JP2002186847A - Method for preparing hydrogel and support for culturing cell - Google Patents
Method for preparing hydrogel and support for culturing cellInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ハイドロゲルの製
造方法とそのハイドロゲルを含有する細胞培養支持体に
関するものである。[0001] The present invention relates to a method for producing a hydrogel and a cell culture support containing the hydrogel.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ハイドロゲルは、コンタクトレンズや創
傷被覆材、薬剤徐放担体等の医療分野や、紙おむつや生
理用品等の生活日用品分野、あるいは土壌保水剤、食品
加工用シート等の農林水産分野等の産業上広い分野に利
用されている。これらの分野に利用されるハイドロゲル
を構成する材料は、ポリビニルアルコール、ポリアクリ
ルアミドやポリアクリル酸等の水溶性高分子あるいはそ
れらの共重合体の架橋物からなるものや、アガロース、
アルギン酸やゼラチン等の天然高分子からなるものが知
られている。2. Description of the Related Art Hydrogels are used in medical fields such as contact lenses, wound dressings, and sustained-release carriers, as well as daily necessities such as disposable diapers and sanitary products, or agricultural, forestry and fisheries fields such as soil water retention agents and food processing sheets. It is used in a wide range of industrial fields. Materials constituting the hydrogel used in these fields include polyvinyl alcohol, water-soluble polymers such as polyacrylamide and polyacrylic acid, and cross-linked products of copolymers thereof, agarose,
Those comprising natural polymers such as alginic acid and gelatin are known.
【０００３】近年、ハイドロゲルは、その重要な利用用
途として、組織工学や再生医工学という先端医療分野に
おける細胞培養支持体や組織再生支持体として注目を集
めている。これらの用途に利用するためには、生体安全
性や生体親和性が要求されるため、主として生体由来の
コラーゲンを主体としたハイドロゲルが利用されてい
る。しかしながら、コラーゲンは動物組織からの抽出に
より生産され、かつオートクレーブ滅菌が不可能である
ことから、未知病原体による汚染等の可能性も否定でき
ない。また、コラーゲンハイドロゲルは、その分解速度
が速すぎるため、化学的や物理的な架橋処理が必要であ
る。一般的に、化学的架橋剤は、細胞毒性を示すものが
多く、残存架橋剤による毒性が否定出来ず、また、物理
的な架橋では放射線や紫外線照射施設等の設備が必要と
なり、簡便には生産できない。さらに、もっとも重大な
問題として、コラーゲンでは力学的強度に優れたハイド
ロゲルを生産できないことが指摘されている。すなわ
ち、組織工学や再生医工学用素材として力学的強度が要
求される部位、例えば軟骨組織再生や骨膜組織再生等に
利用することが出来ないという制限がある。そこで、力
学的強度をもち、生体安全性や生体親和性に優れたハイ
ドロゲルの開発が求められている。[0003] In recent years, hydrogels have attracted attention as important applications for cell culture supports and tissue regeneration supports in advanced medical fields such as tissue engineering and regenerative medical engineering. Since biosafety and biocompatibility are required for use in these applications, hydrogels mainly composed of biological collagen are mainly used. However, since collagen is produced by extraction from animal tissues and cannot be autoclaved, the possibility of contamination by unknown pathogens cannot be ruled out. In addition, collagen hydrogel requires a chemical or physical crosslinking treatment because its decomposition rate is too fast. In general, many chemical cross-linking agents show cytotoxicity, the toxicity of the remaining cross-linking agent cannot be denied, and physical cross-linking requires facilities such as radiation and ultraviolet irradiation facilities. Cannot be produced. Furthermore, as the most serious problem, it is pointed out that collagen cannot produce a hydrogel having excellent mechanical strength. In other words, there is a limitation that the material cannot be used for a part requiring mechanical strength as a material for tissue engineering or regenerative medical engineering, for example, cartilage tissue regeneration or periosteal tissue regeneration. Therefore, development of a hydrogel having mechanical strength and excellent in biosafety and biocompatibility is required.
