを得る。この連結反応
混合液をボルテックスしながら３７℃で１時間インキュベートする。その後、ビ
ーズをペレット化し、そして１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む１×リン酸緩衝化生理食 塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄する。ビーズを４５μｌのＰＢＳ（１ｍＭのＣａＣｌ ₂ を含む）中に再懸濁し、６μｌのプロナーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と組み合
わせる。その後、この混合液を攪拌しながら３７℃で１時間インキュベートする
。遠心分離後、ロードしたビーズをＴＥ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、次いで１×
ＮＥＢ Ｄｐｎ ＩＩ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅ
ｒｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で１回洗浄する。

【００９７】 ビーズにロードされたタグ−ｃＤＮＡ結合体をＤｐｎ ＩＩで切断し、３’−
標識を保有する相補的なアダプターを連結する４つの核酸突出鎖を産生する。従
って、ロードされたビーズを、以下の成分からなる反応混合液に添加し、最終反
応容量１００μｌを得る：１０μｌの１０×ＮＥＢ Ｄｐｎ ＩＩ緩衝液、１μ
ｌの１％Ｔｗｅｅｎ、４μｌのＤｐｎ ＩＩ（５０ユニット／ｍｌ）、および８
５μｌのＨ₂Ｏ。この混合液をボルテックスしながら３７℃で一晩インキュベー トし、その後、このビーズをペレット化し、上清を除去し、そしてこのビーズを
１×ＮＥＢ緩衝液、番号３で１回洗浄する。自己連結を防ぐために、タグ−ｃＤ
ＮＡ結合体の突出鎖を、ホスファターゼ（例えば、子ウシ腸ホスファターゼ（Ｃ
ＩＰ））で処理し、５’リン酸を除去する。従って、ロードされたビーズは、以
下の成分から成る反応混合液に添加し、最終反応容量１００μｌを得る：１０μ
ｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号３、１μｌの１％Ｔｗｅｅｎ ２０、５μｌのＣ
ＩＰ（１０ユニット／μｌ）、および８４μｌのＨ₂Ｏ。得られた混合液をボル テックスしながら３７℃で１時間インキュベートし、その後、このビーズをペレ
ット化し、１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むＰＢＳで１回洗浄し、上記に記載したよう にプロナーゼで処理し、ＴＥ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、そして１×ＮＥＢ緩衝
液、番号２で１回洗浄する。

【００９８】 以下の３’−標識アダプター（配列番号７）を、従来の試薬（例えば、Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用し
て調製する：

【００９９】

【化７】 ここで、「ｐ」は５’リン酸基であり、そして「ＦＡＭ］は、市販されている３
’リンカー基（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の近傍の上位鎖
（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）の最後のヌクレオチドの３’炭素に付着したフルオレ
ッセン色素である。この連結を以下の反応混合液中で実行し、最終反応容量５０
μｌを得る：５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、０．５μｌの１％Ｔｗｅｅ
ｎ ２０、０．５μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、５ｍｌの３’−標識アダプター（
１００ｐｍｏｌ／μｌ）、２．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット
／μｌ）、および３６．５μｌのＨ₂Ｏ。この混合液をボルテックスしながら１ ６℃で一晩インキュベートし、その後、このビーズを１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む ＰＢＳで１回洗浄し、そして上記に記載したようにプロナーゼで処理する。この
初期連結の後、アダプターとタグ−ｃＤＮＡ結合体との間に残存するニックを、
以下に記載のように、キナーゼおよびリガーゼの両方で同時処置することによっ
て塞ぐ。ロードされたビーズを以下の成分から成る反応溶液中に再懸濁する：最
終反応容量の１５０μｌに対して、１５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、１
．５μｌの１％Ｔｗｅｅｎ ２０、１．５μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、２μｌの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μｌ）、１μｌのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（４００ユニット／μｌ）、および１２９μｌのＨ₂Ｏ。この混合液を ボルテックスしながら３７℃で１時間インキュベートし、その後、このビーズを
、上記に記載したようにしてプロナーゼで処理された１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む ＰＢＳで１回洗浄し、そしてＴＥ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する。

【０１００】 この標識鎖を、好ましくは、１５０ｍＭ ＮａＯＨでの処置によって溶解した
後、ビーズ上の参照ＤＮＡを、差示的発現遺伝子産物の競合的なハイブリダイゼ
ーションのために準備する。

【０１０１】 （実施例２：微粒子に付着させた酵母参照ＤＮＡ集団の調製） 本実施例において、ＹＪＭ９２０ ＭＡＴａ Ｇａｌ＋ＳＵＣ２ ＣＵＰ１株
のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、本質的にＷｏｄ
ｉｃｋａら（上述）により記載されるようにリッチ培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕ
ｍ）培養および最小培地培養に別々に増殖させる。両方の条件下で増殖させた細
胞から抽出されたｍＲＮＡを、タグ化し、採取し、増幅し、標識化し、そして微
粒子上にロードした参照ｃＤＮＡ集団を樹立するために用いる。ロードした微粒
子を、ＦＡＣＳにより単離し、標識を取り除き、そしてロードしたＤＮＡの非共
有結合鎖を、溶解し、そして取り除く。

【０１０２】 酵母細胞を、ＹＰＤ（酵母抽出物／ペプトン／グルコース、Ｂｕｆｆｅｒａｄ
、Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪ）からなるリッチ培地または最小培地（アミノ酸を含まな
い酵母窒素塩基、およびグルコースの、Ｂｕｆｆｅｒａｄ）のいずれかで３０℃
で増殖させる。細胞密度を、二連の希釈物由来の細胞を数えることにより測定し
、そして１ｍｌあたりの生細胞の数を、ｍＲＮＡ抽出のために細胞を集める直前
にＹＰＤアガー上に培養物を希釈したものをプレ−ティングすることにより推定
する。中間対数期の細胞（１〜５×１０⁷細胞／ｍｌ）を、ペレットにし、ＡＥ 緩衝溶液（５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．２、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄
し、ドライアイス−エタノールバス中で凍結させ、そして−８０℃で保存する。

【０１０３】 ｍＲＮＡを、参照ＤＮＡライブラリー構築および競合ハイブリダイゼーション
のためのＤＮＡ調製の両方のために以下のように抽出する。総ＲＮＡを、総ＲＮ
Ａを沈降する直前にクロロホルムイソアミルアルコール抽出物を添加して、Ｓｃ
ｈｍｉｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：３０９１
−３０９２（１９９０）に記載されるようなホットフェノール法を用いて凍結さ
せた細胞ペレットから、抽出する。Ｐｈａｓｅ−Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ（５Ｐｒｉｍ
ｅ−３Ｐｒｉｍｅ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）を、ＲＮＡ回収率を増加
させ、有機界面からの、材料とＲＮＡの潜在的な夾雑を減少させるために、全て
の有機抽出物に用いる。Ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴ選択工程（Ｏ ｌｉｇｏｔｅｘ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて、総Ｒ
ＮＡから精製する。

【０１０４】 リッチ培地および最小培地上で増殖させた細胞からの、各５μｇずつのｍＲＮ
Ａを、式Ｉのタグレパートリーを含むｐＵＣ１９に、ｃＤＮＡライブラリー構築
のために混合する。式Ｉのタグレパートリーを、Ｅｃｏ ＲＩおよびＢａｍ Ｈ
Ｉで消化し、そして同様に消化したｐＵＣ１９に挿入する。ｍＲＮＡを、第二鎖
合成時の式Ｉのものと同一であるＢｓｍ ＢＩ部位を生成する配列を含むオリゴ
−ｄＴプライマーを用いる市販のキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ，ＣＡ）で逆転写する。得られたｃＤＮＡを、Ｂｓｍ ＢＩおよびＤｐｎ
ＩＩで切断し、Ｂｓｍ ＢＩおよびＢａｍ ＨＩで消化した後にタグを含むｐＵ
Ｃ１９に挿入する。トラスフェクションおよびコロニー形成させた後、ｐＵＣ１
９形質転換体の密度を、約３０，０００のタグ−ｃＤＮＡ結合体を含むサンプル
を、獲得し得かつ培養物に展開し得るように決定する。あるいは、タグ−ｃＤＮ
Ａ結合体のサンプルを、約３０，０００のクローンを拾うことにより得、次いで
混合しそして培養物に展開する。

【０１０５】 プラスミドの標準的なミニプレップから、タグ−ｃＤＮＡ結合体を、デオキシ
シトシントリホスフェートを５−メチルデオキシシトシントリホスフェートで置
換したＰＣＲにより増幅する。ｐＵＣ１９中の隣接する配列に特異的な以下の１
９−マーの正方向プライマーおよび逆方向プライマー（配列番号８および配列番
号９）を反応に用いる：

【０１０６】

【化８】 ここで、「ＦＡＭ」は、アミノ結合（例えば、アミノリンカーＩＩ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を介した逆方向プライマーの５’末端に結合し
たフルオレセイン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＮＨＳエステルである。逆方向プライマーを、Ｎｏｔ Ｉ部
位が、二本鎖産物中に再構成されるように選択する。ＰＣＲ増幅の後、タグ−ｃ
ＤＮＡ結合体を、アビジン結合（ａｖｉｄｉｎａｔｅ）されたビーズ（例えば、
Ｍ−２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ））上
に単離する。

【０１０７】 洗浄後、ビーズに結合したｃＤＮＡを、Ｐａｃ Ｉで消化し、タグ−ｃＤＮＡ
結合を放出させ、オリゴヌクレオチドタグを一本鎖にするために、脱離反応を行
なう。反応を終了させた後、タグ−ｃＤＮＡ結合体を、フェノール−クロロホル
ム抽出により精製し、そして各タグ相補体が、５’ホスフェートを有するタグ相
補体を有する５．５ Ｏｍ ＧＭＡビーズと組み合わせる。ハイブリダイゼーシ
ョンを、それらの相補体と完全にマッチした二重鎖を形成するタグのみが連結さ
れるように、温度に安定なリガーゼの存在下、ストリンジェント条件下で行なう
。ＧＭＡビーズを洗浄し、そしてロードしたＧＭＡビーズを、ロードしたビーズ
を同定するために蛍光標識したｃＤＮＡを用いるＦＡＣＳソーティングにより濃
縮する。単離したビーズを蛍光標識を取り除くためにＰａｃ Ｉで処理し、その
後ビーズを非共有結合鎖を取り除くために従来のプロトコルを用いてＮａＯＨ溶
液中で加熱する。数回洗浄した後、ＧＭＡビーズを、競合ハイブリダイゼーショ
ンのために用意した。

【０１０８】 （実施例３：異なる増殖条件下に曝露した酵母のアップレギュレートおよびダ
ウンレギュレートされた遺伝子の単離および同定） 本実施例において、ｍＲＮＡを、各培養物中の細胞から抽出し、そして標識さ
れたポリヌクレオチドの２つの集団を、蛍光標識ヌクレオシド三リン酸の存在下
での逆転写酵素により、単回のｐｏｌｙ（ｄＴ）プライマーの伸長により産生す
る。次いで、等量の各々標識されたポリヌクレオチドを、競合ハイブリダイゼー
ションのための参照ＤＮＡ集団を有する実施例１のＧＭＡビーズと組み合わせ、
その後、ビーズをＦＡＣＳにより分析し、そして対角線にのっていない領域のビ
ーズをＭＰＳＳ分析のために集積する。

