JP2002112774A - 海苔赤腐れ病病原菌の検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチド - Google Patents
海苔赤腐れ病病原菌の検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】海苔赤腐れ病病原菌の検出または菌種同定を発
生初期の段階で簡便、迅速に、かつ確実に行う。 【解決手段】赤腐れ病病原菌Pythium porphyraeおよびP
ythium marinumから全ＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡ塩基
配列中で種特異性の高いリボソーム構造遺伝子（rＤＮ
Ａ）、すなわち、5.8S rＤＮＡを含むinternal transcr
ibed spacer（ITS）領域のＤＮＡ塩基配列を決定し、そ
れを基にして赤腐れ病病原菌に特異的なＰＣＲ用オリゴ
ヌクレオチドプライマーＰＰ−１（５’−ＴＧＴＧＴＴ
ＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＴＣＧ−３’）およびＰＰ−２
（５’−ＣＣＣＡＡＡＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣ−
３’）を作成した。これらプライマーを用いたＰＣＲ法
により、上記赤腐れ病病原菌を迅速且つ確実に検出、同
定する。
生初期の段階で簡便、迅速に、かつ確実に行う。 【解決手段】赤腐れ病病原菌Pythium porphyraeおよびP
ythium marinumから全ＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡ塩基
配列中で種特異性の高いリボソーム構造遺伝子（rＤＮ
Ａ）、すなわち、5.8S rＤＮＡを含むinternal transcr
ibed spacer（ITS）領域のＤＮＡ塩基配列を決定し、そ
れを基にして赤腐れ病病原菌に特異的なＰＣＲ用オリゴ
ヌクレオチドプライマーＰＰ−１（５’−ＴＧＴＧＴＴ
ＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＴＣＧ−３’）およびＰＰ−２
（５’−ＣＣＣＡＡＡＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣ−
３’）を作成した。これらプライマーを用いたＰＣＲ法
により、上記赤腐れ病病原菌を迅速且つ確実に検出、同
定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は海苔赤腐れ病病原菌
P.porphyrae及びP.marinumを迅速、簡便かつ確実に検
出、同定するためのオリゴヌクレオチド、及びこれを使
用した上記病原菌の検出方法に関するものである。
P.porphyrae及びP.marinumを迅速、簡便かつ確実に検
出、同定するためのオリゴヌクレオチド、及びこれを使
用した上記病原菌の検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】海苔赤腐れ病はPythium属藻菌類に属す
る病原菌によって引き起こされ、海苔漁場に広く発生し
て品質や収量を低下させ、甚しい被害を引き起こす病気
の一つである。この病気は海苔葉体の所々に丸みのある
赤錆色の病斑が認められることによって初めて気づくこ
とが多い。気づいた時点で海苔網を空気中に長時間晒し
たり、酸処理を施したりするという対策を行うことにな
るが、現在のところ、赤腐れ病に対する有効な防除法は
見つかっていない。従って、海苔赤腐れ病の防除対策の
ためには、病気発生をより早く知ることが最も重要なこ
ととなる。
る病原菌によって引き起こされ、海苔漁場に広く発生し
て品質や収量を低下させ、甚しい被害を引き起こす病気
の一つである。この病気は海苔葉体の所々に丸みのある
赤錆色の病斑が認められることによって初めて気づくこ
とが多い。気づいた時点で海苔網を空気中に長時間晒し
たり、酸処理を施したりするという対策を行うことにな
るが、現在のところ、赤腐れ病に対する有効な防除法は
見つかっていない。従って、海苔赤腐れ病の防除対策の
ためには、病気発生をより早く知ることが最も重要なこ
ととなる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】赤腐れ病は感染拡大が
早く、有効な防除法がないため病気発生に気がついた時
点では手後れになる。これまで赤腐れ病の発見は海苔葉
体に病原菌が感染して患部が拡大し視覚的に確認できる
まで困難であった。海苔漁場での病原菌の出現を、如何
にして早期に把握し、その対策を取るかということが、
被害を軽くするために不可欠である。本特許は赤腐れ病
病原菌を迅速に、確実にそして簡便に検出できる方法に
関するものであり、発病以前に発病の可能性を予知する
手段を提供するものである。
早く、有効な防除法がないため病気発生に気がついた時
点では手後れになる。これまで赤腐れ病の発見は海苔葉
体に病原菌が感染して患部が拡大し視覚的に確認できる
まで困難であった。海苔漁場での病原菌の出現を、如何
にして早期に把握し、その対策を取るかということが、
被害を軽くするために不可欠である。本特許は赤腐れ病
病原菌を迅速に、確実にそして簡便に検出できる方法に
関するものであり、発病以前に発病の可能性を予知する
手段を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、海苔漁場
における赤腐れ病病原菌P.porphyraeおよびP.marinumの
早期検出法確立のため、赤腐れ病病原菌に特異的なＤＮ
Ａ塩基配列について種々検討を重ねた結果、赤腐れ病病
原菌の検出および菌種同定に適する本菌株に極めて特異
性の高いＤＮＡ塩基配列を見出し、本発明を完成するに
至った。
における赤腐れ病病原菌P.porphyraeおよびP.marinumの
早期検出法確立のため、赤腐れ病病原菌に特異的なＤＮ
Ａ塩基配列について種々検討を重ねた結果、赤腐れ病病
