JP2002211954A - Surface-roughened slide glass and method for analyzing biological material using the same - Google Patents
Surface-roughened slide glass and method for analyzing biological material using the sameInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子解析、診
断、治療等に使用される遺伝子あるいは蛋白質等の生体
物質解析用等に用いられるスライドグラス及び該ガラス
を用いて遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質等を解析す
る方法に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a slide glass used for analyzing biological materials such as genes or proteins used for gene analysis, diagnosis, treatment and the like, and a biological material such as genes or proteins using the glass. And the like.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、遺伝子解析用等に用いられる基板
としては、ポリリシン等をコーティングしたスライドグ
ラスが用いられ、表面に１万以上のＤＮＡ断片(ＤＮＡ
プローブ)等の遺伝子を載せうるように加工がされてい
るものが広く用いられれている。2. Description of the Related Art Conventionally, a slide glass coated with polylysine or the like has been used as a substrate used for gene analysis and the like, and more than 10,000 DNA fragments (DNA
Probes and the like that have been processed so that they can carry genes are widely used.
【０００３】前記のようなチップを用いて例えば、ある
ＤＮＡサンプルの塩基配列を知りたい場合には、該スラ
イドグラス上に、予め塩基配列が解明されており、互い
に異なる塩基配列を有する数万本のＤＮＡ断片を、位置
がわかるように結合させておいたものを用意し、これに
蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮＡ断片は、
該スライドグラス上につけたＤＮＡ断片（プローブ）の
うちの相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズ
する。ハイブリダイズ部分は、スライドグラスを蛍光測
定することによりスポットとして識別でき、ＤＮＡサン
プル中のＤＮＡ断片の配列を解明することができる。こ
のように、遺伝子解析用スライドグラスは、あるＤＮＡ
の塩基配列を簡単に特定することができることから、生
体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリング、ゲノムミ
スマッチング等の遺伝子解析等に利用されるほか、さら
にガン遺伝子の突然変異の検出等遺伝子診断や医薬品の
開発等に応用されている。When it is desired to know the base sequence of a certain DNA sample using the above-mentioned chip, for example, the base sequence is previously elucidated on the slide glass, and tens of thousands of bases having different base sequences from each other are obtained. A DNA fragment is prepared by binding the DNA fragments so that their positions can be identified, and a fluorescently-labeled DNA sample is allowed to flow.
It hybridizes with a probe having a complementary sequence among the DNA fragments (probes) attached to the slide glass. The hybridized portion can be identified as a spot by measuring the fluorescence of the slide glass, and the sequence of the DNA fragment in the DNA sample can be elucidated. As described above, the slide glass for gene analysis has a certain DNA.
Can be easily identified, which is used for analysis of living genome, gene expression monitoring, gene analysis such as genome mismatching, etc. It is applied to the development of
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】上記遺伝子解析用スラ
イドグラスを用いて解析を行う場合、蛍光標識ＤＮＡを
ハイブリダイズし、蛍光強度を観察することによって行
われる。しかし、従来の遺伝子解析用スライドグラス
は、前記スポットの解析をするにあたり、ガラスの洗浄
等の前処理を行うため、スポットしたＤＮＡ断片が洗い
流されてしまい、スポットが明瞭に検出できない場合が
多かった。また、固定化するＤＮＡ断片が少ないため、
スポットが明瞭に検出できない場合も多かった。本発明
は、このような従来の遺伝子解析用スライドグラスの有
する蛍光検出の不明瞭さという問題点を解決することを
目的とするものである。The analysis using the above-mentioned slide glass for gene analysis is performed by hybridizing a fluorescent-labeled DNA and observing the fluorescence intensity. However, in the conventional slide glass for gene analysis, in performing the spot analysis, since a pretreatment such as washing of the glass is performed, the spotted DNA fragment is washed away, and the spot cannot be clearly detected in many cases. . In addition, since there are few DNA fragments to be immobilized,
In many cases, spots could not be clearly detected. An object of the present invention is to solve such a problem that the fluorescence detection of a conventional slide glass for gene analysis is unclear.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上
記目的を達成すべく鋭意検討の結果、ＤＮＡプローブあ
るいは蛋白質等の生体物質等を載せる粗面化したスライ
ドグラス表面に炭素系物質層を形成することにより、ス
ライドグラスを洗浄してもスポットしたＤＮＡ断片が洗
い流されずに強固に多く固定化されており、蛍光照射し
た際に、蛍光スポットが明瞭となることに気が付いた。
本発明は係る知見に基づくものである。The inventors of the present invention have conducted intensive studies to achieve the above object, and have found that a carbon-based material layer is formed on a roughened slide glass surface on which a biological material such as a DNA probe or a protein is placed. It was noticed that the formation of No. 1 resulted in that the spotted DNA fragments were firmly fixed in a large amount without being washed away even when the slide glass was washed, and that the fluorescent spots became clear upon irradiation with fluorescence.
The present invention is based on such findings.
【０００６】本発明のスライドグラスは、粗面化処理を
施した表面粗さ（中心線平均粗さ：Ｒａ ＪＩＳ Ｂ ０
６０１）が１〜５１０ｎｍであるガラス基体上の表面に
炭素系物質層が形成されたものであることを特徴とす
る。このようなスライドグラスは、組成、温度処理や表
面処理がどのようなものでも良いが、一般的に市販され
ているホウケイ酸ガラスをスライドグラスサイズに切断
したものが望ましい。ガラスの粗面化処理は、フッ酸あ
るいは、ケイフッ酸とシリカを含んだ水溶液中で処理す
るのが望ましい。また、機械的研磨でも良い。炭素系物
質がダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたは
グラファイトであることが望ましい。前記炭素系物質層
の被膜の厚みは、１ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好
ましい。前記ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス
０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含
んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作製されたも
のであることが好ましい。さらに、前記炭素系物質層の
被膜上に、オリゴヌクレオチド断片を担持させたもので
あることが好ましい。また、このような本発明の粗面化
し、炭素系物質層を形成したスライドグラスは、その表
面にＤＮＡプルーブ等の遺伝子、蛋白質、ペプチド等の
生体物質を担持させて遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生
体物質を解析する方法に利用することができる。The slide glass of the present invention has been subjected to a surface roughening treatment (center line average roughness: Ra JIS B 0).
601) is characterized in that a carbon-based material layer is formed on the surface of a glass substrate having a thickness of 1 to 510 nm. Such a slide glass may have any composition, temperature treatment, or surface treatment, but is preferably a commercially available borosilicate glass cut into a slide glass size. The glass surface roughening treatment is desirably performed in hydrofluoric acid or an aqueous solution containing silicic hydrofluoric acid and silica. Also, mechanical polishing may be used. Desirably, the carbon-based material is diamond, diamond-like carbon, or graphite. The thickness of the carbon-based material layer is preferably 1 nm to 1000 nm. It is preferable that the diamond-like carbon is produced by ionization vapor deposition in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of methane gas. Further, it is preferable that an oligonucleotide fragment is supported on the coating of the carbon-based material layer. Further, such a slide glass of the present invention having a roughened surface and a carbon-based material layer formed thereon carries a gene such as a DNA probe, a biological material such as a protein or a peptide on the surface thereof, and the gene, a protein or a peptide. It can be used for a method of analyzing a biological material.
【０００７】[0007]
【発明の実施の態様】本発明のスライドガラスは、粗面
化したガラス基板最表面に炭素質物質が形成されたもの
を用い、スライドグラスの上にＤＮＡ、蛋白質、ペプチ
ド等のサンプルを載せて様々な解析に用いると、遺伝子
あるいは蛋白質等の生体物質との親和性等が強固になる
ので好ましい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The slide glass of the present invention uses a roughened glass substrate having a carbonaceous substance formed on the outermost surface, and a sample of DNA, protein, peptide, etc. is placed on the slide glass. It is preferable to use it in various analyses, because the affinity with biological substances such as genes or proteins becomes strong.
【０００８】スライドグラスの基板となるガラスの粗面
化方法として、フッ酸を含んだ水溶液、あるいはケイフ
ッ化水素酸とシリカを含んだ水溶液で処理するのが好ま
しい。これらの水溶液にホウ酸などのｐＨ調整用薬品を
添加しても良い。処理する方法は浸漬法、スプレー法が
好ましい。また、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸
化ジルコニウム、べんがらあるいは酸化クロム等の研磨
剤を用いて、機械的に研磨しても良い。特に、ケイフッ
化水素酸とシリカを含んだ水溶液中に浸漬処理すること
により、ガラス表面に微小な凹凸を形成すると効果的で
ある。表面粗さＲａ（中心線平均粗さ：ＪＩＳ Ｂ ０６
０１）は１〜５１０ｎｍが好ましい。１ｎｍ未満では、
オリゴヌクレチドをスポッティングして蛍光検出装置で
蛍光強度を測定しても、蛍光強度が小さすぎて検出が困
難な場合がある。５１０ｎｍを超えると、蛍光強度が飽
和した状態でこれ以上処理するのは不経済である。ま
た、この粗面化処理したガラスの表面に炭素系物質の表
面処理層を形成させることが好ましい。炭素系物質は、
ＤＮＡプローブ固着性の点からダイヤモンドライクカー
ボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファイト等が好ま
しい。[0008] As a method of roughening the glass used as the slide glass substrate, it is preferable to treat the glass with an aqueous solution containing hydrofluoric acid or an aqueous solution containing hydrofluoric acid and silica. A pH adjusting chemical such as boric acid may be added to these aqueous solutions. The treatment method is preferably an immersion method or a spray method. Further, mechanical polishing may be performed using an abrasive such as aluminum oxide, cerium oxide, zirconium oxide, bran or chromium oxide. In particular, it is effective to form fine irregularities on the glass surface by immersion treatment in an aqueous solution containing hydrofluoric acid and silica. Surface roughness Ra (center line average roughness: JIS B 06)
01) is preferably from 1 to 510 nm. Below 1 nm,
Even when spotting oligonucleotides and measuring fluorescence intensity with a fluorescence detector, the fluorescence intensity may be too small to be detected. If it exceeds 510 nm, it is uneconomical to perform further processing in a state where the fluorescence intensity is saturated. Further, it is preferable to form a surface treatment layer of a carbon-based material on the surface of the glass subjected to the surface roughening treatment. Carbon-based materials
From the viewpoint of DNA probe fixation, diamond-like carbon (DLC), diamond, graphite and the like are preferable.
【０００９】基板たるガラス上に、ダイヤモンド、ダイ
ヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系物質
からなる表面処理層を形成させたスライドグラスは、Ｄ
ＮＡプロ−ブを強固に固定化させることができる。すな
わち、炭素は化学的安定性に優れており、ＤＮＡプロー
ブ等を載せる際の反応等に耐えることができるのであ
る。その理由は、炭素上にＤＮＡなどのプローブを固定
化させたときに炭素原子との共有結合の形態を示すの
で、ＤＮＡプローブをスライドグラス表面に強固に固定
化させることができるためであると考えられる。さら
に、上記のダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダ
イヤモンド、グラファイト等の炭素系物質と他の物質と
の混合体、例えば金属やセラミックス等との混合体も表
面処理層として用いることができる。また、上記のダイ
ヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グ
ラファイト等の炭素系物質と他の物質との積層体も表面
処理層として用いることができる。A slide glass in which a surface treatment layer made of a carbon-based material such as diamond, diamond-like carbon, and graphite is formed on a glass serving as a substrate is a D-shaped slide glass.