【０００４】絹フィブロインタンパク質（以下、「絹フ
ィブロイン」と称する。）は、手術用縫合糸としても使
用されており、生体親和性に優れた材料の一つである。
また、最近の研究結果から、精練した絹糸は免疫反応を
惹起することがなく（Opthalmology,91,479-483(198
4)）、また、絹フィブロイン材料の炎症性は高くない
（J.Biomed.Mater.Res.,46,382-389(1999)）ことが報告
されている。さらに、絹フィブロインフィルム上では、
細胞付着や増殖が良好であり（J.Biomed.Mater.Res.,8
9,1215-1211(1995)）、表皮細胞の増殖活性化効果があ
る（特開平11-253155）ことが報告されている。このよ
うに、絹フィブロイン材料は、組織工学や再生医工学用
材料として優れた材料である。[0004] Silk fibroin protein (hereinafter, referred to as "silk fibroin") is also used as a surgical suture and is one of materials having excellent biocompatibility.
Also, recent studies have shown that scoured silk does not elicit an immune response (Opthalmology, 91, 479-483 (198
4)) In addition, it has been reported that silk fibroin material is not highly inflammatory (J. Biomed. Mater. Res., 46, 382-389 (1999)). Furthermore, on silk fibroin film,
Good cell attachment and proliferation (J. Biomed. Mater. Res., 8
9,1215-1211 (1995)), and has an effect of activating the proliferation of epidermal cells (JP-A-11-253155). Thus, the silk fibroin material is an excellent material as a material for tissue engineering or regenerative medical engineering.
【０００５】絹フィブロインを用いたハイドロゲルの製
造方法も種々開示されている。例えば、絹フィブロイン
溶液に絹フィブロインの貧溶媒であるアルコール等を大
量に加えて沈殿させゲル化する方法が広く知られている
が、得られたゲルはもろく十分な強度をもったゲルは製
造出来ない。絹フィブロイン水溶液のpHを等電点以下に
低下させて沈殿させゲル化する方法が開示されているが
（特開平1-118544）、この製造方法によっても得られる
ゲルはもろく十分な強度をもったゲルは製造できない。
また、絹フィブロイン溶液を徐々に乾燥することにより
ゲル化する方法も知られているが、得られたゲルは柔軟
性がなく、製造に長時間かかる。さらに、濃厚フィブロ
イン溶液に対し凍結と融解を繰り返すことによりハイド
ロゲルを作製する方法も開示されている(特開平1-30843
1)が、強度あるゲルを作製するためにはフィブロインの
濃厚溶液が必要であり、細胞培養支持体や組織工学・再
生医工学用素材としての十分な含水率をもったゲルの作
製が困難であり、また強度あるゲルを作製する場合は凍
結・融解操作を繰り返す必要があり、工程は非常に煩雑
になる欠点を有している。Various methods for producing hydrogels using silk fibroin have also been disclosed. For example, it is widely known that a large amount of alcohol or the like, which is a poor solvent for silk fibroin, is added to a silk fibroin solution to precipitate and gelate the gel.However, the resulting gel is brittle and a gel having sufficient strength cannot be produced. Absent. A method of lowering the pH of an aqueous solution of silk fibroin to below the isoelectric point and causing precipitation and gelation has been disclosed (Japanese Unexamined Patent Publication No. 1-118544), but the gel obtained by this production method is brittle and has sufficient strength. Gels cannot be manufactured.
A method of gelling by gradually drying a silk fibroin solution is also known, but the resulting gel is not flexible and takes a long time to produce. Furthermore, a method for producing a hydrogel by repeating freezing and thawing for a concentrated fibroin solution has been disclosed (JP-A-1-30843).
1) However, in order to produce a strong gel, a concentrated solution of fibroin is required, and it is difficult to produce a gel with a sufficient moisture content as a cell culture support or a material for tissue engineering and regenerative medical engineering. In addition, when a strong gel is produced, it is necessary to repeat freezing and thawing operations, which has a drawback that the process becomes very complicated.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】このような状況をふま
えて、本発明は、上記の従来技術がかかえる問題点を解
決することを課題とした。すなわち、本発明は、組織工
学や再生医工学用素材として求められる生体親和性や力
学的強度に優れたハイドロゲルの簡便な製造技術を提供
することを課題としている。さらに、組織工学や再生医
工学用素材に要求される優れた細胞増殖や細胞維持特性
を有する細胞培養支持体を提供することも課題とした。SUMMARY OF THE INVENTION In view of such circumstances, an object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a simple technique for producing a hydrogel excellent in biocompatibility and mechanical strength required as a material for tissue engineering and regenerative medical engineering. Another object of the present invention is to provide a cell culture support having excellent cell growth and cell maintenance characteristics required for materials for tissue engineering and regenerative medical engineering.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を進めた結果、絹フィブロイ
ン水溶液に水溶性有機溶媒を添加し、これを凍結した
後、融解するという簡便な方法により、高含水率であ
り、かつ力学的強度に優れたハイドロゲルを製造できる
技術を見出し、また、このハイドロゲルが優れた細胞増
殖機能を有する優れた細胞培養支持体として有用である
ことを見出し、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that a water-soluble organic solvent is added to an aqueous solution of silk fibroin, which is frozen and then thawed. By a simple method, a technique for producing a hydrogel having a high water content and excellent mechanical strength has been found, and the hydrogel is useful as an excellent cell culture support having an excellent cell growth function. This led to the completion of the present invention.
