JP2002272480A - アデノウイルスベクター - Google Patents
アデノウイルスベクターInfo
- Publication number
- JP2002272480A JP2002272480A JP2001131688A JP2001131688A JP2002272480A JP 2002272480 A JP2002272480 A JP 2002272480A JP 2001131688 A JP2001131688 A JP 2001131688A JP 2001131688 A JP2001131688 A JP 2001131688A JP 2002272480 A JP2002272480 A JP 2002272480A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rgd
- peptide
- fiber
- cells
- lacz
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10344—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
- C12N2810/405—Vectors comprising RGD peptide
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ファイバーのHIループコード遺伝子配列に簡
便な操作で任意のペプチドを導入した、ファイバーミュ
ータントアデノウイルスベクターの作製方法の提供。 【解決手段】 ファイバーのHIループコード遺伝子配列
に、ユニークな制限酵素認識配列を挿入することによ
り、該領域に外来ペプチドコードDNAを導入することを
特徴とする、ファイバーミュータントアデノウイルスベ
クターの作製方法。
便な操作で任意のペプチドを導入した、ファイバーミュ
ータントアデノウイルスベクターの作製方法の提供。 【解決手段】 ファイバーのHIループコード遺伝子配列
に、ユニークな制限酵素認識配列を挿入することによ
り、該領域に外来ペプチドコードDNAを導入することを
特徴とする、ファイバーミュータントアデノウイルスベ
クターの作製方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アデノウイルスの
ファイバーのHIループに外来ペプチドが付与されたファ
イバーミュータントアデノウイルスベクターの作製方法
に関する。
ファイバーのHIループに外来ペプチドが付与されたファ
イバーミュータントアデノウイルスベクターの作製方法
に関する。
【０００２】
【従来技術】アデノウイルスベクターは、種々のタイプ
の細胞へin vivoまたはin vitroで遺伝子を導入するた
めの魅力的なビヒクルとして汎用されている。アデノウ
イルスはエンベロープを持たず、252個のカプソメアよ
りなる正20面体構造をしている。そのうち頂点にある12
個のカプソメアは突起構造を持ったペントン（ペントン
ベースとファイバーから成る）と呼ばれ、他の240個は
ヘキソンと呼ばれる。ウイルスの細胞内への侵入(感染)
は、ファイバーが受容体のCARに結合し(詳細について
は、Bergelson J M ら、Isolation of a common recept
or for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and
5. Science 275:1320-1323, 1997を参照されたい）、そ
の後ペントンベースのRGDモチーフが細胞表面上のイン
テグリンに結合することによって起こる(Bai M, Harfe
B, Freimuth P、Mutations that alter an Arg-Gly-Asp
(RGD) sequence in the adenovirus type 2penton bas
e protein abolish its cell-rounding activity and d
elay virusreproduction in flat cells.,J Virol 67:
5198-5205, 1993；Wickham T Jら、Integrins αvβ3 a
nd αvβ5 promote adenovirus internalization but n
ot virus attachment. Cell 73:309-319, 1993)。エン
ドソームに達したウイルスは酸性条件下でカプシド蛋白
質の構造変化を起こし、エンドソームを破壊して、細胞
質内に侵入する。従って、細胞表面上の受容体であるCA
Rに、ウイルスのファイバーが結合するのが第一ステッ
プであり、ファイバーを修飾することにより、ベクター
の感染域を変えることができると考えられる(Paillard,
F.,Dressing up adenoviruses to modify their tropi
sm. Hum Gene Ther 10:2575-2576, 1999)。
の細胞へin vivoまたはin vitroで遺伝子を導入するた
めの魅力的なビヒクルとして汎用されている。アデノウ
イルスはエンベロープを持たず、252個のカプソメアよ
りなる正20面体構造をしている。そのうち頂点にある12
個のカプソメアは突起構造を持ったペントン（ペントン
ベースとファイバーから成る）と呼ばれ、他の240個は
ヘキソンと呼ばれる。ウイルスの細胞内への侵入(感染)
は、ファイバーが受容体のCARに結合し(詳細について
は、Bergelson J M ら、Isolation of a common recept
or for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and
5. Science 275:1320-1323, 1997を参照されたい）、そ
の後ペントンベースのRGDモチーフが細胞表面上のイン
テグリンに結合することによって起こる(Bai M, Harfe
B, Freimuth P、Mutations that alter an Arg-Gly-Asp
(RGD) sequence in the adenovirus type 2penton bas
e protein abolish its cell-rounding activity and d
elay virusreproduction in flat cells.,J Virol 67:
5198-5205, 1993；Wickham T Jら、Integrins αvβ3 a
nd αvβ5 promote adenovirus internalization but n
ot virus attachment. Cell 73:309-319, 1993)。エン
ドソームに達したウイルスは酸性条件下でカプシド蛋白
質の構造変化を起こし、エンドソームを破壊して、細胞
質内に侵入する。従って、細胞表面上の受容体であるCA
Rに、ウイルスのファイバーが結合するのが第一ステッ
プであり、ファイバーを修飾することにより、ベクター
の感染域を変えることができると考えられる(Paillard,
F.,Dressing up adenoviruses to modify their tropi
sm. Hum Gene Ther 10:2575-2576, 1999)。
【０００３】ファイバー遺伝子はウイルス後期遺伝子の
L5領域に位置し、５型ウイルスにおいては581アミノ酸
からなり３量体を形成している。その構造はテール、シ
ャフト、ノブの部分に分けられ、C末端のノブが受容体
のCARと結合する。従来のアデノウイルスベクターの大
きな問題点として、ベクターの感染域に組織特異性がな
く、全身投与した場合多くの組織細胞に非特異的に移行
すること、また、アデノウイルス受容体（coxsackievir
us-adenovirus receptor (CAR)；遺伝子治療のためのベ
クターとして通常用いられているアデノウイルス２型や
５型における受容体。詳細については、Bergelson J M
ら、上掲、を参照されたい）の発現がない細胞には感染
できないことがあげられる。
L5領域に位置し、５型ウイルスにおいては581アミノ酸
からなり３量体を形成している。その構造はテール、シ
ャフト、ノブの部分に分けられ、C末端のノブが受容体
のCARと結合する。従来のアデノウイルスベクターの大
きな問題点として、ベクターの感染域に組織特異性がな
く、全身投与した場合多くの組織細胞に非特異的に移行
すること、また、アデノウイルス受容体（coxsackievir
us-adenovirus receptor (CAR)；遺伝子治療のためのベ
クターとして通常用いられているアデノウイルス２型や
５型における受容体。詳細については、Bergelson J M
ら、上掲、を参照されたい）の発現がない細胞には感染
できないことがあげられる。
【０００４】当初、ファイバー分子のC末端にヘパラン
硫酸との親和性があるポリリジン配列を有したアデノウ
イルスベクターが作製され、このベクターが期待通り、
広い感染域をもつことが報告された(Wickham T Jら、In
creased in vitro and in vivo gene transfer by aden
ovirus vectors containing chimeric fiber protein
s., J. Virol. 71:8221-8229, 1997；Yoshida Yら、Gen
eration of fiber-mutant recombinant adenoviruses f
or gene therapy of malignant glioma.,Hum Gene Ther
9:2503-2515, 1998；Gonzalez Rら、Increased gene t
ransfer in acutemyeloid leukemic cells by an adeno
virus vector containing a modified fiber protein.,
Gene Ther. 6: 314-320, 1999；Bouri Kら、Poly-lysi
ne Modification of adenoviral fiber protein enhanc
es muscle cell transduction.,Hum Gene Ther 10:1633
-1640, 1999)。しかしながら、この領域への外来ペプチ
ドの挿入は、ファイバーの３量体形成を阻害し、ウイル
スのタイターが野生型のファイバーを有するベクターに
比べ1-2オーダー以上劣ること、また、ファイバーのC末
端はウイルスの内側に向かっていることが明らかとな
り、現在では外来ペプチドの挿入に最適な部位ではない
と考えられている。
硫酸との親和性があるポリリジン配列を有したアデノウ
イルスベクターが作製され、このベクターが期待通り、
広い感染域をもつことが報告された(Wickham T Jら、In
creased in vitro and in vivo gene transfer by aden
