【書類名】 明細書
【発明の名称】 植物色素化合物及びその利用
【特許請求の範囲】
【請求項１】 次の一般式（Ｉ）
【化１】
〔式中、Ｒ1及びＲ2は一緒になって−Ｏ−を形成するか；あるいは、
Ｒ1は、下記の基（ａ）：
【化２】
または、下記の基（ｂ）：
【化３】
または、下記の基（ｃ）：
【化４】
または、下記の基（ｄ）：
【化５】
または、下記の基（ｅ）：
【化６】
であり、そして
Ｒ2は−ＯＨである〕
により表わされる化合物。
【請求項２】 次の式（II）：
【化７】
により表わされる化合物。
【請求項３】 次の式（III)：
【化８】
により表わされる化合物。
【請求項４】 次の式（IV)：
【化９】
により表わされる化合物。
【請求項５】 次の式（Ｖ）：
【化１０】
により表わされる化合物。
【請求項６】 次の式（VI）：
【化１１】
により表わされる化合物。
【請求項７】 次の式（VII）：
【化１２】
により表わされる化合物。
【請求項８】 請求項１，２，４又は７に記載の化合物の製造方法において、バラ植物から、上記化合物を採取することを特徴とする方法。
【請求項９】 前記バラ植物が、マダムビオレ、パープルレイン、ラバンデ、マンハッタンブルー、シャンテリーレース、ブルームーン、タソガレ、シャルルドゴール、バイオレットドリー、ブルーリボン、アオゾラ、レディエックス、ブルーバユー、またはスターリングシルバーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】 請求項３〜５のいずれか１項に記載の化合物の製造方法において、請求項２に記載の化合物を部分加水分解することを特徴とする方法。
【請求項１１】 花弁の色素の含量が変化したバラ植物の製造方法において、バラ植物の組織、器官またはカルスを変異原により処理し、処理した組織、器官またはカルスから個体を再生し、そして、色素の量の変化を指標としてバラ植物を選択することを特徴とする方法。
【請求項１２】 バラ植物のカルスを変異原により処理して突然変異を誘発させることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】 重イオンビーム照射により突然変異を誘発させて花弁の色素の含量を変化させることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】 選択の指標とする前記色素が、請求項１に記載の一般式（I）で表される色素である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】 選択の指標とする前記色素が、請求項２に記載一般式（II）で表される色素である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】 一般式（I）で表される色素の濃度が0.033mg/g花弁以上であることを選択の指標とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】 一般式（II）で表された色素の濃度が0.033mg/g花弁以上であることを選択の指標とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】 花弁の色素の含量の変化を、色相角度で測定することを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】 色相角度が343以下であることを選択の指標とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】 請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法により得られる、花弁の色素含量が変化したバラ植物。
【請求項２１】 花弁中の、式（II）、（VI）または（VII）により示される色素の含量が、0.036mg/g花弁以上である、バラ植物。
【請求項２２】 花弁中の、式（II）により示される色素の含量が0.036mg/g花弁以上である、請求項２１に記載のバラ植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物、特にバラの色素、例えば青色色素、及びその製造方法、並びにこれらの色素が増強された新規なバラ植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バラは切り花として重要な植物であり、その色素は詳細に調べられている。例えばアントシアニン系色素としては、シアニジン ３，５−ジグルコシド、ペラルゴニジン ３，５−ジグルコシド、シアニジン ３−グルコシド、ペラルゴニジン ３−グルコシド、ペオニジン ３，５−ジグルコシド、ペオニジン ３−グルコシドが知られている。また、黄色を呈する多くのカロテノイド化合物も知られている。これらの色素が一緒になって赤色〜橙色を呈し、このため青や紫の花を咲かせるバラは知られていない。また、バラ科植物の交配を繰り返すことによる育種が試みられているが、青や紫色を呈する花を咲かせるバラの育種には成功していない。
【０００３】
青色の花を咲かせるバラを育種するためにはバラの花に青色色素を増加させる必要があり、そのための手段の１つとして、青色色素を生合成する酵素系をコードする遺伝子系をバラ植物に導入してトランスジェニック植物を作出することが考えられるが、このためには、バラにおいて効果的な青色色素の構造を解明してその生合成系に関与する酵素を特定する必要がある。しかしながら、バラに青色色素が存在することは知られていたものの、その色素が単離されたことはなく、その構造が調べられたこともない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、バラに由来する新規な色素化合物及びそれらから誘導される色素化合物を提供しようとするものである。本発明はさらに、変異処理により作出した、青色色素が増加したバラ植物を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明は、次の一般式（Ｉ）：
【化１３】
〔式中、Ｒ1及びＲ2は一緒になって−Ｏ−を形成するか；あるいは
Ｒ1は、下記の基（ａ）：
【化１４】
【０００６】
または、下記の基（ｂ）：
【化１５】
【０００７】
または、下記の基（ｃ）：
【化１６】
【０００８】
または、下記の基（ｄ）：
【化１７】
【０００９】
または、下記の基（ｅ）：
【化１８】
であり、そして
Ｒ2は−ＯＨである〕
により表わされる化合物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、上記の化合物の製造方法を提供する。
本発明はさらに、青色色素が増強されたバラ植物の製造方法において、バラ植物の組織もしくは器官を変異原により処理し、又はバラ植物から誘導されたカルスを変異原により処理し、変異原処理されたカルスの場合はバラ植物を再生し、そして青色色素が増強されたバラ植物を選択する、ことを特徴とする方法を提供する。
本発明はまた、上記の方法により製造されたバラ植物を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の色素化合物の内、一般式（Ｉ）においてＲ1とＲ2が一緒になって−Ｏ−を構成する化合物（化合物VIと称する）、一般式（Ｉ）においてＲ1が上記式（ａ）により表わされ、そしてＲ2が−ＯＨである化合物（化合物IIと称する）、及び一般式（Ｉ）においてＲ1が上記式（ｅ）により表わされ、そしてＲ2が−ＯＨである化合物（化合物VIIと称する）は、バラの花弁の抽出により得られる。具体的な抽出方法は実施例１，２及び４に示す。
【００１２】
また、式（Ｉ）において、Ｒ1が基（ｂ）であり、そしてＲ2が−ＯＨである化合物（化合物IIIと称する）；Ｒ1が基（ｃ）であり、そしてＲ2が−ＯＨである化合物（化合物IVと称する）；及びＲ1が（ｄ）であり、そしてＲ2が−ＯＨである化合物（化合物Ｖと称する）は、化合物IIを部分加水分解（穏和な条件下での加水分解）することにより得られる。具体的な方法を実施例３に記載する。