【０１０９】 蛍光ヌクレオシド三リン酸Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣＹ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）を、別々の反応でｐｏｌｙ（ｄＴ）₁₆プライマーを用いて、実施例
１に記載したように得た、１μｇのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡでの逆転写中にｃＤ ＮＡ中に組み込む。プライマーおよびＲＮＡを７０℃まで１０分間加熱した後、
反応混合物を、氷上に移し、そして２００Ｕ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇ
ｉｂｃｏ）、緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、および蛍光ヌクレオ
シド三リン酸からなる予め混合した溶液を、以下の濃度で添加する：５００μＭ
のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；２００μＭのｄＴＴＰ；および各々１
００ｍＭのＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣＹ５−ｄＵＴＰ。４２℃で２時間インキュ
ベーションした後、組み込まれなかった蛍光ヌクレオチドを、４７０μｌの１０
ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）／１ ｍＭ ＥＤＴＡでの反応混合物
の１度目の希釈、引き続いてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０コンセントレーター（Ａ
ｍｉｃｏｎ）を用いる約５μｌまでの濃縮により取り除く。両方の反応物から精
製した標識ｃＤＮＡを組み合わせ、そして１０μｇのｐｏｌｙ（ｄＡ）および０
．３μｌの１０％ＳＤＳを含む１１μｌの３．５×ＳＳＣ中に再懸濁する。ハイ
ブリダイゼーションに先立って、溶液を２分間沸騰させ、そして室温まで冷却し
、その後、溶液をＧＭＡビーズに添加し、そして６２℃で、約８〜１２時間イン
キュベートする。２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳで２回洗浄後、ＧＭＡビーズ
を、ＮＥＢ−２緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、ＭＡ）中に再懸濁し、そして分析およびソーティングするためにＣｏｕｌ
ｔｅｒ ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰ フローサイトメーター中にロードす
る。二次元蛍光強度等高プロットにおいて、ＧＭＡビーズは、図１ａに示すよう
なパターンを生じる。ソーティングパラメーターを、対角線にのっていない領域
（１１２）のＧＭＡビーズを識別するように、図１ｂに示すように設定し、そし
てＭＰＳＳ分析のために収集する。

【０１１０】 標識されたｃＤＮＡ鎖を、ＧＭＡビーズから溶解し、そして遠心分離により取
り除く。数回洗浄した後、プライマーを式Ｉに示すプライマー結合部位にアニー
ルさせ、そして上述したＤｐｎ ＩＩ部位を含むＧＭＡビーズ上に二本鎖ＤＮＡ
を再構築するために従来の重合反応で伸長させる。Ｄｐｎ ＩＩでの消化後、タ
グ−ｃＤＮＡ結合体をロードしたビーズを、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、（上述）に記
載されるように、ＭＰＳＳ分析のための機器中に配置する。

【０１１１】 ６４のコードアダプターの以下の１６のセット（配列番号１０〜配列番号２５
）の先端鎖を、標準的な方法を用いて自動ＤＮＡ合成装置（モデル３９２Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）で各々別々に合成
する。全てのアダプターについて同じである、後部鎖を別々に合成し、次いでそ
れぞれ先端鎖にハイブリダイズさせる。

【０１１２】

【化９】 ここでＮは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、またはｄＴのいずれかであり；ｐはリン酸基で
あり；そして小文字で示されるヌクレオチドは、１２マーのオリゴヌクレオチド
タグである。それぞれのタグは、６ヌクレオチドずつ互いに異なっている。各ア
ダプターの等しいモル量を、１０００ｐｍｏｌ／μＬの濃度の混合物を形成する
ようにＮＥＢ＃２制限緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に組み合わせる。

【０１１３】 １６タグ相補体の各々を、アミノ誘導されたオリゴヌクレオチドとして別々に
合成し、そしてポリエチレングリコールリンカー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を介してタグ相補体の５’末
端に結合するフルオレセイン分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇ
ｅｎｅ、ＯＲより入手可能なフルオレセインのＮＨＳ−エステルを用いる）でそ
れぞれ標識する。タグ相補体の配列は、単に、上記に列挙したタグの１２マーの
相補体である。

【０１１４】 アダプターの標的ポリヌクレオチドへのライゲーションを、５μｌのビーズ（
２０ｍｇ）、３μＬのＮＥＢ １０×リガーゼ緩衝液、５μのアダプター混合物
（２５ｎＭ）、２，５μＬのＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（２０００単位／μ
Ｌ）、および１４．５μＬの蒸留水からなる混合物中で行なう。混合物を、１６
℃で３０分間インキュベートし、その後ビーズをＴＥ（ｐＨ８．０）で３回洗浄
する。

【０１１５】 遠心分離してＴＥを取り除いた後、連結したアダプターの３’ホスフェートを
、製造者のプロトコルを用いて、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）でポリヌク
レオチド−ビーズ混合物を処理することにより取り除く。３’ホスフェートを取
り除いた後、ＣＩＰを、タンパク分解性消化（例えば、プロナーゼＴＭ（Ｂｏｅ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｉｅｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手
可能）または等価のプロテアーゼを製造者のプロトコルにしたがって用いて、不
活化し得る。次いで、ポリヌクレオチド−ビーズ混合物を洗浄し、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の混合物で処理し、標的ポリヌクレオチド
とアダプターとの間のギャップに５’ホスフェートを付加し、そして標的ポリヌ
クレオチドへのアダプターのライゲーションを完全にする。次いで、ビーズ−ポ
リヌクレオチド混合物を、ＴＥで洗浄する。

【０１１６】 これとは別に、標識されたタグ相補体の各々を、ポリヌクレオチド−ビーズ混
合物に、オリゴヌクレオチドタグとそれぞれのそれらの相補体との間にのみ完全
にマッチした二重鎖が形成され得るような条件下で添加する。その後、混合物を
ストリンジェント条件下で洗浄し、そして蛍光シグナルの存在または不在を測定
する。タグ相補体を、２５ｎＭのタグ相補体、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭ
ｇ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、からなる溶液に２０℃で添加
し、１０分間インキュベートし、次いで同じ溶液（タグ相補体を除く）で、５５
℃で１０分間洗浄する。

【０１１７】 ４つのヌクレオチドを上述のように同定した後、コードアダプターを、ポリヌ
クレオチドから製造者のプロトコルを用いてＢｂｖ Ｉを用いて切断する。最初
のライゲーションおよび同定の後、ライゲーション、同定および切断のサイクル
を標的ポリヌクレオチドの１６末端ヌクレオチドの配列を得るために、３回反復
する。

【０１１８】 好ましくは、ハイブリダイズしたコードアダプターの分析を、ｉ）ロードした
微粒子を、フローチャンバー内の平面のアレイに配置させる、ｉｉ）プロセス試
薬のフローチャンバーへのプログラムされた送達を可能にする、ｉｉｉ）粒子の
アレイからの光学的シグナルを同時に検出する機器で行なう。このような好まし
い機器を、図２に概略図で示し、そしてさらに詳しくは、Ｂｒｉｄｇｈａｍら、
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１２２４に開示される。手短に言えば、フロ
ーチャンバー（５００）を、ガラスプレート（５０６）中の液体注入口（５０２
）および排出口（５０４）を有するキャビティを、標準的な微細加工技術（例え
ば、Ｅｋｓｔｒｏｍら、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ９１／００３２７；Ｂｒｏｗ
ｎ、米国特許第４，９１１，７８２号；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．６４：１９２６−１９３２（１９９２）；など）を用いてエッチングするこ
とにより調製する。フローチャンバー（５００）の次元は、ロードした微粒子（
５０８）（例えば、ＧＭＡビーズ）が、１００，０００〜２００，０００のビー
ズの密接にパッキングされた平面の単層でキャビティ（５１０）に配置し得るよ
うな次元である。キャビティ（５１０）は、エッチングされたガラスプレート（
５０６）（例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ、米国特許第３，３９７，２７９号）上
のガラスカバースリップ（５１２）のアノード結合による注入口および排出口を
有する閉鎖したチャンバー内に作製する。試薬を、自動ＤＮＡおよびペプチド合
成機（例えば、Ｂｒｉｄｇｈａｍら、米国特許第４，６６８，４７９号；Ｈｏｏ
ｄら、米国特許第４，２５２，７６９号；Ｂａｒｓｔｏｗら、米国特許第５，２
０３，３６８号；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、米国特許第４，７０３，９１３号
；など）上で一般に用いられるマイクロプロセッサーにより制御されるバルブブ
ロック（５２２）を介してシリンジポンプ（５１４〜５２０）からフローチャン
バー中で計測される。

【０１１９】 ライゲーション、同定および切断の３サイクルを、フローチャンバー（５００
）内で、約１００，０００フラグメントの各末端に１２ヌクレオチドの配列を与
えるために行なう。フラグメントのヌクレオチドを、上述のコードアダプターに
タグ相補体をハイブリダイズすることにより同定する。特異的にハイブリダイズ
するタグ相補体を、レーザー、水銀アークランプなどであり得る光源（５２６）
からイルミネーションビーム（５２４）を用いてそれらの蛍光標識を励起させる
ことにより検出する。イルミネーションビーム（５２４）は、フィルター（５２
８）を通過し、そしてフローチャンバー（５００）内のコードアダプターに特異
的にハイブリダイズするタグ相補体上の蛍光標識を励起させる。得られる蛍光（
５３０）を、共焦点顕微鏡（５３２）により収集し、フィルター（５３４）を通
過させ、そしてＣＣＤカメラ（５３６）に方向付ける。このカメラは、ワークス
テーション（５３８）による処理および解析のためのビーズアレイの電気的画像
を作製する。好ましくは、各ライゲーションおよび切断の工程の後、ｃＤＮＡを
、プロナーゼＴＭまたは類似の酵素で処理する。約０．７５単位／ｍＬのコード
アダプターおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
）を、１６℃で約２０〜３０分間、毎分約１〜２μｌの流速でフローチャンバー
内を通し、その後、３’ホスフェートを、アダプターから取り除き、そしてｃＤ
ＮＡを、１５〜２０分間、毎分１〜２μＬの流速を用いて、３７℃でフローチャ
ンバー内を、０．０２単位／μＬのアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）および７単位／μＬの
Ｔ４ ＤＮＡキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の混合物を通過させることにより、第２鎖のライゲーション
のために調製する。ライゲーションを、２０〜３０分間フローチャンバーを通過
させるＴ４ ＤＮＡリガーゼ（０．７５単位／ｍＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により行
なう。２５ｎＭの濃度のタグ相補体を、１０分間２０℃で、毎分１〜２μＬの流
速でフローチャンバーを通過させ、その後、タグ相補体により運搬される蛍光標
識を、イルミネートし、そして蛍光を収集する。タグ相補体を、５５℃で１０分
間、毎分１〜２μＬの流速で、フローチャンバーにハイブリダイゼーション緩衝
液を通すことにより、コードアダプターから溶解する。コードアダプターを、３
７℃で２０分間、毎分１〜２μＬの流速で、１単位／μＬのＢｂｖ Ｉ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を通過さ
せることによりｃＤＮＡから切断する。

【０１２０】 （実施例４：フルオレセインおよびＣＹ５を用いて標識されたＤＮＡの異なる
比率でロードされる微粒子のＦＡＣＳ分析） この実施例において、異なる比率の別の仕方で標識されたｃＤＮＡの検出の感
度を、単一のクローンからなる、参照ＤＮＡ集団の構築、次いで異なる蛍光染色
により標識された異なる比率の相補鎖を、参照ＤＮＡ集団に競合的にハイブリダ
イズされることにより試験した。参照ＤＮＡ集団は、「８８．１１」と命名され
たｃＤＮＡクローンからなった。これは、受託番号ＴＩＢ ２０２のアメリカン
タイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から
入手可能な、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１の発現遺伝子の８７塩基対フラグメント
である。８８．１１のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｘｐｒｅｓｓｅ
ｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇライブラリーにおける多くの部分と高い相同性を
有する（例えば、ｇｂＡＡ８３０６０２（９８％））。８８．１１ｃＤＮＡのみ
からなる参照ＤＮＡ集団を、全ての微粒子が付着された同一のタグ相補体を有す
るという微粒子の特別な集団が調製されることを除いて、実施例１に記載される
ように調製した。この対応するオリゴヌクレオチドタグを、８８．１１ｃＤＮＡ
に付着した。従って、タグおよびタグ相補体の単一特異的集団のみが、実験に関
与した。競合ハイブリダイゼーションの後、ロードした微粒子を、上記のＣｙｔ
ｏｍａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．（Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）ＦＡＣＳ機器で分析
した。

