JP2002238552A - ヒト血清アルブミンを用いたヒト末梢血単核球であるｃｄ１４＋細胞からの樹状細胞の調製方法 - Google Patents
ヒト血清アルブミンを用いたヒト末梢血単核球であるｃｄ１４＋細胞からの樹状細胞の調製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト末梢血単核球であるCD14+細胞から樹状
細胞（DC）を安定にかつ安全に調製するための方法を提
供する。 【解決手段】 血清または血漿を含まずヒト血清アルブ
ミン（HSA）を含有する動物細胞培養培地にてヒト末梢
血単核球であるCD14+細胞を含む細胞を培養し、生成し
た樹状細胞を回収することを含む、樹状細胞の調製方
法。
細胞（DC）を安定にかつ安全に調製するための方法を提
供する。 【解決手段】 血清または血漿を含まずヒト血清アルブ
ミン（HSA）を含有する動物細胞培養培地にてヒト末梢
血単核球であるCD14+細胞を含む細胞を培養し、生成し
た樹状細胞を回収することを含む、樹状細胞の調製方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト血清アルブミ
ンを用いたヒト末梢血単核球であるCD14+細胞からの樹
状細胞の調製方法に関する。
ンを用いたヒト末梢血単核球であるCD14+細胞からの樹
状細胞の調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】T細胞による認識機構の分子生物学的な
理解により、抗原特異的な T細胞の免疫応答による癌の
治療が可能になろうとしている (1)。最近の研究の進歩
は細胞傷害性 Tリンパ球 (CTL)が認識するいくつかの腫
瘍抗原の同定を可能にし (2-4)、さらに、CTLにより認
識される抗原提示細胞 (APC)の MHCクラス I分子に結合
している腫瘍抗原由来のペプチドをも明らかにしてきた
(4)。腫瘍抗原由来のペプチドの単独投与は腫瘍に対す
る免疫学的拒絶反応を誘導せず、むしろ免疫学的寛容を
誘導する可能性もあり (5, 6)、腫瘍特異抗原あるいは
それ由来のペプチドをパルスした APCを用いた癌ワクチ
ン細胞療法が注目されている (7)。
理解により、抗原特異的な T細胞の免疫応答による癌の
治療が可能になろうとしている (1)。最近の研究の進歩
は細胞傷害性 Tリンパ球 (CTL)が認識するいくつかの腫
瘍抗原の同定を可能にし (2-4)、さらに、CTLにより認
識される抗原提示細胞 (APC)の MHCクラス I分子に結合
している腫瘍抗原由来のペプチドをも明らかにしてきた
(4)。腫瘍抗原由来のペプチドの単独投与は腫瘍に対す
る免疫学的拒絶反応を誘導せず、むしろ免疫学的寛容を
誘導する可能性もあり (5, 6)、腫瘍特異抗原あるいは
それ由来のペプチドをパルスした APCを用いた癌ワクチ
ン細胞療法が注目されている (7)。
【０００３】樹状細胞 (DC)は T細胞を介する初期免疫
応答を惹起できるAPCの中心的存在であり (8-13)、成熟
度の違いにより異なった機構を示す。未熟 DCは抗原を
取り込み、プロセッシングし、一方、成熟 DCはナイー
ブ T細胞を刺激、活性化する (8-13)。DCは腫瘍抗原特
異的な免疫応答を誘導するためのアジュバントとして、
既に実際の癌ワクチン細胞療法において用いられている
が (14-22)、現在でも臨床試験における重要な課題の 1
つは腫瘍抗原特異的な CTLを誘導できる DCの調整方法
の開発である。実際には、DCはアフェレーシスした白血
球から直接分離したり (14, 17)、末梢血単核球の付着
細胞分画 (15, 16, 18, 19)、末梢血単球 (20)、末梢血
へ動員された CD34+細胞 (21, 22)から誘導されたもの
が臨床試験において使用されている。アフェレーシスし
た白血球から直接分離した DCの回収率と純度にはかな
りのばらつきが見られ (14, 17)、CD34+細胞を末梢血中
に動員するには顆粒球コロニー刺激因子（ G-CSF）など
を患者に投与しなければならない(21, 22)。末梢血単核
球の付着細胞分画あるいは末梢血単球は容易に得られる
が、培養系に血漿あるいは血清を添加する必要がある
(15, 16, 19, 20)。また、血漿中あるいは血清中には D
Cの誘導に影響を与える物質が含まれているため(23, 2
4)、血漿中あるいは血清中を含む調製系では、DCがどの
程度回収されるか予測が立たない。すなわち、DCによる
癌ワクチン細胞療法を実施する前に、十分な量の DCが
得られるかどうかの検証が個々の患者においてそれぞれ
に要求される。
応答を惹起できるAPCの中心的存在であり (8-13)、成熟
度の違いにより異なった機構を示す。未熟 DCは抗原を
取り込み、プロセッシングし、一方、成熟 DCはナイー
ブ T細胞を刺激、活性化する (8-13)。DCは腫瘍抗原特
異的な免疫応答を誘導するためのアジュバントとして、
既に実際の癌ワクチン細胞療法において用いられている
が (14-22)、現在でも臨床試験における重要な課題の 1
つは腫瘍抗原特異的な CTLを誘導できる DCの調整方法
の開発である。実際には、DCはアフェレーシスした白血
球から直接分離したり (14, 17)、末梢血単核球の付着
細胞分画 (15, 16, 18, 19)、末梢血単球 (20)、末梢血
へ動員された CD34+細胞 (21, 22)から誘導されたもの
が臨床試験において使用されている。アフェレーシスし
た白血球から直接分離した DCの回収率と純度にはかな
りのばらつきが見られ (14, 17)、CD34+細胞を末梢血中
に動員するには顆粒球コロニー刺激因子（ G-CSF）など
を患者に投与しなければならない(21, 22)。末梢血単核
球の付着細胞分画あるいは末梢血単球は容易に得られる
が、培養系に血漿あるいは血清を添加する必要がある
(15, 16, 19, 20)。また、血漿中あるいは血清中には D
Cの誘導に影響を与える物質が含まれているため(23, 2
4)、血漿中あるいは血清中を含む調製系では、DCがどの
程度回収されるか予測が立たない。すなわち、DCによる
癌ワクチン細胞療法を実施する前に、十分な量の DCが
得られるかどうかの検証が個々の患者においてそれぞれ
に要求される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このような状況におい
て、本発明の目的は、ヒト末梢血単核球である CD14+細
胞からのDCの調製のための血漿あるいは血清を含まない
培養系を確立することである。このような手法によって
安定した数の DCを患者個体に依存せずに、かつ安全に
供給することが可能になる。DCは、抗腫瘍性免疫反応を
誘導できるため、癌ワクチン療法に使用が期待されてい
る。
て、本発明の目的は、ヒト末梢血単核球である CD14+細
胞からのDCの調製のための血漿あるいは血清を含まない
培養系を確立することである。このような手法によって
安定した数の DCを患者個体に依存せずに、かつ安全に
供給することが可能になる。DCは、抗腫瘍性免疫反応を
誘導できるため、癌ワクチン療法に使用が期待されてい
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ヒト血清ア
ルブミンを用いて、ヒト末梢血単核球であるCD14+細胞
から安定して DCを調製できる方法を見出した。したが
って本発明は以下のものからなる。本発明は、その態様
において、血清または血漿を含まずヒト血清アルブミン
（HSA）を含有する動物細胞培養培地にてヒト末梢血単
核球である CD14+細胞を含む細胞集団を培養し、生成し
たDCを回収することを含む、DCの調製方法を提供する。
ルブミンを用いて、ヒト末梢血単核球であるCD14+細胞
から安定して DCを調製できる方法を見出した。したが
って本発明は以下のものからなる。本発明は、その態様
において、血清または血漿を含まずヒト血清アルブミン
（HSA）を含有する動物細胞培養培地にてヒト末梢血単
核球である CD14+細胞を含む細胞集団を培養し、生成し
たDCを回収することを含む、DCの調製方法を提供する。
【０００６】本発明の実施形態により、HSAが培地あた
り2±0.5％（w/v）、好ましくは2±0.4％（w/v）、より
好ましくは2±0.3％（w/v）、もっと好ましくは2±0.2
％（w/v）、さらにもっと好ましくは2±0.1％（w/v）の
濃度で含有する。ここでw/vは重量/容量を表す。
り2±0.5％（w/v）、好ましくは2±0.4％（w/v）、より
好ましくは2±0.3％（w/v）、もっと好ましくは2±0.2
％（w/v）、さらにもっと好ましくは2±0.1％（w/v）の
濃度で含有する。ここでw/vは重量/容量を表す。
【０００７】本発明の別の実施形態により、培地がカル
シウム、カリウム、マグネシウムおよびナトリウム金属
塩、D-グルコース、グルタチオン（還元型）、必須L-ア
ミノ酸（20種）、ビオチン、パントテン酸カルシウム、
塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ニコチンアミド、
p-アミノ安息香酸、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、
塩酸チアミン、ビタミン類（B12など）、フェノールレ
ッドを含有する。
シウム、カリウム、マグネシウムおよびナトリウム金属
塩、D-グルコース、グルタチオン（還元型）、必須L-ア
ミノ酸（20種）、ビオチン、パントテン酸カルシウム、
塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ニコチンアミド、
p-アミノ安息香酸、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、
塩酸チアミン、ビタミン類（B12など）、フェノールレ
ッドを含有する。
【０００８】本発明のさらに別の実施形態により、培地
がさらにサイトカインを含有する。サイトカインはたと
えばコロニー刺激因子およびインターロイキンを含むも
の、特に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-C
SF）およびインターロイキン４（IL-4）からなるもので
ある。該培地はさらに、上記サイトカインに加えて樹状
細胞成熟化因子を含有しうる。成熟化因子の例は、TNF-
α、CD40リガンドまたはインターフェロンであるが、こ
れらに限定されない。
がさらにサイトカインを含有する。サイトカインはたと
えばコロニー刺激因子およびインターロイキンを含むも
の、特に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-C
SF）およびインターロイキン４（IL-4）からなるもので
ある。該培地はさらに、上記サイトカインに加えて樹状
細胞成熟化因子を含有しうる。成熟化因子の例は、TNF-
α、CD40リガンドまたはインターフェロンであるが、こ
れらに限定されない。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明によれば、樹状細胞（DC）
は、血清または血漿を含まずヒト血清アルブミン（HS
A）を含有する動物細胞培養培地にてヒト末梢血単核球
であるCD14+細胞を含む細胞を培養することによって得
ることができる。
は、血清または血漿を含まずヒト血清アルブミン（HS
A）を含有する動物細胞培養培地にてヒト末梢血単核球
であるCD14+細胞を含む細胞を培養することによって得
ることができる。
【００１０】本発明によれば、CD14を発現するヒト末梢
血単核球(PBMC)細胞、すなわちCD14 +細胞がDC誘導にと
って好ましい細胞として選択された。しかしこの細胞
は、純化したCD14+細胞に限定されず、ヒト末梢血単核球
の他の細胞が混入していてもよい。この選択された細胞
をHSA含有動物細胞培養培地にて培養することによっ
て、DCを誘導し、生成されたDCを回収する。
血単核球(PBMC)細胞、すなわちCD14 +細胞がDC誘導にと
って好ましい細胞として選択された。しかしこの細胞
は、純化したCD14+細胞に限定されず、ヒト末梢血単核球
の他の細胞が混入していてもよい。この選択された細胞
をHSA含有動物細胞培養培地にて培養することによっ
て、DCを誘導し、生成されたDCを回収する。
【００１１】本発明においては、培地あたりのHSA濃度
は重要であり、該HSA濃度は2％（w/v）前後、具体的に
は培地あたり2±0.5％（w/v）、好ましくは2±0.4％（w
/v）、より好ましくは2±0.3％（w/v）、もっと好まし
くは2±0.2％（w/v）、さらにもっと好ましくは2±0.1
％（w/v）である。HSAは天然品または合成品のいずれで
もよく、一般に市販品を使用できる。
は重要であり、該HSA濃度は2％（w/v）前後、具体的に
