JP2009126810A - Anthocyanin dye derived from camellia japonica, method for producing the same and use thereof, and method for identifying variety of camellia japonica - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アントシアニン色素、その製造方法及び用途、並びにツバキの品種識別方法に関する。 The present invention relates to an anthocyanin pigment, its production method and use, and a camellia variety identification method.
ツバキは、観賞用花木として世界的に親しまれているのみならず、種子を椿油の原料として用い、また、花は開花直前に採集して日干ししたものを、腸出血の救急薬や、滋養・強壮のため煎じて服用され、常用すれば美容上にも好ましいなど、民間薬として用いられている（非特許文献１）。 Camellia is not only popular around the world as an ornamental flowering tree, but also uses seeds as a raw material for camellia oil, and the flowers are collected just before flowering and sun-dried to provide emergency medicines for intestinal bleeding, It is used as a folk remedy because it is decocted for tonic and is regularly used for beauty reasons (Non-patent Document 1).
紅色ツバキにはその花色を発現する色素として、アントシアニン色素が含まれていることが報告されている。１９５３年に林らは紅色ツバキより初めてアントシアニン色素を単離し、その化学構造をｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）であることを明らかにした（非特許文献２）。また、斉藤らはカンツバキ、ヤブツバキ、山茶花の紅花からｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）を単離し（非特許文献３）、寺原らは、紅花茶の葉からｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１５）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを単離した報告がある（非特許文献４）。 It has been reported that red camellia contains an anthocyanin pigment as a pigment that expresses its flower color. In 1953, Hayashi et al. Isolated the anthocyanin pigment for the first time from red camellia, and revealed that its chemical structure was cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6) (Non-patent Document 2). Saito et al. Isolated cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-coumaroyl) -β-glucopyranoside (8) from red flowers of Japanese camellia, Japanese camellia and wild tea (Non-Patent Document 3), Terahara et al. Can be obtained from cyanidin 3-O-β-galactopyranoside (15), delphindin 3-O-β-galactopyranoside, delphindin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroylyl) -β-galactopyranoside from safflower tea leaves. Has been reported (Non-patent Document 4).
本発明者の一人である坂田は、１９８８年その学位論文の中で薄層クロマトグラフによりツバキ花弁中に１５種類のアントシアニン色素が存在することを明らかにしている（非特許文献５）。また、著書の中では、紅色ツバキの花弁には、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｓｏｐｈｏｒｏｓｉｄｅ、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３、５−ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅが存在するとの記載がある（非特許文献６）。更に、ヤブツバキ系の品種では、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅの花弁中の含量が増せばより赤色になることや、トウツバキ系品種では、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｓｏｐｈｏｒｏｓｉｄｅの花弁中の含量が増せばより赤色に変化することの記載がある。
Sakata, one of the inventors of the present invention, revealed in the 1988 dissertation that 15 types of anthocyanin pigments were present in camellia petals by thin-layer chromatography (Non-patent Document 5). In addition, in the book, there is a description that cyanidin 3-O-β-sophoroside,
従来において、ツバキの花や植物体には以下のような活性又は利用方法があることが開示されている。 Conventionally, it has been disclosed that camellia flowers and plants have the following activities or utilization methods.
特許文献１には、ツバキ科ツバキ属植物、特に、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、サザンカ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓａｓａｎｑｕａ）の抽出物がヒアルロニダーゼの活性阻害剤作用を有することが開示されている。
特許文献２には、ツバキ科植物の根と茎を除く、該植物由来の、水及び有機溶媒にともに溶解性を示す抽出物がセラミド産生を促進することが開示されている。
特許文献３には、ツバキの花から抽出されたフラボノイド成分を経口又は静注することによって、心臓病又は脳血管症の治療を可能とすることが開示されている。
特許文献４には、ツバキの花など１０種類の漢薬を配合した外用製剤が神経痛、頭痛などに有効であることが開示されている。
特許文献５には、山茶花の抽出物などが美白効果と皮膚のメラニン色素合成を抑制することが開示されている。 Patent Document 5 discloses that an extract of a mountain tea flower or the like suppresses a whitening effect and melanin pigment synthesis in the skin.
特許文献６には、クエン酸やリンゴ酸を添加することによって、ツバキの花から効率よく色素を抽出する方法が開示されている。
特許文献７には、ツバキの花をローストすることによって、カカオ豆と同じ香り、色、味を出すことのできる粉末を製造する方法が開示されている。
特許文献８には、ツバキの花を漬物として保存する製造方法が開示されている。
特許文献９には、ツバキの花を発酵させることによってツバキ茶を製造する方法が開示されている。
前述したように、従来ではツバキの花又は花弁の抽出物の生物学的活性が明らかにされ、また、その利用方法が発明されたものの、ツバキの花又は花弁の抽出物に含まれる、赤色を発現するアントシアニン色素については不明な点が多く、それらの詳細な分離法、色素の詳細な化学構造、色素の品種間での分布の違いについては知られていなかった。これらの分離法が確立できれば、ツバキの花又は花弁の抽出物を更に有効に使用できるものと考えられる。 As described above, the biological activity of the camellia flower or petal extract has been clarified in the past, and the method of using the same has been invented. However, the red color contained in the camellia flower or petal extract has been invented. There are many unclear points about the expressed anthocyanin pigments, and the detailed separation method, the detailed chemical structure of the pigments, and the difference in distribution among pigment varieties were not known. If these separation methods can be established, it is considered that the camellia flower or petal extract can be used more effectively.
そこで、本発明は、ツバキの花又は花弁の抽出物から、赤色を発現するアントシアニン色素を分離する方法、また、分離された色素の化学構造を知ることによって、ツバキ品種間での色素分布の違いを知る方法を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention provides a method for separating red anthocyanin pigments from camellia flower or petal extracts, and knows the chemical structure of the separated pigments, thereby differentiating pigment distribution among camellia varieties. The purpose is to provide a way to know.
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ツバキ花弁の抽出物から２５種類のアントシアニン色素、特に、８種類の新規アントシアニン色素を得ることに成功し、更に、得られたアントシアニンを標品として、高速液体クロマトグラフィー分析を行うことによって、各色素組成を元にツバキを種類分けすることが可能となり、ツバキ花弁由来のアントシアニンエキスを利用するために、明確に種類分けできることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors succeeded in obtaining 25 types of anthocyanin pigments, particularly 8 types of new anthocyanin pigments, from the camellia petal extract. It is possible to classify camellia based on each pigment composition by performing high performance liquid chromatography analysis using the anthocyanin as a standard, and to be able to classify clearly to use the anthocyanin extract derived from camellia petals As a result, the present invention has been completed.
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）次式（Ｉ）
で示される化合物。
The gist of the present invention is as follows.
(1) The following formula (I)
A compound represented by
（２）次式（II）
で示される化合物。
(2) The following formula (II)
A compound represented by
（３）次式（III）
で示される化合物。
(3) The following formula (III)
A compound represented by
（４）ツバキの花又は花弁の抽出物から前記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物を単離及び精製することを特徴とするアントシアニン色素の製造方法。 (4) A method for producing an anthocyanin pigment, comprising isolating and purifying the compound according to any one of (1) to (3) from a camellia flower or petal extract.
（５）前記ツバキがトウツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ Ｌｉｎｄｌ．）であり、アントシアニン色素がｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４）又はｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）である前記（４）に記載の製造方法。 (5) The camellia is Camellia reticulata Lindl. The anthocyanin dye is cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (Z) -p-comaroyl) -β-glucopyroxide (β). 2) cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyroxide (4) or cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p -Coumaroyl) -β-glucopyranoside (7), the production method according to (4) above.
（６）前記ツバキがホンコンツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｓｅｅｍ．）であり、アントシアニン色素がｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１８）又はｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２０）である前記（４）に記載の製造方法。 (6) The camellia is Camellia hongkongensis Seem. The anthocyanin dye is cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-glucopyroxide (7), cyanidin 3-O. -(6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (16), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroylyl) -β-galactopyranoside (17), cyanidin 3 -O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopyranoside (18) or delphidinin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-glucop The manufacturing method according to the above (4) is ranoside (20).
（７）前記ツバキがサルウィンツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ Ｓｔａｐｆ ｅｘ Ｂｅａｎ）であり、アントシアニン色素がｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）又はｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）−５−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２４）である前記（４）に記載の製造方法。 (7) The camellia is Salwin camellia (Camellia saluensis Stapf ex Bean), and the anthocyanin pigment is cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-glucopyroxide (7) or cyanidin 3- The production method according to (4) above, which is O- (6-O- (Z) -p-cumaroyl-β-glucopyranoside) -5-β-glucopyranoside (24).
（８）前記ツバキが園芸品種のツバキ：大理茶（Ｄａｌｉｃｈａ）であり、アントシアニン色素がｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１３）又はｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１４）である前記（４）に記載の製造方法。 (8) The camellia is a cultivar camellia: Dalicha, and the anthocyanin pigment is cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β -Glucopyranoxide (2), cyanidin 3-O- (2-O- [beta] -xylopyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl)-[beta] -glucopyranoside (4), cyanidin 3-O- (2-O- [beta]- xylopyranosyl-6-O-acetyl) -β-glucopyranoside (5), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopylanosyl-6-O- (Z) -p-coumaroyl) -β-galactopyranoside (11) , Cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-galactopylanoside (12), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6 -O- (E) -cafeeoyl) -β-galactopylanoside (13) or cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O-acetyl) -β-galactopyranoside (14) The manufacturing method as described in.
（９）前記単離及び精製手段がカラムクロマトグラフィーである前記（４）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）抽出溶媒が酢酸−メタノール混合溶媒である前記（４）〜（９）のいずれかに記載の製造方法。
(9) The production method according to any one of (4) to (8), wherein the isolation and purification means is column chromatography.
(10) The production method according to any one of (4) to (9), wherein the extraction solvent is an acetic acid-methanol mixed solvent.
（１１）ツバキの花又は花弁の抽出物中に含まれるアントシアニン色素の組成を分析することを特徴とするツバキの品種識別方法。
（１２）高速液体クロマトグラフィー法によりアントシアニン色素の組成を分析する前記（１１）に記載のツバキの品種識別方法。
(11) A method for identifying varieties of camellia, comprising analyzing the composition of anthocyanin pigments contained in a camellia flower or petal extract.
(12) The camellia cultivar identification method according to (11), wherein the composition of the anthocyanin pigment is analyzed by high performance liquid chromatography.
（１３）高速液体クロマトグラフィー法を、リン酸水溶液と、リン酸−ギ酸−アセトニトリル−テトラヒドロフラン−水混合溶媒とを用いてリニアーグラジエント溶出させることにより行う前記（１２）に記載のツバキの品種識別方法。
（１４）ツバキの花又は花弁の抽出物又はその精製物を含有する抗酸化剤。
(13) The camellia cultivar identification method according to (12), wherein the high performance liquid chromatography method is performed by linear gradient elution using a phosphoric acid aqueous solution and a phosphoric acid-formic acid-acetonitrile-tetrahydrofuran-water mixed solvent. .
(14) An antioxidant containing a camellia flower or petal extract or a purified product thereof.
（１５）ツバキの花又は花弁の抽出物の精製物が単離・精製されたアントシアニン色素である前記（１４）に記載の抗酸化剤。
（１６）ツバキの花又は花弁の抽出物又はその精製物を含有する抗癌剤。
（１７）ツバキの花又は花弁の抽出物の精製物が単離・精製されたアントシアニン色素である前記（１６）に記載の抗癌剤。
(15) The antioxidant according to (14) above, wherein the purified product of camellia flower or petal extract is an anthocyanin pigment isolated and purified.
(16) An anticancer agent comprising a camellia flower or petal extract or a purified product thereof.
(17) The anticancer agent according to (16), wherein the purified product of camellia flower or petal extract is an anthocyanin pigment isolated and purified.
本発明によれば、ツバキ抽出物からアントシアニン色素を得ることができ、また、得られたアントシアニン色素を標品として、高速液体クロマトグラフィー分析を行うことによって、各色素組成を元にツバキ属を種類分けすることが可能となり、ツバキ花弁由来のアントシアニンエキスを利用するために、明確に種類分けできる。 According to the present invention, an anthocyanin pigment can be obtained from a camellia extract, and by performing high performance liquid chromatography analysis using the obtained anthocyanin pigment as a standard, a variety of camellia genus based on each pigment composition It can be divided and can be clearly classified to use the anthocyanin extract derived from camellia petals.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るツバキの花又は花弁の抽出物（以下「ツバキ色素抽出物」という。）は、ツバキ、好ましくは紅花ツバキの花弁又は花を溶媒抽出に供することで得ることができる。例えば、ツバキの花弁を、酢酸と低級アルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、好ましくはメタノール）の１〜１．５対１、好ましくは１対１（容量比）で混合した溶媒を用いた抽出に供し、これを１回又は数回（例えば３回）繰り返すことでツバキ色素抽出物を得ることができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The camellia flower or petal extract (hereinafter referred to as “camellia pigment extract”) according to the present invention can be obtained by subjecting camellia, preferably safflower camellia petals or flowers, to solvent extraction. For example, camellia petals are mixed with acetic acid and lower alcohol (eg methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, preferably methanol) 1 to 1.5 to 1, preferably 1 to 1 (volume ratio). The camellia pigment extract can be obtained by subjecting it to extraction using the obtained solvent and repeating this once or several times (for example, 3 times).
通常、ツバキの花弁１ｋｇ当り抽出溶媒３〜４Ｌを使用する。抽出温度は、通常、溶媒の融点ないし溶媒の沸点の範囲内であり、好ましくは１５〜３０℃、更に好ましくは２０〜２５℃である。また、抽出は、通常常圧下で行うが、加圧下又は減圧下で行ってもよい。抽出時間は、抽出温度等により異なり、通常室温で１日〜２日間である。なお、本発明においては、ツバキ色素抽出物とは、前記抽出方法で得られた抽出液もしくは各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥粉末を意味する。 Usually, 3-4 L of extraction solvent is used per 1 kg of camellia petals. The extraction temperature is usually within the range of the melting point of the solvent to the boiling point of the solvent, preferably 15 to 30 ° C, more preferably 20 to 25 ° C. The extraction is usually performed under normal pressure, but may be performed under pressure or under reduced pressure. The extraction time varies depending on the extraction temperature and the like, and is usually 1 day to 2 days at room temperature. In the present invention, the camellia pigment extract means the extract obtained by the extraction method or various solvent extracts, a diluted solution thereof, a concentrated solution thereof or a dried powder thereof.
また、本発明においては、前述したツバキ色素抽出物を濾過、遠心分離又は精製処理等の精製手段に供することで、当該抽出物から夾雑物を除去した精製物を用いることができる。精製手段としては、例えば、カラムクロマトグラフィー、順相又は逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過が挙げられるが、カラムクロマトグラフィーが特に好ましい。 In the present invention, a purified product obtained by removing impurities from the extract can be used by subjecting the aforementioned camellia pigment extract to purification means such as filtration, centrifugation or purification treatment. Examples of the purification means include column chromatography, normal phase or reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and gel filtration, and column chromatography is particularly preferable.
例えば、ツバキ色素の酢酸と低級アルコール抽出溶液を減圧蒸留装置でアルコールを蒸留除去後、濃縮された溶液を直接、逆相用のゲル（例えば、ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学）など）のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸のメタノール溶液を用い、Ａ液とＢ液との比率を１００：０から順次Ｂ液の含量を増加させ、例えば、７０：３０、３０：７０、０：１００と変えて、クロマトグラフィーを行う。最後にＣ液として５％酢酸を含むアセトンを用い、Ａ液とＣ液との比率を５０：５０にしてクロマトグラフィーを行う。Ａ液とＢ液との比率が２０：８０で溶出する粗製分画物、並びにＡ液とＢ液との比率が４０：６０で溶出する粗製分画物並びにＡ液とＢ液との比率が７０：３０で溶出する粗製分画物には、本発明のアントシアニン色素が含有される。従って、これら粗製分画物は、ツバキ色素の粗精製物として好適に使用することができる。 For example, the acetic acid and lower alcohol extraction solution of camellia pigment is distilled off with a vacuum distillation apparatus, and then the concentrated solution is directly opened to a gel for reverse phase (for example, MCI gel CHP-20P (Mitsubishi Chemical)). Subject to column chromatography. Using 5% acetic acid aqueous solution as liquid A and 5% acetic acid methanol solution as liquid B in the mobile phase, the ratio of liquid A and liquid B is increased sequentially from 100: 0, for example, 70:30 , 30:70, 0: 100, and chromatography. Finally, chromatography is performed using acetone containing 5% acetic acid as the C liquid, and the ratio of the A liquid and the C liquid is 50:50. The crude fraction eluted at a ratio of A to B of 20:80, the crude fraction eluted at the ratio of A to B of 40:60, and the ratio of A to B The crude fraction eluted at 70:30 contains the anthocyanin dye of the present invention. Therefore, these crude fractions can be suitably used as a crudely purified product of camellia pigment.