The NA probe can be firmly immobilized. That is, carbon has excellent chemical stability and can withstand a reaction or the like when a DNA probe or the like is mounted. The reason is considered to be that when a probe such as DNA is immobilized on carbon, a covalent bond with a carbon atom is exhibited, so that the DNA probe can be firmly immobilized on the slide glass surface. Can be Further, a mixture of a carbon-based substance such as diamond-like carbon (DLC), diamond, and graphite and another substance, for example, a mixture of a metal, ceramic, or the like, can also be used as the surface treatment layer. Further, a laminate of a carbon-based material such as diamond-like carbon (DLC), diamond, and graphite and another material can also be used as the surface treatment layer.
【００１０】また、固定化されたプローブは、図１に示
すようにスライドグラス上にほぼ垂直に林立させられる
ので、スライドグラス表面の単位面積あたりの固定化密
度を上げることができる。上記表面処理層のダイヤモン
ドの素材としては、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤ
モンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも使用で
きる。また、それらの構造が単結晶体或いは多結晶体の
いずれでも差し支えない。生産性の観点よりマイクロ波
プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いてダイヤモン
ド膜を形成させることが好ましい。また、表面処理層と
しては、ダイヤモンドと同等の性能を有し経済的にも有
利な点で、非晶質のダイヤモンドライクカーボン（Ｄｉ
ａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）膜をガラス表面
に形成することもできる。ダイヤモンドライクカーボン
（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）は、ダイ
ヤモンドやグラファイトと同様に炭素原子から構成さ
れ、ダイヤモンドに類似した特性を有することからＤＬ
Ｃと呼ばれている。ＤＬＣの結晶構造は、アモルファス
（非晶質）である。上記表面処理層としては、グラファ
イト等の炭素系物質も好適に用いられる。ダイヤモンド
は、中心及び四隅に炭素原子をもつ正四面体構造で、ｓ
ｐ３混成軌道を形成するきわめて堅い立方晶系の結晶で
ある。[0010] Further, since the immobilized probe is erected almost vertically on the slide glass as shown in FIG. 1, the immobilization density per unit area of the slide glass surface can be increased. As the diamond material for the surface treatment layer, any of synthetic diamond, high-pressure formed diamond, natural diamond and the like can be used. Further, their structure may be either a single crystal or a polycrystal. From the viewpoint of productivity, it is preferable to form a diamond film using a gas phase synthesis method such as a microwave plasma CVD method. As the surface treatment layer, amorphous diamond-like carbon (Di) is used because it has the same performance as diamond and is economically advantageous.
Amond Like Carbon) film can also be formed on the glass surface. Diamond-like carbon is composed of carbon atoms like diamond and graphite, and has properties similar to diamond.
Called C. The crystal structure of DLC is amorphous. As the surface treatment layer, a carbon-based material such as graphite is preferably used. Diamond has a tetrahedral structure with carbon atoms in the center and four corners.
Very hard cubic crystals that form p3 hybrid orbitals.
【００１１】本発明の炭素系物質としては、グラファイ
トや無定形炭素を挙げることができる。グラファイト
は、ｓｐ２混成の六角形の網面がπ電子を介して層状に
積み重なった構造の六方晶系結晶である。無定形炭素は
明瞭な結晶構造を示さない。無定形炭素には結晶程度の
低い徴晶質炭素も含まれる。また、結晶の大小やその配
列の度合いなどによって、無定形炭素からグラファイト
に至る中間的な構造の炭素系物質が存在するが、これら
の間には明瞭な変態点が存在しない。本発明の炭素系物
質とは、グラファイト又は無定形炭素の単体 、グラフ
ァイトと無定形炭素との混合物、これらに無定形炭素及
びグラファイト の中間的構造を示すものが含まれる。
本発明の表面処理層は、上記ダイヤモンド、ＤＬＣ、グ
ラファイト等の炭素系物質が混合されたものも用いるこ
とができる。また本発明の表面処理層は、ＤＬＣ膜、ダ
イヤモンド膜、炭素系物質膜とが交互に積層されたもの
も用いることができる。The carbon-based material of the present invention includes graphite and amorphous carbon. Graphite is a hexagonal crystal having a structure in which sp2 hybrid hexagonal network planes are stacked in layers via π electrons. Amorphous carbon does not show a distinct crystal structure. Amorphous carbon includes crystalline carbon having a low crystallinity. Further, depending on the size of the crystals and the degree of their arrangement, there are carbonaceous substances having an intermediate structure ranging from amorphous carbon to graphite, but there is no clear transformation point between them. The carbon-based material of the present invention includes a simple substance of graphite or amorphous carbon, a mixture of graphite and amorphous carbon, and those showing an intermediate structure between amorphous carbon and graphite.
As the surface treatment layer of the present invention, a mixture of a carbon-based material such as diamond, DLC, and graphite can also be used. In addition, as the surface treatment layer of the present invention, a layer in which a DLC film, a diamond film, and a carbon-based material film are alternately laminated can be used.
【００１２】本発明の表面処理層の厚みは、特に限定す
るものではないが、１ｎｍ〜１０００ｎｍの厚みがあれ
ばよい。１ｎｍ未満では、あまりに薄すぎて表面処理層
の厚みが均一にはならずに、下地のガラス基板を被覆で
きない部分が存在するので、好ましくない。一方、１０
００ｎｍを超える被覆は表面処理層中の応力により、剥
離が生じやすくなるので好ましくない。工業上の生産性
からすると、表面処理層の厚みは、１０ｎｍ〜５００ｎ
ｍとすることが好ましい。さらに好ましくは、３０〜２
００ｎｍである。The thickness of the surface treatment layer of the present invention is not particularly limited, but may be 1 nm to 1000 nm. If the thickness is less than 1 nm, the thickness of the surface treatment layer is too small to be uniform, and there is a portion that cannot cover the underlying glass substrate. On the other hand, 10
A coating having a thickness of more than 00 nm is not preferable because peeling easily occurs due to stress in the surface treatment layer. From the viewpoint of industrial productivity, the thickness of the surface treatment layer is 10 nm to 500 n.
m is preferable. More preferably, 30 to 2
00 nm.
【００１３】表面処理層のダイヤモンドの形成割合は、
上記プラズマＣＶＤ法で形成する場合には、反応槽内の
圧力、バイアス電圧や基板温度等の条件により適宜設定
することができる。表面処理層中のダイヤモンド濃度の
調整は、例えばプラズマＣＶＤ法でＤＬＣ膜を形成する
場合、置換ガスとしてのＮ２ガスの供給量を調整するこ
とにより、供給原料としての炭化水素ガスにおけるＨ／
Ｃ比を変更することに行うことができる。The formation ratio of diamond in the surface treatment layer is as follows:
In the case of forming by the above-mentioned plasma CVD method, it can be appropriately set depending on conditions such as a pressure in a reaction tank, a bias voltage and a substrate temperature. For example, when a DLC film is formed by a plasma CVD method, the concentration of diamond in the surface treatment layer is adjusted by adjusting the supply amount of N 2 gas as a replacement gas so that H /
Changing the C ratio can be done.
【００１４】Ｎ２ガスの供給量を多くするとＤＬＣ膜中
のＨ２取り込み量が多くなるので、ＤＬＣにおけるダイ
ヤモンド濃度を高くすることができ、一方Ｎ２ガスの供
給量を少なくするとＤＬＣ膜中へのＨ２取り込み量が少
なくなるので、ＤＬＣにおけるダイヤモンド濃度を低く
することができる。ガラス基板上へのダイヤモンド、Ｄ
ＬＣ、グラファイト等の表面処理層形成は、高周波プラ
ズマＣＶＤ法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、しー
ザ蒸着法等により形成することができる。高周波プラズ
マＣＶＤ法では、１３．５６ＭＨｚの高周波によって電
極間に生じるグロー放電により原料ガス(メタン)を分解
し、基板上にＤＬＣ膜を合成する。イオン化蒸着法で
は、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利
用して、原料ガス(ベンゼン)を分解・イオン化し、バイ
アス電圧によって基板上に成膜する。また、水素ガス０
〜９９体積％と残りメタンガス１００〜１体積％からな
る混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ膜を形成
しても良い。[0014] Since allowing a larger amount of supply of N 2 gas becomes large H 2 uptake in the DLC film, it is possible to increase the diamond concentration in the DLC, whereas N 2 gas supply amount to less that the the DLC film of since H 2 uptake is reduced, it is possible to lower the diamond concentration in the DLC. Diamond on glass substrate, D
The surface treatment layer such as LC and graphite can be formed by a high-frequency plasma CVD method, an ionization evaporation method, an arc evaporation method, a laser evaporation method, or the like. In the high-frequency plasma CVD method, a source gas (methane) is decomposed by glow discharge generated between electrodes by a high frequency of 13.56 MHz, and a DLC film is synthesized on a substrate. In the ionization vapor deposition method, a source gas (benzene) is decomposed and ionized using thermoelectrons generated by a tungsten filament, and a film is formed on a substrate by a bias voltage. In addition, hydrogen gas 0
The DLC film may be formed by an ionization vapor deposition method in a mixed gas consisting of ９９99% by volume and the remaining methane gas of 100〜1% by volume.
【００１５】ＤＬＣ膜は、通常黒色を呈しているが、本
発明のスライドグラスにおいては、透明膜であることが
好ましい。すなわち、本発明のスライドグラスは、遺伝
子解析用等に用いられるものであって、スライドグラス
表面に蛍光照射し、その強度を測定するものであること
から、光透過性が要求されるのである。本発明の表面処
理層を形成したスライドグラスの光透過率は、光波長が
４００ｎｍ〜５００ｎｍの領域(Ｂ１ｕｅ領域)における
透過率が、５０％以上であることが好ましい。さらに好
ましくは６０％以上である。また 光波長が６００ｎｍ
〜７００ｎｍの領域（Ｒｅｄ領域）における透過率が、
７０％以上であることが好ましい。さらに好ましくは７
５％以上である。上記のそれぞれの領域における光透過
率を有することでスライドグラス上の蛍光標識の強度を
効率よく測定できるのである。The DLC film usually has a black color, but the slide glass of the present invention is preferably a transparent film. That is, since the slide glass of the present invention is used for gene analysis and the like and irradiates the surface of the slide glass with fluorescent light to measure the intensity thereof, light transparency is required. As for the light transmittance of the slide glass on which the surface treatment layer of the present invention is formed, it is preferable that the transmittance in a region where the light wavelength is 400 nm to 500 nm (B1ue region) is 50% or more. More preferably, it is 60% or more. The light wavelength is 600 nm
The transmittance in the region of 700 nm (Red region) is
It is preferably at least 70%. More preferably, 7
5% or more. By having the light transmittance in each of the above regions, the intensity of the fluorescent label on the slide glass can be measured efficiently.