は培地あたり2±0.5％（w/v）、好ましくは2±0.4％（w
/v）、より好ましくは2±0.3％（w/v）、もっと好まし
くは2±0.2％（w/v）、さらにもっと好ましくは2±0.1
％（w/v）である。HSAは天然品または合成品のいずれで
もよく、一般に市販品を使用できる。
【００１２】また、本発明で使用可能な動物細胞培養培
地は、単核球の培養を可能にする培地ならいずれでもよ
い。このような培地はCD14+細胞の成長およびDC誘導を
可能にする。そのような培地は、たとえばカルシウム、
カリウム、マグネシウム、ナトリウムなどの金属塩、D-
グルコース、グルタチオン（還元型）、必須L-アミノ酸
（20種）、ビオチン、パントテン酸カルシウム、塩化コ
リン、葉酸、i-イノシトール、ニコチンアミド、p-アミ
ノ安息香酸、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チ
アミン、ビタミン類（B12など）、フェノールレッドを
含有する。動物細胞用培養液として、たとえばMoorらの
RPMI-1640培地(25,26)、McCOY'S 5A培地などを挙げるこ
とができる。RPMI 1640培地は下記表１に掲げる組成を
有する。
地は、単核球の培養を可能にする培地ならいずれでもよ
い。このような培地はCD14+細胞の成長およびDC誘導を
可能にする。そのような培地は、たとえばカルシウム、
カリウム、マグネシウム、ナトリウムなどの金属塩、D-
グルコース、グルタチオン（還元型）、必須L-アミノ酸
（20種）、ビオチン、パントテン酸カルシウム、塩化コ
リン、葉酸、i-イノシトール、ニコチンアミド、p-アミ
ノ安息香酸、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チ
アミン、ビタミン類（B12など）、フェノールレッドを
含有する。動物細胞用培養液として、たとえばMoorらの
RPMI-1640培地(25,26)、McCOY'S 5A培地などを挙げるこ
とができる。RPMI 1640培地は下記表１に掲げる組成を
有する。
【００１３】
【表１】
【００１４】本発明においては、培地中にサイトカイン
を含むのがよい。サイトカインとして、たとえばコロニ
ー刺激因子（たとえばGM-CSF、IL-3など）、インターロ
イキン（たとえばIL-4、IL-13、IL-1など）、これらの
混合物を挙げることができるが、好ましくはコロニー刺
激因子とインターロイキンの混合物、特にGM-CSFとIL-4
の組み合わせがよい。
を含むのがよい。サイトカインとして、たとえばコロニ
ー刺激因子（たとえばGM-CSF、IL-3など）、インターロ
イキン（たとえばIL-4、IL-13、IL-1など）、これらの
混合物を挙げることができるが、好ましくはコロニー刺
激因子とインターロイキンの混合物、特にGM-CSFとIL-4
の組み合わせがよい。
【００１５】上記サイトカインに加えて、樹状細胞成熟
化因子を含んでもよい。樹状細胞成熟化因子の例とし
て、TNF-α、CD40リガンド、インターフェロンなどを挙
げることができるが、好ましくはTNF-αがよい。サイト
カインおよび樹状細胞成熟化因子は非限定的に培地あた
り１〜100ng/mlで使用される。
化因子を含んでもよい。樹状細胞成熟化因子の例とし
て、TNF-α、CD40リガンド、インターフェロンなどを挙
げることができるが、好ましくはTNF-αがよい。サイト
カインおよび樹状細胞成熟化因子は非限定的に培地あた
り１〜100ng/mlで使用される。
【００１６】培養は、所定量のHSAを含有し、必要によ
りサイトカインを含有する動物細胞培養培地にCD14+細
胞について培地１ｍｌあたり105〜106オーダーの細胞数
を接種し、温度36〜38℃、３〜10日間インキュベートす
ることによって行う。この間、必要に応じて３〜４日お
きに１〜数回新鮮培地と置換する。
りサイトカインを含有する動物細胞培養培地にCD14+細
胞について培地１ｍｌあたり105〜106オーダーの細胞数
を接種し、温度36〜38℃、３〜10日間インキュベートす
ることによって行う。この間、必要に応じて３〜４日お
きに１〜数回新鮮培地と置換する。
【００１７】培養後、生成したDCを比重遠沈法、磁気ビ
ーズ分離法などの方法で分離することができる。本発明
のように HSAとサイトカイン（例えば GM-CSFおよびIL-
4）、必要に応じて樹状細胞成熟化因子（例えばTNF-
α）、を含む培養液を用いて得られる未熟 DCの数は、H
SAの代わりに0.1%、1%、2%、5%、10%（容量）の自己血
漿あるいは自己血清の存在下で得られるものに比べて高
値であった。自己血漿と自己血清については、たとえ同
一人から採取したものであっても採取時期が異なるサン
プルを用いると未熟 DCの回収率にばらつきが見られた
のに対して、本発明の方法では未熟 DCの回収率にばら
つきが認められなかった。
ーズ分離法などの方法で分離することができる。本発明
のように HSAとサイトカイン（例えば GM-CSFおよびIL-
4）、必要に応じて樹状細胞成熟化因子（例えばTNF-
α）、を含む培養液を用いて得られる未熟 DCの数は、H
SAの代わりに0.1%、1%、2%、5%、10%（容量）の自己血
漿あるいは自己血清の存在下で得られるものに比べて高
値であった。自己血漿と自己血清については、たとえ同
一人から採取したものであっても採取時期が異なるサン
プルを用いると未熟 DCの回収率にばらつきが見られた
のに対して、本発明の方法では未熟 DCの回収率にばら
つきが認められなかった。
【００１８】さらにまた、HSAと GM-CSFおよびIL-4を用
いて得られた未熟 DCの デキストラン取り込みでみた貪
食能、ならびに HSAと GM-CSF 、IL-4 および TNF-αか
らなるとサイトカインを用いて得られた成熟 DCの MH
C、共刺激（co-stimulatory）分子などの機能分子の発
現は、自己血漿あるいは自己血清を用いて得られた DC
と比較して同等であった。また、腫瘍特異抗原の 1つで
ある HER2分子由来で細胞傷害性 Tリンパ球 (CTL)を誘
導できることが確認されている HLA-A2402に対する結合
モチーフを保持するペプチド (HER2p63; TYLPTNASL)を
用いて、HER２分子に対する CTLの誘導能を enzymed-li
nked immunospot (ELISPOT)法にて検討すると、牛胎児
血清（FCS）、自己血漿、自己血清あるいは HSAを用い
て誘導されたそれぞれの DCの間には、その誘導能に差
は認められなかった。これらの一連の結果は、HSAを用
いての DCの調製法では、たとえば癌ワクチン細胞療法
に先立ちDCの調製に最適な自己血漿あるいは自己血清の
採取時期や濃度を検証する必要性がなく、最大数で機能
的な DCを安全に調製できることを示しており、これに
よって臨床応用が高められる。
いて得られた未熟 DCの デキストラン取り込みでみた貪
食能、ならびに HSAと GM-CSF 、IL-4 および TNF-αか
らなるとサイトカインを用いて得られた成熟 DCの MH
C、共刺激（co-stimulatory）分子などの機能分子の発
現は、自己血漿あるいは自己血清を用いて得られた DC
と比較して同等であった。また、腫瘍特異抗原の 1つで
ある HER2分子由来で細胞傷害性 Tリンパ球 (CTL)を誘
導できることが確認されている HLA-A2402に対する結合
モチーフを保持するペプチド (HER2p63; TYLPTNASL)を
用いて、HER２分子に対する CTLの誘導能を enzymed-li
nked immunospot (ELISPOT)法にて検討すると、牛胎児
血清（FCS）、自己血漿、自己血清あるいは HSAを用い
て誘導されたそれぞれの DCの間には、その誘導能に差
は認められなかった。これらの一連の結果は、HSAを用
いての DCの調製法では、たとえば癌ワクチン細胞療法
に先立ちDCの調製に最適な自己血漿あるいは自己血清の
採取時期や濃度を検証する必要性がなく、最大数で機能
的な DCを安全に調製できることを示しており、これに
よって臨床応用が高められる。
【００１９】本発明方法で得られたDCの応用の１つに癌
免疫療法がある。その方法はたとえば、癌患者から取り
出した腫瘍組織または細胞の一部から腫瘍拒絶抗原を含
む画分を得、この抗原でDCをパルスしたのち該DCで患者
を免疫することを含む。これによって、パルスされたDC
で免疫された患者において腫瘍の増殖進行の阻止あるい
は抗腫瘍反応の誘導が生じると考えられる(27)。
免疫療法がある。その方法はたとえば、癌患者から取り
出した腫瘍組織または細胞の一部から腫瘍拒絶抗原を含
む画分を得、この抗原でDCをパルスしたのち該DCで患者
を免疫することを含む。これによって、パルスされたDC
で免疫された患者において腫瘍の増殖進行の阻止あるい
は抗腫瘍反応の誘導が生じると考えられる(27)。
【００２０】
【実施例】1. 材料と方法 （培養液と試薬）培養液は 2 mMの L-グルタミン、50 U
/mlの ペニシリン、50 μg/mlの ストレプトマイシンを
含む RPMI 1640 (日水製薬、東京)を使用し、自己血
漿、自己血清あるいは HSA (Albumin CutterTM; バイエ
ル薬品、大阪)を 0.1%から10%の濃度で、牛胎児血清 (F
CS) (Hyclone, Logan, UT)を 10%で添加した。GM-CSFは
キリンビール(東京)、IL-4は小野薬品 (大阪)、TNF-α
は大日本製薬 (吹田)、IL-2は武田薬品 (大阪)から供与
された。GM-CSFは 10 ng/ml、IL-4は 10 ng/ml、TNF-α
は 20 ng/ml、IL-2は 20 IU/mlで使用した。
/mlの ペニシリン、50 μg/mlの ストレプトマイシンを
含む RPMI 1640 (日水製薬、東京)を使用し、自己血
漿、自己血清あるいは HSA (Albumin CutterTM; バイエ
ル薬品、大阪)を 0.1%から10%の濃度で、牛胎児血清 (F
CS) (Hyclone, Logan, UT)を 10%で添加した。GM-CSFは
キリンビール(東京)、IL-4は小野薬品 (大阪)、TNF-α
は大日本製薬 (吹田)、IL-2は武田薬品 (大阪)から供与
された。GM-CSFは 10 ng/ml、IL-4は 10 ng/ml、TNF-α
は 20 ng/ml、IL-2は 20 IU/mlで使用した。
【００２１】（抗体）使用したモノクローナル抗体: FI
TC-CD1a (Ortho, Raritan, NJ, USA)、PE-CD1a、PE-CD4
0 (Immunotech, Marseille, France)、FITC- or PE-CD1
4, -CD54, -CD80, -HLA-DR (Becton Dickinson, San Jo
se, CA, USA)、PE-HLA-A,B,C (DAKO,Glostrup, Denmar
k)、PE-CD86 (PharMingen, San Diego, CA, USA)、FITC
-myeloperoxidase (MPO) (DAKO)。FITC- or PE-mouse I
gG1, IgG2a (Becton Dickinson), or IgG2b (Coulter,
Hialeah, FL, USA)。
TC-CD1a (Ortho, Raritan, NJ, USA)、PE-CD1a、PE-CD4
0 (Immunotech, Marseille, France)、FITC- or PE-CD1
4, -CD54, -CD80, -HLA-DR (Becton Dickinson, San Jo
se, CA, USA)、PE-HLA-A,B,C (DAKO,Glostrup, Denmar
k)、PE-CD86 (PharMingen, San Diego, CA, USA)、FITC
-myeloperoxidase (MPO) (DAKO)。FITC- or PE-mouse I
gG1, IgG2a (Becton Dickinson), or IgG2b (Coulter,
Hialeah, FL, USA)。
【００２２】（CD14+細胞の分離）同意を得た後、健常
日本人より末梢血をヘパリン加採取した。末梢血単核球
(PBMCs)は Ficoll-Hypaque (Nycomed Pharma AS, Osl
o, Norway)を用いての比重遠沈法にて分離した。CD14+
細胞は PBMCsより MACS Microbeads (Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach, Germany)にて分離した (24)。こ
の方法で得られた CD14+細胞の純度は 95%以上である。
非特異的エステラーゼ染色 (武藤化学、東京)を施行す
