JP2002116120A - Target substance detecting method - Google Patents
Target substance detecting methodInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、複数の試料中に低
濃度に含有される標的物質の検出方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a target substance contained in a plurality of samples at a low concentration.
【0002】[0002]
【従来の技術】ウイルスはヒトや動植物のさまざまな病
気の原因の一つであり、その検査・診断のためには原因
ウイルスの確認が非常に重要である。従来のウイルス検
査・診断法としては、ウイルス抗原あるいは抗ウイルス
抗体の免疫学的測定が一般的である。しかしながら、ウ
イルス感染から数週間〜数ヶ月間は、ウイルス量あるい
は抗ウイルス抗体量が少ないため、これらの免疫学的測
定法では検出できない期間がある。この検出不可能な期
間はウインドウ・ピリオド(空白期間)と呼ばれてお
り、このような患者が献血を行った場合、その献血液は
感染源となることが多く、不特定多数の輸血患者・血液
製剤利用患者に危険をおよぼす可能性がある。したがっ
て、ウインドウ・ピリオドをできる限り短縮するため、
免疫学的測定限界以下のウイルスを高感度に検出できる
技術の開発が急務とされている。2. Description of the Related Art Viruses are one of the causes of various diseases of humans, animals and plants, and the identification of the causative virus is very important for the inspection and diagnosis thereof. As a conventional virus inspection / diagnosis method, immunological measurement of a virus antigen or an antiviral antibody is generally performed. However, several weeks to several months after virus infection, there is a period during which the amount of virus or the amount of anti-virus antibody is small and thus cannot be detected by these immunological assays. This undetectable period is called a window period (blank period). When such a patient makes a blood donation, the blood donation is often the source of infection, and an unspecified number of transfused patients May be dangerous to patients using blood products. Therefore, to keep the window period as short as possible,
There is an urgent need to develop a technology that can detect viruses below the immunological measurement limit with high sensitivity.
【0003】近年、ポリメラーゼチェインリアクション
法(以下PCR法)に代表される、核酸増幅技術によ
り、極微量のウイルスでも検出できる可能性が開けてき
た。しかしながら、PCR法などによっても極微量のウ
イルス検出は特殊な設備と高度な技術が必要とされ、一
般的な施設で簡便に実施することはきわめて困難であ
る。また、使用可能なサンプル量も機器により制限され
ており、少量のため、PCR法によってもウイルス濃度
が低いとウイルスを検出出来ないことがある。そこで、
これらの問題解決のため、検体中のウイルスを濃縮する
手法が用いられている。[0003] In recent years, the possibility of detecting even a trace amount of virus has been opened up by a nucleic acid amplification technique represented by the polymerase chain reaction method (hereinafter, PCR method). However, detection of a trace amount of virus by PCR or the like also requires special equipment and advanced technology, and it is extremely difficult to simply carry it out in a general facility. In addition, the amount of sample that can be used is also limited by the instrument, and since the amount is small, the virus may not be detected if the virus concentration is low even by the PCR method. Therefore,
In order to solve these problems, a technique of concentrating a virus in a sample has been used.
【0004】標的物質の検出率が低い多数の検体中の被
検査物質を効率よく検査するために、複数の検体から少
量、例えば数ミリリットルずつ試料を採取しひとつに集
めたプールをつくり、このプール中のウィルスを検出す
るという手法が検討されている。しかしながら、現在の
方法ではプール中のウィルス濃度が非常に低いために、
検出が困難な場合がある。[0004] In order to efficiently test a test substance in a large number of specimens having a low detection rate of a target substance, a small pool, for example, a few milliliters, is collected from a plurality of specimens, and a pool is created. Techniques for detecting viruses in them are being studied. However, the current method has a very low virus concentration in the pool,
Detection may be difficult.
【0005】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
のウイルス検出法の問題点を解決し、複数試料から作成
されたプール中に含有される標的物質が極く低濃度であ
っても検出することができる方法を提供することにあ
る。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the virus detection method, and to solve the problem even if the target substance contained in a pool prepared from a plurality of samples has an extremely low concentration. It is to provide a method that can be detected.
【0006】[0006]
【発明を解決するための手段】本発明は、上記の課題を
解決するものとして、複数の検体が一定量ずつ混合され
た、標的物質を含有する可能性のある試料に、標的物質
を吸着することのできる吸着体を接触させた後、前記試
料中から前記吸着体を分離し、次に吸着体に結合した標
的物質の検出を行うことを特徴とする標的物質検出方法
を提供するものである。Means for Solving the Problems The present invention solves the above-mentioned problems by adsorbing a target substance to a sample which may contain a target substance, in which a plurality of specimens are mixed at a fixed amount. And then contacting the adsorbent with the adsorbent, separating the adsorbent from the sample, and then detecting a target substance bound to the adsorbent. .
【0007】[0007]
【発明の実施の形態】以下、本発明をより具体的に詳し
く説明する。 [吸着体]本発明で使用することのできる吸着体(以
下、単に「標的物質吸着体」という)は、素材そのもの
を示すのではなく、種々の材料、例えば有機ポリマー、
無機ポリマー、無機化合物および天然高分子化合物な
ど、またはこれらの組合せたものからなり、形状も後述
のように種々の形状をとり得る。該吸着体は標的物質を
容易に分離することができることから、水不溶性である
ことが必要である。試料となる水性物質、例えば血液、
尿、タンパク質水溶液などに不溶の物質からなる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail. [Adsorbent] The adsorbent (hereinafter, simply referred to as “target substance adsorbent”) that can be used in the present invention does not indicate the material itself, but various materials such as organic polymers,
It is made of an inorganic polymer, an inorganic compound, a natural polymer compound, or the like, or a combination thereof, and may have various shapes as described later. Since the adsorbent can easily separate the target substance, it must be water-insoluble. Aqueous material serving as a sample, such as blood,
It consists of substances that are insoluble in urine, aqueous protein solution and the like.
【0008】標的物質吸着体を構成する有機ポリマーと
しては、例えば芳香族ビニル化合物、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル、不飽和カルボン酸などのラ
ジカル重合性モノマーの(共)重合体、ポリエステル、
ポリオレフィン、ポリエーテル、ポリカーボネート、ポ
リイミド、ポリアミド、陽イオン交換樹脂、陰イオン交
換樹脂、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、
ポリリジン、グルコサミン、ポリアリルアミンなどが挙
げられる。Examples of the organic polymer constituting the target substance adsorbent include (co) polymers of radically polymerizable monomers such as aromatic vinyl compounds, acrylates, methacrylates, and unsaturated carboxylic acids, polyesters,
Polyolefin, polyether, polycarbonate, polyimide, polyamide, cation exchange resin, anion exchange resin, polyethylene imine, polypropylene imine,
Polylysine, glucosamine, polyallylamine and the like can be mentioned.
【0009】無機ポリマーとしては、例えばアルコキシ
シラン、オルガノアルコキシシランなどの加水分解縮合
物を挙げることができる。無機化合物としては、例えば
シリカ、アルミナ、リン酸カルシウムなどを挙げること
ができる。天然高分子としては、例えばデキストラン、
セルロース、アガロース、グルコマンナンなどを挙げる
ことができる。Examples of the inorganic polymer include hydrolytic condensates such as alkoxysilane and organoalkoxysilane. Examples of the inorganic compound include silica, alumina, calcium phosphate and the like. Examples of natural polymers include dextran,
Examples include cellulose, agarose, and glucomannan.
【0010】材料が、例えば有機ポリマーの場合などで
は、水溶性のものもあるが、標的物質吸着体は水不溶性
である必要があるので、その場合架橋させたり、水不溶
性基材に保持させるなどの処理が必要である。When the material is, for example, an organic polymer, there is a water-soluble material. However, since the target substance adsorbent must be water-insoluble, it is cross-linked or held on a water-insoluble substrate. Is required.
【0011】本発明において、標的物質吸着体はその表
面がイオン性であることが標的物質の吸着能を上げるた
めに好ましい。ここで、表面がイオン性であるとは、標
的物質吸着体の表面がアニオン性およびカチオン性の少
なくともいずれか一方の荷電を有する、または特定の条
件下で荷電を有する状態となりうることを示す。In the present invention, the surface of the target substance adsorbent is preferably ionic in order to increase the adsorbing ability of the target substance. Here, that the surface is ionic indicates that the surface of the target substance adsorbent has at least one of an anionic charge and a cationic charge, or can be charged under a specific condition.