また、得られた前記ツバキ色素の粗精製物を更に逆相用のゲル（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）など）のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸のメタノール溶液を用い、Ａ液とＢ液との比率を１００：０から順次Ｂ液の含量を増加させ、例えば、７０：３０、３０：７０、０：１００と変えて、クロマトグラフィーを行う。最後にＣ液として５％酢酸を含むアセトンを用い、Ａ液とＣ液との比率を５０：５０にしてクロマトグラフィーを行う。Ａ液とＢ液との比率が１００：０で溶出する粗製分画物並びにＡ液とＢ液との比率が５０：５０で溶出する粗製分画物には、本発明であるアントシアニン色素が含有される。従って、これら粗製分画物は、ツバキ色素の粗精製物として好適に使用することができる。 Moreover, the obtained crudely purified product of the camellia dye is further subjected to open column chromatography on a gel for reverse phase (for example, Sephadex LH-20 (GE Healthcare Biosciences AB)). Using 5% acetic acid aqueous solution as liquid A and 5% acetic acid methanol solution as liquid B in the mobile phase, the ratio of liquid A and liquid B is increased sequentially from 100: 0, for example, 70:30 , 30:70, 0: 100, and chromatography. Finally, chromatography is performed using acetone containing 5% acetic acid as the C liquid, and the ratio of the A liquid and the C liquid is 50:50. The crude fraction eluted at a ratio of A to B of 100: 0 and the crude fraction eluted at a ratio of A to B of 50:50 contain the anthocyanin dye of the present invention. Is done. Therefore, these crude fractions can be suitably used as a crudely purified product of camellia pigment.
更にまた、得られた前記ツバキ色素の粗精製物を逆相用のゲル（例えば、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（Ｆｕｊｉ Ｓｉｌｙｓｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＬＴＤ）など）のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸のメタノール溶液を用い、Ａ液とＢ液との比率を１００：０から順次Ｂ液の含量を増加させ、例えば、１００:０、９０:１０、８０:２０、７０：３０、６０:４０、５０:５０、４０:６０、３０：７０、０：１００と変えて、クロマトグラフィーを行う。最後にＣ液として５％酢酸を含むアセトンを用い、Ａ液とＣ液との比率を５０：５０にしてクロマトグラフィーを行う。この操作を繰り返し行うことによって、本発明であるアントシアニン色素を単離することができる。 Furthermore, the obtained crude product of the camellia dye is subjected to open column chromatography on a gel for reverse phase (for example, Chromatorex ODS (Fuji Silysia Chemical LTD)). Using 5% acetic acid aqueous solution as liquid A and 5% acetic acid methanol solution as liquid B in the mobile phase, the ratio of liquid A and liquid B is increased sequentially from 100: 0, for example, 100: 0 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, and 0: 100. Finally, chromatography is performed using acetone containing 5% acetic acid as the C liquid, and the ratio of the A liquid and the C liquid is 50:50. By repeating this operation, the anthocyanin dye of the present invention can be isolated.
また、単離されたアントシアニン色素の純度を上げるために、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）など）のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｃ液として５％酢酸を含むアセトンを用い、Ａ液とＣ液との比率を０：１００から順次Ａ液の濃度を２％ずつ上げて、２５：７５までクロマトグラフィーを行う。この操作を行うことによって、本発明のアントシアニン色素の純度を上げることができる。 Moreover, in order to raise the purity of the isolated anthocyanin pigment | dye, it attach | subjects to the open column chromatography of Sephadex LH-20 (GE Healthcare Biosciences AB) etc., for example. Using 5% acetic acid aqueous solution as liquid A and acetone containing 5% acetic acid as liquid C in the mobile phase, the ratio of liquid A and liquid C was increased from 0: 100 sequentially by 2%, and 25: Chromatography to 75. By performing this operation, the purity of the anthocyanin dye of the present invention can be increased.
前記単離されたアントシアニン色素及びツバキ色素の粗精製物に含まれるアントシアニン色素を簡単に分析する方法を以下に例示する。 A method for simply analyzing the anthocyanin dye contained in the crudely purified product of the isolated anthocyanin dye and camellia dye will be exemplified below.
例えば、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ；Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いることでアントシアニン色素を確認できる。ＨＰＬＣの溶出溶媒としては、Ａ液としてリン酸水溶液と、Ｂ液としてリン酸−ギ酸−アセトニトリル−テトラヒドロフラン−水混合溶媒を用い、リニアーグラジエント溶出（例えば、流速を１分間に０．８ｍｌ、カラムの温度を４０℃に保ち、検出波長を５２５ｎｍに設定し、Ａ液とＢ液との比率を８２：１８から３０：７０の比率で３５分かけて溶出）させることで、本発明のアントシアニン類をよく検出することができる。 For example, an anthocyanin dye can be confirmed by using a high performance liquid chromatography method (HPLC; High Performance Liquid Chromatography). As an elution solvent for HPLC, an aqueous solution of phosphoric acid as liquid A and a mixed solvent of phosphoric acid-formic acid-acetonitrile-tetrahydrofuran-water as liquid B, linear gradient elution (for example, 0.8 ml per minute, The temperature is kept at 40 ° C., the detection wavelength is set to 525 nm, and the ratio of the liquid A and the liquid B is eluted at a ratio of 82:18 to 30:70 over 35 minutes). Can be detected well.
また、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いることでアントシアニン色素を容易に確認できる。ＴＬＣの展開溶媒としては、例えば、Ａ液としてベンゼン−ギ酸エチル−ギ酸の１：７：１の比率で混合した溶液と、Ｂ液としてギ酸エチル−ギ酸−水の３：１：１の比率で混合した溶液を用い、Ａ液とＢ液との比率を４：１から１：１程度の比率で混合し、ＴＬＣを展開すると、本発明のアントシアニン類はよく検出することができる。 Moreover, an anthocyanin pigment | dye can be easily confirmed by using thin layer chromatography (TLC; Thin Layer Chromatography), for example. As a developing solvent for TLC, for example, a solution prepared by mixing benzene-ethyl formate-formic acid in a ratio of 1: 7: 1 as liquid A and ethyl formate-formic acid-water in a ratio of 3: 1: 1 as liquid B The anthocyanins of the present invention can be well detected by using a mixed solution, mixing the ratio of A liquid and B liquid at a ratio of about 4: 1 to 1: 1 and developing TLC.
以上のように説明したツバキ色素抽出物又は精製物、又は、これらより単離されたアントシアニン色素を分析できる。この結果、２５種類のアントシアニン色素を検出することができる。これらのアントシアニン色素は、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（９）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１０）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１８）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１９）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２０）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２１）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３，５−ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）−５−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）−５−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２５）である。 The camellia pigment extract or purified product as described above, or the anthocyanin pigment isolated from these can be analyzed. As a result, 25 types of anthocyanin dyes can be detected. These anthocyanin dyes are cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl) -β-glucopyranoside (1), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopynosyl-6-O- (Z)- p-comaaroyl) -β-glucopyranoside (2), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O- (E) -p-comaaroyl) -β-glucopyroxide (3), cyanidin 3-O -(2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyroxide (4), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O-acet yl) -β-glucopyranoside (5), cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (7), cyanidin 3 -O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (8), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyranoside (9), cyanidin 3 -O- (2-O- [beta] -xypyranosyl)-[beta] -galactopyranoside (10), cyanidin 3-O- (2-O- [beta] -xylopyranosyl-6-O- (Z) -p-cumaroyl)- β-galactopyranoside (11), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-galactopylanoside (12), cyanidin 3-O- (2-O -Β-xylopyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopylanoside (13), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O-acetyl) -β-galactopylanoside (14) , Cyanidin 3-O-β-galactopyranoside (15), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-galactopyranosi de (16), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (17), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β- galactopyranoside (18), delphindin 3-O-β-glucopyranoside (19), delphindin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-glucopyroxide (20), delphindin 3-O- (6) -O- (E) -p-comaroyl) -β-glucopyranoside (21), delphindin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyranoside (22), yanidin 3,5-di-O-β-glucopyranoside (23), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaroyl-β-glucopyranoside) -5-β-glucopyranoside (24), cyanidin 3 -O- (6-O- (E) -p-cumaroyl- [beta] -glucopyranoside) -5- [beta] -glucopyranoside (25).
前記のアントシアニン色素のうち、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（５）（前記式（Ｉ）においてＲがアセチル基である化合物）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１１）（前記式（II）においてＲが（Ｚ）−ｐ−クマロイル基である化合物）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１２）（前記式（II）においてＲが（Ｅ）−ｐ−クマロイル基である化合物、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１３）（前記式（II）においてＲが（Ｅ）−カフェオイル基である化合物）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１４）（前記式（II）においてＲがアセチル基である化合物）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１６）（前記式（III）においてＲが（Ｚ）−ｐ−クマロイル基である化合物）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１７）（前記式（III）においてＲが（Ｅ）−ｐ−クマロイル基である化合物）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１８）（前記式（III）においてＲが（Ｅ）−カフェオイル基である化合物）は新規化合物である。 Among the anthocyanin dyes, cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O-acetyl) -β-glucopyranoside (5) (compound in which R is an acetyl group in the formula (I)), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (11) (in the formula (II), R is (Z) -p-coumaroyl group) Compound), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (12) (in the formula (II), R is (E) A compound which is a p-coumaroyl group, cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopylanoside (13) (compound in which R is (E) -caffeoyl group in the formula (II)) , Cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O-acetyl) -β-galactopylanoside (14) (compound in which R is an acetyl group in the above formula (II)), cyanidin 3-O- ( 6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (16) (a compound in which R is a (Z) -p-coumaroyl group in the above formula (III)), cyanidin 3-O- (6-O -(E) -p-comaaroyl) -β-galactopyranosi e (17) (a compound in which R is (E) -p-coumaroyl group in the formula (III)), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopyranoside (18) ( The compound in which R is (E) -caffeoyl group in the formula (III) is a novel compound.
なお、本明細書において、アントシアニン色素の化合物名の末尾に付した番号は、後述する実施例及び図面に記載の化合物に付した番号に対応する。 In addition, in this specification, the number attached | subjected to the end of the compound name of the anthocyanin dye respond | corresponds to the number attached | subjected to the compound as described in the Example and drawing which are mentioned later.
前記ツバキとして、トウツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ Ｌｉｎｄｌ．）を使用すれば、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（９）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１０）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１５）、のアントシアニン色素を分析及び製造できる。 If camellia (Camellia reticulata Lindl.) Is used as the camellia, cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl) -β-glucopyranoside (1), cyanidin 3-O- (2-O-β- xylopyranosyl-6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (2), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O- (E) -p-comaroyl) -β -Glucopyroxide (3), cyanidin 3-O- (2-O- [beta] -xypyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl)-[beta] -glucopyranoside (4), cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (7), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -P-comaroyl) -β-glucopyranoside (8), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyranoside (9), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl) ) -Β-galactopyranoside (10), cyanidin 3-O-β-galactopyranoside (15), can be analyzed and produced.
前記ツバキとして、ホンコンツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｓｅｅｍ.）を使用すれば、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（９）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１８）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１９）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２０）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２１）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２２）、のアントシアニン色素を分析及び製造できる。これらのうち、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１８）は新規化合物である。 When the camellia camellia camellia camellia is used as the camellia, cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaroyl) -β- glucopyranoside (7), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (8), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β- glucopyranoside (9), cyanidin 3-O-β-galactopyranoside (15), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-galactopyran side (16), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (17), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β- galactopyranoside (18), delphindin 3-O-β-glucopyranoside (19), delphindin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-glucopyroxide (20), delphindin 3-O- (6) -O- (E) -p-comaroyl) -β-glucopyranoside (21), delphindin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyroxide (22 ), Anthocyanin dyes can be analyzed and produced. Among these, cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-galactopyranoside (16), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-comaaroyl) -β -Galactopyranoside (17), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopyranoside (18) is a novel compound.
前記ツバキとして、サルウィンツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ Ｓｔａｐｆ ｅｘ Ｂｅａｎ）を使用すれば、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３，５−ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）−５−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）−５−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２５）、のアントシアニン色素を分析及び製造できる。
If the camellia camellia camellia (Camellia saluenensis Snapf ex Bean) is used, cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaroyl) -Glucopyranoside (7), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (8),
前記ツバキとして、園芸品種のツバキ：大理茶（Ｄａｌｉｃｈａ）を使用すれば、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１０）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１４）、のアントシアニン色素を分析及び製造できる。これらのうち、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１３）又はｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１４）は新規化合物である。 As the camellia, if the cultivar camellia: Dalicha is used, cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl) -β-glucopyranoside (1), cyanidin 3-O- (2-O -Β-xypyranosyl-6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (2), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -p-cumaroyl ) -Β-glucopyranoside (3), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyranoside (4), cyanidin 3-O- (2-O) -Β- xylopyranosyl-6-O-acetyl) -β-glucopyranoside (5), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl) -β-galactopyranoside (10), cyanidin 3-O- (2-O-β-) xylopyranosyl-6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-galactopyranoside (11), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O- (E) -p-comaroyl) -β -Galactopylanoside (12), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopylanoside (1 ), Cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O-acetyl) -β-galactopyranoside (14), it can be analyzed for anthocyanin and manufacturing. Among these, cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O-acetyl) -β-glucopyranoside (5), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-galactopylanoside (11), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -p-comaaroyl) -β-galactopyranoside (12), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopyranoside (13) or cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyran osyl-6-O-acetyl) -β-galactopyranoside (14) is a novel compound.
以上のように説明したツバキ色素抽出物又は精製物、又は、これらより単離されたアントシアニン色素を有効成分として用いることで、飲食品、医薬品、化粧品などを製造するために利用することができる。ツバキ色素抽出物又は精製物は、例えば、抗酸化剤、抗癌剤の有効成分として用いることができる。 By using the camellia pigment extract or purified product as described above, or an anthocyanin pigment isolated from these as an active ingredient, it can be used to produce foods, drinks, pharmaceuticals, cosmetics and the like. The camellia pigment extract or purified product can be used, for example, as an active ingredient of antioxidants and anticancer agents.
本発明のツバキ色素抽出物又は精製物、又は、これらより単離されたアントシアニン色素の有効量を、錠剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ペットボトルなどの任意の形態に添加又は封入するか、あるいは任意の飲食品に添加することも可能である。 An effective amount of the camellia pigment extract or purified product of the present invention or an anthocyanin pigment isolated therefrom is added to or encapsulated in any form such as tablets, capsules, granules, drinks, plastic bottles, etc. It is also possible to add to other foods and drinks.
飲食品には、例えば、菓子類、レトルト食品、ジュース類、お茶類、乳製品などが含まれるが、これらに限定されない。また、飲食品には、必要に応じて甘味剤、調味料、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤などを添加してもよいし、あるいはビタミン類、栄養剤、免疫増強剤（例えば、プロポリスやきのこ抽出物など）などを添加してもよい。 Examples of the food and drink include, but are not limited to, confectionery, retort food, juices, teas, and dairy products. In addition, sweeteners, seasonings, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. may be added to foods and drinks as necessary, or vitamins, nutrients, immune enhancers (for example, propolis or Mushroom extract etc.) may be added.
