JP2002189015A

JP2002189015A - 酵素電極による反応電流測定方法

Info

Publication number: JP2002189015A
Application number: JP2000387276A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Takahashi; 正昭高橋; Tadamori Konno; 忠盛紺野; Katsuyuki Sunamura; 克之砂村
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2000-12-20
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2002-07-05

Abstract

(57)【要約】【課題】測定の正確さや再現性は勿論のこと、測定時
間が短縮された反応電流測定方法を提供する。【解決手段】被検液中の特定物質の濃度を測定するた
めに、作用極、参照極及び対極で構成される３電極方式
の酵素電極を用い、ａ）測定する被検液が酵素電極に点
着されたことを検出し、ｂ）各電極の酵素膜を膨潤さ
せ、ｃ）作用極と対極との間に所定電流を通電して被検
液中の水分の電気分解を行い、ｄ）参照極と作用極との
間に過酸化水素の酸化電圧まで電圧を時間とともに上昇
させて印加し、前記電気化学的酸化電圧に所定時間保持
した後、作用極と対極との間に流れる反応電流を測定す
る反応電流測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検液中の特定物
質の濃度を測定するために、酵素反応に伴って発生する
過酸化水素の酸化反応に伴う電流（以下、「反応電流」
という）を測定する方法に関する。特に、測定精度の向
上と測定時間の短縮とを図り、例えば、糖尿病患者が自
宅で自己の血糖値を測定するために使用される簡易式血
糖値測定装置に適した反応電流測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液等被検液中のグルコースを分析する
手段として、グルコースオキシダーゼを親水性高分子に
より白金電極表面に包括固定した、所謂「酵素電極」が
使用されている。この酵素電極上では、下記反応１〜反
応４に示すように、被検液中のグルコース濃度はグルコ
ースオキシダーゼ（GOD）の触媒作用により酵素反応が
起こり、反応１において、被検液中のグルコース濃度に
比例した過酸化水素（H₂O₂）が生成される。この過酸化
水素は白金電極の作用極表面で酸化（反応２，反応３）
されることから、そのときの作用極と対極間の電流（反
応電流）を検知することで、予め用意されたグルコース
濃度対反応電流値の検量線から被検液中のグルコース濃
度を算出することができる。

【０００３】

【化１】

【０００４】また、酵素電極は、作用極と対極とから成
る2電極が一般的であるが、酵素電極を作製する際に生
ずる酵素電極個体差の影響の排除や測定精度の向上等を
目的として、作用極と対極の他に参照極を用いた3電極
構造（図１参照）も採用されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ところで、簡易式血糖
値測定装置においては、患者自身や医療関係者が毎日血
糖値を測定しなければならないことから、測定の正確さ
や再現性に加えて、測定時間の短縮が強く要望されてい
る。

【０００６】しかし、従来の簡易式血糖値測定装置で
は、過酸化水素を酸化するための電気化学的酸化電圧
（以下、「酸化電圧」という）の印加に際して、比較的
レートの低い傾斜電圧を印加し、それに反応した電流ピ
ーク、あるいは一定時間後の反応電流を検出している
が、このような手法を白金電極を用いた酵素電極に適用
すると、電流ピーク検出では測定精度が充分に満足され
ず、また、傾斜電圧レートが低いことから測定時間も長
くなっている。

【０００７】また、保存のために酵素膜は乾燥した状態
で電極上に担持されているため、被検液のグルコース濃
度を分析する際、被検液中のグルコースと乾燥状態の酵
素膜中にあるグルコースオキシダーゼとを被検液中の水
分で充分湿らせて膨潤させ、酵素反応を起こさせる必要
がある。このように、膨潤並びに上記した電圧印加手法
が測定に時間を要している主要因となっており、従来の
一般的な簡易式血糖値測定装置では、測定終了までに概
ね３０秒以上要している。

【０００８】また、採取血液の量をより少なくすること
も要求されており、そのためには検出感度を高めて低濃
度のグルコースでも正確に測定できるようにする必要が
ある。