ovirus vectors containing chimeric fiber protein
s., J. Virol. 71:8221-8229, 1997；Yoshida Yら、Gen
eration of fiber-mutant recombinant adenoviruses f
or gene therapy of malignant glioma.,Hum Gene Ther
9:2503-2515, 1998；Gonzalez Rら、Increased gene t
ransfer in acutemyeloid leukemic cells by an adeno
virus vector containing a modified fiber protein.,
Gene Ther. 6: 314-320, 1999；Bouri Kら、Poly-lysi
ne Modification of adenoviral fiber protein enhanc
es muscle cell transduction.,Hum Gene Ther 10:1633
-1640, 1999)。しかしながら、この領域への外来ペプチ
ドの挿入は、ファイバーの３量体形成を阻害し、ウイル
スのタイターが野生型のファイバーを有するベクターに
比べ1-2オーダー以上劣ること、また、ファイバーのC末
端はウイルスの内側に向かっていることが明らかとな
り、現在では外来ペプチドの挿入に最適な部位ではない
と考えられている。
【０００５】1998年、Curielらのグループはファイバー
のHI ループがウイルスの表面につきだした構造をとっ
ていることに着目し、この部位へ外来ペプチドを挿入す
るとウイルス表面にペプチドを表現できること、ウイル
スの増殖を全く阻害しないことを報告し、外来ペプチド
の表現部位として最適である可能性を示した(Krasnykh
V Iら、Characterization of an adenovirus vector co
ntaining a heterologous peptide epitope in the HI
loop of the fiber knob., J Virol 72:1844-1852, 199
8；Dmitriev Iら、An adenovirus vector with genetic
ally modifiedfibers demonstrates expanded tropism
via utilization of a Coxsackievirusand adenovirus
receptor-independent cell entry mechanism., J Vir
ol 72:9706-9713, 1998）。しかしながら、彼らはこの
ようなベクターを特別な大腸菌を用いた相同組換えを利
用した方法で作製しており、その作製法は現状ではそれ
ほど簡便ではないため、広く普及するには至っていな
い。
のHI ループがウイルスの表面につきだした構造をとっ
ていることに着目し、この部位へ外来ペプチドを挿入す
るとウイルス表面にペプチドを表現できること、ウイル
スの増殖を全く阻害しないことを報告し、外来ペプチド
の表現部位として最適である可能性を示した(Krasnykh
V Iら、Characterization of an adenovirus vector co
ntaining a heterologous peptide epitope in the HI
loop of the fiber knob., J Virol 72:1844-1852, 199
8；Dmitriev Iら、An adenovirus vector with genetic
ally modifiedfibers demonstrates expanded tropism
via utilization of a Coxsackievirusand adenovirus
receptor-independent cell entry mechanism., J Vir
ol 72:9706-9713, 1998）。しかしながら、彼らはこの
ようなベクターを特別な大腸菌を用いた相同組換えを利
用した方法で作製しており、その作製法は現状ではそれ
ほど簡便ではないため、広く普及するには至っていな
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、ファ
イバーのHIループコード遺伝子配列に簡便な操作で任意
のペプチドを導入した、ファイバーミュータントアデノ
ウイルスベクターの作製方法を提供することを目的とす
る。
イバーのHIループコード遺伝子配列に簡便な操作で任意
のペプチドを導入した、ファイバーミュータントアデノ
ウイルスベクターの作製方法を提供することを目的とす
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ファイバーの
HIループをコードする遺伝子領域に、ユニークな制限酵
素の認識部位を挿入することにより、該領域に任意のペ
プチドをコードするオリゴDNAを簡便に導入できること
を見出し、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ファイバーの
HIループをコードする遺伝子領域に、ユニークな制限酵
素の認識部位を挿入することにより、該領域に任意のペ
プチドをコードするオリゴDNAを簡便に導入できること
を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、ファイバーのHIループ
コード遺伝子配列に、ユニークな制限酵素認識配列を挿
入し、該遺伝子配列中に外来ペプチドコードDNAを導入
することを特徴とする、ファイバーミュータントアデノ
ウイルスベクターの作製方法である。
コード遺伝子配列に、ユニークな制限酵素認識配列を挿
入し、該遺伝子配列中に外来ペプチドコードDNAを導入
することを特徴とする、ファイバーミュータントアデノ
ウイルスベクターの作製方法である。
【０００９】また本発明は、上記の方法により作製され
るファイバーミュータントアデノウイルスベクターであ
る。さらに本発明は、ファイバーのHIループコード遺伝
子配列に、ユニークな制限酵素認識部位を有することを
特徴とする、アデノウイルスベクターである。以下に本
発明を詳細に説明する。
るファイバーミュータントアデノウイルスベクターであ
る。さらに本発明は、ファイバーのHIループコード遺伝
子配列に、ユニークな制限酵素認識部位を有することを
特徴とする、アデノウイルスベクターである。以下に本
発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のファイバーミュータント
アデノウイルスベクターの作製方法は、ファイバーのHI
ループコード遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列
を挿入し、該遺伝子配列中に外来ペプチドコードDNAを
導入することを特徴とするものである。
アデノウイルスベクターの作製方法は、ファイバーのHI
ループコード遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列
を挿入し、該遺伝子配列中に外来ペプチドコードDNAを
導入することを特徴とするものである。
【００１１】ファイバーのHIループコード遺伝子配列と
は、ファイバー分子のアミノ酸537から549までの領域を
コードする塩基配列をさす。HIループのアミノ酸は大部
分が親水基であり、ノブ領域の外側に配向している。こ
の領域に外来ペプチドが挿入されてもファイバーの３量
体形成には影響を及ぼさない。例えば、５型アデノウイ
ルスでは、該ウイルスのゲノムDNAの32647〜32685番目
に相当する。
は、ファイバー分子のアミノ酸537から549までの領域を
コードする塩基配列をさす。HIループのアミノ酸は大部
分が親水基であり、ノブ領域の外側に配向している。こ
の領域に外来ペプチドが挿入されてもファイバーの３量
体形成には影響を及ぼさない。例えば、５型アデノウイ
ルスでは、該ウイルスのゲノムDNAの32647〜32685番目
に相当する。
【００１２】ユニークな制限酵素認識配列とは、アデノ
ウイルスゲノムDNAに本来存在しない制限酵素認識配列
を意味し、例えば、制限酵素Csp45I、ClaI、SwaI、Pac
I、I-CeuI、PI-SceI、I-PpoI、I-SceIにより認識される
配列が挙げられる。ユニークな制限酵素としてCsp45Iお
よびClaIを使用した場合、これらの制限酵素は互いに適
合性を有する接着型末端を生じ、上記オリゴヌクレオチ
ドをいずれの方向でも挿入することができる。従って、
オリゴヌクレオチドが順方向に挿入されたもの（陽性ク
ローン）がCsp45I認識配列を有し、かつClaI認識配列を
含まないように前記オリゴヌクレオチドを設計すること
により、陽性クローンを制限酵素Csp45IおよびClaIの切
断パターンの違いにより容易に同定することができる。
このように設計されたオリゴヌクレオチドとしては、限
定するものではないが、配列番号１０〜１３に記載の塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができ
る。
ウイルスゲノムDNAに本来存在しない制限酵素認識配列
を意味し、例えば、制限酵素Csp45I、ClaI、SwaI、Pac
I、I-CeuI、PI-SceI、I-PpoI、I-SceIにより認識される
配列が挙げられる。ユニークな制限酵素としてCsp45Iお
よびClaIを使用した場合、これらの制限酵素は互いに適
合性を有する接着型末端を生じ、上記オリゴヌクレオチ
ドをいずれの方向でも挿入することができる。従って、
オリゴヌクレオチドが順方向に挿入されたもの（陽性ク
ローン）がCsp45I認識配列を有し、かつClaI認識配列を
含まないように前記オリゴヌクレオチドを設計すること
により、陽性クローンを制限酵素Csp45IおよびClaIの切
断パターンの違いにより容易に同定することができる。
このように設計されたオリゴヌクレオチドとしては、限
定するものではないが、配列番号１０〜１３に記載の塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができ
る。
【００１３】上記認識配列のHIループコード遺伝子配列
への挿入は、例えば本実施例に記載したようにして実施
することができる。外来ペプチドをコードするDNAの導
入は、例えば、該ペプチドコードDNAと上記のユニーク
な制限酵素認識配列とを有するオリゴヌクレオチドDNA
を合成し、対応する酵素で消化したHIループコード配列
に直接ライゲーションすることによって達成することが
できる。
への挿入は、例えば本実施例に記載したようにして実施
することができる。外来ペプチドをコードするDNAの導
入は、例えば、該ペプチドコードDNAと上記のユニーク
な制限酵素認識配列とを有するオリゴヌクレオチドDNA
を合成し、対応する酵素で消化したHIループコード配列
に直接ライゲーションすることによって達成することが