本発明に使用できるツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ属）野生種として、限定されるものではないが、好ましくは紅花ツバキ、例えば、セッコウベニバナユチャ（浙江紅花油茶、Ｃ．ｃｈｅｋｉａｎｇｏｌｅｏｓａ）、カンツバキ（Ｃ．ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ホンコンツバキ（香港紅山茶、Ｃ．ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）、ヤブツバキ（紅山茶、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、テマリツバキ（桜花短柱茶、Ｃ．ｍａｌｉｆｌｏｒａ）、ピタールツバキ（西南山茶、Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ）、ピタールツバキピタール種（西南山茶西南種、Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ ｖａｒ． ｐｉｔａｒｄｉｉ）、ピタールツバキ雲南種（西南山茶雲南種、Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ ｖａｒ． ｙｕｎｎａｎｉｃａ）、マイレイツバキ（Ｃ．ｍａｉｒｅｉ）、ポリオドンタ（宛田紅花油茶、Ｃ．ｐｏｌｙｏｄｏｎｔａ）、トウツバキ（てん山茶、Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、ロシフロラ（玖瑰連芯茶、Ｃ．ｒｏｓｉｆｌｏｒａ），ユキルバキ（雪椿、Ｃ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）、サルウィンツバキ（怒江山茶、Ｃ．ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ）、サザンカ（山茶花、Ｃ．ｓａｓａｎｑｕａ）、セミセラータ（南山茶、Ｃ．ｓｅｍｉｓｅｒｒａｔａ）、ワビスケ（侘助、Ｃ．ｗａｂｉｓｕｋｅ）が挙げられる。 The wild camellia (genus Camellia) that can be used in the present invention is not limited, but is preferably a safflower camellia, for example, Gypsophila sanctuary (Zhejiang safflower oil tea, C. cheigeoleosa), C. himalis, Hong Kong. Camellia (Hong Kong tea, Hong Kong tea, C. japonica), Temari camellia (C. maliflora), Pital camellia (Nishiyama tea, C. pitardii), Pital camellia petal species ( Southwestern tea, Southwestern species, C. partardia var. Partardii), Pital camellia Yunnan species (Seinanzan tea, Yunnan species, C. partardii var. Yunnanica), Miley camellia (C. mairei), Poliodonta Ueda safflower oil tea, C. polydonta), Japanese camellia (Tenyama tea, C. reticulata), Rosiflora (C. rosiflora), Yukibaki (Yuki-an, C. salanensis), sasanqua (Yamacha flower, C. sasanqua), semiserata (Nanyama tea, C. semiserrata), and wabisuke (C. wabisuke).
本発明に使用できるツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ属）園芸品種として、限定されるものではないが、例えば、艶姿（えにし）、乙女（おとめ）、勘次郎（かんじろう）、皇玉（こうぎょく）、獅子頭（ししがしら）、昭和の栄（しょうわのさかえ）、緋乙女（ひおとめ）、日の出富士（ひのでふじ）、朝日鶴（あさひづる）、大空（おおぞら）、大錦（おおにしき）、桜月夜（さくらづくよ）、七福神（しちふくじん）、東雲（しののめ）、酒中花（しゅちゅうか）、大朱盃（たいしゅはい）、宝合（たからあわせ）、昼夜錦（ちゅうやにしき）、丁子車（ちょうじぐるま）、鳴海潟（なるみがた）、二重弁天（にじゅうべんてん）、肥後入日の海（ひごいりひのうみ）、三国紅（みくにこう）、和合神（わごうじん）、旭（あさひ）、梅ケ香（うめがか）、笑顔（えがお）、凱旋（がいせん）、鎌倉絞（かまくらしぼり）、古金襴（こきんらん）、佐保姫（さほひめ）、三段花（さんだんか）、蜀紅錦（しょっこうにしき）、飛竜（ひりゅう）、曙（あけぼの）、岩根絞（いわねしぼり）、有楽（うらく）、蝦夷錦（えぞにしき）、王冠（おうかん）、大阿蘇（おおあそ）、沖の浪（おきのなみ）、長楽（おさらく）、春日野（かすがの）、玉之浦（たまのうら）、太郎庵（たろうあん）、釣篝（つりかがり）、鶏の子（とりのこ）、白班孔雀（はくはんくじゃく）、羽衣（はごろも）、春の台（はるのうてな）、光源氏（ひかるげんじ）、アドルフ・オーデュソン（Ａｄｏｌｐｈ Ａｕｄｕｓｓｏｎ）、ベティー・シェフィールド・シュープリーム（Ｂｅｔｔｙ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｓｕｐｒｅｍｅ）、カーターズ・サンバースト（Ｃａｒｔｅｒ’ｓ Ｓｕｎｂｕｒｓｔ）、Ｃ．Ｍ．ハヴィー（Ｃ．Ｍ．Ｈｏｖｅｙ）、コンテッサ・ラヴィニア・マギ（Ｃｏｎｔｅｓｓａ Ｌａｖｉｎｉａ Ｍａｇｇｉ）、ドーンズ・アーリー・ライト（Ｄａｗｎ’ｓ Ｅａｒｌｙ Ｌｉｇｈｔ）、ドゥビュタント（Ｄｅｂｕｔａｎｔｅ）、ギリョ・ヌッチオ（Ｇｕｉｌｉｏ Ｎｕｃｃｉｏ）、クレイマーズ・シュープリーム（Ｋｒａｍｅｒ’ｓ Ｓｕｐｒｅｍｅ）、マーガレット・デイヴィス・ピコティー（Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｄａｖｉｓ Ｐｉｃｏｔｅｅ）、マトティアナ（Ｍａｔｈｏｔｉａｎａ）、ミセス・Ｄ．Ｗ．デイヴィス（Ｍｒｓ．Ｄ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ）、ミセス・Ｄ．Ｗ．デイヴィス・デスカンソ（Ｍｒｓ．Ｄ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ Ｄｅｓｃａｎｓｏ）、アーチ・オブ・トライアンフ（Ａｒｃｈ ｏｆ Ｔｒｉｕｍｐｈ）、仏陀（Ｂｕｄｄｈａ）、唐椿（Ｃａｐｔａｉｎ Ｒｏｗｅｓ）、張家茶（Ｃｈａｎｇ’ｓ Ｃａｍｅｌｌｉａ）、チャイナ・レディー（Ｃｈｉｎａ Ｌａｄｙ）、大瑪瑙（Ｃｏｒｎｅｌｉａｎ）、菊弁（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ Ｐｅｔａｌ）、大桃紅（Ｇｒｅａｔ Ｐｅａｃｈ Ｂｌｏｏｍ）、ハワード・アスパー（Ｈａｗａｒｄ Ａｓｐｅｒ）、ラスカ・ビューティー（Ｌａｓｃａ Ｂｅａｕｔｙ）、ロワ・シノー（Ｌｏｉｓ Ｓｈｉｎａｕｌｔ）、シャルレアン（Ｃｈａｒｌｅａｎ）、ドネイション（Ｄｏｎａｔｉｏｎ）、ドリーム・ボート（Ｄｒｅａｍ Ｂｏａｔ）、Ｅ．Ｇ．ウォーターハウス（Ｅ．Ｇ．Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ）、エルジー・ジュアリー（Ｅｌｓｉｅ Ｊｕｒｙ）、Ｊ．Ｃ．ウィリアムズ（Ｊ．Ｃ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、ジュリア・ハミター（Ｊｕｌｉａ Ｈａｍｉｔｅｒ）、ベイビー・ベアー（Ｂａｂｙ Ｂｅａｒ）、センティッド・ジェム（Ｓｃｅｎｔｅｄ Ｇｅｍ）、スニパト（Ｓｎｉｐｐｅｔ）、タイニー・プリンセス（Ｔｉｎｙ Ｐｒｉｎｃｅｓｓ）、ウァーリンガ・プリンセス（Ｗｉｒｌｉｎｇａ Ｐｒｉｎｃｅｓｓ）が挙げられる。 Although it is not limited as a camellia (Camellia genus) horticultural varieties which can be used for this invention, For example, glossy figure (enishi), maiden (otome), kanjiro (Kanjiro), imperial ball (kougiku), lion head ( Shishigashira, Showa no Sakae, Hiotome, Hinode Fuji, Asahizuru, Ozora, Onishi, Sakura Moonlit night, Shichifukujin, Shinonome, Shuchuka, Taishui, Takara, Day and night bronze Nishiki), clove car, Narumigata, double benten, Nihibento sea, Mikuni red, Mikuni God, Asahi, Umeke Incense Umega), smile (Egao), triumph (Gaisen), Kamakura squeeze, Kokinran, Saho Hime, Sandanka, Sandanka (Sandaka) Shikoku Nishiki, Hiryu, Akebono, Iwane Shibori, Yuraku, Enishiki, Crown, Oao So), Okinonami, Nagaraku, Kasugano, Tamanoura, Taroan, fishing rod, chicken chick Saw, Peacock, Hagoromo, Ueno Haruna, Genji Hikaru, Adolph Auduson, Betty Shefiel Supreme), Carter's Sunburst (Carter's Sunburst), C. M.M. C. M. Hovey, Contessa Lavinia Maggi, Dawn's Early Light, Debutante, Guillo Nuccio (Kramer's Supreme), Margaret Davis Picotee, Matothiana, Mrs. D. W. Mrs. DW Davis, Mrs. D. W. Mrs. DW Davis Descanso, Arch of Triumph, Buddha, Captain Rowes, Chang's Camellia, Chinah Dee Lady, Cornelian, Chrysanthhemum Petal, Great Peach Bloom, Howard Asper, Lasca Beauty, Lois Sino (Lois Sin) Charles, Donation, Dream Boat, E.E. G. Water House (E.G. Waterhouse), Elsie Jury, J.A. C. Williams (JC Williams), Julia Hamiter, Baby Bear, Scented Gem, Snippet, Tiny Princess, Waringa Princess Wiringa Prince).
なお、これらのツバキのアントシアニン色素を分析し、新規色素として、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１８）を単離及び精製することも、本発明に含まれる。 In addition, the anthocyanin pigment | dye of these camellias was analyzed, and cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O-acetyl) -β-glucopyranoside (5), cyanidin 3-O- ( 2-O- [beta] -xylopyranosyl-6-O- (Z) -p-cumaroyl)-[beta] -galactopyranoside (11), cyanidin 3-O- (2-O- [beta] -xylopyranosyl-6-O- (E)- p-comaroyl) -β-galactopyranoside (12), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopyranoside (13), cya idin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O-acetyl) -β-galactopyranoside (14), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-galactopyranoside (16), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (17), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopyranoside Isolating and purifying (18) is also included in the present invention.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されないものとする。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕トウツバキ（Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ Ｌｉｎｄｌ．）の分析
（１）花弁から色素の抽出と単離、精製の方法
トウツバキから花弁を採集した。採集した花弁は、褐変を防ぐため熱湯に３〜５秒間浸漬し、ポリフェノールオキシダーゼなどの酵素を死活させた。浸漬後、花弁を室温で乾燥させた。乾燥花弁２ｋｇに、酢酸とメタノールを１対１で混合した溶液（５０％酢酸−メタノール）１２Ｌを加え、２０〜２５℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出液を綿栓でろ過した後、溶媒を減圧下、ロータリーエバポレーターで留去した。抽出残渣を５％酢酸水溶液に溶解し、オープンカラムクロマトグラフィーに付した。オープンカラムクロマトグラフィーの条件は、固定相にエムシーアイゲルＣＨＰ−２０Ｐ（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ、三菱化学株式会社、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、セファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）、クロマトレックスＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ、富士シリシア化学株式会社、Ｆｕｊｉ Ｓｉｌｙｓｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＬＴＤ．）を用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸−メタノールを用い、Ａ液からＢ液の含量を１０％ずつ増やすことによって、ＭＣＩgelのカラム（以下ＭＣＩカラム）−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム−ＯＤＳカラムの順番で各種クロマトグラフィーを行った。また、固定相にセファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｃ液として５％酢酸−アセトン（アセトンに酢酸を５％量加えたもの）を用い、Ｃ液からＡ液の含量を２％ずつ増やすことによってクロマトグラフィーを行った。最後に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムとＯＤＳカラムを用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸−メタノールを用い、Ａ液からＢ液の含量を５％ずつ増やすことを繰り返した。
[Example 1] Analysis of C. reticulata Lindl. (1) Extraction, isolation and purification of pigment from petals Petals were collected from camellia. The collected petals were immersed in hot water for 3 to 5 seconds to prevent browning, and an enzyme such as polyphenol oxidase was activated. After soaking, the petals were dried at room temperature. To 2 kg of dried petals, 12 L of a mixed solution of acetic acid and methanol (1: 1) (50% acetic acid-methanol) was added, and the anthocyanin pigment was extracted at 20 to 25 ° C. After the extract was filtered through a cotton plug, the solvent was distilled off with a rotary evaporator under reduced pressure. The extraction residue was dissolved in 5% aqueous acetic acid and subjected to open column chromatography. The conditions for the open column chromatography were MC eye gel CHP-20P (MCI gel CHP-20P, Mitsubishi Chemical Corporation, Mitsubishi Chemical Corporation), Sephadex LH-20 (GE Healthex Biosciences A). Chromatorex ODS (Chromatorex ODS, Fuji Silysia Chemical Ltd., Fuji Silysia Chemical LTD.), Using 5% acetic acid aqueous solution as the A liquid for the mobile phase, 5% acetic acid-methanol as the B liquid, and from the A liquid to the B liquid By increasing the content of each by 10%, various chromas in the order of MCIgel column (hereinafter MCI column)-Sephadex LH-20 column-ODS column A tomography was performed. Moreover, Sephadex LH-20 (Sephadex LH-20, GE Healthcare Biosciences AB) was used for the stationary phase, 5% acetic acid aqueous solution as the liquid A for the mobile phase, and 5% acetic acid-acetone (5% acetic acid in acetone as the liquid C). Chromatography was performed by increasing the content of solution A by 2% from solution C. Finally, using Sephadex LH-20 column and ODS column, using 5% acetic acid aqueous solution as liquid A and 5% acetic acid-methanol as liquid B, increasing the content of liquid B from liquid A by 5%. Repeated.
これらのオープンカラムクロマトグラフィーを繰り返し行うことによって、アントシアニン色素として、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（９）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１０）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１５）を単離及び精製した（図１）。 By repeating these open column chromatography, cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl) -β-glucopyranoside (1), cyanidin 3-O- (2-O-β-) is used as an anthocyanin dye. xylopyranosyl-6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (2), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O- (E) -p-comaroyl) -β -Glucopyroxide (3), cyanidin 3-O- (2-O- [beta] -xypyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl)-[beta] -glucopyranoside (4), cyanidin -O-β-glucopyranoside (6), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (7), cyanidin 3-O- (6-O- (E)- p-comaroyl) -β-glucopyranoside (8), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyranoside (9), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl) -Β-galactopyranoside (10) and cyanidin 3-O-β-galactopyranoside (15) were isolated and purified (FIG. 1).
（２）色素の各種スペクトルデータ
単離・精製したアントシアニン色素のプロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ-Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ［ＮＭＲ］ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定装置は、ＪＮＭ-ＥＣＡ６００型核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＥＣＡ６００ＫＳ、日本電子データム株式会社、ＪＥＯＬ ＤＡＴＵＭ ＬＴＤ．）を用いた。測定は、ＣＤ３ＯＤとＣＦ３ＣＯＯＤの９対１混合溶液を用いて行った。その結果を表１及び表２に示す。表中の数値はデルタ（δ、ｐｐｍ）で示す。また、二番目に表された数値は、カップリング定数（Ｊ値）を示している。表中の記号で、ｂｒは、ｂｒｏａｄ、ｓはｓｉｎｇｌｅｔ、ｄはｄｏｕｂｌｅｔ、ｄｄはｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ、ｄｄｄはｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ、ｔはｔｒｉｐｌｅｔ、ｍはｍｕｌｔｉｐｌｅｔを示す。
(2) Various spectrum data of the dye The proton nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-Nuclear magnetic resonance [NMR] spectrum) of the isolated and purified anthocyanin dye was measured. As a measuring apparatus, a JNM-ECA600 type nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL JNM-ECA600KS, JEOL Datum Co., Ltd., JEOL DATUM LTD.) Was used. The measurement was performed using a 9: 1 mixed solution of CD 3 OD and CF 3 COOD. The results are shown in Tables 1 and 2. The numerical values in the table are indicated by delta (δ, ppm). The second numerical value represents the coupling constant (J value). In the table, br is “broad”, “s” is a singlet, “d” is a doublet, “dd” is a double doublet, “dd” is a double doublet, “t” is a triplet, and “m” is a multiplet.
単離・精製したアントシアニン色素の炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ-Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ［ＮＭＲ］ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定装置は、ＪＮＭ-ＥＣＡ６００型核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＥＣＡ６００ＫＳ、日本電子データム株式会社、ＪＥＯＬ ＤＡＴＵＭ ＬＴＤ．）を用いた。測定は、ＣＤ３ＯＤとＣＦ３ＣＯＯＤの９対１混合溶液を用いて行った。その結果を表３に示す。表中の数値はデルタ（δ、ｐｐｍ）で示す。また表中、Ｃ（Ｚ）はパラクマル酸のＺ型、Ｃ（Ｅ）はパラクマル酸のＥ型、Ｃａｆ（Ｅ）はカフェー酸のシグナルであることを示す。 The carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum ( 13 C-Nuclear magnetic resonance [NMR] spectrum) of the isolated and purified anthocyanin dye was measured. As a measuring apparatus, a JNM-ECA600 type nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL JNM-ECA600KS, JEOL Datum Co., Ltd., JEOL DATUM LTD.) Was used. The measurement was performed using a 9: 1 mixed solution of CD 3 OD and CF 3 COOD. The results are shown in Table 3. The numerical values in the table are indicated by delta (δ, ppm). In the table, C (Z) indicates the Z-form of paracoumaric acid, C (E) indicates the E-form of paracoumaric acid, and Caf (E) indicates the signal of caffeic acid.