【０００８】本発明のハイドロゲルの製造方法は、絹フ
ィブロイン水溶液に水溶性有機溶媒を添加したものを一
定時間凍結させ、次いで融解してハイドロゲルを得るこ
とからなる。The method for producing a hydrogel of the present invention comprises freezing an aqueous solution of silk fibroin to which a water-soluble organic solvent has been added for a certain period of time, followed by thawing to obtain a hydrogel.
【０００９】本発明の細胞培養支持体は、このようにし
て製造されたハイドロゲルを含有することからなる。[0009] The cell culture support of the present invention comprises the hydrogel thus produced.
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。Embodiments of the present invention will be described below.
【００１１】本発明で用いる絹フィブロインとしては、
家蚕、野蚕、天蚕等の蚕から生産されるものであればい
ずれでもよく、その製造方法としては、繭からの抽出、
絹糸腺からの抽出等のような既知の如何なる方法を用い
ても良い。特に、製造工程の簡便性から家蚕の繭からの
抽出が好ましい。本発明では、絹フィブロインを水溶液
として用いるが、その方法は公知の如何なる方法を用い
てもよく、例えば臭化リチウム水溶液に溶解した絹フィ
ブロインを水に対して透析する方法が挙げられる。この
絹フィブロイン水溶液をハイドロゲル製造のための原料
として用いるわけであるが、組織工学・再生医工学用素
材や細胞培養支持体として用いる場合は、この段階にて
通常のオートクレーブ滅菌処理をしてもよい。用いる絹
フィブロイン水溶液の濃度は、使用目的に合わせて自由
に選択できるが、好ましくは０．１重量％〜１０重量
％、特に好ましくは０．５重量％〜５重量％である。
０．１％重量未満では、十分な強度を持ったハイドロゲ
ルが製造できない場合があり、また１０重量％を超える
と、原料水溶液の調製が困難であったり、製造したハイ
ドロゲルが組織や細胞の増殖や維持に対して不利になる
場合がある。The silk fibroin used in the present invention includes:
Any one produced from silkworms such as silkworms, wild silkworms, and heavenly silkworms may be used.
Any known method such as extraction from silk glands may be used. In particular, extraction from silkworm cocoons is preferred because of the simplicity of the manufacturing process. In the present invention, silk fibroin is used as an aqueous solution, and any known method may be used, for example, a method of dialyzing silk fibroin dissolved in an aqueous solution of lithium bromide against water. This silk fibroin aqueous solution is used as a raw material for producing a hydrogel, but when used as a material for tissue engineering or regenerative medical engineering or a cell culture support, even if it is subjected to a normal autoclave sterilization treatment at this stage. Good. The concentration of the silk fibroin aqueous solution to be used can be freely selected according to the purpose of use, but is preferably 0.1% by weight to 10% by weight, particularly preferably 0.5% by weight to 5% by weight.
If it is less than 0.1% by weight, it may not be possible to produce a hydrogel having sufficient strength. May be disadvantageous for growth and maintenance.