【0012】標的物質吸着体の表面がアニオン性を有す
るものとしては、例えば、標的物質吸着体がアニオン
性基を有するモノマーを共重合した重合体からなるも
の、重合体をアニオン化してなるもの、合成高分子
にスルホン酸含有単量体をシード結合又はグラフト重合
してなる重合体、陽イオン交換樹脂からなるもの、
硫酸化した天然高分子を水不溶性ポリマー担体に担持さ
せたもの、無機ポリマーまたは無機粒子の表面に、ア
ニオン性基を有する重合体または硫酸化した天然高分子
を有するもの、などである。ここで、アニオン性基とし
ては、スルホン基、カルボキシル基などを挙げることが
できる。Examples of the target substance adsorbent having an anionic surface include those in which the target substance adsorbent is composed of a polymer obtained by copolymerizing a monomer having an anionic group, those in which the polymer is anionized, A polymer obtained by seed-bonding or graft-polymerizing a sulfonic acid-containing monomer to a synthetic polymer, one comprising a cation exchange resin,
Examples thereof include those in which a sulfated natural polymer is supported on a water-insoluble polymer carrier, those having a polymer having an anionic group or a sulfated natural polymer on the surface of an inorganic polymer or inorganic particles, and the like. Here, examples of the anionic group include a sulfone group and a carboxyl group.
【0013】上記の例として次のものを挙げることがで
きる。 アニオン性基を有するモノマーを共重合した重合体の
例:カルボン酸含有単量体の(共)重合体をあげること
ができる。ここで、カルボン酸含有単量体(以下「カル
ボン酸単量体」という。)とは、付加重合性の不飽和結
合およびカルボキシル基を分子中に有する重合性単量体
である。具体例としては、アクリル酸、メタクリル酸、
クロトン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸などを
あげることができる。The following can be mentioned as examples of the above. Examples of polymers obtained by copolymerizing monomers having an anionic group: (co) polymers of carboxylic acid-containing monomers. Here, the carboxylic acid-containing monomer (hereinafter referred to as “carboxylic acid monomer”) is a polymerizable monomer having an addition-polymerizable unsaturated bond and a carboxyl group in the molecule. Specific examples include acrylic acid, methacrylic acid,
Crotonic acid, itaconic acid, fumaric acid, maleic acid and the like.
【0014】重合体をアニオン化(スルホン化)して
なるものの例:少なくともその表面にスルホン化可能な
官能基、例えば主鎖または側鎖に不飽和二重結合、芳香
族基、第一級または第二級アミノ基、第一級ハロゲン化
アルキル基、脂肪族アルデヒド、脂肪族ケトン、脂肪族
カルボン酸、脂肪族カルボン酸無水物、水酸基等をもつ
(共)重合体からなり、その表面の少なくとも一部がス
ルホン化されているもの。表面スルホン化可能な(共)
重合体の例として、スチレン、α−メチルスチレン、ビ
ニルナフタレン、ジビニルベンゼン、ブタジエン、イソ
プレン、ビニルアルコール等のスルホン化可能な単量体
の(共)重合体、およびこれら単量体と他の重合性単量
体との(共)重合体等の付加重合系高分子化合物;ポリ
カーボネート、ポリエステル、ポリエステルエーテル、
ポリアリールエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリ
スルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリイ
ミド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリ
ウレタン、芳香族化合物のアセトアルデヒド縮合物、ポ
リエーテル等の縮合重合系高分子化合物等があげられ
る。Examples of the polymer obtained by anionizing (sulfonating): a sulfonable functional group at least on its surface, for example, an unsaturated double bond, an aromatic group, a primary or It consists of a (co) polymer having a secondary amino group, a primary halogenated alkyl group, an aliphatic aldehyde, an aliphatic ketone, an aliphatic carboxylic acid, an aliphatic carboxylic anhydride, a hydroxyl group, etc. Some are sulfonated. Surface sulfonable (co)
Examples of the polymer include (co) polymers of sulphonable monomers such as styrene, α-methylstyrene, vinylnaphthalene, divinylbenzene, butadiene, isoprene, and vinyl alcohol, and polymerization of these monomers and other polymers. Polymerization compounds such as (co) polymers with hydrophilic monomers; polycarbonates, polyesters, polyester ethers,
Polyarylether, polyalkylene oxide, polysulfone, polyethersulfone, polyamide, polyimide, polyetherimide, polyetherketone, polyurethane, acetaldehyde condensate of aromatic compound, condensation polymerization type high molecular compound such as polyether and the like. .
【0015】陽イオン交換樹脂の例としては、ジビニ
ルベンゼン架橋スルホン化ポリスチレンがあげられ、粒
径は、中心粒径が0.1mmから1mm程度のもので良
い。 硫酸化した天然高分子を水不溶性ポリマー担体に担持
させたものの例:硫酸化多糖類としては、ヘパリン、デ
キストラン硫酸、セルロース硫酸、ガードラン硫酸、コ
ンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、
キチン硫酸、キトサン硫酸、デルマタン硫酸、アミロペ
クチン硫酸、ケタラン硫酸、キシラン硫酸、カロニン硫
酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫酸、グ
リコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニン硫
酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラミナリン硫
酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メペサルフェート、
フコイダン、硫酸化グリチルリチンなどの抗ウイルス性
を有する多糖類を挙げることができる。Examples of the cation exchange resin include divinylbenzene cross-linked sulfonated polystyrene, and the particle diameter may be such that the central particle diameter is about 0.1 mm to 1 mm. Examples of a sulfated natural polymer supported on a water-insoluble polymer carrier: sulfated polysaccharides include heparin, dextran sulfate, cellulose sulfate, guardlan sulfate, chondroitin sulfate, heparan sulfate, dextran sulfate,
Chitin sulfate, chitosan sulfate, dermatan sulfate, amylopectin sulfate, ketalan sulfate, xylan sulfate, karonin sulfate, pectin sulfate, inulin sulfate, alginate sulfate, glycogen sulfate, polylactose sulfate, carrageenin sulfate, starch sulfate, polyglucose sulfate, laminarin sulfate, Galactan sulfate, levan sulfate, mepesulfate,
Examples include polysaccharides having antiviral properties such as fucoidan and sulfated glycyrrhizin.
【0016】硫酸化多糖類は、エポキシ基、アミノ基、
アルデヒド基、カルボキシル基、水酸基、酸クロライド
基などの官能基を持つ重合体に直接もしくはカップリン
グ剤やスペーサーを介して担持させることができる。Sulfated polysaccharides include epoxy groups, amino groups,
It can be supported on a polymer having a functional group such as an aldehyde group, a carboxyl group, a hydroxyl group or an acid chloride group directly or via a coupling agent or a spacer.
【0017】標的物質吸着体の表面がカチオン性を有す
るものとしては、例えば、標的物質吸着体がカチオン
性基を有するモノマーを共重合した重合体からなるも
の、カチオン性基を有する重合開始剤を用いてラジカ
ル重合させて得た重合体からなるもの、カチオン性基
を有する化合物を重合体担体に結合してなるもの、陰
イオン交換樹脂からなるもの、カチオン性基含有水溶
性高分子を水不溶性ポリマー担体に担持させたもの、
無機ポリマーまたは無機粒子の表面に、カチオン性基を
有する重合体またはカチオン性基含有水溶性高分子を有
するものなどである。Examples of the target substance adsorbent having a cationic surface include those in which the target substance adsorbent is composed of a polymer obtained by copolymerizing a monomer having a cationic group, and a polymerization initiator having a cationic group. From a polymer obtained by radical polymerization using a compound having a cationic group bonded to a polymer carrier, from an anion exchange resin, or from a water-soluble polymer containing a cationic group. Supported on a polymer carrier,
Examples thereof include a polymer having a cationic group or a polymer having a cationic group-containing water-soluble polymer on the surface of an inorganic polymer or an inorganic particle.
【0018】本明細書においてカチオン性基とは、それ
自体カチオンを形成している基及びそれ自体カチオンを
形成していないが中性付近(約pH6〜8)においてプ
ロトンの結合により容易にカチオンを形成するアミン系
及びイミン系の基を意味する。例えば1級アミノ基、2
級アミノ基、3級アミノ基、4級アンモニウム基、並び
にイミノ基(−NH−基及び=NH基)があげられる。
これらのカチオン性基の存在形態は多様であって何ら制
限されず、例えば化合物中に、アミジノ基、イミジノ
基、ヒドラジノ基、ピリジル基などの状態で存在してい
てもよい。In the present specification, a cationic group refers to a group that forms a cation by itself and a cation that does not form a cation by itself but is easily converted to a cation by the binding of a proton near neutral (about pH 6 to 8). Amine and imine groups to be formed are meant. For example, a primary amino group, 2
And a quaternary amino group, a tertiary amino group, a quaternary ammonium group, and an imino group (-NH- group and = NH group).