ると、CD14+細胞は非特異的エステラーゼ陽性であっ
た。一部の実験においては、PMMCsを 85mmの Falcon ti
ssue culture dish (Becton Dickinson Labware, Linco
ln Park, NJ, USA)に、10% FCS添加 RPMI 1640で37℃2
時間培養し、その dish中の細胞を付着細胞分画と非付
着細胞分画に分けて回収した。
日本人より末梢血をヘパリン加採取した。末梢血単核球
(PBMCs)は Ficoll-Hypaque (Nycomed Pharma AS, Osl
o, Norway)を用いての比重遠沈法にて分離した。CD14+
細胞は PBMCsより MACS Microbeads (Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach, Germany)にて分離した (24)。こ
の方法で得られた CD14+細胞の純度は 95%以上である。
非特異的エステラーゼ染色 (武藤化学、東京)を施行す
ると、CD14+細胞は非特異的エステラーゼ陽性であっ
た。一部の実験においては、PMMCsを 85mmの Falcon ti
ssue culture dish (Becton Dickinson Labware, Linco
ln Park, NJ, USA)に、10% FCS添加 RPMI 1640で37℃2
時間培養し、その dish中の細胞を付着細胞分画と非付
着細胞分画に分けて回収した。
【００２３】（CD14+細胞の培養）CD14+細胞は 5 x 105
個/mlの濃度で、FCS、自己血漿、自己血清あるいは HSA
を添加した RPMI 1640で、24-well tissue culture pla
te (Nunc, Roskilde, Denmark)に培養した。GM-CSFと I
L-4は培養開始時から添加し、実験によっては TNF-αを
後から添加した。培養液は 3 -4日で交換した。生細胞
数は trypan bluedye exclusion法で算定した。
個/mlの濃度で、FCS、自己血漿、自己血清あるいは HSA
を添加した RPMI 1640で、24-well tissue culture pla
te (Nunc, Roskilde, Denmark)に培養した。GM-CSFと I
L-4は培養開始時から添加し、実験によっては TNF-αを
後から添加した。培養液は 3 -4日で交換した。生細胞
数は trypan bluedye exclusion法で算定した。
【００２４】（貪食能試験）GM-CSFと IL-4で 5日間培
養して得られた 2 x 105個の DCを 10% FCS添加 RPMI 1
640に浮遊し、1 mg/mlの FITC-デキストラン (分子量 4
0,000; Sigma, St. Louis, MO, USA)と 4℃あるいは 37
℃で 1時間反応させた。FITC-デキストランの取り込み
は冷却した 1% FCS加 PBSで中断させ、その後細胞は 1%
FCS加 PBSで 4回洗浄した。 FITC-デキストランの取り
込みは FACScan（Becton Dickinson Immunocytometry S
ystems, San Jose, CA, USA）で測定した。
養して得られた 2 x 105個の DCを 10% FCS添加 RPMI 1
640に浮遊し、1 mg/mlの FITC-デキストラン (分子量 4
0,000; Sigma, St. Louis, MO, USA)と 4℃あるいは 37
℃で 1時間反応させた。FITC-デキストランの取り込み
は冷却した 1% FCS加 PBSで中断させ、その後細胞は 1%
FCS加 PBSで 4回洗浄した。 FITC-デキストランの取り
込みは FACScan（Becton Dickinson Immunocytometry S
ystems, San Jose, CA, USA）で測定した。
【００２５】（細胞形質の解析）細胞表面形質は FITC
結合あるいは PE結合モノクローナル抗体での単一ある
いは二重染色で行い、解析は FACScanで施行した。ミエ
ロペルオキシダーゼ（MPO）は細胞内染色キット (Cytof
ix/Cytoperm Kit; PharMingen)で行った。
結合あるいは PE結合モノクローナル抗体での単一ある
いは二重染色で行い、解析は FACScanで施行した。ミエ
ロペルオキシダーゼ（MPO）は細胞内染色キット (Cytof
ix/Cytoperm Kit; PharMingen)で行った。
【００２６】（免疫原性ペプチドの合成とそれらの DC
への結合）HLA-A2402に結合モチーフのある c-erbB-2/H
ER2/neu (HER2)由来の免疫原性ペプチド HER2p63 (TYLP
TNASL)は三菱化学 (横浜)で合成された (28, 29)。ペプ
チドの純度は 95%以上で、pH 7.4で PBSに溶解し、1 mg
/mlの濃度で 4℃にて保管した。1 x 106個の DCを 10μ
Mの濃度の HER2p63と室温で 1時間反応させ、さらに 1
時間 37℃、5% CO2で反応させた(30)。これらの DCを e
nzymed-linked immunospot (ELISPOT) assayに用いた。
への結合）HLA-A2402に結合モチーフのある c-erbB-2/H
ER2/neu (HER2)由来の免疫原性ペプチド HER2p63 (TYLP
TNASL)は三菱化学 (横浜)で合成された (28, 29)。ペプ
チドの純度は 95%以上で、pH 7.4で PBSに溶解し、1 mg
/mlの濃度で 4℃にて保管した。1 x 106個の DCを 10μ
Mの濃度の HER2p63と室温で 1時間反応させ、さらに 1
時間 37℃、5% CO2で反応させた(30)。これらの DCを e
nzymed-linked immunospot (ELISPOT) assayに用いた。
【００２７】（ELISPOT アッセイ）96ウエルの nitroce
llulose MAHAS4510 Millipore プレート (Millipore, B
edford, MA, USA)に 10 μg/mlの抗 インターフェロン-
γ抗体 (1-D1K; Mabtech,Stockholm, Sweden)を入れ
て、4℃にて一晩放置した。この プレートを PBSで洗浄
後、非特異反応をブロックするために、10% AB型血清に
て 2時間 37℃で処理した。HLA-A2402+のヒトからの 1
x 106個/mlの単核球と HER2p63をパルスしたあるいは何
もパルスしていない放射線照射をされた DCを 24ウエル
の プレートに、10%自己血清添加 RPMI 1640で 7日間培
養した。これらの単核球を PBSで 3回洗浄後、HER2p63
をパルスしたあるいは何もパルスしていない放射線照射
された新たに調製された DCとさらに 7日間、今度は IL
-2 (20 IU/ml)も添加し、10%自己血清添加 RPMI 1640で
培養した。これらの単核球を PBSで 3回洗浄後、1 x10
5個/mlのさらに新たに調製した HER2p63をパルスしたあ
るいは何もパルスしていない放射線照射された DCと 24
-wellのプレートに、10%自己血清添加 RPMI1640で共培
養した。24時間後に、24ウエルの プレートを 0.05% Tw
eenを含む PBSで 6回洗浄後、1 μg/mlのビオチン化抗
インターフェロン-γ抗体 (7-B6-1; Mabtech)と 2時間
37℃で反応させ、洗浄後さらに 1 μg/mlの ストレプト
アビジンアルカリフォスファターゼ (Mabtech)と 1時間
反応させた。洗浄後、プレートをアルカリフォスファタ
ーゼ結合基質キット (BioRad, Hercules, CA, USA)で染
色し、Carl Zeissのイメージング分析装置 (Carl Zeiss
Vision, Hallbergmoos,Germany)でスポット数を算定し
た。
llulose MAHAS4510 Millipore プレート (Millipore, B
edford, MA, USA)に 10 μg/mlの抗 インターフェロン-
γ抗体 (1-D1K; Mabtech,Stockholm, Sweden)を入れ
て、4℃にて一晩放置した。この プレートを PBSで洗浄
後、非特異反応をブロックするために、10% AB型血清に
て 2時間 37℃で処理した。HLA-A2402+のヒトからの 1
x 106個/mlの単核球と HER2p63をパルスしたあるいは何
もパルスしていない放射線照射をされた DCを 24ウエル
の プレートに、10%自己血清添加 RPMI 1640で 7日間培
養した。これらの単核球を PBSで 3回洗浄後、HER2p63
をパルスしたあるいは何もパルスしていない放射線照射
された新たに調製された DCとさらに 7日間、今度は IL
-2 (20 IU/ml)も添加し、10%自己血清添加 RPMI 1640で
培養した。これらの単核球を PBSで 3回洗浄後、1 x10
5個/mlのさらに新たに調製した HER2p63をパルスしたあ
るいは何もパルスしていない放射線照射された DCと 24
-wellのプレートに、10%自己血清添加 RPMI1640で共培
養した。24時間後に、24ウエルの プレートを 0.05% Tw
eenを含む PBSで 6回洗浄後、1 μg/mlのビオチン化抗
インターフェロン-γ抗体 (7-B6-1; Mabtech)と 2時間
37℃で反応させ、洗浄後さらに 1 μg/mlの ストレプト
アビジンアルカリフォスファターゼ (Mabtech)と 1時間
反応させた。洗浄後、プレートをアルカリフォスファタ
ーゼ結合基質キット (BioRad, Hercules, CA, USA)で染
色し、Carl Zeissのイメージング分析装置 (Carl Zeiss
Vision, Hallbergmoos,Germany)でスポット数を算定し
た。
【００２８】２． 結果 （末梢血単核球の CD14の発現と DCへの誘導）末梢血単
核球（PBMCs）を付着性と CD14の発現様式から、付着 C
D14+、付着 CD14-、非付着 CD14+、非付着 CD14-の 4群
に分け、それら 4群からの DCの形成能を、GM-CSFと IL
-4を含む 10% FCS添加RPMI 1640で 5日間培養の系で検
討した。CD1a+CD14-細胞を DCとして算定し (24)、結果
を 図 1に示した。CD14+細胞は付着細胞分画の約 15%
で、非付着細胞分画の約 10%であった。DCの大部分は付
着細胞分画および非付着細胞分画ともに CD14+細胞由来
であった。一方、付着細胞分画および非付着細胞分画の
CD14-細胞からは DCは誘導されなかった。これらのこ
とから、以下の DC誘導の実験では、標的細胞は CD14+
細胞を用いることにした。
核球（PBMCs）を付着性と CD14の発現様式から、付着 C
D14+、付着 CD14-、非付着 CD14+、非付着 CD14-の 4群
に分け、それら 4群からの DCの形成能を、GM-CSFと IL
-4を含む 10% FCS添加RPMI 1640で 5日間培養の系で検
討した。CD1a+CD14-細胞を DCとして算定し (24)、結果
を 図 1に示した。CD14+細胞は付着細胞分画の約 15%
で、非付着細胞分画の約 10%であった。DCの大部分は付
着細胞分画および非付着細胞分画ともに CD14+細胞由来
であった。一方、付着細胞分画および非付着細胞分画の
CD14-細胞からは DCは誘導されなかった。これらのこ
とから、以下の DC誘導の実験では、標的細胞は CD14+
細胞を用いることにした。
【００２９】（自己血漿、自己血清あるいは HSAにより
支持される CD14+細胞からの DCの誘導）臨床に用いる
DCの調製法においては、培養系に FCSを使用することは
できない。いくつかの研究グループは自己血漿あるいは
自己血清を使用している (15,20,22)。予備的な実験か
ら、本発明者は自己血漿あるいは自己血清の代わりに H
SAが使用可能であることを見い出した。HLA-A,B,C、HLA
-DR、CD80、CD86、CD40、CD54、CD14分子の発現様式か
ら、自己血漿あるいは自己血清を用いて培養したCD14+
細胞から誘導される細胞においては、CD1a+CD14-細胞だ
けでなく CD1a-CD14-細胞も DCであることを確認したた
め、自己血漿あるいは自己血清を用いた培養系では C
D1a+CD14-細胞と CD1a-CD14-細胞を DCと見なした (31,
32)。HSAの培養系では CD1a-CD14-細胞は殆ど見られな
い。1%自己血漿、1%自己血清、2%HSAで培養した細胞の
CD1aと CD14の発現様式を 図2Aに示した。最も効率的に