【０１２１】 ８８．１１ｃＤＮＡをまた、タグ３３６を含まないことを除いて実施例１と同
一のベクター（図３ｂの３３０）にクローニングした。１０μｇのベクターＤＮ
Ａを、Ｄｐｎ ＩＩのアイソジマーであるＳａｕ ３Ａ（図３ｂの３４２）で完
全に切断することにより線状化し、その後精製された直線ＤＮＡの２つの１μｇ
のアリコートを得た。各１μｇのアリコートから約２０μｇの標識された一本鎖
ＤＮＡ生成物が、プライマー結合部位３３２に特異的なプライマーを用いる線状
増幅の反復サイクルにより生成された。１つのアリコートにおいて、生成物を、
ローダミンＲ１１０標識化ｄＵＴＰ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の取り込みにより標識化し；そしてもう
一方のアリコートにおいて、生成物をＣＹ５標識化ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）の取
り込みにより標識化した。標識された生成物の量を、２つの生成物の７つの５μ
ｇ量を１：１、２：１、１：２、４：１、１：４、８：１および１：８の割合で
形成するために、組み合わせた。５μｇ量の標識された生成物を、別々に、６５
℃で０．２％のＳＤＳを有する５０μｌの４×ＳＳＣ中で一晩、１．６×１０⁵ の粒子（８８．１１ｃＤＮＡを結合させたＧＭＡビーズ）にハイブリダイズさせ
、その後氷冷したＴＥ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液（上記で定義）での１０ｍｌまでの希
釈により反応を終了させた。ロードした微粒子を、遠心分離し、６５℃で１５分
間０．２％ＳＤＳを有する０．５ｍｌの１×ＳＳＣ中に懸濁することにより洗浄
し、遠心分離し、そして５５℃で１５分間０．２％ＳＤＳを有する０．５ｍｌの
０．１×ＳＳＣ中に懸濁して再度洗浄した。２回目の洗浄後、微粒子を、遠心分
離し、そしてＦＡＣＳ分析のために０．５ｍｌのＴＥ／Ｔｗｅｅｎ溶液中に再懸
濁した。

【０１２２】 その結果を、図５ａ〜５ｅに示す。ここで、各図の垂直方向の軸は、ＣＹ５蛍
光に対応し、そして水平方向の軸は、ローダミンＲ１１０蛍光に対応する。図５
ａにおいて、相補的参照鎖にハイブリダイズした全てのＲ１１０標識化ＤＮＡま
たは全てのＣＹ５標識化ＤＮＡのいずれかを有する微粒子の集団を組み合わせた
。５５０および５５２の等高線は、ＦＡＣＳ機器の検出システムにより、明確に
識別され、そして両方の集団の微粒子は、容易に検出可能なシグナルを産生した
。図５ｂは、Ｒ１１０標識化鎖およびＣＹ５標識化鎖が、同じ比率でハイブリダ
イズされる場合を示す。期待されるように、得られた等高線は、グラフの対角線
上に位置し、そして非調節遺伝子について予期される位置と対応する。図５ｃ〜
図５ｅは、競合ハイブリダイゼーションの３対の分析を示す：ｉ）Ｒ１１０標識
化鎖およびＣＹ５標識化鎖が、２：１の濃度比および１：２の濃度比でハイブリ
ダイズされる、ｉｉ）Ｒ１１０標識化鎖およびＣＹ５標識化鎖が、４：１の濃度
比および１：４の濃度比でハイブリダイズされる、ならびにｉｉｉ）Ｒ１１０標
識化鎖およびＣＹ５標識化鎖が、８：１の濃度比および１：８の濃度比でハイブ
リダイズされる。図５ｃのデータは、２の因子によりアップレギュレートされる
遺伝子またはダウンレギュレートされる遺伝子が、本実施態様において検出可能
であるが、有意な重複が、調節遺伝子および非調節遺伝子により生成されるシグ
ナル間に存在し得ることを示唆する。図５ｄおよび５ｅは、４またはそれ以上の
因子により、アップレギュレートされる遺伝子またはダウンレギュレートされる
遺伝子が、非調節遺伝子に関して容易 に検出可能であることを示唆する。

【０１２３】 （実施例５：刺激ＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞から示差的に発
現された遺伝子のＦＡＣＳ分析） 本実施例において、微小粒子に付着した参照ＤＮＡ集団を、以下に示されるよ
うに刺激されたＴＨＰ−１細胞由来のｃＤＮＡから構築した。次いで、刺激され
たＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞の両方に由来する等濃度の標識ｃ
ＤＮＡを、実施例１に記載のように参照ＤＮＡ集団と競合的にハイブリダイズし
、そして標識ｃＤＮＡを運搬する微小粒子をＦＡＣＳ装置で分析した。ＴＨＰ−
１細胞をホルボール１２−ミリステート１３−酢酸（ＰＭＡ）およびリポ多糖（
ＬＰＳ）での処理により刺激した。

【０１２４】 ＴＨＰ−１細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｏ．２
６１４０−０３８）、１００単位（ｕｎｉｔ）／ｍｌのペニシリン、１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｏ．１５１４０−１２２）、およ
び０．５μＭのβメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｍ３１４８）を補
った５０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｏ．１１３２０−０３３
）を含むＴ−１６５フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｎｏ．３１５１）中で増殖した。
培養は、１×１０⁵細胞／ｍｌを接種し、そして１×１０⁶の最大密度まで増殖し
た。培養の細胞集団の倍増時間は、約３６時間であった。細胞を以下のようにＰ
ＭＡで処理した：フラスコからの細胞（約５×１０⁷細胞）を１２００ｒｐｍで ５分間、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６Ｒモデル）し、そしてＤＭＳＯ（
Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．２１９８５−０２３）中の５μｌの１．０ｍＭ ＰＭＡ（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｐ−８１３９）を含む、または５μｌのＤＭＳＯ（非刺激の集
団の場合）を含む５０ｍｌの新鮮培養培地（抗生物質なし）中に再懸濁し、その
後この細胞を４８時間培養した。４８時間の培養の後、培地および非定着細胞を
実験フラスコから吸引し（すなわち、刺激された細胞を含んでいる）、そして新
鮮培地（抗生物質なし）を加えた（この新鮮培地は、リン酸緩衝化生理食塩水（
ＰＢＳ）に１０μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ｌ−４１３０
）を含有している）。非刺激細胞の培養物を、４℃で１２００ｒｐｍ、５分間遠
心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６Ｒモデル）して、ペレットを形成し、次いで
これを１０μｌのＰＢＳを含む新鮮増殖培地の５０ｍｌに再懸濁した。刺激細胞
、および非刺激細胞の両方の培養物を４時間３７℃でインキュベートし、その後
、細胞を以下のように回収した：培地を培養物から吸引し、そして定着した細胞
を温めたＰＢＳで２回洗浄し、その後１０ｍｌのＰＢＳを添加し、そして細胞を
セルスケーパーで取り出した。取り出した細胞を収集し、そしてその濃度を血球
計算器で決定し、その後それらを１２００ｒｐｍで５分間、遠心分離（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ ＧＳ−６Ｒモデル）して、ペレットを形成し、これを直ちにＲＮＡ抽出
のために用いた。

【０１２５】 ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ単離のためのＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０ｋｉｔ（Ｎｏ．
Ｋ１５９３−０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
）を用いて約５×１０⁶の細胞から抽出した。製造業者のプロトコールに有意な 変化なく従った。微小粒子に付着した参照ＤＮＡ集団を、実施例１に記載のよう
に刺激細胞から抽出したｍＲＮＡから構築した。別のｃＤＮＡライブラリーを、
刺激細胞および非刺激細胞から抽出したｍＲＮＡから構築した。ライブラリーの
ために用いたベクターは、オリゴヌクレオチドタグを含まないことを除いては、
実施例１のベクターと同一であった（図３ｂの３３６）。実施例４のプロトコー
ルに従って、ローダミンＲ１１０標識された１本鎖ＤＮＡの約２．５μｇを刺激
細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから作製し、そしてＣＹ５標識された一本鎖Ｄ
ＮＡの約２．５μｇを非刺激細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから作製した。２
．５μｇのアリコートの２つを混合し、そして９．３４×１０⁵の微小粒子上の 参照ＤＮＡに対して競合的にハイブリダイズした。反応条件およびプロトコール
は実施例４に記載した。

【０１２６】 ハイブリダイゼーション後、この微小粒子を、上記のようにＣｙｔｏｔｎａｔ
ｉｏｎ，Ｉｎｃ．のＭｏＦｌｏ ＦＡＣＳ装置で選別した。図６は、２つの蛍光
性色素について異なる蛍光強度の値を有する微小粒子の周波数の従来のＦＡＣＳ
カウンタープロット６００を含む。上方制御された遺伝子に対応する約１０，０
００の微小粒子（図６のソートウインドウ６０２）を単離し、そして下方制御さ
れた遺伝子に対応する約１２，０００の微小粒子（図６のソートウインドウ６０
４）を単離した。上記のように、標識した鎖をメルトオフ（ｍｅｌｔ ｏｆｆ）
した後、微小粒子により運搬されるｃＤＮＡを市販のＰＣＲクローニングキット
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）
を用いて増幅し、製造業者の推薦するクローニングベクターにクローニングした
。形質転換、宿主培養の増殖、およびプレーティングをした後、上方制御された
ｃＤＮＡの８７のコロニーを選び出（ｐｉｃｋ）し、そして下方制御したｃＤＮ
Ａの７３のコロニーを選び出した。これらのコロニーから抽出したプラスミドに
より運搬されるｃＤＮＡをＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの３７
３モデル、自動ＤＮＡシーケンサーの従来のプロトコールを用いて配列決定した
。同定した配列を表１および２に列挙した。

【０１２７】

【表１】

【０１２８】

【表２】 （実施例６：刺激ＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞由来の示差的発
現遺伝子のＦＡＣＳ分析） （実験：Ｃｏｍｐ １１） 微小粒子に付着した参照ＤＮＡ集団を刺激ＴＨＰ−１細胞由来のｃＤＮＡから
構築した。刺激ＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞由来のｃＤＮＡを、
以下のように競合的ハイブリダイゼーションのために調製した。ＴＨＰ−１非刺
激プローブライブラリー（Ｕ３Ａ−ＴＬ）およびＴＨＰ−１刺激プローブライブ
ラリー（Ｓ３Ａ−ＴＬ）のそれぞれ２０μｇを、直線ＰＣＲ（ｌｉｎｅａｒ Ｐ
ＣＲ）のためのベクターを調製するために５０単位のＳａｕ３Ａで消化した。こ
のＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、ＰＣＲにより蛍光標識
した。補正の目的ために、ＣＹ５およびＲ１１０の両方をそれぞれの条件を標識
するために用いた。

【０１２９】 Ｕ３Ａ−ＴＬのＤＮＡをＣＹ５で標識し、そしてＳ３Ａ−ＴＬのＤＮＡをＲ１
１０で標識した。簡略に言えば、反応混合物には以下を含む：８０μｌの１０×
ＰＣＲ緩衝液；１６μｌのビオチン化プライマー（Ｂ−プライマー、１２５ｐｍ
ｏｌｅ／：ｌ）；１６μｌのｄＮＴＰｓ（６．２５ｍＭ）；４μｇのテンプレー
ト；１６μｌのＫｌｅｎｔａｑ酵素；６４μｌのＲ１１０ ｄＵＴＰまたは６．
４μｌのＣＹ５ ｄＵＴＰ；および総容量８００μｌにするための水。この混合
物を８つのアリコートに分配し、次いで、以下のプロトコールに従って３４サイ
クルのＰＣＲを実施した：１）９４℃３分；２）９４℃３０秒；３）６２℃３０
秒；４）７２℃１分；そして５）７２℃１０分。このＰＣＲ反応物を精製し、そ
して着色したヌクレオチドを沈殿することにより除去した。

