JP4133110B2 - Thin film for nucleic acid fixation and nucleic acid analysis method - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は水素化アモルファスカーボン膜又は水素化アモルファスカーボンナイトライド膜を使用した核酸固着用薄膜及び核酸解析方法に関し、更に詳述すれば、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）等の核酸の塩基配列の決定、遺伝子病に関する診断、ゲノム遺伝子の発現モニタリング等の核酸の解析に使用することができるハイブリダイゼーション用のＤＮＡマイクロアレイに利用できる核酸固着用薄膜及び核酸解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーションによる遺伝子の解析は、例えば塩基配列決定、感染症及び遺伝子病の診断、ゲノム遺伝子の発現によるモニタリング等において広く用いられている。ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現パターンのモニタリング法（M.Schena et al., Science, 260, 467(1995)）は、大量の遺伝子の発現を迅速に解析できる手法として注目されている。これらの遺伝子の解析においては、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらの混合物等の核酸をプレート上に固定化したＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるものが用いられる。
【０００３】
ＤＮＡを固定化するプレートとしては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出をＲＩ（ラジオアイソトープ）を使用せずに蛍光物質を用いて行うことを考えると、蛍光物質を含まないガラスプレート又はシリコンプレート等が適していると考えられる。現在では安価でかつ取り扱いが簡便なスライドガラスが多く普及している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ガラスプレートの表面はＤＮＡ（核酸）を固定化するのに適切な官能基を有せず、ＤＮＡを基材の表面に何らかの化学物質でコーティングする必要があった。ガラスプレートのコーティングの方法には、poly-L-lysineコート、sililated（シリレン化）、silanated（シラン化）等がある。例えば、ガラス表面をアミノ基として固相置換する場合、アミノシランを用いてコーティングする方法（Z.Guo et al., Nucl. Acids Res., 22.5456(1994)）、poly-L-lysineを用いてコーティングする方法（M.Schena et al., Science, 270, 467(1995)）が知られている。これらの方法により、ガラス表面をアミノ基等の官能基に固相置換した表面にＤＮＡを固定化したプレートを用いてＤＮＡを解析する場合、ＤＮＡの固定量が十分ではなく、その後のハイブリダイゼーション後の蛍光シグナル強度が低いか、又は固着量のばらつきに起因すると考えられる再現性等に問題点があった。
【０００５】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、膜表面に効率的かつ再現性よくＤＮＡ等の核酸を安定に固定化することができると共に、透明でかつ膜表面が水素終端した水素化アモルファスカーボン膜又は水素化アモルファスカーボンナイトライド膜からなる核酸固着用薄膜及び核酸解析方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る核酸固着用薄膜は、膜表面が−Ｃ−ＨＸ（Ｘ＝１，２，３）による水素結合によって終端され、かつ膜中の水素濃度が２０乃至５０原子％である水素化アモルファスカーボン膜が基材表面にコーティングされていることを特徴とする。
【０００７】
本発明に係る他の核酸固着用薄膜は、膜表面が−Ｎ−Ｈ２又は−Ｎ−ＨＲ（ＲはＣＨ３）又は−Ｃ−ＨＸ（Ｘ＝１，２，３）による水素結合によって終端され、かつ膜中の水素濃度が２０乃至５０原子％である水素化アモルファスカーボンナイトライド膜が基材表面にコーティングされていることを特徴とする。
【０００８】
この核酸固着用薄膜において、例えば、前記コーティング処理基材がガラスプレート又はシリコンプレートである。
【０００９】
また、前記水素化アモルファスカーボン膜又は前記水素化アモルファスカーボンナイトライド膜は、その表面終端水素に対し、官能基を含有する化学物質又はガスによってこの官能基に表面置換したものとすることができる。
【００１０】
更に、前記水素化アモルファスカーボン膜又は前記水素化アモルファスカーボンナイトライド膜の表面終端水素に対し、官能基を一方の末端に有するカップリング剤の他方の末端が化学結合しているものとすることができる。
【００１１】
前記官能基は、例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、クロライド基、エポキシ基、アルデヒド基、イソシアネート基、及びチオシアネート基からなる群から選択された１種である。
【００１２】
本発明に係る核酸解析方法は、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の核酸固着用薄膜に核酸を固定化して、試料中の核酸を解析することを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、例えばガラスプレート上に透明でかつ水素終端した水素化アモルファスカーボン膜が、アミノ基及びカルボキシル基等の官能基を高密度に表面置換できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
更に、膜中に水素を２０乃至５０原子％導入することによって、５００ｎｍ乃至５０００ｎｍ（＝５μｍ）にわたって、膜厚１００ｎｍにおいても９０％以上の透過率を示す透明水素化アモルファスカーボン膜を得ることができ、ハイブリダイゼーション後の光学的処理のバックグラウンドを低減することができる。
【００１５】
更に、本発明者等は、前述のカーボンクラスターにＮを導入し、表面にアミノ基（−ＮＨ２）又は第２級アミンである−ＮＨＲ（Ｒはアルキル基でＣＨ３）で水素終端させた水素化アモルファスカーボンナイトライド膜を作製し、高密度にアミノ基又は第２級アミンが膜表面を終端しているガラスプレートを作製した。この膜は同様に水素を２０乃至５０原子％導入することで、５００ｎｍ乃至５０００ｎｍにわたって、膜厚１００ｎｍにおいても９０％以上の透過率を示す。
【００１６】
これによって一般にガラス基板表面において、ＤＮＡ固着のためのpoly-L-lysineコート等の官能基置換のための化学処理を行うことなく、高密度のアミノ基、第２級アミンを表面に直接導入することができる。
【００１７】
更に、本発明によれば、前記水素化アモルファスカーボン膜をコーティングしたガラスプレートのコーティング表面を官能基置換し、ＤＮＡ等の核酸を固定化したガラスプレート等の基板を得ることができる。また、前記水素化アモルファスカーボンナイトライド膜をコーティングしたガラスプレートの表面では、アミノ基又は第２級アミンで終端され、同様にＤＮＡ等の核酸を固定化したガラスプレート基板である。勿論、シリコン基板でもかまわない。また、本発明によれば、固定化された核酸を用いて試料中の核酸を解析する方法において、前記ガラスプレートを使用して核酸を解析することができる。
【００１８】
本発明によると、膜表面に高密度の官能基の置換が可能であることから、膜をコーティングしたガラス表面に対し、ＤＮＡ等の核酸の固定化を高密度に行うことができ、蛍光強度の安定性、再現性が優れたＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップを得ることができる。
【００１９】
以下、本発明について更に詳細に説明する。本発明の水素化アモルファスカーボン膜は、化学気相蒸着法（ＣＶＤ）によって形成可能である。ＣＨ４ガスをプラズマによって解離させ、成膜前駆体であるＣＨＸ（Ｘ＝１、２、３）によって水素化アモルファスカーボン膜を成膜する。成膜条件によっては、膜の構造を構成するクラスターを数ｎｍに制御することが可能で、この膜中の水素含有量は２０乃至５０原子％となる。これによって、可視光から赤外光にわたって極めて高い透過率を示す。この膜を構成するクラスターは、−Ｃ−ＨＸ（Ｘ＝１、２、３）によって終端されており、表面においてもカーボンクラスターの終端は同様に−Ｃ−ＨＸ（Ｘ＝１、２、３）によって終端されている。つまり、水素被覆率の高い表面を有している。
【００２０】
また、膜の光透過率は、膜厚１００ｎｍにおいて、波長域５００ｎｍ乃至５０００ｎｍ（５μｍ）において９０％以上の透過率を有し、可視光から赤外にわたって優れた透明性を示す。ハイブリダイゼーション後の光学測定においても低バックグランドを実現することが可能である。
【００２１】
この水素化アモルファスカーボン膜を、例えば、ガラス基板にコーティング成膜することにより、これをＤＮＡ等の核酸の固着基板に使用することができる。水素終端されたアモルファスカーボン膜の表面に対し、塩素を含む雰囲気下で紫外線照射を行い、クロライド基に置換する。次に、アンモニアを含む雰囲気下で再度紫外線照射を行い、アミノ基を導入することができる。また、アンモニアプラズマを使ってアモルファスカーボン膜表面の水素をアミノ基に直接置換することも可能である。
【００２２】
アミノ基以外の官能基の固相置換には、例えば、カルボキシル基の固相置換には、このアミノ基を使って、シュウ酸等２価カルボン酸を使っての１つのカルボキシル基をアミド結合させることで可能である（特開２００１−１３９５３２）。
【００２３】
また、このように水素化アモルファスカーボン膜の表面を溶液又はガス等によって反応させ、直接置換する方法以外にも、一方の末端に官能基を有するカップリング剤で処理して、その官能基を利用してもよい。市販されているカップリング剤の官能基としては、アミノ基、イソシアネート基、クロライド基、エポキシ基等があり、固着させるＤＮＡ等の核酸によって適宜選択することが可能である。
【００２４】
上述のようにして製造した本発明の水素化アモルファスカーボン膜を、例えばガラスプレートにコーティングし、コーティングしたガラスプレートのコーティング面を所望の官能基に固相置換し、このコーティング表面に核酸を固定化することで、核酸固定化ガラスプレートを作製することができる。本発明の核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。これらの核酸の分子量等は特に限定されず、合成したオリゴヌクレチオドであっても、また天然の核酸であっても、更にＰＣＲ産物等を使用してもよい。
【００２５】
核酸の解析をハイブリダイゼーションによって行う場合、核酸又は本発明の水素化アモルファスカーボン膜でコーティングされたガラスプレート表面に固定化する核酸（オリゴヌクレチオドを含む）のいずれかが標識されていることが望ましい。標識化の方法は特に限定されるものではなく、例えばＲＩ及び蛍光色素を用いる方法等を使用することができる。ハイブリダイゼーションの結果は、各種標識法に即した方法によって測定することができる。但し、後に述べる遺伝子発現モニタリング法においては、核酸を検出波長が異なる複数の蛍光色素で標識することにより、試料核酸間の発現の強弱を並行して検出できるため、蛍光法による標識を用いることが望ましい。
【００２６】
これらの核酸を本発明の水素化アモルファスカーボン膜をコーティングしたガラスプレート表面に固定化する方法を以下に述べる。水素化アモルファスカーボン膜の表面は、例えば前述のように塩素雰囲気での紫外線照射によってクロライド基に置換し、アンモニア雰囲気での紫外線照射によってアミノ基に既に置換されている。
【００２７】
核酸のガラスプレートへの固定化は適量の核酸溶液を本発明の水素化アモルファスカーボン膜をコーティングしたガラスプレート上に滴下し、乾燥、紫外線照射又は両者を併合することにより行うことができる。核酸をガラスプレートに安定に固定化するという点では、紫外線を照射することが望ましい。その後の解析に使用することを考慮すると、ガラスプレート上に固定されていない核酸等を取り除くため、各種の酸、熱湯、又はアルコール等を用いて後処理することが望ましい。
【００２８】
このようにして作製された核酸を固定化したガラスプレートは、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）マイクロアレイ又はＤＮＡ（又はＲＮＡ）チップといわれ、各種の遺伝子解析を行う際に利用されている。勿論、核酸を固定化したガラスプレートをＤＮＡマイクロアレイということがあるが、ＤＮＡに限定されるものでなく、ＲＮＡを固定化したガラスプレートも含まれる。ＤＮＡマイクロアレイの作製方法としては、上述の方法の他に、プレート上に直接オリゴヌクレチオドを合成する方法（A. C. Pease et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 91, 5022(1994)）又は合成したオリゴヌクレチオド（Z.Guo et al., Nucl. Acids Res., 22.5456(1994)）、又はＰＣＲ産物等（M.Schena et al., Science, 270, 467(1995)）をガラスプレート上に固定化する方法等がある。
【００２９】
本発明の方法により作製されたＤＮＡマイクロアレイは、ＤＮＡ固着量が多く、また安定であることから、ハイブリダイゼーション法により遺伝子を解析しようとする場合、高感度でかつ再現性よく使用できる。
【００３０】
特定の遺伝子を検出する方法としては、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法及びサザンノーザンハイブリダイゼーション法等が広く使用されているが、これらの方法を使用した測定法は、未だ操作が煩雑で、熟練を要する。このため、より簡便で高速な測定方法の開発が望まれており、ＤＮＡチップ法及びキャピラリー電気泳動法等が開発されている。ＤＮＡチップ法は、ガラス基板上に多種類のＤＮＡを固定化したチップを使用する。測定対象遺伝子を蛍光物質及び酵素等で標識しておき、ＤＮＡチップ上で相補的な遺伝子と結合を生じさせた後、標識体による増幅作用を利用して検出する。これに対し、試料遺伝子と相補的な配列をもつ遺伝子を標識しておく方法もあり、ＤＮＡプローブ法とよばれている。このときは試料遺伝子はフィルタ等に固定化しておく。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明の実施例について、本発明の範囲から外れる比較例と比較してその効果について説明する。
【００３２】
［実施例１］
水素化アモルファスカーボン膜の成膜にはプラズマＣＶＤ装置を用いた。使用したガスはＨｅ、ＣＨ４、Ｈ２である。使用したプラズマＣＶＤ装置は狭ギャップ平行平板タイプのもので、ＲＦ（１３．５６ＭＨｚの高周波）が印加されるカソード電極とその対向に平行してグランド電極が設置されている。両電極の表面にはアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）が溶射コーティングされている。両電極間は２ｍｍに設定されている。カソード電極の面積は２０ｍｍ×１２０ｍｍである。グランド電極は対向のカソード電極に対して平行に設置されており、またグランド電極は平行方向に移動できるようになっており、グランド電極にスライドガラスを載置し、両電極間で発生するプラズマ領域（＝およそカソード面積：２０ｍｍ×１２０ｍｍ）中をグランド電極上のスライドガラスが平行移動することで、スライドガラス上に均一に水素化アモルファスカーボンを成膜することができる。
【００３３】
使用したスライドガラスのサイズは２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１．０ｍｍ（ｔ）である。成膜の前の洗浄処理は、エタノール及び超純水による超音波洗浄である。洗浄後、スライドガラスをＣＶＤ装置内のグランド電極上に載置した。
【００３４】
また、実施例１ではグランド電極を浮遊状態とし（グランドではない）、これに４００ｋＨｚの電力を印加し、スライドガラス上へのイオンボンバード処理ができるようにした。
【００３５】
グランド電極の移動速度は１．５ｍｍ／秒とした場合、スライドガラス上に成膜される水素化アモルファスカーボン膜の膜厚は３０ｎｍであった。
【００３６】
上記条件において、グランドの移動速度を変えることで任意の膜厚を得ることができる。図１は上記条件において成膜した膜厚３００ｎｍの水素化アモルファスカーボン膜の波長５００ｎｍ乃至２５００ｎｍにおける光透過率を示すグラフ図である。同波長域において、９０％以上の光透過率を有することが分かり、優れた透明性を示している。比較のためにスパッタ法によって成膜したＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）膜（膜厚１００ｎｍ）の透過率を図１中に示す。本発明の水素化アモルファスカーボン膜と比較して、ＤＬＣ膜は膜厚は１／３であるが、５００ｎｍの透過率は２０％程度であり、膜は茶褐色である。
【００３７】
次に、波長２５００ｎｍ乃至５０００ｎｍの赤外域でのＦＴＩＲによる透過率測定結果について、図２を参照して説明する。本発明の水素化アモルファスカーボン膜は、２５００ｎｍ乃至５０００ｎｍの赤外域においても８５％以上の高い透過率を示す。なお、３３００ｎｍ乃至３５００ｎｍあたりにみられる吸収ピークはｓｐ３軌道のＣＨ３、ｓｐ３軌道のＣＨ２及びｓｐ３軌道のＣＨに起因するピークである。
【００３８】
図３は、図１及び図２に示した水素化アモルファスカーボン膜のラマン分光スペクトルである。ラマンスペクトルは波長５１４．５ｎｍのＡｒ＋レーザーをラマン散乱励起源として得られる。図３から分かるように、ラマンスペクトル上には高分子的な構造をもつ軟質膜に特有の蛍光によるバックグランドが大きく現れている。この結果から、水素化アモルファスカーボン膜を構成するカーボンクラスターのサイズは数ｎｍであることが分かる。
【００３９】
また、水素化アモルファスカーボン膜の膜中の水素濃度を弾性反跳粒子検出法（ＥＲＤＡ）によって測定した結果を図４に示す。図４から分かるように、水素化アモルファスカーボン膜における水素濃度は３０乃至４０原子％である。比較のために、スパッタによるＤＬＣ膜の水素濃度を測定した結果も図４に示すが、このスパッタによるＤＬＣ膜の水素濃度は１０乃至２０原子％であった。
【００４０】
次に、水素化アモルファスカーボン膜表面の水接触角を測定した。この水素化アモルファスカーボン膜の接触角は８５乃至１００°であり、比較のために測定したスパッタによるＤＬＣ膜の接触角は４５乃至６０°であった。従って、水素化アモルファスカーボン膜の表面は水素終端による強い疎水表面であることが分かる。
【００４１】
以上の光透過率、ラマンスペクトル、ＥＲＤＡ、水接触角測定の分析結果により、水素化アモルファスカーボン膜は、膜構造におけるカーボンクラスタが数ｎｍであり、またクラスタの終端（表面も含めて）が−Ｃ−ＨＸ（Ｘ＝１，２，３）であることが分かる。
【００４２】
上述のようにスライドガラスに膜厚３０ｎｍの該水素化アモルファスカーボン膜を成膜コーティングした後、塩素雰囲気において紫外線照射を行い、表面水素をクロライド基に置換し、その後アンモニア雰囲気において紫外線照射を行い、表面をアミノ基に置換した。アミノ基の導入は、前述したようにアンモニアプラズマを使っても可能であり、プラズマ条件を変化させることでアミノ基の密度を変えることができる。そのときの表面は１０°乃至９０°にわたって水接触角を制御できる。今回は紫外線照射を使用した。紫外線照射によるアミノ基導入後の接触角は４０°であった。更に、ガラスプレートを２価カルボン酸の溶液に１時間浸漬し、次に５００ｒｐｍの遠心乾燥によってスライドガラス表面の溶液を取り除いた。このスライドガラスを真空オーブンで５０℃に、３０分加熱して乾燥した。これによって、１つのカルボキシル基をアミノ基表面とアミド結合させ、最表面をカルボキシル基に置換した。
【００４３】
標識化試料ＤＮＡとしては、プラスミドｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）（プロメガ社）を用いた。プラスミドの標識化はＬａｂｅｌｌＴ（宝酒造（株）製）を用いて、蛍光標識（フルオレセイン）により行った。試料ＤＮＡの固定化で標識したプラスミドＤＮＡを０．５ｍｇ／ミリリットルの濃度になるように３×ＳＳＣ（Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)）に溶解した。
【００４４】
このようにして作成したガラスプレートに、試料ＤＮＡをスポットした。対象として、ガラスプレートにポリアスパラギン酸をコーティングし、ガラス表面をカルボキシル基に置換したもの（特開２０００−６３１５４公報）を使用して同様に試料ＤＮＡをスポットした。スポットを風乾した後、湿潤容器内で４５℃に１分保温した。ガラスプレートを９０℃に加熱した超純水上で試料ＤＮＡをスポットした面を５秒蒸気にあてた後（リハドレーション処理）、再度ガラス面をかえして５秒間の瞬間乾燥を行い、ＵＶクロスリンカー（フナコシ社）によって６０ｍＪの紫外線（２５４ｎｍ）を照射した。
【００４５】
次に、無水コハク酸５．５ｇを３１５ミリリットルの１−メチル−２−ピロリドン溶液に溶解させ、これにSodium Borate（ホウ酸６１．８ｇ、ｐＨ調整用ＮａＯＨ（ｐＨ８．０にあわせる）、超純水８００ミリリットル）を注いだ。この溶液に上述のスライドガラスを２０分間浸漬した。その後、９０℃の超純水で１分間リンスした後、更に９５％エタノールで２分間浸漬し、ガラスプレートを８００ｒｐｍで遠心乾燥した（ブロッキング処理）。
【００４６】
固定化されたＤＮＡの量の測定は、プラスミドを標識した蛍光量を定量測定することによって行った。蛍光量の検出にはフルオロイメージャー（FluoroImager）(モレキュラーダイナミックス社)を用いた。その結果、対象としたポリアスパラギン酸をコーティングしたガラスプレートを使用した場合の蛍光強度を１とすると、水素化アモルファスカーボン膜をスライドガラス基板にコーティングし、カルボキシル基に置換させる化学処理を行ったガラスプレートを使用した場合、９であることが分かり、１０倍近い量のＤＮＡが固着していることが分かった。
【００４７】
［実施例２］
実施例１と同様の方法によって、スライドガラスに膜厚３０ｎｍの水素化アモルファスカーボン膜を成膜コーティングした後、アンモニアプラズマ照射を施して、前記水素化アモルファスカーボン膜の表面水素をアミノ基に置換した。このアンモニアプラズマ照射には平行平板型プラズマリアクタを用い、アンモニア（ＮＨ３）ガス流量が１００ｃｃ／分、圧力が３９Ｐａ、高周波実効投入電力が０．１４Ｗ／ｃｍ２の条件で、室温においてプラズマを発生させることによって、水素化アモルファスカーボン膜表面にアンモニアプラズマを所定時間にわたり照射した。
【００４８】
図５は上記のように水素化アモルファスカーボン膜表面にアンモニアプラズマ照射した結果を示す。図５（ａ）はアンモニアプラズマ照射された水素化アモルファスカーボン膜表面における水接触角の測定結果とアンモニアプラズマ照射時間との関係を示すグラフであり、図５（ｂ）はＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）分析の光電子脱出角が１５°の場合における結果から計算したアンモニアプラズマ照射後の水素化アモルファスカーボン膜表面におけるカーボン（Ｃ）と窒素（Ｎ）の原子組成比と水接触角の測定結果との関係を示すグラフである。図５（ａ）から分かるように、アンモニアプラズマ照射時間が長いほど、水素化アモルファスカーボン膜表面における水接触角は小さくなり、より親水性を示すようになった。また、図５（ｂ）から明らかなように、アンモニアプラズマ照射された水素化アモルファスカーボン膜表面において、カーボン（Ｃ）に対する窒素（Ｎ）の原子数比が高くなるほど水接触角が小さくなり、より親水性を示すようになった。ＸＰＳ分析結果を詳細に検討した結果、このアンモニアプラズマ照射された水素化アモルファスカーボン膜表面に存在する窒素（Ｎ）はアミノ基に由来するものと同定された。これらの結果から、水素化アモルファスカーボン膜にアンモニアプラズマを照射することによって、この膜表面にはアミノ基が導入され、膜表面における水接触角が小さくなることが分かった。即ち、水素化アモルファスカーボン膜へのアンモニアプラズマ照射時間が長くなるほど、この膜表面に存在するアミノ基の数は増大し、この膜表面における水接触角は小さくなる。
【００４９】
次に、実施例１と同様の方法によって、スライドガラスに膜厚３０ｎｍの水素化アモルファスカーボン膜が成膜コーティングされたガラスプレートを用意し、このガラスプレート上の水素化アモルファスカーボン膜に上記のアンモニアプラズマ照射を６０秒間にわたり施すことによって、この膜表面にアミノ基を導入した。このようにしてアミノ基が導入された水素化アモルファスカーボン膜の膜表面における水接触角は６０°であった。このようにして作成したガラスプレートを、実施例１と同様に、２価カルボン酸の溶液に１時間浸漬した後、５００ｒｐｍの遠心乾燥によってガラスプレート表面の溶液を取り除いた。次に、ガラスプレートを真空オーブンを用いて５０℃で３０分間にわたり乾燥させた。これによって、１つのカルボキシル基をアミノ基表面とアミド結合させ、最表面をカルボキシル基に置換した。
【００５０】
このガラスプレートにおいて、実施例１と同様に、ＤＮＡスポット処理、リハイドレーション処理、ＵＶクロスリンキング処理、ブロッキング処理を順々に行った。固定化されたＤＮＡの量の測定は、実施例１同様プラスミドを標識した蛍光量を定量測定することによって行った。蛍光量の検出にはフルオロイメージャーを用いた。その結果、実施例１において対象としたガラスプレート、即ちポリアスパラギン酸をコーティングしたガラスプレートを使用した場合の蛍光強度を１とすると、水素化アモルファスカーボン膜をスライドガラスに成膜コーティングし、アンモニアプラズマ照射によりアミノ基を導入してからカルボキシル基に置換させる化学処理を行ったガラスプレートを使用した場合、蛍光強度比が６であることが分かり、６倍近い量のＤＮＡが固着していることが分かった。
【００５１】
［実施例３］
実施例１と同様の方法によって、スライドガラスに膜厚３０ｎｍの水素化アモルファスカーボン膜を成膜コーティングした後、大気中において、この水素化アモルファスカーボン膜の表面に波長が２５４ｎｍの紫外線を照射した。紫外線照射には、ＵＶトランスイルミネーターを用いた。
【００５２】
図６は紫外線照射された水素化アモルファスカーボン膜表面における水接触角の測定結果と紫外線照射時間との関係を示すグラフであり、図７は紫外線照射後の水素化アモルファスカーボン膜表面の反射ＦＴＩＲ（Fourier Transform Infrared Spectroscopy：フーリエ変換赤外分光）による分析結果を示す図である。図６のグラフから分かるように、紫外線照射時間が長いほど、水素化アモルファスカーボン膜表面における水接触角は小さくなり、より親水性を示すようになった。また、図７に示すように、紫外線照射された水素化アモルファスカーボン膜表面の反射ＦＴＩＲによる分析結果には、波数１７１０ｃｍ−１付近に現れＣ＝Ｏ結合に帰属するピークと、波数２９６６ｃｍ−１付近に現れＣ−Ｈ結合に帰属するピークとが明瞭に認められる。なお、他のピークは下地スライドガラスに起因する吸光によるものである。これらの結果から、紫外線照射を施された水素化アモルファスカーボン膜の表面においては、図２に示したような−ＣＨ２及び−ＣＨ３により水素終端されていた膜表面が、アルデヒド基（Ｏ＝Ｃ−Ｈ）で置換されていることがわかった。このようなアルデヒド基は、水素化アモルファスカーボン膜の表面に存在するＣ−Ｈ結合が紫外線照射により切断され、この結合が切れて活性化されたサイトと大気中に存在する酸素又は水とが反応することによって導入されたものと考えられる。このため、水素化アモルファスカーボン膜の表面に紫外線を照射することによって、膜表面にはアルデヒド基が導入されて水接触角が小さくなり、親水性を示すようになる。また、この膜表面への紫外線照射時間が長いほど、膜表面に存在するアルデヒド基の密度が増大し、より親水性を示すようになる。
【００５３】
次に、実施例１と同様の方法によって、スライドガラスに膜厚３０ｎｍの該水素化アモルファスカーボン膜が成膜コーティングされたガラスプレートを用意し、このガラスプレート上の水素化アモルファスカーボン膜に上記の紫外線照射を１８０分間にわたり施すことによって、この膜表面にアルデヒド基を導入した。このようにしてアルデヒド基が導入された水素化アモルファスカーボン膜の膜表面における水接触角は６０°であった。このガラスプレートにおいて、実施例１と同様に、ＤＮＡスポット処理、リハイドレーション処理、ＵＶクロスリンキング処理、ブロッキング処理を順々に行った。固定化されたＤＮＡの量の測定は、実施例１同様プラスミドを標識した蛍光量を定量測定することによって行った。蛍光量の検出にはフルオロイメージャーを用いた。その結果、実施例１において対象としたガラスプレート、即ちポリアスパラギン酸をコーティングしたガラスプレートを使用した場合の蛍光強度を１とすると、水素化アモルファスカーボン膜をスライドガラスに成膜コーティングし、紫外線照射によりアルデヒド基を導入たガラスプレートを使用した場合、蛍光強度比が１０であることが分かり、１０倍近い量のＤＮＡが固着していることが分かった。
【００５４】
［実施例４］
実施例１におけるプラズマＣＶＤ装置を用いて、水素化アモルファスカーボンナイトライド膜の成膜を行った。プラズマＣＶＤで使用したガスはＨｅ、ＣＨ４、Ｈ２、ＮＨ３であり、カソード電極には１３．５６ＭＨｚのＲＦ（高周波）を印加した。Ｎの導入はＮＨ３のほかに、モノメチルアミン（ＣＨ３ＮＨ２）等のＣＮＨ系でも可能である。また、実施例１と同様に、グランド電極を浮遊状態とし（グランドではない）、これに４００ｋＨｚの電力を印加し、スライドガラス上へのイオンボンバード処理ができるようにした。
【００５５】
グランド電極の移動速度は１．５ｍｍ／秒とした場合、スライドガラス上に成膜される水素化アモルファスカーボンナイトライド膜の膜厚は３０ｎｍであった。
【００５６】
上記条件において、グランド電極の移動速度を調整し、膜厚３００ｎｍの水素化アモルファスカーボンナイトライド膜を成膜した。この水素化アモルファスカーボンナイトライド膜において、実施例１と同様に、波長５００ｎｍ乃至５０００ｎｍにおける光透過率を測定した結果、同波長域において、８５％以上の透過率を有することが分かり、優れた透明性を示した。更に、ＦＴＩＲによる赤外吸収スペクトルを測定した結果、３３００ｃｍ−１付近にアミノ基の伸縮振動に起因する吸収と２８００乃至３０００ｃｍ−１付近にメチル基の伸縮振動に起因するピークが得られた。このＦＴＩＲスペクトルの結果からアミノ基及び第２級アミンによって表面が水素終端されていることが分かった。
【００５７】
ラマンスペクトルは図２と同様に、高分子的な構造をもつ軟質膜に特有の蛍光によるバックグランドが大きく現れる結果となり、カーボンクラスタのサイズは数ｎｍ程度と予想される。
【００５８】
また、水素化アモルファスカーボンナイトライド膜の膜中の水素濃度を弾性反跳粒子検出法（ＥＲＤＡ）によって測定したところ、３０乃至４０原子％であることが分かった。
【００５９】
以上の光透過率（ＦＴＩＲ含む）、ラマンスペクトル、ＥＲＤＡの分析の結果、水素化アモルファスカーボンナイトライド膜は、膜構造におけるカーボンクラスタが数ｎｍであり、またクラスタの終端（表面も含めて）が−Ｎ−Ｈ２又は−Ｎ−ＨＲ（Ｒはアルキル基でＣＨ３）又は−Ｃ−ＨＸ（Ｘ＝１，２，３）であることが分かった。今回の実験ではＣＨ４／ＮＨ３比を変えることで表面のＮ−Ｈｘ（親水基）／Ｃ−Ｈｘ（疎水基）比を変えることができる。これによって、表面の接触角を１０°乃至９０°にわたって任意に変えることができる。
【００６０】
実施例１で示したようなクロライド基、アミノ基といった多段処理によって表面にアミノ基を導入せずに、直接的にアミノ基を導入した。実施例１と同様に、スライドガラスにおいて、２価カルボン酸の溶液に１時間浸漬し、次に５００ｒｐｍの遠心乾燥によってスライドガラス表面の溶液を取り除いた。スライドガラスを真空オーブンで５０℃、３０分乾燥させた。これによって、１つのカルボキシル基をアミノ基表面とアミド結合させ、最表面をカルボキシル基に置換した。
【００６１】
このスライドガラスにおいて、実施例１と同様に、ＤＮＡスポット処理、リハイドレーション処理、ＵＶクロスリンキング処理、ブロッキング処理を順々に行った。固定化されたＤＮＡの量の測定は、実施例１と同様に、プラスミドを標識した蛍光量を定量測定することによって行った。蛍光量の検出にはフルオロイメージャー（FluoroImager）(モレキュラーダイナミックス社)を用いた。その結果、実施例１において対象としたガラスプレート、即ちポリアスパラギン酸をコーティングしたガラスプレートを使用した場合の蛍光強度を１とすると、水素化アモルファスカーボン膜をスライドガラス基板にコーティングし、カルボキシル基に置換させる化学処理を行ったガラスプレートを使用した場合、１０であることが分かり、１０倍近い量のＤＮＡが固着していることが分かった。
【００６２】
【発明の効果】
以上詳述したように本発明によれば、膜表面に効率的かつ再現性よくＤＮＡ等の核酸を安定に固定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】横軸に波長をとり、縦軸に光透過率をとって、水素化アモルファスカーボン膜の波長５００ｎｍ乃至２５００ｎｍにおける光透過率の結果を示すグラフ図である。
【図２】横軸に波長をとり、縦軸に光透過率をとって、水素化アモルファスカーボン膜の波長２５００ｎｍ乃至５０００ｎｍにおける光透過率の結果を示すグラフ図である。
【図３】横軸に波数をとり、縦軸に強度をとって、波数６００乃至２２００ｃｍ−１におけるラマンスペクトル結果を示すグラフ図である。
【図４】横軸に膜の深さをとり、縦軸に水素濃度をとって、ＥＲＤＡによる膜中水素濃度を示すグラフ図である。
【図５】図５（ａ）はプラズマ照射時間と水接触角との関係を示すグラフであり、図５（ｂ）は膜表面におけるＣ／Ｎ組成比と水接触角との関係を示すグラフである。
【図６】紫外線照射時間と水接触角との関係を示すグラフである。
【図７】横軸に波数をとり、縦軸に吸光度をとって、波数８００乃至４０００ｃｍ−１における反射ＦＴＩＲ結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a nucleic acid fixing thin film and a nucleic acid analysis method using a hydrogenated amorphous carbon film or a hydrogenated amorphous carbon nitride film, and more specifically, determination of the base sequence of a nucleic acid such as DNA (deoxyribonucleic acid), gene The present invention relates to a nucleic acid fixation thin film and a nucleic acid analysis method that can be used for a DNA microarray for hybridization that can be used for nucleic acid analysis such as diagnosis of diseases and expression monitoring of genomic genes.
[0002]
[Prior art]
Analysis of genes by hybridization is widely used, for example, in base sequence determination, diagnosis of infectious diseases and genetic diseases, monitoring by expression of genomic genes, and the like. A method for monitoring gene expression patterns using a DNA microarray (M. Schena et al., Science, 260, 467 (1995)) has attracted attention as a method capable of rapidly analyzing the expression of a large amount of genes. In the analysis of these genes, what is called a DNA microarray or DNA chip in which nucleic acids such as DNA, RNA or a mixture thereof are immobilized on a plate is used.
[0003]
Nylon membranes, polypropylene membranes, nitrocellulose membranes, glass plates, silicon plates, etc. are used as DNA immobilization plates. Hybridization is detected using a fluorescent substance without using RI (radioisotope). Considering what to do, a glass plate or silicon plate that does not contain a fluorescent material is considered suitable. Currently, many glass slides that are inexpensive and easy to handle are widely used.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, the surface of the glass plate does not have a functional group suitable for immobilizing DNA (nucleic acid), and it was necessary to coat the surface of the substrate with some chemical substance. Examples of the method for coating the glass plate include poly-L-lysine coating, silylated, silanated, and the like. For example, when the glass surface is solid-phase substituted as an amino group, a coating method using aminosilane (Z. Guo et al., Nucl. Acids Res., 22.5456 (1994)), coating using poly-L-lysine (M. Schena et al., Science, 270, 467 (1995)) is known. When DNA is analyzed using these methods using a plate in which the glass surface is solid-phase-substituted with a functional group such as an amino group and DNA is immobilized on the surface, the amount of DNA immobilized is not sufficient. There was a problem in the reproducibility considered to be due to the low fluorescence signal intensity or the variation in the amount of fixation.
[0005]
The present invention has been made in view of such problems, and can stably immobilize nucleic acids such as DNA on the membrane surface with high efficiency and reproducibility, and is transparent and hydrogen-terminated on the membrane surface. An object of the present invention is to provide a nucleic acid fixing thin film comprising a hydrogenated amorphous carbon film or a hydrogenated amorphous carbon nitride film and a nucleic acid analysis method.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The thin film for nucleic acid fixation according to the present invention has a film surface of -CH X The substrate surface is coated with a hydrogenated amorphous carbon film that is terminated by hydrogen bonding according to (X = 1, 2, 3) and has a hydrogen concentration of 20 to 50 atomic% in the film.
[0007]
Another nucleic acid fixing thin film according to the present invention has a film surface of -N-H. 2 Or -N-HR (R is CH 3 ) Or -C-H X The substrate surface is coated with a hydrogenated amorphous carbon nitride film that is terminated by hydrogen bonding according to (X = 1, 2, 3) and the hydrogen concentration in the film is 20 to 50 atomic%. To do.
[0008]
In this thin film for nucleic acid fixation, for example, the coating substrate is a glass plate or a silicon plate.
[0009]
In addition, the hydrogenated amorphous carbon film or the hydrogenated amorphous carbon nitride film may be obtained by surface-substituting the surface-terminated hydrogen with a functional substance-containing chemical substance or gas.
[0010]
Furthermore, the other end of the coupling agent having a functional group at one end is chemically bonded to the surface terminal hydrogen of the hydrogenated amorphous carbon film or the hydrogenated amorphous carbon nitride film. it can.
[0011]
The functional group is, for example, one type selected from the group consisting of an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a chloride group, an epoxy group, an aldehyde group, an isocyanate group, and a thiocyanate group.
[0012]
A nucleic acid analysis method according to the present invention is characterized in that a nucleic acid is immobilized on the nucleic acid fixing thin film according to any one of claims 1 to 8 and the nucleic acid in a sample is analyzed.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found that, for example, a hydrogenated amorphous carbon film that is transparent and hydrogen-terminated on a glass plate has a high density of functional groups such as amino groups and carboxyl groups. The present inventors have found that the surface can be replaced and have completed the present invention.
[0014]
Furthermore, by introducing 20 to 50 atomic% of hydrogen into the film, a transparent hydrogenated amorphous carbon film having a transmittance of 90% or more at a film thickness of 100 nm over a thickness of 500 nm to 5000 nm (= 5 μm) can be obtained. The background of optical processing after hybridization can be reduced.
[0015]
Furthermore, the present inventors introduced N into the above-mentioned carbon cluster, and an amino group (—NH 2 ) Or secondary amine —NHR (where R is an alkyl group and CH 3 The hydrogenated amorphous carbon nitride film terminated with hydrogen was prepared, and a glass plate with amino groups or secondary amines terminating the film surface with high density was prepared. Similarly, when 20 to 50 atomic% of hydrogen is introduced into this film, a transmittance of 90% or more is exhibited even at a film thickness of 100 nm from 500 nm to 5000 nm.
[0016]
As a result, generally high-density amino groups and secondary amines are directly introduced onto the surface of a glass substrate without performing chemical treatment for functional group substitution such as poly-L-lysine coating for DNA fixation. be able to.
[0017]
Furthermore, according to the present invention, it is possible to obtain a substrate such as a glass plate on which a nucleic acid such as DNA is immobilized by functional substitution of the coating surface of the glass plate coated with the hydrogenated amorphous carbon film. Moreover, the glass plate substrate coated with the hydrogenated amorphous carbon nitride film is terminated with an amino group or a secondary amine, and similarly a glass plate substrate on which nucleic acids such as DNA are immobilized. Of course, a silicon substrate may be used. According to the present invention, in the method for analyzing nucleic acid in a sample using immobilized nucleic acid, the nucleic acid can be analyzed using the glass plate.
[0018]
According to the present invention, since a high-density functional group can be substituted on the membrane surface, nucleic acids such as DNA can be immobilized at a high density on the glass surface coated with the membrane, and the fluorescence intensity can be increased. A DNA microarray or DNA chip having excellent stability and reproducibility can be obtained.
[0019]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail. The hydrogenated amorphous carbon film of the present invention can be formed by chemical vapor deposition (CVD). CH 4 The gas is dissociated by plasma, and the film precursor CH X A hydrogenated amorphous carbon film is formed by (X = 1, 2, 3). Depending on the film formation conditions, the clusters constituting the film structure can be controlled to several nm, and the hydrogen content in the film is 20 to 50 atomic%. Thereby, extremely high transmittance is shown from visible light to infrared light. The cluster constituting this membrane is -C-H X (X = 1, 2, 3), and the end of the carbon cluster is similarly -C-H on the surface. X Terminated by (X = 1, 2, 3). That is, it has a surface with a high hydrogen coverage.
[0020]
The film has a light transmittance of 90% or more in a wavelength range of 500 nm to 5000 nm (5 μm) at a film thickness of 100 nm, and exhibits excellent transparency from visible light to infrared. It is possible to realize a low background even in optical measurement after hybridization.
[0021]
The hydrogenated amorphous carbon film can be used as a substrate for fixing a nucleic acid such as DNA by coating the glass substrate on a glass substrate, for example. The surface of the hydrogen-terminated amorphous carbon film is irradiated with ultraviolet rays in an atmosphere containing chlorine to be substituted with chloride groups. Next, the amino group can be introduced by irradiating with ultraviolet rays again in an atmosphere containing ammonia. It is also possible to directly replace the hydrogen on the surface of the amorphous carbon film with an amino group using ammonia plasma.
[0022]
For solid phase substitution of functional groups other than amino groups, for example, for solid phase substitution of carboxyl groups, this amino group is used to amide bond one carboxyl group using a divalent carboxylic acid such as oxalic acid. This is possible (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-139532).
[0023]
In addition to the method of reacting the surface of the hydrogenated amorphous carbon film with a solution or gas and directly replacing it in this way, the functional group is used by treating with a coupling agent having a functional group at one end. May be. Commercially available functional groups of coupling agents include amino groups, isocyanate groups, chloride groups, epoxy groups, and the like, and can be appropriately selected depending on nucleic acids such as DNA to be fixed.
[0024]
The hydrogenated amorphous carbon film of the present invention produced as described above is coated on, for example, a glass plate, the coating surface of the coated glass plate is solid-phase replaced with a desired functional group, and nucleic acid is immobilized on the coating surface. By doing so, a nucleic acid-immobilized glass plate can be produced. The nucleic acid of the present invention may be DNA or RNA. The molecular weight and the like of these nucleic acids are not particularly limited, and may be a synthesized oligonucleotide or a natural nucleic acid, or a PCR product or the like.
[0025]
When nucleic acid analysis is performed by hybridization, either nucleic acid or nucleic acid (including oligonucleotide) immobilized on the surface of a glass plate coated with the hydrogenated amorphous carbon film of the present invention is labeled. desirable. The labeling method is not particularly limited, and for example, a method using RI and a fluorescent dye can be used. The result of hybridization can be measured by a method according to various labeling methods. However, in the gene expression monitoring method described later, since the intensity of expression between sample nucleic acids can be detected in parallel by labeling the nucleic acid with a plurality of fluorescent dyes having different detection wavelengths, it is necessary to use a label by the fluorescence method. desirable.
[0026]
A method for immobilizing these nucleic acids on the glass plate surface coated with the hydrogenated amorphous carbon film of the present invention will be described below. For example, as described above, the surface of the hydrogenated amorphous carbon film is substituted with a chloride group by ultraviolet irradiation in a chlorine atmosphere, and is already substituted with an amino group by ultraviolet irradiation in an ammonia atmosphere.
[0027]
The nucleic acid can be immobilized on the glass plate by dropping a suitable amount of the nucleic acid solution onto the glass plate coated with the hydrogenated amorphous carbon film of the present invention and drying, irradiating with ultraviolet light, or combining both. In view of stably immobilizing the nucleic acid on the glass plate, it is desirable to irradiate with ultraviolet rays. In consideration of use in the subsequent analysis, it is desirable to perform post-treatment using various acids, hot water, alcohol, or the like in order to remove nucleic acids and the like not fixed on the glass plate.
[0028]
The glass plate on which the nucleic acid thus prepared is immobilized is called a DNA (or RNA) microarray or a DNA (or RNA) chip, and is used when various gene analyzes are performed. Of course, the glass plate on which the nucleic acid is immobilized may be referred to as a DNA microarray, but is not limited to DNA, and includes a glass plate on which RNA is immobilized. As a method for producing a DNA microarray, in addition to the above-described method, a method of directly synthesizing oligonucleotides on a plate (AC Pease et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 91, 5022 (1994) ) Or synthesized oligonucleotides (Z. Guo et al., Nucl. Acids Res., 22.5456 (1994)) or PCR products (M. Schena et al., Science, 270, 467 (1995)). There are methods such as immobilization on a glass plate.
[0029]
Since the DNA microarray prepared by the method of the present invention has a large amount of DNA adhering and is stable, it can be used with high sensitivity and good reproducibility when a gene is analyzed by a hybridization method.
[0030]
As a method for detecting a specific gene, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, Southern Northern hybridization method and the like are widely used. Cost. Therefore, development of a simpler and faster measurement method is desired, and a DNA chip method, a capillary electrophoresis method, and the like have been developed. The DNA chip method uses a chip in which various types of DNA are immobilized on a glass substrate. The measurement target gene is labeled with a fluorescent substance, an enzyme, and the like, and after binding with a complementary gene on a DNA chip, detection is performed using the amplification effect of the label. On the other hand, there is a method of labeling a gene having a sequence complementary to the sample gene, which is called a DNA probe method. At this time, the sample gene is immobilized on a filter or the like.
[0031]
【Example】
Hereinafter, the effect of the embodiment of the present invention will be described in comparison with a comparative example that is out of the scope of the present invention.
[0032]
[Example 1]
A plasma CVD apparatus was used to form the hydrogenated amorphous carbon film. Gas used was He, CH 4 , H 2 It is. The plasma CVD apparatus used is of a narrow gap parallel plate type, in which a cathode electrode to which RF (a high frequency of 13.56 MHz) is applied and a ground electrode are installed in parallel with the cathode electrode. Alumina (Al 2 O 3 ) Is spray coated. The distance between both electrodes is set to 2 mm. The area of the cathode electrode is 20 mm × 120 mm. The ground electrode is installed in parallel to the opposite cathode electrode, and the ground electrode can move in the parallel direction. A slide glass is placed on the ground electrode, and a plasma region is generated between the two electrodes. (= About cathode area: 20 mm × 120 mm) When the slide glass on the ground electrode moves in parallel, hydrogenated amorphous carbon can be uniformly formed on the slide glass.
[0033]
The size of the slide glass used is 25.4 mm × 76.2 mm × 1.0 mm (t). The cleaning process before film formation is ultrasonic cleaning with ethanol and ultrapure water. After washing, the slide glass was placed on the ground electrode in the CVD apparatus.
[0034]
In Example 1, the ground electrode was floated (not grounded), and 400 kHz power was applied to the ground electrode so that ion bombardment on the slide glass was possible.
[0035]
When the moving speed of the ground electrode was 1.5 mm / second, the thickness of the hydrogenated amorphous carbon film formed on the slide glass was 30 nm.
[0036]
Under the above conditions, an arbitrary film thickness can be obtained by changing the moving speed of the ground. FIG. 1 is a graph showing the light transmittance at a wavelength of 500 nm to 2500 nm of a 300 nm thick hydrogenated amorphous carbon film formed under the above conditions. In the same wavelength region, it can be seen that it has a light transmittance of 90% or more, and exhibits excellent transparency. For comparison, the transmittance of a DLC (diamond-like carbon) film (film thickness: 100 nm) formed by sputtering is shown in FIG. Compared with the hydrogenated amorphous carbon film of the present invention, the DLC film has a thickness of 1/3, but the transmittance at 500 nm is about 20%, and the film is brown.
[0037]
Next, the transmittance measurement results by FTIR in the infrared region of
[0038]
FIG. 3 is a Raman spectrum of the hydrogenated amorphous carbon film shown in FIGS. The Raman spectrum is Ar at a wavelength of 514.5 nm. + A laser is obtained as a Raman scattering excitation source. As can be seen from FIG. 3, the Raman spectrum shows a large background due to the fluorescence characteristic of the soft film having a polymer structure. From this result, it can be seen that the size of the carbon cluster constituting the hydrogenated amorphous carbon film is several nm.
[0039]
Moreover, the result of having measured the hydrogen concentration in the film | membrane of a hydrogenated amorphous carbon film | membrane by the elastic recoil detection method (ERDA) is shown in FIG. As can be seen from FIG. 4, the hydrogen concentration in the hydrogenated amorphous carbon film is 30 to 40 atomic%. For comparison, the result of measuring the hydrogen concentration of the DLC film by sputtering is also shown in FIG. 4, and the hydrogen concentration of the DLC film by sputtering was 10 to 20 atomic%.
[0040]
Next, the water contact angle on the hydrogenated amorphous carbon film surface was measured. The contact angle of this hydrogenated amorphous carbon film was 85 to 100 °, and the contact angle of the DLC film by sputtering measured for comparison was 45 to 60 °. Therefore, it can be seen that the surface of the hydrogenated amorphous carbon film is a strong hydrophobic surface due to hydrogen termination.
[0041]
From the above analysis results of light transmittance, Raman spectrum, ERDA, and water contact angle measurement, the hydrogenated amorphous carbon film has a carbon cluster of several nm in the film structure, and the end of the cluster (including the surface) is − C-H X It can be seen that (X = 1, 2, 3).
[0042]
As described above, the hydrogenated amorphous carbon film having a film thickness of 30 nm is coated on the slide glass, and then irradiated with ultraviolet rays in a chlorine atmosphere to replace surface hydrogen with chloride groups, and then irradiated with ultraviolet rays in an ammonia atmosphere. The surface was substituted with an amino group. As described above, the introduction of amino groups can also be performed using ammonia plasma, and the density of amino groups can be changed by changing the plasma conditions. The surface at that time can control the water contact angle over 10 ° to 90 °. This time, ultraviolet irradiation was used. The contact angle after amino group introduction by ultraviolet irradiation was 40 °. Further, the glass plate was immersed in a divalent carboxylic acid solution for 1 hour, and then the solution on the surface of the slide glass was removed by centrifugal drying at 500 rpm. The slide glass was dried by heating in a vacuum oven at 50 ° C. for 30 minutes. As a result, one carboxyl group was amide-bonded to the amino group surface, and the outermost surface was substituted with a carboxyl group.
[0043]
As the labeled sample DNA, plasmid pGEM5Zf (+) (Promega) was used. Labeling of the plasmid was performed by fluorescent labeling (fluorescein) using Labelell T (Takara Shuzo Co., Ltd.). 3 × SSC (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2) was added so that the plasmid DNA labeled by immobilizing the sample DNA was 0.5 mg / ml. nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)).
[0044]
Sample DNA was spotted on the glass plate thus prepared. As an object, sample DNA was similarly spotted using a glass plate coated with polyaspartic acid and the glass surface substituted with carboxyl groups (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-63154). After the spots were air-dried, they were kept at 45 ° C. for 1 minute in a wet container. The surface on which the sample DNA is spotted on ultrapure water heated to 90 ° C is exposed to steam for 5 seconds (rehydration treatment), then the glass surface is changed again, and instantaneous drying is performed for 5 seconds, and UV crossing is performed. 60 mJ ultraviolet rays (254 nm) were irradiated by a linker (Funakoshi).
[0045]
Next, 5.5 g of succinic anhydride was dissolved in 315 ml of 1-methyl-2-pyrrolidone solution, and sodium borate (boric acid 61.8 g, pH-adjusting NaOH (according to pH 8.0), ultrapure Water 800ml) was poured. The above slide glass was immersed in this solution for 20 minutes. Then, after rinsing with 90 ° C. ultrapure water for 1 minute, the glass plate was further immersed in 95% ethanol for 2 minutes and centrifuged at 800 rpm (blocking treatment).
[0046]
The amount of immobilized DNA was measured by quantitatively measuring the amount of fluorescence labeled with the plasmid. FluoroImager (Molecular Dynamics) was used to detect the amount of fluorescence. As a result, assuming that the fluorescence intensity when using a glass plate coated with polyaspartic acid as a target is 1, glass with a hydrogenated amorphous carbon film coated on a slide glass substrate and subjected to chemical treatment for substitution with carboxyl groups When the plate was used, it was found to be 9, and it was found that nearly 10 times as much DNA was fixed.
[0047]
[Example 2]
A hydrogenated amorphous carbon film having a film thickness of 30 nm was coated on the slide glass by the same method as in Example 1, and then ammonia plasma irradiation was performed to replace the surface hydrogen of the hydrogenated amorphous carbon film with an amino group. . A parallel plate type plasma reactor is used for this ammonia plasma irradiation, and ammonia (NH 3 ) Gas flow rate 100cc / min, pressure 39Pa, high frequency effective input power 0.14W / cm 2 Under the conditions, plasma was generated at room temperature, and the surface of the hydrogenated amorphous carbon film was irradiated with ammonia plasma for a predetermined time.
[0048]
FIG. 5 shows the result of irradiating the surface of the hydrogenated amorphous carbon film with ammonia plasma as described above. FIG. 5A is a graph showing the relationship between the measurement result of the water contact angle on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film irradiated with ammonia plasma and the ammonia plasma irradiation time, and FIG. 5B is XPS (X-ray photoelectron spectroscopy). ) Comparison of atomic composition ratio of carbon (C) and nitrogen (N) on the surface of hydrogenated amorphous carbon film after ammonia plasma irradiation calculated from the result when the photoelectron escape angle of analysis is 15 ° and the measurement result of water contact angle It is a graph which shows a relationship. As can be seen from FIG. 5 (a), the longer the ammonia plasma irradiation time, the smaller the water contact angle on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film, and the more hydrophilic. Further, as is clear from FIG. 5B, on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film irradiated with ammonia plasma, the higher the atomic ratio of nitrogen (N) to carbon (C), the smaller the water contact angle, It became hydrophilic. As a result of detailed examination of the XPS analysis results, it was identified that nitrogen (N) present on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film irradiated with ammonia plasma was derived from an amino group. From these results, it was found that by irradiating the hydrogenated amorphous carbon film with ammonia plasma, amino groups were introduced into the film surface, and the water contact angle on the film surface was reduced. That is, the longer the time of irradiation of the hydrogenated amorphous carbon film with ammonia plasma, the greater the number of amino groups present on the film surface and the smaller the water contact angle on the film surface.
[0049]
Next, a glass plate in which a hydrogenated amorphous carbon film having a film thickness of 30 nm is formed on a slide glass by a method similar to that in Example 1 is prepared, and the above ammonia is applied to the hydrogenated amorphous carbon film on the glass plate. By applying plasma irradiation for 60 seconds, amino groups were introduced on the film surface. The water contact angle on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film having amino groups introduced in this manner was 60 °. The glass plate thus prepared was dipped in a divalent carboxylic acid solution for 1 hour in the same manner as in Example 1, and then the glass plate surface solution was removed by centrifugal drying at 500 rpm. The glass plate was then dried using a vacuum oven at 50 ° C. for 30 minutes. As a result, one carboxyl group was amide-bonded to the amino group surface, and the outermost surface was substituted with a carboxyl group.
[0050]
On this glass plate, as in Example 1, DNA spot treatment, rehydration treatment, UV cross-linking treatment, and blocking treatment were sequentially performed. The amount of immobilized DNA was measured by quantitatively measuring the amount of fluorescence labeled with the plasmid as in Example 1. A fluoro imager was used to detect the amount of fluorescence. As a result, assuming that the fluorescence intensity when using the glass plate targeted in Example 1, that is, the glass plate coated with polyaspartic acid, is 1, a hydrogenated amorphous carbon film is formed on the slide glass and coated with ammonia plasma. When a glass plate subjected to chemical treatment in which an amino group is introduced by irradiation and then substituted with a carboxyl group is used, it can be seen that the fluorescence intensity ratio is 6, and that nearly 6 times as much DNA is fixed. I understood.
[0051]
[Example 3]
A hydrogenated amorphous carbon film having a film thickness of 30 nm was formed on the slide glass by the same method as in Example 1, and then the surface of the hydrogenated amorphous carbon film was irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 254 nm in the atmosphere. A UV transilluminator was used for ultraviolet irradiation.
[0052]
FIG. 6 is a graph showing the relationship between the measurement result of the water contact angle on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film irradiated with ultraviolet rays and the ultraviolet irradiation time, and FIG. 7 shows the reflection FTIR ( It is a figure which shows the analysis result by Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Fourier transform infrared spectroscopy. As can be seen from the graph of FIG. 6, the longer the ultraviolet irradiation time, the smaller the water contact angle on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film, and the more hydrophilic it became. Further, as shown in FIG. 7, the analysis result by reflection FTIR of the surface of the hydrogenated amorphous carbon film irradiated with ultraviolet rays has a wave number of 1710 cm. -1 A peak that appears in the vicinity and belongs to the C═O bond, and a wave number of 2966 cm -1 A peak appearing in the vicinity and belonging to the C—H bond is clearly recognized. The other peaks are due to light absorption caused by the underlying slide glass. From these results, on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film subjected to ultraviolet irradiation, -CH as shown in FIG. 2 And -CH 3 It was found that the film surface terminated with hydrogen was substituted with an aldehyde group (O═C—H). In such an aldehyde group, the C—H bond existing on the surface of the hydrogenated amorphous carbon film is cleaved by ultraviolet irradiation, and the site activated by breaking this bond reacts with oxygen or water present in the atmosphere. It is thought that it was introduced by doing. For this reason, by irradiating the surface of the hydrogenated amorphous carbon film with ultraviolet rays, aldehyde groups are introduced to the film surface, the water contact angle is reduced, and hydrophilicity is exhibited. In addition, the longer the irradiation time of ultraviolet rays on the film surface, the higher the density of aldehyde groups present on the film surface, and the more hydrophilic the film surface becomes.
[0053]
Next, a glass plate is prepared by coating the slide glass with the hydrogenated amorphous carbon film having a thickness of 30 nm by the same method as in Example 1, and the hydrogenated amorphous carbon film on the glass plate is coated with the above-described film. By applying ultraviolet irradiation for 180 minutes, aldehyde groups were introduced on the film surface. The water contact angle at the film surface of the hydrogenated amorphous carbon film having aldehyde groups introduced in this way was 60 °. On this glass plate, as in Example 1, DNA spot treatment, rehydration treatment, UV cross-linking treatment, and blocking treatment were sequentially performed. The amount of immobilized DNA was measured by quantitatively measuring the amount of fluorescence labeled with the plasmid as in Example 1. A fluoro imager was used to detect the amount of fluorescence. As a result, assuming that the fluorescence intensity when using the glass plate targeted in Example 1, that is, the glass plate coated with polyaspartic acid, is 1, the hydrogenated amorphous carbon film is coated on the slide glass and irradiated with ultraviolet rays. When using a glass plate into which an aldehyde group was introduced, the fluorescence intensity ratio was found to be 10, and it was found that nearly 10 times as much DNA was fixed.
[0054]
[Example 4]
Using the plasma CVD apparatus in Example 1, a hydrogenated amorphous carbon nitride film was formed. Gas used in plasma CVD is He, CH 4 , H 2 , NH 3 And 13.56 MHz RF (high frequency) was applied to the cathode electrode. Introduction of N is NH 3 In addition to monomethylamine (CH 3 NH 2 CNH type such as) is also possible. Similarly to Example 1, the ground electrode was floated (not grounded), and 400 kHz power was applied to the ground electrode so that ion bombardment on the slide glass could be performed.
[0055]
When the moving speed of the ground electrode was 1.5 mm / second, the film thickness of the hydrogenated amorphous carbon nitride film formed on the slide glass was 30 nm.
[0056]
Under the above conditions, the moving speed of the ground electrode was adjusted to form a hydrogenated amorphous carbon nitride film having a thickness of 300 nm. In this hydrogenated amorphous carbon nitride film, the light transmittance at a wavelength of 500 nm to 5000 nm was measured in the same manner as in Example 1. As a result, it was found that the film had a transmittance of 85% or more in the same wavelength region. Showed sex. Furthermore, as a result of measuring an infrared absorption spectrum by FTIR, 3300 cm -1 Absorption due to stretching vibration of amino group in the vicinity and 2800 to 3000 cm -1 A peak due to the stretching vibration of the methyl group was obtained in the vicinity. From the result of this FTIR spectrum, it was found that the surface was hydrogen-terminated by an amino group and a secondary amine.
[0057]
Similar to FIG. 2, the Raman spectrum results in the appearance of a large fluorescence background characteristic of the soft film having a polymer structure, and the size of the carbon cluster is expected to be about several nanometers.
[0058]
Further, when the hydrogen concentration in the hydrogenated amorphous carbon nitride film was measured by an elastic recoil detection method (ERDA), it was found to be 30 to 40 atomic%.
[0059]
As a result of the above light transmittance (including FTIR), Raman spectrum, and ERDA analysis, the hydrogenated amorphous carbon nitride film has a carbon cluster in the film structure of several nanometers, and the end of the cluster (including the surface) -N-H 2 Or -N-HR (where R is an alkyl group and CH 3 ) Or -C-H X It was found that (X = 1, 2, 3). In this experiment, CH 4 / NH 3 Surface NH by changing the ratio x (Hydrophilic group) / C-H x The (hydrophobic group) ratio can be changed. Thereby, the contact angle of the surface can be arbitrarily changed over 10 ° to 90 °.
[0060]
The amino group was directly introduced without introducing the amino group on the surface by multistage treatment such as chloride group and amino group as shown in Example 1. In the same manner as in Example 1, the slide glass was immersed in a divalent carboxylic acid solution for 1 hour, and then the solution on the surface of the slide glass was removed by centrifugal drying at 500 rpm. The slide glass was dried in a vacuum oven at 50 ° C. for 30 minutes. As a result, one carboxyl group was amide-bonded to the amino group surface, and the outermost surface was substituted with a carboxyl group.
[0061]
In the same manner as in Example 1, this glass slide was sequentially subjected to DNA spot treatment, rehydration treatment, UV cross linking treatment, and blocking treatment. The amount of immobilized DNA was measured by quantitatively measuring the amount of fluorescence labeled with the plasmid in the same manner as in Example 1. FluoroImager (Molecular Dynamics) was used to detect the amount of fluorescence. As a result, assuming that the fluorescence intensity when using the glass plate targeted in Example 1, that is, the glass plate coated with polyaspartic acid, is 1, the hydrogenated amorphous carbon film is coated on the slide glass substrate, When a glass plate subjected to chemical treatment for substitution was used, it was found to be 10 and it was found that nearly 10 times as much DNA was fixed.
[0062]
【The invention's effect】
As described in detail above, according to the present invention, nucleic acids such as DNA can be stably immobilized on the membrane surface efficiently and with high reproducibility.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the results of light transmittance at a wavelength of 500 nm to 2500 nm of a hydrogenated amorphous carbon film, with the horizontal axis representing wavelength and the vertical axis representing light transmittance.
FIG. 2 is a graph showing the results of light transmittance at a wavelength of 2500 nm to 5000 nm of a hydrogenated amorphous carbon film, with the horizontal axis representing wavelength and the vertical axis representing light transmittance.
[Fig. 3]
FIG. 4 is a graph showing the hydrogen concentration in the film by ERDA, with the horizontal axis representing the film depth and the vertical axis representing the hydrogen concentration.
FIG. 5 (a) is a graph showing the relationship between plasma irradiation time and water contact angle, and FIG. 5 (b) is a graph showing the relationship between C / N composition ratio on the film surface and water contact angle. It is.
FIG. 6 is a graph showing the relationship between ultraviolet irradiation time and water contact angle.
FIG. 7 shows wave numbers on the horizontal axis and absorbance on the vertical axis, with wave numbers of 800 to 4000 cm. -1 It is a graph which shows the reflection FTIR result in.
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