CD14+細胞から DCを誘導する条件を検討するために、
自己血漿、自己血清、HSAを比較検討した (図2B)。最適
の濃度を探すために、それぞれを 0.1 - 10%の濃度で添
加してみた。10人の健常人（Case 1〜Case 10）で検討
してみると、自己血漿では 1%で 5人、2%で 3人、5%で
1人、10%で 1人において最大数の DCが得られた。自己
血清では 1%で 5人、2%で 1人、5%で 4人において最大
数の DCが得られた。HSAでは、10例全例において 2%で
得られる DC数が最大であった。また、10例それぞれに
おいて、2% HSAで得られる DC数は自己血漿あるいは自
己血清のどの濃度で得られる DC数より有意に高値であ
った。10例を全体的に見ても、2% HSAで得られる DC数
は 0.1% - 10%の自己血漿あるいは自己血清で得られる
どの DC数よりも高かった。5%あるいは 10%の HSAでは
殆ど DCは得られなかったが、この原因は、HSA製剤の添
加物である sodium acetyltryptophanと sodium capryl
ateによることを確認している (データ示さず)。
支持される CD14+細胞からの DCの誘導）臨床に用いる
DCの調製法においては、培養系に FCSを使用することは
できない。いくつかの研究グループは自己血漿あるいは
自己血清を使用している (15,20,22)。予備的な実験か
ら、本発明者は自己血漿あるいは自己血清の代わりに H
SAが使用可能であることを見い出した。HLA-A,B,C、HLA
-DR、CD80、CD86、CD40、CD54、CD14分子の発現様式か
ら、自己血漿あるいは自己血清を用いて培養したCD14+
細胞から誘導される細胞においては、CD1a+CD14-細胞だ
けでなく CD1a-CD14-細胞も DCであることを確認したた
め、自己血漿あるいは自己血清を用いた培養系では C
D1a+CD14-細胞と CD1a-CD14-細胞を DCと見なした (31,
32)。HSAの培養系では CD1a-CD14-細胞は殆ど見られな
い。1%自己血漿、1%自己血清、2%HSAで培養した細胞の
CD1aと CD14の発現様式を 図2Aに示した。最も効率的に
CD14+細胞から DCを誘導する条件を検討するために、
自己血漿、自己血清、HSAを比較検討した (図2B)。最適
の濃度を探すために、それぞれを 0.1 - 10%の濃度で添
加してみた。10人の健常人（Case 1〜Case 10）で検討
してみると、自己血漿では 1%で 5人、2%で 3人、5%で
1人、10%で 1人において最大数の DCが得られた。自己
血清では 1%で 5人、2%で 1人、5%で 4人において最大
数の DCが得られた。HSAでは、10例全例において 2%で
得られる DC数が最大であった。また、10例それぞれに
おいて、2% HSAで得られる DC数は自己血漿あるいは自
己血清のどの濃度で得られる DC数より有意に高値であ
った。10例を全体的に見ても、2% HSAで得られる DC数
は 0.1% - 10%の自己血漿あるいは自己血清で得られる
どの DC数よりも高かった。5%あるいは 10%の HSAでは
殆ど DCは得られなかったが、この原因は、HSA製剤の添
加物である sodium acetyltryptophanと sodium capryl
ateによることを確認している (データ示さず)。
【００３０】（採取時期の異なった自己血漿、自己血清
存在下の CD14+細胞からの DCの誘導）同一人の自己血
漿あるいは自己血清の採取時期の CD14+細胞からの DC
の誘導に対する影響について検討した。Case 3と Case
5において、最低 1週間以上の間隔で 6ヶ月以上掛け
て、血漿と血清を採取した。図 2Bで示したように、こ
れら Case 3と Case 5においては、血漿、血清のいずれ
においても 1%の濃度が最大数の DCの誘導を支持したの
で、培養系には血漿、血清は 1%の濃度で添加した。採
取時期の異なる血漿あるいは血清で得られた結果を 2%
HSAで得られた結果と比較したのが 図3である。５種類
の採取時期（1999年8月16日〜2000年4月7日）の異なる
血漿と血清で得られる DC数は様々であるが、これらの
どれと比較しても 2%HSAの方が得られる DC数は高値で
あった。また、HSAの lotの影響について 10個の ロッ
ト(lot)で調べたが、lot間には DCの誘導支持能の差は
認められなかった (データ示さず)。
存在下の CD14+細胞からの DCの誘導）同一人の自己血
漿あるいは自己血清の採取時期の CD14+細胞からの DC
の誘導に対する影響について検討した。Case 3と Case
5において、最低 1週間以上の間隔で 6ヶ月以上掛け
て、血漿と血清を採取した。図 2Bで示したように、こ
れら Case 3と Case 5においては、血漿、血清のいずれ
においても 1%の濃度が最大数の DCの誘導を支持したの
で、培養系には血漿、血清は 1%の濃度で添加した。採
取時期の異なる血漿あるいは血清で得られた結果を 2%
HSAで得られた結果と比較したのが 図3である。５種類
の採取時期（1999年8月16日〜2000年4月7日）の異なる
血漿と血清で得られる DC数は様々であるが、これらの
どれと比較しても 2%HSAの方が得られる DC数は高値で
あった。また、HSAの lotの影響について 10個の ロッ
ト(lot)で調べたが、lot間には DCの誘導支持能の差は
認められなかった (データ示さず)。
【００３１】（自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む
培養で誘導された DCの貪食能）GM-CSFと IL-4存在下で
自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む培養系で誘導さ
れた DCの貪食能を、フローサイトメトリーを用いて、
温度依存性の FITC-デキストランの取り込みにて検討し
た (図4)。取り込まれたデキストランの量は自己血漿、
自己血清あるいは HSAを含む培養系で誘導された DCの
間ではほぼ同等であった。
培養で誘導された DCの貪食能）GM-CSFと IL-4存在下で
自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む培養系で誘導さ
れた DCの貪食能を、フローサイトメトリーを用いて、
温度依存性の FITC-デキストランの取り込みにて検討し
た (図4)。取り込まれたデキストランの量は自己血漿、
自己血清あるいは HSAを含む培養系で誘導された DCの
間ではほぼ同等であった。
【００３２】（自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む
培養で誘導された DCの形質発現）いろいろな時期に採
取した自己血漿あるいは自己血清に比べて、HSAはより
効率的に CD14+細胞から未熟 DCの誘導を支持したので
(図3)、次に、FCS、自己血漿、自己血清あるいはHSAを
含む培養系で GM-CSFとIL-4で 5日間培養し、さらにTNF
-αを 2日間添加して培養し、成熟 DCを誘導し、それら
の表面形質を調べた(図5)。いずれの方法で得られた細
胞も成熟 DCの表面形質発現パターンと矛盾せず、HLA-
A,B,C、HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD54を強発現して
いた。
培養で誘導された DCの形質発現）いろいろな時期に採
取した自己血漿あるいは自己血清に比べて、HSAはより
効率的に CD14+細胞から未熟 DCの誘導を支持したので
(図3)、次に、FCS、自己血漿、自己血清あるいはHSAを
含む培養系で GM-CSFとIL-4で 5日間培養し、さらにTNF
-αを 2日間添加して培養し、成熟 DCを誘導し、それら
の表面形質を調べた(図5)。いずれの方法で得られた細
胞も成熟 DCの表面形質発現パターンと矛盾せず、HLA-
A,B,C、HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD54を強発現して
いた。
【００３３】（FCS、自己血漿、自己血清あるいは HSA
を含む培養で誘導された DCの HER2特異的 CD8+細胞の
誘導）FCS、自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む培
養で誘導された DCの抗原特異的 CD8+細胞の誘導能を比
較するために、Case 3と Case 8の 2例の PBMCsを用い
て、c-erbB2/HER2/neu原癌遺伝子由来の HER2p63 (TYLP
TNASL)ペプチドをパルスした自己 DCによる CD8+細胞誘
導能を ELISPOTアッセイで検討した (図6)。2例におい
て、HER2p63特異的 インターフェロン-γ分泌細胞数は
同等であった。自己血清あるいは HSAを含む培養系で誘
導された DCにより産生された HER2p63特異的 インター
フェロン-γ分泌細胞数の平均の方が、FCSあるいは自己
血漿を含む培養系で誘導された DCにより産生された HE
R2p63特異的 インターフェロン-γ分泌細胞数の平均よ
り高かったが、これらの間には有意な差は認められなか
った。
を含む培養で誘導された DCの HER2特異的 CD8+細胞の
誘導）FCS、自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む培
養で誘導された DCの抗原特異的 CD8+細胞の誘導能を比
較するために、Case 3と Case 8の 2例の PBMCsを用い
て、c-erbB2/HER2/neu原癌遺伝子由来の HER2p63 (TYLP
TNASL)ペプチドをパルスした自己 DCによる CD8+細胞誘
導能を ELISPOTアッセイで検討した (図6)。2例におい
て、HER2p63特異的 インターフェロン-γ分泌細胞数は
同等であった。自己血清あるいは HSAを含む培養系で誘
導された DCにより産生された HER2p63特異的 インター
フェロン-γ分泌細胞数の平均の方が、FCSあるいは自己
血漿を含む培養系で誘導された DCにより産生された HE
R2p63特異的 インターフェロン-γ分泌細胞数の平均よ
り高かったが、これらの間には有意な差は認められなか
った。
【００３４】３． 考案 腫瘍特異的 CTLにより認識される標的分子の同定など腫
瘍免疫の理解が腫瘍抗原特異的な免疫療法の進展に貢献
してきている。DCは腫瘍抗原に対する T細胞の寛容を凌
駕する機能があることもあり (33)、腫瘍抗原あるいは
それ由来のペプチドをパルスした DCを用いた免疫療法
が癌ワクチン療法のなかでも特に注目されている。しか
し、生体において、DCにより腫瘍特異的な CTLによる効
果的な免疫反応を誘導するには、DCの投与経路や DCの
体内での至適部位への遊走誘導などの問題点も解決して
いかなければならない。この研究では、より適切な臨床
応用に向けて、DCの調製法に焦点を絞り、検討を加え
た。
瘍免疫の理解が腫瘍抗原特異的な免疫療法の進展に貢献
してきている。DCは腫瘍抗原に対する T細胞の寛容を凌
駕する機能があることもあり (33)、腫瘍抗原あるいは
それ由来のペプチドをパルスした DCを用いた免疫療法
が癌ワクチン療法のなかでも特に注目されている。しか
し、生体において、DCにより腫瘍特異的な CTLによる効
果的な免疫反応を誘導するには、DCの投与経路や DCの
体内での至適部位への遊走誘導などの問題点も解決して
いかなければならない。この研究では、より適切な臨床
応用に向けて、DCの調製法に焦点を絞り、検討を加え
た。
【００３５】体外で DCを調製する場合、CD34+造血前駆
細胞、PBMCs中の DCの前駆細胞あるいは末梢血単球から
誘導するのが一般的である。単球も含めて PBMCsの使用
は CD34+造血前駆細胞に比べ、多くの細胞が簡単に得ら
れると言う利点がある。我々はまず、PBMCsにおける DC
の前駆細胞の細胞生物学的特性を、細胞の付着性と CD1
4の発現様式の点から検討した。CD14+細胞は付着細胞分
画および非付着細胞分画ではあまり多くの割合を占めて
いないにも拘わらず、DCの殆どは付着細胞分画および非
付着細胞分画の CD14+細胞から誘導された。これらのこ
とから、PBMCs中の DCの前駆細胞は付着性とは関係な
く、その大部分は CD14+細胞分画に存在することが明ら
かになり、ある程度純化された DCを多く得るためには
DCの前駆細胞として、CD14+細胞を使用することが望ま
しいことが示された。
細胞、PBMCs中の DCの前駆細胞あるいは末梢血単球から
誘導するのが一般的である。単球も含めて PBMCsの使用
は CD34+造血前駆細胞に比べ、多くの細胞が簡単に得ら