できる。
【００１４】外来ペプチドをコードするDNAとしては、
限定されるものではないが、例えば、RGDを含むペプチ
ドをコードするDNA、NGRを含むペプチドをコードするDN
A、ヘパラン硫酸との親和性を有するペプチド(KKKKKK
K：配列番号１)をコードするDNA、ラミニン受容体との
親和性を有するペプチド(TS(GYIGSR)3SS：配列番号２ま
たはTSAA(SIKVAV)2：配列番号３)をコードするDNA、E-
セレクチンとの親和性を有するペプチド(TRSDITWDQLWDL
MKTS：配列番号４)をコードするDNA等を選択することに
より、ベクターの行き先(組織・細胞等)における遺伝子
導入効率を改善することができる。従って、外来ペプチ
ドとして例えば腫瘍血管内皮細胞に対して指向性を有す
ることが報告されているペプチド、例えばRGDやNGRを含
むペプチドを選択すれば、種々の腫瘍の治療に有用なベ
クターを作製することができる。
限定されるものではないが、例えば、RGDを含むペプチ
ドをコードするDNA、NGRを含むペプチドをコードするDN
A、ヘパラン硫酸との親和性を有するペプチド(KKKKKK
K：配列番号１)をコードするDNA、ラミニン受容体との
親和性を有するペプチド(TS(GYIGSR)3SS：配列番号２ま
たはTSAA(SIKVAV)2：配列番号３)をコードするDNA、E-
セレクチンとの親和性を有するペプチド(TRSDITWDQLWDL
MKTS：配列番号４)をコードするDNA等を選択することに
より、ベクターの行き先(組織・細胞等)における遺伝子
導入効率を改善することができる。従って、外来ペプチ
ドとして例えば腫瘍血管内皮細胞に対して指向性を有す
ることが報告されているペプチド、例えばRGDやNGRを含
むペプチドを選択すれば、種々の腫瘍の治療に有用なベ
クターを作製することができる。
【００１５】RGDを含むペプチドとしては、RGD配列を含
みかつ細胞表面のインテグリンに対する結合親和性を有
する限り限定されるものではないが、例えば、RGDを含
めて5〜20個のアミノ酸からなるものが好ましく、具体
的には、例えば、RGD-4Cペプチド(CDCRGDCFC：配列番号
５)を挙げることができる。
みかつ細胞表面のインテグリンに対する結合親和性を有
する限り限定されるものではないが、例えば、RGDを含
めて5〜20個のアミノ酸からなるものが好ましく、具体
的には、例えば、RGD-4Cペプチド(CDCRGDCFC：配列番号
５)を挙げることができる。
【００１６】外来ペプチドとしてRGD-4Cペプチドを選択
した場合、該ペプチドはCARだけでなくインテグリンと
も結合親和性を有することから、アデノウイルス感受性
の細胞だけでなく、CARの発現が乏しいために従来のウ
イルスベクターが適用できない細胞、例えば、CHO細
胞、気道上皮細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、Ｔ細
胞、マクロファージ、造血幹細胞、樹状細胞、インテグ
リンを細胞表面に有する癌細胞（例えばヒトグリオーマ
細胞LN444）等への遺伝子導入効率を改善することがで
きる。
した場合、該ペプチドはCARだけでなくインテグリンと
も結合親和性を有することから、アデノウイルス感受性
の細胞だけでなく、CARの発現が乏しいために従来のウ
イルスベクターが適用できない細胞、例えば、CHO細
胞、気道上皮細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、Ｔ細
胞、マクロファージ、造血幹細胞、樹状細胞、インテグ
リンを細胞表面に有する癌細胞（例えばヒトグリオーマ
細胞LN444）等への遺伝子導入効率を改善することがで
きる。
【００１７】またNGRを含むペプチドとしては、NGR配列
を含みかつ細胞表面のアミノペプチダーゼＮ（CD13）に
対する結合親和性を有する限り限定されるものではない
が、例えば、NGRを含めて5〜20個のアミノ酸からなるも
のが好ましく、具体的には、例えば、NGR関連ペプチド
(CNGRCVSGCAGRC：配列番号６)を挙げることができる。
を含みかつ細胞表面のアミノペプチダーゼＮ（CD13）に
対する結合親和性を有する限り限定されるものではない
が、例えば、NGRを含めて5〜20個のアミノ酸からなるも
のが好ましく、具体的には、例えば、NGR関連ペプチド
(CNGRCVSGCAGRC：配列番号６)を挙げることができる。
【００１８】外来ペプチドとしてNGR関連ペプチドを選
択した場合、該ペプチドはCARだけでなくアミノペプチ
ダーゼＮ／CD13とも結合親和性を有することから、アデ
ノウイルス感受性の細胞だけでなく、CARの発現が乏し
いために従来のウイルスベクターが適用できない細胞、
例えば癌新生血管等のCD13発現細胞（例えばヒトグリオ
ーマ細胞LN444）への特異的な遺伝子導入を達成するこ
とができる。
択した場合、該ペプチドはCARだけでなくアミノペプチ
ダーゼＮ／CD13とも結合親和性を有することから、アデ
ノウイルス感受性の細胞だけでなく、CARの発現が乏し
いために従来のウイルスベクターが適用できない細胞、
例えば癌新生血管等のCD13発現細胞（例えばヒトグリオ
ーマ細胞LN444）への特異的な遺伝子導入を達成するこ
とができる。
【００１９】
【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらにより限定されるもので
はない。 〔実施例１〕 ファイバーのHIループに外来ペプチドを
付与したアデノウイルスベクターの作製−１ 本実施例では、ファイバーのHIループをコードする遺伝
子配列部分にユニークな制限酵素であるCsp45IおよびCl
aIの認識部位を利用した。まず、ベクタープラスミドpA
dHM15,16,17および18を以下のようにして構築した。
に説明するが、本発明はこれらにより限定されるもので
はない。 〔実施例１〕 ファイバーのHIループに外来ペプチドを
付与したアデノウイルスベクターの作製−１ 本実施例では、ファイバーのHIループをコードする遺伝
子配列部分にユニークな制限酵素であるCsp45IおよびCl
aIの認識部位を利用した。まず、ベクタープラスミドpA
dHM15,16,17および18を以下のようにして構築した。
【００２０】５型アデノウイルスゲノムの右末端部(273
31位の塩基から右末端まで(途中、27865〜30995位(E3領
域)は欠損している)を含むプラスミドpEco-ITR1を制限
酵素ApaIおよびMunIで切断した。これをpBR-322由来の
プラスミドpBR-AM2(AatIIとBsaIの認識配列の間にAgeI
とMunIの認識配列を有し、PvuII認識配列からBst 1107I
の認識配列までが欠損している)のApaI／MunI制限断片
と連結することにより、pBR-AM3を得た。このpBR-AM3は
アデノウイルスゲノムの31905〜32825位を有していた。
31位の塩基から右末端まで(途中、27865〜30995位(E3領
域)は欠損している)を含むプラスミドpEco-ITR1を制限
酵素ApaIおよびMunIで切断した。これをpBR-322由来の
プラスミドpBR-AM2(AatIIとBsaIの認識配列の間にAgeI
とMunIの認識配列を有し、PvuII認識配列からBst 1107I
の認識配列までが欠損している)のApaI／MunI制限断片
と連結することにより、pBR-AM3を得た。このpBR-AM3は
アデノウイルスゲノムの31905〜32825位を有していた。
【００２１】次に、pBR-AM3のApaI／AseI制限断片、Apa
I／BsmAI制限断片、BsaAI制限断片、ならびにオリゴヌ
クレオチド１(5'−AACAGGAGACACAACTTCGAAC［ATCGAT］C
CAAGTGCATACTCTATGTCATTTTCATGGGACTGGTCTGGCCACAACTAC
AT−3'：配列番号７)および２(5'−TAATGTAGTTGTGGCCAG
ACCAGTCCCATGAAAATGACATAGAGTATGCACTTGG［ATCGAT］GTT
CGAAGTTGTGTCTCC−3'：配列番号８)を使用(Csp45Iおよ
びClaI(ジアンチピリルメタン(Dam)でメチル化されてい
る)認識部位をそれぞれ下線および括弧［］で示す）し
て、４-ピースライゲーション反応を行ない、プラスミ
ドpBR-AM4を得た。
I／BsmAI制限断片、BsaAI制限断片、ならびにオリゴヌ
クレオチド１(5'−AACAGGAGACACAACTTCGAAC［ATCGAT］C
CAAGTGCATACTCTATGTCATTTTCATGGGACTGGTCTGGCCACAACTAC
AT−3'：配列番号７)および２(5'−TAATGTAGTTGTGGCCAG
ACCAGTCCCATGAAAATGACATAGAGTATGCACTTGG［ATCGAT］GTT
CGAAGTTGTGTCTCC−3'：配列番号８)を使用(Csp45Iおよ
びClaI(ジアンチピリルメタン(Dam)でメチル化されてい
る)認識部位をそれぞれ下線および括弧［］で示す）し
て、４-ピースライゲーション反応を行ない、プラスミ
ドpBR-AM4を得た。
【００２２】さらに、pBR-AM4のHpaI／MunI制限断片とp
Eco-ITR5(５型アデノウイルスゲノムの右末端(27331位
の塩基からゲノムの右末端まで(途中、28133〜30818位
(E3領域)が欠損している))を含む)のHpaI／MunI制限断
片とを連結してpEco-AM4を構築した。
Eco-ITR5(５型アデノウイルスゲノムの右末端(27331位
の塩基からゲノムの右末端まで(途中、28133〜30818位
(E3領域)が欠損している))を含む)のHpaI／MunI制限断
片とを連結してpEco-AM4を構築した。
【００２３】最後に、pAdHM2の誘導体であるpAdHM2-1の
SrfI／ClaI制限断片と上記pEco-AM4のSrfI／ClaI制限断
片とを連結し、その後アデノウイルスゲノムの右末端の
ClaI認識配列を、オリゴヌクレオチド３(5'−CGTTAATTA
A−3'：配列番号９；PacI認識配列を下線で示す)を用い
てライゲ−ションすることにより、PacI認識配列に置き
換えてpAdHM15を得た。また、pAdHM16,17および18も同
様にして構築した(図１Ａ)。
SrfI／ClaI制限断片と上記pEco-AM4のSrfI／ClaI制限断
片とを連結し、その後アデノウイルスゲノムの右末端の
ClaI認識配列を、オリゴヌクレオチド３(5'−CGTTAATTA
A−3'：配列番号９；PacI認識配列を下線で示す)を用い
てライゲ−ションすることにより、PacI認識配列に置き
換えてpAdHM15を得た。また、pAdHM16,17および18も同
様にして構築した(図１Ａ)。
【００２４】これらのプラスミドpAdHM15,16,17および1
8はE1/E3領域を除く全アデノウイルスゲノムを有してお
り、E1欠損領域にはユニーク部位のI-CeuI、SwaI、およ
びPI-SceI認識配列を、またゲノム32679位と32680位(そ
れぞれ、ファイバータンパク質のトレオニン残基(546