【０１３０】 （参照集団） Ｃｏｍｐ１１のビーズライブラリーは、ＴＨＰ−１刺激ライブラリー由来の百
万クローンの複雑性を有する２，６６７，３６９のビーズからなる。このビーズ
は、図３に概説で上記したように調製した。ＦＩＴＣシグナルのためのＰＭＴ２
平均の開始は、１９．５であった。ビーズ上の二本鎖ＤＮＡを中度のボルテック
スで、１５分間の室温（ＲＴ）での２．５ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＯＨ洗浄で変
性した。変性化の効率を、２．２（すなわち、１１．３％の残余の蛍光）である
残りのＦＩＴＣシグナル平均を測定することにより決定した。このビーズを０．
５ｍｌの４×ＳＣＣ ０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。

【０１３１】 （競合的ハイブリダイゼーション） １００，０００のビーズをＣＹ５で標識した刺激プローブライブラリー（Ｓ３
Ａ−ＴＬ）、およびＲ１１０で標識した同じライブラリーのそれぞれの直線ＰＣ
Ｒ産物の１０μｇでハイブリダイズした。９３６，５４２のビーズをＣＹ５刺激
プローブの１０μｇおよびＲ１１０非刺激プローブの１０μｇでハイブリダイズ
した。このビーズを、４×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの最終緩衝液組成物の５０μ
ｌ中に集めた。このサンプルを３分間８０℃に熱し、プローブを添加し、そして
温度を６５℃に変更した。ハイブリダイゼーションは、ボルテックスしながら１
６時間持続した。このビーズを１０ｍｌのＴＥ Ｔｗｅｅｎに氷急冷した。回収
したサンプルを１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回リンスし、０．５ｍｌの１×
ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳに再懸濁し、そして１５分間、６５℃で洗浄した。この
ビーズを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中でリンスし、そして１５分間、０．
１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５５℃で洗浄した。このサンプルをＴＥ Ｔｗ
ｅｅｎでリンスし、そして両方のサンプルの１０，０００事象をＢＤ Ｆａｃｓ
Ｃａｌｉｂｅｒで分析した。１０，１６３ビーズ（１．１５％）（１：１の対角
線から外れた最も鮮明なＣＹ５）を選別した。１１，９７７ビーズ（１．３５％
）（１：１の対角線から外れた最も鮮明なＲ１１０）を選別した。このビーズを
ＰＣＲ反応物にプールし、ＴＡクローン化し、そしてＴＡ配列決定した。同定さ
れた配列を表３および４に列挙する。

【０１３２】

【表３】

【０１３３】

【表４】 （実施例７：刺激ＴＨＰ−１細胞および非刺激ＴＨＰ−１細胞由来の示差的発
現遺伝子のＦＡＣＳ分析） （実験：Ｃｏｍｐ １４） 別の実験において、参照ＤＮＡ集団調整物および競合的ハイブリダイゼーショ
ンを実施例６に記載のように行った。９１５０ビーズ（０．８９％）（１：１の
対角線から外れた最も鮮明なＣＹ５）を選別した。１１０８５ビーズ（１．１５
％）（１：１の対角線から外れた最も鮮明なＲ１１０）を選別した。同定された
配列を表５および６に列挙する。

【０１３４】

【表５】

【０１３５】

【表６】 （実施例８：刺激されたＴＨＰ−１細胞または刺激されないＴＨＰ−１細胞よ
り示差的に発現された遺伝子のＦＡＣＳ分析） （実験：Ｃｏｍｐ１５） 別々の実験において、刺激されたＴＨＰ−１細胞および刺激されないＴＨＰ−
１細胞由来のｃＤＮＡを、実施例６に記載のように、競合的ハイブリダイゼーシ
ョンのために調製した。ＴＨＰ−１刺激されたライブラリーおよびＴＨＰ−１刺
激されないライブラリー（それぞれ５０％）由来の１００万クローンの複雑性を
有する、２，５７０，０００ビーズからなるＣｏｍｐ１５ビーズライブラリーを
除いて、実施例６に記載のように、参照ＤＮＡ集団を調製した。１３，９８８ビ
ーズ（０．８７％）（１：１対角線から離れた最も明るいＣＹ５）を選別した。
１７，３９３ビーズ（１．０８％）（１：１対角線から離れた最も明るいＲ１１
０）を選別した。同定された配列を表７および８に列挙する。

【０１３６】

【表７】

【０１３７】

【表８】 （実施例９：刺激されたＴＨＰ−１細胞由来の希遺伝子の単離） （実験：Ｃｏｔ３） この実施例において、低い相対強度のビーズを収集することによって、希遺伝
子（ｒａｒｅ ｇｅｎｅ）を、刺激されたＴＨＰ−１細胞から単離する。ビーズ
ライブラリーおよびプローブライブラリーを、ホルボールエステルで処理したＴ
ＨＰ−１培養細胞から調製されるｍＲＮＡから構築した。６つのビーズライブラ
リー（１６０Ｋ複雑性）をＢＰ１１組み合せタグ化ビーズに２回ロードした。計
１，２６０，０００ビーズを選別した。このビーズを充填し、連結した。ビーズ
鎖の先端鎖を、室温で１５分間穏かにボルテックスしながら、２．５ｍｌの１５
０ｍＭ ＮａＯＨで洗浄して除去した。このビーズを、０．５ｍｌの４×ＳＳＣ
／０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。１００，０００ビーズを、５０ｎｇのＣＹ
５標識化プローブ（刺激されたＴＨＰ−１細胞由来）を用いて、４×ＳＳＣ／０
．１％ＳＤＳ中、６５℃で、一晩ハイブリダイズした。回収したサンプルを、１
×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回すすぎ、０．５ｍｌの１×ＳＳＣ／０．１％Ｓ
ＤＳ中に再懸濁し、そして６５℃で１５分間洗浄した。次いで、このビーズを０
．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳですすぎ、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤ
Ｓ中５５℃で１５分間洗浄した。９８，８８０クローンを分析し、そしてフロー
サイトメトリによって選別した。サンプルＣＴ００３Ｅは、ほとんどどのＣＹ５
プローブにもハイブリダイズしない１２６クローンを含んだ。サンプルＣＴ００
３Ｆは、対角線へ移動するのに十分なプローブを見出さなかった１５５７クロー
ンを含んだ。これらのビーズは、本発明者らのプローブライブラリーにおいて、
最も少ない頻度のコピーを含んだ。各ゲートからの５０クローン（図７を参照の
こと）を配列分析のために選抜した。この同定された配列を表９に列挙する。

【０１３８】

【表９】 （実施例１０：ヒト骨髄由来の希遺伝子の単離） ビーズライブラリーおよびプローブライブラリーを市販の骨髄由来ｍＲＮＡか
ら構築した。ＢＰ １２組み合せタグ化ビーズに、６つのビーズライブラリー（
１６０Ｋ複雑性）を２回ロードした。それらは、混合物２１６、２１７、２１８
および２１９を形成した。計３，１５０，０００ビーズを選別した。このビーズ
を充填しそして連結した。混合物２１７の先端鎖をＮａＯＨで除去した。ＣＹ５
ヌクレオチドを用いてＣＴ１骨髄プローブを直線状に増幅し、次いで精製した。
２００，０００ビーズを、５ｎｇおよび５０ｎｇのプローブを用いて６５℃で一
晩、ハイブリダイズした。５ｎＧハイブリダイゼーションから生じた１８０，０
００クローンを問い合わせて、そして選別した。サンプルＣＴ００１は、ほとん
どどのＣＹ５プローブもハイブリダイズしない９９６クローンを含んだ。ＣＴ０
０２サンプルは、対角線に移動するのに十分なプローブを見出さなかった１９９
８クローンを含んだ。これらのビーズは。本発明者らのプローブライブラリーに
おいて最も少ない頻度のコピーを含んだ。各ゲート由来の２００クローン（図８
を参照のこと）を配列分析のために選抜した。

【０１３９】 （実施例１１：正常なヒト筋肉組識およびグルコース欠乏ヒト筋肉組識由来の
示差的に発現された遺伝子のＦＡＣＳ分析） ２つの状態における筋肉組識から調製したｍＲＮＡより、ビーズライブラリー
およびプローブライブラリーを構築した：グルコース正常（基本）およびグルコ
ース欠乏（クランプ）。グルコース正常状態由来の６つのビーズライブラリー（
１６０Ｋ複雑性）を、ＢＰ １２組み合わせタグ化ビーズにロードし、混合物２
３７を形成した。計８１０，０００のビーズを選別した。このビーズを充填し、
そして連結した。このビーズを、ＤｐｎＩＩ酵素を用いて消化し、そして共有結
合的に付着させたＤＮＡ鎖に対して逆の鎖上で、ＦＩＴＣと共にアダプターと連
結させた。混合物２１７の先端鎖をＮａＯＨで除去した。ＣＴ１グルコース正常
プローブ（１３，５１０，０００複雑性）を、ＣＹ５ヌクレオチドを用いて線状
に増幅し、次いで精製した。ＣＴ２グルコース星型プローブ（ｓｔａｒｒｅｄ
ｐｒｏｂｅ）（７，１３２，０００複雑性）をＲ１１０ヌクレオチドを用いて線
状に増幅し、次いで精製した。２５０，０００ビーズを５ｕｇの各プローブを用
いて６５℃で一晩、ハイブリダイズした。２３０，０００クローンを問い合わせ
、そして選別した。サンプルＵＰ００１は、アップレギュレートされる９６８ク
ローンを含んだ。サンプルＤＮ００１は、ダウンレギュレートされる１６５２ク
ローンを含んだ。各ゲートからの１０００クローン（図９を参照のこと）を、配
列分析のために選抜した。同定された配列を表１０および１１に列挙する。

【０１４０】

【表１０】

【０１４１】

【表１１】 本明細書中に言及される全ての刊行物および特許明細書は、各個々の刊行物ま
たは特許明細書が、特定のおよび個々に参考として援用されるように示されるの
と同じ程度まで、本明細書中において参考として援用される。

【０１４２】 本発明は、今や十分に記載されている。多くの変更および改変が、添付の特許
請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者に
は明らかである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａおよび図１Ｂは、２つの異なる蛍光色素でラベルされた競合的にハイブ
リダイズされるＤＮＡ鎖をロードされた微小粒子のＦＡＣＳ分析を示す。

【図２】 図２は、配列決定のための制限フラグメントでロードされた微小粒子の平面ア
レイを観察するための、フローチャンバーおよび検出装置の略図である。

【図３Ａ】 図３Ａは、単離されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡへの転換
、およびそのｃＤＮＡのタグ含有ベクター内への挿入のための好ましい模式図を
示す。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、ベクターからのタグｃＤＮＡ結合体の増幅、およびその増幅された
結合体の微小粒子状へのロードのための好ましい模式図を示す。

【図３Ｃ】 図３Ｃは、クローニングおよび配列決定のための分類されたｃＤＮＡを単離す
るための好ましい模式図を示す。

【図４Ａ】 図４Ａは、ＦＡＣＳ分類により単離された差示的に発現されるｃＤＮＡのクロ
ーニングのための、代替的手順を示す。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、ＦＡＣＳ分類により単離された差示的に発現されるｃＤＮＡのクロ
ーニングのための、代替的手順を示す。