【００１２】本発明によれば、この絹フィブロイン水溶
液に水溶性有機溶媒を添加して、所定時間凍結処理し、
次いで融解処理することにより、ハイドロゲルを製造す
る。添加する水溶性有機溶媒は、水に対して部分的にで
も混和できればよい。例えば、メタノール、エタノー
ル、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イ
ソブタノール、sec−ブタノール、ｔ−ブタノール、イ
ソアミルアルコール、グリセロール、アセトン、アセト
ニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン等が挙げられる。
細胞保存用溶媒として広く使用されているグリセロール
やジメチルスルホキシドを用いると、生体組織や細胞に
対する危険性が少なく好ましく使用できる。添加する量
は、絹フィブロイン水溶液にこれらの有機溶媒を添加し
たときに絹フィブロインが沈殿しない範囲ならば特に制
限はないが、好ましくは０．０５容量％〜１０容量％、
特に好ましくは０．１容量％〜５容量％である。０．０
５容量％未満では、ハイドロゲルを形成しない場合もあ
り、１０容量％を超えると、絹フィブロインの沈殿の危
険性があり、また、十分な機械的強度を持ったハイドロ
ゲルを製造できない。凍結温度は特に制限されないが、
設備の簡便性から考えて、通常のフリーザー等が利用で
きる温度を用いればよい。凍結時間は、十分に凍結する
ことのできる時間であればよく、好ましくは４時間以
上、特に好ましくは６時間以上である。４時間未満であ
ると、フリーザーの種類にもよるが、ハイドロゲルが製
造出来なかったり、製造したハイドロゲルの機械的強度
が十分でない場合がある。凍結した絹フィブロイン水溶
液を、そのまま融解することでハイドロゲルが製造でき
る。融解は加温して行ってもよいが、通常、室温下で放
置すれば、より簡便にハイドロゲルが製造できる。得ら
れたハイドロゲルを組織工学・再生医工学用素材や細胞
培養支持体として用いる場合は、水や燐酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）のような生理的緩衝溶液等中で添加した水
溶性有機溶媒を置換したのち、通常のオートクレーブ滅
菌処理を行う。According to the present invention, a water-soluble organic solvent is added to the aqueous solution of silk fibroin, and frozen for a predetermined time,
Then, a hydrogel is produced by a melting treatment. The water-soluble organic solvent to be added may be partially miscible with water. Examples include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, sec-butanol, t-butanol, isoamyl alcohol, glycerol, acetone, acetonitrile, dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), pyridine and the like.
When glycerol or dimethyl sulfoxide, which is widely used as a solvent for cell preservation, is used, there is little danger to living tissues and cells, and it can be preferably used. The amount to be added is not particularly limited as long as the silk fibroin does not precipitate when these organic solvents are added to the aqueous solution of silk fibroin, but preferably 0.05% by volume to 10% by volume,
Particularly preferably, it is 0.1% by volume to 5% by volume. 0.0
If it is less than 5% by volume, a hydrogel may not be formed, and if it exceeds 10% by volume, there is a risk of precipitation of silk fibroin, and a hydrogel having sufficient mechanical strength cannot be produced. The freezing temperature is not particularly limited,
Considering the simplicity of the equipment, a temperature at which a normal freezer or the like can be used may be used. The freezing time may be any time that allows sufficient freezing, and is preferably 4 hours or more, particularly preferably 6 hours or more. If the time is less than 4 hours, depending on the type of the freezer, the hydrogel may not be produced, or the produced hydrogel may have insufficient mechanical strength. A hydrogel can be produced by thawing the frozen silk fibroin aqueous solution as it is. The melting may be carried out by heating, but usually, if left at room temperature, a hydrogel can be produced more easily. When the obtained hydrogel is used as a tissue engineering / regenerative medical engineering material or a cell culture support, a water-soluble organic solvent added in water or a physiological buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS) is used. After the replacement, normal autoclave sterilization is performed.
【００１３】ハイドロゲルに、コラーゲンや細胞成長因
子を混合したり、あるいは生理活性物質を付与した改変
絹フィブロイン等を混合することもできる。この場合
は、絹フィブロイン水溶液あるいはあらかじめオートク
レーブ滅菌処理した絹フィブロイン水溶液に、コラーゲ
ン、細胞成長因子、あるいは改変絹フィブロインを混合
し、上記と同様の製造工程を経ることで、これらの分子
を含んだハイドロゲルを製造できる。また、絹フィブロ
イン分子にタンパク質工学的手法により各種の生理活性
分子や機能性分子を融合したキメラフィブロイン分子等
も同様に混合して、上記と同様の処理を行うことによ
り、これらの分子を含んだハイドロゲルを製造できる。
組織工学や再生医工学用素材や細胞培養支持体として用
いる場合は、あらかじめオートクレーブ滅菌した絹フィ
ブロイン水溶液を用いる方が安全性等の面から好まし
い。The hydrogel may be mixed with collagen or cell growth factor, or with a modified silk fibroin to which a physiologically active substance has been added. In this case, collagen, cell growth factor, or modified silk fibroin is mixed with an aqueous solution of silk fibroin or an aqueous solution of silk fibroin that has been sterilized in advance by autoclaving, and the hydrophile containing these molecules is produced through the same production process as described above. Gels can be manufactured. In addition, chimeric fibroin molecules and the like obtained by fusing various bioactive molecules and functional molecules to silk fibroin molecules by protein engineering techniques are similarly mixed, and the same treatment is performed as described above to include these molecules. Hydrogel can be manufactured.