The form in which these cationic groups are present is various and is not limited at all. For example, the cationic groups may be present in the compound in the form of an amidino group, an imidino group, a hydrazino group, a pyridyl group, or the like.
【0019】上記の例としては、次のものを挙げること
ができる。 カチオン性基を有するモノマーを共重合した重合の
例:カチオン性基を有するモノマーとしては、2−ジメ
チルアミノエチル(メタ)アクリレート、2−ジエチル
アミノエチル(メタ)アクリレート、2−ジメチルアミ
ノプロピル(メタ)アクリレート、3−ジメチルアミノ
プロピル(メタ)アクリレート等のアミノアルキル基含
有(メタ)アクリル酸エステル類及びこれらの塩化メチ
レン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による4級塩;2
−(ジメチルアミノエトキシ)エチル(メタ)アクリレ
ート、2−(ジエチルアミノエトキシ)エチル(メタ)
アクリレート、3−(ジメチルアミノエトキシ)プロピ
ル(メタ)アクリレート等のアミノアルコキシアルキル
基含有(メタ)アクリル酸エステル類及びこれらの塩化
メチレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による4級
塩;N−(2−ジメチルアミノエチル)(メタ)アクリ
ルアミド、N−(2−ジエチルアミノエチル)(メタ)
アクリルアミド、N−(2−ジメチルアミノプロピル)
(メタ)アクリルアミド、N−(3−ジメチルアミノプ
ロピル)(メタ)アクリルアミド等のN−アミノアルキ
ル基含有(メタ)アクリルアミド類及びこれらの塩化メ
チレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による4級塩等
が挙げられる。なかでも、2−ジメチルアミノエチル
(メタ)アクリレート、N−(2−ジメチルアミノエチ
ル)(メタ)アクリルアミド、及びこれらの塩化メチレ
ンによる4級塩が好ましい。これらは、他の重合性モノ
マーと共重合させてもよい。The following can be cited as examples of the above. Example of polymerization in which a monomer having a cationic group is copolymerized: Examples of the monomer having a cationic group include 2-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, 2-diethylaminoethyl (meth) acrylate, and 2-dimethylaminopropyl (meth). Aminoalkyl group-containing (meth) acrylates such as acrylate and 3-dimethylaminopropyl (meth) acrylate, and quaternary salts thereof with methylene chloride, dimethyl sulfate, diethyl sulfate, and the like; 2
-(Dimethylaminoethoxy) ethyl (meth) acrylate, 2- (diethylaminoethoxy) ethyl (meth)
Acrylates, (meth) acrylates containing aminoalkoxyalkyl groups such as 3- (dimethylaminoethoxy) propyl (meth) acrylate and the like, and quaternary salts thereof with methylene chloride, dimethyl sulfate, diethyl sulfate and the like; N- (2- Dimethylaminoethyl) (meth) acrylamide, N- (2-diethylaminoethyl) (meth)
Acrylamide, N- (2-dimethylaminopropyl)
N-aminoalkyl group-containing (meth) acrylamides such as (meth) acrylamide and N- (3-dimethylaminopropyl) (meth) acrylamide, and quaternary salts thereof with methylene chloride, dimethyl sulfate, diethyl sulfate and the like. Can be Among them, 2-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, N- (2-dimethylaminoethyl) (meth) acrylamide, and quaternary salts thereof with methylene chloride are preferable. These may be copolymerized with other polymerizable monomers.
【0020】カチオン性モノマーと共重合するモノマー
としては、下記に示すような架橋性モノマーならびに非
架橋かつ非イオン性モノマーを挙げることができる。Examples of the monomer copolymerizable with the cationic monomer include the following crosslinkable monomers and non-crosslinkable and nonionic monomers.
【0021】架橋性モノマーとしては、ジビニルベンゼ
ン、ジビニルビフェニル、エチレングリコールジ(メ
タ)アクリレート、ジエチレングリコールジ(メタ)ア
クリレート、トリエチレングリコールジ(メタ)アクリ
レート、テトラエチレングリコールジ(メタ)アクリレ
ート、プロピレングリコールジ(メタ)アクリレー
ト、、ジプロピレングリコールジ(メタ)アクリレー
ト、トリプロピレングリコールジ(メタ)アクリレー
ト、テトラプロピレングリコールジ(メタ)アクリレー
ト、1,4−ブタンジオールジ(メタ)アクリレート、
1,6−ヘキサンジオールジ(メタ)アクリレート、ネ
オペンチルグリコールジ(メタ)アクリレート、2,
2’−ビス〔4−(メタ)アクリロイルオキシプロピオ
キシフェニル〕プロパン、2,2’−ビス〔4−(メ
タ)アクリロイルオキシジエトキジフェニル〕プロパ
ン、グリセリントリ(メタ)アクリレート、トリメチロ
ールプロパントリ(メタ)アクリレート、ペンタエリス
リトールテトラ(メタ)アクリレート等のジビニル系モ
ノマー、トリビニル系モノマー及びテトラビニル系モノ
マーが挙げられる。なかでも、ジビニルベンゼン、エチ
レングリコールジメタクリレートおよびトリメチロール
プロパントリメタクリレートが好ましい。Examples of the crosslinking monomer include divinylbenzene, divinylbiphenyl, ethylene glycol di (meth) acrylate, diethylene glycol di (meth) acrylate, triethylene glycol di (meth) acrylate, tetraethylene glycol di (meth) acrylate, and propylene glycol. Di (meth) acrylate, dipropylene glycol di (meth) acrylate, tripropylene glycol di (meth) acrylate, tetrapropylene glycol di (meth) acrylate, 1,4-butanediol di (meth) acrylate,
1,6-hexanediol di (meth) acrylate, neopentyl glycol di (meth) acrylate, 2,
2'-bis [4- (meth) acryloyloxypropoxyoxyphenyl] propane, 2,2'-bis [4- (meth) acryloyloxydiethoxydiphenyl] propane, glycerin tri (meth) acrylate, trimethylolpropane tri ( Examples thereof include divinyl monomers such as meth) acrylate and pentaerythritol tetra (meth) acrylate, trivinyl monomers and tetravinyl monomers. Among them, divinylbenzene, ethylene glycol dimethacrylate and trimethylolpropane trimethacrylate are preferred.
【0022】共重合可能な非架橋性かつ非イオン性モノ
マーは、カチオン性モノマーあるいは架橋性モノマーの
いずれかと共重合可能であって、非架橋性かつ非イオン
性のモノマーである。The non-crosslinkable and nonionic monomer that can be copolymerized is a noncrosslinkable and nonionic monomer that can be copolymerized with either a cationic monomer or a crosslinkable monomer.
【0023】このようなモノマーとして、スチレン、α
−メチルスチレン、p−メチルスチレン、ハロゲン化ス
チレン等の芳香族ビニル単量体;アクリロニトリル等の
不飽和ニトリル;メチルアクリレート、メチルメタクリ
レート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、
ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、シクロヘ
キシルメタクリレート、2−エチルヘキシルアクリレー
ト、2−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアク
リレート、ラウリルメタクリレート、グリシジルアクリ
レート、グリシジルメタクリレート、2−ヒドロキシエ
チルアクリレート、2−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト等のアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステ
ル;ブタジエン、イソプレン等のジオレフィン;酢酸ビ
ニル等のカルボン酸ビニルエステル;塩化ビニル、塩化
ビニリデン等のハロゲン化ビニリデン等を挙げることが
できる。なかでも、スチレン、α−メチルスチレン、ア
クリロニトリル、メチルメタクリレート、ブチルメタク
リレート、2−ヒドロキシエチルアクリレート、シクロ
ヘキシルメタクリレートが好ましい。As such a monomer, styrene, α
Aromatic vinyl monomers such as methyl styrene, p-methyl styrene, halogenated styrene; unsaturated nitriles such as acrylonitrile; methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate;
Acrylates such as butyl acrylate, butyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, and methacrylic acid Esters; diolefins such as butadiene and isoprene; carboxylic acid vinyl esters such as vinyl acetate; and vinylidene halides such as vinyl chloride and vinylidene chloride. Among them, styrene, α-methylstyrene, acrylonitrile, methyl methacrylate, butyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, and cyclohexyl methacrylate are preferred.