【図５】 図５Ａ〜Ｅは、所定の比の２つの差示的に標識されたｃＤＮＡを保持する微小
粒子のフロー分析のデータを示す。

【図６】 図６は、刺激されたＴＨＰ−１細胞および刺激されないＴＨＰ−１細胞由来の
差示的に標識されたｃＤＮＡを保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。

【図７】 図７は、刺激されたＴＨＰ−１細胞中の低い存在度のｍＲＮＡに由来する、標
識されたｃＤＮＡを保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。

【図８】 図８は、ヒト骨髄中の低い存在度のｍＲＮＡに由来する、標識されたｃＤＮＡ
を保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。

【図９】 図９は、グルコース正常筋肉組織およびグルコース飢餓筋肉組織に由来する、
差示的に標識されたｃＤＮＡを保持する微小粒子のフロー分析のデータを示す。

【図１０Ａ】 図１０Ａは、微小粒子上の参照核酸集団の構築のための、本発明の実施態様を
示す。

【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、図１０Ａの参照ライブラリーを使用して、２つの細胞集団の遺伝
子発現を比較するための実施態様を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月５日（２０００．２．５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００４】 種々の技術は、広範に異なる遺伝子発現を分析するために利用可能であり、こ
れらの技術は、簡便さ、費用、および感度において広範に異なる。一般的に使用
される低分解能技術は、差次的な表示、指数化、サブトラクションハイブリダイ
ゼーション、および多数のＤＮＡフィンガープリント技術（例えば、Ｖｏｓら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：４４０７〜４４１４（
１９９５）；Ｈｕｂａｎｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
、２２：５６４０〜５６４８（１９９４）；Ｌｉｎｇｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
５７：９６７〜９７１（１９９２）；Ｅｒｌａｎｄｅｒら、国際特許公開 ＷＯ
９５／１３３６９；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄら、米国特許第５,４３７,９７５号；
Ｕｎｒａｕら、Ｇｅｎｅ、１４５：１６３〜１６９（１９９４）など）を含む。
高分解能技術は、発現された配列タグ（ＥＳＴ）の分析（例えば、Ａｄａｍｓら
、（上記に言及される）；Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （Ｓ
ＡＧＥ）、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４８４
〜４８６（１９９５）；Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：１２６８〜１
２７２（１９９７）；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ、８８：２４３〜２５
１（１９９７））；および発現された遺伝子から相補的なポリヌクレオチドを捕
獲するためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの微小アレイ（ｍｉｃ
ｒｏａｒｒａｙ）の使用（例えば、Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：
４６７〜４６９（１９９５）；ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８：６８
０〜６８６（１９９７）；Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：６１０〜６１
４（１９９６）など）を含む。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２９】 好ましくは、ＲＮＡ由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ分子のクローン亜集団は
、図３ａおよび図３ｂに例示されるプロセスを使用して微粒子に付着される。初
めに、図３ａに例示されるように、ｍＲＮＡ（３００）は、目的の細胞または組
織供給源から従来の技法を用いて抽出され、そしてベクター（３１６）中への挿
入に適切な末端を有するｃＤＮＡ（３０９）へ変換される。好ましくは、５’ビ
オチン（３０５）およびポリ（ｄＴ）領域（３０６）を有するプライマー（３０
２）は、ｃＤＮＡ（３０９）の第一鎖が、４つのデオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートの存在下において、逆転写酵素で合成されるために、ｍＲＮＡ鎖（
３００）とアニーリングされる。好ましくは、５−メチルデオキシシチジントリ
ホスフェートは、ｃＤＮＡ（３０９）がプライマー（３０２）に対応する領域を
除いて、半メチル化されるために、第一鎖合成におけるデオキシシトシントリホ
スフェートの代わりに用いられる。これは、プライマー（３０２）が支持体から
ｃＤＮＡを解離するために非メチル化制限部位を含むことを可能にする。プライ
マー（３０２）におけるビオチンの使用は、本発明に重大ではなく、そして他の
分子捕捉技法、または部分（例えば、三重鎖捕捉など）が用いられ得る。プライ
マー（３０２）の領域（３０３）は、好ましくは、ｃＤＮＡ（３０９）の第二鎖
の合成で制限部位ｒ₂（３０４）の形成を生じるヌクレオチドの配列を含む。ス トレプトアビジン支持体（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−２８０（Ｄｙｎａ
ｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）など）にビオチン化ｃＤＮＡを結合することによ
って単離した後、ｃＤＮＡ（３０９）は、好ましくは、（Ｃの）半メチル化には
非感受性で、そして部位ｒ₁（３０７）を認識する制限エンドヌクレアーゼで切 断される。好ましくは、ｒ₁は、実質的に全てのｃＤＮＡが切断されること、お よび同一の規定された末端が全てのｃＤＮＡにおいて生成されることを保証する
４塩基認識部位（例えば、ＤｐｎＩＩなどのような酵素に相当する）である。洗
浄後、次いで、このｃＤＮＡは、ｒ₂を認識する制限エンドヌクレア−ゼを用い て切断され、例えば、エタノール沈殿、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの
標準的な技法を用いて精製されるフラグメント（３０８）を放出する。適切な緩
衝液中に再懸濁後、フラグメント（３０８）は、タグ（３１０）ならびに末端（
３１２）および末端（３１４）を有するクローニング部位を保有するベクター（
３１６）中へ定方向的にライゲーションされる。好ましくは、ベクター（３１６
）は、クローニング部位において「スタッファー（ｓｕｔａｆｆｅｒ）」フラグ
メントを用いて調製され、クローニングのために完全に切断されたベクターの単
離を援助する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４５】 オリゴヌクレオチドタグは、本発明の特定の実施態様における２つの異なる目
的のために使用される：オリゴヌクレオチドタグは、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許
第５，６０４，０９７号；および国際特許公開ＷＯ９６／４１０１１に記載され
たような固相クローニングを実施するために使用される、ここで多数（例えば、
数千から数十万）のポリヌクレオチドは、分析のために混合物から１つ以上の固
相支持体上の同一のポリヌクレオチドのクローン亜集団へ分類され、そしてそれ
らは、例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許公開ＷＯ９７／４６７０４に開示
されるような、数十から数千の数の範囲に達するアダプターをコードするような
ポリヌクレオチドを同定するための標識を送達する（または許容する）ために使
用される。前者の使用に関して、代表的には、多数、またはレパートリーのタグ
が必要とされ、そのために個々のオリゴヌクレオチドタグの合成は困難である。
これらの実施態様において、このタグの組み合わせの合成が好ましい。他方、例
えば、２から数十の範囲における複数の種類または亜集団の（例えば、アダプタ
ーをコードした）ポリヌクレオチドに対する標識を送達するために極端に多くの
レパートリーのタグが、必要とされない場合、最小クロスハイブリダイズ形成セ
ットのオリゴヌクレオチドタグは、個別に合成、および組み合わせで合成され得
る。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４６】 数百から数千（またはさらに数万）のオリゴヌクレオチドを含むセットは、例
えば、Ｆｒａｎｋら米国特許第４，６８９，４０５号；Ｆｒａｎｋら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：４３６５−４３７７（１９８３
）；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４：１１０−１１６（
１９９５）；Ｆｏｄｏｒら、国際特許公開ＷＯ９３／２２６８４；Ｐｅａｓｅら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：５０２２−５０２６（１９
９４）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５：２１７
−２２７（１９９４）、Ｂｒｅｎｎａｎ、国際特許公開ＷＯ９４／２７７１９；
Ｌａｓｈｋａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：７９１
２−７９１５（１９９５）；などに開示されるような種々の並行合成のアプロー
チによって直接合成され得る。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７５】 （大規模並行サイン配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉ
ｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ））によって識別された遺伝
子の同定） 発現された遺伝子は、ＭＰＳＳによって並列して同定され得る。ＭＰＳＳは、
以下の２つの技術の組み合わせである：並列処理のためにＤＮＡフラグメントを
タグ化し、そして識別するための技術（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら、国際公開第
ＷＯ９６／４１０１１号）、およびＤＮＡフラグメント末端を段階的に配列決定
するための別の技術（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，５９９，６７５
号およびＡｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許公開第ＷＯ９７／４６７０４号）。標的
ポリヌクレオチドの第１の制限エンドヌクレアーゼでの初期消化の後、制限フラ
グメントを、以下およびＢｒｅｎｎｅｒら、国際公開第ＷＯ９６／４１０１１号
に記載されるようにオリゴヌクレオチドタグに連結し、その結果、得られたタグ
フラグメント結合体をサンプリングし、増幅し、そしてオリゴヌクレオチドタグ
の、それらのタグ相補体との特異的なハイブリダイゼーションによって分離固相
支持体上で識別し得る。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７６】 一旦、ＤＮＡフラグメントの増幅サンプルが、固相支持体上で識別され、実質
的に同一なフラグメントの均一集団を形成すると、フラグメントの末端は、好ま
しくは、アダプターに基づいた方法（連結、同定、および切断の反復サイクルを
含むＤＮＡ配列決定（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，５９９，６７５
号に記載される方法））を用いて配列決定される。さらに好ましくは、配列決定
方法に使用されるアダプターの各々は、Ａｌｂｒｅｃｈｔら、国際特許公開第Ｗ
Ｏ９７／４６７０４に教示されるように、突出鎖（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ ｓｔ
ｒａｎｄ）、およびオリゴヌクレオチドの最小の交差ハイブリダイズするセット
から選択されたオリゴヌクレオチドタグを有する。このようなアダプターは、本
明細書中で「コード化アダプター（ｅｎｃｏｄｅｄ ａｄａｐｔｏｒ）」と呼ば
れる。コード化アダプターの突出鎖がフラグメントの相補的突出鎖と完全に一致
した二重鎖を形成するコード化アダプターが、リガンドである。連結後、突出鎖
のヌクレオチドの同一性および順序が決定されるか、あるいは標識化されたタグ
相補体または連結されたアダプター上の対応タグに対する「デコーダー（ｄｅ−
ｃｏｄｅｒ）」と特異的にハイブリダイズすることによって「解読」される。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７８】 （従来の配列決定による識別された遺伝子の同定） 微粒子によって保有される遺伝子産物は、従来のＤＮＡ配列決定プロトコルを
使用して識別後（例えば、ＦＡＣＳによって）、同定され得る。このような配列
決定のための適切なテンプレートは、差示的に発現された遺伝子産物を保有する
識別された微粒子から開始するいくつかの異なる方法において生成され得る。例
えば、単離された微粒子に付着された参照ＤＮＡは、サイクル配列決定（ｃｙｃ
ｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって標識された伸長産物を生成するために使
用され得る（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９６／１２０３９号によ
って教示されるように）。この実施態様において、プライマー結合部位（４００
）は、（図４ａに示されるように）参照ＤＮＡ（４０２）中にタグ相補体（４０
６）に対して遠位に操作される。例えば、別のマイクロターターウェルなどに分
類することによって微粒子を単離した後、差示発現された鎖を溶解する。プライ
マー（４０４）を加え、そして標識された伸長産物を形成するように、従来のサ
ンガー配列決定反応を実行する。次いで、これらの産物は、配列決定にために、
電気泳動などの技術よって分離される。同様の実施態様において、配列決定のテ
ンプレートは、個々の微粒子を識別することなく産生され得る。プライマー結合
部位（４００）および（４２０）は、プライマー（４０４）および（４２２）を
使用するＰＣＲによってテンプレートを生成するために使用され得る。次いで、
このテンプレートを含む、得られた単位複製配列は、従来の配列決定ベクター（
例えば、Ｍ１３）中にクローン化される。形質移入の後、宿主をプレートし、そ
して配列決定のために個々のクローンを選択する。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８１】 約５μｇのｍＲＮＡのペレットを、１０μｌの５×ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ緩
衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、お
よび１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（または同様の逆転写酵素 緩衝液）、５μｌの０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５μｌの３ｄ
ＮＴＰ／メチル−ｄＣＴＰ混合物（１０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
、および５−メチル−ｄＣＴＰ、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
から入手可能）、１μｌ ＲＮａｓｉｎ、１２μｌの以下に示される０．２５μ
ｇ／μｌの逆転写酵素プライマー、および１４．５μｌのＨ₂Ｏからなる、４５ μｌ（最終容量）の第１鎖プレミックス（ｐｒｅ−ｍｉｘ）中に再懸濁する。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８２】