【００１３】
本発明の化合物（III），（IV）及び（Ｖ）はまた、化合物（VI）に、最終化合物に対応する置換基（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）を縮合させることによっても製造することができる。また、本発明の化合物（III）及び（IV）は、化合物（Ｖ）に１個又は２個の没食子酸を結合させることによっても製造することができる。
本発明によればさらに、化合物（Ｖ）又は（Ｖ）に種々の没食子酸誘導体を縮合せしめることにより、対応する種々の色素化合物を得ることができる。
【００１４】
本発明はさらに、変異処理により青色色素が増強されたバラ植物を提供する。この方法は、バラ植物の組織、例えば葉、茎頂、根等から常法に従ってカルスを形成し、このカルスを、あるいはバラ植物の組織又は器官自体を、常用の変異原、例えば、窒素イオンビーム、ネオンイオンビーム等の重イオンビーム、γ−線、Ｘ−線、放射線などの物理的変異原、あるいはＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）やＥＩ（エチレンイミン）、ＮＭＵ（ニトロソメチルウレア）、ＭＮＮＧ（メチルニトロソグアニジン）アジ化ナトリウムなどの化学的変異原等により処理する。
【００１５】
次に、変異処理した組織、器官又はカルスを常法に従って培養して、再生を行い、再生した植物あるいは変異処理した植物自体から色素を抽出し、変異処理前の親植物からの抽出物に比べて色素、例えば青色色素が増加している植物を選択すればよい。この具体例を実施例５に記載する。
【００１６】
一般に、色調呈色の程度は、可視紫外吸収スペクトルの極大吸収値λｍａｘの数値で表現することができる。凡その目安として、４８０nmであれば橙色、５２０nmであれば赤、５４０nmであれば紫、５６０nmであれば青いとされるが、天然に青色の花が極めてまれであることから花卉業界においては花色の場合紫ががった色は青色と称する慣習があり、このため青色の範囲はλｍａｘが５４０nm以上、さらに好ましくは５５０nmから６２０nmの範囲であり、本発明により得られた色素はこの範囲であることを、実施例に記載する。
また、色調呈色の程度は、測色計を用いて色相角度を測定することにより簡便に知ることもできる。色調をＬ*ａ*ｂ*表色系で表した場合の色相角度で表現すると４０〜６５°が橙色、０〜４０°が赤色、３２０〜３６０（０）°が紫、３００〜３３０°がすみれ色、２８０〜３００°が青紫、２４０〜２８０°が青色に分類されるが、花卉業界においては紫やすみれ色の花は慣例的に青花と呼ばれる。本発明により得られたバラ植物の花弁はいわゆる青花、すなわち紫の範囲の色相角度を呈することを、実施例に記載する。
種々の既知のバラについて、花弁中の青色色素（II）の含量を測定したところ、実施例６の表４に示すごとく、最も含量の高いパープルレインにおいて0.036mg/g花弁であり、他のバラの花弁におけるこの色素の含量はいずれもこの量より少なかった。これに対して、実施例５の表３の下表に示すごとく、本発明により、花弁中の青色色素（II）がおよそ0.05〜0.08mg/g花弁にまで増加しており、花弁の青色色素が増大しているバラが初めて得られた。
【００１７】
従って、本発明はまた、式（II）、（VI）または（VII）により示される色素の含量が、花弁中で、従来種よりも増大しているすなわち0.036mg/g以上である新規なバラを提供する。本発明は特に、花弁中で、式（II）で示される色素が0.036mg/g以上である新規なバラを提供する。好ましくは、式（II）、（VI）または（VII）で示される色素、特に式（II）で示される色素の含量は、0.04mg/g花弁以上、例えば0.047mg/g花弁以上、より好ましくは0.05mg/g花弁以上、更に好ましくは0.055mg/g花弁以上、さらに好ましくは0.06mg/g花弁以上、さらに好ましくは0.07mg/g花弁以上、更に好ましくは、表３のN10-28により示されるごとく、0.08mg/g花弁以上である。
【００１８】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に記載する。
実施例１．色素化合物（II）の単離
バラ品種「マダムビオレ」の花弁7.9kgをホモジナイザーを用いて液体窒素中で凍結粉砕し、得られたパウダーに0.1%TFAを含む80%アセトニトリル15Lを加え一晩浸漬した。珪藻土ろ過し、残査は0.1%TFAを含む50%アセトニトリル14Lに再び一晩浸漬し、珪藻土ろ過した。2回のろ液を合せてロータリーエバポレーターで約2/5の体積まで濃縮した。
【００１９】
この濃縮した抽出液を0.1%TFAを含む30%アセトニトリルで平衡化したSephadexLH-20カラム（ファルマシア）(9L)に負荷した。0.1%TFAを含む30%アセトニトリル45Lでアントシアニンを含む画分を溶出した後、60%アセトニトリルで青色色素（化合物II及びVII）を含む画分（35L）を溶出した。さらに80%アセトンで化合物VIを含む画分（8L）を溶出した。
60%アセトニトリル溶出画分はロータリーエバポレーターで約1/3に濃縮した後、吸着樹脂HP-20（三菱化成）1.5Lに負荷した。2Lの水洗後3Lの0.1%TFAを含む10%アセトニトリル、0.1%TFAを含む50%アセトニトリルでステップワイズに溶出した。50%画分に青色色素（化合物II）が溶出した。
【００２０】
この画分を凍結乾燥後、分取HPLCで精製した。カラムはC8のDYNAMAX-60A（レイニン社製）4cmφ×30cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.5%TFA、20ml/min.、以下のグラジエントで行った。B40%(30min保持）B40→B100%のリニアグラジエント（50min）検出はA260nm−AUFS:2.56。50-60minに溶出した化合物IIを集め凍結乾燥した。クロマトは17回にわけて繰り返し行った（化合物（II）の純度約1%）。
【００２１】
C8で得られた青色色素画分をODSカラムで再度クロマトを行った。カラムはDeverosil-ODS（野村化学社製）5cmφ＊30cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.5%TFA、32ml/min.、以下のグラジエントで行った。B45%(20min保持）B45→B70%のリニアグラジエント（50min）検出はA260nm−AUFS:1.0。55-62minに溶出した化合物IIを集め凍結乾燥した。クロマトは6回にわけて繰り返し行った（化合物（II）の純度約15%）。
【００２２】
ODSで得られた青色色素をさらに精製した。カラムはAsahipak-ODP50（昭和電工社製）2.15cmφ＊30cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.5%TFA、6ml/min.、以下のグラジエントで行った。B65%(35min保持）B65→B75%のリニアグラジエント（15min）検出はA260nm−AUFS:0.64。47-68minに溶出した化合物IIを集め凍結乾燥した。クロマトは16回にわけて繰り返し行った（化合物IIの純度約70-95%）。
【００２３】
この化合物の構造をNMR、FAB-MSなどにより決定したところ、下記の式（II）(Ｃ56Ｈ37Ｏ31）：
【化１９】
により表わされることが明らかになった。
【００２４】
この化合物（II）の理化学的性質は、次の通りであった。
１．可視紫外吸収スペクトル
82μg の化合物（II）を5mlのメタノールに溶解し、700-200nmの吸収スペクトルを測定した（島津分光光度計UV-265）。この結果を図１及び下記表１に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
２．FAB-MSーネガティブ、ポジティブ及び高分解能質量分析の測定を行った。