【0024】カチオン性基を有する重合開始剤を使用
してモノマーを重合して得た重合体の例:カチオン性基
を有するラジカル重合開始剤は、これを用いたラジカル
重合により得られたポリマーがその末端に該ラジカル重
合開始剤に由来するカチオン性基を有するようになるも
のである。好ましいカチオン性基を有するラジカル重合
開始剤としては、アミジノ基、イミジノ基あるいはピリ
ジウム基を有するアゾビス型の開始剤が挙げられる。ま
た、10時間半減期温度が40〜95℃の範囲にあるも
のが温和な条件下で重合を行うことができるので好まし
い。Examples of a polymer obtained by polymerizing a monomer using a polymerization initiator having a cationic group: A radical polymerization initiator having a cationic group is a polymer obtained by radical polymerization using the same. It has a cationic group derived from the radical polymerization initiator at its terminal. Preferred examples of the radical polymerization initiator having a cationic group include azobis-type initiators having an amidino group, an imidino group, or a pyridium group. Those having a 10-hour half-life temperature in the range of 40 to 95 ° C. are preferable because the polymerization can be carried out under mild conditions.
【0025】カチオン性基を有する化合物を重合体担
体に結合させてなる重合体 粒子表面にカルボキシル基、ハイドロキシル基、エポキ
シ基、アミノ基、アミド基などを共重合やシード重合法
などにより導入し、それらの基を結合部として反応させ
ることにより、カチオン性基を有する化合物を重合体表
面に導入することができる。カチオン性基を有する化合
物としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミ
ン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリプロピ
レンアミンなどのポリアミン化合物、ポリリジン、ポリ
アルギニン、ポリヒスチジンなどの遊離アミノ酸類、前
述のカチオン性基を有するモノマーを共重合したポリマ
ーなどを挙げることができる。A carboxyl group, a hydroxyl group, an epoxy group, an amino group, an amide group and the like are introduced into the surface of a polymer particle obtained by binding a compound having a cationic group to a polymer carrier by copolymerization or seed polymerization. By reacting these groups as a bonding portion, a compound having a cationic group can be introduced to the polymer surface. Examples of the compound having a cationic group include polyethyleneamine, polypropyleneimine, polyallylamine, polyvinylamine, polyamine compounds such as polypropyleneamine, polylysine, polyarginine, free amino acids such as polyhistidine, and monomers having the above-described cationic group. Copolymers and the like can be mentioned.
【0026】陰イオン交換樹脂 ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンに第4級アンモニウ
ム基−CH2N+(CH3)3(I型)あるいは−CH2N+(CH3)3(C2H4
OH)(II型)を導入した強塩基性陰イオン交換樹脂、−N
H(CH3)2、−NH(CH2CH2NH)nH、−CONH(CH2)3N(CH3)2を導
入した弱塩基性陰イオンなど。Anion exchange resin A divinylbenzene cross-linked polystyrene has a quaternary ammonium group -CH 2 N + (CH 3 ) 3 (type I) or -CH 2 N + (CH 3 ) 3 (C 2 H 4
OH) (Type II) introduced strong basic anion exchange resin, -N
Weakly basic anions into which H (CH 3 ) 2 , —NH (CH 2 CH 2 NH) n H, and —CONH (CH 2 ) 3 N (CH 3 ) 2 are introduced.
【0027】無機ポリマーまたは無機化合物の表面に
カチオン性基を有する重合体またはカチオン性基含有水
溶性高分子を有するもの。 さらにキレート樹脂といわれる供与体原子(O,N,
S)を有する樹脂も挙げることができる。キレート樹脂
としては、イミノ二酢酸型、イミノプロピオン酸型、エ
チレンジアミン三酢酸型、キノリン型、アミノカルボン
酸型、アミンリン酸型、アミドキシム型、クリプタント
型、ポリアミン型、ピリジン型、ピコリルアミン型、チ
オール型、リン酸型、多価フェノール型、ジチオカルバ
ミン酸型、チオ尿素型、イソチウロニウム型およびジチ
ゾン型などが挙げられる。A polymer having a cationic group or a cationic group-containing water-soluble polymer on the surface of an inorganic polymer or inorganic compound. In addition, donor atoms (O, N,
Resins having S) can also be mentioned. Examples of the chelating resin include iminodiacetic acid type, iminopropionic acid type, ethylenediamine triacetic acid type, quinoline type, aminocarboxylic acid type, amine phosphoric acid type, amidoxime type, cryptant type, polyamine type, pyridine type, picolylamine type, and thiol type , Phosphoric acid type, polyphenol type, dithiocarbamic acid type, thiourea type, isothiuronium type and dithizone type.
【0028】また、本発明において標的物質吸着体には
検査の自動化、分離操作の自動化のための有効な強磁性
体、超常磁性体などの磁性体を含有させることができ
る。標的物質吸着体の形状は特に限定されず種々有り得
る。例えば、粒子状、フィルター状、繊維状、シート
状、チューブ状、板状などである。標的物質吸着体の形
状が粒子状の場合、粒径は試料中に分散して使用する場
合には0.08〜300μm程度、カラムに充填して使
用する場合には0.1〜1mm程度の粒径を有すること
が好ましい。In the present invention, the target substance adsorbent may contain a magnetic substance such as a ferromagnetic substance and a superparamagnetic substance, which are effective for automating the inspection and the separating operation. The shape of the target substance adsorbent is not particularly limited and may be various. For example, it may be in the form of particles, filters, fibers, sheets, tubes, plates, or the like. When the shape of the target substance adsorbent is particulate, the particle size is about 0.08 to 300 μm when dispersed and used in a sample, and about 0.1 to 1 mm when used by filling a column. It preferably has a particle size.
【0029】フィルターの場合には、好ましくは、平均
孔径が0.1〜50μmの範囲にあるフィルターであ
り、平膜、中空糸膜、不織布、織布などを例示できる。
血漿や培養液などを対象とした場合は、平均孔径が0.
1μm〜10μm が好ましい。平均孔径が0.1μ以
下だと、孔径が小さくなるため十分な濾過量が得られな
くなる。平均孔径は、ASTM−F316に記載された
パームポロメーター(ポーラスマテリアル社製)を用い
て求めた値であり、実際の透過孔を反映する値である。
また、フィルターの通水量は、0.7kg/cm2の圧
力下で、25℃±2℃で測定した値で、10mL/mi
n/m2/mmHg以上、好ましくは100mL/min
/m2/mmHg以上であることが、濾過圧を低くでき
るため好ましい。また、不織布状の基材の場合、フィル
ター材を形成するフィラメントは、モノフィラメントで
あってもマルチフィラメントであってもよいが、平均直
径(走査型電子顕微鏡で観察したフィラメントの長径と
短径の平均値)が100μm以下、好ましくは、50μ
m以下であると、膜の表面積が大きくなり吸着部位が増
加することとなるため好ましい。さらに、異形フィラメ
ントであっても多孔質フィラメントであっても良い。さ
らに、フィルターの空孔部の割合(空孔率)は、20%
以上、好ましくは50%以上である。The filter is preferably a filter having an average pore diameter in the range of 0.1 to 50 μm, and examples thereof include a flat membrane, a hollow fiber membrane, a nonwoven fabric, and a woven fabric.
When the target is plasma, culture solution, or the like, the average pore size is 0.
1 μm to 10 μm is preferred. If the average pore size is 0.1 μm or less, a sufficient filtration amount cannot be obtained because the pore size becomes small. The average pore diameter is a value obtained by using a palm porometer (manufactured by Porous Materials) described in ASTM-F316, and is a value reflecting an actual transmission pore.
The amount of water passing through the filter was 10 mL / mi as a value measured at 25 ° C. ± 2 ° C. under a pressure of 0.7 kg / cm 2.
n / m 2 / mmHg or more, preferably 100 mL / min
/ M 2 / mmHg or more, because the filtration pressure can be reduced. In the case of a nonwoven base material, the filaments forming the filter material may be monofilaments or multifilaments, but the average diameter (average of the major and minor diameters of the filaments observed with a scanning electron microscope) Value) is 100 μm or less, preferably 50 μm.
It is preferable that it is not more than m since the surface area of the film becomes large and the number of adsorption sites increases. Further, it may be a modified filament or a porous filament. Further, the ratio of the porosity of the filter (porosity) is 20%.
Or more, preferably 50% or more.