【化２】 転写プライマー（配列番号２） 室温下で１５分間のインキュベートした後、５ｍｌの２００Ｕ／μｌ ＳＵＰ
ＥＲＳＣＲＩＰＴを添加し、そしてこの混合液を４２℃で１時間インキュベート
した。1時間のインキュベートの後、上記の混合液（総量約５０μｌ）を、氷上 で、８０μｌの５×第２鎖緩衝液（９４ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．９）、
４５３ｍＭ ＫＣｌ、２３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および５０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ）からなる、第２鎖プレミックス（容量３３６μｌ）に添加し、約３８６μｌの
総反応容量を得る。別に、４μｌの０．８Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｈ（３．２ユ
ニット）および１０μｌの１０ｕｎｉｔ／μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（１００ユニット）を組み合わせ、そしてこの組み合わせた酵素混合液を
、上記の第２鎖反応混合液に添加する。その後、総反応容量を５秒間、微量遠心
し、次いで１６℃で１時間および室温で１時間インキュベートし、以下の二重鎖
ｃＤＮＡ（配列番号３）を得る：

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８５】

【化４】 従来のクローニングベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＩＩ、ｐＢＣな
ど（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ
、ＣＡ））を操作し、以下のエレメントの配列（配列番号５）を有する（これら
は式１で示される配列である）。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９３】 タグ−ｃＤＮＡ結合体のハイブリダイゼーションの前に、このタグ相補体の５
’末端を、好ましくは、ポリヌクレオチドキナーゼ処置によってリン酸化する。
手短には、１００μｌのＨ₂Ｏ中に懸濁された２．５×１０⁸のビーズを、１００
μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、１０μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、１μｌの１０％
ＴＷＥＥＮ ２０、１７μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／
μｌ）、および７２２μｌのＨ₂Ｏと組み合わせ、最終容量を１０００μｌにす る。ボルテックスしながら、２時間、３７℃でインキュベートした後、ボルテッ
クスを続けたまま、２０分間温度を６５℃に上昇し、キナーゼを不活性化する。
インキュベートの後、ビーズを遠心沈降およびそれらを０．０１％ ＴＷＥＥＮ
２０を含む１ｍｌのＴＥ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）中に再懸濁することによって、２回洗浄する。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９４】 タグ−ｃＤＮＡ結合体のタグ相補体へのハイブリダイゼーションのために、上
記のように調製したタグ−ｃＤＮＡ結合体を、５０μｌのＨ₂Ｏ中に懸濁し、得 られた混合液を４０μｌの２．５×ハイブリダイゼーション緩衝液と組み合わせ
る。その後、この組み合わせた混合液を、従来のプロトコルを使用してＳＰＩＮ
−Ｘスピンカラム（０．２２μｍ）を通して濾過し、タグ−ｃＤＮＡ結合体を含
む濾液を得る（１．２５ｍｌの０．１Ｍ ＮａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、１．２５ ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５ｍｌの０．５％ＴＷＥＥＮ ２０、１．５０ｍ
ｌの２５％硫酸デキストラン、および０．７５ｍｌのＨ₂Ｏからなる５ｍｌの２ ．５×ハイブリダイゼーション緩衝液）。１０μｌのＴＥ／ＴＷＥＥＮ緩衝液（
０．０１％ＴＷＥＥＮ ２０を含むＴＥ）中の約１．８×１０⁷のビーズを遠心 分離し、その結果、ビーズをペレット化し、そしてＴＥ／ＴＷＥＥＮを除去する
。このビーズに、２５μｌの１×ハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭのＮ
ａＰＯ₄（ｐＨ７．２）、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％ＴＷＥＥＮ ２０ 、３％硫酸デキストラン）を加え、この混合液をボルテックスし、ビーズを十分
に再懸濁する。その後、この混合液を遠心分離し、その結果、ビーズをペレット
化し、そして上清を除去する。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９５】 上記の濾液中のタグ−ｃＤＮＡ結合体を７５℃で３分間インキュベートし、ビ
ーズと組み合わせる。その後、この混合液をボルテックスし、このビーズを十分
に再懸濁する。得られた混合液を、約３日間（６０時間）ボルテックスしながら
７５℃でさらにインキュベートする。ハイブリダイゼーションの後、この混合液
を２分間遠心分離し、そして上清を除去する。その後、このビーズを、５００μ
ｌのＴＥ／ＴＷＥＥＮで２回洗浄し、そして０．０１％ＴＷＥＥＮ ２０を含む
、５００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液、番号２中に再懸濁する。このビーズをこの溶
液中で６４℃、３０分間インキュベートする。その後、この混合液を遠心分離し
、その結果、ビーズをペレット化し、そして上清を除去し、そしてこのビーズを
５００μｌのＴＥ／ＴＷＥＥＮに再懸濁する。

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９６】 ロードされたビーズを、高速セルソーター、好ましくは、４８８ｎｍで作動す
るアルゴンイオンレーザーを装備するＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｃｙｔ
ｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎ，ＣＯ）、または同様の装置を
使用して、ロードされていないビーズから識別する。識別の後、このロードされ
たビーズを、以下の反応成分と合わせることによってフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉ
ｎ）反応に供する：１０μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、０．４μｌの２５
ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌの１％ＴＷＥＥＮ ２０、２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（１０ユニット／ｍｌ）、および８６．６μｌのＨ₂Ｏ、最終反応容量１ ００μｌ。ボルテックスしながら１２℃で３０分間インキュベートした後、この
反応混合液を遠心分離し、その結果ビーズをペレット化し、そして上清を除去す
る。ペレット化されたビーズを、１５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、１．
５μｌの１％ＴＷＥＥＮ ２０、１．５μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、１μｌのＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／１ｍｌ）、および１３１μｌのＨ₂Ｏか らなる連結緩衝液中に再懸濁し、最終反応容量１５０μｌを得る。この連結反応
混合液をボルテックスしながら３７℃で１時間インキュベートする。その後、ビ
ーズをペレット化し、そして１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む１×リン酸緩衝化生理食 塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄する。ビーズを４５μｌのＰＢＳ（１ｍＭのＣａＣｌ ₂ を含む）中に再懸濁し、６μｌのプロナーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と組み合
わせる。その後、この混合液を攪拌しながら３７℃で１時間インキュベートする
。遠心分離後、ロードしたビーズをＴＥ／ＴＷＥＥＮで２回洗浄し、次いで１×
ＮＥＢ Ｄｐｎ ＩＩ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅ
ｒｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で１回洗浄する。

【手続補正１５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９７】 ビーズにロードされたタグ−ｃＤＮＡ結合体をＤｐｎ ＩＩで切断し、３’−
標識を保有する相補的なアダプターを連結する４つの核酸突出鎖を産生する。従
って、ロードされたビーズを、以下の成分からなる反応混合液に添加し、最終反
応容量１００μｌを得る：１０μｌの１０×ＮＥＢ Ｄｐｎ ＩＩ緩衝液、１μ
ｌの１％ＴＷＥＥＮ、４μｌのＤｐｎ ＩＩ（５０ユニット／ｍｌ）、および８
５μｌのＨ₂Ｏ。この混合液をボルテックスしながら３７℃で一晩インキュベー トし、その後、このビーズをペレット化し、上清を除去し、そしてこのビーズを
１×ＮＥＢ緩衝液、番号３で１回洗浄する。自己連結を防ぐために、タグ−ｃＤ
ＮＡ結合体の突出鎖を、ホスファターゼ（例えば、子ウシ腸ホスファターゼ（Ｃ
ＩＰ））で処理し、５’リン酸を除去する。従って、ロードされたビーズは、以
下の成分から成る反応混合液に添加し、最終反応容量１００μｌを得る：１０μ
ｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号３、１μｌの１％ＴＷＥＥＮ ２０、５μｌのＣ
ＩＰ（１０ユニット／μｌ）、および８４μｌのＨ₂Ｏ。得られた混合液をボル テックスしながら３７℃で１時間インキュベートし、その後、このビーズをペレ
ット化し、１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むＰＢＳで１回洗浄し、上記に記載したよう にプロナーゼで処理し、ＴＥ／ＴＷＥＥＮで２回洗浄し、そして１×ＮＥＢ緩衝
液、番号２で１回洗浄する。

【手続補正１６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９９】

【化７】 ここで、「ｐ」は５’リン酸基であり、そして「ＦＡＭ］は、市販されている３
’リンカー基（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の近傍の上位鎖
（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）の最後のヌクレオチドの３’炭素に付着したフルオレ
ッセン色素である。この連結を以下の反応混合液中で実行し、最終反応容量５０
μｌを得る：５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、０．５μｌの１％ＴＷＥＥ
Ｎ ２０、０．５μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、５ｍｌの３’−標識アダプター（
１００ｐｍｏｌ／μｌ）、２．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット
／μｌ）、および３６．５μｌのＨ₂Ｏ。この混合液をボルテックスしながら１ ６℃で一晩インキュベートし、その後、このビーズを１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む ＰＢＳで１回洗浄し、そして上記に記載したようにプロナーゼで処理する。この
初期連結の後、アダプターとタグ−ｃＤＮＡ結合体との間に残存するニックを、
以下に記載のように、キナーゼおよびリガーゼの両方で同時処置することによっ
て塞ぐ。ロードされたビーズを以下の成分から成る反応溶液中に再懸濁する：最
終反応容量の１５０μｌに対して、１５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液、番号２、１
．５μｌの１％ＴＷＥＥＮ ２０、１．５μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、２μｌの
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μｌ）、１μｌのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（４００ユニット／μｌ）、および１２９μｌのＨ₂Ｏ。この混合液を ボルテックスしながら３７℃で１時間インキュベートし、その後、このビーズを
、上記に記載したようにしてプロナーゼで処理された１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む ＰＢＳで１回洗浄し、そしてＴＥ／ＴＷＥＥＮで２回洗浄する。

【手続補正１７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０６】

【化８】 ここで、「ＦＡＭ」は、アミノ結合（例えば、アミノリンカーＩＩ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を介した逆方向プライマーの５’末端に結合し
たフルオレセイン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＮＨＳエステルである。逆方向プライマーを、Ｎｏｔ Ｉ部
位が、二本鎖産物中に再構成されるように選択する。ＰＣＲ増幅の後、タグ−ｃ
ＤＮＡ結合体を、アビジン結合（ａｖｉｄｉｎａｔｅ）されたビーズ（例えば、
Ｍ−２８０ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ））上
に単離する。