【０００９】本発明はこのような状況に鑑みてなされた
ものであり、測定の正確さや再現性は勿論のこと、測定
時間が短縮された反応電流測定方法を提供することを目
的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、被検液中の特定物質の濃度を測定するた
めに、作用極、参照極及び対極で構成される３電極方式
の酵素電極を用い、酵素反応により生成した過酸化水素
の酸化に伴う反応電流を測定する方法において、ａ）測定する被検液が酵素電極に点着されたことを検出
し、ｂ）各電極の酵素膜を膨潤させ、ｃ）作用極と対極との間に所定電流を通電して被検液中
の水分の電気分解を行い、ｄ）参照極と作用極との間に過酸化水素の電気化学的酸
化電圧まで電圧を時間とともに上昇させて印加し、前記
電気化学的酸化電圧に所定時間保持した後、作用極と対
極との間に流れる反応電流を測定する、工程を含むこと
を特徴とする反応電流測定方法を提供する。

【００１１】また、本発明は、前記工程ｃ）と工程ｄ）
との間に、電気分解により発生した酸素ガス及び水素ガ
スによる泡沫を安定化させる工程を挿入することを特徴
とする上記反応電流測定方法を提供する。

【００１２】また、本発明は、前記工程ｄ）において、
電気化学的酸化電圧まで電圧を直線的に上昇させて印加
することを特徴とする上記反応電流測定方法を提供す
る。

【００１３】また、本発明は、前記工程ｄ）において、
電気化学的酸化電圧まで電圧を曲線的に上昇させて印加
することを特徴とする上記反応電流測定方法を提供す
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明に関して図面を参照
して詳細に説明する。

【００１５】本発明においては、酵素電極は、図１にそ
の上面図として示すように、作用極１と対極２との中央
に参照極３を配した３電極構造を採用している。各電極
は何れも公知の構成で構わず、例えばガラスエポキシ基
板１０に設けられた電極形成部１１に、メッキ等により
白金電極を所定形状に成膜し、その上に酵素膜を担持さ
せ、更にその上に血球分離膜を積層して概略構成され
る。

【００１６】２電極構造では、電極の分極も含めて個々
の電極の均一性が異なると、過酸化水素を酸化するため
の酸化電圧が正確に印加されないという問題が発生し、
このことは、再現性の低下につながる可能性が高い。し
かし、実際には電極作成時における膜液のコントロール
精度あるいは保存状態等により、厳密には個々の酵素電
極の膜質(膜厚、膜の吸湿程度等)が異なっていることが
多い。そこで、本発明においては、参照極３を用いた３
電極法を採用する。

【００１７】また、各電極は、例えば図２に示される測
定回路４に接続される。この測定回路４において、符号
４１は電位測定用増幅器であり、正端子に作用極１が接
続され、負端子に参照極３が接続されている。符号４２
はボルテージフォロワー型増幅器であり、正端子には端
子Ｔ１を通じて外部から電極への電圧及び電流の指示信
号が印加され、負端子にはスイッチＳＷ１が接続されて
いる。また、このボルテージフォロワー型増幅器４２の
出力端子には作用極１が接続されている。対極２は、符
号４３で示される電流測定用増幅器の負端子に接続され
ている。電流測定用増幅器４３はフィードバック回路４
４を備えており、このフィードバック回路４４は、ツェ
ナーダイオード４５と抵抗Ｒｓとが直列に挿入され、こ
れと並列に抵抗Ｒｐが挿入され、更にスイッチＳＷ２を
介してフィードバック抵抗Ｒｉが並列に挿入されてい
る。また、電流測定用増幅器４３の出力端子は、抵抗Ｒ
ａを介して反転増幅器４６に接続されている。反転増幅
器４６の出力端子には抵抗Ｒｉ１，抵抗Ｒｉ２が直列に
接続されており、両抵抗を分配するようにスイッチＳＷ
１の一方の端子ａと接続されている。また、反転増幅器
４６の出力端子からは、端子Ｔ２を通じて測定電流が電
圧の形態で出力される。