【0030】標的物質吸着体がシート状、チューブ状ま
たは板状である例としては、採血管、真空採血管、試験
管、ウェルプレート、マイクロプレート、マイクロテス
トチューブ、エッペンドルフチューブ(商品名)などを
挙げることができる。Examples of the target substance adsorbent having a sheet shape, a tube shape, or a plate shape include a blood collection tube, a vacuum blood collection tube, a test tube, a well plate, a microplate, a microtest tube, and an Eppendorf tube (trade name). Can be mentioned.
【0031】これらの形状の標的物質吸着体を得るに
は、上記に例示された有機ポリマーのうちポリスチレ
ン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレ
フタレート、ノルボルネン系樹脂などの熱可塑性樹脂は
そのまま所望の形状に成形することができる。In order to obtain a target substance adsorbent having these shapes, a thermoplastic resin such as polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyethylene terephthalate, norbornene-based resin among the organic polymers exemplified above is directly formed into a desired shape. be able to.
【0032】また、ガラス、ポリスチレン、ポリメチル
メタクリレートなどからなる汎用の採血管などの表面を
イオン化することにより、本発明に適した標的物質吸着
体とすることもできる。The target substance adsorbent suitable for the present invention can be obtained by ionizing the surface of a general-purpose blood collection tube made of glass, polystyrene, polymethyl methacrylate, or the like.
【0033】[試料]本発明の検出方法の適用対象は、
複数の検体が混合された、標的物質を含有する可能性の
ある試料である。検体としては、例えば血液、血漿、血
清、尿、唾液等の各種体液、細胞破砕液、培養細胞破砕
液などである。[Sample] The detection method of the present invention is applied to:
This is a sample in which a plurality of analytes are mixed and may contain a target substance. Samples include, for example, various body fluids such as blood, plasma, serum, urine, and saliva, cell lysates, and cultured cell lysates.
【0034】上記の複数の検体から一定量ずつ採取さ
れ、混合されたものを「プール」と称し、このプール作
成の1回目を1次プールと称する。1次プールの作成に
おいて集められる検体の数は通常5〜500、好ましく
は10〜50であり、一つの検体から採取される試料の
量は0.01〜1ミリリットル、好ましくは0.1〜
0.5ミリリットルである。A sample obtained by collecting a predetermined amount from each of the plurality of samples and mixing the sample is called a "pool", and the first pool creation is called a primary pool. The number of samples collected in the creation of the primary pool is usually 5 to 500, preferably 10 to 50, and the amount of the sample collected from one sample is 0.01 to 1 ml, preferably 0.1 to 1 ml.
0.5 ml.
【0035】必要に応じ、さらに複数の1次プールから
試料を集め、2次プールを作成することもできる。同様
に3次以上のプールもあり得る。2次プールの作成にお
いて集められるプールの数は通常2〜100、好ましく
は5〜20であり、一つの検体から採取される試料の量
は0.01〜1ミリリットル、好ましくは0.1〜0.
5ミリリットルである。If necessary, samples may be collected from a plurality of primary pools to form a secondary pool. Similarly, there may be third or higher pools. The number of pools collected in the preparation of the secondary pool is usually 2 to 100, preferably 5 to 20, and the amount of a sample collected from one specimen is 0.01 to 1 ml, preferably 0.1 to 0 ml. .
5 ml.
【0036】このようにして、1次または2次以上のプ
ールを作成するが、ここで各検体またはプールから採取
する試料の量および集める検体またはプールの数を適宜
調整することにより、複数の被験者からの検体が場合に
より一定量ずつ含まれ、かつ後述する標的物質検出手段
に適した量に試料を調製することができる。In this manner, a primary or secondary pool is prepared. Here, by appropriately adjusting the amount of samples collected from each sample or pool and the number of collected samples or pools, a plurality of subjects can be prepared. The sample can be prepared in an amount suitable for the target substance detection means described later, in which a certain amount of the sample is contained in some cases.
【0037】[接触・結合]本発明では、前記のとおり
調製された試料に前記の標的物質吸着体を接触させる。
接触の方法は種々有り得、特に限定されない。不溶性担
体の形状、大きさなどに応じて適切な方法をとればよ
い。[Contact / Binding] In the present invention, the target substance adsorbent is brought into contact with the sample prepared as described above.
There are various contact methods and there is no particular limitation. An appropriate method may be used depending on the shape, size, etc. of the insoluble carrier.
【0038】例えば、標的物質吸着体が粒径200μm
未満の粒子の場合には、標的物質吸着体を試料中に分散
させ試料と不溶性担体を接触させる。この分散及び接触
は場合によっては振とうすることにより行う。標的物質
吸着体が粒径200μmを超える粒子の場合には、カラ
ムに充填し、その中に試料を通過させる。また、標的物
質吸着体が直径5〜6mmのプラスチックビーズなど大
きなものの場合は、1〜数個を試験管に入れ、試料と接
触させる。標的物質吸着体がフィルター状または繊維状
の場合には、フィルターまたは繊維表面と試料が充分接
触するように、フィルターまたは繊維で試料を濾過す
る。標的物質吸着体が試験管やウェルプレートなどの試
験器具である場合には、該試験器具の中に試料を入れ振
とうする。For example, the target substance adsorbent has a particle size of 200 μm.
In the case of particles having a particle size of less than 1, the target substance adsorbent is dispersed in the sample, and the sample is brought into contact with the insoluble carrier. This dispersing and contacting is optionally carried out by shaking. When the target substance adsorbent is a particle having a particle diameter of more than 200 μm, the column is packed and a sample is passed through the column. When the target substance adsorbent is a large one such as plastic beads having a diameter of 5 to 6 mm, one to several pieces are put into a test tube and brought into contact with the sample. When the target substance adsorbent is in the form of a filter or a fiber, the sample is filtered through the filter or the fiber so that the surface of the filter or the fiber sufficiently contacts the sample. When the target substance adsorbent is a test device such as a test tube or a well plate, a sample is placed in the test device and shaken.
【0039】標的物質吸着体に試料を接触させる際に
は、必要に応じて多価金属イオンなどをさらに添加する
こともできる。標的物質吸着体に試料を接触させる際の
試料の温度は通常5〜37℃、接触時間は長すぎるとフ
ィブリン等の析出がおきるため、対象によって調整する
事が好ましい。When the sample is brought into contact with the target substance adsorbent, a polyvalent metal ion or the like can be further added as necessary. When the sample is brought into contact with the target substance adsorbent, the temperature of the sample is usually 5 to 37 ° C., and if the contact time is too long, precipitation of fibrin or the like occurs.
【0040】[分離]標的物質吸着体と試料を接触させ
た後、標的物質吸着体を試料から分離する。この際、標
的物質吸着体が粒径200μm未満の粒子の場合には、
例えば遠心により分離する。また、標的物質吸着体に磁
性体を含有させておくことにより、試料から磁気により
容易に分離することができる。[Separation] After the target substance adsorbent is brought into contact with the sample, the target substance adsorbent is separated from the sample. At this time, when the target substance adsorbent is a particle having a particle size of less than 200 μm,
For example, it is separated by centrifugation. In addition, when the magnetic substance is contained in the target substance adsorbent, it can be easily separated from the sample by magnetism.
【0041】試料から分離された標的物質吸着体上の標
的物質は濃縮されている。こうして濃縮された標的物質
は次に検出に供される。但し、検出に供する前に必要に
応じて標的物質吸着体を緩衝液で洗浄したり、および/
または標的物質を標的物質吸着体から分離した後に検出
に移行してもよい。例えば、標的物質がウイルスまたは
細菌である場合にはこれを分離し、核酸である場合には
抽出することができる。あるいは、標的物質が標的物質
吸着体上に結合したままで検出に移ることもできる。標
的物質の種類、標的物質吸着体の材質等に応じて適宜の
方法を選択すればよい。The target substance on the target substance adsorbent separated from the sample is concentrated. The target substance thus concentrated is then subjected to detection. However, if necessary, the target substance adsorbent may be washed with a buffer before being subjected to detection, and / or
Alternatively, detection may be started after the target substance is separated from the target substance adsorbent. For example, when the target substance is a virus or a bacterium, it can be separated, and when it is a nucleic acid, it can be extracted. Alternatively, detection can be performed while the target substance remains bound on the target substance adsorbent. An appropriate method may be selected according to the type of the target substance, the material of the target substance adsorbent, and the like.