図１で示した（１）〜（４）、（６）〜（１０）及び（１５）のアントシアニン色素の紫外部吸収スペクトル（Ｕｌｔｒａ Ｖｉｏｌｅｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定には、島津製作所株式会社の分光機器（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、ＵＶ−２１００）を用いた。その結果は次の通りである。測定溶媒はメタノールである。ｓｈはｓｈｏｕｌｄｅｒを示す。
色素（１）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８２ （４．３１）， ３７９ （３．１０）， ５３８ （３．４７）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８２ （４．３７）， ３３２ （３．６８）， ５３０ （４．５９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４０）， ３１２ （４．００）， ４１１ （３．８１）， ５６４ （４．６２）。
色素（２）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．５１）， ３１１ｓｈ （４．４０）， ５５３ （３．１８）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８４ （４．５３）， ３１４ （４．４０）， ５３０ （４．５４）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４６）， ３１３ （４．４９）， ５７０ （４．６１）。
色素（３）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．５８）， ３１１ｓｈ （４．４８）， ５５３ （３．２５）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８４ （４．６０）， ３１４ （４．４８）， ５３０ （４．６１）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．５３）， ３１３ （４．５６）， ５７０ （４．６９）。
色素（４）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．６１）， ３３１ （４．４６）， ５３２ （４．５３）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８４ （４．６５）， ３３０ （４．５０）， ５３０ （４．６９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４８）， ３１４ （４．４７）， ３４９ （４．４９）， ５７１ （４．７５）。
色素（６）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．０４）， ３１１ｓｈ（４．１７）， ５３８ （３．５５）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８３ （４．０８）， ３３２ （３．６４）， ５３０ （４．１９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８８ （３．９９）， ３１３ （３．９４）， ５７１ （４．２８）。
色素（７）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．３０）， ３０８ｓｈ （４．１９）， ５３１ （３．８９）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．３３）， ３１１ （４．１７）， ３７５ｓｈ （３．５８）， ５３０ （４．３５）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．２６）， ３１１ （４．２７）， ４１１ （３．７０）， ５７３ （４．４４）。
色素（８）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．４９）， ３１１ｓｈ （４．３９）， ５５３ （３．１７）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．５１）， ３１４ （４．３９）， ５３０ （４．５２）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４５）， ３１３ （４．４７）， ５７０ （４．６０）。
色素（９）：赤色無晶形粉末、 ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．６１）， ３３１ （４．４６）， ５３２ （４．５３）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．６５）， ３３０ （４．５０）， ５３０ （４．６９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４８）， ３１４ （４．４７）， ３４９ （４．４９）， ５７１ （４．７５）。
色素（１０）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８２ （４．１２）， ３３３ （３．２６）， ５３０ （４．２７）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８２ （４．１９）， ３３２ （３．４０）， ５３０ （４．４２）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８７ｓｈ （４．００）， ３１３ （３．８２）， ４０９ （３．５７）， ５７０ （４．５０）。
色素（１５）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８３ （４．００）， ３１１ｓｈ （３．２２）， ５３０ （３．０８）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８２ （４．５４）， ３３１ （３．９７）， ５２９ （４．７４）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２７２ （４．４３）， ３１２ （４．２４）， ５７１ （４．８５）。
The ultraviolet absorption spectrum (Ultra Violet spectrum) of the anthocyanin dyes (1) to (4), (6) to (10) and (15) shown in FIG. 1 was measured. A spectroscopic instrument (UV-visible recording spectrometer, UV-2100) manufactured by Shimadzu Corporation was used for the measurement. The results are as follows. The measurement solvent is methanol. sh indicates a shoulder.
Dye (1): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 282 (4.31), 379 (3.10), 538 (3.47); 0.01% HCl -MeOH: 282 (4.37), 332 (3.68), 530 (4.59); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.40), 312 (4.00), 411 (3.81), 564 (4.62).
Dye (2): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.51), 311sh (4.40), 553 (3.18); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.53), 314 (4.40), 530 (4.54); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.46), 313 (4.49), 570 (4.61).
Dye (3): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.58), 311sh (4.48), 553 (3.25); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.60), 314 (4.48), 530 (4.61); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.53), 313 (4.56), 570 (4.69).
Dye (4): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.61), 331 (4.46), 532 (4.53); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.65), 330 (4.50), 530 (4.69); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.48), 314 (4.47), 349 (4.49), 571 (4.75).
Dye (6): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.04), 311sh (4.17), 538 (3.55); 0.01% HCl -MeOH: 283 (4.08), 332 (3.64), 530 (4.19); AlCl 3 -MeOH: 288 (3.99), 313 (3.94), 571 (4.28).
Dye (7): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.30), 308sh (4.19), 531 (3.89); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.33), 311 (4.17), 375sh (3.58), 530 (4.35); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.26), 311 (4.27), 411 (3.70), 573 (4.44).
Dye (8): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.49), 311sh (4.39), 553 (3.17); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.51), 314 (4.39), 530 (4.52); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.45), 313 (4.47), 570 (4.60).
Dye (9): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.61), 331 (4.46), 532 (4.53); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.65), 330 (4.50), 530 (4.69); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.48), 314 (4.47), 349 (4.49), 571 (4.75).
Dye (10): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 282 (4.12), 333 (3.26), 530 (4.27); 0.01% HCl -MeOH: 282 (4.19), 332 (3.40), 530 (4.42); AlCl 3 -MeOH: 287sh (4.00), 313 (3.82), 409 (3.57), 570 (4.50).
Dye (15): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 283 (4.00), 311sh (3.22), 530 (3.08); 0.01% HCl -MeOH: 282 (4.54), 331 (3.97), 529 (4.74); AlCl 3 -MeOH: 272 (4.43), 312 (4.24), 571 (4.85).
質量分析計（ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ-Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて、図１で示した（１）〜（４）、（６）〜（１０）及び（１５）のアントシアニン色素の質量を測定した。
色素（１）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５８１．３７ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ２９Ｏ１５ ５８１．４１）。
色素（２）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７２７．３７ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１７ ７２７．５３）。
色素（３）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７２７．３８ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１７ ７２７．５３）。
色素（４）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７４３．３５ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１８ ７４３．５３）。
色素（６）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ４４９．２１ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１１ ４４９．３１）。
色素（７）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５９５．１９ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１３ ５９５．４４）。
色素（８）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５９５．１４ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１３ ５９５．４４）。
色素（９）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６１１．２２ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１４ ６１１．４４）。
色素（１０）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５８１．１８ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ２９Ｏ１５ ５８１．４１）。
色素（１５）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ４４９．２３ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１１ ４４９．３１）。
以上の結果、理論値と測定値がよく一致した。
Masses of anthocyanin dyes of (1) to (4), (6) to (10) and (15) shown in FIG. 1 using a mass spectrometer (positive ion ionization-mass spectrometry; ESI-MS) Was measured.
Dye (1): ESI-MS (m / z): 581.37 M + (Calcd for C 26 H 29 O 15 581.41).
Dye (2): ESI-MS (m / z): 727.37 M + (Calcd for C 35 H 35 O 17 727.53).
Dye (3): ESI-MS (m / z): 727.38 M + (Calcd for C 35 H 35 O 17 727.53).
Dye (4): ESI-MS (m / z): 743.35 M + (Calcd for C 35 H 35 O 18 743.53).
Dye (6): ESI-MS (m / z): 449.21 M + (Calcd for C 21 H 21 O 11 449.31).
Dye (7): ESI-MS (m / z): 595.19 M + (Calcd for C 30 H 27 O 13 595.44).
Dye (8): ESI-MS (m / z): 595.14 M + (Calcd for C 30 H 27 O 13 595.44).
Dye (9): ESI-MS (m / z): 611.22 M + (Calcd for C 30 H 27 O 14 611.44).
Dye (10): ESI-MS (m / z): 581.18 M + (Calcd for C 26 H 29 O 15 581.41).
Dye (15): ESI-MS (m / z): 449.23 M + (Calcd for C 21 H 21 O 11 449.31).
As a result, the theoretical value and the measured value agreed well.
〔実施例２〕ホンコンツバキ（Ｃ．ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｓｅｅｍ．）の分析
（１）花弁から色素の抽出と単離、精製の方法
ホンコンツバキから花弁を採集した。採集した花弁１０ｋｇに直接、酢酸とメタノールを１対１で混合した溶液（５０％酢酸−メタノール）２０Ｌを加え、２０〜２５℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出液を綿栓でろ過した後、溶媒を減圧下、ロータリーエバポレーターで留去した。抽出残渣を５％酢酸水溶液に溶解し、オープンカラムクロマトグラフィーに付した。オープンカラムクロマトグラフィーの条件は、固定相にエムシーアイゲルＣＨＰ−２０Ｐ（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ、三菱化学株式会社、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、セファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）、クロマトレックスＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ、富士シリシア化学株式会社、Ｆｕｊｉ Ｓｉｌｙｓｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＬＴＤ．）を用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸−メタノールを用い、Ａ液からＢ液の含量を１０％ずつ増やすことによって、ＭＣＩgelのカラム（以下ＭＣＩカラム）−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム−ＯＤＳカラムの順番で各種クロマトグラフィーを行った。また、固定相にセファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｃ液として５％酢酸−アセトン（アセトンに酢酸を５％量加えたもの）を用い、Ｃ液からＡ液の含量を２％ずつ増やすことによってクロマトグラフィーを行った。最後に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムとＯＤＳカラムを用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸−メタノールを用い、Ａ液からＢ液の含量を５％ずつ増やすことを繰り返した。これらのオープンカラムクロマトグラフィーを繰り返し行うことによって、アントシアニン色素として、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（９）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１８）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１９）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２０）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２１）、ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２２）を単離及び精製した（図２）。単離及び精製したアントシアニン色素のうち、（１６）、（１７）、（１８）は新規な色素である（図２）。
[Example 2] Analysis of C. hongkongensis (1) Extraction, isolation and purification of pigment from petals Petals were collected from honkon camellia. 20 L of a mixed solution of 50% acetic acid and methanol (50% acetic acid-methanol) was directly added to 10 kg of the collected petals, and an anthocyanin pigment was extracted at 20 to 25 ° C. After the extract was filtered through a cotton plug, the solvent was distilled off with a rotary evaporator under reduced pressure. The extraction residue was dissolved in 5% aqueous acetic acid and subjected to open column chromatography. The conditions for the open column chromatography were MC eye gel CHP-20P (MCI gel CHP-20P, Mitsubishi Chemical Corporation, Mitsubishi Chemical Corporation), Sephadex LH-20 (GE Healthex Biosciences A). Chromatorex ODS (Chromatorex ODS, Fuji Silysia Chemical Ltd., Fuji Silysia Chemical LTD.), Using 5% acetic acid aqueous solution as the A liquid for the mobile phase, 5% acetic acid-methanol as the B liquid, and from the A liquid to the B liquid By increasing the content of each by 10%, various chromas in the order of MCIgel column (hereinafter MCI column)-Sephadex LH-20 column-ODS column A tomography was performed. Moreover, Sephadex LH-20 (Sephadex LH-20, GE Healthcare Biosciences AB) was used for the stationary phase, 5% acetic acid aqueous solution as the liquid A for the mobile phase, and 5% acetic acid-acetone (5% acetic acid in acetone as the liquid C). Chromatography was performed by increasing the content of solution A by 2% from solution C. Finally, using Sephadex LH-20 column and ODS column, using 5% acetic acid aqueous solution as liquid A and 5% acetic acid-methanol as liquid B, increasing the content of liquid B from liquid A by 5%. Repeated. By repeating these open column chromatography, cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-glucopyroxide is used as an anthocyanin dye. (7), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (8), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyroxide (9), cyanidin 3-O-β-galactopyranoside (15), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (1) ), Cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-galactopyranoside (17), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopyranoside (18) ), Delphindin 3-O-β-glucopyranoside (19), delphindin 3-O- (6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (20), delphindin 3-O- (6-O—) Isolation and purification of (E) -p-coumaroyl) -β-glucopyranoside (21), delphindin 3-O- (6-O- (E) -caffeoyl) -β-glucopyranoside (22) It was (Fig. 2). Of the isolated and purified anthocyanin dyes, (16), (17) and (18) are novel dyes (FIG. 2).
（２）色素の各種スペクトルデータ
単離・精製したアントシアニン色素のプロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ-Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ［ＮＭＲ］ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定装置は、ＪＮＭ-ＥＣＡ６００型核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＥＣＡ６００ＫＳ、日本電子データム株式会社、ＪＥＯＬ ＤＡＴＵＭ ＬＴＤ．）を用いた。測定は、ＣＤ３ＯＤとＣＦ３ＣＯＯＤの９対１混合溶液を用いて行った。その結果を表４〜表６に示す。表中の数値はデルタ（δ、ｐｐｍ）で示す。また、二番目に表された数値は、カップリング定数（Ｊ値）を示している。表中の記号で、ｂｒは、ｂｒｏａｄ、ｓはｓｉｎｇｌｅｔ、ｄはｄｏｕｂｌｅｔ、ｄｄはｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ、ｄｄｄはｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ、ｔはｔｒｉｐｌｅｔ、ｍはｍｕｌｔｉｐｌｅｔを示す。
(2) Various spectrum data of the dye The proton nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-Nuclear magnetic resonance [NMR] spectrum) of the isolated and purified anthocyanin dye was measured. As a measuring apparatus, a JNM-ECA600 type nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL JNM-ECA600KS, JEOL Datum Co., Ltd., JEOL DATUM LTD.) Was used. The measurement was performed using a 9: 1 mixed solution of CD 3 OD and CF 3 COOD. The results are shown in Tables 4-6. The numerical values in the table are indicated by delta (δ, ppm). The second numerical value represents the coupling constant (J value). In the table, br is “broad”, “s” is a singlet, “d” is a doublet, “dd” is a double doublet, “dd” is a double doublet, “t” is a triplet, and “m” is a multiplet.
単離・精製したアントシアニン色素の炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ-Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ［ＮＭＲ］ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定装置は、ＪＮＭ-ＥＣＡ６００型核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＥＣＡ６００ＫＳ、日本電子データム株式会社、ＪＥＯＬ ＤＡＴＵＭ ＬＴＤ．）を用いた。測定は、ＣＤ３ＯＤとＣＦ３ＣＯＯＤの９対１混合溶液を用いて行った。その結果を表７〜表９に示す。表中の数値はデルタ（δ、ｐｐｍ）で示す。また表中、Ｃ（Ｚ）はパラクマル酸のＺ型、Ｃ（Ｅ）はパラクマル酸のＥ型、Ｃａｆ（Ｅ）はカフェー酸のシグナルであることを示す。ｓｈはｓｈｏｕｌｄｅｒである。 The carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum ( 13 C-Nuclear magnetic resonance [NMR] spectrum) of the isolated and purified anthocyanin dye was measured. As a measuring apparatus, a JNM-ECA600 type nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL JNM-ECA600KS, JEOL Datum Co., Ltd., JEOL DATUM LTD.) Was used. The measurement was performed using a 9: 1 mixed solution of CD 3 OD and CF 3 COOD. The results are shown in Tables 7-9. The numerical values in the table are indicated by delta (δ, ppm). In the table, C (Z) indicates the Z-form of paracoumaric acid, C (E) indicates the E-form of paracoumaric acid, and Caf (E) indicates the signal of caffeic acid. sh is a shoulder.