【００１８】また、端子Ｔ１及び端子Ｔ２は、図示は省
略される制御回路に接続しており、制御回路では下記に
示す測定チャートの各工程における上記電気回路４の動
作の制御や、測定結果の表示等を行う。

【００１９】また、本発明においては、反応電流を測定
する際に、作用極１と参照極３との間の電圧を制御して
過酸化水素の酸化電圧を印加する。しかし、このとき過
渡的な電流変化が極めて大きく、電流測定分解能を上げ
ようとすると、電流測定用増幅器４３が飽和する。そこ
で、上記測定回路４において、電流測定分解能を下げず
に電流測定用増幅器４３の飽和を回避し、かつ電極間に
流入する電流に影響を与えずに電流測定が可能となるよ
うに、フィードバック回路４４にツェナーダイオード４
５と直列に抵抗Rs、更に並列に抵抗Rpを挿入してある。
ここで、抵抗Rｓよりも抵抗Rｐを数段大きく設定してお
くことにより、電流測定用増幅器４３のフィードバック
抵抗は、電流測定用増幅器４３への流入電流と抵抗Rsと
の積がツェナー電圧を超えるまではほぼ抵抗Rｐとな
り、ツェナー電圧を越えた後はほぼ抵抗Rｓとなる。従
って、ツェナー電圧を越した後の電流測定分解能を低く
し、電流測定用増幅器４３の飽和を避けることができ
る。また、電流測定用増幅器４３から流出する負の電流
については、抵抗Rsと抵抗Ｒｐとによる並列抵抗がフィ
ードバック抵抗として作用するため、負極性電流測定時
の飽和を避けることができる。尚、ツェナー電圧は電流
測定用増幅器４３の増幅特性が保証される電圧以下に設
定されなければならない。また、反応電流の測定は抵抗
Rpで作用するため、電源電圧および電流分解能の両方を
考慮して設定する必要がある。

【００２０】また、作用極１と参照極３との間の電圧を
制御して印加する電圧制御回路と、作用極１と対極２と
の間に流れる電流を一定にする定電流回路とを共用し、
その切り換えをスイッチＳＷ１で行う。両回路を共用す
ることにより、電子部品の点数を減少させ、例えば、電
気回路の消費電力を少なくすることにより電源に用いる
電池の寿命を伸ばすことができ、また、電子回路部を小
型化できる利点を有する。

【００２１】そして、電圧制御回路では、スイッチＳＷ
１の端子ｂを接続状態とし、ボルテージフォロワー型増
幅器４２の正端子（＋）と電圧制御信号とが同じ電圧に
なるように追従して動作させる。これにより、作用極１
と参照極３との間の電圧は端子Ｔ１から入力する電圧に
比例して制御されることになる。一方、定電流回路で
は、スイッチＳＷ１を端子ａに切り替えてボルテージフ
ォロワー型増幅器４２の正端子(＋)電圧に追従して電流
測定用増幅器４３及び反転増幅器４６の出力が決まり、
それにより、端子Ｔ１から入力する電圧に追従して作用
極１と対極２との間に流れる電流が決まる。このとき、
スィッチＳＷ２を接続状態にすることにより電流測定用
増幅器４３のフィードバック抵抗Ｒｉを小さくし、後段
の反転増幅器４６の増幅率を抵抗Ｒａと抵抗Ｒｂとの比
で決定し、更にその出力を抵抗Ｒｉ1と抵抗Ｒｉ２とで
分圧することにより、定電流制御におけるダイナミック
レンジを大きくすることができる。これにより、電流測
定用増幅器４３を飽和させることなく、グルコース濃度
換算値20〜600mg／dlの測定が可能となる。