位)およびプロリン残基(547位)に対応している)の間に
は、それぞれCsp45IとClaI(Damでメチル化されている)
(pAdHM15)、ClaI(pAdHM16)、Csp45I(pAdHM17,18)認識配
列を有していた(図１)。それぞれのプラスミドのHIルー
プ領域は、制限酵素認識配列の違いにより、新たに付与
された2〜3アミノ酸が異なっており、目的に応じて使い
分けることができる。
8はE1/E3領域を除く全アデノウイルスゲノムを有してお
り、E1欠損領域にはユニーク部位のI-CeuI、SwaI、およ
びPI-SceI認識配列を、またゲノム32679位と32680位(そ
れぞれ、ファイバータンパク質のトレオニン残基(546
位)およびプロリン残基(547位)に対応している)の間に
は、それぞれCsp45IとClaI(Damでメチル化されている)
(pAdHM15)、ClaI(pAdHM16)、Csp45I(pAdHM17,18)認識配
列を有していた(図１)。それぞれのプラスミドのHIルー
プ領域は、制限酵素認識配列の違いにより、新たに付与
された2〜3アミノ酸が異なっており、目的に応じて使い
分けることができる。
【００２５】次に、外来ペプチドに対応するオリゴヌク
レオチドDNAを有するプラスミドベクターを構築した。
外来ペプチドとして、RGD-4Cペプチド(CDCRGDCFC：配列
番号５)を選択し、このペプチドに対応するオリゴヌク
レオチドDNA（オリゴヌクレオチド４および５）を使用
した。まず、上記で構築したpAdHM15を、Csp45I／ClaI
で切断し、オリゴヌクレオチド４(5'−CGAAGTGTGACTGCC
GCGGAGACTGTTTCTG−3'：配列番号１０)および５(5'−CG
CAGAAACAGTCTCCGCGGCAGTCACACTT−3'：配列番号１１)と
連結した。
レオチドDNAを有するプラスミドベクターを構築した。
外来ペプチドとして、RGD-4Cペプチド(CDCRGDCFC：配列
番号５)を選択し、このペプチドに対応するオリゴヌク
レオチドDNA（オリゴヌクレオチド４および５）を使用
した。まず、上記で構築したpAdHM15を、Csp45I／ClaI
で切断し、オリゴヌクレオチド４(5'−CGAAGTGTGACTGCC
GCGGAGACTGTTTCTG−3'：配列番号１０)および５(5'−CG
CAGAAACAGTCTCCGCGGCAGTCACACTT−3'：配列番号１１)と
連結した。
【００２６】次いで、連結した上記DNAを大腸菌DH5株に
導入して形質転換し、pAdHM15-RGDを得た(図２)。pAdHM
15,16,17および18について、外来オリゴヌクレオチドの
挿入部位周辺の配列、および各ベクタープラスミドに対
して合成されうるオリゴヌクレオチドを図１(それぞれ
Ｂ、Ｃ)に示す。
導入して形質転換し、pAdHM15-RGDを得た(図２)。pAdHM
15,16,17および18について、外来オリゴヌクレオチドの
挿入部位周辺の配列、および各ベクタープラスミドに対
して合成されうるオリゴヌクレオチドを図１(それぞれ
Ｂ、Ｃ)に示す。
【００２７】制限酵素Csp45IおよびClaIは互いに適合性
を有する接着型末端を生じ、上記オリゴヌクレオチドを
いずれの方向でも挿入することができるため、陽性プラ
スミド(オリゴヌクレオチドが順方向に挿入されたもの)
がCsp45I認識配列を有し、かつClaI認識配列を含まない
ように、これらのオリゴヌクレオチドを設計した(図
２)。自己連結させたプラスミド、および上記オリゴヌ
クレオチドが逆方向に連結されているプラスミドでは、
いずれもCsp45I認識配列を有していなかった。このた
め、陽性クローンを制限酵素Csp45IおよびClaIの切断パ
ターンの違いにより容易に同定することができた。さら
に、pAdHM15-RGDに挿入されたオリゴヌクレオチドの配
列を遺伝子配列解析によって決定することにより、クロ
ーンが適切な配列を含んでいることを確認した。
を有する接着型末端を生じ、上記オリゴヌクレオチドを
いずれの方向でも挿入することができるため、陽性プラ
スミド(オリゴヌクレオチドが順方向に挿入されたもの)
がCsp45I認識配列を有し、かつClaI認識配列を含まない
ように、これらのオリゴヌクレオチドを設計した(図
２)。自己連結させたプラスミド、および上記オリゴヌ
クレオチドが逆方向に連結されているプラスミドでは、
いずれもCsp45I認識配列を有していなかった。このた
め、陽性クローンを制限酵素Csp45IおよびClaIの切断パ
ターンの違いにより容易に同定することができた。さら
に、pAdHM15-RGDに挿入されたオリゴヌクレオチドの配
列を遺伝子配列解析によって決定することにより、クロ
ーンが適切な配列を含んでいることを確認した。
【００２８】次いで、シャトルプラスミドpHMCMV5(H.Mi
zuguchi, M.A.Kay., A simple method for constructin
g E1 and E1/E4 deleted recombinant adenovirus vect
or.Hum.Gene Ther.10(1999)2013-2017)にpCMVβ(クロン
テック社)由来のβガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子を挿
入することにより、pHMCMVLacZ-1を作製した。
zuguchi, M.A.Kay., A simple method for constructin
g E1 and E1/E4 deleted recombinant adenovirus vect
or.Hum.Gene Ther.10(1999)2013-2017)にpCMVβ(クロン
テック社)由来のβガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子を挿
入することにより、pHMCMVLacZ-1を作製した。
【００２９】さらに、I-CeuI／PI-SceIで消化したpAdHM
15-RGD およびpHMCMVLacZ-1をin vitroライゲーション
により連結し、pAdHM15-RGD-LacZを構築した(図２)。こ
こで、I-CeuIおよびPI-SceIは、それぞれ少なくとも9〜
10、11塩基からなる配列を認識する稀な切断酵素であ
る。
15-RGD およびpHMCMVLacZ-1をin vitroライゲーション
により連結し、pAdHM15-RGD-LacZを構築した(図２)。こ
こで、I-CeuIおよびPI-SceIは、それぞれ少なくとも9〜
10、11塩基からなる配列を認識する稀な切断酵素であ
る。
【００３０】野生型ファイバータンパク質を有する対照
ウイルス調製用プラスミドとして、pAdHM4とpHMCMVLacZ
-1とを連結してpAdHM4-LacZを構築した。上記pAdHM15-R
GD-LacZ とpAdHM4-LacZはいずれも、サイトメガロウイ
ルス(CMV)プロモーター駆動性LacZ遺伝子およびウシ成
長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルを含んでい
た。
ウイルス調製用プラスミドとして、pAdHM4とpHMCMVLacZ
-1とを連結してpAdHM4-LacZを構築した。上記pAdHM15-R
GD-LacZ とpAdHM4-LacZはいずれも、サイトメガロウイ
ルス(CMV)プロモーター駆動性LacZ遺伝子およびウシ成
長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルを含んでい
た。
【００３１】次に、上記２つのプラスミドpAdHM15-RGD-
LacZ およびpAdHM4-LacZをPacIで消化して線状化し、こ
れをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈
殿に供して精製した。線状化したpAdHM15-RGD-LacZ とp
AdHM4-LacZを293細胞にトランスフェクトして各プラス
ミド由来のウイルスを調製し（AdHM15-RGD-LacZ、AdHM4
-LacZ）、CsCl2段階勾配超遠心、次いでCsCl2直線勾配
超遠心に供して精製した。
LacZ およびpAdHM4-LacZをPacIで消化して線状化し、こ
れをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈
殿に供して精製した。線状化したpAdHM15-RGD-LacZ とp
AdHM4-LacZを293細胞にトランスフェクトして各プラス
ミド由来のウイルスを調製し（AdHM15-RGD-LacZ、AdHM4
-LacZ）、CsCl2段階勾配超遠心、次いでCsCl2直線勾配
超遠心に供して精製した。
【００３２】ウイルス粒子の力価はMaizelらの方法(Mai
zel,J.V.J., White,D.O. and Scharff,M.D. (1968). Th
e polypeptides of adenovirus. I. Evidence for mult
ipleprotein components in the virion and a compari
son of types 2, 7A, and 12. Virology. 36, 115-12
5.)に従い、ウイルスDNAを分光光学的に測定した。その
結果、AdHM15-RGD-LacZの力価は5.28×1011 particle t
iter/mL、AdHM4-LacZの力価は2.02×1012 particle tit
er/mLであった。
zel,J.V.J., White,D.O. and Scharff,M.D. (1968). Th
e polypeptides of adenovirus. I. Evidence for mult
ipleprotein components in the virion and a compari
son of types 2, 7A, and 12. Virology. 36, 115-12
5.)に従い、ウイルスDNAを分光光学的に測定した。その
結果、AdHM15-RGD-LacZの力価は5.28×1011 particle t
iter/mL、AdHM4-LacZの力価は2.02×1012 particle tit
er/mLであった。
【００３３】また、ベクタープラスミド(pAdHM15-RGDも
しくはpAdHM15-RGD-LacZ)またはファイバー中にRGDペプ
チドを有するLacZ発現組換えアデノウイルスDNA(AdHM15
-RGD-LacZ)について、DNA制限分析(制限酵素としてHind
III/PacI、Csp45I/PacI、HindIIIまたはCsp45Iを使用
し、0.7％アガロースゲル上で電気泳動)を行なった。各
レーンは以下の通りである。
しくはpAdHM15-RGD-LacZ)またはファイバー中にRGDペプ
チドを有するLacZ発現組換えアデノウイルスDNA(AdHM15
-RGD-LacZ)について、DNA制限分析(制限酵素としてHind