図２で示した（６）〜（９）及び（１５）〜（２２）のアントシアニン色素の紫外部吸収スペクトル（Ｕｌｔｒａ Ｖｉｏｌｅｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定には、島津製作所株式会社の分光機器（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、ＵＶ−２１００）を用いた。その結果は次の通りである。測定溶媒はメタノールである。
色素（６）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．０４）， ３１１ｓｈ （４．１７）， ５３８ （３．５５）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８３ （４．０８）， ３３２ （３．６４）， ５３０ （４．１９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８８ （３．９９）， ３１３ （３．９４）， ５７１ （４．２８）。
色素（７）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．３０）， ３０８ｓｈ （４．１９）， ５３１ （３．８９）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．３３）， ３１１ （４．１７）， ３７５ｓｈ （３．５８）， ５３０ （４．３５）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．２６）， ３１１ （４．２７）， ４１１ （３．７０）， ５７３ （４．４４）。
色素（８）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．４９）， ３１１ｓｈ（４．３９）， ５５３ （３．１７）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．５１）， ３１４ （４．３９）， ５３０ （４．５２）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４５）， ３１３ （４．４７）， ５７０ （４．６０）。
色素（９）：赤色無晶形粉末、 ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．６１）， ３３１ （４．４６）， ５３２ （４．５３）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．６５）， ３３０ （４．５０）， ５３０ （４．６９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４８）， ３１４ （４．４７）， ３４９ （４．４９）， ５７１ （４．７５）。
色素（１５）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８３ （４．００）， ３１１ｓｈ （３．２２）， ５３０ （３．０８）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８２ （４．５４）， ３３１ （３．９７）， ５２９ （４．７４）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２７２ （４．４３）， ３１２ （４．２４）， ５７１ （４．８５）。
色素（１６）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．２６）， ３０９ （４．１４）， ５３１ （４．０６）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．２８）， ３１０ （４．１５）， ５３０ （４．２８）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．２５）， ３１３ （４．２７）， ４０５ （３．６６）， ５７１ （４．３９）。
色素（１７）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．２９）， ３１１ｓｈ （４．１９）， ５３１ （４．１０）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．３１）， ３１２ （４．１９）， ５３０ （４．３２）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．２５）， ３１３ （４．２６）， ４０１ （３．５４）， ５５８ （４．３２）。
色素（１８）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．２７）， ３３０ （４．１４）， ５３１ （４．００）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．３０）， ３３０ （４．１８）， ５３１ （４．２９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８７ （４．１３）， ３１２ （４．１３）， ３５１ （４．１６）， ５６９ （４．３８）。
色素（１９）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８１ （３．９６）， ３１９ｓｈ （３．１６）， ５４４ （４．３７）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２７８ （４．０８）， ３３３ （４．４６）， ５４２ （４．３５）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２７７ （４．０３）， ３１８ （３．６８）， ５８０ （４．４１）。
色素（２０）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．３２）， ３０８ （３．８４）， ５４５ （３．０４）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８５ （４．３２）， ３００ （４．２５）， ５４５ （４．１６）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８８ （４．３２）， ３１５ （４．２７）， ５８６ （４．２５）。
色素（２１）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．２８）， ３０７ （４．２４）， ５４４ （３．７９）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８３ （４．３１）， ２９９ （４．２６）， ５４２ （４．３６）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８８ （４．２７）， ３１５ （４．２７）， ５８４ （４．４３）。
色素（２２）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．０５）， ３１８ｓｈ （３．９０）， ３２９ （３．９４）， ５４８ （３．７４）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８２ （４．１１）， ３１７ｓｈ （３．９４）， ３３２ （３．９８）， ５４４ （４．２０）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８５ （４．００）， ３２９ｓｈ （４．０１）， ３５０ （４．０６）， ５８７ （４．２６）。
Ultraviolet absorption spectra (Ultra Violet spectrum) of the anthocyanin dyes (6) to (9) and (15) to (22) shown in FIG. 2 were measured. A spectroscopic instrument (UV-visible recording spectrometer, UV-2100) manufactured by Shimadzu Corporation was used for the measurement. The results are as follows. The measurement solvent is methanol.
Dye (6): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.04), 311sh (4.17), 538 (3.55); 0.01% HCl -MeOH: 283 (4.08), 332 (3.64), 530 (4.19); AlCl 3 -MeOH: 288 (3.99), 313 (3.94), 571 (4.28).
Dye (7): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.30), 308sh (4.19), 531 (3.89); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.33), 311 (4.17), 375sh (3.58), 530 (4.35); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.26), 311 (4.27), 411 (3.70), 573 (4.44).
Dye (8): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.49), 311sh (4.39), 553 (3.17); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.51), 314 (4.39), 530 (4.52); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.45), 313 (4.47), 570 (4.60).
Dye (9): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.61), 331 (4.46), 532 (4.53); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.65), 330 (4.50), 530 (4.69); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.48), 314 (4.47), 349 (4.49), 571 (4.75).
Dye (15): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 283 (4.00), 311sh (3.22), 530 (3.08); 0.01% HCl -MeOH: 282 (4.54), 331 (3.97), 529 (4.74); AlCl 3 -MeOH: 272 (4.43), 312 (4.24), 571 (4.85).
Dye (16): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.26), 309 (4.14), 531 (4.06); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.28), 310 (4.15), 530 (4.28); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.25), 313 (4.27), 405 (3.66), 571 (4.39).
Dye (17): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.29), 311sh (4.19), 531 (4.10); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.31), 312 (4.19), 530 (4.32); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.25), 313 (4.26), 401 (3.54), 558 (4.32).
Dye (18): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.27), 330 (4.14), 531 (4.00); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.30), 330 (4.18), 531 (4.29); AlCl 3 -MeOH: 287 (4.13), 312 (4.13), 351 (4.16), 569 (4.38).
Dye (19): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 281 (3.96), 319sh (3.16), 544 (4.37); 0.01% HCl -MeOH: 278 (4.08), 333 (4.46), 542 (4.35); AlCl 3 -MeOH: 277 (4.03), 318 (3.68), 580 (4.41).
Dye (20): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.32), 308 (3.84), 545 (3.04); 0.01% HCl -MeOH: 285 (4.32), 300 (4.25), 545 (4.16); AlCl 3 -MeOH: 288 (4.32), 315 (4.27), 586 (4.25).
Dye (21): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.28), 307 (4.24), 544 (3.79); 0.01% HCl -MeOH: 283 (4.31), 299 (4.26), 542 (4.36); AlCl 3 -MeOH: 288 (4.27), 315 (4.27), 584 (4.43).
Dye (22): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.05), 318sh (3.90), 329 (3.94), 548 (3.74) ); 0.01% HCl-MeOH: 282 (4.11), 317sh (3.94), 332 (3.98), 544 (4.20); AlCl 3 -MeOH: 285 (4.00), 329sh (4.01), 350 (4.06), 587 (4.26).
質量分析計（ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ-Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて、図２で示した（６）〜（９）及び（１５）〜（２２）のアントシアニン色素の質量を測定した。
色素（６）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ４４９．２１ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１１ ４４９．３１）。
色素（７）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５９５．１９ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１３ ５９５．４４）。
色素（８）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５９５．１４ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１３ ５９５．４４）。
色素（９）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６１１．２２ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１４ ６１１．４４）。
色素（１５）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ４４９．２３ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１１ ４４９．３１）。
色素（１６）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５９５．１９ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１３ ５９５．４４）。
色素（１７）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５９５．１７ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１３ ５９５．４４）。
色素（１８）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６１１．３９ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１４ ６１１．４４）。
色素（１９）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ４６５．２３ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１２ ４６５．３１）。
色素（２０）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６１１．３５ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１４ ６１１．４４）。
色素（２１）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６１１．２２ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１４ ６１１．４４）。
色素（２２）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６２７．３７ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１５ ６２７．４３）。
以上の結果、理論値と測定値がよく一致した。
The masses of the anthocyanin dyes (6) to (9) and (15) to (22) shown in FIG. 2 were measured using a mass spectrometer (positive ion ionization-mass spectrometer: ESI-MS).
Dye (6): ESI-MS (m / z): 449.21 M + (Calcd for C 21 H 21 O 11 449.31).
Dye (7): ESI-MS (m / z): 595.19 M + (Calcd for C 30 H 27 O 13 595.44).
Dye (8): ESI-MS (m / z): 595.14 M + (Calcd for C 30 H 27 O 13 595.44).
Dye (9): ESI-MS (m / z): 611.22 M + (Calcd for C 30 H 27 O 14 611.44).
Dye (15): ESI-MS (m / z): 449.23 M + (Calcd for C 21 H 21 O 11 449.31).
Dye (16): ESI-MS (m / z): 595.19 M + (Calcd for C 30 H 27 O 13 595.44).
Dye (17): ESI-MS (m / z): 595.17 M + (Calcd for C 30 H 27 O 13 595.44).
Dye (18): ESI-MS (m / z): 611.39 M + (Calcd for C 30 H 27 O 14 611.44).
Dye (19): ESI-MS (m / z): 465.23 M + (Calcd for C 21 H 21 O 12 465.31).
Dye (20): ESI-MS (m / z): 611.35 M + (Calcd for C 30 H 27 O 14 611.44).
Dye (21): ESI-MS (m / z): 611.22 M + (Calcd for C 30 H 27 O 14 611.44).
Dye (22): ESI-MS (m / z): 627.37 M + (Calcd for C 30 H 27 O 15 627.43).
As a result, the theoretical value and the measured value agreed well.
〔実施例３〕サルウィンツバキ（Ｃ．ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ Ｓｔａｐｆ ｅｘ Ｂｅａｍ）の分析
（１）花弁から色素の抽出と単離、精製の方法
サルウィンツバキから花弁を採集した。採集した花弁は、褐変を防ぐため熱湯に３〜５秒間浸漬し、ポリフェノールオキシダーゼなどの酵素を死活させた。浸漬後、花弁を室温で乾燥させた。乾燥花弁３ｋｇに、酢酸とメタノールを１対１で混合した溶液（５０％酢酸−メタノール）１３Ｌを加え、２０〜２５℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出液を綿栓でろ過した後、溶媒を減圧下、ロータリーエバポレーターで留去した。抽出残渣を５％酢酸水溶液に溶解し、オープンカラムクロマトグラフィーに付した。オープンカラムクロマトグラフィーの条件は、固定相にエムシーアイゲルＣＨＰ−２０Ｐ（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ、三菱化学株式会社、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、セファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）、クロマトレックスＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ、富士シリシア化学株式会社、Ｆｕｊｉ Ｓｉｌｙｓｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＬＴＤ．）を用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸−メタノールを用い、Ａ液からＢ液の含量を１０％ずつ増やすことによって、ＭＣＩgelのカラム（以下ＭＣＩカラム）−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム−ＯＤＳ カラムの順番で各種クロマトグラフィーを行った。また、固定相にセファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｃ液として５％酢酸−アセトン（アセトンに酢酸を５％量加えたもの）を用い、Ｃ液からＡ液の含量を２％ずつ増やすことによってクロマトグラフィーを行った。次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムとＯＤＳカラムを用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸−メタノールを用い、Ａ液からＢ液の含量を５％ずつ増やすことを繰り返した。これらのオープンカラムクロマトグラフィーを繰り返し行うことによって、アントシアニン色素として、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３，５−ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）−５−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）−５−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２５）を単離及び精製した（図３）。
[Example 3] Analysis of C. saluenensis Snapf ex Beam (1) Extraction, isolation and purification of pigments from petals Petals were collected from Salwins. The collected petals were immersed in hot water for 3 to 5 seconds to prevent browning, and an enzyme such as polyphenol oxidase was activated. After soaking, the petals were dried at room temperature. 13 L of a mixed solution of acetic acid and methanol (50% acetic acid-methanol) was added to 3 kg of dried petals, and the anthocyanin pigment was extracted at 20 to 25 ° C. After the extract was filtered through a cotton plug, the solvent was distilled off with a rotary evaporator under reduced pressure. The extraction residue was dissolved in 5% aqueous acetic acid and subjected to open column chromatography. The conditions for the open column chromatography were MC eye gel CHP-20P (MCI gel CHP-20P, Mitsubishi Chemical Corporation, Mitsubishi Chemical Corporation), Sephadex LH-20 (GE Healthex Biosciences A). Chromatorex ODS (Chromatorex ODS, Fuji Silysia Chemical Ltd., Fuji Silysia Chemical LTD.), Using 5% acetic acid aqueous solution as the A liquid for the mobile phase, 5% acetic acid-methanol as the B liquid, and from the A liquid to the B liquid By increasing the content of 10% by 10%, various chromatophores were prepared in the order of MCIgel column (hereinafter referred to as MCI column) -Sephadex LH-20 column-ODS column. The door chromatography was carried out. Moreover, Sephadex LH-20 (Sephadex LH-20, GE Healthcare Biosciences AB) was used for the stationary phase, 5% acetic acid aqueous solution as the liquid A for the mobile phase, and 5% acetic acid-acetone (5% acetic acid in acetone as the liquid C). Chromatography was performed by increasing the content of solution A by 2% from solution C. Next, using Sephadex LH-20 column and ODS column, using 5% acetic acid aqueous solution as liquid A and 5% acetic acid-methanol as liquid B, and increasing the content of liquid B from liquid A by 5%. It was. By repeating these open column chromatography, cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6), cyanidin 3-O- (6-O- (Z) -p-comaaroyl) -β-glucopyroxide is used as an anthocyanin dye. (7), cyanidin 3-O- (6-O- (E) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (8),
（２）色素の各種スペクトルデータ
単離・精製したアントシアニン色素のプロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ-Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ［ＮＭＲ］ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定装置は、ＪＮＭ-ＥＣＡ６００型核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＥＣＡ６００ＫＳ、日本電子データム株式会社、ＪＥＯＬ ＤＡＴＵＭ ＬＴＤ．）を用いた。測定は、ＣＤ３ＯＤとＣＦ３ＣＯＯＤの９対１混合溶液を用いて行った。その結果を表１０及び表１１に示す。表中の数値はデルタ（δ、ｐｐｍ）で示す。また、二番目に表された数値は、カップリング定数（Ｊ値）を示している。表中の記号で、ｂｒは、ｂｒｏａｄ、ｓはｓｉｎｇｌｅｔ、ｄはｄｏｕｂｌｅｔ、ｄｄはｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ、ｄｄｄはｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ、ｔはｔｒｉｐｌｅｔ、ｍはｍｕｌｔｉｐｌｅｔを示す。
(2) Various spectrum data of the dye The proton nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-Nuclear magnetic resonance [NMR] spectrum) of the isolated and purified anthocyanin dye was measured. As a measuring apparatus, a JNM-ECA600 type nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL JNM-ECA600KS, JEOL Datum Co., Ltd., JEOL DATUM LTD.) Was used. The measurement was performed using a 9: 1 mixed solution of CD 3 OD and CF 3 COOD. The results are shown in Table 10 and Table 11. The numerical values in the table are indicated by delta (δ, ppm). The second numerical value represents the coupling constant (J value). In the table, br is “broad”, “s” is a singlet, “d” is a doublet, “dd” is a double doublet, “dd” is a double doublet, “t” is a triplet, and “m” is a multiplet.
単離・精製したアントシアニン色素の炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ-Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ［ＮＭＲ］ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定装置は、ＪＮＭ-ＥＣＡ６００型核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＥＣＡ６００ＫＳ、日本電子データム株式会社、ＪＥＯＬ ＤＡＴＵＭ ＬＴＤ．）を用いた。測定は、ＣＤ３ＯＤとＣＦ３ＣＯＯＤの９対１混合溶液を用いて行った。その結果を表１２に示す。表中の数値はデルタ（δ、ｐｐｍ）で示す。また表中、Ｃ（Ｚ）はパラクマル酸のＺ型、Ｃ（Ｅ）はパラクマル酸のＥ型、Ｃａｆ（Ｅ）はカフェー酸のシグナルであることを示す。 The carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum ( 13 C-Nuclear magnetic resonance [NMR] spectrum) of the isolated and purified anthocyanin dye was measured. As a measuring apparatus, a JNM-ECA600 type nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL JNM-ECA600KS, JEOL Datum Co., Ltd., JEOL DATUM LTD.) Was used. The measurement was performed using a 9: 1 mixed solution of CD 3 OD and CF 3 COOD. The results are shown in Table 12. The numerical values in the table are indicated by delta (δ, ppm). In the table, C (Z) indicates the Z-form of paracoumaric acid, C (E) indicates the E-form of paracoumaric acid, and Caf (E) indicates the signal of caffeic acid.
図３で示した（６）〜（８）及び（２３）〜（２５）のアントシアニン色素の紫外部吸収スペクトル（Ｕｌｔｒａ Ｖｉｏｌｅｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定には、島津製作所株式会社の分光機器（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、ＵＶ−２１００）を用いた。その結果は次の通りである。測定溶媒はメタノールである。ｓｈはｓｈｏｕｌｄｅｒを示す。
色素（６）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．０４）， ３１１ｓｈ （４．１７）， ５３８ （３．５５）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８３ （４．０８）， ３３２ （３．６４）， ５３０ （４．１９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８８ （３．９９）， ３１３ （３．９４）， ５７１ （４．２８）。
色素（７）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．３０）， ３０８ｓｈ （４．１９）， ５３１ （３．８９）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．３３）， ３１１ （４．１７）， ３７５ｓｈ （３．５８）， ５３０ （４．３５）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．２６）， ３１１ （４．２７）， ４１１ （３．７０）， ５７３ （４．４４）。
色素（８）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．４９）， ３１１ｓｈ （４．３９）， ５５３ （３．１７）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．５１）， ３１４ （４．３９）， ５３０ （４．５２）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４５）， ３１３ （４．４７）， ５７０ （４．６０）。
色素（２３）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８２ （３．１４）， ３１１ｓｈ （１．８９）， ５２７ （２．７１）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２７９ （３．１４）， ３３１ （２．４９）， ５２６ （３．４３）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８４ｓｈ （２．９７）， ３１３ （２．８２）， ４５２ （２．６４）， ５７０ （３．４４）。
色素（２４）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８６ （４．２７）， ３１７ｓｈ （４．０９）， ５３１ （２．５８）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８１ （４．２５）， ２９４ （４．２２）， ５３０ （４．３４）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８１ （４．１９）， ３１２ （４．２１）， ４２１ （３．６８）， ５７１ （４．３７）。
色素（２５）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．５６）， ３１１ｓｈ（４．４６）， ５５３ （３．２３）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．５８）， ３１４ （４．４６）， ５３０ （４．５９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．５１）， ３１３ （４．５４）， ５７０ （４．６７）。
The ultraviolet absorption spectrum (Ultra Violet spectrum) of the anthocyanin dyes (6) to (8) and (23) to (25) shown in FIG. 3 was measured. A spectroscopic instrument (UV-visible recording spectrometer, UV-2100) manufactured by Shimadzu Corporation was used for the measurement. The results are as follows. The measurement solvent is methanol. sh indicates a shoulder.