When used as a material for tissue engineering or regenerative medical engineering or as a support for cell culture, it is preferable to use an aqueous solution of silk fibroin which has been sterilized in an autoclave in advance from the viewpoint of safety and the like.
【００１４】製造したハイドロゲルを細胞培養支持体と
して用いる場合は、絹フィブロイン水溶液と細胞浮遊液
とを混合し、細胞に対して傷害を与えないような水溶性
溶媒、たとえばグリセロールやジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）を添加して、上記のハイドロゲル製造工程
によりゲル化することで３次元的な培養が可能となる。
また、もっと簡便には、あらかじめ製造したハイドロゲ
ル上へ細胞浮遊液を添加することで、徐々に細胞がゲル
内部へ進入して３次元的な培養が可能となる。３次元細
胞培養支持体として広く利用されているコラーゲンに比
較して、本発明のハイドロゲルは、そのゲルの空隙率や
孔径を制御しやすく、また経時的なゲル体積の縮小もな
く、より効率的に細胞を培養できる特色がある。When the produced hydrogel is used as a support for cell culture, an aqueous solution of silk fibroin and a cell suspension are mixed, and a water-soluble solvent that does not damage cells, for example, glycerol or dimethyl sulfoxide (DMSO) is used. ) Is added and gelation is performed in the above-described hydrogel production step, thereby enabling three-dimensional culture.
More simply, by adding a cell suspension onto a previously produced hydrogel, the cells gradually enter the inside of the gel, enabling three-dimensional culture. Compared to collagen, which is widely used as a three-dimensional cell culture support, the hydrogel of the present invention can control the porosity and pore size of the gel more easily, does not reduce the gel volume over time, and is more efficient. There is a characteristic that cells can be cultured.
【００１５】[0015]
【実施例】以下に実施例を示して、本発明を具体的に説
明する。 （実施例１）精錬した絹糸を９Ｍ臭化リチウム水溶液中
に溶解した後、蒸留水に対して十分に透析して絹フィブ
ロイン水溶液を調製した。１重量％および２重量％絹フ
ィブロイン水溶液中に、表１に示した各種水溶性有機溶
媒を全量に対して１容量％になるように添加し、よく混
合したのち、−２０℃のフリーザー中で１２時間凍結し
た。凍結したサンプルを室温下で放置し、ゲル化の状態
を観察した。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. (Example 1) A refined silk thread was dissolved in a 9 M aqueous solution of lithium bromide, and then sufficiently dialyzed against distilled water to prepare an aqueous solution of silk fibroin. Various water-soluble organic solvents shown in Table 1 were added to 1% by weight and 2% by weight aqueous solution of silk fibroin so as to be 1% by volume with respect to the total amount, and mixed well. Frozen for 12 hours. The frozen sample was left at room temperature, and the state of gelation was observed.
【００１６】[0016]
【表１】 （注） ＋＋＋：堅いゲル、＋＋：柔らかいゲル、＋：もろいゲ
ル、−：ゲル化せず 表１から明らかなように、溶媒未添加の場合はゲル化し
なかった。また、溶媒の種類によりゲルの状態をコント
ロールすることができる。[Table 1] (Note) +++: Hard gel, ++: Soft gel, +: Fragile gel,-: No gelation As is clear from Table 1, no gel was formed when no solvent was added. Further, the state of the gel can be controlled by the type of the solvent.