1203(M-2H)- 、1205 (M)+
分子式は高分解能質量分析により求めた。
Ｃ56Ｈ37Ｏ31、MW=1205.1319、Err +0.2ppm/+0.2mmu U.S.:38.5
３．NMRスペクトル
20mgの化合物（II）を用いて0.5%TFA-d/DMSO-d6、0.6ml中でBruker DMX-750で測定した。測定項目は1H、13C、DQF-COSY、HSQC、HMBC(65ms、300ms)、NOESY(100ms、200ms、500ms、1sec) であった。1H NMR及び13C NMRの結果を図５に示す。
【００２７】
また、単離した化合物（II）のＨＰＬＣのクロマトグラムを図２に示す。分析条件は、次の通りであった。
分析条件はカラム：昭和電工Asahipack ODP-50 4.6mm*250mm、移動相：35%CH3CN,0.5%TFA、検出：A560nm及び250-650nm（Photodiode array検出器島津SPD-M10A）
溶出時間17分及び20分のピークの合計面積を化合物（II）として計算。
この化合物はメタノール、エタノール、アセトニトリル、DMSO又はアセトン溶液においてλmax 580nm付近の青色を呈し、水溶液においてλmax 560nmの青紫色を呈する。
【００２８】
実施例２ 色素化合物（VI）の単離
実施例１において、Sephadex LH-20から80％アセトンにより溶出した画分を吸着樹脂HP-20（三菱化成）1.5Lに負荷した。2Lの水洗後2Lの0.1%TFAを含む15%アセトニトリル、0.1%TFAを含む20%アセトニトリル、0.1%TFAを含30%アセトニトリルでステップワイズに溶出した。30%画分に化合物VIが溶出した。
【００２９】
30%アセトニトリル画分を凍結乾燥しその粉末を7回に分けて分取HPLCにかけた。カラムはDeverosil-ODS（野村化学社製）5cmφ＊50cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.5%TFA、32ml/min.、以下のグラジエントで行った。B30%(30min保持）B30→B100%のリニアグラジエント（30min）の後B100%で50min保持した。検出はA260nm−AUFS:1.28。90-92minに溶出した化合物VI画分を集め凍結乾燥した（化合物（VI）の純度約5%）。
【００３０】
5cmの分取HPLCで得られた色素画分をセミ分取HPLCで再度精製した。カラムはD-ODS-5（野村化学）2 cmφ＊30cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.1%HCl、6ml/min.、以下のグラジエントで行った。B70%(30min保持）B70→B100%のリニアグラジエント（20min）B100%を30min保持。検出はA260nm−AUFS:0.32。50-53minに溶出した化合物VI画分を集め凍結乾燥した（化合物VIの純度約30-60%）。
得られた色素を少量のエタノールに溶かし徐々に水を加えて静置した。沈殿した赤色色素を遠心分離により補集した（化合物（VI）の純度約90%）。
【００３１】
この化合物の構造は、NMR、FAB-MSなどにより、次の式（VI）(Ｃ22Ｈ11Ｏ9）：
【化２０】
であることが決定された。
【００３２】
化合物（VI）の理化学的性質は次の通りであった。
１．可視紫外吸収スペクトル
λmax＝529nm（0.5%TFA、35%アセトニトリル中）であった。この結果を図３に示す。
２．マススペクトル及び高分解能質量分析
FAB-MSはJEOL-DX-300/DA-5000でポジティブの測定を行った。
M+＝419
高分解能質量分析により求めた分子式：Ｃ22Ｈ11Ｏ9、MW=419.0409
【００３３】
３．NMRスペクトル
2mgの化合物（VI）を用いて0.5%DCl/DMSO-d6、0.6ml中でBruker DMX-750で測定した。測定項目は1H、13C、DQF-COSY、HSQC、HMBC、NOESYであった。1H NMRの結果を図６に示す。
この化合物はメタノール又はエタノール溶液において赤色を呈する。
【００３４】
実施例３． 化合物（II）の加水分解による化合物（III）,（IV）及び（Ｖ）の製造
化合物（II） 20mgを5%EtOHを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH5.5）に溶解しTannase（フナコシ株式会社）10mgを加え室温で16時間攪拌した。セップパックC18（ウォーターズ株式会社）に反応液を負荷し水洗後、0.1%TFAを含む50%CH3CN／H2Oで反応物を溶出した。この反応物を分取HPLCでクロマトし化合物（II）から没食子酸が1個または2個外れた色素を得た。
【００３５】
分取HPLCの条件
カラム：YMC-polymerC18、 2cmｘ30cm
移動相：0.5%TFAを含むCH3CN25%から50%のグラジエント溶出を50分の後50%CH3CNを30分保持した。このクロマトで53〜55分に溶出した物が化合物（Ｖ）である。また65〜67分溶出した物が化合物（III）及び化合物（IV）であった。
これらの化合物は35%CH3CN、0.5%TFA中で化合物IIと同様に580nmに極大吸収をもつ青色色素であった。
【００３６】
上記の方法により得た分解生成物を、NMR、FAB-MSなどにより構造決定したところ、各化合物の構造は次の通り、決定された。
化合物（III)の構造：
【化２１】
【００３７】
化合物（IV）の構造：
【化２２】
【００３８】
化合物（Ｖ）の構造：
【化２３】
【００３９】
化合物（III）,（IV）及び（Ｖ）の理化学的性質は次の通りであった。
化合物（III）（Ｃ49Ｈ33Ｏ27）
λｍａｘ（３５％ ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ、0.5％ TFA）580nm
FAB-MS [M]+＝1053
化合物（IV）（Ｃ49Ｈ33Ｏ27）
λｍａｘ（３５％ ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ、0.5％ TFA）580nm
FAB-MS [M]+＝1053
【００４０】
化合物（Ｖ）（Ｃ42Ｈ 29 Ｏ23）
λｍａｘ（３５％ ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ、0.5％ TFA）578nm
FAB-MS [M]+＝901
化合物（III）,（IV）及び（Ｖ）は、メタノール、エタノール、アセトニトリル又はアセトン溶液においてλmax 580nm付近の青色を呈し、水溶液においてλmax 560nmの青紫色を呈する。
【００４１】
実施例４． 色素化合物（VII ）の単離
バラ品種「マダムビオレ」（月本バラ園（京都）より購入）の花弁7.9kgをホモジナイザーを用いて液体窒素中で凍結粉砕し得られたパウダーに0.1%TFAを含む80%アセトニトリル15Lを加え一晩浸漬した。珪藻土ろ過し、残査は0.1%TFAを含む50%アセトニトリル14Lに再び一晩浸漬し、珪藻土ろ過した。2回のろ液を合せてロータリーエバポレーターで約2/5の体積まで濃縮した。
【００４２】
この濃縮した抽出液を0.1%TFAを含む30%アセトニトリルで平衡化したsephadexLH-20カラム（ファルマシア）(9L)に負荷した。0.1%TFAを含む30%アセトニトリル45Lでアントシアニンを含む画分を溶出した後、60%アセトニトリルで青色色素（化合物II及びVII）を含む画分（35L）を溶出した。さらに80%アセトンで化合物（VI）を含む画分（8L）を溶出した。
【００４３】
60%アセトニトリル溶出画分はロータリーエバポレーターで約1/3に濃縮した後、吸着樹脂HP-20（三菱化成）1.5Lに負荷した。2Lの水洗後3Lの0.1%TFAを含む10%アセトニトリル、0.1%TFAを含む50%アセトニトリルでステップワイズに溶出した。50%画分に青色色素（化合物II及びVII）が溶出した。この画分を凍結乾燥後、分取HPLCで精製した。