Dye (6): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.04), 311sh (4.17), 538 (3.55); 0.01% HCl -MeOH: 283 (4.08), 332 (3.64), 530 (4.19); AlCl 3 -MeOH: 288 (3.99), 313 (3.94), 571 (4.28).
Dye (7): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.30), 308sh (4.19), 531 (3.89); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.33), 311 (4.17), 375sh (3.58), 530 (4.35); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.26), 311 (4.27), 411 (3.70), 573 (4.44).
Dye (8): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.49), 311sh (4.39), 553 (3.17); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.51), 314 (4.39), 530 (4.52); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.45), 313 (4.47), 570 (4.60).
Dye (23): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 282 (3.14), 311sh (1.89), 527 (2.71); 0.01% HCl -MeOH: 279 (3.14), 331 (2.49), 526 (3.43); AlCl 3 -MeOH: 284sh (2.97), 313 (2.82), 452 (2.64), 570 (3.44).
Dye (24): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 286 (4.27), 317sh (4.09), 531 (2.58); 0.01% HCl -MeOH: 281 (4.25), 294 (4.22), 530 (4.34); AlCl 3 -MeOH: 281 (4.19), 312 (4.21), 421 (3.68), 571 (4.37).
Dye (25): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.56), 311sh (4.46), 553 (3.23); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.58), 314 (4.46), 530 (4.59); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.51), 313 (4.54), 570 (4.67).
質量分析計（ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ-Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて、図３で示した（６）〜（８）及び（２３）〜（２５）のアントシアニン色素の質量を測定した。
色素（６）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ４４９．２１ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１１ ４４９．３１）。
色素（７）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５９５．１９ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１３ ５９５．４４）。
色素（８）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５９５．１４ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｏ１３ ５９５．４４）。
色素（２３）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６１１．３９ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ３１Ｏ１６ ６１１．４３）。
色素（２４）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７５７．４４ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３６Ｈ３７Ｏ１８ ７５７．５５）。
色素（２５）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７５７．４４ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３６Ｈ３７Ｏ１８ ７５７．５５）。
以上の結果、理論値と測定値がよく一致した。
The masses of anthocyanin dyes (6) to (8) and (23) to (25) shown in FIG. 3 were measured using a mass spectrometer (positive ion ionization-mass spectrometer; ESI-MS).
Dye (6): ESI-MS (m / z): 449.21 M + (Calcd for C 21 H 21 O 11 449.31).
Dye (7): ESI-MS (m / z): 595.19 M + (Calcd for C 30 H 27 O 13 595.44).
Dye (8): ESI-MS (m / z): 595.14 M + (Calcd for C 30 H 27 O 13 595.44).
Dye (23): ESI-MS (m / z): 611.39 M + (Calcd for C 27 H 31 O 16 611.43).
Dye (24): ESI-MS (m / z): 757.44 M + (Calcd for C 36 H 37 O 18 757.55).
Dye (25): ESI-MS (m / z): 757.44 M + (Calcd for C 36 H 37 O 18 757.55).
As a result, the theoretical value and the measured value agreed well.
〔実施例４〕園芸品種ツバキ：大理茶（Ｄａｌｉｃｈａ）の分析
（１）花弁から色素の抽出と単離、精製の方法
園芸品種ツバキから花弁を採集した。採集した花弁は、褐変を防ぐため熱湯に３〜５秒間浸漬し、ポリフェノールオキシダーゼなどの酵素を死活させた。浸漬後、花弁を室温で乾燥させた。乾燥花弁２ｋｇに、酢酸とメタノールを１対１で混合した溶液（５０％酢酸−メタノール）１１Ｌを加え、２０〜２５℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出液を綿栓でろ過した後、溶媒を減圧下、ロータリーエバポレーターで留去した。抽出残渣を５％酢酸水溶液に溶解し、オープンカラムクロマトグラフィーに付した。オープンカラムクロマトグラフィーの条件は、固定相にエムシーアイゲルＣＨＰ−２０Ｐ（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ、三菱化学株式会社、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、セファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）、クロマトレックスＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ、富士シリシア化学株式会社、Ｆｕｊｉ Ｓｉｌｙｓｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＬＴＤ．）を用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸−メタノールを用い、Ａ液からＢ液の含量を１０％ずつ増やすことによって、ＭＣＩgelのカラム（以下ＭＣＩカラム）−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム−ＯＤＳカラムの順番で各種クロマトグラフィーを行った。また、固定相にセファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を用い、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｃ液として５％酢酸−アセトン（アセトンに酢酸を５％量加えたもの）を用い、Ｃ液からＡ液の含量を増やすことによってクロマトグラフィーを行った。これらのオープンカラムクロマトグラフィーを繰り返し行うことによって、アントシアニン色素として、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（５）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１０）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｚ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１１）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１２）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｃａｆｆｅｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１３）、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１４）を単離及び精製した（図４）。単離及び精製したアントシアニン色素のうち、（５）、（１１）〜（１４）は新規な色素である（図４）。
[Example 4] Horticultural variety camellia: Analysis of Dalicha (1) Extraction, isolation and purification of pigments from petals Petals were collected from the garden variety camellia. The collected petals were immersed in hot water for 3 to 5 seconds to prevent browning, and an enzyme such as polyphenol oxidase was activated. After soaking, the petals were dried at room temperature. To 2 kg of dried petals, 11 L of a mixed solution of acetic acid and methanol (1: 1) (50% acetic acid-methanol) was added, and the anthocyanin pigment was extracted at 20 to 25 ° C. After the extract was filtered through a cotton plug, the solvent was distilled off with a rotary evaporator under reduced pressure. The extraction residue was dissolved in 5% aqueous acetic acid and subjected to open column chromatography. The conditions for the open column chromatography were MC eye gel CHP-20P (MCI gel CHP-20P, Mitsubishi Chemical Corporation, Mitsubishi Chemical Corporation), Sephadex LH-20 (GE Healthex Biosciences A). Chromatorex ODS (Chromatorex ODS, Fuji Silysia Chemical Ltd., Fuji Silysia Chemical LTD.), Using 5% acetic acid aqueous solution as the A liquid for the mobile phase, 5% acetic acid-methanol as the B liquid, and from the A liquid to the B liquid By increasing the content of each by 10%, various chromas in the order of MCIgel column (hereinafter MCI column)-Sephadex LH-20 column-ODS column A tomography was performed. Moreover, Sephadex LH-20 (Sephadex LH-20, GE Healthcare Biosciences AB) was used for the stationary phase, 5% acetic acid aqueous solution as the liquid A for the mobile phase, and 5% acetic acid-acetone (5% acetic acid in acetone as the liquid C). Chromatography was performed by increasing the content of solution A from solution C. By repeating these open column chromatography, cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl) -β-glucopyranoside (1), cyanidin 3-O- (2-O-β-) is used as an anthocyanin dye. xylopyranosyl-6-O- (Z) -p-cumaroyl) -β-glucopyranoside (2), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O- (E) -p-comaroyl) -β -Glucopyroxide (3), cyanidin 3-O- (2-O- [beta] -xylopyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl)-[beta] -glucopyranoside (4), cyanidin 3- -(2-O- [beta] -xylopyranosyl-6-O-acetyl)-[beta] -glucopyranoside (5), cyanidin 3-O- (2-O- [beta] -xylopyranosyl)-[beta] -galactopyranoside (10), cyanidin 3-O -(2-O- [beta] -xylopyranosyl-6-O- (Z) -p-cumaroyl)-[beta] -galactopyranoside (11), cyanidin 3-O- (2-O- [beta] -xylopyranosyl-6-O- (E ) -P-cumaroyl) -β-galactopylanoside (12), cyanidin 3-O- (2-O-β-xypyranosyl-6-O- (E) -caffeoyl) -β-galactopyran side (13), cyanidin 3-O- (2-O-β-xylopyranosyl-6-O-acetyl) -β-galactopyranoside (14) was isolated and purified (FIG. 4). Of the anthocyanin dyes isolated and purified, (5) and (11) to (14) are novel dyes (FIG. 4).
（２）色素の各種スペクトルデータ
単離・精製したアントシアニン色素のプロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ-Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ［ＮＭＲ］ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定装置は、ＪＮＭ-ＥＣＡ６００型核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＥＣＡ６００ＫＳ、日本電子データム株式会社、ＪＥＯＬ ＤＡＴＵＭ ＬＴＤ．）を用いた。測定は、ＣＤ３ＯＤとＣＦ３ＣＯＯＤの９対１混合溶液を用いて行った。その結果を表１３及び表１４に示す。表中の数値はデルタ（δ、ｐｐｍ）で示す。また、二番目に表された数値は、カップリング定数（Ｊ値）を示している。表中の記号で、ｂｒは、ｂｒｏａｄ、ｓはｓｉｎｇｌｅｔ、ｄはｄｏｕｂｌｅｔ、ｄｄはｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ、ｄｄｄはｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ、ｔはｔｒｉｐｌｅｔ、ｍはｍｕｌｔｉｐｌｅｔを示す。
(2) Various spectrum data of the dye The proton nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-Nuclear magnetic resonance [NMR] spectrum) of the isolated and purified anthocyanin dye was measured. As a measuring apparatus, a JNM-ECA600 type nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL JNM-ECA600KS, JEOL Datum Co., Ltd., JEOL DATUM LTD.) Was used. The measurement was performed using a 9: 1 mixed solution of CD 3 OD and CF 3 COOD. The results are shown in Tables 13 and 14. The numerical values in the table are indicated by delta (δ, ppm). The second numerical value represents the coupling constant (J value). In the table, br is “broad”, “s” is a singlet, “d” is a doublet, “dd” is a double doublet, “dd” is a double doublet, “t” is a triplet, and “m” is a multiplet.
単離・精製したアントシアニン色素の炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ-Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ［ＮＭＲ］ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定装置は、ＪＮＭ-ＥＣＡ６００型核磁気共鳴装置（ＪＥＯＬ ＪＮＭ-ＥＣＡ６００ＫＳ、日本電子データム株式会社、ＪＥＯＬ ＤＡＴＵＭ ＬＴＤ．）を用いた。測定は、ＣＤ３ＯＤとＣＦ３ＣＯＯＤの９対１混合溶液を用いて行った。その結果を表１５に示す。表中の数値はデルタ（δ、ｐｐｍ）で示す。また表中、Ｃ（Ｚ）はパラクマル酸のＺ型、Ｃ（Ｅ）はパラクマル酸のＥ型、Ｃａｆ（Ｅ）はカフェー酸のシグナルであることを示す。 The carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum ( 13 C-Nuclear magnetic resonance [NMR] spectrum) of the isolated and purified anthocyanin dye was measured. As a measuring apparatus, a JNM-ECA600 type nuclear magnetic resonance apparatus (JEOL JNM-ECA600KS, JEOL Datum Co., Ltd., JEOL DATUM LTD.) Was used. The measurement was performed using a 9: 1 mixed solution of CD 3 OD and CF 3 COOD. The results are shown in Table 15. The numerical values in the table are indicated by delta (δ, ppm). In the table, C (Z) indicates the Z-form of paracoumaric acid, C (E) indicates the E-form of paracoumaric acid, and Caf (E) indicates the signal of caffeic acid.
図４で示した（１）〜（５）及び（１０）〜（１４）のアントシアニン色素の紫外部吸収スペクトル（Ｕｌｔｒａ Ｖｉｏｌｅｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を測定した。測定には、島津製作所株式会社の分光機器（ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、ＵＶ−２１００）を用いた。その結果は次の通りである。測定溶媒はメタノールである。ｓｈはｓｈｏｕｌｄｅｒを示す。
色素（１）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８２ （４．３１）， ３７９ （３．１０）， ５３８ （３．４７）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８２ （４．３７）， ３３２ （３．６８）， ５３０ （４．５９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４０）， ３１２ （４．００）， ４１１ （３．８１）， ５６４ （４．６２）。
色素（２）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．５１）， ３１１ｓｈ （４．４０）， ５５３ （３．１８）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８４ （４．５３）， ３１４ （４．４０）， ５３０ （４．５４）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４６）， ３１３ （４．４９）， ５７０ （４．６１）。
色素（３）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８４ （４．５８）， ３１１ｓｈ （４．４８）， ５５３ （３．２５）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８４ （４．６０）， ３１４ （４．４８）， ５３０ （４．６１）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．５３）， ３１３ （４．５６）， ５７０ （４．６９）。
色素（４）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．６１）， ３３１ （４．４６）， ５３２ （４．５３）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８４ （４．６５）， ３３０ （４．５０）， ５３０ （４．６９）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．４８）， ３１４ （４．４７）， ３４９ （４．４９）， ５７１ （４．７５）。
色素（５）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８３ （４．１７）， ３４０ （３．２２）， ３６１ （３．２５）， ５３１ （３．５８）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８３ （４．２２）， ３３６ （３．５６））， ３８２ （３．６５）， ５３１ （４．４５）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８６ （４．０９）， ３１３ （３．８９）， ４０９ （３．７１）， ５７０ （４．５２）。
色素（１０）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８２ （４．１２）， ３３３ （３．２６）， ５３０ （４．２７）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８２ （４．１９）， ３３２ （３．４０）， ５３０ （４．４２）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８７ｓｈ （４．００）， ３１３ （３．８２）， ４０９ （３．５７）， ５７０ （４．５０）。
色素（１１）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．３９）， ３１３ｓｈ（４．２２）， ５３４ （４．３８）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．４１）， ３１１ （４．２３）， ５３４ （４．４８）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．３２）， ３１１ （４．３１）， ４０５ （３．８０）， ５７４ （４．５７）。
色素（１２）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．２２）， ３０８ｓｈ （４．１２）， ５３５ （３．３６）； ０．０１％ ＨＣｌ-ＭｅＯＨ： ２８４ （４．２４）， ３１２ （４．１２）， ５３１ （４．２５）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２９０ （４．１８）， ３１３ （４．２０）， ４０７ （３．４６）， ５７１ （４．３３）。
色素（１３）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８５ （４．３０）， ３３０ （４．１２）， ５３２ （３．４０）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８４ （４．３２）， ３３１ （４．１８）， ５３１ （４．４０）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８９ （４．１２）， ３１５ （４．１２）， ３５５ （４．１８）， ５６７ （４．４８）。
色素（１４）：赤色無晶形粉末、ＵＶ−ｖｉｓ λｍａｘ ＭｅＯＨ （ｎｍ） （ｌｏｇ ε）： ２８３ （４．１０）， ３４７ （３．２９）， ５５０ （２．９９）； ０．０１％ ＨＣｌ−ＭｅＯＨ： ２８３ （４．１４）， ３３５ （３．５５）， ３８１ （３．５６）， ５３１ （４．３６）； ＡｌＣｌ３−ＭｅＯＨ： ２８７ （３．９７）， ３１２ （３．７９）， ４０３ （３．６３）， ５７２ （４．４３）。
The ultraviolet absorption spectra (Ultra Violet spectrum) of the anthocyanin dyes (1) to (5) and (10) to (14) shown in FIG. 4 were measured. A spectroscopic instrument (UV-visible recording spectrometer, UV-2100) manufactured by Shimadzu Corporation was used for the measurement. The results are as follows. The measurement solvent is methanol. sh indicates a shoulder.
Dye (1): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 282 (4.31), 379 (3.10), 538 (3.47); 0.01% HCl -MeOH: 282 (4.37), 332 (3.68), 530 (4.59); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.40), 312 (4.00), 411 (3.81), 564 (4.62).
Dye (2): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.51), 311sh (4.40), 553 (3.18); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.53), 314 (4.40), 530 (4.54); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.46), 313 (4.49), 570 (4.61).