れると言う利点がある。我々はまず、PBMCsにおける DC
の前駆細胞の細胞生物学的特性を、細胞の付着性と CD1
4の発現様式の点から検討した。CD14+細胞は付着細胞分
画および非付着細胞分画ではあまり多くの割合を占めて
いないにも拘わらず、DCの殆どは付着細胞分画および非
付着細胞分画の CD14+細胞から誘導された。これらのこ
とから、PBMCs中の DCの前駆細胞は付着性とは関係な
く、その大部分は CD14+細胞分画に存在することが明ら
かになり、ある程度純化された DCを多く得るためには
DCの前駆細胞として、CD14+細胞を使用することが望ま
しいことが示された。
【００３６】DCの臨床応用においては、調製できる DC
数も重要な課題である。これまでの臨床試験では、DCの
前駆細胞から DCを誘導する培養系における蛋白成分と
して、自己血漿、自己血清、場合によっては FCSが使用
されてきた (14-22)。FCS中には DCの機能に影響を与え
る異種蛋白などの物質が含まれているため、臨床応用に
向けての DCの調製においてはその使用は避けるべきで
あろう。また、同種血漿あるいは同種血清も未知の感染
症を引き起こす可能性がある。これらのことからでは、
自己血漿あるいは自己血清の使用が最も危険性が少ない
ということになる。しかし、図2に示したように、自己
血漿あるいは自己血清の 0.1%から 10%までの濃度依存
性の実験の結果では、DCの調製のための自己血漿あるい
は自己血清の至適濃度には個人差が認められた。また、
図 3に示したように、自己血漿あるいは自己血清は同一
個体であっても、採取時期が異なると、得られる DC数
も随分異なることが判明した。以上のことは、DCを用い
たワクチン療法において、自己血漿あるいは自己血清を
使用して DCを調製する場合には、採取時期の異なるい
くつかのサンプルの中からの DCの調製に至適な血漿あ
るいは血清の選択とそれらの至適濃度の決定をワクチン
療法に先立って検討しなければならないことを示唆して
いる。そこで、本発明者は CD14+細胞から DCを安定し
て調製できる培養条件を探索した。様々な条件を検討
し、自己血漿あるいは自己血清の代わりに HSAが使用で
きることを見出した。試験した 10人それぞれにおい
て、約2% HSAは最大数の DCの誘導を支持した。また、1
0人全体を統計学的に検討してみると、約2% HSAはどの
濃度の自己血漿あるいは自己血清と比べても、より多く
の DCの調製を支持した。これらの観察から、約2% HSA
で DCの調製を行えば、ワクチン療法を開始する前に、
個々の患者において、至適条件を決定するための検討を
する必要性はないと思われる。
数も重要な課題である。これまでの臨床試験では、DCの
前駆細胞から DCを誘導する培養系における蛋白成分と
して、自己血漿、自己血清、場合によっては FCSが使用
されてきた (14-22)。FCS中には DCの機能に影響を与え
る異種蛋白などの物質が含まれているため、臨床応用に
向けての DCの調製においてはその使用は避けるべきで
あろう。また、同種血漿あるいは同種血清も未知の感染
症を引き起こす可能性がある。これらのことからでは、
自己血漿あるいは自己血清の使用が最も危険性が少ない
ということになる。しかし、図2に示したように、自己
血漿あるいは自己血清の 0.1%から 10%までの濃度依存
性の実験の結果では、DCの調製のための自己血漿あるい
は自己血清の至適濃度には個人差が認められた。また、
図 3に示したように、自己血漿あるいは自己血清は同一
個体であっても、採取時期が異なると、得られる DC数
も随分異なることが判明した。以上のことは、DCを用い
たワクチン療法において、自己血漿あるいは自己血清を
使用して DCを調製する場合には、採取時期の異なるい
くつかのサンプルの中からの DCの調製に至適な血漿あ
るいは血清の選択とそれらの至適濃度の決定をワクチン
療法に先立って検討しなければならないことを示唆して
いる。そこで、本発明者は CD14+細胞から DCを安定し
て調製できる培養条件を探索した。様々な条件を検討
し、自己血漿あるいは自己血清の代わりに HSAが使用で
きることを見出した。試験した 10人それぞれにおい
て、約2% HSAは最大数の DCの誘導を支持した。また、1
0人全体を統計学的に検討してみると、約2% HSAはどの
濃度の自己血漿あるいは自己血清と比べても、より多く
の DCの調製を支持した。これらの観察から、約2% HSA
で DCの調製を行えば、ワクチン療法を開始する前に、
個々の患者において、至適条件を決定するための検討を
する必要性はないと思われる。
【００３７】本発明者は HSAを含む培養系で調製された
DCの生物学的特性に変化はなかった。すなわちHSAを含
む培養系で調製された DCの貪食能は、自己血漿あるい
は自己血清を用いて調製された DCと同等であったし、M
HC分子や co-stimulatory分子などの発現も自己血漿あ
るいは自己血清を用いて調製された DCと同等であっ
た。これらのことはまた、HSAの使用の有用性を示して
いると思われる。本発明者は、マウスモデルを用いて、
c-erbB2/HER2/neu原癌遺伝子由来の HER2が腫瘍拒絶抗
原であることと HLA-A2402への結合モチーフをももつ H
ER2p63 (TYLPTNASL)ペプチドが HER2の免疫原性の責任
ペプチドであることを報告してきた (25, 26)。そこ
で、HER2p63を使用して、HSAを含む培養系で調製された
DCの CTLの priming能を調べた。ELISPOTアッセイで検
討すると、HSAを含む培養系で調製された DCはペプチド
特異的に HER2特異的 CD8+細胞を誘導した。現在、本発
明者は、HER2発現腫瘍を持つ HLA-A2402+の患者に対し
て、HSAを含む培養系で調製され、HER2p63をパルスした
DCを用いた細胞免疫療法の臨床試験を計画中である。
DCの生物学的特性に変化はなかった。すなわちHSAを含
む培養系で調製された DCの貪食能は、自己血漿あるい
は自己血清を用いて調製された DCと同等であったし、M
HC分子や co-stimulatory分子などの発現も自己血漿あ
るいは自己血清を用いて調製された DCと同等であっ
た。これらのことはまた、HSAの使用の有用性を示して
いると思われる。本発明者は、マウスモデルを用いて、
c-erbB2/HER2/neu原癌遺伝子由来の HER2が腫瘍拒絶抗
原であることと HLA-A2402への結合モチーフをももつ H
ER2p63 (TYLPTNASL)ペプチドが HER2の免疫原性の責任
ペプチドであることを報告してきた (25, 26)。そこ
で、HER2p63を使用して、HSAを含む培養系で調製された
DCの CTLの priming能を調べた。ELISPOTアッセイで検
討すると、HSAを含む培養系で調製された DCはペプチド
特異的に HER2特異的 CD8+細胞を誘導した。現在、本発
明者は、HER2発現腫瘍を持つ HLA-A2402+の患者に対し
て、HSAを含む培養系で調製され、HER2p63をパルスした
DCを用いた細胞免疫療法の臨床試験を計画中である。
【００３８】
【発明の効果】本発明は以下の効果を有する。 1） 自己血漿あるいは自己血清の至適濃度には個人差が
あるが、HSAでは、10人で検討したが、個人差はなく 2%
が最適であり、癌ワクチン細胞療法のための DC調製に
先立ち、至適濃度を検討する必要がない。
あるが、HSAでは、10人で検討したが、個人差はなく 2%
が最適であり、癌ワクチン細胞療法のための DC調製に
先立ち、至適濃度を検討する必要がない。
【００３９】2） 自己血漿あるいは自己血清は同一人で
あっても、採取時期が異なると、それらを用いて調製さ
れた DC数にばらつきが見られるため、癌ワクチン細胞
療法のための DCの調製前に、いくつか時期を変えて、
血漿あるいは血清を採取、保存し、それらの中から最適
なものを選ぶ必要がある。HSAを用いる場合には、この
ようなことは必要ない。
あっても、採取時期が異なると、それらを用いて調製さ
れた DC数にばらつきが見られるため、癌ワクチン細胞
療法のための DCの調製前に、いくつか時期を変えて、
血漿あるいは血清を採取、保存し、それらの中から最適
なものを選ぶ必要がある。HSAを用いる場合には、この
ようなことは必要ない。
【００４０】3） HSAでは ロット間の差はなく、いつで
も同等数の DCの調製が期待できる。 4） デキストランの貪食能、MHC分子や 共刺激（co-sti
mulatory）分子の発現、ペプチドパルスでの CD8+細胞
の誘導能については、HSAを用いて調製した DCが自己血
漿あるいは自己血清を用いて調製した DCと比べ、劣っ
ていることはない。
も同等数の DCの調製が期待できる。 4） デキストランの貪食能、MHC分子や 共刺激（co-sti
mulatory）分子の発現、ペプチドパルスでの CD8+細胞
の誘導能については、HSAを用いて調製した DCが自己血
漿あるいは自己血清を用いて調製した DCと比べ、劣っ
ていることはない。
【００４１】5） 自己血漿あるいは自己血清は、各施設
で分離し、保管する必要があるため、感染あるいは汚染
の危険性も高くなる。HSAは採取、保管する必要がな
い。すなわち、HSAの使用は自己血漿あるいは自己血清
の使用に比べ、体外での DCの調製においてより安全で
ある。
で分離し、保管する必要があるため、感染あるいは汚染
の危険性も高くなる。HSAは採取、保管する必要がな
い。すなわち、HSAの使用は自己血漿あるいは自己血清
の使用に比べ、体外での DCの調製においてより安全で
ある。
【００４２】本明細書中に引用された参考文献は以下の
とおりである。 1) Pardoll DM: Cancer vaccines. Nature Med 4: 525-
531, 1998. 2) Boon T, Gajewski TF, Coulie PG: From defined hu
man tumor antigens toeffective immunization? Immun
ol Today 16: 334-336, 1995. 3) Houghton AN: Cancer antigens: Immune recognitio
n of self and alteredself. J Exp Med 180: 1-4, 199
4. 4) Van den Eynde BJ, van der Bruggen P: T cell def
ined tumor antigens. Curr Opin Immunol 9: 684-693,
1997. 5) Aichele P, Brduscha-Riem K, Zinkernagel RM, Hen
gartner H, Pircher H:T cell priming versus T cell
tolerance induced by systhetic peptides. JExp Med
182: 261-266, 1995.
とおりである。 1) Pardoll DM: Cancer vaccines. Nature Med 4: 525-
531, 1998. 2) Boon T, Gajewski TF, Coulie PG: From defined hu
man tumor antigens toeffective immunization? Immun
ol Today 16: 334-336, 1995. 3) Houghton AN: Cancer antigens: Immune recognitio
n of self and alteredself. J Exp Med 180: 1-4, 199
4. 4) Van den Eynde BJ, van der Bruggen P: T cell def
ined tumor antigens. Curr Opin Immunol 9: 684-693,
1997. 5) Aichele P, Brduscha-Riem K, Zinkernagel RM, Hen
gartner H, Pircher H:T cell priming versus T cell
tolerance induced by systhetic peptides. JExp Med
182: 261-266, 1995.
【００４３】6) Toes RE, Blom RJ, Offringa R, Kast
WM, Melief CJM: Enhanced tumor growth after peptid
e vaccination: Functional deletion of tumor-specif
ic CTLinduced by peptide vaccination can lead to t
he inability to reject tumors. J Immunol 156: 3911