【００１６】このような光透過性を待ったダイヤモンド
ライクカーボンを製造するには、例えば、イオン化蒸着
法において、炭化水素ガスと水素ガスとの混合ガス中の
水素ガスの含有率を増すほど、光透過率を高くしたダイ
ヤモンドライクカーボンを製造することができる。上記
のイオン化蒸着法とは、Weissmantelらにより考案され
た方法で、炭化水素ガスソースＤＬＣ成膜法のー種であ
り、イオン源は陰極である熱フィラメントと対向する陽
極グリツドとそれらを取り囲む金属円筒からなる。In order to produce diamond-like carbon which has been waiting for such light transmittance, for example, in ionization vapor deposition, light transmittance increases as the content of hydrogen gas in the mixed gas of hydrocarbon gas and hydrogen gas increases. Diamond-like carbon with a high rate can be produced. The above-mentioned ionization vapor deposition method is a method devised by Weissmantel et al., Which is a kind of a hydrocarbon gas source DLC film formation method, wherein an ion source is an anode grid facing a hot filament as a cathode and a metal cylinder surrounding them. Consists of
【００１７】イオン化蒸着法を用いて、スライドグラス
上に光透過率を高くしたダイヤモンドライクカーボンを
製造する実施態様を述べる。例えば、厚みｌｍｍのスラ
イドグラス（マツナミガラス（株）製Ｓ−１１１２）を
用いて、この上にダイヤモンドライクカーボン（ＤＬ
Ｃ）膜を厚み１０ｎｍ形成した。そしてこのＤＬＣ膜を
形成したスライドグラスの光透過率を調べた結果は次の
ようになった。すなわち、水素ガスを全く含まない雰囲
気（０体積％）でＤＬＣ膜を形成したスライドグラス
は、４００ｎｍの波長の光では８８．７％の光透過率で
あった。水素ガスを１体積％含んだ雰囲気でＤＬＣ膜を
形成したスライドグラスは、４００ｎｍの波長では８
９．４％の光透過率であった。更に、水素ガスを８０体
積％含んだ雰囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグラス
は、４００ｎｍの波長では９０．８％の光透過率であっ
た。このように、水素ガスの割合を増すほど光透過率が
高くなることが分かった。An embodiment in which diamond-like carbon having a high light transmittance is produced on a slide glass using an ionization vapor deposition method will be described. For example, a slide glass (S-1112 manufactured by Matsunami Glass Co., Ltd.) having a thickness of 1 mm is used, and diamond-like carbon (DL
C) A film having a thickness of 10 nm was formed. The result of examining the light transmittance of the slide glass having the DLC film formed thereon was as follows. That is, the slide glass on which the DLC film was formed in an atmosphere containing no hydrogen gas (0% by volume) had a light transmittance of 88.7% for light having a wavelength of 400 nm. A slide glass on which a DLC film was formed in an atmosphere containing 1% by volume of hydrogen gas was 8 at a wavelength of 400 nm.
The light transmittance was 9.4%. Furthermore, the slide glass on which the DLC film was formed in an atmosphere containing 80% by volume of hydrogen gas had a light transmittance of 90.8% at a wavelength of 400 nm. Thus, it was found that the light transmittance increased as the proportion of the hydrogen gas increased.
【００１８】また、７００ｎｍの波長の光で光透過率を
測定してみると、水素ガスを全く含まない雰囲気（０体
積％）でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、９０．
０％の光透過率であった。水素ガスを１体積％含んだ雰
囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグヲスは、９０．８
％の光透過率であった。更に、水素ガスを８０体積％含
んだ雰囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、９
２％の光透過率であった。このように、７００ｎｍの波
長の光で測定した場合も４００ｎｍの波長を用いて測定
した結果と同じように、水素ガスの割合を増すほど光透
過率が高くなることが分かった。When the light transmittance was measured with light having a wavelength of 700 nm, the slide glass on which the DLC film was formed in an atmosphere (0% by volume) containing no hydrogen gas was 90.
The light transmittance was 0%. A slide gas in which a DLC film was formed in an atmosphere containing 1% by volume of hydrogen gas was 90.8%.
% Light transmittance. Furthermore, a slide glass on which a DLC film was formed in an atmosphere containing 80% by volume of hydrogen gas was 9%.
The light transmittance was 2%. Thus, it was found that the light transmittance increased as the proportion of the hydrogen gas increased, as in the case of the measurement with the light of the wavelength of 700 nm, similarly to the result of the measurement with the wavelength of 400 nm.
【００１９】なお、表面処理層を全く形成していないス
ライドグラス自体(ブランク)の光透過率は、４００ｎｍ
の波長では９１．０％を示し、７００ｎｍの波長では９
２％の光透過率を示した。ここで、光透過率は以下の式
に基づき計算した。 光透過率Ｔ＝（Ｉ／Ｉ0）×１００ Ｉ:ブランクでの透過光の強度 Ｉ０:表面処理層を形成したときの透過光の強度The light transmittance of the slide glass itself (blank) having no surface treatment layer formed thereon is 400 nm.
At a wavelength of 91.0%, and 90.0% at a wavelength of 700 nm.
It showed a light transmittance of 2%. Here, the light transmittance was calculated based on the following equation. Light transmittance T = (I / I 0 ) × 100 I: Intensity of transmitted light in blank I 0 : Intensity of transmitted light when surface treatment layer is formed
【００２０】水素ガスを含有すると透明になりやすいの
は、水素ガスを含有しないとｓｐ２混成軌道を多量に含
み着色の原因となるが、水素ガスを含むと、透明なｓｐ
３軌道を多く含むようになるためと考えられる。しか
し、水素ガスを多く含むとダイヤモンドライクカーボン
の成膜速度が遅くなり、水素ガスの含有率は、より好ま
しくは１〜５０体積％が良い。When hydrogen gas is contained, it is easy to become transparent. When hydrogen gas is not contained, sp2 hybrid orbitals are contained in a large amount and cause coloring, but when hydrogen gas is contained, transparent sp2 is contained.
This is probably because three orbits are included. However, if a large amount of hydrogen gas is contained, the film-forming speed of diamond-like carbon becomes slow, and the content of hydrogen gas is more preferably 1 to 50% by volume.
【００２１】アーク式蒸着法では、固体のグラファイト
原料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧
を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰
極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさら
に負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に
向かってプラズマ中の炭素イオンを加速し成膜を行う。
また、しーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ
(パルス発振)光をグラファイトのターゲット板に照射し
て溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させること
により形成することができる。In the arc deposition method, a direct current voltage is applied between a solid graphite raw material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode) to cause an arc discharge in a vacuum to generate a plasma of carbon atoms from the cathode. By applying a more negative bias voltage to the substrate than the evaporation source, carbon ions in the plasma are accelerated toward the substrate to form a film.
Further, in the so-called vapor deposition method, for example, an Nd: YAG laser
(Pulse oscillation) can be formed by irradiating a graphite target plate with light to melt it and depositing carbon atoms on a glass substrate.
【００２２】本発明のスライドグラスは、ＤＮＡプロー
ブ等の遺伝子、蛋白質、ベプチド等の生体物質を多数載
せることができるものである。従って、スライドグラス
の表面上に複数の微小区分が設けられ、１つの区分に多
数のオリゴヌクレオチド断片を担持可能となっているも
のも好ましく採用される。微小区分のそれぞれにおい
て、ＤＮＡプローブ等の種類を変えることについては特
に制限はなく、用途に応じて適宜変化させることができ
る。The slide glass of the present invention can carry a large number of biological substances such as genes such as DNA probes, proteins, and peptides. Therefore, it is also preferable to employ a slide glass in which a plurality of microsections are provided on the surface and one section can carry a large number of oligonucleotide fragments. There is no particular limitation on the type of DNA probe or the like in each of the microsections, and it can be changed as appropriate according to the application.
【００２３】スライドグラスの形状は特に限定されず、
例えば、フィルムまたはシートのような平板状、円盤
状、または粒状等のものであってもよい。また、スライ
ドグラスの厚さ、大きさ等にも特に制限はなく、通常用
いられるのと同様の範囲とすることができる。スライド
グラスの基板たるガラスの種類として、通常用いられて
いるスライドグラス、結晶化ガラス、石英ガラス、強化
ガラスなど特に限定されるものではない。また、組成の
異なるガラスを２層以上に積層したガラスでも良い。The shape of the slide glass is not particularly limited.
For example, it may be in the form of a flat plate, a disk, or a grain such as a film or a sheet. The thickness, size, etc. of the slide glass are not particularly limited, and can be in the same range as that usually used. The type of glass serving as the substrate of the slide glass is not particularly limited, such as a commonly used slide glass, crystallized glass, quartz glass, and tempered glass. Further, glass in which two or more glasses having different compositions are laminated may be used.
【００２４】本発明の粗面化したスライドグラスに載せ
ることができるオリゴヌクレオチド断片（プロ―ブ）に
ついては、１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ断片等、
塩基数にも特に制限はない。オリゴヌクレオチド断片の
固定は、スライドグラスの表面への化学結合等により行
うことができる。例えば、ダイヤモンドライクカーボン
による炭素系物質層を形成させたスライドグラスを用い
る場合、表面を活性化、すなわちＤＮＡと化学結合しや
すくした後に、ＤＮＡの末端塩基のアミノ基を結合する
ことができる。Oligonucleotide fragments (probes) which can be placed on the roughened slide glass of the present invention include single-stranded or double-stranded DNA and RNA fragments.
There is no particular limitation on the number of bases. The oligonucleotide fragments can be fixed by chemical bonding to the surface of a slide glass. For example, when a slide glass having a carbon-based material layer formed of diamond-like carbon is used, the amino group of the terminal base of the DNA can be bound after activating the surface, that is, making it easy to chemically bond to the DNA.
【００２５】この場合のスライドグラス表面活性化の一
例を挙げると、該スライドグラスを塩素ガス中で固体支
持体に紫外線照射してダイヤモンドライクカーボン膜表
面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射し
てアミノ化した後、適当な酸クロリドあるいは酸無水物
を用いてカルボキシル化する。更に、カルボキシル化し
てないアミノ基を多価カルボン酸溶液に浸漬することに
よりマスキングする。末端のカルボキシル基をカルボジ
イミド或いはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ
−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することによ
り、アミド結合を介して炭化水素基の末端にＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル基等の活性エステル基が結
合した基を固定化することができ、活性化される。ま
た、該スライドグラスをアンモニアガスまたはアミノ基
を含む化合物を導入した反応容器に入れ、プラズマによ
りアミノ化しても良い。As an example of activating the surface of the slide glass in this case, the surface of the diamond-like carbon film is chlorinated by irradiating the slide glass with ultraviolet light in chlorine gas and then irradiating with ultraviolet light in ammonia gas. After amination, carboxylation is performed using an appropriate acid chloride or acid anhydride. Further, the non-carboxylated amino group is masked by immersion in a polycarboxylic acid solution. The terminal carboxyl group is replaced with carbodiimide or dicyclohexylcarbodiimide and N
By dehydration-condensation with -hydroxysuccinimide, a group in which an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide ester group is bonded to a terminal of a hydrocarbon group via an amide bond can be immobilized and activated. Alternatively, the slide glass may be placed in a reaction vessel into which ammonia gas or a compound containing an amino group has been introduced, and aminated by plasma.
【００２６】こうして本発明のスライドグラス表面を活
性化させておけば、例えば、塩基配列が既に解明されて
いる数万本のＤＮＡ断片（プローブ）を担持させること
ができる。また、該スライドグラス上にオリゴｄＴプラ
イマーを結合させておき、逆転写反応等で目的のｃＤＮ
Ａを伸張させると同時にスライドグラスに結合すること
もできる。さらに、ＰＣＲ等を用いてガラス上で多数の
ＤＮＡ鎖を伸張させ、かつ結合させることもできる。By activating the surface of the slide glass of the present invention in this way, it is possible to carry, for example, tens of thousands of DNA fragments (probes) whose base sequence has already been elucidated. Also, an oligo dT primer is bound to the slide glass, and the desired cDN is obtained by a reverse transcription reaction or the like.
A can be attached to a slide glass at the same time as A is extended. Furthermore, a large number of DNA chains can be extended and bound on glass using PCR or the like.