Dye (3): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 284 (4.58), 311sh (4.48), 553 (3.25); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.60), 314 (4.48), 530 (4.61); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.53), 313 (4.56), 570 (4.69).
Dye (4): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.61), 331 (4.46), 532 (4.53); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.65), 330 (4.50), 530 (4.69); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.48), 314 (4.47), 349 (4.49), 571 (4.75).
Dye (5): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 283 (4.17), 340 (3.22), 361 (3.25), 531 (3.58) ); 0.01% HCl-MeOH: 283 (4.22), 336 (3.56)), 382 (3.65), 531 (4.45); AlCl 3 -MeOH: 286 (4.09) 313 (3.89), 409 (3.71), 570 (4.52).
Dye (10): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 282 (4.12), 333 (3.26), 530 (4.27); 0.01% HCl -MeOH: 282 (4.19), 332 (3.40), 530 (4.42); AlCl 3 -MeOH: 287sh (4.00), 313 (3.82), 409 (3.57), 570 (4.50).
Dye (11): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.39), 313sh (4.22), 534 (4.38); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.41), 311 (4.23), 534 (4.48); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.32), 311 (4.31), 405 (3.80), 574 (4.57).
Dye (12): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.22), 308sh (4.12), 535 (3.36); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.24), 312 (4.12), 531 (4.25); AlCl 3 -MeOH: 290 (4.18), 313 (4.20), 407 (3.46), 571 (4.33).
Dye (13): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 285 (4.30), 330 (4.12), 532 (3.40); 0.01% HCl -MeOH: 284 (4.32), 331 (4.18), 531 (4.40); AlCl 3 -MeOH: 289 (4.12), 315 (4.12), 355 (4.18), 567 (4.48).
Dye (14): Red amorphous powder, UV-vis λ max MeOH (nm) (log ε): 283 (4.10), 347 (3.29), 550 (2.99); 0.01% HCl -MeOH: 283 (4.14), 335 (3.55), 381 (3.56), 531 (4.36); AlCl 3 -MeOH: 287 (3.97), 312 (3.79), 403 (3.63), 572 (4.43).
質量分析計（ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ-Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて、図４で示した（１）〜（５）、（１０）〜（１４）のアントシアニン色素の質量を測定した。
色素（１）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５８１．３７ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ２９Ｏ１５ ５８１．４１）。
色素（２）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７２７．３７ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１７ ７２７．５３）。
色素（３）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７２７．３８ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１７ ７２７．５３）。
色素（４）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７４３．３５ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１８ ７４３．５３）。
色素（５）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６２３．２５ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ３１Ｏ１６ ６２３．４４）。色素（１０）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ５８２．２２ ［Ｍ＋Ｈ］＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ２９Ｏ１５ ５８１．４１）。
色素（１１）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７２７．３７ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１７ ７２７．５３）。
色素（１２）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７２７．３２ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１７ ７２７．５３）。
色素（１３）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ７４３．４８ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ３５Ｏ１８ ７４３．５３）。
色素（１４）：ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ）： ６２３．３８ Ｍ＋ （Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ３１Ｏ１６ ６２３．４４）。
以上の結果、理論値と測定値がよく一致した。
The masses of anthocyanin dyes (1) to (5) and (10) to (14) shown in FIG. 4 were measured using a mass spectrometer (positive ion ionization-mass spectrometer; ESI-MS).
Dye (1): ESI-MS (m / z): 581.37 M + (Calcd for C 26 H 29 O 15 581.41).
Dye (2): ESI-MS (m / z): 727.37 M + (Calcd for C 35 H 35 O 17 727.53).
Dye (3): ESI-MS (m / z): 727.38 M + (Calcd for C 35 H 35 O 17 727.53).
Dye (4): ESI-MS (m / z): 743.35 M + (Calcd for C 35 H 35 O 18 743.53).
Dye (5): ESI-MS (m / z): 623.25 M + (Calcd for C 28 H 31 O 16 623.44). Dye (10): ESI-MS (m / z): 582.22 [M + H] + (Calcd for C 26 H 29 O 15 581.41).
Dye (11): ESI-MS (m / z): 727.37 M + (Calcd for C 35 H 35 O 17 727.53).
Dye (12): ESI-MS (m / z): 727.32 M + (Calcd for C 35 H 35 O 17 727.53).
Dye (13): ESI-MS (m / z): 743.48 M + (Calcd for C 35 H 35 O 18 743.53).
Dye (14): ESI-MS (m / z): 623.38 M + (Calcd for C 28 H 31 O 16 623.44).
As a result, the theoretical value and the measured value agreed well.
〔実施例５〕ＨＰＬＣによる各種ツバキの花弁に含まれる色素の分析
（１）トウツバキ（Ｃ．ｒｅｌｉｃｕｌａｔａ Ｌｉｎｄｌ．）の分析
トウツバキ（Ｃ．ｒｅｌｉｃｕｌａｔａ Ｌｉｎｄｌ．）の花弁（花）０．５ｇを採集し、予め準備した抽出溶媒１０ｍｌで２０℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出溶媒の組成は、メタノール−ギ酸−トリフルオロ酢酸−水（ＭｅＯＨ−ＨＣＯＯＨ−ＣＦ３ＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ）の７０：２：１：２７（ｖ／ｖ％）である。抽出液は、ミリポアフィルター（メッシュは０．４５μＭ）で通導後、下記のＨＰＬＣ分析条件にて分析した。その結果を図５に示す。色素がよく分離していることが分かる。
（ＨＰＬＣ分析条件）
ＨＰＬＣの溶出溶媒としては、Ａ液として１．５％リン酸を含む水溶液と、Ｂ液としてリン酸−ギ酸−アセトニトリル−テトラヒドロフラン−水の１．４：１９：２３．８：５：５０．８の比率で混合した溶液を用い、流速を１分間に０．８ｍｌ、カラムの温度を４０℃に保ち、検出波長を５２５ｎｍに設定し、Ａ液とＢ液との比率を８２：１８から３０：７０の比率で３５分かけてリニアーグラジエント溶出させた。
[Example 5] Analysis of pigments contained in various camellia petals by HPLC (1) Analysis of C. relicula Lindl. Collect 0.5 g of petals (flowers) of C. reliculata Lindl. The anthocyanin pigment was extracted at 20 ° C. with 10 ml of an extraction solvent prepared in advance. The composition of the extraction solvent, methanol - formic acid - trifluoroacetic acid - water (MeOH-HCOOH-CF 3 COOH -H 2 O) of 70: 2: 1: 27 (v / v%). The extract was passed through a Millipore filter (mesh was 0.45 μM) and then analyzed under the following HPLC analysis conditions. The result is shown in FIG. It can be seen that the pigments are well separated.
(HPLC analysis conditions)
As an elution solvent for HPLC, 1.4: 19: 23.8: 5: 50.8 is an aqueous solution containing 1.5% phosphoric acid as solution A and phosphoric acid-formic acid-acetonitrile-tetrahydrofuran-water as solution B. The solution was mixed at the following ratio, the flow rate was 0.8 ml per minute, the column temperature was kept at 40 ° C., the detection wavelength was set at 525 nm, and the ratio of liquid A to liquid B was changed from 82:18 to 30: A linear gradient was eluted at a ratio of 70 over 35 minutes.
（２）ピタールツバキ雲南種（西南山茶雲南種、Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ ｖａｒ． ｙｕｎｎａｎｉｃａ）の分析
ピタールツバキ雲南種（西南山茶雲南種、Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ ｖａｒ． ｙｕｎｎａｎｉｃａ）の花弁（花）０．５ｇを採集し、予め準備した抽出溶媒１０ｍｌで２０℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出溶媒の組成は、メタノール−ギ酸−トリフルオロ酢酸−水（ＭｅＯＨ−ＨＣＯＯＨ−ＣＦ３ＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ）の７０：２：１：２７（ｖ／ｖ％）である。抽出液は、ミリポアフィルター（メッシュは０．４５μＭ）で通導後、前記ＨＰＬＣ条件にて分析した。その結果を図６に示す。色素がよく分離していることが分かる。また、トウツバキ（Ｃ．ｒｅｌｉｃｕｌａｔａ Ｌｉｎｄｌ．）の花弁（花）から得られたアントシニン色素組成と類似しているが、両者のＨＰＬＣ分析のデータによる品種識別は可能であると考える。
(2) Analysis of Pital camellia Yunnan species (Seinanyama tea Yunnan species, C. partardii var. Yunnanica) Pital camellia Yunnan species (Seinanzan tea Yunnan species, C. pitardii var. Yunnanica) The anthocyanin dye was extracted at 20 ° C. with 10 ml of the prepared extraction solvent. The composition of the extraction solvent, methanol - formic acid - trifluoroacetic acid - water (MeOH-HCOOH-CF 3 COOH -H 2 O) of 70: 2: 1: 27 (v / v%). The extract was passed through a Millipore filter (mesh was 0.45 μM) and then analyzed under the above HPLC conditions. The result is shown in FIG. It can be seen that the pigments are well separated. Moreover, although it is similar to the anthinine pigment composition obtained from the petals (flowers) of C. reliculata Lindl., It is considered that the cultivar identification can be performed based on both HPLC analysis data.
（３）ホンコンツバキ（Ｃ．ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｓｅｅｍ．）の分析
ホンコンツバキ（Ｃ．ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｓｅｅｍ．）の花弁（花）０．５ｇを採集し、予め準備した抽出溶媒１０ｍｌで２０℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出溶媒の組成は、メタノール−ギ酸−トリフルオロ酢酸−水（ＭｅＯＨ−ＨＣＯＯＨ−ＣＦ３ＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ）の７０：２：１：２７（ｖ／ｖ％）である。抽出液は、ミリポアフィルター（メッシュは０．４５μＭ）で通導後、前記ＨＰＬＣ条件にて分析した。その結果を図７に示す。色素がよく分離していることが分かる。
(3) Analysis of Hong Kong camellia (C. hongkongensis Seem.) 0.5 g of petals (flowers) of Hong Kong camellia (C. hongkongensis Seem.) Was collected, and anthocyanin pigment was extracted at 20 ° C. with 10 ml of an extraction solvent prepared in advance. . The composition of the extraction solvent, methanol - formic acid - trifluoroacetic acid - water (MeOH-HCOOH-CF 3 COOH -H 2 O) of 70: 2: 1: 27 (v / v%). The extract was passed through a Millipore filter (mesh was 0.45 μM) and then analyzed under the above HPLC conditions. The result is shown in FIG. It can be seen that the pigments are well separated.
（４）ヤブツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）の分析
ヤブツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）の花弁（花）０．５ｇを採集し、予め準備した抽出溶媒１０ｍｌで２０℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出溶媒の組成は、メタノール−ギ酸−トリフルオロ酢酸−水（ＭｅＯＨ−ＨＣＯＯＨ−ＣＦ３ＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ）の７０：２：１：２７（ｖ／ｖ％）である。抽出液は、ミリポアフィルター（メッシュは０．４５μＭ）で通導後、前記ＨＰＬＣ条件にて分析した。その結果を図８に示す。色素がよく分離していることが分かる。また、ホンコンツバキ（Ｃ．ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）の花弁（花）から得られたアントシニン色素組成とは違い、デルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）系の配糖体が認められないことが分かる。
(4) Analysis of C. japonica 0.5 g of petals (flowers) of C. japonica were collected, and anthocyanin pigment was extracted at 20 ° C. with 10 ml of an extraction solvent prepared in advance. The composition of the extraction solvent, methanol - formic acid - trifluoroacetic acid - water (MeOH-HCOOH-CF 3 COOH -H 2 O) of 70: 2: 1: 27 (v / v%). The extract was passed through a Millipore filter (mesh was 0.45 μM) and then analyzed under the above HPLC conditions. The result is shown in FIG. It can be seen that the pigments are well separated. It can also be seen that, unlike the anthinine pigment composition obtained from the petals (flowers) of C. hongkongensis, no delphinidin-based glycosides are observed.
（５）サルウィンツバキ（Ｃ．ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ Ｓｔaｐｆ ｅｘ Ｈｅａｍ）の分析
サルウィンツバキ（Ｃ．ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ Ｓｔaｐｆ ｅｘ Ｈｅａｍ）の花弁（花）２５ｇを採集し、予め準備した抽出溶媒１０ｍｌで２０℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出溶媒の組成は、メタノール−ギ酸−トリフルオロ酢酸−水（ＭｅＯＨ−ＨＣＯＯＨ−ＣＦ３ＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ）の７０：２：１：２７（ｖ／ｖ％）である。抽出液は、ミリポアフィルター（メッシュは０．４５μＭ）で通導後、前記ＨＰＬＣ条件にて分析した。その結果を図９に示す。色素がよく分離していることが分かる。
(5) Analysis of C. saluenensis staf ex Heam 25 g of petals (flowers) of C. saluensis staf ex Heam were collected, and anthocyanin pigment was extracted at 10 ° C. with 10 ml of a preliminarily prepared extraction solvent. . The composition of the extraction solvent, methanol - formic acid - trifluoroacetic acid - water (MeOH-HCOOH-CF 3 COOH -H 2 O) of 70: 2: 1: 27 (v / v%). The extract was passed through a Millipore filter (mesh was 0.45 μM) and then analyzed under the above HPLC conditions. The result is shown in FIG. It can be seen that the pigments are well separated.
（６）ピタールツバキピタール種（西南山茶西南種、Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ ｖａｒ． ｐｉｔａｒｄｉｉ）の分析
ピタールツバキピタール種（西南山茶西南種、Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ ｖａｒ． ｐｉｔａｒｄｉｉ）の花弁（花）０．５ｇを採集し、予め準備した抽出溶媒１０ｍｌで２０℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出溶媒の組成は、メタノール−ギ酸−トリフルオロ酢酸−水（ＭｅＯＨ−ＨＣＯＯＨ−ＣＦ３ＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ）の７０：２：１：２７（ｖ／ｖ％）である。抽出液は、ミリポアフィルター（メッシュは０．４５μＭ）で通導後、前記ＨＰＬＣ条件にて分析した。その結果を図１０に示す。色素がよく分離していることが分かる。また、サルウィンツバキ（Ｃ．ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ Ｓｔaｐｆ ｅｘ Ｈｅａｍ）の花弁（花）から得られたアントシニン色素組成と類似しているが、両者のＨＰＬＣ分析データによる品種識別は可能であると考える。
(6) Analysis of Pital camellia pitari species (Seinanyama tea southwest species, C. partardii var. Partardii) Pital camellia pital species (Nishinanyama tea southwest species, C. pitaldi var. Pitaradii) Petals (flowers) 0. 5 g was collected, and the anthocyanin dye was extracted at 20 ° C. with 10 ml of an extraction solvent prepared in advance. The composition of the extraction solvent, methanol - formic acid - trifluoroacetic acid - water (MeOH-HCOOH-CF 3 COOH -H 2 O) of 70: 2: 1: 27 (v / v%). The extract was passed through a Millipore filter (mesh was 0.45 μM) and then analyzed under the above HPLC conditions. The result is shown in FIG. It can be seen that the pigments are well separated. Moreover, although it is similar to the anthinine pigment composition obtained from the petals (flowers) of C. saluenensis Snapf ex Heam, it is considered that cultivar identification can be performed by HPLC analysis data of both.
（７）園芸品種ツバキ：大理茶（Ｄａｌｉｃｈａ）の分析
園芸品種ツバキ：大理茶（Ｄａｌｉｃｈａ）の花弁（花）０．２５ｇを採集し、予め準備した抽出溶媒１０ｍｌで２０℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出溶媒の組成は、メタノール−ギ酸−トリフルオロ酢酸−水（ＭｅＯＨ−ＨＣＯＯＨ−ＣＦ３ＣＯＯＨ−Ｈ２Ｏ）の７０：２：１：２７（ｖ／ｖ％）である。抽出液は、ミリポアフィルター（メッシュは０．４５μＭ）で通導後、前記ＨＰＬＣ条件にて分析した。その結果を図１１に示す。色素がよく分離していることが分かる。
(7) Analysis of Horticulture Variety Camellia: Dalicha Horticulture Variety Camellia: Dalicha Petal (flower) 0.25g was collected, and anthocyanin pigment was extracted at 20 ° C with 10 ml of extraction solvent prepared in advance. . The composition of the extraction solvent, methanol - formic acid - trifluoroacetic acid - water (MeOH-HCOOH-CF 3 COOH -H 2 O) of 70: 2: 1: 27 (v / v%). The extract was passed through a Millipore filter (mesh was 0.45 μM) and then analyzed under the above HPLC conditions. The result is shown in FIG. It can be seen that the pigments are well separated.