【００４４】
カラムはDeverosil-ODS（野村化学社製）5cmφ＊50cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.5%TFA、32ml/min.、以下のグラジエントで行った。B45%(20min保持）B45→B70%のリニアグラジエント（50min）検出はA260nm−AUFS:1.0。51-54minに溶出した青色色素を集め凍結乾燥した。
ODSで得られた青色色素をさらに精製した。
カラムはYMC-polymerC18（YMC社製）2cmφ＊30cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.5%TFA、6ml/min.、以下のグラジエントで行った。B75%(30min保持）B75→B100%のリニアグラジエント（20min）の後B100%30分保持。検出はA560nm−AUFS:0.06、52-62minに溶出した青色色素を集め凍結乾燥した。（化合物VIIの純度約20%）。
【００４５】
polymerC18で得られた青色色素をさらに精製した。カラムはDeverosil C30-UG（野村化学社製）2cmφ＊30cm、移動相はA:水、B:50%アセトニトリル0.5%TFA、6ml/min.、以下のグラジエントで行った。B52%(30min保持）B52→B100%のリニアグラジエント（20min）の後B100%、20分保持。検出はA560nm−AUFS:0.06、44-55minに溶出した青色色素を集め凍結乾燥した。（化合物VIIの純度約90%）
【００４６】
化合物VIIの理化学的性質
（１）可視紫外吸収スペクトル
Shimadzu Photodiodearray検出器で650-250nmの吸収スペクトルを測定した。結果を図７に示す。
（２）FAB-MSで高分解能MSの測定を行った。その結果分子量は1357.1510で、分子式はC63H 41 O35であった。
（３）NMRスペクトル
4mgの化合物VIIを用いて1%DCl/DMSO-d6、0.5ml中でBruker DMX-750で測定した。測定項目は1H、DQF-COSY、TOCSY、HSQC、HMBC、NOESY 結果を図８に示す。
（４）色素化合物（VII）の構造は次の通りである。
【００４７】
【化２４】
【００４８】
（５）分子量など
1357.98（C63H41O35 +）；C55.72；H3.04；O41.24
実施例５． 青色色素が増強されたバラの作出
カルスの形成
マダムビオレの茎頂を、ＭＳ培地にベンジルアデニン（BA）2.25mg／Ｌ、ジベレリン（GA）3.46mg／Ｌ、ショ糖30ｇ／Ｌ及びジェランガム２ｇ／Ｌ加えた固体培地で培養し、カルスを誘導した。
【００４９】
変異処理
リングサイクロトロン施設において、窒素イオンビーム（135MeV/u)及びネオンイオンビーム（135MeV/u)をそれぞれ０〜50Gyの線量で照射した。
植物の再成
各照射につき50個づつ（計900個）のカルスを用い、次のようにして植物の再生を行った。ベンジルアデニン（BA）１mg／Ｌ及びナフタレン酢酸（NAA）0.005mg／Ｌを添加したＭＳ改変培地にカルスを移植し、再生シュートを得た。再生シュートを発根処理した後、馴化し、鉢上げし、温室で栽培して開花させた。
上記の方法において、900個のカルスから378の再生個体を得て、色調又は形状の変化した個体47株を得た。
結果を次の表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
色素の分析
上記の方法により再生した植物を温室で栽培し、開化させた後、花弁に含まれる化合物II及びシアニジンを次のようにして測定した。花弁を約0.5ｇ秤量し、凍結乾燥した後、５０％ ＣＨ3ＣＮ／0.1％ TFA溶液４mlで抽出を行った。化合物（II）は実施例１に記載した方法によりＨＰＬＣを行った。
【００５２】
一方、シアニジンは、抽出液を0.2ml乾固し、0.2mlの6N-HCl中で100℃で20分加水分解した後、HPLCで分析した。分折条件はカラム：YMC ODS-A312 6mm*150mm、移動相：CH3COOH：CH3OH：H2O＝15:20:65、検出：A520nm及び400-600nm（Photodiode array検出器島津SPD-M10A）とした。
結果を次の表３に示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
上記の通り、花弁の色が、親植物のそれに比べて赤方向に変化したバラ植物が10個体、青方向に変化したバラ植物が６個体得られた。
なお、色素をＨＰＬＣにより分析した結果の１例を図４に示す。
【００５５】
実施例６． 各バラ品種の花弁中の化合物（II）の含量
実施例１及び５に記載した方法により、各バラ品種の花弁中の化合物IIの含量を測定し、次の表４に示す。
【００５６】
【表４】
藤色系のバラにはどれも化合物（II）が含まれていることが確認された。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、バラの花弁中の青色系色素の幾つかが抽出、単離され、またその誘導体が得られ、それらの構造が解明された。これにより、バラの色を遺伝子工学的に改変した新規なバラ植物の作出の基礎が与えられたのみならず、本発明の色素は、例えばバラなどの切花に吸収させることにより切花の色を改良するのに使用できる可能性があり、さらにはより一般に植物性天然色素として、例えば飲食物の加色などへの利用も期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の化合物（II）のメタノール中での可視〜紫外線吸収スペクトルを示す図である。
【図２】
図２は本発明の化合物（II）をＨＰＬＣにより分析した際のクロマトグラムで、化合物（II）は糖の１位がαとβの互変異性を示すため２本のピークが認められる。
【図３】
図３は、本発明の化合物（VI）の溶剤３５％ＣＨ3ＣＮ／0.5％ TFA中での可視〜紫外線吸収スペクトルを示す図である。
【図４】
図４は実施例４においてバラ品種マダムビオレを重イオン照射した物と同様にカルスから再生した非照射の株の花弁から抽出した色素をＨＰＬＣにより分析した結果を示すクロマトグラムであり、クロマトグラム中の１８．８５分及び２２．５２分のピークが、互変異性体からなる混合物である化合物（II）を構成する図２における１７．０６分と１９．８７分のピークに相当する。
【図５】
図５は、化合物（II）の 1 Ｈ ＮＭＲスペクトル及び13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】
図６は、化合物（VI）の 1 Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】
図７は、色素化合物（VII ）の650-250nm吸収スペクトルを示す。
【図８】
図８は、色素化合物（VII ）の 1 Ｈ NMRスペクトルを示す。
[Document name] Description [Title of invention] Plant pigment compound and its use [Claims]
1. The following general formula (I)
Embedded image
R 1 represents the following group (a):
Embedded image
Or the following group (b):
Embedded image
Or the following group (c):
Embedded image
Or the following group (d):
Embedded image
Or the following group (e):
Embedded image
And R 2 is —OH.
