JP2002045176A - Method for concentrating virus - Google Patents

Method for concentrating virus

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JP2002045176A
JP2002045176A JP2001143036A JP2001143036A JP2002045176A JP 2002045176 A JP2002045176 A JP 2002045176A JP 2001143036 A JP2001143036 A JP 2001143036A JP 2001143036 A JP2001143036 A JP 2001143036A JP 2002045176 A JP2002045176 A JP 2002045176A
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JP
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virus
particles
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nucleic acid
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Application number
JP2001143036A
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Japanese (ja)
Inventor
Mikio Hikata
Mitsuhiro Murata
Kouei Satou
Kenji Tanaka
功栄 佐藤
幹雄 日方
充弘 村田
建志 田中
Original Assignee
Jsr Corp
Tit:Kk
ジェイエスアール株式会社
有限会社ティーアイーティー
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for concentrating virus in a specimen. SOLUTION: This method for concentrating virus is characterized by comprising a step wherein particles are added to a specimen which may contain virus, the virus, if any, is bound to the particles, and the resulting particles are collected using a filter.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、検体中のウイルスを濃縮するウイルス濃縮方法に関する。 The present invention relates to relates to virus concentration method for concentrating the virus in a specimen.

【0002】 [0002]

【従来の技術】ウイルスはヒトや動植物のさまざまな病気の原因の一つであり、その検査・診断のためには原因ウイルスの確認が非常に重要である。 BACKGROUND OF THE INVENTION virus is one of the causes of various diseases of humans, animals and plants, the confirmation of the causative virus is for the testing and diagnosis is very important. 従来のウイルス検査・診断法としては、ウイルス抗原あるいは抗ウイルス抗体の免疫学的測定が一般的である。 Conventional viral testing and diagnostic methods, immunological determination of viral antigens or anti-virus antibodies are common. しかしながら、ウイルス感染から数週間から数ヶ月は、ウイルス量あるいは抗ウイルス抗体量が少ないため、これらの免疫学的測定法では検出できない場合がある。 However, weeks to months from a viral infection, since a small amount of virus or anti-virus antibody amount may not be detected by these immunoassay. この検出不可能な期間はウインドウ・ピリオド(空白期間)と呼ばれており、このような患者が献血を行った場合、その献血液は十分な感染性を持つことが多く、不特定多数の輸血患者・血液製剤利用患者に危険をおよぼす可能性がある。 The undetectable period is called the window period (blank period), if such a patient has performed a blood donation, the donation solution is often of sufficient infectivity, unspecified number of transfusions there is a possibility on the danger to patients and blood products available patient. したがって、ウインドウ・ピリオドをできる限り短縮するため、免疫学的測定限界下のウイルスを高感度に検出できる技術の開発が急務とされている。 Therefore, in order to shorten as much as possible the window period, the development of technology that can detect virus under immunological detection limit in high sensitivity has been a pressing need.

【0003】近年、ポリメラーゼチェインリアクション法(以下PCR法)に代表される、核酸増幅技術により、極微量のウイルスでも検出できる可能性が開けてきた。 In recent years, as typified by the polymerase chain reaction (hereinafter PCR) method, the nucleic acid amplification technology, have the potential to detect opened in trace amounts of the virus. しかしながら、PCR法などによっても極微量のウイルス検出は特殊な施設と高度な技術が必要とされ、一般的な施設で簡便に実施することはきわめて困難である。 However, pole virus detection of traces of the PCR method or the like is required special facilities and advanced technology, it is extremely difficult to conveniently implemented in a general facility. そこで、これらの問題解決のため、検体中のウイルスを濃縮する手法が用いられている。 Therefore, for solving these problems, a method of concentrating virus in a specimen are used.