〔実施例６〕ツバキ花弁より抽出した抽出エキス、及び単離・精製したアントシアニン色素の生物活性試験
（１）アントシアニンサンプルの調製
実施例２と同様に、ホンコンツバキの花弁からアントシアニンを抽出した。採集した花弁８ｋｇに直接、酢酸とメタノールを１対１で混合した溶液（５０％酢酸−メタノール）２０Ｌを加え、２０−２５℃でアントシアニン色素を抽出した。抽出液を綿栓でろ過した後、溶媒を減圧下、ロータリーエバポレーターで留去した。抽出残渣を５％酢酸水溶液に溶解し、オープンカラムクロマトグラフィーに付した。オープンカラムクロマトグラフィーの条件は、固定相にエムシーアイゲルＣＨＰ−２０Ｐ（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ、三菱化学株式会社、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、移動相にＡ液として５％酢酸水溶液、Ｂ液として５％酢酸−メタノールを用い、Ａ液からＢ液の含量を１０％ずつ増やすことによって、ＭＣＩｇｅｌのカラム（以下ＭＣＩカラム）クロマトグラフィーを行い、６つの分画を得た。
[Example 6] Extraction extract extracted from camellia petals and biological activity test of isolated and purified anthocyanin pigment (1) Preparation of anthocyanin sample Anthocyanins were extracted from petals of Honkon camellia as in Example 2. 20 L of a mixed solution of 50% acetic acid and methanol (50% acetic acid-methanol) was directly added to 8 kg of the collected petals, and the anthocyanin pigment was extracted at 20-25 ° C. After the extract was filtered through a cotton plug, the solvent was distilled off with a rotary evaporator under reduced pressure. The extraction residue was dissolved in 5% aqueous acetic acid and subjected to open column chromatography. The conditions of the open column chromatography were as follows: MC Igel CHP-20P (MCI gel CHP-20P, Mitsubishi Chemical Corporation, Mitsubishi Chemical Corporation) as the stationary phase, 5% acetic acid aqueous solution as the liquid A, and 5% as the liquid B Using acetic acid-methanol, the content of liquid B from liquid A was increased by 10%, and MCIgel column (hereinafter referred to as MCI column) chromatography was performed to obtain six fractions.
ＤＰＰＨラジカル消去能とヒト白血病細胞増殖抑制作用の実験に用いたサンプル名とサンプル量は以下の通りである。ツバキ花弁の抽出エキス（抽出溶媒を留去した原液）は８５５．７ｍｇ、分画１は０．８４ｇ、分画２は０．２３ｇ、分画３は０．２０ｇ、分画４は１０６．７ｍｇ、分画５は１０１．２ｍｇ、分画６は１０３．４ｍｇであった。
The sample names and sample amounts used in the experiments for DPPH radical scavenging ability and human leukemia cell growth inhibitory action are as follows. Camellia petal extract (stock solution from which the extraction solvent was distilled off) was 855.7 mg,
また、これらの分画の他に、精製したアントシアニン類を実験に供試した。それらのアントシアニンの種類と供試量は以下の通りである。ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）は２１．３ｍｇ、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３，５−ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２３）は２１．２ｍｇ、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８）は２２．７ｍｇ、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１）は２０．２ｍｇ、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３）は１５．５ｍｇ、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−β−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−６−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１２）は１５．３ｍｇ、を供試した。
In addition to these fractions, purified anthocyanins were used for experiments. The types and test amounts of these anthocyanins are as follows. cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6) is 21.3 mg,
（２）ＤＰＰＨラジカル消去能の実験方法
抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Ｈａｒｗａｔ， Ｋ．Ｓ．Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓ．， ３６：１７７−１８７， ２００２）。
(2) Experimental method for DPPH radical scavenging ability Antioxidant experiment was performed using the method described in the following literature (Harwat, KS et al, Free Radical Res., 36: 177-). 187, 2002).
サンプルは、前記（１）で得られた６つの粗製分画物と抽出エキス及び６種のアントシアニンをそれぞれ２０から１６０μｇ／ｍｌ以下の濃度で調整したものを順次半等分に希釈して用いた。 Samples were prepared by sequentially diluting the six crude fractions obtained in (1) above, the extracted extract and the six types of anthocyanins into concentrations of 20 to 160 μg / ml or less in order. .
これらのサンプルを平底のプレート（９６ｗｅｌｌ）に加え、更にＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ、マイクロモーラーの濃度で調整したもの）を１９０μｌ加え、１０秒間混合した後、遮光して３０分間放置した。この反応後、各ウエルの反応溶液を、４９０ｎｍの波長の吸光度を用いてマイクロプレートリーダーで測定し、その吸光度の値からＴｒｏｌｏｘの吸光度標準曲線を用いてＴｒｏｌｏｘ濃度を換算した。その換算値より、Ｔｒｏｌｏｘのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去率を算出した。 Add these samples to a flat-bottom plate (96 well), add 190 μl of DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, adjusted to the concentration of micromolar), mix for 10 seconds, and then shield from light for 30 minutes. I left it alone. After this reaction, the reaction solution in each well was measured with a microplate reader using absorbance at a wavelength of 490 nm, and the Trolox concentration was converted from the absorbance value using a Trolox absorbance standard curve. From the converted value, the radical scavenging rate was calculated from the Trolox radical scavenging standard curve.
ＤＰＰＨラジカル消去能の結果を表１６に示した。アントシアニンでは、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６）が最も強い抗酸化作用を示すことが分かる。続いて、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３，５−ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２３）が強い抗酸化作用を示した。
The results of DPPH radical scavenging ability are shown in Table 16. In anthocyanins, it can be seen that cyanidin 3-O-β-glucopyranoside (6) exhibits the strongest antioxidant effect. Subsequently,
ＤＰＰＨラジカル消去能の結果を表１７に示した。分画では、分画３が最も強い抗酸化作用を示し、続いて、分画４，分画５の順で強い抗酸化活性を示した。このように、ツバキの抽出エキスのみならず、分画が強い活性を示したことから、ツバキ花弁のエキスが抗酸化作用に有効であることが分かった。
The results of DPPH radical scavenging ability are shown in Table 17. In the fractionation,
（３）ヒト急性前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）に対する抑制効果を見るための実験方法
ＨＬ−６０細胞増殖抑制作用の実験は、特開２００５−０７５７９０号公報に記載の方法を用いて行った。
(3) Experimental method for observing the inhibitory effect on human acute promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells) The HL-60 cell proliferation inhibitory effect was tested using the method described in JP-A-2005-075790. went.
［ヒト急性前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）の調製］
ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地の作成：
ＲＭＰＩ１６４０を２．０４ｇ秤取し、蒸留水にて全量を２００ｍｌとし、攪拌して溶解した後、溶液をオートクレーブで滅菌した（１２１℃、２０分）。冷却後、これに、１０％炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を４ｍｌ、ＦＢＳ（予め非動化したもの）を２０ｍｌ、抗生物質溶液（ペニシリン・ストレプトマイシン）２ｍｌを加え、４℃で保存した。
[Preparation of human acute promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells)]
Preparation of RMPI 1640 (10% FBS +) medium:
After 2.04 g of RMPI 1640 was weighed and made up to 200 ml with distilled water and dissolved by stirring, the solution was sterilized with an autoclave (121 ° C., 20 minutes). After cooling, 4 ml of 10% sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ), 20 ml of FBS (previously immobilized) and 2 ml of antibiotic solution (penicillin / streptomycin) were added and stored at 4 ° C.
ＨＬ−６０細胞の融解と増殖：
−８０℃で保管しておいたＨＬ−６０細胞を３７℃で溶解し、予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌに混入し、よく混合した。培地は、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）を行った後、上澄みを除去した。これにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、更にＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌを加え、混合した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）を行い、上澄みを除去した。これにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、更にＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌを加え、混合した後、シャーレ（６ｃｍ）に培地を入れ、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターでＨＬ−６０細胞を培養した。
Thawing and proliferation of HL-60 cells:
HL-60 cells stored at −80 ° C. were lysed at 37 ° C., mixed in 5 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium previously incubated at 37 ° C., and mixed well. The culture medium was centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and then the supernatant was removed. To this, 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium was added, stirred gently, and further 5 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium was added and mixed, followed by centrifugation (1200 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed. To this, 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium was added, stirred gently, 5 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium was added and mixed, and then the medium was placed in a petri dish (6 cm) and 37% in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. HL-60 cells were cultured in an incubator under the condition of ° C.
ＨＬ−６０細胞の継代：
培養し、増殖されたＨＬ−６０細胞を１５ｍｌチューブで回収し、丁寧に攪拌した後、その少量を血球計算盤に採取し、細胞数をカウントした。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞は、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）を行った後、上澄みを除去した。これに予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、先の細胞数を計算した値から、培地中の細胞の濃度が２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／６ｍｌとなるように、ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で濃度を調整した。調製した培地は、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターでＨＬ−６０細胞を継代した。
Passage of HL-60 cells:
Cultured and proliferated HL-60 cells were collected in a 15 ml tube and carefully stirred, and a small amount thereof was collected on a hemocytometer, and the number of cells was counted. HL-60 cells collected in a 15 ml tube were centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and then the supernatant was removed. To this, 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium preliminarily kept at 37 ° C. was added, stirred gently, and based on the calculated number of cells, the concentration of cells in the medium was 2 × 10 6 cells / 6 ml. The concentration was adjusted with RMPI 1640 (10% FBS +) medium. The prepared medium was subcultured HL-60 cells in an incubator under conditions of 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide.
ＨＬ−６０細胞の保存：
継代されたＨＬ−６０細胞を１５ｍｌチューブで回収し、丁寧に攪拌した後、その少量を血球計算盤に採取し、細胞数をカウントした。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞は、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）を行った後、上澄みを除去した。これに予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、先の細胞数を計算した値から、培地中の細胞の濃度が２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌとなるように、ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地を８０％、ＦＢＳを１０％、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１０％の組成を有する培地で、濃度を調整した。これをセラムチューブに１ｍｌずつ分注し、−２０℃で一夜保存後、翌日より−８０℃にて
保存した。
Storage of HL-60 cells:
The subcultured HL-60 cells were collected in a 15 ml tube and carefully stirred, and a small amount thereof was collected on a hemocytometer, and the number of cells was counted. HL-60 cells collected in a 15 ml tube were centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and then the supernatant was removed. To this, 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium preliminarily kept at 37 ° C. was added, stirred gently, and from the value obtained by calculating the number of cells, the concentration of cells in the medium was 2 × 10 6 cells / 1 ml. The concentration was adjusted with a medium having a composition of 80% RMPI 1640 (10% FBS +), 10% FBS, and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO). 1 ml of this was dispensed into a serum tube, stored overnight at -20 ° C, and then stored at -80 ° C from the next day.
［細胞増殖抑制実験（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）；ＨＬ−６０細胞の５０％生存率の検定方法］
本法は、文献記載の方法を参考にした（Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｔ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５：５５−６３、１９８３）。２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で継代したＨＬ−６０細胞を、平底の９６ ｗｅｌｌのプレート１ ｗｅｌｌあたり２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＨＬ−６０細胞数になるように培地でＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で希釈し、２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＨＬ−６０細胞を各ｗｅｌｌへ分注した。これを５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで２４時間培養した。
[Cell growth inhibition experiment (MTT assay); assay method of 50% viability of HL-60 cells]
This method was based on a method described in the literature (Mosmann, T .: J. Immunol. Methods, 65: 55-63, 1983). HL-60 cells passaged in 2 × 10 6 cells / ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium are RMPI 1640 in the medium so that the number of HL-60 cells is 2 × 10 4 cells / 100 μl per well of 96-well plate with flat bottom. After dilution with (10% FBS +) medium, 2 × 10 4 cells / 100 μl of HL-60 cells were dispensed into each well. This was cultured in an incubator for 24 hours under conditions of 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide.
培養後各ｗｅｌｌに、各アントシアニン及び分画の濃度が０、５０、１００、２００、４００マイクログラム／ｍｌの濃度になるように、また、各ｗｅｌｌの培地量が全量で１１０μｌとなるように添加した。添加後、プレート毎に規定した時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで４８時間培養した。 Added to each well after culture so that the concentration of each anthocyanin and fractions is 0, 50, 100, 200, 400 micrograms / ml, and the total amount of each well is 110 μl. did. After the addition, the cells were cultured in an incubator for 48 hours under conditions of 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide for the time specified for each plate.
培養後、各ｗｅｌｌにＭＴＴ溶液（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロミド；３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＭＴＴ、の１５０ｍｇをＰＢＳの３０ｍｌに溶解したもの）を１０μｌずつ分注した。プレート毎に４時間、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌに０．０４Ｎ ＨＣｌ−イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）溶液を１００μｌずつ分注した。室温で１０分間放置した後、マイクロプレートリーダーのマルチラベルカウンター（５９５ｎｍ）で吸光度を測定した。細胞生存率（％）は、アントシアニン又は分画を添加していない（コントロール細胞の）吸光度から各アントシアニン又は分画の吸光度を引いたものを、コントロール細胞の吸光度で割った値に１００を乗じて算出した。 After the culture, each well was added with MTT solution (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide; 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5- 10 mg of diphenyl tetrazole bromide, MTT, dissolved in 30 ml of PBS) was dispensed. Each plate was cultured for 4 hours in an incubator at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. After completion of the culture, 100 μl of 0.04N HCl-isopropanol solution was dispensed to each well. After standing at room temperature for 10 minutes, the absorbance was measured with a multi-label counter (595 nm) of a microplate reader. Cell viability (%) is obtained by subtracting the absorbance of each anthocyanin or fraction from the absorbance of no anthocyanin or fraction (control cells) divided by the absorbance of the control cells and multiplying by 100. Calculated.
ヒト急性前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）に対する抑制効果の結果を表１８に示した。アントシアニンでは、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３，５−ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２３）が最も強いＨＬ−６０細胞の増殖抑制活性を示した。続いて、ｃｙａｎｉｄｉｎ ３−Ｏ−（２−Ｏ−βｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１）が強いＨＬ−６０細胞の増殖抑制活性を示した。このように、ツバキ花弁由来のアントシアニン色素がＨＬ−６０細胞の増殖抑制に有効であることが分かった。
The results of the inhibitory effect on human acute promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells) are shown in Table 18. In anthocyanins,
ヒト急性前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）に対する抑制効果の結果を表１９に示した。分画では、分画５が最も強いＨＬ−６０細胞の増殖抑制活性を示し、続いて、分画３，分画２、分画４の順で強いＨＬ−６０細胞の増殖抑制活性を示した。このように、ツバキ花弁抽出エキスの分画が強い活性を示したことから、ツバキ花弁のエキスがＨＬ−６０細胞の増殖抑制に有効であることが分かった。
The results of the inhibitory effect on human acute promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells) are shown in Table 19. In fractionation, fraction 5 showed the strongest HL-60 cell growth inhibitory activity, followed by strong HL-60 cell growth inhibitory activity in the order of
本発明のアントシアニン色素は、飲食品、医薬品、化粧品の添加剤として有用である。本発明のツバキの色素による品種識別方法は、ツバキの品種を決定する方法として利用することができる。 The anthocyanin pigment of the present invention is useful as an additive for foods and drinks, pharmaceuticals, and cosmetics. The method for identifying a variety of camellia according to the present invention can be used as a method for determining a variety of camellia.
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Cited By (3)
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997041137A1 (en) * | 1996-04-17 | 1997-11-06 | Unifob | Use of anthocyanidin and anthocyanidin derivatives |
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| WO2005077176A1 (en) * | 2004-02-11 | 2005-08-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Anthocyanin compounds and methods of use thereof |
| JP2007302577A (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-22 | National Agriculture & Food Research Organization | Tea leaf extract composition |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6012050731; Ｎｏｒｉｏ Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．: Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６（１０）, 1987, ｐ．２７６１-２７６２ * |
| JPN6012050732; Ｎｏｒｉｈｉｋｏ Ｔｅｒａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．: Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．５６, 2001, ｐ．３５９-３６１ * |
| JPN6012050733; Ｊｕｎｇｍｉｎ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．: Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｏｌ．８７, 2007, ｐ．２６６５-２６７５ * |
| JPN6012050734; Ｊｉａｎ-Ｂｉｎ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．: Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｖｏｌ．７１（１１）, 2007, ｐ．２８３３-２８３６ * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104761596A (en) * | 2015-02-01 | 2015-07-08 | 云南农业大学 | Method for preparing anthocyanin standard substance |
| KR20180036354A (en) * | 2016-09-30 | 2018-04-09 | (주)아모레퍼시픽 | Method for evaluating a quality of camellia seed oil using Gas Chromatography Ion Mobility Spectrometer(GC-IMS) |
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