A compound represented by
2. The following formula (II):
Embedded image
A compound represented by
3. The following formula (III):
Embedded image
A compound represented by
4. The following formula (IV):
Embedded image
A compound represented by
5. The following formula (V):
Embedded image
A compound represented by
6. The following formula (VI):
Embedded image
A compound represented by
7. The following formula (VII):
Embedded image
A compound represented by
8. The method for producing a compound according to claim 1, 2, 4, or 7, wherein the compound is collected from a rose plant.
9. The rose plant is Madam Biore, Purple Rain, Labande, Manhattan Blue, Chantery Lace, Blue Moon, Tasogare, Charles de Gaulle, Violet Dolly, Blue Ribbon, Aozora, Lady X, Blue Bayou, or Sterling Silver. The method of claim 8.
10. A method for producing a compound according to any one of claims 3 to 5, wherein the compound according to claim 2 is partially hydrolyzed.
11. A method for producing a rose plant having altered petal pigment content, comprising treating a rose plant tissue, organ or callus with a mutagen, regenerating an individual from the treated tissue, organ or callus; A method comprising selecting a rose plant using the change in the amount of pigment as an index.
12. The method according to claim 11, wherein the callus of the rose plant is treated with a mutagen to induce a mutation.
13. The method according to claim 11, wherein the mutation is induced by irradiation with a heavy ion beam to change the pigment content of the petals.
14. The method according to any one of claims 11 to 13, wherein the dye as an indicator of selection is a dye represented by the general formula (I) according to claim 1.
15. The method according to any one of claims 11 to 13, wherein the dye as an indicator of selection is a dye represented by the general formula (II) according to claim 2.
16. The method according to claim 14, wherein the concentration of the pigment represented by the general formula (I) is 0.033 mg / g or more petals as an indicator of selection.
17. The method according to claim 15, wherein the concentration of the pigment represented by the general formula (II) is 0.033 mg / g or more petals as an indicator of selection.
18. The method according to claim 11, wherein the change in the pigment content of the petals is measured by a hue angle.
19. The method according to claim 18, wherein a hue angle of 343 or less is used as an indicator of selection.
20. A rose plant obtained by the method according to claim 11, wherein the pigment content of petals is changed.
21. A rose plant wherein the content of the pigment represented by the formula (II), (VI) or (VII) in the petals is 0.036 mg / g or more petals.
22. The rose plant according to claim 21, wherein the content of the pigment represented by the formula (II) in the petals is 0.036 mg / g petal or more.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to plants, especially rose pigments, such as blue pigments, and methods for their production, as well as novel rose plants in which these pigments are enhanced.
[0002]
[Prior art]
Roses are important plants as cut flowers, and their pigments have been investigated in detail. For example, as anthocyanin-based dyes, cyanidin 3,5-diglucoside, pelargonidin 3,5-diglucoside, cyanidin 3-glucoside, pelargonidin 3-glucoside, peonidine 3,5-diglucoside, and peonidine 3-glucoside are known. Many carotenoid compounds exhibiting a yellow color are also known. Roses that combine these pigments to give a red-orange color and thus bloom blue or purple flowers are not known. Although breeding by repeating crosses of Rosaceae plants has been attempted, breeding of roses that bloom in blue or purple has not been successful.
[0003]
In order to breed roses that bloom blue flowers, it is necessary to increase the amount of blue pigment in rose flowers. One of the means for this is to use a gene system encoding an enzyme system that synthesizes blue pigment in rose plants. It is conceivable that the transgenic plant is introduced to produce a transgenic plant. For this purpose, it is necessary to elucidate the structure of an effective blue pigment in rose and to identify enzymes involved in the biosynthetic system. However, although the presence of blue pigments in roses was known, the pigments have never been isolated and their structures have not been investigated.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel dye compound derived from rose and a dye compound derived therefrom. The present invention further provides a rose plant having an increased blue pigment, produced by a mutation treatment.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention provides the following general formula (I):
Embedded image
Wherein R 1 and R 2 together form —O—; or R 1 is a group (a):
Embedded image
[0006]
Or the following group (b):
Embedded image
[0007]
Or the following group (c):
Embedded image
[0008]
Or the following group (d):
Embedded image
[0009]
Or the following group (e):
Embedded image
And R 2 is —OH.
A compound represented by the formula:
[0010]
The present invention also provides a method for producing the above compound.
The present invention further provides a method for producing a rose plant in which the blue pigment is enhanced, wherein the tissue or organ of the rose plant is treated with a mutagen, or the callus derived from the rose plant is treated with a mutagen, and the mutagen is treated. Regenerating rose plants in the case of a callus, and selecting rose plants with enhanced blue pigment.
The present invention also provides a rose plant produced by the above method.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Among the dye compounds of the present invention, in the general formula (I), a compound in which R 1 and R 2 together form —O— (referred to as compound VI), and in the general formula (I), R 1 is a compound represented by the above formula ( a) and R 2 is —OH (designated compound II); and in general formula (I), R 1 is represented by the above formula (e), and R 2 is —OH Certain compounds (designated compound VII) are obtained by extracting rose petals. Specific extraction methods are described in Examples 1, 2, and 4.
[0012]
A compound of formula (I) wherein R 1 is a group (b) and R 2 is —OH (referred to as compound III); R 1 is a group (c); and R 2 is —OH (Referred to as compound IV); and a compound wherein R 1 is (d) and R 2 is —OH (referred to as compound V), partially hydrolyzes compound II (under mild conditions). (Hydrolysis). A specific method is described in Example 3.
[0013]
Compounds (III), (IV) and (V) of the present invention are also prepared by condensing compound (VI) with a substituent (b), (c) or (d) corresponding to the final compound. be able to. Compounds (III) and (IV) of the present invention can also be produced by binding one or two gallic acids to compound (V).
According to the present invention, by further condensing various gallic acid derivatives with compound (V) or (V), various corresponding dye compounds can be obtained.
[0014]
The present invention further provides a rose plant whose blue pigment has been enhanced by mutation treatment. This method forms a callus from a rose plant tissue, for example, a leaf, a shoot apex, a root, or the like according to a conventional method, and converts the callus or the rose plant tissue or organ itself into a common mutagen, for example, a nitrogen ion beam , A heavy ion beam such as a neon ion beam, a physical mutagen such as γ-ray, X-ray, and radiation, or EMS (ethyl methanesulfonic acid), EI (ethylene imine), NMU (nitrosomethylurea), MNNG ( Treatment with a chemical mutagen such as methyl nitrosoguanidine) sodium azide.