【0042】標的物質を標的物質吸着体から分離する方
法としては、塩溶液および界面活性剤あるいは両者の混
合物を作用させて標的物質を標的物質吸着体から解離さ
せる方法がある。塩溶液としては高濃度の、例えば2〜
8Mの臭化カリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウ
ム、グアニジンイソチオシアネート、グアニジンチオシ
アネート、塩酸グアニジン、硫酸グアニジン、チオシア
ン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウムおよびその塩の
水溶液、1.5〜6M塩化ナトリウム水溶液、0.5〜5mMリン
タングステン酸水溶液等を用いることができる。As a method for separating the target substance from the target substance adsorbent, there is a method in which the target substance is dissociated from the target substance adsorbent by the action of a salt solution and a surfactant or a mixture of both. The salt solution has a high concentration, for example,
8 M potassium bromide, sodium bromide, sodium iodide, guanidine isothiocyanate, guanidine thiocyanate, guanidine hydrochloride, guanidine sulfate, sodium thiocyanate, aqueous solution of potassium thiocyanate and its salts, 1.5-6 M aqueous sodium chloride solution, 0.5-5 mM An aqueous solution of phosphotungstic acid or the like can be used.
【0043】界面活性剤としては、SDS、トライトン
X−100、Tween20,80、NP−40などが
ある。Examples of the surfactant include SDS, Triton X-100, Tween 20, 80 and NP-40.
【0044】また、核酸抽出は、標的物質が標的物質吸
着体に結合したままでも行うことができる。標的核酸を
効果的に増幅して検出するためには、通常、その核酸を
細胞やその他の被検体残渣から単離しなければらない。
様々な分離方法が知られており、凍結法、プロテアーゼ
(例、プロテイナーゼK)などの消化酵素による処理
法、煮沸法、各種洗剤を使用する方法(例えば、1988年
4月6日出願のHiguchiの米国特許出願第178,202号明細書
および1991年5月22日発行の欧州特許出願公開第07828 1
97号公報参照)、溶剤析出法並びに加熱プロトコールが
ある。分離された標的物質吸着体に少量の緩衝液を加
え、加熱することで直接、標的物質の核酸を抽出するこ
とも可能であるし、市販されている核酸抽出試薬を直接
添加して標的物質の核酸を抽出することも可能である。Further, nucleic acid extraction can be performed while the target substance remains bound to the target substance adsorbent. In order to effectively amplify and detect a target nucleic acid, the nucleic acid typically must be isolated from cells or other analyte residues.
Various separation methods are known, including a freezing method, a treatment method using digestive enzymes such as protease (eg, proteinase K), a boiling method, and a method using various detergents (for example, 1988
Higuchi U.S. Patent Application No. 178,202 filed on April 6, and European Patent Application Publication No. 078281 issued on May 22, 1991
No. 97), a solvent precipitation method and a heating protocol. It is also possible to directly extract the nucleic acid of the target substance by adding a small amount of buffer solution to the separated target substance adsorbent and heating it, or directly add a commercially available nucleic acid extraction reagent to remove the target substance. It is also possible to extract nucleic acids.
【0045】[標的物質の検出]上記のようにして標的
物質吸着体上に濃縮され、場合によってはさらに濃縮さ
れた状態で分離、抽出された標的物質の検出が行われ
る。検出方法は、標的物質の種類に応じて公知の方法を
採用することができ、例えば核酸増幅検査、免疫化学測
定法等が挙げられる。[Detection of Target Substance] The target substance which has been concentrated on the target substance adsorbent as described above and, if necessary, separated and extracted in a further concentrated state is detected. As the detection method, a known method can be adopted according to the type of the target substance, and examples thereof include a nucleic acid amplification test and an immunochemical assay.
【0046】ウイルスの核酸増幅検査(NAT; nuclei
c acid amplification test)の方法は特に限定され
ず、例えば、ロシュ社のPCR(Polymerization chain
reaction)法、ジェン・プローブ社のTMA(Transcript
ion Mediated amplification-hybridization protectio
n assay)法、アボット社のLCR(Ligase chain reacti
on)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amp
lification)(RNAをターゲット、温度一定が特徴)、
CPT(Cyclic Probe Tech)(DNAをターゲット、D
NA/RNAキメラprobeを使用し、ビオチン標識probe
を増幅)、QβReplicase Amplification(RNAをター
ゲット、ストレプトアビジン粒子でRNAを単離)、In
vader Assay等を利用することができる。Virus nucleic acid amplification test (NAT; nuclei
The method of c acid amplification test is not particularly limited. For example, PCR (Polymerization chain) of Roche
reaction) method, TMA (Transcript
ion Mediated amplification-hybridization protectio
n assay) method, Abbott's LCR (Ligase chain reacti
on) method, NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amp)
lification) (targeting RNA, characterized by constant temperature),
CPT (Cyclic Probe Tech) (Target DNA, D
Using NA / RNA chimera probe, biotin-labeled probe
Amplification), Qβ Replicase Amplification (target RNA, isolate RNA with streptavidin particles), In
A vader Assay or the like can be used.
【0047】免疫化学測定法としては、例えば酵素免疫
反応(EIA)法、化学発光法(CLTA)、蛍光法
(FIA)などを挙げることができる。本発明の標的物
質検出方法で検出することのできる標的物質は、ウィル
ス、核酸、抗原、抗体、タンパク質などである。Examples of the immunochemical measurement method include an enzyme immunoreaction (EIA) method, a chemiluminescence method (CLTA), and a fluorescence method (FIA). Target substances that can be detected by the target substance detection method of the present invention include viruses, nucleic acids, antigens, antibodies, proteins, and the like.
【0048】ウィルスとしては、例えばヘパドナウイル
ス(B型肝炎ウイルス等)、アデノウイルス、フラビウ
イルス(日本脳炎ウイルス等)、ヘルペスウイルス(単
純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイト
メガロウイルス、EBウイルス等)、ポックスウイルス、
パルボウイルス(アデノ関連ウイルス等)、オルソミク
ソウイルス(インフルエンザウイルス等)、ラブドウイ
ルス(狂犬病ウイルス等)、レトロウイルス(後天性免
疫不全症候群ウイルス等)、C型肝炎ウイルス、ヒトT
細胞白血病ウイルス(HTLV−1)、ヒト免疫不全ウ
イルス(HIV−1、HIV−2)、ヒトパルボウイル
スB−19等のウイルスなどである。Examples of the virus include hepadnavirus (hepatitis B virus, etc.), adenovirus, flavivirus (Japanese encephalitis virus, etc.), herpes virus (herpes simplex virus, varicella-zoster virus, cytomegalovirus, EB virus) Etc.), poxvirus,
Parvovirus (Adeno-associated virus, etc.), Orthomyxovirus (Influenza virus, etc.), Rhabdovirus (Rabies virus, etc.), Retrovirus (Acquired immunodeficiency syndrome virus, etc.), Hepatitis C virus, Human T
Virus such as cell leukemia virus (HTLV-1), human immunodeficiency virus (HIV-1, HIV-2), and human parvovirus B-19.
【0049】核酸としては、DNA、RNA、mRN
A、tRNAなどである。抗原、抗体としてはフェリチ
ン、ASO、T3、T4、α−フェトプロテイン、HBs
抗原、CEA(癌胎児性抗原)、HCV表面抗原、HI
V表面抗原、抗トレポネーマパリダム、抗カルビオライ
ピン抗原、抗HBC抗体、抗HIV抗体など免役反応で
測定されるすべての物が挙げられる。タンパク質として
は、α−リポ蛋白、β−リポ蛋白などである。The nucleic acids include DNA, RNA, mRN
A, tRNA and the like. Antigens and antibodies include ferritin, ASO, T 3 , T 4 , α-fetoprotein, HBs
Antigen, CEA (carcinoembryonic antigen), HCV surface antigen, HI
V-surface antigens, anti-Treponemal pallidum, anti-carbiolipin antigens, anti-HBC antibodies, anti-HIV antibodies, etc., all of which are measured by immunological reactions. Examples of the protein include α-lipoprotein and β-lipoprotein.
【0050】[0050]
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
以下の記載においては、特記しない限り「部」は「重量
部」を意味する。EXAMPLES The present invention will be described below in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
In the following description, “parts” means “parts by weight” unless otherwise specified.