【００１７】また、上記のようにして得られたヒドロゲ
ルの力学的強度は、次のようであった。３重量％に調製
した絹フィブロイン水溶液に１容量％になるようにｔ−
ブタノールを添加しよく混合した後、９０ｍｍ径のシャ
ーレ中に厚み２ｍｍになるように絹フィブロイン水溶液
をを添加し、−２０℃のフリーザー中で１２時間凍結
し、その後室温下に放置することでヒドロゲル板を作製
した。この試料をダンベル片に打ち抜き、引っ張り強度
を測定した。また、同じ絹フィブロイン水溶液を同じシ
ャーレ中に２ｍｍ厚になるように入れ、−２０℃のフリ
ーザー中１２時間、室温下に１２時間の凍結−融解を５
回繰り返してヒドロゲルを作製して同様のダンベル片を
作製して、引っ張り強度試験の対照とした。測定は４回
繰り返し、その結果の平均を表２に纏めた。The mechanical strength of the hydrogel obtained as described above was as follows. In the silk fibroin aqueous solution adjusted to 3% by weight, t-
After butanol was added and mixed well, an aqueous solution of silk fibroin was added to a 90 mm diameter petri dish to a thickness of 2 mm, frozen in a freezer at −20 ° C. for 12 hours, and then left at room temperature to obtain a hydrogel. A plate was made. This sample was punched out into a dumbbell piece, and the tensile strength was measured. Further, the same silk fibroin aqueous solution was placed in the same Petri dish so as to have a thickness of 2 mm, and was freeze-thawed in a freezer at −20 ° C. for 12 hours and at room temperature for 12 hours.
The same procedure was repeated to produce a hydrogel to produce a similar dumbbell piece, which was used as a control for the tensile strength test. The measurement was repeated four times, and the average of the results was summarized in Table 2.
【００１８】[0018]
【表２】 表２から明らかなように、本発明の製造方法で得られた
ヒドロゲルは、凍結−融解を繰り返して得たヒドロゲル
よりも優れた力学的強度を持っていることが分かる。 （実施例２）実施例１と同様に調製した種々の濃度（重
量％）の絹フィブロイン水溶液に対して、０．５容量％
から２容量％までのＤＭＳＯを添加して、−２０℃のフ
リーザー中で１２時間凍結した後、室温下で放置してハ
イドロゲルを作製した。このハイドロゲルを蒸留水中に
数日間浸漬して平衡状態まで含水させ、重量を測定した
（Ｗａ）。このゲルを６０℃の減圧乾燥機中で十分に乾
燥させ、ゲルの乾燥重量を測定した（Ｗｂ）。次式に従
って含水率を算出し、表２に示した。[Table 2] As is clear from Table 2, the hydrogel obtained by the production method of the present invention has better mechanical strength than the hydrogel obtained by repeated freezing and thawing. (Example 2) 0.5% by volume of silk fibroin aqueous solution having various concentrations (% by weight) prepared in the same manner as in Example 1
To 2% by volume of DMSO was added and frozen in a freezer at −20 ° C. for 12 hours, and then left at room temperature to prepare a hydrogel. This hydrogel was immersed in distilled water for several days to be hydrated until an equilibrium state, and the weight was measured (Wa). This gel was sufficiently dried in a vacuum dryer at 60 ° C., and the dry weight of the gel was measured (Wb). The water content was calculated according to the following equation and is shown in Table 2.
【００１９】 含水率（％）＝（Ｗａ−Ｗｂ）×１００／ＷｂWater content (%) = (Wa−Wb) × 100 / Wb
【００２０】[0020]
【表３】 表２から明らかなように、絹フィブロイン水溶液濃度や
添加溶媒濃度を変動させることにより、含水率をコント
ロールすることができる。 （実施例３）実施例１と同様に調製した絹フィブロイン
水溶液に対し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌
を行い、２重量％濃度の滅菌絹フィブロイン水溶液を得
た。無菌条件下で、このフィブロイン水溶液に滅菌ＤＭ
ＳＯを１容量％になるように添加し、−２０℃のフリー
ザー中で１２時間凍結した後、取り出して室温下で放置
し、ハイドロゲルを調製した。このハイドロゲルを無菌
ＰＢＳ中に浸漬した後、９６穴マルチウェルに入れ、５
×１０5個／ｍＬの細胞浮遊液を１００ｍＬ添加して、
３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養した。所定時間ごとに
ゲルを取り出し、ＬＤＨ法により細胞数を計数した。得
られた結果を図１に示した。 （比較例１）新田ゼラチン製のCellMatrix Ａ（コラー
ゲン）を用いて、実施例３と同じ細胞数の添加されたコ
ラーゲンゲル中で、実施例３と同様の培養条件下で細胞
培養評価を行った。得られた結果を図１に示した。[Table 3] As is clear from Table 2, the water content can be controlled by changing the concentration of the silk fibroin aqueous solution and the concentration of the added solvent. (Example 3) The silk fibroin aqueous solution prepared in the same manner as in Example 1 was subjected to autoclave sterilization at 121 ° C for 20 minutes to obtain a sterilized silk fibroin aqueous solution having a concentration of 2% by weight. Under aseptic conditions, sterile DM
SO was added to 1% by volume, frozen in a freezer at −20 ° C. for 12 hours, taken out and left at room temperature to prepare a hydrogel. This hydrogel was immersed in sterile PBS, placed in a 96-well multiwell,
Add 100 mL of cell suspension of × 10 5 cells / mL,
The cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment. The gel was taken out at predetermined time intervals, and the number of cells was counted by the LDH method. The results obtained are shown in FIG. (Comparative Example 1) Cell culture evaluation was performed using CellMatrix A (collagen) manufactured by Nitta Gelatin in a collagen gel containing the same number of cells as in Example 3 under the same culture conditions as in Example 3. Was. The results obtained are shown in FIG.