-3918, 1996. 7) Toes REM, van der Voort EIH, Schoenberger SP, D
rijfhout JW, van Bloois L, Storm G, Kast WM, Offri
nga R, Melief CJM: Enhancement of tumor outgrowth
through CTL tolerization after peptide vaccination
is avoided by peptide presentation on dendritic c
ells. J Immunol 160: 4449-4456, 1998. 8) Steinman RM: The dendritic cell system and its
role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9: 271-29
6, 1991. 9) Caux C, Liu Y-J, Banchereau J: Recent advances
in the study of dendritic cells and follicular den
dritic cells. Immunol Today 16: 2-5, 1995. 10) Hart DNJ: Dendritic cells: Unique leukocyte po
pulations which control the primary immune respons
e. Blood 90: 3245-3287, 1997.
WM, Melief CJM: Enhanced tumor growth after peptid
e vaccination: Functional deletion of tumor-specif
ic CTLinduced by peptide vaccination can lead to t
he inability to reject tumors. J Immunol 156: 3911
-3918, 1996. 7) Toes REM, van der Voort EIH, Schoenberger SP, D
rijfhout JW, van Bloois L, Storm G, Kast WM, Offri
nga R, Melief CJM: Enhancement of tumor outgrowth
through CTL tolerization after peptide vaccination
is avoided by peptide presentation on dendritic c
ells. J Immunol 160: 4449-4456, 1998. 8) Steinman RM: The dendritic cell system and its
role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9: 271-29
6, 1991. 9) Caux C, Liu Y-J, Banchereau J: Recent advances
in the study of dendritic cells and follicular den
dritic cells. Immunol Today 16: 2-5, 1995. 10) Hart DNJ: Dendritic cells: Unique leukocyte po
pulations which control the primary immune respons
e. Blood 90: 3245-3287, 1997.
【００４４】11) Cella MF, Sallusto F, Lanzavecchia
A: Origin, maturation and antigenpresenting funct
ion of dendritic cells. Curr Opin Immunol 9: 10-1
6, 1997. 12) Banchereau J, Steinman RM: Dendritic cells and
the control of immunity. Nature 392: 245-252, 199
8. 13) Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Leb
ecque S, Liu Y-J, Pulendran B, Palucka K: Immunobi
ology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18: 767
-811, 2000. 14) Hsu FJ, Benike C, Fagnoni F, Liles TM, Czerwin
ski D, Taidi B, Engleman EG, Levy R: Vaccination o
f patients with B-cell lymphoma using autologous a
ntigen-pulsed dendritic cells. Nature Med 2: 52-5
8, 1996. 15) Murphy G, Tjoa B, Ragde H, Kenny G, Boynton A:
Phase I clinical trial: T-cell therapy for prosta
te cancer using autologous dendritic cells pulsed
with HLA-A0201-specific peptides from prostate-spe
cific membrane antigen. Prostate 29: 371-380, 199
6.
A: Origin, maturation and antigenpresenting funct
ion of dendritic cells. Curr Opin Immunol 9: 10-1
6, 1997. 12) Banchereau J, Steinman RM: Dendritic cells and
the control of immunity. Nature 392: 245-252, 199
8. 13) Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Leb
ecque S, Liu Y-J, Pulendran B, Palucka K: Immunobi
ology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18: 767
-811, 2000. 14) Hsu FJ, Benike C, Fagnoni F, Liles TM, Czerwin
ski D, Taidi B, Engleman EG, Levy R: Vaccination o
f patients with B-cell lymphoma using autologous a
ntigen-pulsed dendritic cells. Nature Med 2: 52-5
8, 1996. 15) Murphy G, Tjoa B, Ragde H, Kenny G, Boynton A:
Phase I clinical trial: T-cell therapy for prosta
te cancer using autologous dendritic cells pulsed
with HLA-A0201-specific peptides from prostate-spe
cific membrane antigen. Prostate 29: 371-380, 199
6.
【００４５】16) Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M,
Sun Y, Grabbe S, Dummer R, Burg G,Schadendorf D: V
accination of melanoma patients with peptide- or t
umorlysate-pulsed dendritic cells. Nature Med 3: 3
28-332, 1998. 17) Reichardt VL, Okada CY, Liso A, Benike CJ, Sto
ckerl-Goldstein KE, Engleman EG, Blume KG, Levy R:
Idiotype vaccination using dendritic cellsafter a
utologous peripheral blood stem cell transplantati
on for multiplemyeloma: A feasibility study. Blood
93: 2411-2419, 1999. 18) Morse MA, Deng Y, Coleman D, Hull S, Kitrell-F
isher E, Nair S, Schlom J, Ryback M-E, Lyerly HK:
A phase I study of active immunotherapy withcarcin
oembryonic antigen peptide (CAP-1)-pulsed, autolog
ous human cultured dendritic cells in patients wit
h metastatic malignancies expressingcarcinoembryon
ic antigen. Clin Cancer Res 5: 1331-1338, 1999. 19) Lim SH, Bailey-Wood R: Idiotypic protein-pulse
d dendritic cell vaccination in multiple myeloma.
Int J Cancer 83: 215-222, 1999. 20) Thurner B, Haendle I, Roder C, Dieckmann D, Ma
czek C, Schreiner D, von den Driesch P, Brocker E
B, Steinman RM, Enk A, Kampgen E, Schuler G:Vaccin
ation with Mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyt
e-derived dendritic cells expands specific cytotox
ic T cells and induces regression of some metastas
es in advanced stage IV melanoma. J Exp Med 190: 1
669-1678,1999.
Sun Y, Grabbe S, Dummer R, Burg G,Schadendorf D: V
accination of melanoma patients with peptide- or t
umorlysate-pulsed dendritic cells. Nature Med 3: 3
28-332, 1998. 17) Reichardt VL, Okada CY, Liso A, Benike CJ, Sto
ckerl-Goldstein KE, Engleman EG, Blume KG, Levy R:
Idiotype vaccination using dendritic cellsafter a
utologous peripheral blood stem cell transplantati
on for multiplemyeloma: A feasibility study. Blood
93: 2411-2419, 1999. 18) Morse MA, Deng Y, Coleman D, Hull S, Kitrell-F
isher E, Nair S, Schlom J, Ryback M-E, Lyerly HK:
A phase I study of active immunotherapy withcarcin
oembryonic antigen peptide (CAP-1)-pulsed, autolog
ous human cultured dendritic cells in patients wit
h metastatic malignancies expressingcarcinoembryon
ic antigen. Clin Cancer Res 5: 1331-1338, 1999. 19) Lim SH, Bailey-Wood R: Idiotypic protein-pulse
d dendritic cell vaccination in multiple myeloma.