【００２２】反応電流の測定は、以下に示す工程に従い
行う。尚、図３にこれら工程のチャート図を示す。（工程１：被検液点着の検出）測定装置を起動した後、
被検液を酵素電極に点着する。このとき、被検液が酵素
電極上に点着されたか否かの検知を行う。この検知は、
予め作用極１と参照極３との間に0.1〜0.5Ｖ程度の電圧
を印加しておき、被検液点着により作用極１と対極２と
の間に0.01〜0.1μＡ／秒以上の電流が検知されたと
き、すなわち図２の端子Ｔ２から出力される前記電流値
に相当した電圧値に達したときに被検液が点着されたと
みなす。そして、被検液検知後は、作用極１と参照極３
に印加している電圧が再び０Vになるように電圧調整を
行う。尚、被検液の点着量は２〜５μｌ程度である。

【００２３】（工程２：膜膨潤）酵素電極では、血球分
離膜に含まれるリン酸緩衝液等及び酵素膜に含まれるグ
ルコースオキシダーゼ等は乾燥状態で保存されているた
め、被検液が血球分離膜上に導入されても直ちに反応し
ない。そこで、血液とこれらの物質が十分に馴染み合う
までの時間を数秒間（例えば１〜１０秒程度）設ける。
この時の作用極１と参照極３との間の電位は、０Ｖに維
持される。また、このとき、作用極１と対極２との間に
流れる電流は０μＡとは限らず、前記被検液点着時に印
加した電圧により、酵素電極が電荷を蓄積した場合、ま
た、被検液自身が電荷を持っている場合、あるいは、電
極に分極が生じている場合には、その電位に依存した微
小電流が流れることになり、前記条件下でこの時間を設
けることにより酵素電極の電位が安定する。尚、図３で
は、この微小電流を考慮して、作用極−対極間の電流を
点線で示してある。

【００２４】尚、以上の被検液点着（工程１）及び膜膨
潤（工程２）は、図２のスイッチＳＷ１の端子がｂの状
態にある、電圧制御回路にて行う。

【００２５】（工程３：水分の電気分解）作用極１と参
照極３との間の電圧を制御することにより、作用極１と
対極２との間に一定の電流を所定時間通電して被検液中
に含まれる水分の電気分解を行う。これは、白金電極と
酵素膜との界面から微小の泡状酸素ガス及び水素ガスを
発生させ、酵素反応をより短時間に効率的に行わせて、
例えば、グルコース濃度に依存した過酸化水素濃度に至
らしめるためである。また、酵素反応において、血液中
の溶存酸素以上の酸素が必要な場合、作用極１にて発生
した酸素が効率良く使われる。尚、この水分の電気分解
は、例えば２０〜１００μAの電流を３〜２０秒間通電
すればよい。また、水分の電気分解を終了する際は、一
定の電流値から好ましくは時間と電流値の関係を段階的
に減少させて０μＡになるように制御し、この０μＡの
状態を０．０５〜０．２秒程度保持する。

【００２６】尚、この電気分解は、図２のスイッチＳＷ
１の端子がａの状態にある、定電流制御回路にて行う。

【００２７】（工程４：休止時間）上記工程３による水
の電気分解を行った後、作用極１上に発生した酸素ガス
及び対極２に発生した水素ガスの泡沫同士の結合による
変動を安定化し、それに伴い、電極電位の変動が安定化
すること、また、電気分解時に行う定電流制御から終了
後の電圧制御への切り替え時の電流変動を軽減し、これ
によって変動する被検液の電位を安定化するための時間
を設ける。このとき、作用極１及び参照極３は、例えば
０V〜−０．７Vの範囲内で、一定の電圧で制御され、休
止時間は例えば０．３〜１秒で充分である。