【0004】従来のウイルス濃縮法の代表例としては超遠心法が挙げられるが、高価な機器と長時間を要し、かつ同時に多数の検体を処理することは困難であり簡便な方法とは言い難い。 [0004] Representative examples of traditional virus concentration methods include ultracentrifugation, requires expensive equipment and long, and say that is difficult simple method to process many samples simultaneously hard. また、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBs抗原)がヘパリンと結合する性質から、ヘパリンセファロース担体によるクロマトグラフィー法も報告されているが、これも同時に多数の検体を処理することは困難である。 Furthermore, the nature of the hepatitis B virus surface antigen (HBs antigen) binds to heparin, it has been reported chromatographic methods with heparin sepharose carrier, which is also difficult to process many samples simultaneously. その他、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコール、ポリアニオンと2価イオンの組み合わせ等によりウイルスを沈殿させる方法があるが、混合する試薬にPCR阻害がある等の問題からウイルスの沈殿分離後の検体精製が必要であるという難点があった。 Other, ammonium sulfate or polyethylene glycol, that there is a method of precipitating the virus by such a combination of polyanion and a divalent ion, it is necessary sample purification after precipitation virus isolation from problems such as there is a PCR inhibition reagent mixing there was a drawback.

【0005】 [0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記のウイルス濃縮法の問題点を解決し、簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便に処理することができ、自動化への対応も容易で、核酸増幅検査に悪影響を及ぼさないウイルス濃縮方法を提供することにある。 OBJECTS OF THE 0008] The present invention is to solve the problems of the virus concentration method described above, by simple means, it can be processed easily many samples simultaneously, also corresponding to the automation easy to provide a virus concentration methods which do not adversely affect the nucleic acid test.

【0006】 [0006]

【発明を解決するための手段】本発明者らは研究の結果、上記課題を解決する手段として、次のウイルス濃縮方法を開発するに到った。 The present inventors have invented a means for solving] The findings, as means for solving the above problems, led to the development of the next viral concentration method. 即ち、本発明は、ウイルスを含有する可能性のある検体に粒子を添加し、ウイルスを前記粒子に結合させた後、フィルターにより前記粒子を回収する工程を含むことを特徴とするウイルス濃縮方法を提供するものである。 That is, the present invention is the addition of particles to the sample which may contain a virus after binding the virus to the particles, the virus concentration method which comprises the step of recovering the particles by a filter it is intended to provide.

【0007】 [0007]

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明において、粒子とは、血液や体液等の検体中のウイルを吸着した後、分離・濃縮するウイルス濃縮用粒子であり、当該粒子により分離・濃縮されたウイルスは核酸抽出・検査・診断、特に核酸増幅を伴う検査・診断に用いられる。 In the present invention, the particles, after having adsorbed viruses in a specimen such as blood and body fluid, a virus concentration for particles to separate and concentrate viruses isolated, concentrated by the particles nucleic acid extraction, examination and diagnosis, particularly used in testing and diagnosis with a nucleic acid amplification. 本発明方法によるウイルス濃縮の対象となる検体としては、血漿、血清、細胞破砕液、尿、唾液等の各種体液、培養細胞破砕液等を挙げることができる。 The subject to sample the virus concentration by the method of the present invention can include plasma, serum, cell lysate, urine, various body fluids such as saliva, the culture cell lysate or the like.
このような検体はそのまま検体として使用されてもよいし、何らかの目的で希釈などされた状態で検体として使用されてもよい。 Such analytes may be directly used as a sample, it may be used as a sample in a state of being like diluted for some purposes. また、濃縮できるウィルスとしては、 In addition, as the virus can be concentrated,
例えばヘパドナウイルス(B型肝炎ウイルス等)、アデノウイルス、フラビウイルス(日本脳炎ウイルス等)、 For example Hepadnaviruses (B hepatitis virus, etc.), adenoviruses, flaviviruses (Japanese encephalitis virus, etc.),
ヘルペスウイルス、(単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス等)、ポックスウイルス、パルボウイルス(アデノ関連ウイルス等)、オルソミクソウイルス(インフルエンザウイルス等)、ラブドウイルス(狂犬病ウイルス等)、 Herpes virus, (herpes simplex virus, varicella - zoster virus, cytomegalovirus, EB virus, etc.), pox virus, parvo virus (adeno-associated virus, etc.), Orthomyxoviridae (influenza virus, etc.), rhabdovirus (rabies virus, etc. ),
レトロウイルス(後天性免疫不全症候群ウイルス等)、 Retroviruses (such as acquired immune deficiency syndrome virus),
C型肝炎ウイルス等を挙げることができる。 Mention may be made of the hepatitis C virus and the like.