【手続補正１８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０９】 蛍光ヌクレオシド三リン酸Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣＹ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）を、別々の反応でｐｏｌｙ（ｄＴ）₁₆プライマーを用いて、実施例
１に記載したように得た、１μｇのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡでの逆転写中にｃＤ ＮＡ中に組み込む。プライマーおよびＲＮＡを７０℃まで１０分間加熱した後、
反応混合物を、氷上に移し、そして２００Ｕ ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ（Ｇ
ｉｂｃｏ）、緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、および蛍光ヌクレオ
シド三リン酸からなる予め混合した溶液を、以下の濃度で添加する：５００μＭ
のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；２００μＭのｄＴＴＰ；および各々１
００ｍＭのＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣＹ５−ｄＵＴＰ。４２℃で２時間インキュ
ベーションした後、組み込まれなかった蛍光ヌクレオチドを、４７０μｌの１０
ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）／１ ｍＭ ＥＤＴＡでの反応混合物
の１度目の希釈、引き続いてＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０コンセントレーター（Ａ
ｍｉｃｏｎ）を用いる約５μｌまでの濃縮により取り除く。両方の反応物から精
製した標識ｃＤＮＡを組み合わせ、そして１０μｇのｐｏｌｙ（ｄＡ）および０
．３μｌの１０％ＳＤＳを含む１１μｌの３．５×ＳＳＣ中に再懸濁する。ハイ
ブリダイゼーションに先立って、溶液を２分間沸騰させ、そして室温まで冷却し
、その後、溶液をＧＭＡビーズに添加し、そして６２℃で、約８〜１２時間イン
キュベートする。２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳで２回洗浄後、ＧＭＡビーズ
を、ＮＥＢ−２緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、ＭＡ）中に再懸濁し、そして分析およびソーティングするためにＣｏｕｌ
ｔｅｒ ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰ フローサイトメーター中にロードす
る。二次元蛍光強度等高プロットにおいて、ＧＭＡビーズは、図１ａに示すよう
なパターンを生じる。ソーティングパラメーターを、対角線にのっていない領域
（１１２）のＧＭＡビーズを識別するように、図１ｂに示すように設定し、そし
てＭＰＳＳ分析のために収集する。

【手続補正１９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１８】 好ましくは、ハイブリダイズしたコードアダプターの分析を、ｉ）ロードした
微粒子を、フローチャンバー内の平面のアレイに配置させる、ｉｉ）プロセス試
薬のフローチャンバーへのプログラムされた送達を可能にする、ｉｉｉ）粒子の
アレイからの光学的シグナルを同時に検出する機器で行なう。このような好まし
い機器を、図２に概略図で示し、そしてさらに詳しくは、Ｂｒｉｄｇｈａｍら、
国際特許公開ＷＯ９８／５３３００に開示される。手短に言えば、フローチャン
バー（５００）を、ガラスプレート（５０６）中の液体注入口（５０２）および
排出口（５０４）を有するキャビティを、標準的な微細加工技術（例えば、Ｅｋ
ｓｔｒｏｍら、国際特許公開ＷＯ９１／１６９６６；Ｂｒｏｗｎ、米国特許第４
，９１１，７８２号；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：１９２
６−１９３２（１９９２）；など）を用いてエッチングすることにより調製する
。フローチャンバー（５００）の次元は、ロードした微粒子（５０８）（例えば
、ＧＭＡビーズ）が、１００，０００〜２００，０００のビーズの密接にパッキ
ングされた平面の単層でキャビティ（５１０）に配置し得るような次元である。
キャビティ（５１０）は、エッチングされたガラスプレート（５０６）（例えば
、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ、米国特許第３，３９７，２７９号）上のガラスカバース
リップ（５１２）のアノード結合による注入口および排出口を有する閉鎖したチ
ャンバー内に作製する。試薬を、自動ＤＮＡおよびペプチド合成機（例えば、Ｂ
ｒｉｄｇｈａｍら、米国特許第４，６６８，４７９号；Ｈｏｏｄら、米国特許第
４，２５２，７６９号；Ｂａｒｓｔｏｗら、米国特許第５，２０３，３６８号；
Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、米国特許第４，７０３，９１３号；など）上で一般
に用いられるマイクロプロセッサーにより制御されるバルブブロック（５２２）
を介してシリンジポンプ（５１４〜５２０）からフローチャンバー中で計測され
る。

【手続補正２０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１２１】 ８８．１１ｃＤＮＡをまた、タグ３３６を含まないことを除いて実施例１と同
一のベクター（図３ｂの３３０）にクローニングした。１０μｇのベクターＤＮ
Ａを、Ｄｐｎ ＩＩのアイソジマーであるＳａｕ ３Ａ（図３ｂの３４２）で完
全に切断することにより線状化し、その後精製された直線ＤＮＡの２つの１μｇ
のアリコートを得た。各１μｇのアリコートから約２０μｇの標識された一本鎖
ＤＮＡ生成物が、プライマー結合部位３３２に特異的なプライマーを用いる線状
増幅の反復サイクルにより生成された。１つのアリコートにおいて、生成物を、
ローダミンＲ１１０標識化ｄＵＴＰ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の取り込みにより標識化し；そしてもう
一方のアリコートにおいて、生成物をＣＹ５標識化ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）の取
り込みにより標識化した。標識された生成物の量を、２つの生成物の７つの５μ
ｇ量を１：１、２：１、１：２、４：１、１：４、８：１および１：８の割合で
形成するために、組み合わせた。５μｇ量の標識された生成物を、別々に、６５
℃で０．２％のＳＤＳを有する５０μｌの４×ＳＳＣ中で一晩、１．６×１０⁵ の粒子（８８．１１ｃＤＮＡを結合させたＧＭＡビーズ）にハイブリダイズさせ
、その後氷冷したＴＥ／ＴＷＥＥＮ緩衝液（上記で定義）での１０ｍｌまでの希
釈により反応を終了させた。ロードした微粒子を、遠心分離し、６５℃で１５分
間０．２％ＳＤＳを有する０．５ｍｌの１×ＳＳＣ中に懸濁することにより洗浄
し、遠心分離し、そして５５℃で１５分間０．２％ＳＤＳを有する０．５ｍｌの
０．１×ＳＳＣ中に懸濁して再度洗浄した。２回目の洗浄後、微粒子を、遠心分
離し、そしてＦＡＣＳ分析のために０．５ｍｌのＴＥ／ＴＷＥＥＮ溶液中に再懸
濁した。

【手続補正２１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１３１】 （競合的ハイブリダイゼーション） １００，０００のビーズをＣＹ５で標識した刺激プローブライブラリー（Ｓ３
Ａ−ＴＬ）、およびＲ１１０で標識した同じライブラリーのそれぞれの直線ＰＣ
Ｒ産物の１０μｇでハイブリダイズした。９３６，５４２のビーズをＣＹ５刺激
プローブの１０μｇおよびＲ１１０非刺激プローブの１０μｇでハイブリダイズ
した。このビーズを、４×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの最終緩衝液組成物の５０μ
ｌ中に集めた。このサンプルを３分間８０℃に熱し、プローブを添加し、そして
温度を６５℃に変更した。ハイブリダイゼーションは、ボルテックスしながら１
６時間持続した。このビーズを１０ｍｌのＴＥ ＴＷＥＥＮに氷急冷した。回収
したサンプルを１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回リンスし、０．５ｍｌの１×
ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳに再懸濁し、そして１５分間、６５℃で洗浄した。この
ビーズを０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中でリンスし、そして１５分間、０．
１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５５℃で洗浄した。このサンプルをＴＥ ＴＷ
ＥＥＮでリンスし、そして両方のサンプルの１０，０００事象をＢＤ Ｆａｃｓ
Ｃａｌｉｂｅｒで分析した。１０，１６３ビーズ（１．１５％）（１：１の対角
線から外れた最も鮮明なＣＹ５）を選別した。１１，９７７ビーズ（１．３５％
）（１：１の対角線から外れた最も鮮明なＲ１１０）を選別した。このビーズを
ＰＣＲ反応物にプールし、ＴＡクローン化し、そしてＴＡ配列決定した。同定さ
れた配列を表３および４に列挙する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 3832 Ｂａｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐｌａｃ ｅ， Ｈａｙｗａｒｄ， Ｃａｌｉｆｏｒ ｎｉａ 94545 Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 ブレナー， シドニー イギリス国 シービー２ ３ピージェイ ケンブリッジ， エドワーズ パセージ ビー ストリート 17 (72)発明者 ダブリッジ， ロバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002， ベルモント， ホリー ロード 825 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA07 AA10 AA11 AA20 CA01 CA09 CA20 EA04 HA08 HA11 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QA19 QA20 QQ02 QQ04 QQ05 QQ06 QQ07 QQ08 QQ42 QQ52 QQ53 QR08 QR56 QR59 QR62 QR83 QS25 QS34 QX02