III/PacI、Csp45I/PacI、HindIIIまたはCsp45Iを使用
し、0.7％アガロースゲル上で電気泳動)を行なった。各
レーンは以下の通りである。
【００３４】レーン１：１kb DNAラダーマーカー。 レーン２：HindIII/PacI消化したpAdHM15-RGD。 レーン３：Csp45I/PacI消化したpAdHM15-RGD。 レーン４：HindIII/PacI消化したpAdHM15-RGD-LacZ。 レーン５：Csp45I/PacI消化したpAdHM15-RGD-LacZ。 レーン６：HindIII消化したAdHM15-RGD-LacZウイルスDN
A。 レーン７：Csp45I消化したAdHM15-RGD-LacZウイルスDN
A。 結果を図３Ａに示す。
A。 レーン７：Csp45I消化したAdHM15-RGD-LacZウイルスDN
A。 結果を図３Ａに示す。
【００３５】（結果）結果より、LacZカセットを含むか
または含まないベクタープラスミド、すなわち、pAdHM1
5-RGD、pAdHM15-RGD-LacZ、あるいはウイルスDNA、即
ち、AdHM15-RGD-LacZが、予想された断片（表１）を含
むことが示された（図３）。
または含まないベクタープラスミド、すなわち、pAdHM1
5-RGD、pAdHM15-RGD-LacZ、あるいはウイルスDNA、即
ち、AdHM15-RGD-LacZが、予想された断片（表１）を含
むことが示された（図３）。
【００３６】
【表１】
【００３７】得られたベクターAdHM15-RGD-LacZの遺伝
子導入効率を、後述の実施例４において解析した。
子導入効率を、後述の実施例４において解析した。
【００３８】〔実施例２〕 ファイバーのHIループに外
来ペプチドを付与したアデノウイルスベクターの作製−
２ ベクタープラスミドpAdHM15-RGDの構築方法は、実施例
１に示した通りである。
来ペプチドを付与したアデノウイルスベクターの作製−
２ ベクタープラスミドpAdHM15-RGDの構築方法は、実施例
１に示した通りである。
【００３９】シャトルプラスミドpHMCMV6(H.Mizuguchi,
M.A.Kay., A simple method for constructing E1 and
E1/E4 deleted recombinant adenovirus vector. Hum.
GeneTher.10(1999)2013-2017)にpGL3-Control(プロメガ
社)由来のルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を挿入することに
より、pCMVL1を作製した。
M.A.Kay., A simple method for constructing E1 and
E1/E4 deleted recombinant adenovirus vector. Hum.
GeneTher.10(1999)2013-2017)にpGL3-Control(プロメガ
社)由来のルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を挿入することに
より、pCMVL1を作製した。
【００４０】さらに、前記pAdHM15-RGD およびルシフェ
ラーゼをコードしたpCMVL1をI-CeuI／PI-SceIで消化
後、in vitroライゲーションにより連結してpAdHM15-RG
D-CMVL2を構築した(図４)。
ラーゼをコードしたpCMVL1をI-CeuI／PI-SceIで消化
後、in vitroライゲーションにより連結してpAdHM15-RG
D-CMVL2を構築した(図４)。
【００４１】野生型ファイバータンパク質を有する対照
ウイルス調製用プラスミドとして、pAdHM4とpCMVL1とを
連結してpAdHM4-CMVL2を構築した。上記pAdHM15-RGD-CM
VL2 とpAdHM4-CMVL2はいずれも、CMVプロモーター駆動
性Luc遺伝子およびBGHポリアデニル化シグナルを含んで
いた。
ウイルス調製用プラスミドとして、pAdHM4とpCMVL1とを
連結してpAdHM4-CMVL2を構築した。上記pAdHM15-RGD-CM
VL2 とpAdHM4-CMVL2はいずれも、CMVプロモーター駆動
性Luc遺伝子およびBGHポリアデニル化シグナルを含んで
いた。
【００４２】次に、上記２つのプラスミドpAdHM15-RGD-
CMVL2およびpAdHM4-CMVL2をPacIで消化して線状化し、
これをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール
沈殿に供して精製した。線状化したpAdHM15-RGD-CMVL2
とpAdHM4-CMVL2を293細胞にトランスフェクトして各プ
ラスミド由来のウイルスを調製し（AdHM15-RGD-L2、AdH
M4-L2）、CsCl2段階勾配超遠心、次いでCsCl2直線勾配
超遠心に供して精製した。得られたベクターAdHM15-RGD
-L2およびAdHM4-L2（対照）の遺伝子導入効率を、後述
の実施例５において解析した。
CMVL2およびpAdHM4-CMVL2をPacIで消化して線状化し、
これをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール
沈殿に供して精製した。線状化したpAdHM15-RGD-CMVL2
とpAdHM4-CMVL2を293細胞にトランスフェクトして各プ
ラスミド由来のウイルスを調製し（AdHM15-RGD-L2、AdH
M4-L2）、CsCl2段階勾配超遠心、次いでCsCl2直線勾配
超遠心に供して精製した。得られたベクターAdHM15-RGD
-L2およびAdHM4-L2（対照）の遺伝子導入効率を、後述
の実施例５において解析した。
【００４３】〔実施例３〕 ファイバーのHIループに外
来ペプチドを付与したアデノウイルスベクターの作製−
３ ベクタープラスミドpAdHM15の構築方法は、実施例１に
示した通りである。外来ペプチドとして、NGR関連ペプ
チド(CNGRCVSGCAGRC：配列番号６)を選択し、このペプ
チドに対応するオリゴヌクレオチドDNA(オリゴヌクレオ
チド６および７)を使用した。
来ペプチドを付与したアデノウイルスベクターの作製−
３ ベクタープラスミドpAdHM15の構築方法は、実施例１に
示した通りである。外来ペプチドとして、NGR関連ペプ
チド(CNGRCVSGCAGRC：配列番号６)を選択し、このペプ
チドに対応するオリゴヌクレオチドDNA(オリゴヌクレオ
チド６および７)を使用した。
【００４４】まず、上記で構築したpAdHM15を、Csp45I
／ClaIで切断し、オリゴヌクレオチド６(5'−CGGCTGCAA
CGGCCGCTGCGTGAGCGGCTGCGCCGGCCGCTG−3'：配列番号１
２)および７(5'−CGCAGCGGCCGGCGCAGCCGCTCACGCAGCGGCC
GTTGCAGC−3'：配列番号１３)と連結した。次いで、連
結した上記DNAを大腸菌DH5株に導入して形質転換し、pA
dHM15-NGRを得た。I-CeuI／PI-SceIで消化したpAdHM15-
NGR およびpCMVL1をin vitroライゲーションにより連結
し、pAdHM15-NGR-CMVL2を構築した。pAdHM15-NGR-CMVL2
は、CMVプロモーター駆動性Luc遺伝子およびBGHポリア
デニル化シグナルを含んでいた。
／ClaIで切断し、オリゴヌクレオチド６(5'−CGGCTGCAA
CGGCCGCTGCGTGAGCGGCTGCGCCGGCCGCTG−3'：配列番号１
２)および７(5'−CGCAGCGGCCGGCGCAGCCGCTCACGCAGCGGCC
GTTGCAGC−3'：配列番号１３)と連結した。次いで、連
結した上記DNAを大腸菌DH5株に導入して形質転換し、pA
dHM15-NGRを得た。I-CeuI／PI-SceIで消化したpAdHM15-
NGR およびpCMVL1をin vitroライゲーションにより連結
し、pAdHM15-NGR-CMVL2を構築した。pAdHM15-NGR-CMVL2
は、CMVプロモーター駆動性Luc遺伝子およびBGHポリア
デニル化シグナルを含んでいた。
【００４５】次に、プラスミドpAdHM15-NGR-CMVL2をPac
Iで消化して線状化し、これをフェノール−クロロホル
ム抽出およびエタノール沈殿に供して精製した。線状化
したpAdHM15-NGR-CMVL2を293細胞にトランスフェクトし
てプラスミド由来のウイルス（AdHM15-NGR-L2）を調製
し、CsCl2段階勾配超遠心、次いでCsCl2直線勾配超遠心
に供して精製した。得られたベクターAdHM15-NGR-L2の
遺伝子導入効率を、後述の実施例５において解析した。
Iで消化して線状化し、これをフェノール−クロロホル
ム抽出およびエタノール沈殿に供して精製した。線状化
したpAdHM15-NGR-CMVL2を293細胞にトランスフェクトし
てプラスミド由来のウイルス（AdHM15-NGR-L2）を調製
し、CsCl2段階勾配超遠心、次いでCsCl2直線勾配超遠心
に供して精製した。得られたベクターAdHM15-NGR-L2の
遺伝子導入効率を、後述の実施例５において解析した。
【００４６】〔実施例４〕 遺伝子導入効率の解析−１ 実施例１で作製したベクターAdHM15-RGD-LacZ中に挿入
したRGD-4Cペプチドの機能を調べるために、AdHM15-RGD
-LacZおよびAdHM4-LacZ(対照)の遺伝子導入効率を、CAR
の発現を有しアデノウイルスに感受性のSK-HEP1細胞
と、非感受性（CARの発現がないため）のCHO細胞を用い
て解析した。ここで、SK-HEP1細胞はヒト肝臓血管内皮
細胞に由来し、Dr.Mark A.Kay(Stanford Univ.)より供
与されたものである。またCHO細胞(chinese hamster ov
ary cell)は、Dr.Tadanori Mayumi(真弓忠範博士，大阪
大学)より供与されたものである。
したRGD-4Cペプチドの機能を調べるために、AdHM15-RGD
-LacZおよびAdHM4-LacZ(対照)の遺伝子導入効率を、CAR
の発現を有しアデノウイルスに感受性のSK-HEP1細胞
と、非感受性（CARの発現がないため）のCHO細胞を用い
て解析した。ここで、SK-HEP1細胞はヒト肝臓血管内皮
細胞に由来し、Dr.Mark A.Kay(Stanford Univ.)より供
与されたものである。またCHO細胞(chinese hamster ov
ary cell)は、Dr.Tadanori Mayumi(真弓忠範博士，大阪
大学)より供与されたものである。
【００４７】まず、SK-HEP1細胞およびCHO細胞を、AdHM
15-RGD-LacZ とAdHM4-LacZのベクター粒子1200個／細胞
および8000個／細胞のスケールで1.5時間形質転換し
た。２日後、LacZタンパク質の発現(すなわちLacZ酵素
活性)を、発光β-ガラクトシダーゼ検出キット(クロン
テック社)を用いた発光アッセイおよびX-gal(5-ブロモ-