【0008】本発明で使用することのできる粒子は、ポリマー、無機化合物、天然多糖類およびこれらが複合化されたものなどであるが、いずれも水不溶性であることが必要である。 [0008] particles that can be used in the present invention, a polymer, an inorganic compound, natural polysaccharides and these and the like which are prepared by combining, it is necessary that both are water-insoluble. 粒子の表面は必要に応じてアニオン性基、カチオン性基などを有し、さらに磁性体を含有していてもよい。 Surface may optionally anionic groups on the particle, have such a cationic group, may further contain a magnetic material. 本発明で好ましい粒子としては磁性体を含有するポリマー粒子に1級アミノ基、2級アミノ基、3 Preferred particles according to the invention primary amino groups in the polymer particles containing a magnetic material, secondary amino group, 3
級アミノ基、第4級アンモニウム基、イミノ基、アミジノ基、イミジノ基、ヒドラジノ基、及び含窒素環式基からなる群から選ばれる基を含有するアミン化合物を固定化した粒子である。 Grade amino group, quaternary ammonium group, an imino group, amidino group, imidino group, a hydrazino group, and immobilized particles amine compound containing a group selected from the group consisting of nitrogen-containing cyclic group. 本発明において使用される粒子の平均粒径は0.08〜300μmであるが、特に本発明の方法は平均粒径が5μm以下の粒径の粒子を使用する場合に適している。 The average particle diameter of the particles used in the present invention is a 0.08~300Myuemu, especially the method of the present invention is suitable for the case where the average particle diameter of particles are used following particle size 5 [mu] m. また、粒子形状はまったく限定されず、球状などの一定形状でもよいし、不定形の粒子の集まりであってもよい。 The particle shape is not at all limited, it may be constant shape such as spherical, or may be a collection of amorphous particles. なお球状でない粒子の粒径は各粒子の最長径と最短径との平均値をとるものとする。 Note the particle size of non-spherical particles is assumed to take the average value of the longest diameter and the shortest diameter of each particle.

【0009】本発明の粒子の使用割合は、検体に含まれているウイルス濃度および粒子の形状にもよるが、検体の通常0.001〜50重量%、好ましくは0.005〜10重量%である。 [0009] The ratio of the particles of the present invention, depending on the shape of the virus concentration and particle contained in the sample, usually 0.001 to 50 wt% of the sample, preferably 0.005 to 10% by weight. 粒子の使用量が少なすぎると、粒子に吸着できるウイルスの数が限られるため濃縮効率が悪化する。 When the amount of the particles is too small, it exacerbated enrichment efficiency due to limited number of viruses that can be adsorbed on the particles. また、添加量が多すぎると、吸着したウイルスを後段階で脱離させるのに多量の脱離液が必要となり濃縮効率が低下する。 A larger amount of, a large amount of releasing liquid to desorb at the rear stage adsorbed virus requires concentration efficiency is lowered.

【0010】検体中のウイルスを吸着した粒子は、検体から分離されるが本発明では、この工程においてフィルターを用いることを特徴とする。 [0010] particles with adsorbed virus in a sample, which is separated from the specimen in the present invention, is characterized by using a filter in this step. 本発明で用いることのできるフィルターとしては、最大孔径が用いる粒子の粒径より小さいこと、好ましくは最大孔径が0.1μ〜5 The filter can be used in the present invention, the maximum pore diameter is smaller than the size of the particles to be used, preferably the maximum pore diameter 0.1μ~5
0μの範囲にあるフィルタ−であり、平膜、中空糸膜、 Filter in the range of 0Myu - a is a flat membrane, hollow fiber membrane,
不織布、織布などを例示できる。 Nonwoven, woven fabric or the like can be exemplified. 検体が血漿や培養液などの場合は、最大孔径が0.1μ〜5μ が好ましく、 If such sample plasma and culture medium, the maximum pore size is preferably 0.1Myu~5myu,
細胞などが含まれる場合は、最大孔径が、5〜50μが好ましい。 If etc. cells, maximum pore diameter, 5~50Myu is preferred. 最大孔径が0.1μ以下だと、孔径が小さくなるため十分な濾過量が得られなくなるからである。 If the maximum pore diameter but less 0.1 [mu], because sufficient filtration rate for pore diameter decreases can not be obtained. また、孔径が0.1μ以下だとサイズにより捕捉されるウイルスもある。 There is also a virus pore size are captured by the size that it less 0.1 [mu]. 本発明のフィルタ−の透水量は、10ml Filter of the present invention - water permeability of, 10ml
/min/m 2 /mmHg 以上、好ましくは100ml/min/ m 2 /m / min / m 2 / mmHg or more, preferably 100ml / min / m 2 / m
mHg 以上であることが、濾過圧を低くできるため好ましい。 It is preferable because it can reduce the filtration pressure is mHg or more.

【0011】また、不織布状の基材の場合、フィルタ− [0011] In the case of nonwoven substrates, filters -
材を形成するフィラメントは、モノフィラメントであってもマルチフィラメントであってもよいが、平均直径が100μm以下、好ましくは、50μm以下であると、 Filaments forming the timber may be a multifilament be monofilament, but the average diameter is 100μm or less, preferably, if it is 50μm or less,
膜の表面積が大きくなり吸着部位が増加することとなるため好ましい。 Preferred for the the surface area of ​​the film becomes adsorption sites is greatly increased. さらに、フィルタ−の空孔部の割合(空孔率)は、20%以上、好ましくは50%以上である。 Further, the filter - cavity ratio of the (porosity) is preferably 20% or more, preferably 50% or more.
基材の材質は、特に限定されず、セルロ−スやその誘導体などの天然高分子、あるいはポリオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリサルホン、ポリアクリルニトリルなどの高分子材料を例示できるが、好ましくは、寸法安定性に優れ水に対して低膨潤性の材料、たとえばポリプロピレンやポリフッ化ビニリデンなどにより基材膜が構成されており、表面処理により親水性フィルタ−に改質されているものが好ましい。 The material of the substrate is not particularly limited, cellulose - natural polymers such as scan and their derivatives, or polyolefin, polyamide, polyimide, polyurethane, polyester, polysulfone, can be exemplified a polymer material such as polyacrylonitrile, preferably is low swelling material for outstanding water dimensional stability, for example base film by such as polypropylene and polyvinylidene fluoride is configured, hydrophilic filter by surface treatment - what is modified in a preferred .

【0012】本発明では検体を上記のようなフィルターと接触させることにより、ウイルスを吸着した粒子をフィルターにより回収することができる。 [0012] The analyte in the present invention by contacting with the filter as described above, the adsorbed particles virus can be recovered by the filter.

【0013】次いで、フィルターにより分離された粒子からウイルスを分離する方法としては、塩溶液を作用させるなどの方法により、粒子とウイルスとを解離させる。 [0013] Then, as a method of separating viruses from the particles separated by the filter, by a method such as the action of the salt solution, to dissociate the particles and viruses. 塩溶液としては高濃度の臭化カリウム、臭化ナトリウム、1.5M塩化ナトリウム、1mMリンタングステン酸等を用いることができる。 The salt solution may be to use a high concentration potassium bromide, sodium bromide, 1.5M NaCl, 1mM phosphotungstic acid.

【0014】本発明の方法により濃縮されたウイルスは核酸増幅検査を始め、その他の免疫学的検査に供することができる。 [0014] Virus concentrated by the method of the present invention began nucleic acid test, it can be subjected to other immunoassay. 例えば、ウィルスの核酸増幅検査の場合、 For example, if the nucleic acid test virus,
まず、ウィルスから核酸を抽出する。 First, to extract the nucleic acids from the virus. 核酸の抽出は分離されたウイルスに少量の緩衝液を加え、加熱する方法または市販されている核酸抽出試薬を直接添加してウイルスの核酸を抽出する方法などにより行うことが可能である。 The nucleic acid extraction small buffer was added to the separated virus, it can be performed by a method of a method or a nucleic acid extraction reagent which is commercially available directly added to extract the nucleic acids of the virus to heat. この核酸抽出は、ウイルスが粒子に結合したままでも行うことができる。 The nucleic acid extraction, the virus can be carried out whilst remaining bound to the particles. ウイルスの核酸増幅検査(NA Nucleic acid test virus (NA
T; nucleic acid amplification test)の方法は特に限定されず、例えば、ロシュ社のPCR(Polymerizatio T; nucleic acid methods Amplification test) is not particularly limited, for example, Roche PCR (Polymerizatio
n chain reaction)法、ジェン・プローブ社のTMA(Tr n chain reaction) method, Gen-Probe's TMA (Tr
anscription Mediated amplification-hybridization p anscription Mediated amplification-hybridization p
rotection assay)法、アボット社のLCR(Ligase chai rotection assay) method, Abbott of the LCR (Ligase chai
n reaction)法等を利用することができる。 It is possible to use the n reaction) method, or the like. このウイルス濃縮方法を利用したウイルス検出法では、核酸増幅検査に供される検体中のウイルスが既に濃縮されているので、元の検体または検体に含まれているウイルスが極く微量であっても効率的にウイルスの検出を行うことができる。 This virus concentration method virus detection method utilizing, since the virus in a sample to be subjected to nucleic acid test is already concentrated, also viruses contained in the original specimen or sample is a trace amount efficiently it can detect the virus.

【0015】 [0015]

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、 EXAMPLES Hereinafter, a description will be given of an embodiment of the present invention,
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 The present invention is not limited to these examples. なお、粒子の粒径の測定および粒子表面に存在するアニオン性基の存在量は次のようにして測定した値である。 Incidentally, the abundance of anionic groups present in the measurement and the particle surface of the particle size of the particles is a value measured as follows. -
粒径の測定:粒子粒径は光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡または透過型電子顕微鏡により写真撮影を行い200個の粒子の粒径を測定し、その平均値を求めた。 Particle size measurements: particle diameter is an optical microscope, a scanning electron microscope or a transmission electron microscope to measure the particle diameter of 200 particles were photographed, and the average value was calculated.

【0016】 磁性カルボン酸粒子の調製油性磁性流体「フェリコロイドHC50」〔タイホー工業(株)製〕にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体(粒子径:0.01 [0016] After the preparation of the magnetic carboxylic acid particles oily magnetic fluid "ferrimagnetic colloidal HC50" [Taiho Kogyo Co.] particles by adding acetone to precipitate precipitated by dried, the lipophilic treatment ferritic superparamagnetic material having a surface (particle diameter: 0.01
μm)を得た。 μm) was obtained. 超常磁性体40部に、シクロヘキシルメタクリレート95部、メタクリル酸5部およびベンゾイルペルオキシド(重合開始剤)3部を添加し、この系を混合攪拌することにより超常磁性体を均一に分散させてモノマー組成物を調製した。 40 parts of superparamagnetic, 95 parts of cyclohexyl methacrylate, methacrylic acid 5 parts of benzoyl peroxide (polymerization initiator) 3 parts were added, the system uniformly dispersing superparamagnetic material by the stirring and mixing with the monomer composition It was prepared. 一方、ポリビニルアルコール10部、ラウリル酸ナトリウム0.05部およびポリエチレオキシドノニルフェニルエーテル0.1部を水1 On the other hand, 10 parts of polyvinyl alcohol, 0.05 part of sodium laurate and polyethylene 0.1 part les oxide nonylphenyl ether Water 1
000部に溶解して水性媒体を調製した。 It was prepared aqueous medium and dissolved in 000 parts. 得られた水性媒体(水相)中に上記のモノマー組成物を添加し、この系を、ホモミキサーで予備攪拌した後、超音波分散機で分散処理することにより、平均粒子径が2μmの油滴(油相)が水性媒体に分散されてなる懸濁液(油滴分散体)を調製した。 Was added to the obtained above monomer composition in an aqueous medium (aqueous phase), after the system was pre-stirred by a homomixer, by dispersing with an ultrasonic dispersing machine, an average particle diameter of 2μm oil droplets (oil phase) was prepared suspension is dispersed in an aqueous medium (oil droplet dispersion). 次いで、得られた懸濁液を、容量2リットルの攪拌機付三つ口フラスコ内に仕込み、この系を75℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しながら5 Then, the resulting suspension was charged into 2-liter stirrer-equipped three-neck flask, heated the system to 75 ° C., with stirring in a nitrogen atmosphere 5
時間にわたって、油滴中のモノマーを重合(懸濁重合) Over time, polymerization of the monomer in the oil droplets (suspension)
させることにより、本発明の磁性ポリマー粒子が水性媒体中に分散されてなる平均粒径2.0μmの磁性粒子分散体(磁性ポリマーラテックス)を調製した。 By, magnetic polymer particles of the present invention has magnetic particle dispersion having an average particle size of 2.0μm which is dispersed in an aqueous medium (magnetic polymer latex) was prepared. 得られた粒子を5mM水酸化ナトリウム水溶液に分散し、80 The obtained particles were dispersed in 5mM aqueous solution of sodium hydroxide, 80
℃、12時間処理して、表面カルボン酸粒子を得た。 ° C., was treated for 12 hours to obtain surface-carboxylic acid particles. 次に、得られた表面カルボン酸粒子1gを水50gに分散し、抗HBV抗体10mgを加え、37℃で2時間反応後、冷水で洗浄し、ウィルス濃縮用粒子を得た。 Next, the obtained surface-carboxylic acid particles 1g dispersed in water 50 g, the anti-HBV antibody 10mg added and after 2 hours at 37 ° C., washed with cold water, to give virus-concentrating particles.

【0017】 実施例1 (1)上記で得られたウィルス濃縮用粒子の水分散体を精製後、生理食塩水で固形分濃度5重量%に調製した。 [0017] was prepared aqueous dispersion of Example 1 (1) obtained above viral concentrating particles after purification, the solid content concentration of 5 wt% with saline. (2)HBVを1×10 5コピー/ml含有するヒト血漿を、ウイルスDNA陰性血漿を用いて段階的に希釈し、HBVを10 4 〜1 (2) a 1 × 10 5 copies / ml human plasma containing HBV, serially diluted using a viral DNA-negative plasma, HBV 10 4 to 1
0 1コピー/mlで含有する試料を調製した。 0 Samples containing prepared in 1 copy / ml. この試料5mlに上記(1)で調製した粒子懸濁液(5重量%)100μLおよび1M酢酸亜鉛水溶液100μLを加え、室温で10分間攪拌し、ウイルス吸着処理を行った。 The sample 5ml above (1) prepared particle suspension (5 wt%) 100 [mu] L and 1M aqueous zinc acetate solution 100 [mu] L was added, and stirred for 10 minutes at room temperature, was subjected to virus adsorption process. ウイルス吸着処理後、磁気分離スタンドにセットし、粒子と上清を分離し、上清を除去した。 After virus adsorption treatment was set in a magnetic separation stand, the particles were separated and supernatant and the supernatant was removed. (3)このウイルスを吸着した粒子に、1 mol/lのチオシアン酸ナトリウム水溶液100μLを添加してウイルスを粒子から解離させた。 (3) the adsorbed particles the virus, and the virus was added to 1 mol / l sodium thiocyanate aqueous solution 100μL of dissociated from the particles. この粒子とウイルスの懸濁液を、孔径0.45μmの遠心ろ過フィルター(ウルトラフリーC3 HV:商品名、ミリポア社製)でろ過し、粒子をろ別した。 The suspension of the particles and viruses, centrifugal filtration filter having a pore size of 0.45 [mu] m (Ultrafree C3 HV: trade name, manufactured by Millipore) and filtered through and by the particles by filtration. (4)上記(3)で得られたろ液から、スマイテストEX (4) from the resulting filtrate in (3), SMITEST EX
R&D(商品名、ゲノムサイエンス研究所)を用いて、付属の手順書に従い核酸を抽出した。 R & D (product name, Genome Science Laboratories) was used to extract the nucleic acid in accordance with instructions provided with. 実施例2 (1)実施例1(2)で得たウイルスを吸着したウィルス濃縮用粒子に、スマイテストEX R&Dから蛋白希釈液40 Example 2 (1) Example 1 (2) virus virus concentration for particles with adsorbed obtained by, SMITEST EX R & protein diluent 40 from D
0μLを加えて、55℃で30分インキュベートしてウイルスを溶解し、ウイルス核酸を溶液状態にした。 Adding 0MyuL, and incubated for 30 minutes at 55 ° C. to dissolve the virus was the viral nucleic acid in solution. (2)上記(1)で得たウイルス核酸とウィルス濃縮用粒子との混合液を、孔径0.45μmの遠心ろ過フィルター(ウルトラフリーC3 HV:商品名、ミリポア社製)でろ過し、粒子をろ別した。 (2) above the liquid mixture of viral nucleic acids and viral concentrate particles obtained in (1), centrifugal filtration filter having a pore size of 0.45 [mu] m (Ultrafree C3 HV: trade name, manufactured by Millipore) and filtered, the filtrate the particles another was. (3)上記(2)で得られたろ液に、スマイテストEX R (3) to the filtrate obtained in the above (2), SMITEST EX R
&Dから蛋白溶解液250μLを加え、55℃で30分インキュベートし、以下、付属の手順書に従って核酸を抽出した。 & D added protein lysates 250μL from and incubated for 30 minutes at 55 ° C., less, nucleic acids were extracted according to the instructions provided with.

【0018】実施例3 (1)実施例1(2)で得たウイルスを吸着したウィルス濃縮用粒子に、スマイテストEX R&Dから蛋白希釈液40 [0018] Example 3 (1) Example 1 virus virus concentration for particles with adsorbed obtained in (2), SMITEST EX R & protein diluent 40 from D
0μLを加えて、55℃で30分インキュベートしてウイルスを溶解し、ウイルス核酸を溶液状態にした。 Adding 0MyuL, and incubated for 30 minutes at 55 ° C. to dissolve the virus was the viral nucleic acid in solution. (2)上記(1)で得られたウイルス核酸とウィルス濃縮用粒子との混合液に、エタノール300μLを添加し、 (2) in a mixture of the resulting viral nucleic acid and virus concentration for particles in the above (1), ethanol was added 300 [mu] L,
キアゲン社製、DN easy Tissue Kit(商品名)に付属のシリカマトリクスフィルターにアプライし、6000ラgで1 Qiagen, was applied to a silica matrix filter that comes with the DN easy Tissue Kit (trade name), 1 in 6000 La g
分間遠心して核酸をフィルターに吸着させた。 Centrifugation was adsorbed nucleic acid to the filter min. その後、 after that,
フィルターをKitに付属の洗浄液で2回洗浄し、蒸留水1 Filters were washed twice with wash solution supplied with the the Kit, distilled water 1
00μLでフィルターに吸着した核酸を溶出させ、この溶出液を再度フィルターにアプライして核酸を溶出させ、 Eluted the nucleic acid adsorbed to filters 00MyuL, eluted nucleic acids was applied to the eluate again filter,
凍結乾燥することにより核酸を得た。 To obtain a nucleic acid by lyophilization.

【0019】比較例1 HBVを10 4 〜10 1コピー/mlで含有する血漿検体100μLから、スマイテストEX R&Dを用いて核酸を抽出した。 [0019] From plasma samples 100μL containing in Comparative Example 1 HBV 10 4 ~10 1 copy / ml, nucleic acids were extracted with SMITEST EX R & D. 上記実施例1〜3、比較例1で得られた抽出物をPCR法により、35回のPCRの増幅過程によりDNAを増幅した。 Examples 1-3 above, by the PCR method The resultant extract in Comparative Example 1, was amplified DNA by 35 times the course of PCR amplification. PCR PCR
のプライマー配列は、Hiroaki Okamoto, Igakuno ayum Primer sequences of, Hiroaki Okamoto, Igakuno ayum
i, (1992),162(9), PP544-549.に従った。 i, (1992), 162 (9), according to the PP544-549.. 得られたPCR The resulting PCR
の増幅産物を3%アガロースを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色によりDNAを可視化しポラロイド(登録商標)写真に撮影した。 The amplification product using 3% agarose subjected to electrophoresis, the DNA was taken to visualize Polaroid photos by ethidium bromide staining. 得られた目的DNAの量をバンドの蛍光強度から、-,+,++,+++の4段階で判定した。 The amount of the obtained target DNA from the fluorescence intensity of the band, -, +, ++, was determined in four steps +++. 結果を表1(実施例1)、表2(実施例2)、表3 Results Table 1 (Example 1), Table 2 (Example 2), Table 3
(実施例3)および表4(比較例1)に示す。 (Example 3) and Table 4 (Comparative Example 1).

【0020】 [0020]

【表1】 [Table 1]

【0021】 [0021]

【表2】 [Table 2]

【0022】 [0022]

【表3】 [Table 3]

【0023】 [0023]

【表4】 [Table 4] 比較例では、ウイルス核酸の陽性を判定するには、1×1 In the comparative example, the determines positive viral nucleic acid, 1 × 1
0 3コピー/ml以上のウイルス濃度の検体である必要があったが、本発明の方法を用いることにより、実施例1〜 0 3 but had to be subject of a virus concentration of more copies / ml, by using the method of the present invention, Examples 1
3で示されたように、1×10 1コピー/ml以上のウイルス濃度の検体からウイルス核酸を検出することが出来た。 As shown in 3, it was able to detect the viral nucleic acid from a sample of 1 × 10 1 copies / ml or more viral concentration.

【0024】 [0024]

【発明の効果】本発明のウイルス濃縮材料は、ウイルスの認識・分離(除去)・濃縮などに使用することができるため、食品工業、発酵工業、医薬品工業を初めとした産業界で広く実用可能な材料である。 Virus concentrated material of the present invention according to the present invention, since it can be used for the recognition and separation (removal) and concentration of the virus, the food industry, the fermentation industry, widely practical at the beginning and the industry to the pharmaceutical industry is such material. また、血漿などの蛋白質成分を含む溶液中でもウイルスを認識できるため、医療や生活現場におけるウイルス汚染やウイルス感染の防止、治療、診断などに有効である。 Further, since it recognizes the virus even in a solution containing a protein component, such as blood plasma, the prevention of viral contamination and viral infections in healthcare and life scene, therapy, diagnosis is effective for such. 本発明のウイルス濃縮材料が粒子状である場合、遠心分離や磁気を作用させる簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便に濃縮処理することのができ、しかも得られた濃縮ウイルスを含む試料は核酸増幅の処理に悪影響を及ぼさない。 When the virus concentration material of the invention is a particulate, by a simple means for applying a centrifugation or magnetic, can that be easily concentrated processing many samples simultaneously, yet the resulting sample containing concentrated virus It does not adversely affect the process of nucleic acid amplification.
この粒子を利用するウイルス濃縮方法は、極く微量のウイルスを含む検体からウイルスを効率良く短時間で濃縮することができ、その結果ウイルスをより高精度で検出することができる。 Virus concentration method utilizing the particles can be concentrated virus from specimens containing viruses trace amount efficiently in a short time, it is possible to detect the results viruses with higher accuracy. また、本発明の粒子は検体よりウィルスを吸着した後、免疫化学的測定に供することもできる。 The particle of the present invention, after having adsorbed viruses from the sample may be subjected to immunochemical assay. また、多孔質膜として用いた場合、取り扱いが容易であり、しかもウイルスに対して選択的な相互作用を有し、簡便で処理速度に優れている。 Furthermore, when used as a porous film, it is easy to handle, yet has a selective interaction with the virus, has excellent simple and the processing speed.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日方 幹雄 東京都中央区築地二丁目11番24号ジェイエ スアール株式会社内 (72)発明者 佐藤 功栄 茨城県猿島郡総和町大字下大野字高谷2965 −37 (72)発明者 田中 建志 東京都世田谷区用賀3−15−14−107 Fターム(参考) 4B065 AA95X BD14 BD21 CA46 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (72) inventor Date Mikio Ho, Chuo-ku, Tokyo Tsukiji chome No. 11 No. 24 Jeie Suaru within Co., Ltd. (72) inventor Sato IsaoSakae Ibaraki Prefecture Sashima District sum-cho Oaza Shimoono character Takaya 2965 -37 (72) inventor Tanaka Takeshi Tokyo Setagaya-ku, Yoga 3-15-14-107 F-term (reference) 4B065 AA95X BD14 BD21 CA46

Claims (2)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 ウイルスを含有する可能性のある検体に粒子を添加し、ウイルスを前記粒子に結合させた後、フィルターにより前記粒子を回収する工程を含むことを特徴とするウイルス濃縮方法。 [Claim 1] was added to the particles in the sample that may contain viruses, after binding the virus to the particle, the virus concentration method which comprises the step of recovering the particles by a filter.
  2. 【請求項2】 粒子の粒径が0.08〜300μmであることを特徴とする請求項1記載の濃縮方法。 2. A method for concentrating claim 1, wherein the particle size of the particles is characterized in that it is a 0.08~300Myuemu.
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