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 差次的な遺伝子発現を分析する方法であって、以下の工程： クローン亜集団において別個の固相支持体に付着された核酸配列の参照集団を
   提供する工程； 第１の細胞または組織供給源由来の発現された遺伝子のポリヌクレオチドの集
   団および異なる細胞または組織供給源由来の発現された遺伝子のポリヌクレオチ
   ドの少なくとも１つの集団を提供する工程であって、該各々の供給源由来の発現
   された遺伝子のポリヌクレオチドが、任意の他の供給源のポリヌクレオチドによ
   って含まれる標識と異なる光生成標識を含む、工程； 該ポリヌクレオチドが、該供給源においてこれらの対応する遺伝子の相対的な
   発現に直接関連した比で該各々の固相支持体上に二重鎖として存在するように、
   該参照核酸集団と該各々の供給源由来の発現された遺伝子のポリヌクレオチドの
   集団を競合的にハイブリダイズして、該参照核酸集団の該核酸配列と該各々の供
   給源のポリヌクレオチドとの間で二重鎖を形成する工程；および 該各々の固相支持体に付着された該二重鎖の該光生成標識によって生成された
   相対的な光学シグナルを検出する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記核酸配列がＤＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、前記参照配列集団を提供す
   る工程がさらに以下の工程： 少なくとも１つの前記供給源から抽出されたｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチ
   ドタグのレパートリーから、少なくとも１つのタグ−ｃＤＮＡ結合体の集団を形
   成する工程； 該タグ−ｃＤＮＡ結合体のサンプルを取り出す工程；および 該サンプルの該タグ−ｃＤＮＡ結合体を増幅する工程、 を包含する、方法。
4. 【請求項４】 前記タグ−ｃＤＮＡ結合体の集団が、前記各々の供給源から
   抽出されたｍＲＮＡから形成され、前記方法が、前記サンプルを取り出す前に該
   各々の供給源由来の該タグ−ｃＤＮＡ結合体の集団とを合わせる工程をさらに包
   含する、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記サンプルが、実質的に全て異なるｃＤＮＡが異なるオリ
   ゴヌクレオチドタグを有する、前記総タグ−ｃＤＮＡ結合体に対して十分小さい
   、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記参照集団を提供する工程が、前記タグ−ｃＤＮＡ結合体
   の前記オリゴヌクレオチドタグとそれらのそれぞれの相補体とを特異的にハイブ
   リダイズすることによって、前記別個の固相支持体に対して該サンプルの該タグ
   −ｃＤＮＡ結合体を付着する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応において前記サ
   ンプルの前記タグ−ｃＤＮＡ結合体を複製する工程を包含する、請求項６に記載
   の方法。
8. 【請求項８】 前記増幅する工程が、クローニングベクター中に前記タグ−
   ｃＤＮＡ結合体を挿入し、そしてそれを用いて宿主細胞にトランスフェクトする
   ことによって前記サンプルの前記タグ−ｃＤＮＡ結合体を複製する工程を包含す
   る、請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記サンプルが、前記レパートリーにおいて前記オリゴヌク
   レオチドタグの１％未満かまたは等しい、多くのオリゴヌクレオチドタグを含む
   、請求項６に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記参照ＤＮＡ集団が、分析されたすべての前記供給源の
    前記発現された遺伝子由来である、請求項２に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記相対的な光学シグナルに従って、各々の固相支持体を
    識別する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記異なる光生成標識が、異なる蛍光標識である、請求項
    ２に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記発現された遺伝子のポリヌクレオチドの集団が、ｃＤ
    ＮＡの集団である、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法であって、以下の工程： 前記供給源での遺伝子発現における差異に対応する値の１つ以上の所定の範囲
    内の値で前記相対的な光学シグナルを有する前記各々の固相支持体を蓄積する工
    程；および 該各々のポリヌクレオチドの一部のヌクレオチド配列を決定することによって
    前記各々の固相支持体上の前記ポリヌクレオチドを同定する工程、 をさらに包含する、方法。
15. 【請求項１５】 前記相対的な光学シグナルが蛍光強度の比であって、ここ
    で前記ポリヌクレオチドの集団が２つの供給源に由来する、請求項１４に記載の
    方法。
16. 【請求項１６】 前記ポリヌクレオチドの部分が、少なくとも１０ヌクレオ
    チドの配列である、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記同定する工程が、大規模に並行サイン配列決定するこ
    とによって少なくとも１万の前記ポリヌクレオチドを同時配列決定する工程を包
    含する、請求項１５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 複数の異なる細胞または組織において差次的に発現された
    遺伝子由来のポリヌクレオチドを単離する方法であって、該方法が、以下の工程
    ： クローン亜集団において別個の微粒子に付着されたＤＮＡ配列の参照ＤＮＡ集
    団を提供する工程； 該各々の複数の異なる細胞または組織において発現された遺伝子由来のポリヌ
    クレオチドの集団を提供する工程であって、各々のポリヌクレオチドが、該ポリ
    ヌクレオチドが由来する該細胞または組織の光学シグナル表示を生成し得る光生
    成標識を有する、工程； 該ポリヌクレオチドが、該異なる細胞または組織においてこれらの対応する遺
    伝子の相対的な発現に直接関連した比で該各々の微粒子上に二重鎖として存在す
    るように、該各々の複数の異なる細胞または組織において発現された遺伝子のポ
    リヌクレオチドの集団を該参照ＤＮＡ集団と競合的にハイブリダイズして、該参
    照ＤＮＡ集団の該ＤＮＡ配列と該各々の異なる細胞または組織由来のポリヌクレ
    オチドとの間で二重鎖を形成する工程；および 該各々の微粒子上にハイブリダイズされた該ポリヌクレオチドの集団によって
    生成された光学シグナルに基づいて微粒子を識別することによって、該異なる細
    胞または組織において差次的に発現された遺伝子に対応するポリヌクレオチドを
    単離する工程、 を包含する、方法。
19. 【請求項１９】 前記参照ＤＮＡ集団が、分析された前記複数の異なる細胞
    または組織において発現された遺伝子に由来する、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記複数の異なる細胞または組織が２つであり、ここで前
    記光学シグナルが蛍光シグナルである、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記ポリヌクレオチドの集団が異なる蛍光標識で標識され
    る、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記ポリヌクレオチドの集団がｃＤＮＡの集団である、請
    求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記競合的にハイブリダイズする工程が、実質的に全ての
    前記二重鎖が完全に一致した二重鎖を生じるハイブリダイゼーション条件を提供
    する工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記単離する工程が、前記各々の粒子上にハイブリダイズ
    された前記ｃＤＮＡの集団によって生成された蛍光強度の比に基づいて前記微粒
    子を識別する工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記単離する工程が、蛍光活性化セルソーターを用いて前
    記微粒子を識別する工程を包含する、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記単離されたｃＤＮＡの各々の一部のヌクレオチド配列
    を決定することによって、該単離されたｃＤＮＡを同定する工程をさらに包含す
    る、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 遺伝子産物の相対量を決定する方法であって、以下の工程
    ： クローン亜集団において別個の固相支持体に付着されたＤＮＡ配列の参照ＤＮ
    Ａ集団を提供する工程； 少なくとも１つの細胞または組織供給源において発現された遺伝子由来のポリ
    ヌクレオチドの集団を提供する工程であって、該ポリヌクレオチドが光生成標識
    を有する、工程； 該ポリヌクレオチドと該参照ＤＮＡ集団をハイブリダイズして、該参照ＤＮＡ
    の該ＤＮＡ配列と該ポリヌクレオチドとの間で二重鎖を形成する工程；および 該別個の固相支持体に付着された該二重鎖の該光生成標識によって生成された
    該光学シグナルに従って各々の固相支持体を識別する工程、 を包含し、ここで、該遺伝子産物の相対量が二重鎖から得られる該光学シグナル
    の相対強度レベルに相関し、ここでより低い強度が稀な遺伝子産物を示す、方法
    。
28. 【請求項２８】 より低い相対強度を有する固相支持体を単離する工程をさ
    らに包含し、ここで、該単離された固相支持体が、提供される総固相支持体の多
    くても約５％を包含する、請求項２７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記単離された固相支持体が、提供される総固相支持体の
    多くても約０．５％を包含する、請求項２８に記載の方法。
30. 【請求項３０】 ポリヌクレオチドが由来している前記核酸配列の量に基づ
    いてポリヌクレオチドを単離する方法であって、以下の工程： クローン亜集団において別個の微粒子に付着されたＤＮＡ配列の参照ＤＮＡ集
    団を提供する工程； 少なくとも１つの細胞または組織供給源の細胞に存在する核酸配列由来のポリ
    ヌクレオチドの集団を提供する工程であって、各々のポリヌクレオチドが光学シ
    グナルを生成し得る光生成標識を有する、工程； 該ポリヌクレオチド集団と該参照ＤＮＡ集団とを競合的にハイブリダイズして
    、該参照ＤＮＡ集団の該ＤＮＡ配列と該ポリヌクレオチドとの間で二重鎖を形成
    する工程であって、該ハイブリダイズする工程が、該ポリヌクレオチドの該量に
    比例したハイブリダイゼーション割合を提供する条件下で行われ、ここで、あま
    り豊富でないポリヌクレオチドがハイブリダイズされずに残っている、工程； ハイブリダイスされた集団とハイブリダイズされない集団とに該ポリヌクレオ
    チドを識別する工程、 を包含する、方法。
31. 【請求項３１】 前記ポリヌクレオチドが、前記ハイブリダイズされない集
    団が稀な遺伝子産物由来のポリヌクレオチドを包含するような条件下で、前記参
    照ＤＮＡ集団とハイブリダイズされる、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記ポリヌクレオチドが、前記ハイブリダイズされない集
    団が非反復核酸配列由来のポリヌクレオチドに実質的に富化されるような条件下
    で、前記参照ＤＮＡ集団とハイブリダイズされる、請求項３０に記載の方法。
33. 【請求項３３】 微粒子の混合物を含む組成物であって、各々の微粒子が該
    微粒子に付着された同一の一本鎖核酸分子の集団を有し、該一本鎖核酸分子が各
    々の微粒子上で異なっており、そして少なくとも１つの細胞または組織供給源の
    ｍＲＮＡ由来のポリペプチドと近位でオリゴヌクレオチドタグを包含する、組成
    物。
34. 【請求項３４】 前記核酸分子がＤＮＡである、請求項３３に記載の組成物
    。
35. 【請求項３５】 前記ポリヌクレオチドが複数の細胞または組織供給源由来
    である、請求項３４に記載の組成物。
36. 【請求項３６】 前記混合物が、少なくとも１００の異なる微粒子を含む、
    請求項３５に記載の組成物。
37. 【請求項３７】 前記混合物が、少なくとも１０００の異なる微粒子を含む
    、請求項３５に記載の組成物。
38. 【請求項３８】 前記混合物が、少なくとも１０⁴の異なる微粒子を含む、 請求項３５に記載の組成物。
39. 【請求項３９】 前記オリゴヌクレオチドタグが、約１２〜約６０ヌクレオ
    チドの長さである、請求項３５に記載の組成物。
40. 【請求項４０】 前記オリゴヌクレオチドタグが、約１８〜約４０ヌクレオ
    チドの長さである、請求項３５に記載の組成物。
41. 【請求項４１】 前記オリゴヌクレオチドタグが、約２５〜約４０ヌクレオ
    チドの長さである、請求項３５に記載の組成物。
42. 【請求項４２】 微粒子の混合物を含む組成物であって、各々の微粒子が、
    該微粒子に対して付着された同一の一本鎖核酸分子の集団を有し、該一本鎖核酸
    分子が各々の微粒子上で異なっており、そして該各々の異なる核酸分子が以下：
    細胞周期タンパク質、シグナル伝達経路タンパク質、オンコジーン遺伝子産物、
    腫瘍サプレッサー、キナーゼ、ホスファターゼ、転写因子、成長因子レセプター
    、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質、プロテアーゼ、骨格タンパク質、
    膜レセプター、Ｒｂ経路タンパク質、ｐ５３経路タンパク質、代謝に関与するタ
    ンパク質、ストレスに対する細胞性応答に関与するタンパク質、サイトカイン、
    ＤＮＡ損傷および修復に関与するタンパク質、ならびにアポトーシスに関与する
    タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を含む、組成物。
43. 【請求項４３】 前記各々の核酸分子が、前記ポリヌクレオチドの近位で、
    かつ前記微粒子と該ポリヌクレオチドとの間に位置されるオリゴヌクレオチドタ
    グをさらに包含する、請求項４２に記載の組成物。
44. 【請求項４４】 前記各々の微粒子が、前記組成物において任意の他の微粒
    子のオリゴヌクレオチドタグと異なる配列を有するオリゴヌクレオチドタグのセ
    ットを含む、請求項４３に記載の組成物。
45. 【請求項４５】 前記ポリヌクレオチドがキナーゼをコードする、請求項４
    ２に記載の組成物。
46. 【請求項４６】 前記ポリヌクレオチドが細胞周期タンパク質をコードする
    、請求項４２に記載の組成物。
47. 【請求項４７】 前記ポリヌクレオチドがシグナル伝達経路タンパク質をコ
    ードする、請求項４２に記載の組成物。
48. 【請求項４８】 前記ポリヌクレオチドがアポトーシスに関与するタンパク
    質をコードする、請求項４２に記載の組成物。
49. 【請求項４９】 前記ポリヌクレオチドが代謝に関与するタンパク質をコー
    ドする、請求項４２に記載の組成物。
50. 【請求項５０】 参照集団を調製するためのキットであって、以下： 付着されたオリゴヌクレオチドタグ相補体を有する複数の微粒子であって、該
    オリゴヌクレオチドタグ相補体配列が各々の微粒子上で異なっている微粒子を含
    む、キット。
51. 【請求項５１】 タグのライブラリーを含む複数のベクターをさらに包含し
    、該タグが前記タグ相補体に相補的な配列を有する、請求項５０に記載のキット
    。
52. 【請求項５２】 少なくとも１つの細胞または組織供給源由来のポリヌクレ
    オチド集団をさらに含む、請求項５１に記載のキット。
53. 【請求項５３】 前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項５２に記
    載のキット。
54. 【請求項５４】 前記ポリヌクレオチドの集団が、前記複数の微粒子とは別
    個の容器中に含まれる、請求項５２に記載のキット。
55. 【請求項５５】 前記参照集団を調製するための少なくとも１つの試薬をさ
    らに含む、請求項５１に記載のキット。
56. 【請求項５６】 差次的に発現された遺伝子を分析するためのキットであっ
    て、以下： 各々の微粒子が、該微粒子に付着された同一の一本鎖核酸分子の集団を有し、
    該一本鎖核酸分子が各々の微粒子上で異なっており、そして少なくとも１つの細
    胞または組織供給源のｍＲＮＡ由来のポリヌクレオチドを含む、微粒子の混合物
    を含む、キット。
57. 【請求項５７】 前記各々の核酸分子が、前記ポリヌクレオチドの近位で、
    かつ前記微粒子と該ポリヌクレオチドとの間に位置されるオリゴヌクレオチドタ
    グをさらに包含する、請求項５６に記載のキット。
58. 【請求項５８】 差次的に発現された遺伝子を分析することにおける使用の
    ための印刷された取扱説明書をさらに包含する、請求項５６に記載のキット。
59. 【請求項５９】 容器をさらに包含する、請求項５６に記載のキット。
60. 【請求項６０】 少なくとも１つの前記細胞または組織供給源由来のｃＤＮ
    Ａ分子の集団をさらに包含する、請求項５６に記載のキット。