【００２１】図１から、本発明の方法で製造したハイド
ロゲル（実施例３）に対しては、極めて良好な細胞増殖
が観察され、優れた細胞培養支持体であり、従来のコラ
ーゲンゲル（比較例１）に比較して、細胞増殖効果が極
めて優れていることがわかる。FIG. 1 shows that the hydrogel produced by the method of the present invention (Example 3) showed excellent cell growth, was an excellent support for cell culture, and showed a conventional collagen gel (comparative). It can be seen that the cell proliferation effect is extremely excellent as compared with Example 1).
【００２２】[0022]
【発明の効果】本発明によれば、生体親和性に優れた絹
フィブロインを用いてハイドロゲルを製造する際に、水
溶性有機溶媒の添加と凍結・融解のみの簡便な製造工程
により、力学的特性に優れたハイドロゲルを製造するこ
とができる。また、この製造方法により得られたハイド
ロゲルは、従来のコラーゲンゲルよりも細胞増殖性が高
く、力学的特性に優れているため、細胞培養支持体とし
て、あるいは組織工学や再生医工学用素材としても好適
に利用できる。According to the present invention, when a hydrogel is produced using silk fibroin having excellent biocompatibility, a dynamic process can be achieved by a simple production process involving only addition of a water-soluble organic solvent and freezing / thawing. A hydrogel having excellent characteristics can be produced. In addition, the hydrogel obtained by this production method has higher cell proliferation and better mechanical properties than conventional collagen gel, so it can be used as a cell culture support or as a material for tissue engineering or regenerative medical engineering. Can also be suitably used.
【図１】 本発明により得られたハイドロゲルの細胞増
殖効果を、従来のコラーゲンゲルと比較して示すグラ
フ。FIG. 1 is a graph showing the cell proliferation effect of a hydrogel obtained according to the present invention in comparison with a conventional collagen gel.
Claims (2)
を添加したものを一定時間凍結させ、次いで融解してハ
イドロゲルを得ることを特徴とするハイドロゲルの製造
方法。1. A method for producing a hydrogel, comprising a step of freezing a silk fibroin aqueous solution to which a water-soluble organic solvent has been added for a certain period of time, followed by thawing to obtain a hydrogel.
ドロゲルを含有することを特徴とする細胞培養支持体。2. A cell culture support comprising the hydrogel produced by the production method according to claim 1.