【００２８】（工程５：反応電流の測定）上記工程２、
工程３、工程４で生成した過酸化水素を作用極１にて酸
化させ、そのときの反応電流を測定する。この時作用極
１と参照極３との間の電圧を制御して印加する電圧は、
上記工程４の休止時間で設定した０V〜−０．７Vの電圧
から、過酸化水素が酸化される電圧である０．６Ｖ〜
０．７５Vを印加する。昇圧後、この酸化電圧を例えば
２〜１０秒間保持する。この時、作用極１と対極２との
間の電流は急激な減衰を示した後、緩やかな減衰傾向を
示す。これは、測定電流には、被検液や酵素膜等に存在
する電解質及び電極構造と酵素膜等に依存して形成され
る電気的容量成分から電気回路的に発生する電流が重畳
しており、この電流が一定電圧に保持したことにより、
急激に減衰するためである。そこで、反応電流の測定
は、この緩やかな電流減衰を示す期間から更に２秒〜１
０秒経過後に行う。これにより、グルコース濃度に依存
した電流の測定確度が大きく向上する。

【００２９】上記の電圧印加において、反応電流は、電
圧／時間のレート（以下、「傾斜電圧レート」と呼ぶ）
にほとんど依存することなく、グルコース濃度に依存し
てある電流値に収束する。図４にこの傾斜電圧のレート
を変えたときの電流パターンを示すが、300、600、9000
mV／秒の傾斜電圧のレートによってそれぞれピーク電流
値が異なっているものの、印加電圧が一定になった後の
電流は、それぞれの傾斜電圧レートによらず、ほぼグル
コース濃度に比例した電流値に収束していることが判
る。また、この結果から、電極間インピーダンス、特に
酵素膜及び血球分離膜の膜質のバラツキに伴う電気的容
量成分の変動があっても、反応電流に依存した一定電流
に収束することが推察される。更には、印加電圧を直線
的に印加するだけでなく、例えば曲線的に電圧を昇圧さ
せても安定した測定が可能である。これらのことから、
本発明によれば、例えばグルコース濃度測定の同時再現
性とグルコース濃度の測定確度が向上すると云える。

【００３０】そして、この測定電流を反応電流とし、標
準試料をもとに作製しておいたグルコース濃度対反応電
流値の検量線と対照させることにより、測定血液中のグ
ルコース濃度を求めることができる。上記の工程５まで
に要する時間は、例えばグルコース濃度を測定する際の
血球分離膜及び酵素膜からなる酵素電極を用いると最長
でも２０秒以内であり、従来の簡易式血糖値測定装置に
おける平均的な所要時間に比べて約半分にまで時間短縮
が可能になる。

【００３１】尚、上記の休止期間（工程４）及び反応電
流測定（工程５）は、図２のスイッチＳＷ１の端子がｂ
の状態にある、電圧制御回路にて行う。

【００３２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に説明す
る。但し、本発明は以下の実施例に何ら制限されるもの
ではない。

【００３３】図１に示すように、ガラスエポキシ基板上
に作用極１、対極２及び参照極３を備える３電極構成の
酵素電極を作製した。尚、各電極の寸法は、全長が何れ
も２．５ｍｍであり、幅は作用極１及び対極２は０．６
ｍｍで、参照極３は０．３ｍｍとした。また、各電極の
間隔は０．１５ｍｍとした。

【００３４】また、図２に従い測定回路４を作製した。
尚、抵抗Ｒｓを１ＫΩ、抵抗Ｒｐを５０ＫΩ、抵抗Ｒｉ
を１６．６ＫΩとし、ＲａとＲｂとの分圧比を、Ｒａ：
Ｒｂ＝１：２とした。更に、過酸化水素の酸化電圧とし
て０．７Ｖ、傾斜電圧レートを１４０００ｍＶ／秒、工
程２の膜膨潤時間を６．８秒、工程３の電気分解を８０
μＡで７．２秒、工程４の休止時間を０．５秒、工程５
の反応電流測定開始を酸化電圧に維持後２．９秒となる
ように、それぞれ設定した。