【0051】参考例1 (1)油性磁性流体フェリコロイドHC50[商品名、タイ
ホー工業(株)製]にアセトンを加えて粒子を析出沈殿
させた後、これを乾燥することにより、親油化処理され
た表面を有するフェライト系の超常磁性体(粒子径:
0.01μm)を得た。ついで、上で得た超常磁性体4
0部にシクロヘキシルメタクリレート90部、トリメチ
ルアミノエチルメタクリレートの塩化物10部およびベ
ンゾイルペルオキシド(重合開始剤)3部を添加し、こ
の系を混合攪拌することにより超常磁性体を均一に分散
させてモノマー組成物を調製した。Reference Example 1 (1) Acetone was added to oily magnetic fluid ferricolloid HC50 [trade name, manufactured by Taiho Kogyo Co., Ltd.] to precipitate particles, which were then dried to obtain a lipophilic treatment. Ferrite-based superparamagnetic material (particle size:
0.01 μm). Then, the superparamagnetic material 4 obtained above
To 0 parts, 90 parts of cyclohexyl methacrylate, 10 parts of chloride of trimethylaminoethyl methacrylate and 3 parts of benzoyl peroxide (polymerization initiator) are added, and the system is mixed and stirred to uniformly disperse the superparamagnetic material, thereby obtaining a monomer composition. Was prepared.
【0052】一方、ポリビニルアルコール10部、ラウ
リル硫酸ナトリウム0.05部およびポリエチレンオキ
シドノニルフェニルエーテル0.1部を水1000部に
溶解して水性モノマー組成物を調製した。こうして調製
した水性モノマー組成物中に上記のモノマー組成物を添
加し、ホモジナイザーで予備攪拌した後、超音波分散機
で分散処理することにより平均粒子径が1μmの油滴
(油相)が水性媒体に分散した懸濁液(油滴分散体)を
調製した。On the other hand, an aqueous monomer composition was prepared by dissolving 10 parts of polyvinyl alcohol, 0.05 part of sodium lauryl sulfate and 0.1 part of polyethylene oxide nonylphenyl ether in 1000 parts of water. The above monomer composition was added to the aqueous monomer composition thus prepared, and the mixture was preliminarily stirred with a homogenizer, and then subjected to a dispersion treatment with an ultrasonic disperser, whereby oil droplets (oil phase) having an average particle diameter of 1 μm were formed in the aqueous medium. (Oil droplet dispersion) was prepared.
【0053】次に、得られた懸濁液を容量2リットルの
攪拌機付き三つ口フラスコに仕込み、この系を75℃に
昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しながら5時間にわ
たり油滴中のモノマーを重合(懸濁重合)させることに
より、磁性ポリマー粒子を作製した。得られた粒子を光
学顕微鏡で写真撮影し、粒子200個の直径を計測してそ
の平均を求めた結果1.2μmであった。Next, the obtained suspension was charged into a two-liter three-necked flask equipped with a stirrer. The temperature of the system was raised to 75 ° C., and the system was stirred for 5 hours under a nitrogen atmosphere. By polymerizing the monomer (suspension polymerization), magnetic polymer particles were produced. The obtained particles were photographed with an optical microscope, the diameter of 200 particles was measured, and the average was determined. The result was 1.2 μm.
【0054】(2)上記(1)で得られた磁性ポリマー
粒子を5mM水酸化ナトリウム水溶液に分散し、80℃
で12時間処理してカルボキシ変性磁性ポリマー粒子と
した。 (3)得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子1gを
20mLの10mM MES緩衝溶液(pH6.0)に懸
濁し、ポリエチレンイミン(和光純薬工業株式会社、数
平均分子量7万)30%水溶液、33μLおよび水溶性
カルボジイミド試薬EDC・塩酸塩(1−エチル−3
(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロ
クロライド)0.05gを添加し、2時間室温で反応さ
せて吸着体を得た。(2) The magnetic polymer particles obtained in (1) were dispersed in a 5 mM aqueous sodium hydroxide solution,
For 12 hours to obtain carboxy-modified magnetic polymer particles. (3) 1 g of the obtained carboxy-modified magnetic polymer particles were suspended in 20 mL of 10 mM MES buffer solution (pH 6.0), and a 30% aqueous solution of polyethyleneimine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., number average molecular weight 70,000), 33 μL, Water-soluble carbodiimide reagent EDC · hydrochloride (1-ethyl-3
0.05 g of (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) was added and reacted at room temperature for 2 hours to obtain an adsorbent.
【0055】実施例1 (1)参考例1で得られた標的物質吸着体の水性懸濁液
を精製後、生理食塩水で固形分濃度5%に調整した。 (2)100コピー/mLのHBV陽性血100μLと
正常ヒト血漿(HBV陰性)の49検体各100μLとを混
合し、合計量5mLの試料Aを調製した。 (3)この試料A4.9mLに上記(1)で調製した標
的物質吸着体水性懸濁液(5重量%)100μLを加え、
室温で10分間回転撹拌して両者を接触させ、標的物質
吸着体にウイルス吸着処理を行った。Example 1 (1) The aqueous suspension of the target substance adsorbent obtained in Reference Example 1 was purified and then adjusted to a solid concentration of 5% with physiological saline. (2) 100 μL of 100 copies / mL of HBV-positive blood and 100 μL of each of 49 samples of normal human plasma (HBV-negative) were mixed to prepare a sample A having a total volume of 5 mL. (3) 100 μL of the target substance adsorbent aqueous suspension (5% by weight) prepared in the above (1) was added to 4.9 mL of this sample A,
The two were brought into contact with each other by rotating and stirring at room temperature for 10 minutes, and the target substance adsorbent was subjected to virus adsorption treatment.
【0056】ウイルス吸着処理後、磁気分離スタンドに
セットし、標的物質吸着体の粒子と上清を分離し、上清
を捨て、Tris-HCl緩衝液(pH7.4)を加え、100μLの標
的物質吸着体粒子分散液を得た。この粒子分散液からDN
A Extractor Kit(和光純薬工業株式会社製)を用い、
付属の手順書に従い核酸を抽出した。抽出により得られ
た抽出物(核酸)を試料Bという。得られた抽出物をPC
R法により、35回のPCRの増幅過程によりDNAを増幅し
た。PCRのプライマー配列は、Hiroaki Okamoto,Igaku
no ayumi,(1992),162(9),544-549.に従った。得られ
た1st-PCR、2nd-PCRそれぞれの増幅産物を3%アガロー
スを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色
によりDNAを可視化しポラロイド写真に撮影した。得ら
れた目的DNAの量をバンドの蛍光強度から、−,+,+
+,+++の4段階で判定した。After the virus adsorption treatment, the sample was set on a magnetic separation stand, the supernatant of the target substance adsorbent was separated from the supernatant, the supernatant was discarded, and Tris-HCl buffer (pH 7.4) was added. An adsorbent particle dispersion was obtained. From this particle dispersion, DN
Using A Extractor Kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.),
The nucleic acid was extracted according to the attached procedure manual. The extract (nucleic acid) obtained by the extraction is referred to as sample B. Extract the obtained extract into PC
By the R method, DNA was amplified by the amplification process of 35 times of PCR. PCR primer sequences are available from Hiroaki Okamoto, Igaku
no ayumi, (1992), 162 (9), 544-549. The obtained 1st-PCR and 2nd-PCR amplification products were subjected to electrophoresis using 3% agarose, DNA was visualized by ethidium bromide staining, and photographed on a polaroid photograph. From the fluorescence intensity of the band, the amount of the obtained target DNA was determined based on-, +, +
Judgment was made in four stages of + and +++.
【0057】試料A100μL、元のHBV陽性血10
0μL(試料C)および正常ヒト血漿100μL(試料
D)から上記DNA Extractor Kitにより核酸を抽出し、
同様にPCR反応を行い、同様に評価した。以上の結果を
表1に示す。Sample A 100 μL, original HBV positive blood 10
Nucleic acids were extracted from 0 μL (sample C) and 100 μL of normal human plasma (sample D) using the above DNA Extractor Kit.
A PCR reaction was performed in the same manner, and evaluation was similarly performed. Table 1 shows the above results.
【0058】[0058]
【表1】 [Table 1]
【0059】実施例2 HCV(C型肝炎ウイルス)を2×104コピー/mL
含有するヒト血漿1検体と正常ヒト血漿の9検体、49
検体、99検体をそれぞれ一定の割合で混合してそれぞ
れ10検体プール、50検体プール、100検体プール
の試料を作製した。Example 2 HCV (hepatitis C virus) was 2 × 10 4 copies / mL
1 human plasma sample and 9 normal human plasma samples, 49
Samples and 99 samples were mixed at a fixed ratio to prepare samples of 10 sample pool, 50 sample pool, and 100 sample pool, respectively.