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Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005510268A (en) * | 2001-10-25 | 2005-04-21 | ユニヴァーシティー オブ コネティカット | Bioactive material, method for producing bioactive material and method of use thereof |
| JP2006504852A (en) * | 2002-11-01 | 2006-02-09 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | Templated natural silk smectic gel |
| JP2006204289A (en) * | 2004-12-27 | 2006-08-10 | Koojin Bio Kk | Medium for culturing cell |
| JP2006249115A (en) * | 2005-03-08 | 2006-09-21 | Nagano Prefecture | Method for producing silk sponge |
| WO2010116994A1 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | 日立化成工業株式会社 | Method for producing porous silk fibroin material |
| WO2011021706A1 (en) | 2009-08-19 | 2011-02-24 | 国立大学法人東北大学 | Sheet for corneal transplants |
| WO2011021712A1 (en) * | 2009-08-21 | 2011-02-24 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | Substratum for supplying cells/tissues, cell/tissue supply material and process for production thereof, method for regeneration of tissues, and process for production of porous material |
| WO2011126031A1 (en) * | 2010-04-06 | 2011-10-13 | 日立化成工業株式会社 | Silk fibroin porous material and method for producing same |
| JP2012505297A (en) * | 2008-10-09 | 2012-03-01 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | Modified silk film containing glycerol |
| JP2012080915A (en) * | 2010-10-06 | 2012-04-26 | Hitachi Chemical Co Ltd | Wound covering material |
| WO2014175178A1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-10-30 | スパイバー株式会社 | Polypeptide porous body and method for producing same |
| US9732125B2 (en) | 2013-04-25 | 2017-08-15 | Spiber Inc. | Polypeptide particle and method for producing same |
| WO2021002437A1 (en) * | 2019-07-03 | 2021-01-07 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | Modified fibroin complex and method for producing same |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2000
- 2000-12-19 JP JP2000385662A patent/JP3412014B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005510268A (en) * | 2001-10-25 | 2005-04-21 | ユニヴァーシティー オブ コネティカット | Bioactive material, method for producing bioactive material and method of use thereof |
| JP4669662B2 (en) * | 2001-10-25 | 2011-04-13 | ユニヴァーシティー オブ コネティカット | Bioactive material, method for producing bioactive material and method of use thereof |
| JP2011202170A (en) * | 2002-11-01 | 2011-10-13 | Trustees Of Tufts College | Templated native silk smectic gel |
| JP2006504852A (en) * | 2002-11-01 | 2006-02-09 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | Templated natural silk smectic gel |
| US8580924B2 (en) | 2002-11-01 | 2013-11-12 | Trustees Of Tufts College | Templated native silk smectic gels |
| US9370579B2 (en) | 2002-11-01 | 2016-06-21 | Trustees Of Tufts College | Templated native silk smectic gels |
| JP4800622B2 (en) * | 2002-11-01 | 2011-10-26 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | Templated natural silk smectic gel |
| JP2006204289A (en) * | 2004-12-27 | 2006-08-10 | Koojin Bio Kk | Medium for culturing cell |
| JP2006249115A (en) * | 2005-03-08 | 2006-09-21 | Nagano Prefecture | Method for producing silk sponge |
| US10493179B2 (en) | 2008-10-09 | 2019-12-03 | Trustees Of Tufts College | Modified silk films containing glycerol |
| JP2012505297A (en) * | 2008-10-09 | 2012-03-01 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | Modified silk film containing glycerol |
| WO2010116994A1 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | 日立化成工業株式会社 | Method for producing porous silk fibroin material |
| US9328135B2 (en) | 2009-04-06 | 2016-05-03 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Method for producing porous silk fibroin material |
| WO2011021706A1 (en) | 2009-08-19 | 2011-02-24 | 国立大学法人東北大学 | Sheet for corneal transplants |
| WO2011021712A1 (en) * | 2009-08-21 | 2011-02-24 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | Substratum for supplying cells/tissues, cell/tissue supply material and process for production thereof, method for regeneration of tissues, and process for production of porous material |
| JP5789799B2 (en) * | 2009-08-21 | 2015-10-07 | 国立研究開発法人農業生物資源研究所 | Porous body manufacturing method, cell or tissue supply support manufacturing method, and tissue supply body manufacturing method |
| US9440005B2 (en) | 2009-08-21 | 2016-09-13 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Substrate for feeding cells and/or tissues, cell/tissue-feeder and method for the production of the same, method for the regeneration of tissues, and method for the production of porous bodies |
| US9090703B2 (en) | 2010-04-06 | 2015-07-28 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Silk fibroin porous material and method for producing same |
| EP2557112B2 (en) † | 2010-04-06 | 2019-08-14 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Silk fibroin porous material and method for producing same |
| WO2011126031A1 (en) * | 2010-04-06 | 2011-10-13 | 日立化成工業株式会社 | Silk fibroin porous material and method for producing same |
| JP2012080915A (en) * | 2010-10-06 | 2012-04-26 | Hitachi Chemical Co Ltd | Wound covering material |
| JP5796147B2 (en) * | 2013-04-25 | 2015-10-21 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | Polypeptide porous body and method for producing the same |
| WO2014175178A1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-10-30 | スパイバー株式会社 | Polypeptide porous body and method for producing same |
| US9732125B2 (en) | 2013-04-25 | 2017-08-15 | Spiber Inc. | Polypeptide particle and method for producing same |
| US10065997B2 (en) | 2013-04-25 | 2018-09-04 | Spiber Inc. | Polypeptide porous body and method for producing same |
| WO2021002437A1 (en) * | 2019-07-03 | 2021-01-07 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | Modified fibroin complex and method for producing same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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