Int J Cancer 83: 215-222, 1999. 20) Thurner B, Haendle I, Roder C, Dieckmann D, Ma
czek C, Schreiner D, von den Driesch P, Brocker E
B, Steinman RM, Enk A, Kampgen E, Schuler G:Vaccin
ation with Mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyt
e-derived dendritic cells expands specific cytotox
ic T cells and induces regression of some metastas
es in advanced stage IV melanoma. J Exp Med 190: 1
669-1678,1999.
【００４６】21) Mackensen A, Herbst B, Chen J-L, K
ohler G, Noppen C, Herr W, Spagnolf GC, Cerundolo
V, Lindemann A: Phase I study in melanoma patients
of avaccine with peptide-pulsed dendritic cells g
enerated in vitro from CD34+ hematopoietic progeni
tor cells. Int J Cancer 86: 385-392, 2000. 22) Titzer S, Christensen O, Manzke O, Tesch H, Wo
lf J, Emmerich B, Carsten C, Diehl V, Bohlen H: Va
ccination of multiple myeloma patients withidiotyp
e-pulsed dendritic cells: Immunological and clinic
al aspects. BrJ Haematol 108: 805-816, 2000. 23) Siena S, Nicola MD, Bregni M, Mortarini R, Ani
chini A, Lombardi L, Ravagnani F, Parmiani G, Gian
ni AM: Massive ex vivo generation of functional de
ndritic cells from mobilized CD34+ blood progenito
rs for anticancer therapy. Exp Hematol 23: 1463-14
71, 1995. 24) Mitani H, Katayama N, Araki H, Ohishi K, Kobay
ashi K, Suzuki H, Nishii K, Masuya M, Yasukawa K,
Minami N, Shiku H: Activity of interleukin 6in the
differentiation of monocytes to macrophages and d
endritic cells.Br J Haematol 109: 288-295, 2000. 25) Moore GE, Gerner RE, Franklin HA: Culture of n
ormal human leukocytes. JAMA 199:519-524, 1967.
ohler G, Noppen C, Herr W, Spagnolf GC, Cerundolo
V, Lindemann A: Phase I study in melanoma patients
of avaccine with peptide-pulsed dendritic cells g
enerated in vitro from CD34+ hematopoietic progeni
tor cells. Int J Cancer 86: 385-392, 2000. 22) Titzer S, Christensen O, Manzke O, Tesch H, Wo
lf J, Emmerich B, Carsten C, Diehl V, Bohlen H: Va
ccination of multiple myeloma patients withidiotyp
e-pulsed dendritic cells: Immunological and clinic
al aspects. BrJ Haematol 108: 805-816, 2000. 23) Siena S, Nicola MD, Bregni M, Mortarini R, Ani
chini A, Lombardi L, Ravagnani F, Parmiani G, Gian
ni AM: Massive ex vivo generation of functional de
ndritic cells from mobilized CD34+ blood progenito
rs for anticancer therapy. Exp Hematol 23: 1463-14
71, 1995. 24) Mitani H, Katayama N, Araki H, Ohishi K, Kobay
ashi K, Suzuki H, Nishii K, Masuya M, Yasukawa K,
Minami N, Shiku H: Activity of interleukin 6in the
differentiation of monocytes to macrophages and d
endritic cells.Br J Haematol 109: 288-295, 2000. 25) Moore GE, Gerner RE, Franklin HA: Culture of n
ormal human leukocytes. JAMA 199:519-524, 1967.
【００４７】26) Moore GE, Kitamura H: Cell line de
rived from patient with myeloma. NY State J Med 6
8:2054-2060, 1968. 27) Shimizu J, Suda T, Yoshioka T, Kosugi A, Fujiw
ara H, Hamaoka T: Induction of tumor-specific in v
ivo protective immunity by immunization withtumor
antigen-pulsed antigen-presenting cells. J Immunol
142:1053-1059,1989. 28) Nagata Y, Furugen R, Hiasa A, Ikeda H, Ohta N,
Furukawa K, NakamuraH, Kurukawa K, Kanematsu T, S
hiku H: Peptides derived from a wild-type murine p
roto-oncogene c-erbB-2/HER2/neu can induce CTL and
tumor suppression in syngeneic hosts. J Immunol 1
59: 1336-1343, 1997. 29) Okugawa T, Ikuta Y, Takahashi Y, Obata H, Tani
da K, Watanabe M, ImaiS, Furugen R, Nagata Y, Toyo
da N, Shiku H: A novel human HER2-derived peptide
homologous to the mouse Kd-restricted tumor reject
ion antigen caninduce HLA-A24-restricted cytotoxic
T lymphocytes in ovarian cancer patients and heal
thy individuals. Eur J Immunol (in press). 30) Ikuta Y, Okugawa T, Furugen R, Nagata Y, Takah
ashi Y, Wang L, IkedaH, Watanabe M, Imai S, Shiku
H: A HER2/neu-derived peptide, a Kd-restricted mur
ine tumor rejection antigen, induces HER2-specific
HLA-A2402-restricted CD8+ cytotoxic T lymphocyte
s. Int J Cancer 87: 553-558, 2000.
rived from patient with myeloma. NY State J Med 6
8:2054-2060, 1968. 27) Shimizu J, Suda T, Yoshioka T, Kosugi A, Fujiw
ara H, Hamaoka T: Induction of tumor-specific in v
ivo protective immunity by immunization withtumor
antigen-pulsed antigen-presenting cells. J Immunol
142:1053-1059,1989. 28) Nagata Y, Furugen R, Hiasa A, Ikeda H, Ohta N,
Furukawa K, NakamuraH, Kurukawa K, Kanematsu T, S
hiku H: Peptides derived from a wild-type murine p
roto-oncogene c-erbB-2/HER2/neu can induce CTL and
tumor suppression in syngeneic hosts. J Immunol 1
59: 1336-1343, 1997. 29) Okugawa T, Ikuta Y, Takahashi Y, Obata H, Tani
da K, Watanabe M, ImaiS, Furugen R, Nagata Y, Toyo
da N, Shiku H: A novel human HER2-derived peptide
homologous to the mouse Kd-restricted tumor reject
ion antigen caninduce HLA-A24-restricted cytotoxic
T lymphocytes in ovarian cancer patients and heal
thy individuals. Eur J Immunol (in press). 30) Ikuta Y, Okugawa T, Furugen R, Nagata Y, Takah
ashi Y, Wang L, IkedaH, Watanabe M, Imai S, Shiku
H: A HER2/neu-derived peptide, a Kd-restricted mur
ine tumor rejection antigen, induces HER2-specific
HLA-A2402-restricted CD8+ cytotoxic T lymphocyte
s. Int J Cancer 87: 553-558, 2000.
【００４８】31) Pietschmann P, Stockl J, Draxler
S, Majdic O, Knapp W: Functional and phenotyipic c
haracteristics of dendritic cells generated in hum
an plasma supplemented medium. Scand J Immunol 51:
377-383, 2000. 32) Duperrier K, Eljaafari A, Dezutter-Dambuyant
C, Bardin C, Jacquet C,Yoneda K, Schmitt D, Gebuhr
er L, Rigal D: Distinct subsets of dendriticcells
resembling dermal DCs can be generated in vitro fr
om monocytes, in the presence of different serum s
upplements. J Immunol Methods 238: 119-131, 2000. 33) Gong J, Chen D, Kashiwada M, Li Y, Chen L, Tak
euchi H, Qu H, Rowse GJ, Gendler SJ, Kufe D: Rever
sal of tolerance to human MUC1 antigen in MUC1 tra
nsgenic mice immunized with fusions of dendritic a
nd carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 95: 627
9-6283, 1998.
S, Majdic O, Knapp W: Functional and phenotyipic c
haracteristics of dendritic cells generated in hum
an plasma supplemented medium. Scand J Immunol 51:
377-383, 2000. 32) Duperrier K, Eljaafari A, Dezutter-Dambuyant
C, Bardin C, Jacquet C,Yoneda K, Schmitt D, Gebuhr
er L, Rigal D: Distinct subsets of dendriticcells
resembling dermal DCs can be generated in vitro fr
om monocytes, in the presence of different serum s
upplements. J Immunol Methods 238: 119-131, 2000. 33) Gong J, Chen D, Kashiwada M, Li Y, Chen L, Tak
euchi H, Qu H, Rowse GJ, Gendler SJ, Kufe D: Rever
sal of tolerance to human MUC1 antigen in MUC1 tra
nsgenic mice immunized with fusions of dendritic a
nd carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 95: 627
9-6283, 1998.
【図１】付着 CD14+、付着 CD14-、非付着 CD14+、非付
着 CD14- PBMCsの DC形成能。4x 107個の PBMCsを、付
着 CD14+、付着 CD14-、非付着 CD14+、非付着 CD14-の
4群に分けた。ここでAdは付着を、またNon-Adは非付着
を示す。それぞれの分画を GM-CSFと IL-4を添加した 1
0% FCS添加RPMI 1640を用いて、5 x 104個/mlの濃度
で、24ウエルのプレートにて37 ℃で培養した。5日間の
培養後、細胞数を測定し、抗 CD1a抗体と抗 CD14抗体で
染色し、CD1a+CD14-細胞を DCとして算定した。結果は
5回の実験の内の代表的な 1つからのものである。
着 CD14- PBMCsの DC形成能。4x 107個の PBMCsを、付
着 CD14+、付着 CD14-、非付着 CD14+、非付着 CD14-の
4群に分けた。ここでAdは付着を、またNon-Adは非付着
を示す。それぞれの分画を GM-CSFと IL-4を添加した 1
0% FCS添加RPMI 1640を用いて、5 x 104個/mlの濃度
で、24ウエルのプレートにて37 ℃で培養した。5日間の
培養後、細胞数を測定し、抗 CD1a抗体と抗 CD14抗体で
染色し、CD1a+CD14-細胞を DCとして算定した。結果は
5回の実験の内の代表的な 1つからのものである。
【図２】自己血漿、自己血清あるいは HSAの CD14+細胞
からの DCの誘導の支持能の比較。CD14+細胞を 5 x 104
個/mlで GM-CSFと IL-4を添加したRPMI 1640培地を用い
て、24ウエルの プレートにて37℃で培養した。5日間の
培養後、細胞を回収し、細胞数を測定し、抗 CD1a抗体
と抗 CD14抗体で染色した。(A) Case 6由来の培養細胞
を 1%自己血漿、1%自己血清、2% HSAで培養した後の FI
TC結合抗 CD1a抗体と PE結合抗 CD14抗体による二重染
色。本文中の"材料と方法"のところで述べたように、図
中のそれぞれの枠内の細胞を DCと見なした。(B) 健常
人 10人(Case 1〜Case 10)における 0.1%、1%、2%、5
%、10%の自己血漿あるいは自己血清または 0.1%、0.5
%、1%、2%、5%の HSA存在下で誘導される CD14+細胞由
来の DC数。データは 3個の平均で示してある。2% HSA
で得られる DC数は、どの濃度の自己血漿あるいは自己
血清で得られる DC数より有意に高い (paired t-test検
定でP<0.01)。
からの DCの誘導の支持能の比較。CD14+細胞を 5 x 104
個/mlで GM-CSFと IL-4を添加したRPMI 1640培地を用い
て、24ウエルの プレートにて37℃で培養した。5日間の
培養後、細胞を回収し、細胞数を測定し、抗 CD1a抗体
と抗 CD14抗体で染色した。(A) Case 6由来の培養細胞
を 1%自己血漿、1%自己血清、2% HSAで培養した後の FI
TC結合抗 CD1a抗体と PE結合抗 CD14抗体による二重染
色。本文中の"材料と方法"のところで述べたように、図
中のそれぞれの枠内の細胞を DCと見なした。(B) 健常
人 10人(Case 1〜Case 10)における 0.1%、1%、2%、5
%、10%の自己血漿あるいは自己血清または 0.1%、0.5
%、1%、2%、5%の HSA存在下で誘導される CD14+細胞由
来の DC数。データは 3個の平均で示してある。2% HSA
で得られる DC数は、どの濃度の自己血漿あるいは自己
血清で得られる DC数より有意に高い (paired t-test検
定でP<0.01)。
【図３】採取時期の異なる自己血漿あるいは自己血清の
CD14+細胞から DCへの誘導に対する影響。Case 3と Ca
se 5由来の CD14+細胞を 24ウエルのプレートにて 5 x1
05個/mlの濃度で GM-CSFと IL-4を添加したRPMI 1640培
地を用いて37℃で培養した。培養 5日後に、細胞を回収
し、DC数を算定した。5つの異なった自己血漿と自己血
清は少なくとも 1週間以上の間隔を開けて、6ヶ月以上
掛けて採取した。自己血漿と自己血清は 1%で、HSAは 2
%で添加した。データは 3つの平均であり、10% FCSで得
られたデータを 100%として、換算した。2% HSAとの差
が 一対の t-test検定で、＊印は P<0.01、†印は P<0.