[0015]
Next, the mutated tissue, organ or callus is cultured according to a conventional method, regenerated, and a pigment is extracted from the regenerated plant or the mutated plant itself, and compared with the extract from the parent plant before the mutated treatment. For example, a plant having an increased pigment, for example, a blue pigment may be selected. This specific example is described in Example 5.
[0016]
In general, the degree of color tone can be expressed by the value of the maximum absorption value λmax of the visible ultraviolet absorption spectrum. As a rule of thumb, it is considered orange at 480 nm, red at 520 nm, purple at 540 nm, and blue at 560 nm. In the case of, there is a custom that a purple color is called blue, and therefore, the range of blue is λmax of 540 nm or more, more preferably 550 nm to 620 nm, and the dye obtained by the present invention is in this range. This is described in the examples.
Further, the degree of color tone can be easily known by measuring the hue angle using a colorimeter. When the color tone is represented by a hue angle when represented by an L * a * b * color system, 40 to 65 ° is orange, 0 to 40 ° is red, 320 to 360 (0) ° is purple, and 300 to 330 ° is orange. Violet color is classified as blue-violet at 280 to 300 ° and blue at 240 to 280 °, and purple and violet flowers are conventionally called blue flowers in the flower industry. The examples show that the petals of rose plants obtained according to the invention exhibit so-called blue flowers, i.e. exhibit a hue angle in the purple range.
When the content of blue pigment (II) in the petals of various known roses was measured, as shown in Table 4 of Example 6, 0.036 mg / g petal was found in the highest content of purple rain, and other roses were found. In all petals, the content of this pigment was less than this amount. In contrast, as shown in the lower table of Table 3 in Example 5, the blue pigment (II) in the petals was increased to about 0.05 to 0.08 mg / g petals according to the present invention, and the blue pigment in the petals was increased. Rose for the first time was obtained.
[0017]
Accordingly, the present invention also provides novel roses in which the content of the pigment represented by formula (II), ( VI ) or (VII) is increased in petals as compared with the conventional species, that is, 0.036 mg / g or more. I will provide a. The present invention particularly provides novel roses in which the pigment of formula (II) is 0.036 mg / g or more in petals. Preferably, the content of the pigment represented by the formula (II), ( VI ) or (VII), particularly the pigment represented by the formula (II), is 0.04 mg / g petal or more, for example, 0.047 mg / g petal or more, more preferably Is at least 0.05 mg / g petal, more preferably at least 0.055 mg / g petal, more preferably at least 0.06 mg / g petal, more preferably at least 0.07 mg / g petal, more preferably as indicated by N10-28 in Table 3. As it is, it is 0.08 mg / g or more petals.
[0018]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Embodiment 1 FIG . 7.9 kg of petals of rose compound "Madamu Biore" isolated from pigment compound (II) were freeze-ground in liquid nitrogen using a homogenizer, and 15 L of 80% acetonitrile containing 0.1% TFA was added to the obtained powder and immersed overnight. . After diatomaceous earth filtration, the residue was again immersed in 14 L of 50% acetonitrile containing 0.1% TFA overnight, followed by diatomaceous earth filtration. The two filtrates were combined and concentrated to about 2/5 volume with a rotary evaporator.
[0019]
The concentrated extract was loaded on a Sephadex LH-20 column (Pharmacia) (9 L) equilibrated with 30% acetonitrile containing 0.1% TFA. After eluting the fraction containing anthocyanin with 45 L of 30% acetonitrile containing 0.1% TFA, the fraction (35 L) containing the blue dye (compounds II and VII) was eluted with 60% acetonitrile. Further, a fraction (8 L) containing compound VI was eluted with 80% acetone.
The fraction eluted with 60% acetonitrile was concentrated to about 1/3 with a rotary evaporator, and then loaded on 1.5 L of adsorption resin HP-20 (Mitsubishi Chemical). After washing with 2 L of water, elution was performed stepwise with 3 L of 10% acetonitrile containing 0.1% TFA and 50% acetonitrile containing 0.1% TFA. The blue dye (compound II) eluted in the 50% fraction.
[0020]
This fraction was lyophilized and purified by preparative HPLC. The column was C8 DYNAMAX-60A (manufactured by Rainin) 4 cmφ × 30 cm, the mobile phase was A: water, B: 50% acetonitrile 0.5% TFA, 20 ml / min., With the following gradient. A linear gradient (50 min) of B40% (retained for 30 min) B40 → B100% was detected at A260 nm-AUFS: 2.56. Compound II eluted at 50-60 min was collected and freeze-dried. Chromatography was repeated 17 times (the purity of compound (II) was about 1%).
[0021]
The blue dye fraction obtained in C8 was re-chromatographed on an ODS column. The column was Deverosil-ODS (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) 5 cmφ * 30 cm, the mobile phase was A: water, B: 50% acetonitrile 0.5% TFA, 32 ml / min., With the following gradient. A linear gradient (50 min) of B45% (retained for 20 min) B45 → B70% was detected at A260 nm-AUFS: 1.0. Compound II eluted at 55-62 min was collected and freeze-dried. Chromatography was repeated six times (the purity of compound (II) was about 15%).
[0022]
The blue dye obtained by ODS was further purified. The column was Asahipak-ODP50 (manufactured by Showa Denko KK) 2.15 cmφ * 30 cm, the mobile phase was A: water, B: 50% acetonitrile 0.5% TFA, 6 ml / min., With the following gradient. B65% (35 min retention) B65 → B75% linear gradient (15 min) detection: A260 nm-AUFS: 0.64. Compound II eluted at 47-68 min was collected and lyophilized. Chromatography was repeated 16 times (the purity of compound II was about 70-95%).
[0023]
The structure of this compound was determined by NMR, FAB-MS, and the like, and was found to have the following formula (II) (C 56 H 37 O 31 ):
Embedded image
It has become clear that is represented by
[0024]
The physicochemical properties of this compound (II) were as follows.
1. Visible ultraviolet absorption spectrum
82 μg of the compound (II) was dissolved in 5 ml of methanol, and the absorption spectrum at 700 to 200 nm was measured (Shimadzu spectrophotometer UV-265). The results are shown in FIG. 1 and Table 1 below.
[0025]
[Table 1]
[0026]
2. FAB-MS-negative, positive and high resolution mass spectrometry measurements were performed.
1203 (M-2H) - , 1205 (M) +
The molecular formula was determined by high-resolution mass spectrometry.
C 56 H 37 O 31, MW = 1205.1319, Err + 0.2ppm / + 0.2mmu US: 38.5
3. NMR spectrum
The measurement was carried out with 0.5% TFA-d / DMSO-d6 in 0.6 ml using a Bruker DMX-750 using 20 mg of the compound (II). The measurement items were 1 H, 13 C, DQF-COSY, HSQC, HMBC (65 ms, 300 ms) and NOESY (100 ms, 200 ms, 500 ms, 1 sec). FIG. 5 shows the results of 1 H NMR and 13 C NMR.