【００２７】このようにして、ＤＮＡ断片を結合させた
後、これに蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮ
Ａサンプルは、該スライドグラス上に結合させたＤＮＡ
断片（プローブ）のうちの相補的な配列を有するプロー
ブとハイブリダイズするので、蛍光スポットとしてＤＮ
Ａサンプルの配列を解明することができる。さらに、本
発明のスライドグラスは、その裏面に例えば金属蒸着膜
のような反射層が形成されていることが好ましい。この
ような反射層をスライドグラスの裏面に形成させると、
表面から蛍光照射をした場合の蛍光の反射効率を高める
効果を有し、蛍光分析装置の感度を高めることができ
る。すなわち、蛍光スポットを明瞭に観察することがで
き、一度に多量の解析を行うことができる。スライドグ
ラスの裏面に形成させる反射層の種類としては、Ｔｉ、
Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、ＷＣ、等の単層又はこれらの複合層
が好ましい。反射層の厚みは、スライドグラス全体に均
一に被覆されなければならないことから１００ｎｍ以上
が好ましい。さらに好ましくは、１０００ｎｍ以上であ
る。このような反射層を形成するにはー般に真空蒸着法
を用いることができる。その他、スパッタリング法、イ
オンビーム蒸着法などの上記の反射層を形成させるのに
適した従来技術を適宜選択して用いることができる。After the DNA fragment is bound in this way, a DNA sample labeled with fluorescence is applied to
Sample A is the DNA bound on the slide glass.
Since it hybridizes with a probe having a complementary sequence among fragments (probes), DN
The sequence of the A sample can be elucidated. Further, the slide glass of the present invention preferably has a reflective layer such as a metal deposition film formed on the back surface thereof. When such a reflective layer is formed on the back surface of the slide glass,
This has the effect of increasing the reflection efficiency of fluorescence when the surface is irradiated with fluorescence, and can increase the sensitivity of the fluorescence analyzer. That is, the fluorescent spot can be clearly observed, and a large amount of analysis can be performed at once. Types of the reflective layer formed on the back surface of the slide glass include Ti,
A single layer of Au, Pt, Nb, WC, or the like, or a composite layer thereof is preferable. The thickness of the reflective layer is preferably 100 nm or more because it must be uniformly coated on the entire slide glass. More preferably, it is 1000 nm or more. In general, a vacuum evaporation method can be used to form such a reflective layer. In addition, a conventional technique suitable for forming the above-described reflective layer such as a sputtering method or an ion beam evaporation method can be appropriately selected and used.
【００２８】このように、本発明のスライドグラスは、
あるＤＮＡの塩基配列を従来と同様の方法をそのまま使
いながら従来よりも格段に明瞭に解析、特定することが
できることから、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニ
タリング、ゲノムミスマッチング等の遺伝子解析等に利
用されるほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検出等遺
伝子診断や医薬品の開発等に有用である。As described above, the slide glass of the present invention
Because the base sequence of a certain DNA can be analyzed and identified much more clearly than before using the same method as before, it can be used for analysis of biological genomes, monitoring of gene expression, gene analysis such as genome mismatching, etc. In addition to its use, it is useful for gene diagnosis such as detection of mutations in oncogenes, and development of pharmaceuticals.
【００２９】[0029]
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに説明す
る。 実施例1 （１）以下のようにして、遺伝子解析用に用いるための
スライドグラスを用意した。まず、スライドグラスの基
板として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ
（厚み）のガラスを用いて、ガラスを粗面化した。ケイ
フッ化水素酸２０ｍｏｌ／Ｌ、シリカゲル３０ｇ／Ｌ及び
ホウ酸０．０４ｍｏｌ／Ｌを含んだ水溶液中に温度２５
℃の条件で、ガラスを浸漬した。浸漬時間は適宜行い、
表面粗さＲａを変化させた。更に、イオン交換水で洗浄
後、乾燥して、粗面化したガラスを得た。次に、この粗
面化したガラス基体表面に、イオン化蒸着法により、メ
タンガス９５体積％と水素ガスを５体積％を混合したガ
スを原料として、ＤＬＣ膜２５ｎｍの厚みに形成したス
ライドグラスを作成した。The present invention will be further described below with reference to examples. Example 1 (1) A slide glass to be used for gene analysis was prepared as follows. First, as a slide glass substrate, 25 mm (width) × 75 mm (length) × 1 mm
Using (thickness) glass, the glass was roughened. Temperature 25 in an aqueous solution containing 20 mol / L hydrosilicofluoric acid, 30 g / L silica gel and 0.04 mol / L boric acid.
The glass was immersed under the condition of ° C. Immersion time is performed appropriately,
The surface roughness Ra was changed. Furthermore, after washing with ion-exchanged water, drying was performed to obtain a roughened glass. Next, a slide glass having a DLC film thickness of 25 nm was formed on the roughened glass substrate surface by ionization deposition using a gas obtained by mixing 95% by volume of methane gas and 5% by volume of hydrogen gas as a raw material. .
【００３０】（２）次に、このスライドグラス表面を化
学修飾し、活性化させた。すなわち、ガラス基体表面を
１分間塩素化した後、１０分間アミノ化し、さらに酸ク
ロリドへ１０分間直接浸漬した。次に、超純水で洗浄
後、活性化液へ浸漬して直接活性化を行った。活性化液
の組成は、１，４−ジオキサン１ｍＬ、ハイドロゲンシ
アナミド２５ｍｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド
１５０ｍｇであり、これらを溶解したものである。さら
に超純水で洗浄後、６５℃で乾燥して活性化した。(2) Next, the surface of the slide glass was chemically modified and activated. That is, the glass substrate surface was chlorinated for 1 minute, then aminated for 10 minutes, and then directly immersed in acid chloride for 10 minutes. Next, after cleaning with ultrapure water, the substrate was immersed in an activation liquid to directly activate. The composition of the activating solution was 1 mL of 1,4-dioxane, 25 mg of hydrogen cyanamide, and 150 mg of N-hydroxysuccinimide, which were dissolved. After washing with ultrapure water, it was dried and activated at 65 ° C.
【００３１】前記のようにして作成したスライドグラス
表面に、１０ｐｍｏｌ／ｍＬ濃度の蛍光標識オリゴヌク
レチド（Ｃｙ３−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、
Ｃｙ３、アマシャムファルマシアバイオテク社製、配列
表の配列番号１参照）をスポッティングして、蛍光検出
装置で蛍光強度を測定した。また、スポティング後洗浄
し、同様に蛍光強度を測定した。なお、装置として、Ｌ
ＡＳ−１０００Ｐｌｕｓを用い、測定時間を１分とし
た。表１に示すように、こうして得られた蛍光強度は、
表面粗さＲａが大きいほど強いことが判明した。On the surface of the slide glass prepared as described above, a fluorescence-labeled oligonucleotide (Cy3-AAAAAAAAAAAAAAAAAA, 10 pmol / mL) was added.
Cy3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd., see SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) was spotted, and the fluorescence intensity was measured with a fluorescence detector. Further, after spotting, washing was performed, and the fluorescence intensity was measured in the same manner. In addition, as an apparatus, L
The measurement time was 1 minute using AS-1000Plus. As shown in Table 1, the fluorescence intensity thus obtained is
It was found that the larger the surface roughness Ra, the stronger.
【００３２】[0032]
【表１】 表１において、粗面化しない比較例のガラスの表面粗さ
Ｒａは０．８ｎｍであり、粗面化した本発明のスライド
グラスは、スポット後および洗浄後の蛍光強度は、粗面
化しないガラス上のスポット後および洗浄後の蛍光強度
よりも優れていた。すなわち、祖面化した本発明のスラ
イドグラスには、スポットしたＤＮＡ、蛋白質、ペプチ
ド等の生体関連物質断片の密度が高く維持されており、
スポットが明瞭に検出できた。[Table 1] In Table 1, the surface roughness Ra of the glass of the comparative example that is not roughened is 0.8 nm, and the roughened slide glass of the present invention has a fluorescence intensity after spotting and after washing, which is higher than that of the glass that is not roughened. It was better than the fluorescence intensity after the above spot and after washing. That is, in the slide glass of the present invention, the density of spots of bio-related substances such as DNA, protein, and peptide is maintained high,
Spots could be clearly detected.
【００３３】[0033]
【発明の効果】本発明の粗面化したスライドグラスは、
粗面化しないガラスに比べて、あるＤＮＡの塩基配列を
従来と同様の方法をそのまま使いながら従来よりも格段
に明瞭に解析、特定することができることから、生体ゲ
ノムの解析、遺伝子発現のモニタリング、ゲノムミスマ
ッチング等の遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質の解析
等に利用されるほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検
出等遺伝子診断や医薬品の開発等に有用である。According to the present invention, the roughened slide glass is
Compared to non-roughened glass, the base sequence of a certain DNA can be analyzed and identified much more clearly than before using the same method as before, so analysis of living genome, monitoring of gene expression, It is used not only for analysis of biological substances such as genes or proteins such as genome mismatching, but also for gene diagnosis such as mutation detection of cancer genes and development of pharmaceuticals.
【図１】本発明のスライドグラス上にプローブを固定化
する場合の概略説明図である。FIG. 1 is a schematic explanatory view when a probe is immobilized on a slide glass of the present invention.
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Toyo Kohan Co., Ltd. <120> 粗面化スライドグラス及びそれを用いて生体物質
を解析する方法 <130> P4081 <150> JP 2000-339675 <151> 2000-11-07 <160> 1 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 1 AAAAAAAAAA AAAAAA 16[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Toyo Kohan Co., Ltd. <120> Roughened slide glass and method for analyzing biological material using the same <130> P4081 <150> JP 2000-339675 <151> 2000 -11-07 <160> 1 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 1 AAAAAAAAAA AAAAAA 16
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１３年１１月１９日（２００１．１１．
１９）[Submission date] November 19, 2001 (2001.11.
19)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】発明の詳細な説明[Correction target item name] Detailed description of the invention
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子解析、診
断、治療等に使用される遺伝子あるいは蛋白質等の生体
物質解析用等に用いられるスライドグラス及び該ガラス
を用いて遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質等を解析す
る方法に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a slide glass used for analyzing biological materials such as genes or proteins used for gene analysis, diagnosis, treatment and the like, and a biological material such as genes or proteins using the glass. And the like.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、遺伝子解析用等に用いられる基板
としては、ポリリシン等をコーティングしたスライドグ
ラスが用いられ、表面に１万以上のＤＮＡ断片(ＤＮＡ
プローブ)等の遺伝子を載せうるように加工がされてい
るものが広く用いられれている。2. Description of the Related Art Conventionally, a slide glass coated with polylysine or the like has been used as a substrate used for gene analysis and the like, and more than 10,000 DNA fragments (DNA
Probes and the like that have been processed so that they can carry genes are widely used.
【０００３】前記のようなチップを用いて例えば、ある
ＤＮＡサンプルの塩基配列を知りたい場合には、該スラ
イドグラス上に、予め塩基配列が解明されており、互い
に異なる塩基配列を有する数万本のＤＮＡ断片を、位置
がわかるように結合させておいたものを用意し、これに
蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮＡ断片は、
該スライドグラス上につけたＤＮＡ断片（プローブ）の
うちの相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズ
する。ハイブリダイズ部分は、スライドグラスを蛍光測
定することによりスポットとして識別でき、ＤＮＡサン
プル中のＤＮＡ断片の配列を解明することができる。こ
のように、遺伝子解析用スライドグラスは、あるＤＮＡ
の塩基配列を簡単に特定することができることから、生
体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリング、ゲノムミ
スマッチング等の遺伝子解析等に利用されるほか、さら
にガン遺伝子の突然変異の検出等遺伝子診断や医薬品の
開発等に応用されている。When it is desired to know the base sequence of a certain DNA sample using the above-mentioned chip, for example, the base sequence is previously elucidated on the slide glass, and tens of thousands of bases having different base sequences from each other are obtained. A DNA fragment is prepared by binding the DNA fragments so that their positions can be identified, and a fluorescently-labeled DNA sample is allowed to flow.