4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)染色
により確認した(図５)。LacZ酵素活性の程度は、キット
に付属の標準物質を指標として評価した。
15-RGD-LacZ とAdHM4-LacZのベクター粒子1200個／細胞
および8000個／細胞のスケールで1.5時間形質転換し
た。２日後、LacZタンパク質の発現(すなわちLacZ酵素
活性)を、発光β-ガラクトシダーゼ検出キット(クロン
テック社)を用いた発光アッセイおよびX-gal(5-ブロモ-
4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)染色
により確認した(図５)。LacZ酵素活性の程度は、キット
に付属の標準物質を指標として評価した。
【００４８】（結果）SK HEP-1細胞では、AdHM15-RGD-L
acZ(RGDファイバー)とAdHM4-LacZ(野生型ファイバー)で
の形質転換後に検出されたLacZ酵素活性の差は２倍程度
であったが(図５Ａ)、CHO細胞においてはその差は４０
倍にも達し、AdHM15-RGD-LacZで形質転換した方がその
活性が高かった。また、AdHM15-RGD-LacZおよびAdHM4-L
acZで形質転換したCHO細胞における X-gal陽性細胞の割
合は、上記発光アッセイの結果と非常によく相関してい
た(図５Ｂ)。
acZ(RGDファイバー)とAdHM4-LacZ(野生型ファイバー)で
の形質転換後に検出されたLacZ酵素活性の差は２倍程度
であったが(図５Ａ)、CHO細胞においてはその差は４０
倍にも達し、AdHM15-RGD-LacZで形質転換した方がその
活性が高かった。また、AdHM15-RGD-LacZおよびAdHM4-L
acZで形質転換したCHO細胞における X-gal陽性細胞の割
合は、上記発光アッセイの結果と非常によく相関してい
た(図５Ｂ)。
【００４９】これらのことから、RGDファイバーを有す
るAdHM15-RGD-LacZ がRGD-CAR結合経由だけでなくRGD-
インテグリン結合経由でも感染し、遺伝子を効率的に導
入できることが確認された（ペントンベースのRGDモチ
ーフとインテグリンとの結合は、感染の第一ステップと
しては働かないことが知られている）。
るAdHM15-RGD-LacZ がRGD-CAR結合経由だけでなくRGD-
インテグリン結合経由でも感染し、遺伝子を効率的に導
入できることが確認された（ペントンベースのRGDモチ
ーフとインテグリンとの結合は、感染の第一ステップと
しては働かないことが知られている）。
【００５０】尚、AdHM15-RGD-LacZ はCARとインテグリ
ンのどちらを経由しても感染できるため、SK-HEP1細胞
ではAdHM4-LacZに比べやや遺伝子導入効率が高くなった
ものと考えられる。従って、ファイバーにRGD-4Cペプチ
ドを付与することにより、CHO細胞等のCAR欠損細胞に効
率的に遺伝子を導入できることが示された。
ンのどちらを経由しても感染できるため、SK-HEP1細胞
ではAdHM4-LacZに比べやや遺伝子導入効率が高くなった
ものと考えられる。従って、ファイバーにRGD-4Cペプチ
ドを付与することにより、CHO細胞等のCAR欠損細胞に効
率的に遺伝子を導入できることが示された。
【００５１】〔実施例５〕 遺伝子導入効率の解析 ２ 実施例２で作製したベクターAdHM15-RGD-L2中に挿入し
たRGD-4Cペプチドおよび、実施例３で作製したベクター
AdHM15-NGR-L2中に挿入したNGR関連ペプチドの機能を調
べるために、AdHM15-RGD-L2、AdHM15-NGR-L2およびAdHM
4-L2(対照)の遺伝子導入効率を、CARの発現を有しアデ
ノウイルスに感受性のSK-HEP1細胞と、非感受性（CARの
発現がないため）のLN444細胞を用いて解析した。ここ
で、LN444細胞はヒトグリオーマ細胞であり、Dr.Mitsuh
iro Tada（多田光宏博士，北海道大学）より供与された
ものであり、その細胞表面にはRGDペプチドのターゲッ
トインテグリン(αvβ3あるいはαvβ5)およびアミノペ
プチダーゼＮ／CD13を発現している。
たRGD-4Cペプチドおよび、実施例３で作製したベクター
AdHM15-NGR-L2中に挿入したNGR関連ペプチドの機能を調
べるために、AdHM15-RGD-L2、AdHM15-NGR-L2およびAdHM
4-L2(対照)の遺伝子導入効率を、CARの発現を有しアデ
ノウイルスに感受性のSK-HEP1細胞と、非感受性（CARの
発現がないため）のLN444細胞を用いて解析した。ここ
で、LN444細胞はヒトグリオーマ細胞であり、Dr.Mitsuh
iro Tada（多田光宏博士，北海道大学）より供与された
ものであり、その細胞表面にはRGDペプチドのターゲッ
トインテグリン(αvβ3あるいはαvβ5)およびアミノペ
プチダーゼＮ／CD13を発現している。
【００５２】まず、SK-HEP1細胞およびLN444細胞それぞ
れ5×104個を、AdHM4-L2、AdHM15-RGD-L2およびAdHM15-
NGR-L2のベクター粒子100個／細胞、300個／細胞、1000
個／細胞および3000個／細胞のスケールで1.5時間形質
転換した。２日後、ルシフェラーゼ(Luc)タンパク質の
発現(すなわちLuc酵素活性)を、ルシフェラーゼレポー
ターアッセイキット(クロンテック社)を用いて確認した
(図６)。
れ5×104個を、AdHM4-L2、AdHM15-RGD-L2およびAdHM15-
NGR-L2のベクター粒子100個／細胞、300個／細胞、1000
個／細胞および3000個／細胞のスケールで1.5時間形質
転換した。２日後、ルシフェラーゼ(Luc)タンパク質の
発現(すなわちLuc酵素活性)を、ルシフェラーゼレポー
ターアッセイキット(クロンテック社)を用いて確認した
(図６)。
【００５３】（結果）SK HEP-1細胞では、AdHM15-NGR-L
2 (NGRファイバー；▲)とAdHM4-L2 (対照：野生型ファ
イバー；○)での形質転換後に検出されたLuc酵素活性の
差は２倍程度であったが、AdHM15-RGD-L2(RGDファイバ
ー；●)においてはその差は10倍に達し、AdHM15-RGD-L2
で形質転換した方がその活性が高かった(図６Ａ)。LN44
4細胞においては、AdHM15-NGR-L2(▲)とAdHM4-L2(対
照；○)での形質転換後に検出されたLuc酵素活性の差は
100倍に達し、AdHM15-NGR-L2で形質転換した方がその活
性が高かった。また、AdHM15-RGD-L2(●)においてはそ
の差は約1000倍に達した(図６Ｂ)。尚、図６横軸中の
「VP」は、vector particles（ベクター粒子数）を示
す。
2 (NGRファイバー；▲)とAdHM4-L2 (対照：野生型ファ
イバー；○)での形質転換後に検出されたLuc酵素活性の
差は２倍程度であったが、AdHM15-RGD-L2(RGDファイバ
ー；●)においてはその差は10倍に達し、AdHM15-RGD-L2
で形質転換した方がその活性が高かった(図６Ａ)。LN44
4細胞においては、AdHM15-NGR-L2(▲)とAdHM4-L2(対
照；○)での形質転換後に検出されたLuc酵素活性の差は
100倍に達し、AdHM15-NGR-L2で形質転換した方がその活
性が高かった。また、AdHM15-RGD-L2(●)においてはそ
の差は約1000倍に達した(図６Ｂ)。尚、図６横軸中の
「VP」は、vector particles（ベクター粒子数）を示
す。
【００５４】これらのことから、RGDファイバーを有す
るAdHM15-RGD-L2が、RGD-CAR結合経由だけでなくRGD-イ
ンテグリン結合経由でも感染し、遺伝子を効率的に導入
できることが再度確認された。さらに、NGRファイバー
を有するAdHM15-NGR-L2がRGD-CAR結合経由だけでなくNG
R-CD13結合経由でも感染し、遺伝子を効率的に導入でき
ることが確認された。従って、ファイバーにNGR関連ペ
プチドを付与することにより、LN444細胞等のCD13発現
細胞に効率的に遺伝子を導入できることが示された。
るAdHM15-RGD-L2が、RGD-CAR結合経由だけでなくRGD-イ
ンテグリン結合経由でも感染し、遺伝子を効率的に導入
できることが再度確認された。さらに、NGRファイバー
を有するAdHM15-NGR-L2がRGD-CAR結合経由だけでなくNG
R-CD13結合経由でも感染し、遺伝子を効率的に導入でき
ることが確認された。従って、ファイバーにNGR関連ペ
プチドを付与することにより、LN444細胞等のCD13発現
細胞に効率的に遺伝子を導入できることが示された。
【００５５】
【発明の効果】本発明の方法では、１ステップのin vit
roライゲーションにより、任意のペプチドをファイバー
HIループコード遺伝子配列に導入することができる。従
って、遺伝子導入効率の高いアデノウイルスベクターを
簡易な操作により作製することができる。
roライゲーションにより、任意のペプチドをファイバー
HIループコード遺伝子配列に導入することができる。従
って、遺伝子導入効率の高いアデノウイルスベクターを
簡易な操作により作製することができる。
【００５６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Koichi Shudo, Director-General, National Institute of Health Scien ces; Hiroyuki Mizuguchi; Takao Hayakawa <120> Adenovirus Vector <130> P01-0332 <150> JP 2000-161577 <151> 2000-05-31 <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide having affinity with h eparan sulfate. <400> 1 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide having affinity with l aminin receptor. <400> 2 Thr Ser Gly Tyr Ile Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Gly Ser Arg Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Gly Ser Arg Ser Ser 20 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide having affinity with l aminin receptor. <400> 3 Thr Ser Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ser Ile Lys Val