[0027]
FIG. 2 shows an HPLC chromatogram of the isolated compound (II). The analysis conditions were as follows.
Analysis conditions are as follows: column: Showa Denko Asahipack ODP-50 4.6 mm * 250 mm, mobile phase: 35% CH3CN, 0.5% TFA, detection: A560 nm and 250-650 nm (Photodiode array detector Shimadzu SPD-M10A)
The total area of peaks at elution times of 17 minutes and 20 minutes was calculated as compound (II).
This compound exhibits a blue color around λmax of 580 nm in a solution of methanol, ethanol, acetonitrile, DMSO or acetone, and a blue-violet color of λmax of 560 nm in an aqueous solution.
[0028]
Example 2 Isolation of Dye Compound (VI) In Example 1, the fraction eluted from Sephadex LH-20 with 80% acetone was loaded on 1.5 L of adsorption resin HP-20 (Mitsubishi Chemical). After washing with 2 L of water, elution was performed stepwise with 2 L of 15% acetonitrile containing 0.1% TFA, 20% acetonitrile containing 0.1% TFA, and 30% acetonitrile containing 0.1% TFA. Compound VI eluted in the 30% fraction.
[0029]
The 30% acetonitrile fraction was lyophilized and the powder was subjected to preparative HPLC in seven batches. The column was Deverosil-ODS (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) 5 cmφ * 50 cm, the mobile phase was A: water, B: 50% acetonitrile 0.5% TFA, 32 ml / min., With the following gradient. B30% (30 min hold) After a linear gradient of B30 → B100% (30 min), the sample was held at B100% for 50 min. The detection was performed at A260 nm-AUFS: 1.28. The compound VI fraction eluted at 90-92 min was collected and freeze-dried (compound (VI) purity: about 5%).
[0030]
The dye fraction obtained by 5 cm preparative HPLC was purified again by semi-preparative HPLC. The column was D-ODS-5 (Nomura Chemical) 2 cmφ * 30 cm, the mobile phase was A: water, B: 50% acetonitrile 0.1% HCl, 6 ml / min., With the following gradient. B70% (30min hold) B70 → B100% linear gradient (20min) B100% hold for 30min. The detection was performed at A260 nm-AUFS: 0.32, and the compound VI fractions eluted at 50-53 min were collected and freeze-dried (compound VI purity: about 30-60%).
The obtained dye was dissolved in a small amount of ethanol, water was gradually added thereto, and the mixture was allowed to stand. The precipitated red dye was collected by centrifugation (purity of compound (VI): about 90%).
[0031]
The structure of this compound was determined by NMR, FAB-MS and the like according to the following formula (VI) (C 22 H 11 O 9 ):
Embedded image
Was determined to be.
[0032]
The physicochemical properties of compound (VI) were as follows.
1. The visible ultraviolet absorption spectrum was λmax = 529 nm (in 0.5% TFA, 35% acetonitrile). The result is shown in FIG.
2. Mass spectrum and high-resolution mass spectrometry
FAB-MS performed positive measurement with JEOL-DX-300 / DA-5000.
M + = 419
Molecular formula determined by high-resolution mass spectrometry: C 22 H 11 O 9 , MW = 419.0409
[0033]
3. NMR spectrum
The measurement was performed using a Bruker DMX-750 in 0.6% of 0.5% DCl / DMSO-d6 using 2 mg of the compound (VI). The measurement items were 1 H, 13 C, DQF-COSY, HSQC, HMBC, and NOESY. FIG. 6 shows the results of 1 H NMR.
This compound exhibits a red color in a methanol or ethanol solution.
[0034]
Embodiment 3 FIG. Production of compounds (III), (IV) and (V) by hydrolysis of compound (II) 20 mg of compound (II) is dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 5.5) containing 5% EtOH. Then, 10 mg of Tannase (Funakoshi Co., Ltd.) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. The reaction solution was loaded on Seppak C18 (Waters Co., Ltd.), washed with water, and eluted with 50% CH3CN / H2O containing 0.1% TFA. The reaction product was chromatographed by preparative HPLC to obtain a dye in which one or two gallic acids were deviated from compound (II).
[0035]
Preparative HPLC condition column: YMC-polymer C18, 2cm x 30cm
Mobile phase: 50% gradient elution from 25% to 50% CH3CN with 0.5% TFA followed by 50% CH3CN for 30 minutes. The compound eluted at 53 to 55 minutes by this chromatography is the compound (V). Those eluted for 65 to 67 minutes were Compound (III) and Compound (IV).
These compounds were blue dyes having a maximum absorption at 580 nm similarly to compound II in 35% CH3CN, 0.5% TFA.
[0036]
The structure of the decomposition product obtained by the above method was determined by NMR, FAB-MS, etc., and the structure of each compound was determined as follows.
Structure of compound (III):
Embedded image
[0037]
Structure of compound (IV):
Embedded image
[0038]
Structure of compound (V):
Embedded image
[0039]
The physicochemical properties of compounds (III), (IV) and (V) were as follows.
Compound (III) (C 49 H 33 O 27)
λmax (35% CH 3 CN / H 2 O, 0.5% TFA) 580 nm
FAB-MS [M] + = 1053
Compound (IV) (C 49 H 33 O 27)
λmax (35% CH 3 CN / H 2 O, 0.5% TFA) 580 nm
FAB-MS [M] + = 1053
[0040]
Compound (V) (C 42 H 29 O 23 )
λmax (35% CH 3 CN / H 2 O, 0.5% TFA) 578 nm
FAB-MS [M] + = 901
Compounds (III), (IV) and (V) exhibit a blue color near λmax of 580 nm in a methanol, ethanol, acetonitrile or acetone solution, and exhibit a blue-violet color with a λmax of 560 nm in an aqueous solution.
[0041]
Embodiment 4. FIG. Isolate of pigment compound (VII) Rose varieties "Madame Biore" (purchased from Tsukimoto Rose Garden (Kyoto)) 7.9 kg of petals freeze-ground in liquid nitrogen using a homogenizer Powder containing 0.1% TFA 15 L of 80% acetonitrile was added and immersed overnight. After diatomaceous earth filtration, the residue was again immersed in 14 L of 50% acetonitrile containing 0.1% TFA overnight, followed by diatomaceous earth filtration. The two filtrates were combined and concentrated to about 2/5 volume with a rotary evaporator.
[0042]
The concentrated extract was loaded on a sephadex LH-20 column (Pharmacia) (9 L) equilibrated with 30% acetonitrile containing 0.1% TFA. After eluting the fraction containing anthocyanin with 45 L of 30% acetonitrile containing 0.1% TFA, the fraction (35 L) containing the blue dye (compounds II and VII) was eluted with 60% acetonitrile. Further, a fraction (8 L) containing the compound (VI) was eluted with 80% acetone.