05である。
CD14+細胞から DCへの誘導に対する影響。Case 3と Ca
se 5由来の CD14+細胞を 24ウエルのプレートにて 5 x1
05個/mlの濃度で GM-CSFと IL-4を添加したRPMI 1640培
地を用いて37℃で培養した。培養 5日後に、細胞を回収
し、DC数を算定した。5つの異なった自己血漿と自己血
清は少なくとも 1週間以上の間隔を開けて、6ヶ月以上
掛けて採取した。自己血漿と自己血清は 1%で、HSAは 2
%で添加した。データは 3つの平均であり、10% FCSで得
られたデータを 100%として、換算した。2% HSAとの差
が 一対の t-test検定で、＊印は P<0.01、†印は P<0.
05である。
【図４】GM-CSFと IL-4存在下で自己血漿、自己血清あ
るいは HSAを含む培養系で誘導された DCの FITC-デキ
ストランの取り込み。RPMI 1640培養系には自己血漿は
1%、自己血清は 1%、HSAは 2%で添加した。細胞を FITC
-デキストランと 1時間、4℃あるいは 37℃で反応さ
せ、冷却 PBSで 3回洗浄後、FACScanで解析した。図2A
で示したように自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む
培養系ではマクロファージは誘導されないため、解析は
回収された全細胞で行った。点線が 4℃における FITC-
デキストランの取り込みを示しており、実線が 37℃に
おける FITC-デキストランの取り込みを示している。結
果は 4回の実験の内の代表的な 1つからのものである。
るいは HSAを含む培養系で誘導された DCの FITC-デキ
ストランの取り込み。RPMI 1640培養系には自己血漿は
1%、自己血清は 1%、HSAは 2%で添加した。細胞を FITC
-デキストランと 1時間、4℃あるいは 37℃で反応さ
せ、冷却 PBSで 3回洗浄後、FACScanで解析した。図2A
で示したように自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む
培養系ではマクロファージは誘導されないため、解析は
回収された全細胞で行った。点線が 4℃における FITC-
デキストランの取り込みを示しており、実線が 37℃に
おける FITC-デキストランの取り込みを示している。結
果は 4回の実験の内の代表的な 1つからのものである。
【図５】FCS、自己血漿、自己血清あるいは HSAを含む
培養で誘導された DCの形質の解析。Case 6由来の CD14
+細胞を 24ウエルのプレートに 5 x 105個/mlの濃度で
GM-CSFと IL-4を添加したRPMK 1640培養系にて37℃で5
日間培養し、さらに 2日間TNF-αを加えて培養した。FC
Sは 10%で、自己血漿と自己血清は 1%で、HSAは 2%で添
加した。培養 7日後に、細胞を回収し、図に示したモノ
クローナル抗体で染色した。図の左に CD1a-FITCと CD1
4-PEで染色したドットプロットを示した。形質発現は図
の左の CD1a-FITCと CD14-PEの ドットプロットの中に
示した枠内の細胞について解析した。点線がコントロー
ル抗体での解析結果を示しており、実線が用いたモノク
ローナル抗体での解析結果を示している。結果は 8回の
実験の内の代表的な 1つからのものである。
培養で誘導された DCの形質の解析。Case 6由来の CD14
+細胞を 24ウエルのプレートに 5 x 105個/mlの濃度で
GM-CSFと IL-4を添加したRPMK 1640培養系にて37℃で5
日間培養し、さらに 2日間TNF-αを加えて培養した。FC
Sは 10%で、自己血漿と自己血清は 1%で、HSAは 2%で添
加した。培養 7日後に、細胞を回収し、図に示したモノ
クローナル抗体で染色した。図の左に CD1a-FITCと CD1
4-PEで染色したドットプロットを示した。形質発現は図
の左の CD1a-FITCと CD14-PEの ドットプロットの中に
示した枠内の細胞について解析した。点線がコントロー
ル抗体での解析結果を示しており、実線が用いたモノク
ローナル抗体での解析結果を示している。結果は 8回の
実験の内の代表的な 1つからのものである。
【図６】HER2p63ペプチドをパルスした自己 DCを用いて
の ELISPOTアッセイ。HLA-A2402+の Case 3と Case 8か
ら自己 DCを調製した。CD14+細胞を 24ウエルのプレー
トに 5 x 105個/mlの濃度で、GM-CSFと IL-4を添加した
RPMI 1640培養系にて37℃で 5日間培養し、さらに 2日
間 TNF-αを加えて培養した。FCSは 10%で、自己血漿と
自己血清は 1%で、HSAは 2%で添加した。培養 7日後
に、細胞を回収し、アッセイに賦した。HER2p63をパル
スした DCで得られたスポット数とペプチドをパルスし
ていない DCで得られたスポット数の差を HER2p63特異
的なリンパ球とした。それぞれの棒グラフは 3つの wel
lで行った 2 x 105個の PBMCsあたりのスポット数の 平
均±標準偏差（SD）を示している。異なった 4種類の方
法で調製した DC間で得られた IFN-γ特異的な スポッ
ト数の間には、t-test検定で差を認めなかった。
の ELISPOTアッセイ。HLA-A2402+の Case 3と Case 8か
ら自己 DCを調製した。CD14+細胞を 24ウエルのプレー
トに 5 x 105個/mlの濃度で、GM-CSFと IL-4を添加した
RPMI 1640培養系にて37℃で 5日間培養し、さらに 2日
間 TNF-αを加えて培養した。FCSは 10%で、自己血漿と
自己血清は 1%で、HSAは 2%で添加した。培養 7日後
に、細胞を回収し、アッセイに賦した。HER2p63をパル
スした DCで得られたスポット数とペプチドをパルスし
ていない DCで得られたスポット数の差を HER2p63特異
的なリンパ球とした。それぞれの棒グラフは 3つの wel
lで行った 2 x 105個の PBMCsあたりのスポット数の 平
均±標準偏差（SD）を示している。異なった 4種類の方
法で調製した DC間で得られた IFN-γ特異的な スポッ
ト数の間には、t-test検定で差を認めなかった。
Claims (12)
- 【請求項１】 血清または血漿を含まずヒト血清アルブ
ミン（HSA）を含有する動物細胞培養培地にてヒト末梢
血単核球であるCD14+細胞を含む細胞を培養し、生成し
た樹状細胞を回収することを含む、樹状細胞の調製方
法。 - 【請求項２】 前記HSAが培地あたり2±0.5％（w/v）の
濃度で含有する、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記HSAが培地あたり2±0.4％（w/v）の
濃度で含有する、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記HSAが培地あたり2±0.3％（w/v）の
濃度で含有する、請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 前記HSAが培地あたり2±0.2％（w/v）の
濃度で含有する、請求項２記載の方法。 - 【請求項６】 前記HSAの濃度が培地あたり2±0.1％（w
/v）である、請求項2記載の方法。 - 【請求項７】 前記培地が、カルシウム、カリウム、マ
グネシウムおよびナトリウム金属塩、D-グルコース、グ
ルタチオン（還元型）、必須L-アミノ酸（20種）、ビオ
チン、パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-
イノシトール、ニコチンアミド、p-アミノ安息香酸、塩
酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミ
ン類（B12など）、フェノールレッドを含有する、請求
項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記培地がさらにサイトカインを含有す
る、請求項1記載の方法。 - 【請求項９】 前記サイトカインがコロニー刺激因子お
よびインターロイキンを含む、請求項8記載の方法。 - 【請求項１０】 前記コロニー刺激因子およびインター
ロイキンがGM-CSFおよびIL-4からなる、請求項９記載の
方法。 - 【請求項１１】 前記培地がさらに樹状細胞成熟化因子
を含有する、請求項８、９または１０記載の方法 - 【請求項１２】 前記樹状細胞成熟化因子がTNF-αであ
る、請求項１１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001041867A JP2002238552A (ja) | 2001-02-19 | 2001-02-19 | ヒト血清アルブミンを用いたヒト末梢血単核球であるｃｄ１４＋細胞からの樹状細胞の調製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001041867A JP2002238552A (ja) | 2001-02-19 | 2001-02-19 | ヒト血清アルブミンを用いたヒト末梢血単核球であるｃｄ１４＋細胞からの樹状細胞の調製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002238552A true JP2002238552A (ja) | 2002-08-27 |
Family
ID=18904242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001041867A Pending JP2002238552A (ja) | 2001-02-19 | 2001-02-19 | ヒト血清アルブミンを用いたヒト末梢血単核球であるｃｄ１４＋細胞からの樹状細胞の調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002238552A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249322A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-13 | 蓝莲(杭州)生物科技有限公司 | 一种dc细胞的培养液及其培养方法 |
-
2001
- 2001-02-19 JP JP2001041867A patent/JP2002238552A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249322A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-13 | 蓝莲(杭州)生物科技有限公司 | 一种dc细胞的培养液及其培养方法 |
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|---|---|---|---|
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