JP2002209576A - イソマルチフロレノールシンターゼおよび該酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】イソマルチフロレノールシンターゼをコードす
るDNAをクローン化し、その塩基配列を決定し、更にク
ローン化した組換えDNAを発現させた細胞を用いてイソ
マルチフロレノールシンターゼ、該酵素をコードするDN
Aおよびイソマルチフロレノールおよび／またはこのイ
ソマルチフロレノールから生合成される各種テルペノイ
ドを製造することを課題とする。 【解決手段】イソマルチフロレノールシンターゼおよび
該酵素遺伝子を用いて、イソマルチフロレノールおよび
／またはイソマルチフロレノールから生合成される各種
トリテルペンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はイソマルチフロレノ
ールの生合成酵素であるイソマルチフロレノールシンタ
ーゼ、該酵素をコードするDNAおよびイソマルチフロレ
ノールおよび／またはこのイソマルチフロレノールから
生合成される各種テルペノイドを製造する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ブリオノール酸は、トリテルペノイドに
分類される植物二次代謝産物の一種で、ウリ科ヘチマ属
植物のヘチマ(Luffa cylindrica Roem.)、カラスウリ属
植物のキカラスウリ(Trichosanthes kirilowii var. ja
ponica)、スイカ属植物のスイカ(Citrullus lanatus)、
ブリオニア属植物のブリオニア・ディオイカ(Bryonia d
ioica)などウリ科植物の根に含有されていることが明ら
かになっている。ブリオノール酸およびその誘導体は他
の植物由来のトリテルペノイドとは異なった構造を有し
ており、他にはない生理活性を持つことが期待されると
ともに、医薬用の原料としても注目されている。

【０００３】しかしながら、ブリオノール酸およびその
誘導体を製造する場合、植物体を原料として用いる場合
は、栽培に多額のコストがかかるとともに、その生産性
は極めて低いものとならざるを得ない。そのため、ヘチ
マの細胞培養によるトリテルペノイドの生産に関する研
究がなされ、ヘチマのカルスがブリオノール酸およびそ
の誘導体を生産することを報告している[Plant and Cel
l Physiology 25,1571-1574(1984); Organic Magnetic
Resonance 22,93-100(1984)]。また、ブリオノール酸の
生合成経路についても幾つか研究がなされており、メバ
ロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクワレン
が環化することにより生成したイソマルチフロレノール
が生合成前駆体と考えられ、生成したイソマルチフロレ
ノールが酸化されることでブリオノール酸が生成するも
のと考えられる。天然には90以上の異なったタイプのト
リテルペン骨格が存在すると言われており、２，３−オ
キシドスクワレンを環化するβ―アミリンシンターゼ、
ルペオールシンターゼなど幾つかのトリテルペン合成酵
素が知られている[Eur. J. Biochem. 256 ,238-244 (19
98) ; Eur. J. Biochem. 266 ,302-307 (1999)]。しか
し、２，３−オキシドスクワレンからブリオノール酸の
前駆体であるイソマルチフロレノールの生成を触媒する
イソマルチフロレノールシンターゼに関する研究はなさ
れていなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、イソマルチ
フロレノールシンターゼをコードするDNAをクローン化
し、その塩基配列を決定し、更にクローン化した組換え
DNAを発現させた細胞を用いてイソマルチフロレノール
シンターゼ、該酵素をコードするDNAおよびイソマルチ
フロレノールおよび／またはこのイソマルチフロレノー
ルから生合成される各種テルペノイドを製造することを
目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、カンゾウのβ―アミリンシンターゼcDNAをプロ
ーブとしてヘチマ培養細胞のcDNAをスクリーニングし、
１種類のオキシドスクワレン環化酵素cDNAをクローニン
グした。本cDNAの全長のORFを酵母発現ベクターに組込
み、ラノステロールシンターゼを欠く酵母に形質転換し
て機能解析をした結果、該酵母において本来生合成され
ないイソマルチフロレノールの生産が認められたことか
ら、本cDNAがイソマルチフロレノールシンターゼをコー
ドしていることを確認した。