[0043]
The fraction eluted with 60% acetonitrile was concentrated to about 1/3 with a rotary evaporator, and then loaded on 1.5 L of adsorption resin HP-20 (Mitsubishi Chemical). After washing with 2 L of water, elution was performed stepwise with 3 L of 10% acetonitrile containing 0.1% TFA and 50% acetonitrile containing 0.1% TFA. Blue dye (compounds II and VII) eluted in the 50% fraction. This fraction was lyophilized and purified by preparative HPLC.
[0044]
The column was Deverosil-ODS (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) 5 cmφ * 50 cm, the mobile phase was A: water, B: 50% acetonitrile 0.5% TFA, 32 ml / min., With the following gradient. B45% (retained for 20 min) B45 → B70% linear gradient (50 min) detection: A260 nm-AUFS: 1.0. Blue pigment eluted at 51-54 min was collected and freeze-dried.
The blue dye obtained by ODS was further purified.
The column was YMC- polymer C18 (manufactured by YMC) 2 cmφ * 30 cm, the mobile phase was A: water, B: 50% acetonitrile 0.5% TFA, 6 ml / min., With the following gradient. B75% (30 min hold) After B75 → B100% linear gradient (20 min), B100% hold for 30 min. Detection was performed by collecting blue pigment eluted at A560 nm-AUFS: 0.06, 52-62 min and freeze-dried. (Compound VII purity approximately 20%).
[0045]
The blue dye obtained with polymer C18 was further purified. The column was Deverosil C30-UG (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) 2 cmφ * 30 cm, the mobile phase was A: water, B: 50% acetonitrile 0.5% TFA, 6 ml / min., With the following gradient. B52% (30 min hold) After B52 → B100% linear gradient (20 min), B100%, hold for 20 min. Detection was performed by collecting blue pigment eluted at A560 nm-AUFS: 0.06, 44-55 min and freeze-drying. (Purity of compound VII: about 90%)
[0046]
Physicochemical properties of compound VII (1) Visible ultraviolet absorption spectrum
Absorption spectra at 650-250 nm were measured with a Shimadzu Photodiodearray detector. FIG. 7 shows the results.
(2) High resolution MS was measured by FAB-MS. As a result, the molecular weight was 1357.1510, and the molecular formula was C 63 H 41 O 35 .
(3) NMR spectrum
Measured on a Bruker DMX-750 in 0.5 ml of 1% DCl / DMSO-d6 using 4 mg of compound VII . The measurement items are 1 H, DQF-COSY, TOCSY, HSQC, HMBC and NOESY. The results are shown in FIG.
(4) The structure of the dye compound (VII) is as follows.
[0047]
Embedded image
[0048]
(5) Molecular weight, etc.
1357.98 (C 63 H 41 O 35 +); C55.72; H3.04; O41.24
Embodiment 5 FIG. Creating roses with enhanced blue dye
Callus formation Madam biore shoot apex was cultured in MS medium supplemented with a solid medium containing benzyladenine (BA) 2.25 mg / L, gibberellin (GA) 3.46 mg / L, sucrose 30 g / L and gellan gum 2 g / L. Was induced.
[0049]
In mutagenesis ring cyclotron facility, nitrogen ion beam (135MeV / u), and neon ion beam (135Me V / u) was irradiated with a dose of 0~50Gy respectively.
Using callus 50 increments per SaiNaru each irradiation plant (total 900), reproduction was performed in a plant as follows. Callus was transplanted to a modified MS medium supplemented with 1 mg / L of benzyladenine (BA) and 0.005 mg / L of naphthaleneacetic acid (NAA) to obtain a regenerated shoot. After rooting treatment of the regenerated shoots, the shoots were acclimatized, raised in pots, cultivated in a greenhouse and flowered.
In the above method, 378 regenerated individuals were obtained from 900 calli, and 47 strains of individuals having changed color or shape were obtained.
The results are shown in Table 2 below.
[0050]
[Table 2]
[0051]
Analysis of pigment The plant regenerated by the above method was cultivated in a greenhouse and opened, and then the compound II and cyanidin contained in the petals were measured as follows. After weighing about 0.5 g of the petals and freeze-drying, the petals were extracted with 4 ml of a 50% CH 3 CN / 0.1% TFA solution. Compound (II) was subjected to HPLC by the method described in Example 1.
[0052]
On the other hand, cyanidin was analyzed by HPLC after 0.2 ml of the extract was dried and hydrolyzed in 0.2 ml of 6N-HCl at 100 ° C. for 20 minutes. The analysis conditions were as follows: column: YMC ODS-A312 6 mm * 150 mm, mobile phase: CH 3 COOH: CH 3 OH: H 2 O = 15: 20: 65, detection: A520 nm and 400-600 nm (Photodiode array detector Shimadzu SPD- M10A).
The results are shown in Table 3 below.
[0053]
[Table 3]
[0054]
As described above, 10 rose plants whose petal color changed in the red direction and 6 rose plants whose blue color changed in comparison with the parent plant were obtained.
FIG. 4 shows an example of the result of analyzing the dye by HPLC.
[0055]
Embodiment 6 FIG. Compound (II) Content in Petals of Each Rose Variety The content of compound II in the petals of each rose variety was measured by the method described in Examples 1 and 5, and is shown in Table 4 below.
[0056]
[Table 4]
It was confirmed that all the mauve roses contained the compound (II).
[0057]
【The invention's effect】
According to the present invention, some blue pigments in rose petals have been extracted and isolated, and derivatives thereof have been obtained, and their structures have been elucidated. This not only provided a basis for the production of a novel rose plant in which the color of rose was genetically modified, but also improved the color of the cut flower by absorbing the pigment of the present invention into cut flowers such as roses. In addition, it is expected to be used as a natural vegetable pigment, for example, for coloring foods and drinks.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 is a view showing a visible to ultraviolet absorption spectrum of the compound (II) of the present invention in methanol.
FIG. 2
FIG. 2 is a chromatogram obtained by analyzing the compound (II) of the present invention by HPLC. In the compound (II), two peaks are recognized because the 1-position of the saccharide shows α and β tautomerism.
FIG. 3
FIG. 3 is a view showing a visible to ultraviolet absorption spectrum of the compound (VI) of the present invention in a solvent of 35% CH 3 CN / 0.5% TFA.
FIG. 4
FIG. 4 is a chromatogram showing the results of HPLC analysis of pigments extracted from the petals of a non-irradiated strain regenerated from callus in the same manner as those obtained by irradiation of rose variety Madame Biore with heavy ions in Example 4. The peaks at 18.85 minutes and 22.52 minutes correspond to the peaks at 17.06 minutes and 19.87 minutes in FIG. 2 constituting compound (II), which is a mixture of tautomers.
FIG. 5
FIG. 5 shows the 1 H NMR spectrum and 13 C NMR spectrum of compound (II).
FIG. 6
FIG. 6 shows the 1 H NMR spectrum of the compound (VI).
FIG. 7
FIG. 7 shows a 650-250 nm absorption spectrum of the dye compound (VII).
FIG. 8
FIG. 8 shows the 1 H NMR spectrum of the dye compound (VII).