【００３５】上記酵素電極及び測定回路を用い、同時再
現性試験を行った。本試験は、標準液及び全血において
行った。標準液については、グルコース濃度100mg／dl
を用いた。測定は、室内湿度20％環境下で行った。検量
線は予め標準液で求めておいたｙ＝0.0389X＋1.1897を
用いた。また、測定１と測定２は、酵素電極の作製日の
異なるものを用いた。その結果、測定１についてn=12、
電流平均値＝5.66μＡ、ＳＤ(標準偏差)＝0.11、電流値
のＣＶ％（変動係数）＝2.02、およびグルコース濃度換
算値のＣＶ％＝2.97、また測定２についてn=12、電流平
均値＝5.81μＡ、ＳＤ(標準偏差)＝0.14、電流値のＣＶ
％（変動係数）＝2.37、およびグルコース濃度換算値の
ＣＶ％＝3.45を得た。グルコース濃度換算値における正
確性は、測定１についてグルコース濃度＝98.81mg/dl、
エラー＝−1.19％、測定２についてはグルコース濃度＝
102.56mg/dl、エラー＝＋2.56％を得た。

【００３６】全血測定は採血後、ヘパリンを添加した全
血を35℃環境下で、24時間インキュベートし、グルコー
ス濃度を40mg/dl以下にし、再度、蒸留水により作製し
たグルコース濃度5000mg／dlのグルコース溶液を添加し
てほぼ40、100、200、300、400、500mg/dlに調整した。
この時、調整用グルコースメータとしてGA−1150((株)
アークレイファクトリー製)を用いた。続いて、このグ
ルコース濃度調整後の全血を用いて検量線を求めた。図
５に示す。この時の各グルコース濃度における電流値の
同時再現性は、n=5でＣＶ％はすべて３％以下である。
また、この検量線を基に濃度換算し、医療施設の検査室
で使用されている前記GA-1150との相関性を求めた。図
６に結果を示すが、相関係数はR=0.998と極めて高く、
この相関係数から簡易型血糖値測定装置としての充分な
正確性を持つことがわかる。

【００３７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
測定の正確さや再現性は勿論のこと、測定時間が短縮さ
れた反応電流測定方法が提供され、特に簡易式血糖値測
定装置において有益となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る酵素電極の一実施形態を示す上面
図である。

【図２】本発明に係る酵素電極に接続される測定回路図
である。

【図３】本発明に係る反応電流測定方法を示すチャート
図である。

【図４】傾斜電圧レートの違いによる電流パターンの変
化を示すグラフである。

【図５】実施例において得られた反応電流値と検量線と
の相関を求めたグラフである。

【図６】本発明の測定方法による全血測定の結果と、標
準装置（ＧＡ−１１５０）による全血測定の結果との相
関を示すグラフである。

【符号の説明】

１作用極２対極３参照極４測定回路１０ガラスエポキシ基板１１電極形成部４１電位測定用増幅器４２ボルテージフォロワー型増幅器４３電流測定用増幅器４４フィードバック回路４５ツェナーダイオード４６反転増幅器

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検液中の特定物質の濃度を測定するた
めに、作用極、参照極及び対極で構成される３電極方式
の酵素電極を用い、酵素反応により生成した過酸化水素
の酸化に伴う反応電流を測定する方法において、ａ）測定する被検液が酵素電極に点着されたことを検出
し、ｂ）各電極の酵素膜を膨潤させ、ｃ）作用極と対極との間に所定電流を通電して被検液中
の水分の電気分解を行い、ｄ）参照極と作用極との間に過酸化水素の電気化学的酸
化電圧まで電圧を時間とともに上昇させて印加し、前記
電気化学的酸化電圧に所定時間保持した後、作用極と対
極との間に流れる反応電流を測定する、工程を含むこと
を特徴とする反応電流測定方法。
【請求項２】前記工程ｃ）と工程ｄ）との間に、電気
分解により発生した酸素ガス及び水素ガスによる泡沫を
安定化させる工程を挿入することを特徴とする請求項１
記載の反応電流測定方法。
【請求項３】前記工程ｄ）において、電気化学的酸化
電圧まで電圧を直線的に上昇させて印加することを特徴
とする請求項１または２に記載の反応電流測定方法。
【請求項４】前記工程ｄ）において、電気化学的酸化
電圧まで電圧を曲線的に上昇させて印加することを特徴
とする請求項１または２に記載の反応電流測定方法。