Ala Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide having affinity with E -selectin. <400> 4 Thr Arg Ser Asp Ile Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys Thr 1 5 10 15 Ser <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: RGD-4C peptide. <400> 5 Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: NGR associating peptide. <400> 6 Cys Asn Gly Arg Cys Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide 1. <400> 7 aacaggagac acaacttcga acatcgatcc aagtgcatac tctatgtcat tttcatggga 60 ctggtctggc cacaactaca t 81 <210> 8 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide 2. <400> 8 taatgtagtt gtggccagac cagtcccatg aaaatgacat agagtatgca cttggatcga 60 tgttcgaagt tgtgtctcc 79 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide 3. <400> 9 cgttaattaa 10 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide 4. <400> 10 cgaagtgtga ctgccgcgga gactgtttct g 31 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide 5. <400> 11 cgcagaaaca gtctccgcgg cagtcacact t 31 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide 6. <400> 12 cggctgcaac ggccgctgcg tgagcggctg cgccggccgc tg 42 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide 7. <400> 13 cgcagcggcc ggcgcagccg ctcacgcagc ggccgttgca gc 42
【図１】ベクタープラスミドの特徴を示す。（Ａ）ベク
タープラスミドpAdHM15,16,17および18は、E1/E3欠損ア
デノウイルスゲノムDNAを含み、このゲノムDNAの32679
位と32680位との間にCsp45Iおよび／またはClaI部位を
含み、E1欠損領域にI-CeuI/SwaI/PI-SceI部位を含む。
（Ｂ）各ベクタープラスミドについて、外来オリゴヌク
レオチド挿入部位周辺の配列を示す。外来オリゴヌクレ
オチドはイタリック体で示す。（Ｃ）各プラスミドベク
ター用に合成するオリゴヌクレオチドを示す。pAdHM15
については、オリゴヌクレオチドが挿入された陽性のク
ローンが、Csp45Iでは切断されるがClaIでは切断されな
いように設計した時のオリゴヌクレオチドが示されてい
る。
タープラスミドpAdHM15,16,17および18は、E1/E3欠損ア
デノウイルスゲノムDNAを含み、このゲノムDNAの32679
位と32680位との間にCsp45Iおよび／またはClaI部位を
含み、E1欠損領域にI-CeuI/SwaI/PI-SceI部位を含む。
（Ｂ）各ベクタープラスミドについて、外来オリゴヌク
レオチド挿入部位周辺の配列を示す。外来オリゴヌクレ
オチドはイタリック体で示す。（Ｃ）各プラスミドベク
ター用に合成するオリゴヌクレオチドを示す。pAdHM15
については、オリゴヌクレオチドが挿入された陽性のク
ローンが、Csp45Iでは切断されるがClaIでは切断されな
いように設計した時のオリゴヌクレオチドが示されてい
る。
【図２】ファイバーノブのHIループにRGD-4Cペプチドを
含有し、E1欠損領域にLacZ発現カセットを含有するアデ
ノウイルスベクターの構築計画を示す。
含有し、E1欠損領域にLacZ発現カセットを含有するアデ
ノウイルスベクターの構築計画を示す。
【図３】制限エンドヌクレアーゼ分析の結果を示す。
（Ａ）ベクタープラスミド(pAdHM15-RGDもしくはpAdHM1
5-RGD-LacZ)またはファイバー中にRGDペプチドを有する
LacZ発現組換えアデノウイルスDNA(AdHM15-RGD-LacZ)を
HindIII/PacI、Csp45I/PacI、HindIIIまたはCsp45Iで消
化し、0.7％アガロースゲル上で電位泳動した結果であ
る。 レーン１：１kb DNAラダーマーカー。 レーン２：HindIII/PacI消化したpAdHM15-RGD。 レーン３：Csp45I/PacI消化したpAdHM15-RGD。 レーン４：HindIII/PacI消化したpAdHM15-RGD-LacZ。 レーン５：Csp45I/PacI消化したpAdHM15-RGD-LacZ。 レーン６：HindIII消化したAdHM15-RGD-LacZウイルスDN
A。 レーン７：Csp45I消化したAdHM15-RGD-LacZウイルスDN
A。 （Ｂ）組換えアデノウイルスベクター(AdHM15-RGD-Lac
Z)のHindIIIとCsp45I制限地図を示す。断片のサイズ(k
b)をゲノムの上下に示す。CMVはサイトメガロウイルス
中間-初期プロモーター／エンハンサーを表わし、P(A)
はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを表わす。
（Ａ）ベクタープラスミド(pAdHM15-RGDもしくはpAdHM1
5-RGD-LacZ)またはファイバー中にRGDペプチドを有する
LacZ発現組換えアデノウイルスDNA(AdHM15-RGD-LacZ)を
HindIII/PacI、Csp45I/PacI、HindIIIまたはCsp45Iで消
化し、0.7％アガロースゲル上で電位泳動した結果であ
る。 レーン１：１kb DNAラダーマーカー。 レーン２：HindIII/PacI消化したpAdHM15-RGD。 レーン３：Csp45I/PacI消化したpAdHM15-RGD。 レーン４：HindIII/PacI消化したpAdHM15-RGD-LacZ。 レーン５：Csp45I/PacI消化したpAdHM15-RGD-LacZ。 レーン６：HindIII消化したAdHM15-RGD-LacZウイルスDN
A。 レーン７：Csp45I消化したAdHM15-RGD-LacZウイルスDN
A。 （Ｂ）組換えアデノウイルスベクター(AdHM15-RGD-Lac
Z)のHindIIIとCsp45I制限地図を示す。断片のサイズ(k
b)をゲノムの上下に示す。CMVはサイトメガロウイルス
中間-初期プロモーター／エンハンサーを表わし、P(A)
はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを表わす。
【図４】ファイバーノブのHIループにRGD-4Cペプチドを
含有し、E1欠損領域にLuc発現カセットを含有するアデ
ノウイルスベクターの構築計画を示す。
含有し、E1欠損領域にLuc発現カセットを含有するアデ
ノウイルスベクターの構築計画を示す。
【図５】AdHM4-LacZとAdHM15-RGD-LacZにより形質導入
された培養細胞におけるLacZ発現を比較した図である。
（Ａ）LacZ発現を発光アッセイにより測定した結果。図
中(ａ)、(ｂ)はそれぞれ、ベクター粒子を(ａ) 1200個
／細胞、（ｂ）8000個／細胞用いた場合の結果を示す。
データは3回ずつ行なった試験データの平均値±S.D.で
示す。（Ｂ）CHO細胞（ベクター粒子1200個／細胞）に
おけるX-gal染色の結果。（ａ）はAdHM4-LacZ、（ｂ）
はAdHM15-RGD-LacZについての結果である。
された培養細胞におけるLacZ発現を比較した図である。
（Ａ）LacZ発現を発光アッセイにより測定した結果。図
中(ａ)、(ｂ)はそれぞれ、ベクター粒子を(ａ) 1200個
／細胞、（ｂ）8000個／細胞用いた場合の結果を示す。
データは3回ずつ行なった試験データの平均値±S.D.で
示す。（Ｂ）CHO細胞（ベクター粒子1200個／細胞）に
おけるX-gal染色の結果。（ａ）はAdHM4-LacZ、（ｂ）
はAdHM15-RGD-LacZについての結果である。
【図６】AdHM4-L2、AdHM15-RGD-L2およびAdHM15-NGR-L2
により形質導入された培養細胞におけるLuc発現を比較
した図である。それぞれAdHM4-L2は白丸（○）、AdHM15
-RGD-L2は黒丸（●）、AdHM15-NGR-L2は黒三角（▲）で
示す。（Ａ）SK HEP-1細胞におけるLuc発現を測定した
結果。（Ｂ）LN444細胞におけるLuc発現を測定した結
果。データは４回ずつ行なった試験データの平均値±S.
D.で示す。
により形質導入された培養細胞におけるLuc発現を比較
した図である。それぞれAdHM4-L2は白丸（○）、AdHM15
-RGD-L2は黒丸（●）、AdHM15-NGR-L2は黒三角（▲）で
示す。（Ａ）SK HEP-1細胞におけるLuc発現を測定した
結果。（Ｂ）LN444細胞におけるLuc発現を測定した結
果。データは４回ずつ行なった試験データの平均値±S.
D.で示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 水口 裕之 東京都世田谷区上用賀１−18−１ 国立医 薬品食品衛生研究所 生物薬品部内 (72)発明者 早川 堯夫 東京都世田谷区上用賀１−18−１ 国立医 薬品食品衛生研究所 生物薬品部内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA07 BA80 CA02 CA20 DA02 DA03 EA02 GA11 HA09 HA17 4C087 AA02 BC83 NA20 ZB26
Claims (8)
- 【請求項１】 ファイバーのHIループコード遺伝子配列
に、ユニークな制限酵素認識配列を挿入し、該遺伝子配
列中に外来ペプチドコードDNAを導入することを特徴と
する、ファイバーミュータントアデノウイルスベクター
の作製方法。 - 【請求項２】 ユニークな制限酵素がCsp45Iおよび／ま
たはClaIである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 外来ペプチドが腫瘍血管内皮細胞に対し
て指向性を有するペプチドである、請求項１または２記
載の方法。 - 【請求項４】 腫瘍血管内皮細胞に対して指向性を有す