【０００６】すなわち、本発明の第１の態様は、イソマ
ルチフロレノールシンターゼの酵素活性を有するポリペ
プチドおよび／または配列番号１に記載のアミノ酸配列
を含むポリペプチドである。また、第２の態様は、イソ
マルチフロレノールシンターゼ酵素活性を有するポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAおよび
／または配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAであ
り、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むDNAが
挙げられる。本発明の第３の様態は、第１の様態に記載
のDNAを含むベクターである。本発明の第４の様態は、
上記ベクターで形質転換された細胞である。また、本発
明の第５の様態は、上記形質転換細胞を用いて、植物二
次代謝産物を製造する方法である。この植物二次代謝産
物はイソマルチフロレノールから生合成されるテルペノ
イドであってもよい。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、ブリオノール酸の生産性が高いヘチマ培
養細胞よりcDNAライブラリーを作成し、カンゾウのβ―
アミリンシンターゼ(GgbAS1) cDNAをプローブとしてス
クリーニングを行い、１種類のオキシドスクワレン環化
酵素cDNAをクローニングした。得られたcDNAの全長ORF
を酵母発現ベクター(pYES2)に組み込み、ラノステロー
ルシンターゼを欠く酵母(GIL77)に形質転換して機能解
析をした結果、本cDNAがイソマルチフロレノールシンタ
ーゼをコードしていることが確認された。新規に得られ
たイソマルチフロレノールシンターゼのアミノ酸配列は
プローブとして用いたカンゾウのβ―アミリンシンター
ゼとは67％の相同性があったが、既知のクローンの中に
これ以上高い相同性のものは認められなかった。

【０００８】本発明に係るイソマルチフロレノールシン
ターゼとは、２，３−オキシドスクワレンからイソマル
チフロレノールを生成する反応を触媒する酵素を指して
おり、その起源は特に限定されないが、好ましくは植物
由来であり、そのようなものとしてたとえば以下の実施
例に記載のものを挙げることが出来る。

【０００９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ ヘチマ培養細胞株の作成および培養 ヘチマ(Luffa cylindrica)の種子を無菌処理し、無菌発
芽させた実生から子葉および茎の切片を切り取り、これ
を2,4-Dを10^-6Mとなるように添加したリンスマイヤー・
スクーグ（LS）の寒天培地に移植し、27℃暗所下で培養
した。5-7週間後に得られたヘチマのカルスを2,4-Dを10
^-7Mになるように添加したLSの液体培地に移植し、27
℃、暗所にて振盪培養を行い、3年間以上継代培養を行
った後、この細胞を2,4-DをNAAに変更したLSの液体培
地、27℃、暗所下で継代培養を行った。

【００１０】実施例２ cDNAライブラリーの作成 このようにして得られた培養10日目のヘチマ細胞から、
グアニジンチオシアネート／ホットフェノール法により
全RNAを抽出し、更にｍRNA精製キット（Pharmacia製）
を用い、製造者の説明書に従ってPoly(A)⁺RNAを精製し
た。精製したPoly(A)⁺RNAを用い、ZAP-cDNA合成キット
（Stratagene製）を用いて製造者の説明書に従ってヘチ
マcDNAライブラリーを作成した。

【００１１】実施例３ プローブの作成 イソマルチフロレノールシンターゼのクローニングに用
いるプローブにはG.glabra由来のGgbAS1β-アミリンシ
ンターゼのアミノ酸残基353-729に相当する1227-bpジオ
キシゲニン（DIG）ラベルDNAプローブを用いた。本プロ
ーブは、GgbAS1をテンプレートとし、配列番号２および
配列番号３に示す２種のプライマー、TaqDNAポリメラー
ゼ、DIG-dNTPミクスチャーを用いて製造者の説明書に従
い、PCR法により調製した。

【００１２】実施例４ cDNAライブラリーのスクリーニ
ング このようにして調製したDIGラベルプローブを用いてヘ
チマcDNAライブラリーを低ストリンジェンシー条件下で
スクリーニングした結果、cDNAライブラリーの200,000
プラークから陽性クローンを１種取得し、pBluescript
SK(-)ベクターにサブクローニングした。このクローン
を両ストランド共にシークエンスした結果、本クローン
は2277塩基からなるオープンリーディングフレーム(OR
F)を含む2551塩基からなり、分子量87.7kDの759アミノ
酸からなる翻訳産物ポリペプチドが想定された。cDNA配
列中には、既知のオキシドスクワレン環化酵素配列中に
繰り返し認められるQWモチーフ[Trends Biochem. Sci.
19 ,157-158 (1994)]やオキシドスクワレン環化酵素の
活性部位であることが指摘されているDCTAEモチーフ[J.
Biol. Chem. 269 ,802-804 (1994)]が存在した。

【００１３】実施例５ 機能確認 実施例４で得られたcDNAの機能を明らかにするため、得
たcDNAのORFをPCRにより増幅し、酵母での発現プラスミ
ドpYES2(Invitrogen社)に組込んだ。PCRは得られたcDNA
を鋳型とし、配列番号４と配列番号５で示される塩基配
列のプライマーを用い、94℃で40秒間のディネーチャ
ー、50℃で40秒間のアニール、72℃で２分間の伸長反応
を1サイクルとし、25サイクル反応させた。得られたPCR
産物は制限酵素KpnIとXbaIで処理し、発現プラスミドpY
ES2のKpnIとXbaIサイトに組込み、これをpYES2-LcOSC3
とした。これによりLcOSC3はGAL1プロモーターの下流に
センス方向に導入される。更に得られたpYES2-LcOSC3プ
ラスミドをラノステロール合成酵素欠損株である酵母変
異株GIL77に酢酸リチウム法により導入した。培養条
件、がラクトースによる発現誘導、トリテルペンモノア
ルコール画分の調整方法はKushiro,T. et al.文献に記
載されている方法と同様に行った[Eur. J. Biochem.25
6, 238-244(1998)]。ガラクトースによる発現誘導後、
形質転換酵母から生成物を抽出し、TLCにより精製後、
トリテルペンモノアルコール画分をLC-MS/MSにより分析
した。LC-MS/MＳは以下に示すHPLC条件下、LCQ(Thermo
Quest)で測定した。 （HPLC条件） Column: SUPER-ODS(diameter: 4.6mm, length: 200mm;
Tosoh製) Solvent system: 95% CH₃CN aq.、Flow rate: 1ml/mi
n、Column temp.: 40℃、Detection: UV205nm、Retenti
on time for isomultiflorenol: 23.9min. 標準品イソマルチフロレノールのMS/MSフラグメントパ
ターンとの比較から、LC-MS/MSにより同定したトリテル
ペンモノアルコール画分から得られたピークはイソマル
チフロレノールであり、本画分から得られた化合物はイ
ソマルチフロレノールのみであった（図１）。尚、イソ
マルチフロレノールのMSおよびMS/MS分析の結果、MS m/
z 409[M+H-H₂O]⁺、MS/MS (precursor ion at m/z 409)
353(10%),313(22%), 299(57%), 245(65%), 231(91%), 2
17(100%), 191(71%)の結果を得た。よって本cDNAは、高
等植物から得られたオキシドスクワレン環化酵素の１つ
に位置づけられるイソマルチフロレノールシンターゼ
（IMS1）をコードしているものと結論づけた。

【００１４】ヘチマ由来の３種オキシドスクワレン環化
酵素、シクロアルテノールシンターゼ（CAS1）[Plant P
hysiol. 121,1384 (1999)]、機能不明であるオキシドス
クワレン環化酵素（OSC2）[Plant Physiol. 122,1457
(2000)]、イソマルチフロレノールシンターゼ（IMS1）
のアミノ酸配列を比較した結果、IMS1のアミノ酸配列は
CAS1と51％、OSC2と50％の相同性を示した（図２）。更
にIMS1のアミノ酸配列と高等植物からクローン化された
オキシドスクワレン環化酵素のアミノ酸配列から系統樹
を作成した（図３）。IMS1はβ−アミリンシンターゼと
67-66％の相同性、ルペオールシンターゼと61-57％の相
同性を示した。IMS1のアミノ酸配列は他のトリテルペン
シンターゼと67-57％の低相同性であったことから、イ
ソマルチフロレノールシンターゼはウリ科植物に認めら
れる新しいクラスのトリテルペンシンターゼに分類され
る。

【００１５】実施例６ ノーザンブロット分析 DIGラベルRNAプローブはBamHI処理CAS1、EcoRI処理OSC
2、BamHI処理IMS1からT7RNAポリメラーゼおよびDIG RNA
Labeling Mix (Roche Diagnostic製)を用いて製造者の
説明書に従って調製した。全RNAはExtract-A-Plant^TM R
NA Isolation Kit(Clontech製)を用いて抽出した。レー
ン当たり５μgの全RNAをホルムアルデヒド含有１％アガ
ロースゲルで分離し、正電荷ナイロンメンブラン（Roch
e Diagnostic製）にブロットした。メンブラン上のRNA
を、50mM Na-Pi buffer(pH7.0)、50% ホルムアミド、0.
1% N-ラウリルサルコシン、7% SDS、5xSSC、1mg/ml tRN
A(yeast)、blocking reagentを含むハイブリダイゼーシ
ョンバッファー中50℃で、DIGラベルRNAプローブを用い
てハイブリダイズし、DIG Nucleic Acid DetectionKit
Mix (Roche Diagnostic製)を用いて製造者の説明書に従
って検出した（図４）。

【００１６】実施例７ 細胞増殖およびブリオノール酸
生産のタイムコース 培養開始日後4、8、12、16、20、24日目の細胞増殖およ
びブリオノール酸の生産の経時変化を示した（図５）。
ブリオノール酸の定性分析は以下の方法で行った。培養
終了後の細胞を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥細胞50mg
から酢酸エチル2mlを用いて60℃、１時間の撹拌抽出を2
回行った。得られた抽出液に内部標準としてコレステロ
ール1mgを添加し、ロータリーエバポレーターを用いて
溶媒を流去した後、乾燥サンプルをピリジン20(l、N,O-
ビストリメチルシリルアセトアミド20(lからなる混合溶
媒に再溶解し、50℃、１時間インキュベートした。反応
後の液1(lを以下に示す条件下、ガスクロマトグラフィ
ーにより分析し、ブリオノール酸の定量を行った。ブリ
オノール酸の定量は内部標準のTMSi誘導体のピーク面積
から算出した。 （ガスクロマトグラフィー分析条件） Column: Ultra Alloy⁺-17 capillary column (15m x 0.
5mm i.d., film thickness: 1(l, Frontier Lab Ltd.
製)、Column temp.: 295℃(isothermal)、 injector an
d detector temp.: 320℃、Carrier gas: He 3.5ml/mi
n。 ヘチマ培養細胞によるブリオノール酸の生産は対数増殖
期の後期から立ち上がる。ブリオノール酸生産のタイム
コースとIMS1のmRNAレベル、CAS1のmRNAレベル、OSC2の
mRNAレベルを比較した結果、ヘチマ細胞内で３種のオキ
シドスクワレン環化酵素のmRNAレベルは異なった制御を
受けていた（図６）。イソマルチフロレノールシンター
ゼmRNAレベルは培養16日目、20日目で最も高く、この時
点でブリオノール酸合成活性は非常に高い。ところが
4、8、24日目ではイソマルチフロレノールシンターゼmR
NAレベルは低く、この時点ではブリオノール酸生産はさ
ほど顕著には認められない。一方、シクロアルテノール
シンターゼmRNAレベルは4、8日目で高く、この時点では
細胞の増殖が顕著に認められる。そして対数増殖期の後
期ではmRNAレベルはより低いレベルとなっている。ま
た、オキシドスクワレン環化酵素と推定されるOSC2のmR
NAレベルは20、24日目で高く、この時点では細胞は既に
安定期に入っている。

【００１７】

【発明の効果】以上記載の如く、イソマルチフロレノー
ルシンターゼをコードするDNAのクローン化に初めて成
功し、更にクローン化した組換えDNAを発現させた細胞
を用いてイソマルチフロレノールシンターゼ、該酵素を
コードするDNAおよびイソマルチフロレノールおよび／
またはこのイソマルチフロレノールから生合成される各
種テルペノイドを製造することが可能である。

【００１８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUI CHEMICALS, INC <120> A isomultiflorenol synthase and a gene encodes the isomultiflorenol synthase <130>31010005 <160>5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2551 <212> DNA <213> Luffa cylindrica <220> <221> CDS <222> (130)..(2409) <400> 1 gttaggtata aattaaaagt cctcctcctc cctccacagc cggccatgaa caactagctt 60 agattaagtt tattatgatt tgagaatata ggttggtggg taaagacgat tgagttgagg 120 tgattgatc atg tgg agg ctt aag gta gca gat ggg gga aat gac ccc tac 171 Met Trp Arg Leu Lys Val Ala Asp Gly Gly Asn Asp Pro Tyr 1 5 10 atc tat tcc atg aac aac ttc ata gga agg caa ata tgg gag ttc gat 219 Ile Tyr Ser Met Asn Asn Phe Ile Gly Arg Gln Ile Trp Glu Phe Asp 15 20 25 30 cca aat gct ggc acc ccc gaa gag cga gca gaa att gaa cgc ctc cgt 267 Pro Asn Ala Gly Thr Pro Glu Glu Arg Ala Glu Ile Glu Arg Leu Arg 35 40 45 cac cat ttc acc aaa aac cgt cac aag ggt ttt cct agc gcc gat ttg 315 His His Phe Thr Lys Asn Arg His Lys Gly Phe Pro Ser Ala Asp Leu 50 55 60 ctt tgg cgt gtc cag ctt ctg 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Met Glu Pro Glu Arg 495 500 505 510 ttc tac gat gct gtc aat gtc att cta aat atg caa agc aaa aac ggg 1707 Phe Tyr Asp Ala Val Asn Val Ile Leu Asn Met Gln Ser Lys Asn Gly 515 520 525 ggt ttg cca gct tgg gag cca gcg tca agt tac tac tgg atg gag tgg 1755 Gly Leu Pro Ala Trp Glu Pro Ala Ser Ser Tyr Tyr Trp Met Glu Trp 530 535 540 ttg aat cca gtg gaa ttt ctt gaa gac cta atc atc gag cac cag cat 1803 Leu Asn Pro Val Glu Phe Leu Glu Asp Leu Ile Ile Glu His Gln His 545 550 555 gtg gag tgc acc tca tct gcg ttg cag gcg ata ctc tta ttt agg aaa 1851 Val Glu Cys Thr Ser Ser Ala Leu Gln Ala Ile Leu Leu Phe Arg Lys 560 565 570 caa tac cca gga cat aga aga aaa gaa atc aat aat ttc atc aac aag 1899 Gln Tyr Pro Gly His Arg Arg Lys Glu Ile Asn Asn Phe Ile Asn Lys 575 580 585 590 gcc gtt caa ttt ctt caa gac ata caa ctg cca gat ggg tct tgg tat 1947 Ala Val Gln Phe Leu Gln Asp Ile Gln Leu Pro Asp Gly Ser Trp Tyr 595 600 605 gga aat tgg gga att tgc tat act tat gga acg tgg ttt gca ctt aag 1995 Gly Asn Trp Gly Ile Cys Tyr Thr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Leu Lys 610 615 620 gca ttg tcg atg gca ggg aag acg tat gaa aat tgt gag gca gtt cgg 2043 Ala Leu Ser Met Ala Gly Lys Thr Tyr Glu Asn Cys Glu Ala Val Arg 625 630 635 aaa ggt gcg aat ttt cta aga aaa ata cag aat cca gaa gga ggg ttt 2091 Lys Gly Ala Asn Phe Leu Arg Lys Ile Gln Asn Pro Glu Gly Gly Phe 640 645 650 gga gag agc tac ttg tca tgt cct tat aag aga tat ata ccg ctg gat 2139 Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Pro Tyr Lys Arg Tyr Ile Pro Leu Asp 655 660 665 670 ggg aaa cga tca aat ttg gtg caa acg gca tgg ggt atg atg ggt ttg 2187 Gly Lys Arg Ser Asn Leu Val Gln Thr Ala Trp Gly Met Met Gly Leu 675 680 685 ata tgt gca gga cag gca gat gta gat ccc act cct att cat cgt gca 2235 Ile Cys Ala Gly Gln Ala Asp Val Asp Pro Thr Pro Ile His Arg Ala 690 695 700 gcc aag ttg ttg atc aat tct caa acg gaa gat ggt gat ttt cct caa 2283 Ala Lys Leu Leu Ile Asn Ser Gln Thr Glu Asp Gly Asp Phe Pro Gln 705 710 715 gag gaa att act gga gaa ttc ttc aaa aat tgt aca tta cac ttt gca 2331 Glu Glu Ile Thr Gly Glu Phe Phe Lys Asn Cys Thr Leu His Phe Ala 720 725 730 gca ttt agg gaa gtc ttt cct gtg atg gcg ttg gga gaa tat tgt aac 2379 Ala Phe Arg Glu Val Phe Pro Val Met Ala Leu Gly Glu Tyr Cys Asn 735 740 745 750 aag gtt ccg ttg cct tct aag aaa aaa tag taaattaaga ttggagactt 2429 Lys Val Pro Leu Pro Ser Lys Lys Lys 755 760 ttactcttca ataatcttta aacggtcacg tgtaatataa taactttttt tttttttttt 2489 ttttgaaaag acgtgtagta taatactaaa caaaaggtaa tcgagcacaa cttttaattc 2549 cc 2551 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Forward primer for PCR to make a DIG-labelled DNA probe (GgbAS1) <400> 2 gaagcatatc cactatgaag atga 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Reverse primer for PCR to make a DIG-labelled DNA probe (GgbAS1) <400> 3 tgaatactcc cgtgatttcc tgttg 25 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Forward primer for PCR (IMS1) <400> 4 ctggtaccga ttgagttgag gtgattg 27 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Reverse primer for PCR (IMS1) <400> 5 cctctagagt aaaagtctcc aatc 24

【図面の簡単な説明】

【図1】標準品イソマルチフロレノールとpYES2-OSC3形
質転換酵母抽出物のHPLCクロマトグラムおよびLC-MS/MS
フラグメントを比較した図である。

【図2】CAS1、OSC2、IMS1のアミノ酸配列の比較した図
である。相同なアミノ酸を白文字反転で示した。

【図3】高等植物由来オキシドスクワレン環化酵素のア
ミノ酸配列から作成した系統樹である。方法：UPGMA (G
enetyx software）。bAS,β-アミリンシンターゼ；LUS,
ルペオールシンターゼ；IMS,イソマルチフロレノールシ
ンターゼ；CAS,シクロアルテノールシンターゼ；CDS,ク
クルビタジエノールシンターゼ；OSC,オキシドスクワレ
ン環化酵素。

【図4】CAS1,OSC2,IMS1の制限酵素サイトおよびDIGラベ
ルRNAプローブ部位を示す図である。

【図5】細胞増殖およびブリオノール酸生産のタイムコ
ースを示す図である。

【図6】ヘチマ細胞培養時のIMS1 mRNA、CAS1 mRNA、OSC
2 mRNA量の変化を示した電気泳動図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 7/40 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｐ 7/40 (Ｃ１２Ｎ 9/00 // Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/00 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/40 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 7/02 (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 7/02 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 池城 安正 新潟県新潟市上新栄町５−13−２ 新潟薬 科大学内 (72)発明者 矢崎 一史 京都府京都市左京区北白川追分町 京都大 学大学院内 (72)発明者 田中 重雄 東京都世田谷区桜丘１−１−１ 東京農業 大学内 (72)発明者 渋谷 雅明 東京都文京区本郷７−３−１ 東京大学大 学院内 (72)発明者 海老塚 豊 東京都文京区本郷７−３−１ 東京大学大 学院内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA17 CA19 CB03 CD02 CD06 CD09 CD17 4B024 AA03 AA08 BA07 CA04 CA09 CA11 DA01 DA12 EA04 FA02 GA11 GA17 GA19 HA12 4B050 CC03 DD13 LL05 4B064 AC14 AD49 BH07 CA06 CA11 CA19 CC24 CE08 DA16 4B065 AA72X AA88Y AA89X AB01 BA02 BD16 CA05 CA10 CA27 CA53 CA60

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】イソマルチフロレノールシンターゼ活性を
   有するポリペプチド。
2. 【請求項２】配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポ
   リペプチド。
3. 【請求項３】請求項１記載のポリペプチドをコードする
   ヌクレオチド配列を含むDNA。
4. 【請求項４】請求項２記載のポリペプチドをコードする
   ヌクレオチド配列を含むDNA。
5. 【請求項５】配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含
   むDNA。
6. 【請求項６】配列表の配列番号１の１３０〜２４０９番
   目のヌクレオチド配列を含む請求項５記載のDNA。
7. 【請求項７】請求項３〜６のいずれか一項に記載のDNA
   を含むベクター。
8. 【請求項８】請求項７に記載のベクターで形質転換され
   た細胞。
9. 【請求項９】請求項８記載の細胞を用いて、イソマルチ
   フロレノールシンターゼの酵素活性を有するポリペプチ
   ドを製造する方法。
10. 【請求項１０】請求項８記載の細胞を用いて植物二次代
    謝産物を製造する方法。
11. 【請求項１１】植物二次代謝産物がイソマルチフロレノ
    ールから生合成されるテルペノイドである請求項１０記
    載の方法。