It hybridizes with a probe having a complementary sequence among the DNA fragments (probes) attached to the slide glass. The hybridized portion can be identified as a spot by measuring the fluorescence of the slide glass, and the sequence of the DNA fragment in the DNA sample can be elucidated. As described above, the slide glass for gene analysis has a certain DNA.
Can be easily identified, so that it can be used for analysis of biological genome, monitoring of gene expression, gene analysis such as genome mismatching, etc. It is applied to the development of
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】上記遺伝子解析用スラ
イドグラスを用いて解析を行う場合、蛍光標識ＤＮＡを
ハイブリダイズし、蛍光強度を観察することによって行
われる。しかし、従来の遺伝子解析用スライドグラス
は、前記スポットの解析をするにあたり、ガラスの洗浄
等の前処理を行うため、スポットしたＤＮＡ断片が洗い
流されてしまい、スポットが明瞭に検出できない場合が
多かった。また、固定化するＤＮＡ断片が少ないため、
スポットが明瞭に検出できない場合も多かった。本発明
は、このような従来の遺伝子解析用スライドグラスの有
する蛍光検出の不明瞭さという問題点を解決することを
目的とするものである。The analysis using the above-mentioned slide glass for gene analysis is performed by hybridizing a fluorescent-labeled DNA and observing the fluorescence intensity. However, in the conventional slide glass for gene analysis, in performing the spot analysis, since a pretreatment such as washing of the glass is performed, the spotted DNA fragment is washed away, and the spot cannot be clearly detected in many cases. . In addition, since there are few DNA fragments to be immobilized,
In many cases, spots could not be clearly detected. An object of the present invention is to solve such a problem that the fluorescence detection of a conventional slide glass for gene analysis is unclear.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上
記目的を達成すべく鋭意検討の結果、ＤＮＡプローブあ
るいは蛋白質等の生体物質等を載せる粗面化したスライ
ドグラス表面に炭素系物質層を形成することにより、ス
ライドグラスを洗浄してもスポットしたＤＮＡ断片が洗
い流されずに強固に多く固定化されており、蛍光照射し
た際に、蛍光スポットが明瞭となることに気が付いた。
本発明は係る知見に基づくものである。The inventors of the present invention have conducted intensive studies to achieve the above object, and have found that a carbon-based material layer is formed on a roughened slide glass surface on which a biological material such as a DNA probe or a protein is placed. It was noticed that the formation of No. 1 resulted in that the spotted DNA fragments were firmly fixed in a large amount without being washed away even when the slide glass was washed, and that the fluorescent spots became clear upon irradiation with fluorescence.
The present invention is based on such findings.
【０００６】本発明のスライドグラスは、粗面化処理を
施した表面粗さ（中心線平均粗さ：Ｒａ ＪＩＳ Ｂ ０
６０１）が１〜５１０ｎｍであるガラス基体上の表面に
炭素系物質層が形成されたものであることを特徴とす
る。このようなスライドグラスは、組成、温度処理や表
面処理がどのようなものでも良いが、一般的に市販され
ているホウケイ酸ガラスをスライドグラスサイズに切断
したものが望ましい。ガラスの粗面化処理は、フッ酸あ
るいは、ケイフッ酸とシリカを含んだ水溶液中で処理す
るのが望ましい。また、機械的研磨でも良い。炭素系物
質がダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたは
グラファイトであることが望ましい。前記炭素系物質層
の被膜の厚みは、１ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好
ましい。前記ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス
０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含
んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作製されたも
のであることが好ましい。さらに、前記炭素系物質層の
被膜上に、オリゴヌクレオチド断片を担持させたもので
あることが好ましい。また、このような本発明の粗面化
し、炭素系物質層を形成したスライドグラスは、その表
面にＤＮＡプルーブ等の遺伝子、蛋白質、ペプチド等の
生体物質を担持させて遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生
体物質を解析する方法に利用することができる。The slide glass of the present invention has been subjected to a surface roughening treatment (center line average roughness: Ra JIS B 0).
601) is characterized in that a carbon-based material layer is formed on the surface of a glass substrate having a thickness of 1 to 510 nm. Such a slide glass may have any composition, temperature treatment, or surface treatment, but is preferably a commercially available borosilicate glass cut into a slide glass size. The glass surface roughening treatment is desirably performed in hydrofluoric acid or an aqueous solution containing silicic hydrofluoric acid and silica. Also, mechanical polishing may be used. Desirably, the carbon-based material is diamond, diamond-like carbon, or graphite. The thickness of the carbon-based material layer is preferably 1 nm to 1000 nm. It is preferable that the diamond-like carbon is produced by ionization vapor deposition in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of methane gas. Further, it is preferable that an oligonucleotide fragment is supported on the coating of the carbon-based material layer. Further, such a slide glass of the present invention having a roughened surface and a carbon-based material layer formed thereon carries a gene such as a DNA probe, a biological material such as a protein or a peptide on the surface thereof, and the gene, a protein or a peptide. It can be used for a method of analyzing a biological material.
【０００７】[0007]
【発明の実施の態様】本発明のスライドガラスは、粗面
化したガラス基板最表面に炭素質物質が形成されたもの
を用い、スライドグラスの上にＤＮＡ、蛋白質、ペプチ
ド等のサンプルを載せて様々な解析に用いると、遺伝子
あるいは蛋白質等の生体物質との親和性等が強固になる
ので好ましい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The slide glass of the present invention uses a roughened glass substrate having a carbonaceous substance formed on the outermost surface, and a sample of DNA, protein, peptide, etc. is placed on the slide glass. It is preferable to use it in various analyses, because the affinity with biological substances such as genes or proteins becomes strong.
【０００８】スライドグラスの基板となるガラスの粗面
化方法として、フッ酸を含んだ水溶液、あるいはケイフ
ッ化水素酸とシリカを含んだ水溶液で処理するのが好ま
しい。これらの水溶液にホウ酸などのｐＨ調整用薬品を
添加しても良い。処理する方法は浸漬法、スプレー法が
好ましい。また、酸化アルミニウム、酸化セリウム、酸
化ジルコニウム、べんがらあるいは酸化クロム等の研磨
剤を用いて、機械的に研磨しても良い。特に、ケイフッ
化水素酸とシリカを含んだ水溶液中に浸漬処理すること
により、ガラス表面に微小な凹凸を形成すると効果的で
ある。表面粗さＲａ（中心線平均粗さ：ＪＩＳ Ｂ ０６
０１）は１〜５１０ｎｍが好ましい。１ｎｍ未満では、
オリゴヌクレチドをスポッティングして蛍光検出装置で
蛍光強度を測定しても、蛍光強度が小さすぎて検出が困
難な場合がある。５１０ｎｍを超えると、蛍光強度が飽
和した状態でこれ以上処理するのは不経済である。ま
た、この粗面化処理したガラスの表面に炭素系物質の表
面処理層を形成させることが好ましい。炭素系物質は、
ＤＮＡプローブ固着性の点からダイヤモンドライクカー
ボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファイト等が好ま
しい。[0008] As a method of roughening the glass used as the slide glass substrate, it is preferable to treat the glass with an aqueous solution containing hydrofluoric acid or an aqueous solution containing hydrofluoric acid and silica. A pH adjusting chemical such as boric acid may be added to these aqueous solutions. The treatment method is preferably an immersion method or a spray method. Further, mechanical polishing may be performed using an abrasive such as aluminum oxide, cerium oxide, zirconium oxide, bran or chromium oxide. In particular, it is effective to form fine irregularities on the glass surface by immersion treatment in an aqueous solution containing hydrofluoric acid and silica. Surface roughness Ra (center line average roughness: JIS B 06)
01) is preferably from 1 to 510 nm. Below 1 nm,
Even when spotting oligonucleotides and measuring fluorescence intensity with a fluorescence detector, the fluorescence intensity may be too small to be detected. If it exceeds 510 nm, it is uneconomical to perform further processing in a state where the fluorescence intensity is saturated. Further, it is preferable to form a surface treatment layer of a carbon-based material on the surface of the glass subjected to the surface roughening treatment. Carbon-based materials
From the viewpoint of DNA probe fixation, diamond-like carbon (DLC), diamond, graphite and the like are preferable.
【０００９】基板たるガラス上に、ダイヤモンド、ダイ
ヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系物質
からなる表面処理層を形成させたスライドグラスは、Ｄ
ＮＡプロ−ブを強固に固定化させることができる。すな
わち、炭素は化学的安定性に優れており、ＤＮＡプロー
ブ等を載せる際の反応等に耐えることができるのであ
る。その理由は、炭素上にＤＮＡなどのプローブを固定
化させたときに炭素原子との共有結合の形態を示すの
で、ＤＮＡプローブをスライドグラス表面に強固に固定
化させることができるためであると考えられる。さら
に、上記のダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダ
イヤモンド、グラファイト等の炭素系物質と他の物質と
の混合体、例えば金属やセラミックス等との混合体も表
面処理層として用いることができる。また、上記のダイ
ヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グ
ラファイト等の炭素系物質と他の物質との積層体も表面
処理層として用いることができる。A slide glass in which a surface treatment layer made of a carbon-based material such as diamond, diamond-like carbon, and graphite is formed on a glass serving as a substrate is a D-shaped slide glass.
The NA probe can be firmly immobilized. That is, carbon has excellent chemical stability and can withstand a reaction or the like when a DNA probe or the like is mounted. The reason is considered to be that when a probe such as DNA is immobilized on carbon, a covalent bond with a carbon atom is exhibited, so that the DNA probe can be firmly immobilized on the slide glass surface. Can be Further, a mixture of a carbon-based substance such as diamond-like carbon (DLC), diamond, and graphite and another substance, for example, a mixture of a metal, ceramic, or the like, can also be used as the surface treatment layer. Further, a laminate of a carbon-based material such as diamond-like carbon (DLC), diamond, and graphite and another material can also be used as the surface treatment layer.
【００１０】また、固定化されたプローブは、図１に示
すようにスライドグラス上にほぼ垂直に林立させられる
ので、スライドグラス表面の単位面積あたりの固定化密
度を上げることができる。上記表面処理層のダイヤモン
ドの素材としては、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤ
モンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも使用で
きる。また、それらの構造が単結晶体或いは多結晶体の
いずれでも差し支えない。生産性の観点よりマイクロ波
プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いてダイヤモン
ド膜を形成させることが好ましい。また、表面処理層と
しては、ダイヤモンドと同等の性能を有し経済的にも有
利な点で、非晶質のダイヤモンドライクカーボン（Ｄｉ
ａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）膜をガラス表面
に形成することもできる。ダイヤモンドライクカーボン
（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）は、ダイ
ヤモンドやグラファイトと同様に炭素原子から構成さ
れ、ダイヤモンドに類似した特性を有することからＤＬ
Ｃと呼ばれている。ＤＬＣの結晶構造は、アモルファス
（非晶質）である。上記表面処理層としては、グラファ
イト等の炭素系物質も好適に用いられる。ダイヤモンド
は、中心及び四隅に炭素原子をもつ正四面体構造で、ｓ
ｐ３混成軌道を形成するきわめて堅い立方晶系の結晶で
ある。[0010] Further, since the immobilized probe is erected almost vertically on the slide glass as shown in FIG. 1, the immobilization density per unit area of the slide glass surface can be increased. As the diamond material for the surface treatment layer, any of synthetic diamond, high-pressure formed diamond, natural diamond and the like can be used. Further, their structure may be either a single crystal or a polycrystal. From the viewpoint of productivity, it is preferable to form a diamond film using a gas phase synthesis method such as a microwave plasma CVD method. As the surface treatment layer, amorphous diamond-like carbon (Di) is used because it has the same performance as diamond and is economically advantageous.
Amond Like Carbon) film can also be formed on the glass surface. Diamond-like carbon is composed of carbon atoms like diamond and graphite, and has properties similar to diamond.
Called C. The crystal structure of DLC is amorphous (amorphous). As the surface treatment layer, a carbon-based material such as graphite is preferably used. Diamond has a tetrahedral structure with carbon atoms in the center and four corners.
It is a very hard cubic crystal forming p3 hybrid orbitals.
【００１１】本発明の炭素系物質としては、グラファイ
トや無定形炭素を挙げることができる。グラファイト
は、ｓｐ２混成の六角形の網面がπ電子を介して層状に
積み重なった構造の六方晶系結晶である。無定形炭素は
明瞭な結晶構造を示さない。無定形炭素には結晶程度の
低い徴晶質炭素も含まれる。また、結晶の大小やその配
列の度合いなどによって、無定形炭素からグラファイト
に至る中間的な構造の炭素系物質が存在するが、これら
の間には明瞭な変態点が存在しない。本発明の炭素系物
質とは、グラファイト又は無定形炭素の単体 、グラフ
ァイトと無定形炭素との混合物、これらに無定形炭素及
びグラファイト の中間的構造を示すものが含まれる。
本発明の表面処理層は、上記ダイヤモンド、ＤＬＣ、グ
ラファイト等の炭素系物質が混合されたものも用いるこ
とができる。また本発明の表面処理層は、ＤＬＣ膜、ダ
イヤモンド膜、炭素系物質膜とが交互に積層されたもの
も用いることができる。The carbon-based material of the present invention includes graphite and amorphous carbon. Graphite is a hexagonal crystal having a structure in which sp2 hybrid hexagonal network planes are stacked in layers via π electrons. Amorphous carbon does not show a distinct crystal structure. Amorphous carbon includes crystalline carbon having a low crystallinity. Further, depending on the size of the crystals and the degree of their arrangement, there are carbonaceous substances having an intermediate structure ranging from amorphous carbon to graphite, but there is no clear transformation point between them. The carbon-based material of the present invention includes a simple substance of graphite or amorphous carbon, a mixture of graphite and amorphous carbon, and those showing an intermediate structure between amorphous carbon and graphite.
As the surface treatment layer of the present invention, a material in which a carbon-based material such as diamond, DLC, and graphite is mixed can also be used. Further, as the surface treatment layer of the present invention, a layer in which a DLC film, a diamond film, and a carbon-based material film are alternately laminated can also be used.
【００１２】本発明の表面処理層の厚みは、特に限定す
るものではないが、１ｎｍ〜１０００ｎｍの厚みがあれ
ばよい。１ｎｍ未満では、あまりに薄すぎて表面処理層
の厚みが均一にはならずに、下地のガラス基板を被覆で
きない部分が存在するので、好ましくない。一方、１０
００ｎｍを超える被覆は表面処理層中の応力により、剥
離が生じやすくなるので好ましくない。工業上の生産性
からすると、表面処理層の厚みは、１０ｎｍ〜５００ｎ
ｍとすることが好ましい。さらに好ましくは、３０〜２
００ｎｍである。The thickness of the surface treatment layer of the present invention is not particularly limited, but may be 1 nm to 1000 nm. If the thickness is less than 1 nm, the thickness of the surface treatment layer is too small to be uniform, and there is a portion that cannot cover the underlying glass substrate. On the other hand, 10
A coating having a thickness of more than 00 nm is not preferable because peeling easily occurs due to stress in the surface treatment layer. From the viewpoint of industrial productivity, the thickness of the surface treatment layer is 10 nm to 500 n.
m is preferable. More preferably, 30 to 2
00 nm.
【００１３】表面処理層のダイヤモンドの形成割合は、
上記プラズマＣＶＤ法で形成する場合には、反応槽内の
圧力、バイアス電圧や基板温度等の条件により適宜設定
することができる。表面処理層中のダイヤモンド濃度の
調整は、例えばプラズマＣＶＤ法でＤＬＣ膜を形成する
場合、置換ガスとしてのＮ２ガスの供給量を調整するこ
とにより、供給原料としての炭化水素ガスにおけるＨ／
Ｃ比を変更することに行うことができる。The formation ratio of diamond in the surface treatment layer is as follows:
In the case of forming by the above-mentioned plasma CVD method, it can be appropriately set depending on conditions such as a pressure in a reaction tank, a bias voltage and a substrate temperature. For example, when a DLC film is formed by a plasma CVD method, the concentration of diamond in the surface treatment layer is adjusted by adjusting the supply amount of N 2 gas as a replacement gas so that H /
Changing the C ratio can be done.
【００１４】Ｎ２ガスの供給量を多くするとＤＬＣ膜中
のＨ２取り込み量が多くなるので、ＤＬＣにおけるダイ
ヤモンド濃度を高くすることができ、一方Ｎ２ガスの供
給量を少なくするとＤＬＣ膜中へのＨ２取り込み量が少
なくなるので、ＤＬＣにおけるダイヤモンド濃度を低く
することができる。ガラス基板上へのダイヤモンド、Ｄ
ＬＣ、グラファイト等の表面処理層形成は、高周波プラ
ズマＣＶＤ法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、しー
ザ蒸着法等により形成することができる。高周波プラズ
マＣＶＤ法では、１３．５６ＭＨｚの高周波によって電
極間に生じるグロー放電により原料ガス(メタン)を分解
し、基板上にＤＬＣ膜を合成する。イオン化蒸着法で
は、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利
用して、原料ガス(ベンゼン)を分解・イオン化し、バイ
アス電圧によって基板上に成膜する。また、水素ガス０
〜９９体積％と残りメタンガス１００〜１体積％からな
る混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ膜を形成
しても良い。[0014] Since allowing a larger amount of supply of N 2 gas becomes large H 2 uptake in the DLC film, it is possible to increase the diamond concentration in the DLC, whereas N 2 gas supply amount to less that the the DLC film of since H 2 uptake is reduced, we are possible to lower the diamond concentration in the DLC. Diamond on glass substrate, D
The surface treatment layer such as LC and graphite can be formed by a high-frequency plasma CVD method, an ionization evaporation method, an arc evaporation method, a laser evaporation method, or the like. In the high-frequency plasma CVD method, a source gas (methane) is decomposed by glow discharge generated between electrodes by a high frequency of 13.56 MHz, and a DLC film is synthesized on a substrate. In the ionization vapor deposition method, a raw material gas (benzene) is decomposed and ionized using thermoelectrons generated by a tungsten filament, and a film is formed on a substrate by a bias voltage. In addition, hydrogen gas 0
The DLC film may be formed by an ionization vapor deposition method in a mixed gas consisting of ９９99% by volume and the remaining methane gas of 100〜1% by volume.
【００１５】ＤＬＣ膜は、通常黒色を呈しているが、本
発明のスライドグラスにおいては、透明膜であることが
好ましい。すなわち、本発明のスライドグラスは、遺伝
子解析用等に用いられるものであって、スライドグラス
表面に蛍光照射し、その強度を測定するものであること
から、光透過性が要求されるのである。本発明の表面処
理層を形成したスライドグラスの光透過率は、光波長が
４００ｎｍ〜５００ｎｍの領域(Ｂ１ｕｅ領域)における
透過率が、５０％以上であることが好ましい。さらに好
ましくは６０％以上である。また 光波長が６００ｎｍ
〜７００ｎｍの領域（Ｒｅｄ領域）における透過率が、
７０％以上であることが好ましい。さらに好ましくは７
５％以上である。上記のそれぞれの領域における光透過
率を有することでスライドグラス上の蛍光標識の強度を
効率よく測定できるのである。The DLC film usually has a black color, but the slide glass of the present invention is preferably a transparent film. That is, since the slide glass of the present invention is used for gene analysis and the like and irradiates the surface of the slide glass with fluorescent light to measure the intensity thereof, light transparency is required. As for the light transmittance of the slide glass on which the surface treatment layer of the present invention is formed, it is preferable that the transmittance in a region where the light wavelength is 400 nm to 500 nm (B1ue region) is 50% or more. More preferably, it is 60% or more. The light wavelength is 600 nm
The transmittance in the region of 700 nm (Red region) is
It is preferably at least 70%. More preferably, 7
5% or more. By having the light transmittance in each of the above regions, the intensity of the fluorescent label on the slide glass can be measured efficiently.
【００１６】このような光透過性を待ったダイヤモンド
ライクカーボンを製造するには、例えば、イオン化蒸着
法において、炭化水素ガスと水素ガスとの混合ガス中の
水素ガスの含有率を増すほど、光透過率を高くしたダイ
ヤモンドライクカーボンを製造することができる。上記
のイオン化蒸着法とは、Weissmantelらにより考案され
た方法で、炭化水素ガスソースＤＬＣ成膜法のー種であ
り、イオン源は陰極である熱フィラメントと対向する陽
極グリツドとそれらを取り囲む金属円筒からなる。In order to produce diamond-like carbon which has been waiting for such light transmittance, for example, in ionization vapor deposition, light transmittance increases as the content of hydrogen gas in the mixed gas of hydrocarbon gas and hydrogen gas increases. Diamond-like carbon with a high rate can be produced. The above-mentioned ionization vapor deposition method is a method devised by Weissmantel et al., Which is a kind of a hydrocarbon gas source DLC film forming method, wherein the ion source is an anode grid facing a hot filament as a cathode and a metal cylinder surrounding them. Consists of
【００１７】イオン化蒸着法を用いて、スライドグラス
上に光透過率を高くしたダイヤモンドライクカーボンを
製造する実施態様を述べる。例えば、厚みｌｍｍのスラ
イドグラス（マツナミガラス（株）製Ｓ−１１１２）を
用いて、この上にダイヤモンドライクカーボン（ＤＬ
Ｃ）膜を厚み１０ｎｍ形成した。そしてこのＤＬＣ膜を
形成したスライドグラスの光透過率を調べた結果は次の
ようになった。すなわち、水素ガスを全く含まない雰囲
気（０体積％）でＤＬＣ膜を形成したスライドグラス
は、４００ｎｍの波長の光では８８．７％の光透過率で
あった。水素ガスを１体積％含んだ雰囲気でＤＬＣ膜を
形成したスライドグラスは、４００ｎｍの波長では８
９．４％の光透過率であった。更に、水素ガスを８０体
積％含んだ雰囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグラス
は、４００ｎｍの波長では９０．８％の光透過率であっ
た。このように、水素ガスの割合を増すほど光透過率が
高くなることが分かった。An embodiment in which diamond-like carbon having a high light transmittance is produced on a slide glass using an ionization vapor deposition method will be described. For example, a slide glass (S-1112 manufactured by Matsunami Glass Co., Ltd.) having a thickness of 1 mm is used, and diamond-like carbon (DL
C) A film having a thickness of 10 nm was formed. The result of examining the light transmittance of the slide glass having the DLC film formed thereon was as follows. That is, the slide glass on which the DLC film was formed in an atmosphere containing no hydrogen gas (0% by volume) had a light transmittance of 88.7% for light having a wavelength of 400 nm. A slide glass on which a DLC film was formed in an atmosphere containing 1% by volume of hydrogen gas was 8 at a wavelength of 400 nm.
The light transmittance was 9.4%. Furthermore, the slide glass on which the DLC film was formed in an atmosphere containing 80% by volume of hydrogen gas had a light transmittance of 90.8% at a wavelength of 400 nm. Thus, it was found that the light transmittance increased as the proportion of the hydrogen gas increased.
【００１８】また、７００ｎｍの波長の光で光透過率を
測定してみると、水素ガスを全く含まない雰囲気（０体
積％）でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、９０．
０％の光透過率であった。水素ガスを１体積％含んだ雰
囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグヲスは、９０．８
％の光透過率であった。更に、水素ガスを８０体積％含
んだ雰囲気でＤＬＣ膜を形成したスライドグラスは、９
２％の光透過率であった。このように、７００ｎｍの波
長の光で測定した場合も４００ｎｍの波長を用いて測定
した結果と同じように、水素ガスの割合を増すほど光透
過率が高くなることが分かった。When the light transmittance was measured with light having a wavelength of 700 nm, the slide glass on which the DLC film was formed in an atmosphere (0% by volume) containing no hydrogen gas was 90.
The light transmittance was 0%. A slide gas in which a DLC film was formed in an atmosphere containing 1% by volume of hydrogen gas was 90.8%.
% Light transmittance. Furthermore, a slide glass on which a DLC film was formed in an atmosphere containing 80% by volume of hydrogen gas was 9%.
The light transmittance was 2%. Thus, it was found that the light transmittance increased as the proportion of the hydrogen gas increased, as in the case of the measurement with the light of the wavelength of 700 nm, similarly to the result of the measurement with the wavelength of 400 nm.
【００１９】なお、表面処理層を全く形成していないス
ライドグラス自体(ブランク)の光透過率は、４００ｎｍ
の波長では９１．０％を示し、７００ｎｍの波長では９
２％の光透過率を示した。ここで、光透過率は以下の式
に基づき計算した。 光透過率Ｔ＝（Ｉ／Ｉ0）×１００ Ｉ:ブランクでの透過光の強度 Ｉ０:表面処理層を形成したときの透過光の強度The light transmittance of the slide glass itself (blank) having no surface treatment layer formed thereon is 400 nm.
At a wavelength of 91.0%, and 90.0% at a wavelength of 700 nm.
It showed a light transmittance of 2%. Here, the light transmittance was calculated based on the following equation. Light transmittance T = (I / I 0 ) × 100 I: Intensity of transmitted light in blank I 0 : Intensity of transmitted light when surface treatment layer is formed
【００２０】水素ガスを含有すると透明になりやすいの
は、水素ガスを含有しないとｓｐ２混成軌道を多量に含
み着色の原因となるが、水素ガスを含むと、透明なｓｐ
３軌道を多く含むようになるためと考えられる。しか
し、水素ガスを多く含むとダイヤモンドライクカーボン
の成膜速度が遅くなり、水素ガスの含有率は、より好ま
しくは１〜５０体積％が良い。When hydrogen gas is contained, it is easy to become transparent. When hydrogen gas is not contained, sp2 hybrid orbitals are contained in a large amount and cause coloring, but when hydrogen gas is contained, transparent sp2 is contained.
This is probably because three orbits are included. However, if a large amount of hydrogen gas is contained, the film-forming speed of diamond-like carbon becomes slow, and the content of hydrogen gas is more preferably 1 to 50% by volume.
【００２１】アーク式蒸着法では、固体のグラファイト
原料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧
を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰
極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさら
に負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に
向かってプラズマ中の炭素イオンを加速し成膜を行う。
また、しーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ
(パルス発振)光をグラファイトのターゲット板に照射し
て溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させること
により形成することができる。In the arc deposition method, a direct current voltage is applied between a solid graphite raw material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode) to cause an arc discharge in a vacuum to generate a plasma of carbon atoms from the cathode. By applying a more negative bias voltage to the substrate than the evaporation source, carbon ions in the plasma are accelerated toward the substrate to form a film.
Further, in the so-called vapor deposition method, for example, an Nd: YAG laser
(Pulse oscillation) can be formed by irradiating a graphite target plate with light to melt it and depositing carbon atoms on a glass substrate.
【００２２】本発明のスライドグラスは、ＤＮＡプロー
ブ等の遺伝子、蛋白質、ベプチド等の生体物質を多数載
せることができるものである。従って、スライドグラス
の表面上に複数の微小区分が設けられ、１つの区分に多
数のオリゴヌクレオチド断片を担持可能となっているも
のも好ましく採用される。微小区分のそれぞれにおい
て、ＤＮＡプローブ等の種類を変えることについては特
に制限はなく、用途に応じて適宜変化させることができ
る。The slide glass of the present invention can carry a large number of biological substances such as genes such as DNA probes, proteins, and peptides. Therefore, it is also preferable to employ a slide glass in which a plurality of microsections are provided on the surface and one section can carry a large number of oligonucleotide fragments. There is no particular limitation on the type of DNA probe or the like in each of the microsections, and it can be changed as appropriate according to the application.
【００２３】スライドグラスの形状は特に限定されず、
例えば、フィルムまたはシートのような平板状、円盤
状、または粒状等のものであってもよい。また、スライ
ドグラスの厚さ、大きさ等にも特に制限はなく、通常用
いられるのと同様の範囲とすることができる。スライド
グラスの基板たるガラスの種類として、通常用いられて
いるスライドグラス、結晶化ガラス、石英ガラス、強化
ガラスなど特に限定されるものではない。また、組成の
異なるガラスを２層以上に積層したガラスでも良い。The shape of the slide glass is not particularly limited.
For example, it may be in the form of a flat plate, a disk, or a grain such as a film or a sheet. The thickness, size, etc. of the slide glass are not particularly limited, and can be in the same range as that usually used. The type of glass serving as the substrate of the slide glass is not particularly limited, such as a commonly used slide glass, crystallized glass, quartz glass, and tempered glass. Further, glass in which two or more glasses having different compositions are laminated may be used.
【００２４】本発明の粗面化したスライドグラスに載せ
ることができるオリゴヌクレオチド断片（プロ―ブ）に
ついては、１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ断片等、
塩基数にも特に制限はない。オリゴヌクレオチド断片の
固定は、スライドグラスの表面への化学結合等により行
うことができる。例えば、ダイヤモンドライクカーボン
による炭素系物質層を形成させたスライドグラスを用い
る場合、表面を活性化、すなわちＤＮＡと化学結合しや
すくした後に、ＤＮＡの末端塩基のアミノ基を結合する
ことができる。Oligonucleotide fragments (probes) which can be placed on the roughened slide glass of the present invention include single-stranded or double-stranded DNA and RNA fragments.
There is no particular limitation on the number of bases. The oligonucleotide fragments can be fixed by chemical bonding to the surface of a slide glass. For example, when a slide glass having a carbon-based material layer formed of diamond-like carbon is used, the amino group of the terminal base of the DNA can be bound after activating the surface, that is, making it easy to chemically bond to the DNA.
【００２５】この場合のスライドグラス表面活性化の一
例を挙げると、該スライドグラスを塩素ガス中で固体支
持体に紫外線照射してダイヤモンドライクカーボン膜表
面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射し
てアミノ化した後、適当な酸クロリドあるいは酸無水物
を用いてカルボキシル化する。更に、カルボキシル化し
てないアミノ基を多価カルボン酸溶液に浸漬することに
よりマスキングする。末端のカルボキシル基をカルボジ
イミド或いはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ
−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することによ
り、アミド結合を介して炭化水素基の末端にＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル基等の活性エステル基が結
合した基を固定化することができ、活性化される。ま
た、該スライドグラスをアンモニアガスまたはアミノ基
を含む化合物を導入した反応容器に入れ、プラズマによ
りアミノ化しても良い。As an example of activating the surface of the slide glass in this case, the surface of the diamond-like carbon film is chlorinated by irradiating the slide glass with ultraviolet light in chlorine gas and then irradiating with ultraviolet light in ammonia gas. After amination, carboxylation is performed using an appropriate acid chloride or acid anhydride. Further, the non-carboxylated amino group is masked by immersion in a polycarboxylic acid solution. The terminal carboxyl group is replaced with carbodiimide or dicyclohexylcarbodiimide and N
By dehydration-condensation with -hydroxysuccinimide, a group in which an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide ester group is bonded to a terminal of a hydrocarbon group via an amide bond can be immobilized and activated. Alternatively, the slide glass may be placed in a reaction vessel into which ammonia gas or a compound containing an amino group has been introduced, and aminated by plasma.
【００２６】こうして本発明のスライドグラス表面を活
性化させておけば、例えば、塩基配列が既に解明されて
いる数万本のＤＮＡ断片（プローブ）を担持させること
ができる。また、該スライドグラス上にオリゴｄＴプラ
イマーを結合させておき、逆転写反応等で目的のｃＤＮ
Ａを伸張させると同時にスライドグラスに結合すること
もできる。さらに、ＰＣＲ等を用いてガラス上で多数の
ＤＮＡ鎖を伸張させ、かつ結合させることもできる。By activating the surface of the slide glass of the present invention in this way, it is possible to carry, for example, tens of thousands of DNA fragments (probes) whose base sequence has already been elucidated. Also, an oligo dT primer is bound to the slide glass, and the desired cDN is obtained by a reverse transcription reaction or the like.
A can be attached to a slide glass at the same time as A is extended. Furthermore, a large number of DNA chains can be extended and bound on glass using PCR or the like.
【００２７】このようにして、ＤＮＡ断片を結合させた
後、これに蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮ
Ａサンプルは、該スライドグラス上に結合させたＤＮＡ
断片（プローブ）のうちの相補的な配列を有するプロー
ブとハイブリダイズするので、蛍光スポットとしてＤＮ
Ａサンプルの配列を解明することができる。さらに、本
発明のスライドグラスは、その裏面に例えば金属蒸着膜
のような反射層が形成されていることが好ましい。この
ような反射層をスライドグラスの裏面に形成させると、
表面から蛍光照射をした場合の蛍光の反射効率を高める
効果を有し、蛍光分析装置の感度を高めることができ
る。すなわち、蛍光スポットを明瞭に観察することがで
き、一度に多量の解析を行うことができる。スライドグ
ラスの裏面に形成させる反射層の種類としては、Ｔｉ、
Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、ＷＣ、等の単層又はこれらの複合層
が好ましい。反射層の厚みは、スライドグラス全体に均
一に被覆されなければならないことから１００ｎｍ以上
が好ましい。さらに好ましくは、１０００ｎｍ以上であ
る。このような反射層を形成するにはー般に真空蒸着法
を用いることができる。その他、スパッタリング法、イ
オンビーム蒸着法などの上記の反射層を形成させるのに
適した従来技術を適宜選択して用いることができる。After the DNA fragment is bound in this way, a DNA sample labeled with fluorescence is applied to
Sample A is the DNA bound on the slide glass.