るペプチドがトリペプチド：R-G-Dを含むペプチドであ
る、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 腫瘍血管内皮細胞に対して指向性を有す
るペプチドがトリペプチド：N-G-Rを含むペプチドであ
る、請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法により作製されるファイバーミュータントアデノウイ
ルスベクター。 - 【請求項７】 ファイバーのHIループコード遺伝子配列
に、ユニークな制限酵素部位を有することを特徴とす
る、アデノウイルスベクター。 - 【請求項８】 ユニークな制限酵素がCsp45Iおよび／ま
たはClaIである、請求項７記載のアデノウイルスベクタ
ー。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001131688A JP3635462B2 (ja) | 2000-05-31 | 2001-04-27 | アデノウイルスベクター |
| US09/845,160 US6921663B2 (en) | 2000-05-31 | 2001-05-01 | Adenovirus vector |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000161577 | 2000-05-31 | ||
| JP2000-161577 | 2000-05-31 | ||
| JP2001131688A JP3635462B2 (ja) | 2000-05-31 | 2001-04-27 | アデノウイルスベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002272480A true JP2002272480A (ja) | 2002-09-24 |
| JP3635462B2 JP3635462B2 (ja) | 2005-04-06 |
Family
ID=26592986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001131688A Expired - Lifetime JP3635462B2 (ja) | 2000-05-31 | 2001-04-27 | アデノウイルスベクター |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6921663B2 (ja) |
| JP (1) | JP3635462B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011052504A1 (ja) | 2009-10-28 | 2011-05-05 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 幹細胞から肝細胞への分化誘導方法 |
| US8216833B2 (en) | 2003-04-18 | 2012-07-10 | Izumu Saito | Cosmid vector |
| WO2014168157A1 (ja) | 2013-04-08 | 2014-10-16 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | 肝幹前駆様細胞の培養方法及びその培養物 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114555625A (zh) * | 2019-07-02 | 2022-05-27 | 塔夫茨学院托管部 | 用于将剂递送至细胞和组织中的新型肽、组合物和方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7297542B2 (en) | 1998-02-06 | 2007-11-20 | The Uab Research Foundation | Adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the hi loop of the fiber knob |
| CA2321135A1 (en) | 1998-02-17 | 1999-08-19 | Uab Research Foundation | Modified adenovirus containing a fiber replacement protein |
| JP2002523105A (ja) | 1998-08-27 | 2002-07-30 | アバンテイス・フアルマ・エス・アー | 異種遺伝子の運搬用の標的化アデノウイルスベクター |
-
2001
- 2001-04-27 JP JP2001131688A patent/JP3635462B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-01 US US09/845,160 patent/US6921663B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8216833B2 (en) | 2003-04-18 | 2012-07-10 | Izumu Saito | Cosmid vector |
| WO2011052504A1 (ja) | 2009-10-28 | 2011-05-05 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 幹細胞から肝細胞への分化誘導方法 |
| WO2014168157A1 (ja) | 2013-04-08 | 2014-10-16 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | 肝幹前駆様細胞の培養方法及びその培養物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6921663B2 (en) | 2005-07-26 |
| JP3635462B2 (ja) | 2005-04-06 |
| US20020058045A1 (en) | 2002-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU765276B2 (en) | Chimaeric adenoviruses | |
| Krasnykh et al. | Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism | |
| AU684220B2 (en) | Recombinant adenovirus comprising a chimeric penton base protein | |
| US7297542B2 (en) | Adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the hi loop of the fiber knob | |
| ES2246533T3 (es) | Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas. | |
| IL146479A (en) | Adenovirus gene carriers that contain at least one component of type 35 adenovirus | |
| CA2448908C (en) | Adenovirus protein ix, its domains involved in capsid assembly, transcriptional activity and nuclear reorganization | |
| EP1067188A1 (en) | Infection with chimaeric adenoviruses of cells negative for the adenovirus serotype 5 Coxsacki adenovirus receptor (CAR) | |
| AU2002344190A1 (en) | Adenovirus protein IX, its domains involved in capsid assembly, transcriptional activity and nuclear reorganization | |
| JP3635462B2 (ja) | アデノウイルスベクター | |
| US6815200B1 (en) | Modified adenovirus containing a fiber replacement protein | |
| US7560527B1 (en) | Modified adenovirus fibre and uses | |
| JP4328116B2 (ja) | 変異型アデノウイルスベクター | |
| JP2003250566A (ja) | アデノウイルスベクター | |
| AU2003268608B2 (en) | Chimaeric adenoviruses | |
| Zerbini et al. | Insertion of an exogenous domain in the adenovirus type 2 fiber globular region | |
| Mizuguchi et al. | Improvement of Adenovirus Vectors for Gene Transfer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040824 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041020 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20041124 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20041217 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 3635462 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090114 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090114 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100114 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110114 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140114 Year of fee payment: 9 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |