JP2002204695A - ヒト前立腺特異的還元酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 前立腺癌の一層特異的かつ高感度な診断のた
めの手段を提供する。 【解決手段】 ヒト前立腺特異的還元酵素ポリペプチド
およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド、および組換え技術によってそのようなポリペプ
チドを調製する方法。このようなポリヌクレオチドを前
立腺癌の診断マーカーとしておよび前立腺癌が転移して
いるかどうかを決定する試薬として利用する方法。前立
腺癌細胞を標的とし前立腺癌ワクチンの位置部として使
用するヒト前立腺特異的還元酵素ポリペプチドに特異的
な抗体。該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニ
ストのスクリーニング方法および該アンタゴニストの治
療的使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規に同定されたポ
リヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコ
ードされたポリペプチドおよびそのようなポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドを前立腺癌の存在および前立腺
癌の転移を検出するための診断アッセイの一部として使
用することに関する。本発明のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドはヒト前立腺特異的還元酵素であり、以後
時に「ＰＳＲ」として称する。

【０００２】

【従来の技術】前立腺の癌腫は多様な処置の結果を評価
することにおける健全な治療決定を非常に困難にする予
測不能の疾患として長い間考えられてきた。前立腺癌は
潜在的致死性ヒト悪性腫瘍の間では、癌として認識可能
な組織的変化の広範な普及と臨床的疾患の非常に低い普
及といった広範な矛盾がある点で独特である。前立腺の
アデノカルシノーマは潜伏性および臨床的形態に存在す
るという概念は疫病学的、病理学的および臨床的証拠に
より支持されている。前立腺癌のこれらの多様な兆候は
構造および細胞学的特徴にあるが、それらは互いに障害
の量、程度および侵入程度のようなある種の病理学的特
徴によりある程度まで区別されることができる。

【０００３】前立腺癌は米国人男性の間で最もありふれ
ている癌であり、唯一肺癌のみが該癌より癌による死亡
が高い（ボーリング（Boring, C. C.）、Cancer Statis
tics、４１：１９−３６（１９９１））。年齢特異的な
死亡率は過去５０年をかけてゆっくりと増加しており、
米国黒人男性においては白人男性においてみられる率の
ほぼ２倍である（カーター（Carter, H. B.）、Prostat
e、１６：３９−４８（１９９０））。前立腺癌は５５
歳より高齢の男性における死亡全体のほぼ３％である
（ジードマン（Seidman, H.）ら、Probabilities of Ev
entually Developing or Dying of Cancer-United Stat
es、３５：３６−５６（１９８５））。前立腺癌の発生
は他の癌より年齢と共により一層急速に増加し、米国人
男性の平均年齢が上昇しているので、前立腺癌を罹患し
ている患者数はこれからの１０年間で劇的に増加すると
予期される。

【０００４】前立腺癌の男性の約３０％は診断時に遠位
に転移が見られる（シュミット（Schmidt, J. D.）ら、
J. Urol.、１３６：４１６−４２１（１９８６）。ホル
モン操作（アンドロゲン除去）に対する印象的な症状の
応答にもかかわらず、これらの患者の生存率はみじめな
ものである：その生存期間の中央値は３年より短い（ア
イアー（Eyar, D. P.）、ウロロジック・パソロジー（Ur
ologic Pathology）：ザ・プロステート（The Prostat
e）、フィラデルフィア、ＰＡ、リー・アンド・フェビ
ガー（Lea and Febiger）、２４１−２６７（１９７
７））。５年間までに７５％を越える人々が、１０年間
までに９０％を越える患者がその癌により死亡している
（シルバーバーグ（Silverberg, E.）、Cancer、６０：
６９２−７１７（１９８７）（Suppl.））。

【０００５】前立腺癌に伴う問題は、前立腺癌の多くの
形態が潜在性であること、言い換えると、検出が困難で
あることである。前立腺癌の臨床症状が全くない５０歳
を越える男性のうちの約３０％には前立腺内に癌を宿し
ている（マクニール（McNeal, J. E.）ら、Lancet Janu
ary、１１：６０−６３（１９８６））。この剖検にお
ける前立腺癌の顕著に高い普及はその他の器官において
見られず、それにより人類において最も共通の悪性腫瘍
とさせている（ドーム（Dhom, G.）、J. Cancer Res. C
lin. Oncol.、１０６：２１０−２１８（１９８
３））。潜在的な癌が、完全な悪性腫瘍発現にすべてで
はないにせよ、いくつかの段階を通して進行するという
前立腺癌の病理発生における多段階プロセスの概念は強
く支持されている（アッター（Utter, H. B.)ら、J. Ur
ol.、１４３：７４２−７４６（１９９０）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前立腺癌の初期決定お
よび特徴付けに関する多様な技術はあるが、しかしなが
ら、それらのうちのひとつもいかなる問題を解決してい
ない。前立腺癌は殆ど初期症状がない悪評高い無症状疾
患である。襄排出障害に関する症状は５０歳を越える男
性に共通に見られるものであり、しばしば良性の前立腺
過形成（ＢＰＨ）のためである。

【０００７】直腸内指診検査（ＤＲＥ）は伝統的に前立
腺癌の検出の最も正確な試験であると認識されている。
ＤＲＥは他の利用可能な多様な研究試験より、一層感度
が高く、一層特異的であり、ついで利用できる実験室で
の多様な試験より一層有効性を有するものであると示さ
れているが、しかしながらこれらの研究試験のうちで今
日使用されるものは殆どない（ギナン（Guinan, P.）
ら、N. Engl. J. Med．、３０３：４９９−５０３（１
９８０））。ＤＲＥにより検出される癌は比較的末期で
あり、ＤＲＥにより推定される癌の大きさと実際に存在
する正確な大きさの間の相関は弱いものでしかない。最
も重大なＤＲＥの限界は、その感度の欠如である（偽陰
性の結果）。例えば、癌を示唆する明瞭な異常が全くな
い患者における良性の前立腺肥大に関して行われた経尿
道的切除の約１０％から２０％は前立腺癌の発生を網羅
していない。スクリーニング研究において見られる２２
のうちのわずか１２をＤＲＥは検出するが、一方で直腸
横断エコー（transrectal ultrasonography）（ＴＲＵ
Ｓ）は２０である（リー（Lee, F.）ら、Radiology、１
６８：３８９−３９４（１９８８））。従って、ＤＲＥ
は比較的感度が低く、非特異的である。触知により検出
された癌は比較的大きく、発達後期であり、もはや治療
不可能であり、いくつかは非常に小さく臨床的に重要で
はない癌である。

【０００８】前立腺癌を有する患者は前立腺特異的抗原
レベルが上昇している。ＰＳＡレベル４.０〜１０.０ng
／mlを有する男性の２６％において癌が検出された。血
清ＰＳＡレベルは一般的に大きさ、臨床的段階、前立腺
癌の病理学的段階に相関を示すが、所定の大きさまたは
段階に関連したＰＳＡ値は広範囲に存在する（ハドソン
（Hudson, M. A.）、J. Urol．１４２：１０１１−１０
１７（１９８９））。しかしながらＰＳＡは個々の患者
において癌の特徴の予兆ではない。ＰＳＡのレベルが１
０.０ng／mlより高いならば、患者のうちの５７％〜９
２％が局所に進行した癌を有するであろう。故に、一層
特異的であり、１０ng／mlより高いＰＳＡレベルを用い
ることは初期検出に有効な技術を提供しない。初期検出
についてこの血清マーカーを使用する他の理論的な制限
が存在する。通常の血清ＰＳＡレベルは癌の診断を排除
しない。偽陰性の結果は共通であり、前立腺癌のために
放射線による前立腺切除で処置した男性の１／３は通常
の血清ＰＳＡレベルを有する。偽陽性の結果もまた、Ｐ
ＳＡレベルがしばしばＢＰＨまたは前立腺炎などの良性
の症状を有する男性において上昇するから共通である。
要約すると、ＰＳＡレベルは前立腺癌の初期検出におい
て非常に有用であり、特にＤＲＥまたはＴＲＵＳと一緒
の場合には有用である。しかしながらＰＳＡレベル検出
は、存在するものが癌であってＢＰＨまたは前立腺炎で
ないことを確実にするためにＤＲＥまたはＴＲＵＳと組
み合わせて使用されなければない。

【０００９】ＴＲＵＳの導入は、前立腺の内部の解剖学
的構造および病理を理解する有効な方法を提供した。Ｔ
ＲＵＳはいくつかの大きな連続において前立腺癌をスク
リーニングするのに使用され、ＤＲＥに比較して検出を
増加することを矛盾なく示す。ＴＲＵＳは骨盤領域のエ
コーを行い、おそらく、前立腺癌の初期検出における最
も重要なＴＲＵＳの使用は前立腺の直接的針生検の指針
としている（リーら、Radiology、１７０：６０９−６
１５（１９８９））。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の一態様により、
宿主由来のサンプル中の特異的な核酸配列の存在を決定
することにより前立腺癌の転移を診断する方法および手
順を提供する。本発明の他の態様により、宿主由来の生
物学的サンプル中のＰＳＲタンパク質のレベルの変化を
決定する（ＰＳＲタンパク質の上昇レベルは前立腺疾患
の診断を示す）ことにより前立腺障害を診断する方法お
よび手順を提供する。本発明の他の態様により、本発明
の前立腺特異的還元酵素遺伝子およびポリペプチドに特
異的にハイブリダイズするのに十分長い核酸分子を有す
る核酸プローブもまた提供する。

【００１１】本発明のさらに別の態様により、前立腺特
異的還元酵素ポリペプチドである新規ポリペプチドなら
びにその生物学的に活性であり診断学的または治療学的
に有用な断片、類似体および誘導体を提供する。本発明
の別の態様によりmＲＮＡs、ＤＮＡs、cＤＮＡs、ゲノ
ムＤＮＡsを含むヒトＰＳＲタンパク質をコードする単
離した核酸分子ならびにその生物学的に活性であり、診
断学的または治療学的に有用な断片、類似体および誘導
体を提供する。本発明のさらに別の態様により、ヒト前
立腺特異的還元酵素核酸配列を含む組換え原核生物およ
び／または真核生物宿主細胞を、該タンパク質の発現を
促進し、ついで該タンパク質を回集する条件下で培養す
ることを含む、組換え技術によりこのようなポリペプチ
ドを産生する工程を提供する。

【００１２】本発明のさらに別の態様により、このよう
なポリペプチドに特異的な抗体を提供する。本発明の別
の態様により、本発明のＰＳＲポリペプチドを用いて化
合物をスクリーニングする方法、例えば該ポリペプチド
と相互作用するアンタゴニストおよび／またはアゴニス
トおよび抗体をスクリーニングする方法を提供する。本
発明のさらに別の態様によりこのようなポリペプチドに
対するアンタゴニストを提供し、例えば前立腺癌の処置
においてこのようなポリペプチドの作用を抑制するのに
使用する。本発明のこれらおよび他の態様は本明細書の
教示から当業者には明らかである。

【００１３】本発明の一態様により、宿主内の前立腺癌
の微小転移（micrometastases）を検出する診断アッセ
イを提供する。本出願人は本発明の論拠を任意の特定の
科学的理論に制限することを望んではないが、宿主の細
胞中のＰＳＲをコードするmＲＮＡの存在は前立腺由来
の他のものより一層、前立腺癌の転移の指標である。こ
れは、ＰＳＲ遺伝子は身体全ての細胞中で見られるが、
そのmＲＮＡへの転写およびコードされたポリペプチド
の発現は正常個体の前立腺に制限される。しかしなが
ら、前立腺癌が存在するならば、前立腺癌細胞は癌から
他の細胞へと移動し、これら他の細胞は積極的にＰＳＲ
遺伝子を転写および発現し、mＲＮＡが存在するように
なる。この細胞中のmＲＮＡまたは発現したタンパク質
の検出は前立腺からのものである他、前立腺癌の転移の
指標である。

【００１４】このような診断アッセイにおいて、前立腺
以外の組織からのサンプル中の核酸配列を増幅して検出
する。そのサンプルには核酸または核酸の混合物を含
み、少なくとも１つのＰＳＲポリペプチドをコードする
配列を含むと考えられるものを含む。従って、例えば、
細胞中の特異的なmＲＮＡの存在を決定するアッセイの
形態において最初にＲＮＡが該細胞から単離される。血
液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの細胞から
得られたサンプル中に特異的な核酸配列が存在すること
を決定する、当該技術分野において良く知られる多数の
方法がある。前立腺以外の細胞から得られたサンプル中
のＰＳＲ遺伝子から転写されたmＲＮＡを検出するアッ
セイの使用は本明細書の教示から当業者の範囲内でよく
行われている。

【００１５】mＲＮＡの単離には、細胞を破壊し、分画
遠心を行うことにより、総細胞ＲＮＡを単離することを
含む。一度総ＲＮＡが単離されると、ｍＲＮＡは、その
３'端にて各真核生物mＲＮＡ分子に実質的に見られるポ
リＡテールとして当業者に知られるアデニンヌクレオチ
ド残基を使用することによって単離される。デオキシチ
ミジン［オリゴ（dT）］のみからなるオリゴヌクレオチ
ドをセルロースに結合させ、小さいカラムにオリゴ（d
T）−セルロースを充填する。総細胞ＲＮＡの調製がこ
のようなカラムを通して行われると、mＲＮＡ分子はポ
リＡテールによってオリゴ（dT）に結合し、一方で残り
のＲＮＡはカラムを流れて行く。ついで結合したmＲＮ
Ａsをカラムから溶出し収集する。

【００１６】例えば、ＰＳＲなどの特定のタンパク質を
コードするmＲＮＡを検出する１つの例には、収集したm
ＲＮＡsを、検出されるべきmＲＮＡにハイブリダイズす
るよう常法により設計された遺伝子特異的オリゴヌクレ
オチドでスクリーニングすることを含む。プロービング
技術は当該技術分野においてよく知られており、プロー
ブの大きさは多様であるが、少なくとも１５ヌクレオチ
ドの長さのプローブであることが好ましいと認識されて
いる。また、このようなプローブは、該プローブの同定
を容易にする分析的に検出可能な試薬で標識するのが好
ましいと認識されている。有用ではあるが、しかし制限
するものではない試薬としては、放射能、蛍光染料また
は検出可能な産物の形成を触媒することができる酵素で
ある。

【００１７】特定のmＲＮＡ配列を検出するための他の
方法は、逆転写酵素とともにポリメラーゼチェインリア
クション（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲはＤＮＡまたは
ＲＮＡ伸長の特異的な増幅に非常に強力な方法である
（サイキ（Saiki）ら、Nature、２３４：１６３−１６
６（１９８６））。この技術の一つの応用は、核酸プロ
ーブ技術においてコピー数の少ない核酸配列を検出可能
なレベルまでにするためのものである。この方法の多数
の診断学的、科学的応用はアーリッヒ（H. A. Erlich）
(編)により、ＰＣＲテクノロジー−プリンシプルズ・ア
ンド・アプリケーションズ・フォー・ＤＮＡアンプリフ
ィケーション（ＰＣＲ Technology-Principles and App
lications for DNA Amplification）、ストックトンプ
レス（Stockton Press）、ＵＳＡ、１９８９に、および
アイニス（M. A. Inis）によりＰＣＲプロトコールズ
（ＰＣＲ Protocols）、アカデミックプレス(Academic
Press）、サンディエゴ、ＵＳＡ、１９９０に記載され
ている。ＲＴ−ＰＣＲはいわゆる逆転写酵素とＰＣＲの
組合せである。逆転写酵素は対応するmＲＮＡ分子からc
ＤＮＡ分子を産生する酵素である。これはＰＣＲが核酸
分子特にＤＮＡを増幅するので重要であり、このＤＮＡ
は宿主由来の身体サンプルから分離したmＲＮＡから産
生されるものである。

【００１８】ＲＴ−ＰＣＲ診断アッセイの例には、宿主
の組織からサンプルを取り出すことにかかわる。このよ
うなサンプルは組織（前立腺以外の組織）からのもので
あり、そのサンプルから総ＲＮＡを抽出し、ついで総Ｒ
ＮＡのＰＳＲ ＲＴ−ＰＣＲを行い、ついでアガロース
ゲル上でそのＰＣＲ産物を電気泳動する。ＲＴ−ＰＣＲ
に使用したオリゴヌクレオチドプライマーは長さ１６〜
５０ヌクレオチド塩基および好ましくは１６〜３０ヌク
レオチド塩基であった。ＰＳＲ mＲＮＡ配列の任意のセ
グメントがオリゴヌクレオチドを生産するのに使用され
る。このやり方で、一度配列がＰＣＲを使用して増幅さ
れるとゲノムＤＮＡは１.２％のアガロースゲル上での
電気泳動後に異なるサイズのバンドが現れるので、ＰＳ
Ｒ mＲＮＡから区別される。約１.２kbのバンドである
ゲノムＤＮＡの存在は、転移に関する負の表示であると
解釈される。しかしながら、一層小さなバンドはmＲＮ
Ａが存在することを示しており、それはＰＳＲ遺伝子が
積極的に転写されていることを意味し、このことが今度
は前立腺細胞が血液中を循環し、おそらく転移している
ことを示している。

【００１９】サンプル中の特定のＲＮＡを検出する他の
例は、逆転写酵素の使用によって検出されるべきmＲＮ
Ａに対応するｃＤＮＡ分子を産生することに関係し、つ
いでその後、そのｃＤＮＡ分子をベクターにクローニン
グしてライブラリーを調製することに関する。このよう
な方法はプラスミドで細菌細胞を形質転換し、細胞を増
殖に必要な栄養分および選択に必要な適切な抗生物質を
含むアガープレートの上に撒くことに関係する。このや
り方で、収集した画分からのmＲＮＡsのすべてを細菌に
形質転換し、個々のコロニーにプレートアウト（plate
out）した。そのmＲＮＡは多様な方法によりライブラリ
ーから検出された。例えば核酸プローブは目的のＤＮＡ
配列を運ぶクローンを位置付けるのに使用される。この
ような方法において、ライブラリーの複製をニトロセル
ロースフィルター上に調製した。このプロセスは各コロ
ニーの位置をこれらのニトロセルロースに移す。検出さ
れるべきmＲＮＡに対応するｃＤＮＡに特異的な抗体と
ともに核酸プローブを有するこれらのニトロセルロース
レプリカをインキュベートすることによりスクリーニン
グを行う。

【００２０】前立腺とは別に由来する細胞中のＰＳＲか
ら転写されたmＲＮＡの存在はまた、このような遺伝子
の発現産物を検出するアッセイの使用により決定され
る。従って、例えばこのようなアッセイはサンプル中に
含まれるmＲＮＡからのcＤＮＡを産生することに関係
し、ついでそれらから産生されたcＤＮＡの発現産物を
検出することによって特異的なmＲＮＡの存在を決定す
る。このような方法において、cＤＮＡsは、そのcＤＮ
Ａを発現ベクターと名付けられた適切に構築されたプラ
スミドにクローニングした後、細菌中で遺伝子産物を探
すことにより同定する。cＤＮＡsはその発現を大腸菌
（E. coli）において促進させる領域内でこれらのベク
ターに挿入される。調節可能な細菌のプロモーターが使
用される。タンパク質は原核生物タンパク質からのアミ
ノ酸が真核生物タンパク質の一端に組み込まれた融合タ
ンパク質として発現される。融合タンパク質は対応する
真核生物タンパク質より細菌中で一層安定であり、それ
ゆえ、一層高いレベルで産生される。

【００２１】mＲＮＡ配列を検出するための他の方法
は、所望のタンパク質を発現するクローンをつきとめ、
例えばＰＳＲなどのタンパク質の機能をアッセイするこ
とである。ＰＳＲの放射線標識した基質をイン・ビトロ
で基質と結合することができるタンパク質を発現するク
ローンを同定するためのプローブとして使用する。クロ
ーニングされた遺伝子はまた、真核生物細胞にて機能的
なアッセイによって同定される。この技術は、関心のあ
るcＤＮＡを発現する細胞の直接的な物理的選択を可能
にし、ついでこのcＤＮＡを細胞から直接回収できる。
哺乳類遺伝子もまた、受容細胞においてその機能の遺伝
的選択によって単離することができる。

【００２２】前立腺以外の細胞において対応するmＲＮ
Ａを産生するＰＳＲ遺伝子からの積極的な転写の存在は
転移した前立腺癌の存在の指標である。というのは、前
立腺癌細胞は一般的な循環器系に前立腺から移動するか
らである。従って、この現象は、転移した腫瘍に対し、
局在化されている腫瘍の処置方法は全く異なるので、重
要な臨床的示唆を有するかもしれない。末梢静脈血中の
ＰＳＲ mＲＮＡの存在は転移の指標である。上記のアッ
セイはまた、化学療法の前に保存された骨髄が前立腺癌
細胞の微小転移で汚染されていないかどうかを試験する
のに使用される。アッセイにおいて、骨髄からの血球を
上記のように単離し、処置し、この方法は保存された骨
髄が化学療法の後、なお移植のため生存可能であるかど
うかを決定することができる。

【００２３】本発明はまた、診断的な遺伝子としてのＰ
ＳＲ遺伝子の使用にも関する。例えば、いくつかの疾患
は遺伝した欠陥遺伝子から生じる。ＤＮＡレベルにて遺
伝子における突然変異は多様な技術によって検出され
る。診断のために使用される核酸（ゲノムＤＮＡ、mＲ
ＮＡなど）は、血液、尿、唾液、組織生検および剖検物
質などの前立腺以外の患者の細胞から得られる。該ゲノ
ムＤＮＡは検出に直接的に使用され得て、または分析の
前にＰＣＲを使用することによって酵素的に増幅され
る。ＲＮＡまたはcＤＮＡはまた同様の目的のために使
用される。一例として、本発明の核酸に相補的であるＰ
ＣＲプライマーは、ＰＳＲ遺伝子突然変異を同定し、分
析するのに使用することができる。例えば、欠失および
挿入は、通常の遺伝子型に比較して、増幅された産物の
大きさにおける変化によって検出することができる。点
突然変異は、増幅したＤＮＡを放射線標識したＰＳＲ遺
伝子ＲＮＡ、または代わりに放射線標識したアンチセン
スＤＮＡ配列にハイブリダイズすることによって同定さ
れることができる。完全にマッチした配列はＲＮアーゼ
Ａによる消化または融解温度における相違によってマッ
チしていない二重らせんから区別することができる。

【００２４】参照遺伝子と「突然変異体」の間の配列の
差異は直接的なＤＮＡシークエンシング方法によって明
らかにされる。さらに、クローニングされたＤＮＡセグ
メントは特定のＤＮＡセグメントを検出するプローブと
して使用することができる。この方法の感度はＰＣＲと
組み合わすと非常に増大される。例えば、シークエンシ
ングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または修飾したＰＣ
Ｒにより産生した一本鎖鋳型分子と共に使用される。配
列決定は、放射線標識したヌクレオチドでの従来手順ま
たは蛍光タグでの自動化シークエンシング手順によって
行われる。ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝的試験は、
変性試薬を使用するかまたは使用しないで、ＤＮＡ断片
およびゲルの電気泳動移動度における変化の検出によっ
て達成される。小さな配列の欠失および挿入は、高解像
（high-resolution）ゲル電気泳動によって可視化され
る。異なる配列のＤＮＡ断片は異なるＤＮＡ断片の移動
度が特異的または部分的な融点に従って異なる位置でゲ
ル中で遅延される変性ホルムアミド濃度勾配ゲルで区別
され得る（例えば、マイヤーズ（Myers）ら、Science、
２３０：１２４２（１９８５））。さらに、配列の変化
は特に小さな欠失の場合、ＤＮＡの移動パターン中での
変化として検出される。

【００２５】特定の位置における配列の変化はまた、Ｒ
ＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法などのヌ
クレアーゼ保護アッセイによって明らかにされる（例え
ば、コットン（Cotton）ら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：
４３９７−４４０１（１９８５））。従って、特定のＤ
ＮＡ配列の検出はハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ
保護、化学的開裂、直接的ＤＮＡシークエンシングまた
は制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（ＲＦＬ
Ｐ））およびサザンブロッティングなどの方法を用いて
達成される。

【００２６】本発明の他の態様により、例えば癌などの
前立腺障害を前立腺以外の組織由来の生物学的サンプル
中のＰＳＲ産物の異常なレベルを決定することによって
診断する方法を提供する。宿主由来のサンプル中のＰＳ
Ｒタンパク質のレベルを検出するために使用したアッセ
イは当業者によく知られており、ラジオイムノアッセ
イ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬ
ＩＳＡアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイを含
む。生物学的サンプルには、以下に制限されるものでは
ないが、組織抽出物、細胞サンプルまたは生物学的液体
が含まれる。しかしながら生物学的サンプルは、前立腺
の組織または細胞を特に含まない。ＥＬＩＳＡアッセイ
（コリガン（Coligan）ら、Current Protocols in Immu
nology、１（２）、第６章、１９９１）は最初にＰＳＲ
タンパク質に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル
抗体を調製することを含む。さらに、リポーター抗体は
該モノクローナル抗体に対して調製される。リポーター
抗体には放射能、蛍光、または本例においては西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ酵素などの検出可能な試薬を結合さ
せる。サンプルを宿主から除去し、例えばサンプル中の
該タンパク質をサンプル中で結合させるポリスチレン皿
などの固相支持体上でインキュベートする。該皿上の任
意の遊離のタンパク質結合部位を、ついでＢＳＡのよう
な非特異的なタンパク質とインキュベートすることによ
って覆う。次に、モノクローナル抗体を皿の中でインキ
ュベートすると、その間にポリスチレン皿に結合したＰ
ＳＲタンパク質にモノクローナル抗体が結合する。全て
の未結合モノクローナル抗体をバッファーで洗い流す。
西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体
を皿に入れると、ＰＳＲタンパク質に結合したモノクロ
ーナル抗体にリポーター抗体が結合する。結合していな
いリポーター抗体を洗い流す。ついでペルオキシダーゼ
基質をさらに加え、ついで所定の時間での発色量を標準
曲線に対して比較すると、患者のサンプルの所定量にお
いて存在するＰＳＲタンパク質の量が測定される。

【００２７】競合アッセイも使用でき、該アッセイで
は、ＰＳＲタンパク質に対する特異的抗体を固相支持体
に結合させ、標識されたＰＳＲタンパク質および宿主由
来のサンプルを固相支持体に通過させ、例えば液体シン
チレーションクロマトグラフィーによって検出された標
識の量をサンプル中のＰＳＲタンパク質の量に関連づけ
ることができる。「サンドイッチ」アッセイはＥＬＩＳ
Ａアッセイと同様である。「サンドイッチ」アッセイに
おいて、ＰＳＲタンパク質を固相支持体を通過させ、固
相支持体に結合した抗体に結合する。ついで第二抗体を
ＰＳＲタンパク質に結合させる。第二抗体に特異的な標
識第三抗体を、ついで固相支持体に通過させ、第二抗体
に結合すると、その量を定量できる。

【００２８】別法において、ＰＳＲタンパク質に対する
標識された抗体を使用する。１工程アッセイにおいて、
標的分子がもし存在するのであれば、固定化され、標識
された抗体とともにインキュベートする。標識した抗体
は固定化標的分子に結合する。非結合分子を洗浄して除
去した後、該サンプルを標識の存在に関してアッセイす
る。２工程のアッセイにおいては、固定化された標的分
子を未標識の抗体とインキュベートする。その標的分子
−標識抗体複合体は、もし存在するのであれば、ついで
未標識の抗体に特異的である第二の標識した抗体に結合
する。抗体を標識するのに使用されたマーカーの選択は
この応用に依存して多様である。しかしながら、マーカ
ーの選択は当業者には容易に決定できる。これらの標識
した抗体はイムノアッセイにてならびに該タンパク質の
存在を検出するための組織学的な応用において使用され
る。その標識された抗体はポリクローナルまたはモノク
ローナルである。

【００２９】このようなＰＳＲに特異的である抗体（例
えば、抗イデオタイプ抗体）は、しっかりとそこに結合
することによってＰＳＲの作用を妨げ、それゆえ、前立
腺癌細胞の生存を妨害または排除するので前立腺癌ワク
チンとして使用されることができる。該抗体はまた、例
えば、前立腺癌細胞と接触させるとそれらを破壊する相
互作用薬剤をホーミングする方法において前立腺癌細胞
をターゲティングするのに用いることができる。これは
該抗体が前立腺において主として発現されるＰＳＲに特
異的であり、かつ相互作用薬剤の抗体への結合が相互作
用薬剤を前立腺に直接もたらすことから真実である。

【００３０】このタイプの抗体はまた、イン・ビボイメ
ージングを行うため使用され、例えば、骨盤領域および
前立腺のスキャンを容易にするために抗体を標識するこ
とによって行われる。イメージングの１つの方法には、
イメージしようとする前立腺の腫瘍細胞を検出可能なマ
ーカーで標識した抗−ＰＳＲ抗体と接触させることを含
む。該方法は標識された抗体がＰＳＲに結合するような
条件下で行われる。具体的な例において、該抗体は前立
腺、例えば前立腺癌細胞と相互作用し、そのように接触
すると、前立腺のイメージングおよび可視化が増強され
て、前立腺の疾患状態または非疾患状態の決定を可能に
するように蛍光を発する。ＰＳＲポリペプチドの量が上
昇しているかどうかを決定するために、上記の方法は健
常である、すなわち前立腺の障害を有さないことがわか
っている多数の宿主に対して行われてよい。ついでＰＳ
Ｒポリペプチドの平均レベルを決定すると、これは標準
として働き、該標準に対してＰＳＲポリペプチドの異常
な量のイン・ビボにおいての同定のために、ＰＳＲポリ
ペプチドレベルを測定することができる。

【００３１】本発明の他の態様により、配列番号：２の
推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたは１９
９４年１０月１１日にＡＴＣＣ受託番号第７５９１３号
として寄託されたクローンのcＤＮＡによってコードさ
れる成熟ポリペプチドをコードする単離した核酸（ポリ
ヌクレオチド）を提供する。本発明のポリヌクレオチド
はヒト前立腺由来のcＤＮＡライブラリーにおいて見い
出された。該ＰＳＲ遺伝子は、前立腺において主として
発現し、本発明者らによってスクリーニングされたその
他のヒトのcＤＮＡ組織ライブラリーにおいては全く見
られなかった（下記表１参照）。ＰＳＲは３１６アミノ
酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディング
フレームを含む。

【００３２】表１：前立腺特異的遺伝子としてのＰＳＲ
の同定

【表１】

【００３３】表１に示すように、３つの前立腺cＤＮＡ
ライブラリーを構築し、これら３つのライブラリーから
得られた多数のクローンをシークエンシングした。これ
らのライブラリーから同定されたクローンをヒト前立腺
cＤＮＡライブラリー以外の３００以上のヒトcＤＮＡラ
イブラリーから得られた２７５,２６１の独立したcＤＮ
Ａクローンの同定を含むデータベースと比較した。表に
示されるように、ヒト前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は正
常のヒト前立腺ライブラリーにおいて４回、ステージＢ
２のヒト前立腺癌ライブラリーにおいて７回、ついでス
テージＣのヒト前立腺癌ライブラリーにおいて１４回同
定された。ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）は
正常のヒト前立腺ライブラリーにおいて１３回、ステー
ジＢ２のヒト前立腺癌ライブラリーにおいて１回、つい
でステージＣのヒト前立腺癌ライブラリーにおいて１４
回同定された。本発明の前立腺特異的還元酵素は、ステ
ージＢ２のヒト前立腺癌ライブラリーにおいて３回、つ
いでステージＣのヒト前立腺癌ライブラリーにおいて７
回同定され、最も顕著なことには、正常なヒト前立腺ラ
イブラリーにおいて、または非前立腺組織由来のライブ
ラリーにおいては全く同定されることがなく、このこと
により、前立腺障害のマーカーとして重要であることを
示している。

【００３４】本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡまたは
ＤＮＡの形態であり、そのＤＮＡにはcＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡおよび合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは二本鎖
または一本鎖であり、一本鎖の場合には、コーディング
鎖または非コーディング鎖（アンチセンス）であってよ
い。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は
配列番号：２に示されるコーディング配列または寄託さ
れたクローンの配列に同一であってよいし、または遺伝
的コードの重複性または縮重の結果コーディング配列が
配列番号：１または寄託されたcＤＮＡのＤＮＡと同一
の成熟ポリペプチドをコードする異なるコーディング配
列であってよい。

【００３５】配列番号：２の成熟ポリペプチドまたは寄
託されたcＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドには以下が含まれる：
成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ、または成熟
ポリペプチドのコーディング配列（および時にさらに別
のコーディング配列）および例えば、イントロンまたは
該成熟ポリペプチドのコーディング配列の５'および／
または３'の非コーディング配列などの非コーディング
配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド」なる語は、該ポリペプチドのコーディング配列
のみを含むかまたはコーディグおよび／または非コーデ
イング配列をさらに含むポリヌクレオチドを含む。

【００３６】本発明はさらに、配列番号：２の推定アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクロー
ンのcＤＮＡによってコードされるポリペプチドの断
片、類似体および誘導体をコードする上記のポリヌクレ
オチドの変異体にも関連する。該ポリヌクレオチドの変
異体は、天然に存在する該ポリヌクレオチドの対立遺伝
子変異体または天然には存在しない該ポリヌクレオチド
の変異体であってよい。従って、本発明は、配列番号：
２に示すのと同じ成熟ポリペプチド、または寄託された
クローンのｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその
ようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変
異体は、配列番号：２のポリペプチドまたは寄託された
クローンのｃＤＮＡによってコードされるポリヌクレオ
チドの断片、誘導体、または類似体をコードする。その
ようなヌクレオチド変異体には欠失変異体、置換変異体
および付加または挿入変異体が含まれる。

【００３７】先に示したように、該ポリヌクレオチドは
配列番号：１に示すコーディング配列の天然に存在する
対立遺伝子変異体または寄託されたクローンのコーディ
ング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコー
ディング配列を有してよい。当該技術分野において公知
のように、対立遺伝子変異体は１またはそれ以上のヌク
レオチドの置換、欠失または付加（実質的にはコードす
るポリペプチドの機能を変えない）を有してよい別の形
のポリヌクレオチド配列である。本発明のポリヌクレオ
チドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合したコーディング配
列を有してもよい。該マーカー配列は、細菌宿主の場合
には、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提
供するためのベクター、好ましくはｐＱＥ−９ベクター
によって与えられるヘキサ−ヒスチジンタグであり、ま
たは例えば、哺乳動物宿主（例えば，ＣＯＳ−７細胞）
を使用する場合には、マーカー配列は、赤血球凝集素
（ＨＡ）タグであってよい。該ＨＡタグはインフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質より得られるエピトープに対
応する（ウィルソン（Wilson, I.）ら、Cell、３７：７
６７（１９８４））。

【００３８】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％、また好ましくは少なくとも７０％の同一性がある場
合に、本明細書に記載の上記の配列にハイブリダイズす
るポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリン
ジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用す
る場合、「ストリンジェント条件」という語は、配列間
に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％
の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが
起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上
記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、配列番号：１のｃＤＮＡまたは寄託されたｃ
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物
学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチド
をコードする。

【００３９】本明細書で使用する寄託は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
約定の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に
当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が
３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認す
るものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌク
レオチドの配列、さらにまた、それによりコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成
して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際
は、いつでも制御している。寄託された物質を製造し、
使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得
て、またそのような実施許諾は、ここでは付与されな
い。本発明はさらに、配列番号：２の推定アミノ酸配列
を有する、または寄託されたｃＤＮＡによりコードされ
るアミノ酸配列を有するＰＳＲポリペプチド、さらには
また、そのようなポリペプチドの断片、類似体および誘
導体に関する。

【００４０】配列番号：２のポリペプチドまたは寄託さ
れたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに言及す
る場合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という
語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的
機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従
って、類似体には、プロタンパク質部分を切断すること
により活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造する
ことができるプロタンパク質が含まれる。本発明のポリ
ペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドま
たは合成ポリペプチドであってよいが、組換えポリペプ
チドが好ましい。

【００４１】配列番号：２のポリペプチドまたは寄託さ
れたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断片、
誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたはそれ以上のア
ミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましく
は、保存アミノ酸残基）で置換されており、またそのよ
うな置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされる
ものであってもよく、またはコードされたものでなくて
もよいもの、または（ii）１つまたはそれ以上のアミノ
酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポ
リペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化
合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の
化合物と融合しているものであり得る。そのような断
片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から当業
者の範囲内であると思われる。

【００４２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。「単離された」と
いう語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に
存在するなら、天然の環境）から除去されていることを
意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在す
るポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
ないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全
てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドは
ベクターの一部であってよく、および／またはそのよう
なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部
であってよく、それでいて、そのようなベクターまたは
組成物はその天然の環境の一部ではないという点で、な
お単離されている。

【００４３】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クロ
ーニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明
のベクターで遺伝的に操作される（形質導入、または形
質転換、またはトランスフェクションされる）。該ベク
ターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ
等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモータ
ーを活性化し、形質転換体を選択し、またはＰＳＲ遺伝
子を増幅するのに適するよう改変された通常の栄養培地
で培養することができる。温度、ｐＨ等といったような
培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用し
た培養条件であって、当業者に明らかであろう。

【００４４】本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチ
ドを組換え技術により製造するのに使用することができ
る。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１
つに含ませることができる。そのようなベクターには、
染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮ
Ａ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；
ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；
プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから得られ
るベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれ
る。しかしながら、他のいずれのベクターも、それが宿
主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用す
ることができる。

【００４５】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌク
レアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方
法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクター
中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモータ
ー）に作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を行わせる。
そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが
挙げられる；ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸
菌、lac、またはtrp、ファージラムダＰ_Ｌプロモータ
ー、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイル
スでの遺伝子の発現を調節することが知られている他の
プロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のための
リボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。
該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含
み得る。

【００４６】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性といったようなまたは、大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換さ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるための
１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む
のが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらに
はまた、適当なプロモーターまたは調節配列を含むベク
ターを、適当な宿主を形質転換するために使用して、そ
の宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることがで
きる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げら
れる：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）、
サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimuri
um）といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；
ドロソフィラ（Drosophila） Ｓ２およびＳｆ９といっ
たような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノ
ーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細
胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業
者の範囲内であると思われる。

【００４７】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。そのような構築物は、本発明の配列が順方
向または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウ
イルスベクターといったようなベクターを含む。この実
施態様の好ましい側面では、該構築物はさらに、例え
ば、該配列に作動可能に連結したプロモーターなどの調
節配列を含む。適当なベクターおよびプロモーターが多
数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベ
クターを例として挙げる。細菌用；ｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Qiagen））、ｐＢＳ、ｐ
Ｄ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐ
ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８
Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（スト
ラタジーン（Stratagene)）；ptrc９９a、pＫＫ２２３
−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(ファ
ルマシア（Pharmacia）)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、p
ＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(ストラタジ
ーン)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(ファル
マシア)。しかしながら、他のいずれのプラスミドまた
はベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生
存可能である限り、使用することができる。

【００４８】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ前初期(immediate e
arly)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ
４０、レトロウイルス由来のＬＴＲｓ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。

【００４９】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、哺
乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下
等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞の
ような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入
は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレク
トロポレーションにより行うことができる。(デイビス
（Davis, L.）、ディブナー（Dibner, M.）、バッテイ
（Battey, I.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキ
ュラー・バイオロジー（Basic Methods in Molecular B
iology）、（１９８６）)。宿主細胞中の構築物を通常
の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明
のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成
的に製造することができる。

【００５０】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡsを用いて製
造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Sambrook）
ら、モレキュラークローニング（Molecular Clonin
g）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Ma
nual）、 第２版、コールド・スプリング・ハーバー（C
old Spring Harbor）、ニューヨーク、（１９８９)によ
り記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成
する。

【００５１】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。

【００５２】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマ
ーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子なら
びにサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae） Ｔ
ＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を行わせる
ために高度に発現される遺伝子から得られるプロモータ
ーが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、と
りわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のよ
うな解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または
熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得るこ
とができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および
終結配列と共に、適当な相(phase)で集合する。場合に
より、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、
発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を
与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質
をコードすることができる。

【００５３】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
作動可能なリーディング相にある適当な翻訳開始および
終結シグナルと機能的なプロモーターと共に挿入するこ
とにより構築される。そのようなベクターは、ベクター
の維持を確実なものとするために、また所望により、宿
主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表
現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含むであ
ろう。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラ
ス・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・テ
ィフィムリウム、およびシュードモナス（Pseudomona
s）属、ストレプロマイセス属、ならびにスタフィロコ
ッカス（Staphylococcus）属の範囲内の様々な種が含ま
れるが、他のものもまた選択可能である。

【００５４】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用な発現ベクターは、周知のクロー
ニングベクター ｐＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の
遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、
選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでい
てよい。そのような市販のベクターには、例えば、pＫ
Ｋ２２３−３(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（P
harmacia Fine Chemicals）、ウプサラ（Uppsala）、ス
ウェーデン)およびＧＥＭ１(プロメガ・バイオテク（Pr
omega Biotec）、マディソン（Madison）、ウィスコン
シン、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部
分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列
と組み合わせる。

【００５５】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度までの増殖させた後、選択されたプロ
モーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学
誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的ま
たは化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製
の抽出物を更なる精製のために保有する。タンパク質の
発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、
超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
むいずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法
は、当業者に周知である。

【００５６】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、グルズマン（Gluzman）、Cel
l、２３：１７５（１９８１）により記載されている、
サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能
なベクターを発現させることができる他の細胞系、例え
ば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ
細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始
点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいず
れかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終
結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含むで
あろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ
配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とさ
れる非転写遺伝要素を与えることができる。

【００５７】ＰＳＲポリペプチドは、硫酸アンモニウム
またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオ
ン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマト
グラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイ
トクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフ
ィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収
して、精製することができる。必要に応じて、タンパク
質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成する
のに使用することができる。最後に、高性能液体クロマ
トグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用すること
ができる。

【００５８】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て）組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。

【００５９】本発明の他の態様により、ＰＳＲが還元酵
素であり、前立腺癌細胞の増殖に必要であるので、ＰＳ
Ｒを抑制する治療剤をスクリーニングするのに使用され
るアッセイを提供する。本発明は十分なアフィニティー
でＰＳＲと複合体を形成してＰＳＲの生物学的作用を妨
害する治療剤を選択する方法を開示する。該方法には多
様なアッセイが含まれ、ＰＳＲが支持体に固定化され、
ＰＳＲの天然の基質および標識した治療剤と同時かまた
は連続して接触させ、ついで該治療剤がその基質に対し
てＰＳＲの結合を妨害するために十分なやり方において
天然の基質と有効に競合するかどうかを決定する競合ア
ッセイを含む。他の態様において、該天然の基質は標識
され、ついで該治療剤は標識されない。さらなる態様に
おいて、該基質は支持体に固定化され、ついで標識され
たＰＳＲおよび治療剤（または標識されていないＰＳＲ
および標識された治療剤）の両方に接触させ、ついで基
質に結合したＰＳＲの量が治療剤を添加しないアッセイ
と比較して減少したかどうかを決定する。該ＰＳＲは本
発明の抗ＰＳＲ抗体で標識される。

【００６０】このようなスクリーニングアッセイの他の
例において、ＰＳＲポリペプチドを発現する哺乳類細胞
または膜調製物を、同時の酸化および還元を行う要素、
例えば一緒になって水を形成する水素および酸素（その
際、水素は放射能、例えばトリチウムで標識できる）を
スクリーニングされるべき化合物の存在下、水素および
酸素が水を形成する酸化還元反応に有利な条件の下でイ
ンキュベートする。ついでこの相互作用を増強または阻
害する化合物の能力を測定する。ＰＳＲに対する潜在的
なアンタゴニストには、該ポリペプチドに結合する抗
体、すなわち上記のような抗イデオタイプ抗体または、
ある場合にはオリゴヌクレオチドを含む。

【００６１】潜在的な他のＰＳＲアンタゴニストはま
た、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンス
構築物をも含む。アンチセンス技術は三重螺旋形成また
はアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（その両者の方法は
ポリヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡに結合させるこ
と基礎としている）によって遺伝子発現を制御するのに
使用されることができる。例えば、該ポリヌクレオチド
配列の５'コーディング部位（本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードする）は長さが約１０から４０塩基対のアン
チセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに使用
される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺
伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−
リー（Lee）ら、Nucl. Acids Res.、６：３０７３（１
９７９）；クーニー（Cooney）ら、Science、２４１：
４５６（１９８８）；およびダーバン（Dervan）ら、Sc
ience、２５１：１３６０（１９９１）参照）、それに
よってＰＳＲの転写および産生を妨害する。アンチセン
スＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボでｍＲＮＡに
ハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＰＳＲポリペプチド
への翻訳を阻害する（アンチセンス−オカノ（Okan
o）、J. Neurochem．５６：５６０（１９９１）；オリ
ゴデオキシヌクレオチド・アズ・アンチセンス・インヒ
ビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Oligod
eoxynucleotidesasAntisense Inhibitors of Gene Expr
ession）、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Press)、ボカ・レイ
トン（Boca Raton）、フロリダ（１９８８））。上記に
記載のオリゴヌクレオチドはまたアンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡがイン・ビボでＰＳＲの産生を阻害するため
に発現されるように細胞に運搬されることができる。潜
在的なアンタゴニストにはまた、該ポリペプチドのよう
な活性部位に結合または該部位を占領することによって
活性部位が基質に接近できなくなり、通常の生物学的活
性が妨害されるような小分子を含む。基質に接近しにく
い活性部位を作成するものが含まれる。小分子の例には
これらに限られるものではないが、小ペプチドまたはペ
プチド様分子が含まれる。

【００６２】該アンタゴニストは前立腺癌細胞の生存に
必要であるＰＳＲの機能を抑制するため前立腺癌を治療
するのに使用される。該アンタゴニストは、例えば以下
に記載するような製薬学的に許容し得る担体と組み合わ
せて使用される。全長のＰＳＲ遺伝子の断片は、全長の
ＰＳＲ遺伝子およびＰＳＲ遺伝子に高い類似性を有する
かまたは同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離
するためのcＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用されてよい。このタイプのプロ
ーブは、例えば２０〜２０００塩基対の間であってよ
い。しかしながら、好ましくは、該プローブは３０〜５
０塩基である。該プローブはまた、全長の転写物および
ゲノムクローンまたは調節領域およびプロモーター領
域、エクソンおよびイントロンを含む完全なＰＳＲ遺伝
子を含むクローンに対応するcＤＮＡを同定するのに使
用されてよい。スクリーニングの例には、オリゴヌクレ
オチドプローブを合成するための公知のＤＮＡ配列を使
用することによってＰＳＲ遺伝子のコーディング領域を
単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な
配列を有する標識したオリゴヌクレオチドはヒトcＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスク
リーニングして該プローブがライブラリーのどのメンバ
ーにハイブリダイズするのかを決定するのに使用され
る。

【００６３】ＰＳＲポリペプチドまたはアゴニストまた
はアンタゴニストは、適当な製薬学的担体と組み合わせ
て使用することができる。そのような組成物は、治療上
有効な量のポリペプチド、および製薬学上許容され得る
担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、
これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生
理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤
は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発
明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、
１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックま
たはキットも提供する。そのような容器には、製薬学的
または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する
政府当局により規定された形の通知を付してもよく、こ
の通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売
の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明のポリ
ペプチドは、他の治療化合物と共に使用することができ
る。

【００６４】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内経路といったような
便利な方法で投与することができる。製薬学的な組成物
は、特定の徴候を治療および／または予防するのに有効
な量で投与される。一般に、該組成物は、１日当たり少
なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、たいて
いの場合、約８mg／kg(体重)を超えない量で投与される
であろう。たいていの場合、投与経路および症状等を考
慮に入れて、投与量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／k
g(体重)である。該ＰＳＲポリペプチドおよびアゴニス
トおよびアンタゴニストはまた、しばしば「遺伝子治
療」と呼ばれる、そのようなポリペプチドのイン・ビボ
における発現により、本発明に従って使用してよい。

【００６５】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
ス・ビボ（ex vivo）においてポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した
後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与え
る。そのような方法は、当該技術分野で公知である。例
えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含む
レトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分
野で公知の方法により操作することができる。

【００６６】同様に、例えば、当該技術分野で既知の方
法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のた
めに、細胞をイン・ビボにおいて操作することができ
る。当該技術分野において知られているように、細胞を
イン・ビボにおいて処理してポリペプチドをイン・ビボ
において発現させるために、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するた
めのプロデューサー細胞を患者に投与することができ
る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教
示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作す
るための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、
例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞を
イン・ビボにおいて操作するために使用することができ
るアデノウイルスであってもよい。

【００６７】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対
して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることが
できる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づ
いた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマー
クするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮ
Ａの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関連
遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言え
ば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１
５−２５bp)を調製することにより、配列を染色体にマ
ップすることができる。該遺伝子の３'非翻訳領域のコ
ンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１を越
えるエクソンにまたがらないプライマーを迅速に選択す
ることから、増幅過程を複雑なものとする。ついで、こ
れらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハ
イブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライ
マーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、
増幅された断片を与えるであろう。

【００６８】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成するこ
とができる。その染色体へマップするのに同様に利用す
ることができる他のマッピング方法には、イン・サイチ
ュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識化フロー
−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレス
クリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
セレクションが含まれる。

【００６９】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程
で与えることができる。この技術は、わずか５００また
は６００塩基の短いｃＤＮＡで利用することができる；
しかしながら、２,０００ ｂｐより大きいクローンは、
簡単な検出に関して十分なシグナル強度を有する独特の
染色体の位置に結合しやすい。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが由
来するクローンの使用を必要とし、長ければ長いほど良
い。例えば、２,０００ｂｐは良く、４,０００は一層良
く、および４,０００以上がおそらく時間の合理的なパ
ーセントの良い結果である。この技術の概説には、ベル
マ（Verma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（Human C
hromosomes）：ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テ
クニクス（a Manual of Basic Techniques）、パガモン
・プレス（Pergamon Press）、ニューヨーク（１９８
８）を参照。

【００７０】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、マックジック（V. McKusick）、メンデリアン
・インヘリタンス・イン・マン（Mendelian Inheritanc
e in Man）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
ー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Johns Hopk
ins University WelchMedical Library）を介してオン
ラインで利用できる)に見い出される。ついで、同じ染
色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係
を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheri
tance))によって確認する。

【００７１】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピング技術の解析から、疾患と関連する染色体領域に正
確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の原因となり
得る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メ
ガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝
子を仮定する)。

【００７２】ポリペプチド、それらの断片もしくは他の
誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発
現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗
体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さ
らにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブ
ラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公知の様々
な方法を、そのような抗体および断片の製造に使用する
ことができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに
対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注
入することにより、またはポリペプチドを動物、好まし
くはヒトでない動物に投与することにより得ることがで
きる。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポ
リペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポ
リペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な
天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用
することができる。ついで、そのような抗体は、そのポ
リペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離する
ために使用できる。

【００７３】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Kohler）およびミルシュタイン（Milstei
n）、１９７５、Nature、２５６:４９５−４９７)、ト
リオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(コ
ズボール（Kozbor）ら、１９８３、Immunology Today
４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造する
ためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Cole）ら、
１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド
・キャンサー・セラピー（Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy）、アラン・アール・リス、インク（Al
an R. Liss, Inc.）、７７−９６頁において)が含まれ
る。

【００７４】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。また、トランスジェニックマウスを本発明
の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化した抗体を発
現させるのに使用される。本発明をさらに、以下の実施
例に関して記載する；しかしながら、本発明は、そのよ
うな実施例に限定されないことを理解すべきである。部
または量は全て、特にことわらない限り、重量単位であ
る。

【００７５】以下の実施例の理解を容易にするために、
幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載
する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび
／または続けて大文字および／または数字により示す。
本明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、限
定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公
開された方法により入手可能なプラスミドから構築でき
る。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミド
は、当該技術分野で公知であって、当業者に明らかであ
ろう。

【００７６】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、典型的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に使用する。
プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的に
は、より多量の容積中、典型的にＤＮＡ５〜５０μgを
２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に
適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されて
いる。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通
常利用されるが、供給者の指示に従って変えることがで
きる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで
直接電気泳動して、所望の断片を単離する。

【００７７】開裂した断片のサイズ分離は、ゲッデル
（Goeddel, D）ら、Nucleic Acids Res.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、
化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌ
クレオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌクレオ
チド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは
５'リン酸を有さないことから、キナーゼの存在下、Ａ
ＴＰとともにリン酸を加えることなしには、別のオリゴ
ヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴ
ヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片にライゲ
ーションするであろう。

【００７８】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
断片の間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう
(マニアチス（Maniatis, T.）ら、同上、１４６頁)。特
にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさ
せるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５μg当り１０
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知
の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。
特にことわらない限り、形質転換は、グラハム（Graha
m, F.）およびファン・デル・エブ（Van der Eb,
A.）、Virology、５２：４５６−４５７（１９７３）の
方法に記載されているようにして行った。

【００７９】

【実施例】実施例１ 前立腺以外の組織中のＰＳＲ遺伝子転写物の決定 ＰＳＲ mＲＮＡの活性転写物の存在または不在を明らか
にするために、約６mlの静脈血をヘパリン化した管を用
いて標準静脈穿刺技術にて得た。全血液を当量のリン酸
緩衝食塩水と混合し、１５mlのポリスチレン管中の層状
になった８mlを越えるFicoll（ファルマシア、ウプサ
ラ、スウェーデン）の上に置いた。該勾配を５℃で２０
分間１８００×ｇで遠心した。リンパ球細胞および顆粒
球の層（約５ml）を注意深く通気し、ついで５０ml管中
で５０mlまでリン酸緩衝食塩水で再度希釈し、５℃で２
０分間、１８００×ｇで遠心した。該上清を捨て、有核
（nucleated）細胞を含むペレットを製造者によって記
載されるようにしてＲＮＡzolＢ法を用いてＲＮＡ抽出
するのに使用する（テル−テストインク（Tel−Test, I
nc.）、フレンズウッド、テキサス）。

【００８０】２つのオリゴヌクレオチドプライマーをサ
ンプル中に存在するＰＳＲヌクレオチド配列を増幅する
ために使用する：５'プライマーは5' AAGAGATCCAGACCAC
GACAGG 3'（配列番号：３）であり、３'プライマーは5'
AAGGCACAGTGCAGCCTGGTCT 3'（配列番号：４）である。
その逆転写酵素反応およびＰＣＲ増幅を続いてパーキン
・エルマー９６００ＰＣＲ機械（エメリビル（Emeryvil
le）、カリフォルニア）において中断なしに行った。２
０μlのジエチルピロカーボネート処理した水中の４０
０ngの総ＲＮＡを６５℃の水浴中で５分間静置し、つい
ですぐに氷冷し、直後にＰＣＲ試薬を添加した。総量５
０μlのＰＣＲ容量は２.５単位のＴaqポリメラーゼ（パ
ーキン・エルマー）、２単位のトリ骨髄芽球症ウイルス
逆転写酵素（ベーリンガーマンハイム、（Boehringer M
annheim）、インディアナポリス、インディアナ）；各
２００μＭのdＣＴＰ、dＡＴＰ、dＧＴＰおよびdＴＴＰ
（パーキン・エルマー）；各１８pＭのプライマー、１
０mＭのトリス−ＨＣｌ；５０mＭのＫＣl；および２mＭ
のＭgＣｌ_２（パーキン・エルマー）からなる。

【００８１】ＰＣＲの条件は以下のとおりである：サイ
クル１は４２℃、１５分間ついで９７℃、１５秒間（１
サイクル）；サイクル２は９５℃１分間、６０℃１分間
ついで７２℃３０秒間（１５サイクル）；サイクル３は
９５℃１分間、６０℃１分間ついで７２℃１分間（１０
サイクル）；サイクル４は９５℃１分間、６０℃１分間
ついで７２℃２分間（８サイクル）；サイクル５は７２
℃１５分間（１サイクル）；ついで最終サイクルはサン
プルを機械から取り出すまで４℃で維持する。その５０
μlのＰＣＲ産物は減圧遠心によって１０μlまで濃縮
し、ついで全サンプルをエチジウムブロミドを含む薄い
１.２％のトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡアガロースゲル上
にて流す。１.２kbのバンドがゲノムＤＮＡが増幅され
たことを示し、そのことは前立腺癌転移の指標とはなら
ない。しかしながら、幾分バンドが小さく、５６７塩基
対産物であるならば、それは該ＰＳＲのmＲＮＡがＰＣ
Ｒによって増幅され、前立腺以外の細胞は積極的に転写
しているＰＳＲタンパク質であり、血中を循環してい
る、すなわち転移していることを示す。すべての標本を
少なくとも２回、正または負の結果を確認するために分
析する。

【００８２】ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列の証明が微
小シークエンシングによって行われる。該ＰＣＲ産物は
製造者の記載通りにキアゲンＰＣＲピュアリフィケーシ
ョンキット（Qiagen ＰＣＲ Product Purification Ki
t）（キアゲン、チャッツワース（Chatsworth）、カリ
フォルニア）で精製した。該ＰＣＲ産物の１μgをアプ
ライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォ
スター（Foster）、カリフォルニア）によって記載され
るようにパーキン−エルマー９６００ＰＣＲ機械におい
てＴaqダイデオキシ・ターミネーター・サイクル・シー
クエンシング・キット（Taq Dye Deoxy Terminator Cyc
le sequencing Kit）を用いてＰＣＲシークエンシング
を行った。そのシークエンシングされた産物を会社の記
載通りにセントリ−セップ・カラム（Centri-Sep colum
s）（プリンストン・セパレーションズ（Princeton Sep
arations）、アデルフィア（Adelphia）、ニュージャー
ジー）を用いて精製している。ついでこの産物をマッキ
ントッシュIIciコンピューターと統合したＡＢＩモデル
３７３Ａ ＤＮＡシークエンシングシステム（アプライ
ド・バイオシステムズ）で分析する。

【００８３】実施例２ ＰＳＲの細菌による発現および精製 ＰＳＲをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ受託番号第７
５９１３号は最初にプロセッシングされたタンパク質の
５'配列（シグナルペプチド配列を差し引いたもの）お
よび該ＰＳＲ遺伝子の３'側配列に対応するＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。ＰＳＲに
対応するさらなるヌクレオチドにそれぞれ５'および３'
配列を加える。その５'オリゴヌクレオチドプライマー
は配列 5' GATCGATGTCGACCTGTCCAGTGGGGTGTGTAC 3'（配列番
号：５） を有し、ＳalＩ制限酵素部位を含み、アミノ酸１０から
出発するＰＳＲコーディングの２０ヌクレオチドが続
く。その３'配列： 5' ATCGATCTCTAGATTATGTTAGTCTATTGGGAGGCCC 3'（配列
番号：６） はＸbaＩ部位に相補的な配列を有し、ＰＳＲコーディン
グ配列の２３ヌクレオチドが続く。細菌発現ベクターp
ＱＥ−９（キアゲンインク、９２５９イートンアベニュ
ー、チャタスワース、カリフォルニア、９１３１１）の
制限酵素部位に対応する。pＱＥ−９は抗生物質耐性
（Ａmp')、細菌の複製起点（ori）、ＩＰＴＧ−調節可
能なプロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム
結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈis タグおよび制限酵素部
位をコードする。ついでpＱＥ−９をＳalＩおよびＸba
Ｉで消化する。その増幅した配列をpＱＥ−９にライゲ
ーションし、ついでヒスチジンタグおよびＲＢＳをコー
ドする配列とともにインフレームで挿入する。ついでそ
のライゲーション混合物をサンブルック（Sambrook,
J.）ら、モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー
・マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manu
al）、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス
（Cold Spring Laboratory Press）、（１９８９））に
記載の手順によって商標Ｍ１５／rep ４の下、キアゲン
から入手可能である大腸菌株 m１５／pＲＥＰ４を形質
転換するのに使用する。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲ
ＥＰ４の多数のコピーを含み、それはlacＩリプレッサ
ーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋan'）を与え
る。形質転換体はＬＢプレートの上での増殖の能力によ
り同定され、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニー
が選択される。プラスミドＤＮＡを単離し、ついで制限
分析によって確認する。

【００８４】目的構築物を含むコロニーをＡmp（１００
μg／ml）およびＫan（２５μg/ml）の両者を補ったＬ
Ｂ培地中で液体培養にて一夜（Ｏ／Ｎ）増殖させる。そ
のＯ／Ｎ培養物を１：１００から１：２５０の割合で大
量培養を播取するのに使用する。その細胞を吸光度６０
０（Ｏ．Ｄ．^６００）で０.４から０.６の間に増殖させ
る。ついでＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド」）を最終濃度１mＭに添加してい
る。ＩＰＴＧはlacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／
Ｏを清浄化して遺伝子発現を増加させるのを誘導する。
細胞をさらに３〜４時間増殖させる。ついで細胞を遠心
によって採取する。その細胞ペレットを６モーラのグア
ニジンＨＣlのカオトロピック薬剤中で可溶化する。浄
化後、可溶化したＰＳＲを６−Ｈisタグ（ホリウチ（Ho
chuli, E.)ら、J. Chromatography ４１１：１７７−１
８４（１９８４））を含むタンパク質によってしっかり
と結合できるような条件で、ニッケル−キレートカラム
の上でクロマトグラフィーによってこの溶液から精製し
ている。ＰＳＲ（純度９０％）は６モーラのグアニジン
ＨＣl（pＨ ５.０）中でカラムから溶出し、ついで復元
のために３モーラーのグアニジンＨＣl、１００mＭのリ
ン酸ナトリウム、１０nＭグルタチオン（還元した）お
よび２mＭのグルタチオン（酸化した）で調整した。こ
の溶液中で１２時間インキュベートした後、そのタンパ
ク質を１０ｎＭのリン酸ナトリウムにて透析した。

【００８５】実施例３ ＣＯＳ細胞内での組換えＰＳＲの発現 発現プラスミド、ＰＳＲ ＨＡは以下を含むベクターpc
ＤＮＡＩ／Ａmp（インビトロゲン（Invitrogen）由来で
ある：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺
伝子、３）大腸菌複製起点、４）ポリリンカー領域、Ｓ
Ｖ４０イントロンおよびポリアデニレーション部位が続
くＣＭＶプロモーター。ＰＳＲ前駆体全体をコードする
ＤＮＡ断片および３'端にインフレームで融合するＨＡ
タグをそのベクターのポリリンカー領域にクローニング
し、それゆえ、その組換えタンパク質発現をＣＭＶプロ
モーターの下で行う。そのＨＡタグは、以前に記載した
ように（ウィルソン（I. Wilson）、ニーマン（H. Nima
n）、ハイテン（R. Heighten）、チェレンソン（A. Che
renson）、コノリー（M. Connolly）およびラーナー
（R. Lerner）、１９８４、Cell ３７、７６７）インフ
ルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに一
致する。ＨＡタグの我々の標的タンパク質への注入によ
りＨＡエピトープを認識する抗体を有する組換えタンパ
ク質の検出を容易にする。

【００８６】そのプラスミドの構築策は以下に記載する
とおりである：ＰＳＲ、ＡＴＣＣ受託番号第７５９１３
号をコードするＤＮＡ配列を２つのプライマーを用いて
元々の全長ＰＳＲに関してＰＣＲによって構築する：
５'プライマー：5' GATCGAAGTCCTTCCTTCTGTATATGGCTG
3'（配列番号：７）はＨindIII部位を含み、続いて開始
コドンから出発するＰＳＲコーディング配列の１９ヌク
レオチドを含む；３'配列：5' CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCT
GGGACGTCGTATGGGTATTGGGAGGCCCAGCAGGT 3'（配列番号：
８）はＸbaＩ部位、翻訳終結コドン、ＨＡタグおよびＰ
ＳＲコーディング配列の最終の１８ヌクレオチド（終止
コドンハイブリダイゼーション含まない）に相補的な配
列を含む。

【００８７】それゆえ、そのＰＣＲ産物はＨindIII部位
およびインフレームで融合したＨＡタグが続くＰＳＲコ
ーディング配列およびＸbaＩ部位を含む。そのＰＣＲ増
幅したＤＮＡ断片およびベクターpcＤＮＡＩ／ＡmpをＨ
indIIIおよびＸbaＩ制限酵素で消化してライゲーション
する。そのライゲーション混合物を大腸菌株ＳＵＲＥ
（ストラタジーン・クローニング・システムズ（Strata
gene Cloning Systems）、ラ・ホラ、カリフォルニア）
に形質転換して、その形質転換した培養物をアンピシリ
ン培地プレートにプレーティングし、ついで耐性コロニ
ーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離
し、ついで正確な断片の存在のために制限分析によって
試験する。

【００８８】組換えＰＳＲの発現のため、ＣＯＳ細胞を
ＤＥＡＥ−デキストラン法（サンブルック、フィリッチ
（E. Fritsch）、マニアチス（T. Maniatis）、モレキ
ュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュア
ル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、
（１９８９））によって発現ベクターでトランスフェク
ションする。ＰＳＲ ＨＡタンパク質の発現を放射線標
識および免疫沈降法（ハーロウ（E. Harlow）、レーン
（D. Lane）、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、（１９８８））により検出する。２日
間のトランスフェクションの後、^３５Ｓ−システインで
８時間標識する。ついで培養培地を回収し、その細胞を
界面活性剤（ＲＩＰＡバッファー（１５０mＭ ＮaＣl、
１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、
０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ７.５）にて溶解
する（ウィルソンら、上記、３７：７６７（１９８
４））。細胞リゼイトおよび培養培地の両者をＨＡ特異
的モノクローナル抗体で沈澱させる。沈澱したタンパク
質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析する。

【００８９】実施例４ ヒト組織におけるＰＳＲの発現パターン ヒト組織におけるＰＳＲの発現のレベルを調べるためノ
ーザンブロット分析を行った。総細胞ＲＮＡサンプルを
ＲＮＡzol^ＴＭＢシステム（バイオテックス・ラボラト
リーズ・インク（Biotecx Laboratories, Inc.）６０２
３ サウス・ループ・イースト（South Loop East）、ヒ
ューストン、テキサス７７０３３）で単離した。特定の
各ヒト組織から単離した総ＲＮＡの約１０μgを１％ ア
ガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルターにブロッ
トした（サンブルック、フリッチュおよびマニアチス、
モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニ
ュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、
（１９８９））。その標識反応は、５０ｎgのＤＮＡ断
片とともにストラタジーンプライム−イット キット（S
tratagene Prime-It kit）に従って行った。標識したＤ
ＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラムで精製した。（５ プラ
イム−３ プライム、インク、ブルダー（Boulder）、コ
ロラド）。ついで、フィルターを放射性標識したＰＳＲ
遺伝子の全長と０.５Ｍ ＮaＰＯ_４、ｐＨ７.４および７
％ ＳＤＳ中で１,０００,０００cpm／mlで６５℃で一夜
ハイブリダイズさせた。室温で２回洗浄した後、６０℃
で０.５×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで２回洗浄し、つい
でフィルターを増感紙で−７０℃で一晩露光させた（表
１参照）。先の教示から見て、本発明の多数の変更およ
び変化が可能であることから、追記する請求の範囲内
で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことができ
る。

【００９０】 SEQUENCE LISTING <110> HUMAN GENOME SCIENCES, INC. <120> Human Prostatic Specific Reductase <130> 157097 <150> JP 08-522224 <151> 1995-01-20 <160> 8 <210> 1 <211> 1186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA coding for prostatic specific reductase (PSR) <400> ccggcagaga tggttgagct catgttcccg ctgttgctcc tccttctgcc cttccttctg 60 tatatggctg cgccccaaat caggaaaatg ctgtccagtg gggtgtgtac atcaactgtt 120 cagcttcctg ggaaagtagt tgtggtcaca ggagctaata caggtatcgg gaaggagaca 180 gccaaagagc tggctcagag aggagctcga gtatatttag cttgccggga tgtggaaaag 240 ggggaattgg tggccaaaga gatccagacc acgacaggga accagcaggt gttggtgcgg 300 aaactggacc tgtctgatac taagtctatt cgagcttggg ctaagggctt cttagctgag 360 gaaaagcacc tccacgtttg gatcaacaat gcaggagtga tgatgtgtcc gtactcgaag 420 acagcagatg gctttgagat gcacatagga gtcaaccact tgggtcactt cctcctaacc 480 catctgctgc tagagaaact aaaggaatca gccccatcaa ggatagtaaa tgtgtcttcc 540 ctcgcacatc acctgggaag gatccacttc cataacctgc agggcgagaa attctacaat 600 gcaggcctgg cctactgtca cagcaagcta gccaacatcc tcttcaccca ggaactggcc 660 cggagactaa aaggctctgg cgttacgacg tattctgtac accctggcac agtccaatct 720 gaactggttc ggcactcatc tttcatgaga tggatgtggt ggcttttctc ctttttcatc 780 aagactcctc agcagggagc ccagaccagg ctgcactgtg ccttaacaga aggtcttgag 840 attctaagtg ggaatcattt cagtgactgt catgtggcat gggtctctgc ccaagctcgt 900 aatgagacta tagcaaggcg gctgtgggac gtcattgtga cctgctgggc ctcccaatag 960 actaacaggc agtgccagtt ggacccaaga gaagactgca gcagactaca cagtacttct 1020 tgtcaaaatg attctccttc aaggttttca aaacctttag cacaaagaga gcaaaacctt 1080 ccagcc 1086 <210> 2 <211> 316 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of prostatic specific reductase (PSR) deduced from the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1 <400> Met Val Glu Leu Met Phe Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Phe 5 10 15 Leu Leu Tyr Met Ala Ala Pro Gln Ile Arg Lys Met Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Val Cys Thr Ser Thr Val Gln Leu Pro Gly Lys Val Val Val 35 40 45 Val Thr Gly Ala Asn Thr Gly Ile Gly Lys Glu Thr Ala Lys Glu 50 55 60 Leu Ala Gln Arg Gly Ala Arg Val Tyr Leu Ala Cys Arg Asp Val 65 70 75 Glu Lys Gly Glu Leu VAl Ala Lys Glu Ile Gln Thr Thr Thr Gly 80 85 90 Asn Gln Gln Val Leu Val Arg Lys Leu Asp Leu Ser Asp Thr Lys 95 100 105 Ser Ile Arg Ala Trp Ala Lys Gly Phe Lys Ala Glu Glu Lys His 110 115 120 Leu His Val Trp Ile Asn Asn Ala Gly Val Met Met Cys Pro Tyr 125 130 135 Ser Lys Thr Ala Asp Gly Phe Glu Met His Ile Gly Val Asn His 140 145 150 Leu Gly His Phe Leu Leu Thr His Leu Leu Leu Glu Lys Leu Lys 155 160 165 Glu Ser Ala Pro Ser Arg Ile Val Asn Val Ser Ser Leu Ala His 170 175 180 His Leu Gly Arg Ile His Phe His Asn Leu Gln Gly Glu Lys Phe 185 190 195 Tyr Asn Ala Gly Leu Ala Tyr Cys His Ser Lys Leu Ala Asn Ile 200 205 210 Leu Phe Thr Gln Glu Leu Ala Arg Arg Leu Lys Gly Ser Gly Val 215 220 225 Thr Thr Tyr Ser Val His Pro Gly Thr Val Gln Ser Glu Leu Val 230 235 240 Arg His Ser Ser Phe Met Arg Trp Met Trp Trp Leu Phe Ser Phe 245 250 255 Phe Ile Lys Thr Pro Gln Gln Gly Ala Gln Thr Arg Leu His Cys 260 265 270 Ala Leu Thr Glu Gly Leu Glu Ile Leu Ser Gly Asn His Phe Ser 275 280 285 Asp Cys His Val Ala Trp Val Ser Ala Gln Ala Arg Asn Glu Thr 290 295 300 Ile Ala Arg Arg Leu Trp Asp Val Ile Val Thr Cys Trp Ala Ser 305 310 315 Gln <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer used in PCR for amplifying the PSR nucleotide sequence <400> aagagatcca gaccacgaca gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer used in PCR for amplifying the PSR nucleotide sequence <400> aaggcacagt gcagcctggt ct 22 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer used in PCR for amplifying the PSR nucleotide sequence <400> gatcgatgtc gacctgtcca gtggggtgtg tac 33 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer used in PCR for amplifying the PSR nucleotide sequence <400> atcgatctct agattatgtt agtctattgg gaggccc 37 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer used in PCR for amplifying the PSR nucleotide sequence <400> gatcgaagtc cttccttctg tatatggctg 30 <210> 8 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer used in PCR for amplifying the PSR nucleotide sequence <400> cgctctagat caagcgtagt ctgggacgtc gtatgggtat tgggaggccc agcaggt 57

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＰＳＲポリペプチドのｃＤＮＡ配列および対
応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸には標準１文
字省略記号を使用する。

【図２】 ＰＳＲポリペプチドのｃＤＮＡ配列および対
応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸には標準１文
字省略記号を使用する。

【図３】 他の還元酵素に対するＰＳＲのホモロジーを
示す。枠囲みしたアミノ酸はポリペプチド間で正確に一
致するものである。

【図４】 他の還元酵素に対するＰＳＲのホモロジーを
示す。枠囲みしたアミノ酸はポリペプチド間で正確に一
致するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポール・エス・マイスナー アメリカ合衆国20838メリーランド州バー ネスビル、バーネスビル・ロード18040番 ピー・オー・ボックス306 (72)発明者 ピーター・エル・ハドソン アメリカ合衆国20874メリーランド州ジャ ーマンタウン、ハイストリーム・ドライブ 19041番 (72)発明者 クレイグ・エイ・ローゼン アメリカ合衆国20882メリーランド州レイ トンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA04 DA02 DA06 GA11

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 本明細書に記載したヒト前立腺特異的還
   元酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。