【0060】10検体プール試料から0.9mL、50
検体プール試料から4.9mL、100検体プール試料
から9.9mLをとり、それぞれに参考例1で製造した
吸着体懸濁液(5重量%)100μLを加えた後、室温
で10分間回転攪拌し吸着体を磁気的に凝集させ、上澄
みをそれぞれ100μL残して除去した後、磁気を解除
し吸着体を上澄み100mL中に再分散させ濃縮液を得
た。0.9 mL, 50
After taking 4.9 mL from the sample pool sample and 9.9 mL from the 100 sample pool sample, 100 μL of the adsorbent suspension (5% by weight) produced in Reference Example 1 was added thereto, and the mixture was rotated and stirred at room temperature for 10 minutes. After the adsorbent was magnetically aggregated and the supernatant was removed leaving 100 μL each, the magnetism was released and the adsorbent was redispersed in 100 mL of the supernatant to obtain a concentrated solution.
【0061】得られた濃縮液を核酸抽出試薬(商品名ス
マイスライト EX R&D、ゲノムサイエンス研究所製)で
吸着体に捕捉されたウィルスを酵素分解した後、磁気に
より吸着体を凝集させ、濃縮液から吸着体を除去した。
次いで、抽出されたHCV核酸を分離し、リアルタイム
検出PCR法(Proc. Nail. Acad. Sci. U.S.A.,Vol.8
8, pp7276-7280, 1991)であるTaqMan PCR法によりABI
PRISM 7700 Sequence Detection System(PE Biosystem
社製)を用いHCV核酸量を定量した。The obtained concentrate is enzymatically decomposed with a nucleic acid extraction reagent (trade name: Smythrite EX R & D, manufactured by Genome Science Laboratories), and the adsorbent is aggregated by magnetism. Was removed from the adsorbent.
Next, the extracted HCV nucleic acid was separated and subjected to a real-time detection PCR method (Proc. Nail. Acad. Sci. USA, Vol. 8).
8, pp7276-7280, 1991) by the TaqMan PCR method.
PRISM 7700 Sequence Detection System (PE Biosystem
HCV nucleic acid).
【0062】DNAの定量は、40回の増幅過程におい
て、蛍光強度が一定の基準値(Threshhold:Th)を越えた
サイクル数(Thサイクル)をウィルス濃度既知の検体
の希釈系列を用いて同時に測定して作成した。DNA量
Thサイクルの検量線に外挿して求めた。結果を表2の
「濃縮100μL」の欄に示す。[0062] For the quantitative determination of DNA, the number of cycles (Th cycle) in which the fluorescence intensity exceeded a certain reference value (Threshhold: Th) during the 40 amplification steps was simultaneously measured using a dilution series of a sample with a known virus concentration. Created. DNA amount
Extrapolated to the Th cycle calibration curve. The results are shown in the column of “concentration 100 μL” in Table 2.
【0063】[0063]
【表2】 [Table 2]
【0064】(2)別のチューブに(1)と同じ10検
体プール、50検体プール、100検体プールから100
μLずつ、核酸抽出試薬(商品名:スマイラスト EX R&
D、ゲノムサイエンス研究所製)で処理し、上記(1)
と同様にしてDNA量を定量した結果を表2「未濃縮1
00μL」の欄に示す。この結果、HCVはプール検体
そのものより約1桁高いウイルス核酸のコピー数を示
し、本粒子による濃縮が有効であることが示された。(2) The same 10-sample pool, 50-sample pool, and 100-sample pool from 100
Add the nucleic acid extraction reagent (product name: Suma Illustration EX R &
D, manufactured by Genome Science Laboratories)
The results of quantifying the amount of DNA in the same manner as in Table 2 are shown in Table 2 “Unconcentrated 1
00 μL ”. As a result, HCV showed a copy number of the viral nucleic acid which was about one digit higher than that of the pool specimen itself, indicating that concentration with the present particles was effective.
【0065】実施例3 HBs抗原が陽性血(試料E)と正常ヒト血漿49人分
を用い、各100μLと試料Aを混合した試料F(5mL)
を作製した。試料Fから100μLを取り、残りの4.9mLに
参考例の粒子100μLを加え10分間攪拌し、ウイルス吸着
処理を行った。この後、粒子を0.1%BSA、Twee
n80(0.01を含む)溶液で4回洗浄し、スチレンスル
ホン酸ソーダ(0.1%)を加え、ウイルスを解離させ
た。この後、磁気で粒子を分離し、100μLのウイルス濃
縮液とした(試料G)。これらの試料を富士レビオルシ
パルスHBs抗原で測定した。Example 3 Sample F (5 mL) obtained by mixing 100 μL of each sample with Sample A using HBs antigen-positive blood (sample E) and 49 normal human plasmas
Was prepared. 100 μL was taken from Sample F, 100 μL of the particles of Reference Example was added to the remaining 4.9 mL, and the mixture was stirred for 10 minutes to perform virus adsorption treatment. After this, the particles were made 0.1% BSA, Tween
After washing four times with n80 (including 0.01) solution, sodium styrenesulfonate (0.1%) was added to dissociate the virus. Thereafter, the particles were separated by magnetism to obtain 100 μL of a virus concentrate (sample G). These samples were measured with Fujirebi Orcipulse HBs antigen.
【0066】[0066]
【表3】 [Table 3]
【0067】[0067]
【発明の効果】本発明の標的物質検出法では、核酸増幅
検査に供される検体中の標的物質が既に濃縮されている
ので、元の検体または試料に含まれている標的物質が極
く微量であっても効率的に標的物質の検出を行うことが
できる。According to the method for detecting a target substance of the present invention, the target substance contained in the original specimen or sample is extremely small because the target substance in the specimen subjected to the nucleic acid amplification test has already been concentrated. Even in this case, the target substance can be efficiently detected.
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) // G01N 27/447 G01N 27/26 315Z 325B (72)発明者 田中 建志 東京都世田谷区用賀3−15−14−107 (72)発明者 村田 充弘 東京都中央区築地二丁目11番24号 ジェイ エスアール株式会社内 (72)発明者 日方 幹雄 東京都中央区築地二丁目11番24号 ジェイ エスアール株式会社内 Fターム(参考) 2G052 AA29 AD06 AD54 BA02 BA21 ED03 JA13 JA16 Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification FI FI Theme Court II (Reference) // G01N 27/447 G01N 27/26 315Z 325B (72) Inventor Tatsushi Tanaka 3-15-14- Yoga, Setagaya-ku, Tokyo 107 (72) Inventor Mitsuhiro Murata 2--11-24 Tsukiji, Chuo-ku, Tokyo Inside JSR Corporation (72) Inventor Mikio Hikami 2-11-11 Tsukiji 2-chome, Chuo-ku, Tokyo FSR term inside (Reference) 2G052 AA29 AD06 AD54 BA02 BA21 ED03 JA13 JA16
Claims (7)
有する可能性のある試料に、標的物質を吸着することの
できる吸着体を接触させた後、前記試料中から前記吸着
体を分離し、次に吸着体に結合した標的物質の検出を行
うことを特徴とする標的物質検出方法。An adsorbent capable of adsorbing a target substance is brought into contact with a sample containing a plurality of analytes and possibly containing a target substance, and then the adsorbent is separated from the sample. And then detecting a target substance bound to the adsorbent.
項1に記載の標的物質検出方法。2. The method for detecting a target substance according to claim 1, wherein the sample is a body fluid.
またはタンパク質であることを特徴とする請求項1また
は2に記載の標的物質検出方法。3. The method for detecting a target substance according to claim 1, wherein the target substance is a virus, a nucleic acid, an antigen, an antibody or a protein.
が、粒子状、フィルター状、繊維状、シート状、チュー
ブ状または板状であることを特徴とする請求項1、2ま
たは3に記載の標的物質検出方法。4. The adsorbent capable of adsorbing a target substance is in the form of a particle, a filter, a fiber, a sheet, a tube, or a plate. Target substance detection method.
が、有機ポリマー、無機ポリマー、無機化合物または天
然高分子からなることを特徴とする請求項1〜4のいず
れか1項に記載の標的物質検出方法。5. The target according to claim 1, wherein the adsorbent capable of adsorbing the target substance comprises an organic polymer, an inorganic polymer, an inorganic compound or a natural polymer. Substance detection method.
疫化学測定法で行うことを特徴とする請求項1〜5のい
ずれか1項に記載の標的物質検出方法。6. The target substance detection method according to claim 1, wherein the target substance is detected by a nucleic acid amplification method or an immunochemical measurement method.
いることを特徴とする吸着体。7. An adsorbent used for the detection method according to claim 1.
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JP2007535933A (en) * | 2004-05-03 | 2007-12-13 | ハンディーラブ インコーポレイテッド | Processing of samples containing polynucleotides |
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-
2001
- 2001-04-13 JP JP2001115968A patent/JP2002116120A/en active Pending
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