Since it hybridizes with a probe having a complementary sequence among fragments (probes), DN
The sequence of the A sample can be elucidated. Further, the slide glass of the present invention preferably has a reflective layer such as a metal deposition film formed on the back surface thereof. When such a reflective layer is formed on the back surface of the slide glass,
This has the effect of increasing the reflection efficiency of fluorescence when the surface is irradiated with fluorescence, and can increase the sensitivity of the fluorescence analyzer. That is, the fluorescent spot can be clearly observed, and a large amount of analysis can be performed at once. Types of the reflective layer formed on the back surface of the slide glass include Ti,
A single layer of Au, Pt, Nb, WC, or the like, or a composite layer thereof is preferable. The thickness of the reflective layer is preferably 100 nm or more because it must be uniformly coated on the entire slide glass. More preferably, it is 1000 nm or more. In general, a vacuum evaporation method can be used to form such a reflective layer. In addition, a conventional technique suitable for forming the above-described reflective layer such as a sputtering method or an ion beam evaporation method can be appropriately selected and used.
【００２８】このように、本発明のスライドグラスは、
あるＤＮＡの塩基配列を従来と同様の方法をそのまま使
いながら従来よりも格段に明瞭に解析、特定することが
できることから、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニ
タリング、ゲノムミスマッチング等の遺伝子解析等に利
用されるほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検出等遺
伝子診断や医薬品の開発等に有用である。As described above, the slide glass of the present invention
Because the base sequence of a certain DNA can be analyzed and identified much more clearly than before using the same method as before, it can be used for analysis of biological genomes, monitoring of gene expression, gene analysis such as genome mismatching, etc. In addition to its use, it is useful for gene diagnosis such as detection of mutations in oncogenes, and development of pharmaceuticals.
【００２９】[0029]
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに説明す
る。 実施例1 （１）以下のようにして、遺伝子解析用に用いるための
スライドグラスを用意した。まず、スライドグラスの基
板として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ
（厚み）のガラスを用いて、ガラスを粗面化した。ケイ
フッ化水素酸２０ｍｏｌ／Ｌ、シリカゲル３０ｇ／Ｌ及び
ホウ酸０．０４ｍｏｌ／Ｌを含んだ水溶液中に温度２５
℃の条件で、ガラスを浸漬した。浸漬時間は適宜行い、
表面粗さＲａを変化させた。更に、イオン交換水で洗浄
後、乾燥して、粗面化したガラスを得た。次に、この粗
面化したガラス基体表面に、イオン化蒸着法により、メ
タンガス９５体積％と水素ガスを５体積％を混合したガ
スを原料として、ＤＬＣ膜２５ｎｍの厚みに形成したス
ライドグラスを作成した。The present invention will be further described below with reference to examples. Example 1 (1) A slide glass to be used for gene analysis was prepared as follows. First, as a slide glass substrate, 25 mm (width) × 75 mm (length) × 1 mm
Using (thickness) glass, the glass was roughened. Temperature 25 in an aqueous solution containing 20 mol / L hydrosilicofluoric acid, 30 g / L silica gel and 0.04 mol / L boric acid.
The glass was immersed under the condition of ° C. Immersion time is performed appropriately,
The surface roughness Ra was changed. Furthermore, after washing with ion-exchanged water, drying was performed to obtain a roughened glass. Next, a slide glass having a DLC film thickness of 25 nm was formed on the roughened glass substrate surface by ionization deposition using a gas obtained by mixing 95% by volume of methane gas and 5% by volume of hydrogen gas as a raw material. .
【００３０】（２）次に、このスライドグラス表面を化
学修飾し、活性化させた。すなわち、ガラス基体表面を
１分間塩素化した後、１０分間アミノ化し、さらに酸ク
ロリドへ１０分間直接浸漬した。次に、超純水で洗浄
後、活性化液へ浸漬して直接活性化を行った。活性化液
の組成は、１，４−ジオキサン１ｍＬ、ハイドロゲンシ
アナミド２５ｍｇおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド
１５０ｍｇであり、これらを溶解したものである。さら
に超純水で洗浄後、６５℃で乾燥して活性化した。(2) Next, the surface of the slide glass was chemically modified and activated. That is, the glass substrate surface was chlorinated for 1 minute, then aminated for 10 minutes, and then directly immersed in acid chloride for 10 minutes. Next, after cleaning with ultrapure water, the substrate was immersed in an activation liquid to directly activate. The composition of the activating solution was 1 mL of 1,4-dioxane, 25 mg of hydrogen cyanamide, and 150 mg of N-hydroxysuccinimide, which were dissolved. After washing with ultrapure water, it was dried and activated at 65 ° C.
【００３１】前記のようにして作成したスライドグラス
表面に、１０ｐｍｏｌ／ｍＬ濃度の蛍光標識オリゴヌク
レチド（Ｃｙ３−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、
Ｃｙ３、アマシャムファルマシアバイオテク社製、配列
表の配列番号１参照）をスポッティングして、蛍光検出
装置で蛍光強度を測定した。また、スポティング後洗浄
し、同様に蛍光強度を測定した。なお、装置として、Ｌ
ＡＳ−１０００Ｐｌｕｓを用い、測定時間を１分とし
た。表１に示すように、こうして得られた蛍光強度は、
表面粗さＲａが大きいほど強いことが判明した。On the surface of the slide glass prepared as described above, a fluorescence-labeled oligonucleotide (Cy3-AAAAAAAAAAAAAAAAAA, 10 pmol / mL) was added.
Cy3 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd., see SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) was spotted, and the fluorescence intensity was measured with a fluorescence detector. Further, after spotting, washing was performed, and the fluorescence intensity was measured in the same manner. In addition, as an apparatus, L
The measurement time was 1 minute using AS-1000Plus. As shown in Table 1, the fluorescence intensity thus obtained is
It was found that the larger the surface roughness Ra, the stronger.
【００３２】[0032]
【表１】 表１において、粗面化しない比較例のガラスの表面粗さ
Ｒａは０．８ｎｍであり、粗面化した本発明のスライド
グラスは、スポット後および洗浄後の蛍光強度は、粗面
化しないガラス上のスポット後および洗浄後の蛍光強度
よりも優れていた。すなわち、祖面化した本発明のスラ
イドグラスには、スポットしたＤＮＡ、蛋白質、ペプチ
ド等の生体関連物質断片の密度が高く維持されており、
スポットが明瞭に検出できた。[Table 1] In Table 1, the surface roughness Ra of the glass of the comparative example that is not roughened is 0.8 nm, and the roughened slide glass of the present invention has a fluorescence intensity after spotting and after washing, which is higher than that of the glass that is not roughened. It was better than the fluorescence intensity after the above spot and after washing. That is, in the slide glass of the present invention, the density of spots of bio-related substances such as DNA, protein, and peptide is maintained high,
Spots could be clearly detected.
【００３３】[0033]
【発明の効果】本発明の粗面化したスライドグラスは、
粗面化しないガラスに比べて、あるＤＮＡの塩基配列を
従来と同様の方法をそのまま使いながら従来よりも格段
に明瞭に解析、特定することができることから、生体ゲ
ノムの解析、遺伝子発現のモニタリング、ゲノムミスマ
ッチング等の遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質の解析
等に利用されるほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検
出等遺伝子診断や医薬品の開発等に有用である。According to the present invention, the roughened slide glass is
Compared to non-roughened glass, the base sequence of a certain DNA can be analyzed and identified much more clearly than before using the same method as before, so analysis of living genome, monitoring of gene expression, It is used not only for analysis of biological substances such as genes or proteins such as genome mismatching, but also for gene diagnosis such as mutation detection of cancer genes and development of pharmaceuticals.
【００３４】[0034]
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Toyo Kohan Co., Ltd. <120> 粗面化スライドグラス及びそれを用いて生体物質
を解析する方法 <130> P4081 <150> JP 2000-339675 <151> 2000-11-07 <160> 1 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 1 AAAAAAAAAA AAAAAA 16[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Toyo Kohan Co., Ltd. <120> Roughened slide glass and method for analyzing biological material using the same <130> P4081 <150> JP 2000-339675 <151> 2000 -11-07 <160> 1 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 1 AAAAAAAAAA AAAAAA 16
【手続補正２】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図面の簡単な説明[Correction target item name] Brief description of drawings
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】本発明のスライドグラス上にプローブを固定化
する場合の概略説明図である。FIG. 1 is a schematic explanatory view when a probe is immobilized on a slide glass of the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２ Ｆ (72)発明者 山川 薫 山口県下松市東豊井1296番地の１ 東洋鋼 鈑株式会社技術研究所内 (72)発明者 高木 研一 山口県下松市東豊井1296番地の１ 東洋鋼 鈑株式会社技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA14 HA19 4B029 AA23 CC04 4B033 NA45 NB23 NC04 ND05 NE02 NF02 NG10 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR55 QS34 4G059 AA08 AB11 AC01 AC24 AC30 BB04 BB14 BB15 EA11 EB03──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 15/09 ZNA G01N 33/53 D C12Q 1/68 M G01N 33/53 37/00 102 C12N 15/00 ZNAA 37/00 102 F (72) Inventor Kaoru Yamakawa 1296, Higashi-Toyoi, Higashi-Toyoi, Kudamatsu, Yamaguchi Pref. (72) Inventor Kenichi Takagi 1-126-1, Higashi-Toyoi, Kudamatsu, Yamaguchi Pref. F term in the company's technology research laboratory (reference) 4B024 AA20 CA01 CA11 HA14 HA19 4B029 AA23 CC04 4B033 NA45 NB23 NC04 ND05 NE02 NF02 NG10 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR55 QS34 4G059 AA08 AB11 AC01 AC24 AC30 BB04 BB14 BB15 BB14 BB14 BB15
Claims (9)
５００ｎｍである基板表面上に炭素系物質層の表面処理
層を形成した粗面化スライドグラス。1. A surface roughness Ra: 1 to which a surface roughening treatment is applied.
A roughened slide glass in which a surface treatment layer of a carbon-based material layer is formed on a substrate surface of 500 nm.
液中で処理されることを特徴とする請求項１記載の粗面
化スライドグラス。2. The roughened slide glass according to claim 1, wherein the roughening treatment is performed in an aqueous solution containing hydrofluoric acid.
を含んだ水溶液中で処理されることを特徴とする請求項
１記載の粗面化スライドグラス。3. The surface-roughened slide glass according to claim 1, wherein the surface-roughening treatment is performed in an aqueous solution containing silica hydrofluoric acid and silica.
とを特徴とする請求項１記載の粗面化スライドグラス。4. The roughened slide glass according to claim 1, wherein the roughening treatment is mechanical polishing.
ヤモンドライクカーボンまたはグラファイトである請求
項１に記載の粗面化スライドグラス。5. The roughened slide glass according to claim 1, wherein the carbon-based material is diamond, diamond-like carbon, or graphite.
００ｎｍである請求項１又は５のいずれかに記載の粗面
化スライドグラス。6. The thickness of the carbon-based material is 1 nm to 10 nm.
The roughened slide glass according to claim 1, which has a thickness of 00 nm.
素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積
％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作製し
た請求項５又は６記載の粗面化スライドグラス。7. The surface roughening method according to claim 5, wherein the diamond-like carbon is produced by an ionization deposition method in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of methane gas. Slide glasses.
レオチド断片を担持させた請求項１〜７のいずれかに記
載の粗面化スライドグラス。8. The roughened slide glass according to claim 1, wherein an oligonucleotide fragment is supported on the coating of the carbon-based material.
スライドガラス表面にＤＮＡプルーブ等の遺伝子、蛋白
質、ペプチド等の生体物質を担持させて、遺伝子、蛋白
質、ペプチド等の生体物質を解析する方法。9. A biological material such as a gene, a protein, a peptide, or the like, wherein a gene, a protein, a peptide, or the like biological material such as a DNA probe is carried on the surface of the roughened slide glass according to any one of claims 1 to 8. How to parse.
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