原菌の検出および菌種同定に適する本菌株に極めて特異
性の高いＤＮＡ塩基配列を見出し、本発明を完成するに
至った。
【０００５】すなわち、本発明は、P.porphyraeまたは
P.marinumの全ＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡ塩基配列中
で種特異性の高いリボゾーム構造遺伝子（rＤＮＡ）、
すなわち、5.8S rＤＮＡを含むinternal transcribed s
pacer（ITS）領域のＤＮＡ塩基配列を決定し、それを基
にして赤腐れ病病原菌に特異的なpolymerase chain rea
ction（ＰＣＲ）用オリゴヌクレオチドプライマーを作
成し、このプライマーを用いてＰＣＲ法により赤腐れ病
病原菌P.porphyraeおよびP.marinumを検出・同定するも
のである。
P.marinumの全ＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡ塩基配列中
で種特異性の高いリボゾーム構造遺伝子（rＤＮＡ）、
すなわち、5.8S rＤＮＡを含むinternal transcribed s
pacer（ITS）領域のＤＮＡ塩基配列を決定し、それを基
にして赤腐れ病病原菌に特異的なpolymerase chain rea
ction（ＰＣＲ）用オリゴヌクレオチドプライマーを作
成し、このプライマーを用いてＰＣＲ法により赤腐れ病
病原菌P.porphyraeおよびP.marinumを検出・同定するも
のである。
【０００６】したがって本発明は、P.porphyraeまたは
P.marinumのITS領域を含むrＤＮＡ塩基配列とハイブリ
ダイズし得る極めて特異性の高い塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドに関するものであり、さらに、このオリ
ゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用い、ＰＣＲ
法により海苔赤腐れ病病原菌を検出することを特徴とす
る海苔赤腐れ病病原菌の検出方法に関するものであり、
さらにまた、このオリゴヌクレオチド及び内部標準ＤＮ
Ａを用いて競合ＰＣＲ法により海苔赤腐れ病病原菌を定
量する方法に関するものである。
P.marinumのITS領域を含むrＤＮＡ塩基配列とハイブリ
ダイズし得る極めて特異性の高い塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドに関するものであり、さらに、このオリ
ゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用い、ＰＣＲ
法により海苔赤腐れ病病原菌を検出することを特徴とす
る海苔赤腐れ病病原菌の検出方法に関するものであり、
さらにまた、このオリゴヌクレオチド及び内部標準ＤＮ
Ａを用いて競合ＰＣＲ法により海苔赤腐れ病病原菌を定
量する方法に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】赤腐れ病病原菌P.porphyraeおよ
びP.marinumに特異的なＤＮＡ塩基配列を見出すべく、
愛知、福岡、宮城、韓国・莞島産の罹病海苔葉体から分
離した菌株、公的供託株IFO30800およびCBS312.93の菌
株から、Cetyltrimethyl ammonium bromide（CTAB）法
で全ＤＮＡを抽出した。抽出全ＤＮＡを鋳型として菌類
のrＤＮＡ領域を増幅する既知のプライマーITS4，ITS5
を用いたＰＣＲにより、海苔赤腐れ病病原菌のrＤＮＡ
を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片を回収してrＤＮＡ領
域の塩基配列を決定した。このrＤＮＡ塩基配列のう
ち、種特異性の高いことが知られているITS領域の塩基
配列を基に、赤腐れ病病原菌に特異的なＰＣＲプライマ
ーを作成した。本プライマーを用いたＰＣＲ法により、
海水中に存在するP.porphyraeおよびP.marinumの遊走
子、さらに乾し海苔や焼き海苔などの加工製品における
赤腐れ病罹病葉体の存在の有無についても、迅速、簡便
且つ確実な検出および定量が可能となった。以下実施例
を示し、本発明の実施形態を詳細に説明する。
びP.marinumに特異的なＤＮＡ塩基配列を見出すべく、
愛知、福岡、宮城、韓国・莞島産の罹病海苔葉体から分
離した菌株、公的供託株IFO30800およびCBS312.93の菌
株から、Cetyltrimethyl ammonium bromide（CTAB）法
で全ＤＮＡを抽出した。抽出全ＤＮＡを鋳型として菌類
のrＤＮＡ領域を増幅する既知のプライマーITS4，ITS5
を用いたＰＣＲにより、海苔赤腐れ病病原菌のrＤＮＡ
を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片を回収してrＤＮＡ領
域の塩基配列を決定した。このrＤＮＡ塩基配列のう
ち、種特異性の高いことが知られているITS領域の塩基
配列を基に、赤腐れ病病原菌に特異的なＰＣＲプライマ
ーを作成した。本プライマーを用いたＰＣＲ法により、
海水中に存在するP.porphyraeおよびP.marinumの遊走
子、さらに乾し海苔や焼き海苔などの加工製品における
赤腐れ病罹病葉体の存在の有無についても、迅速、簡便
且つ確実な検出および定量が可能となった。以下実施例
を示し、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【０００８】（実施例１）愛知、福岡、宮城、韓国・莞
島産の罹病葉体から分離したP.porphyrae菌株、P.marin
um菌株である。CBS312.93、P.porphyrae菌株であるIFO3
0800菌株より全ＤＮＡを抽出した。すなわち、コンミー
ル寒天培地に生育させた菌糸を1lのArasaki Ｂ培地に植
菌し、20℃で15日間培養した。得られた菌糸を液体窒素
中で磨砕して菌糸粉末を得た。この菌糸粉末100mgを20m
M EDTA、1.4M NaCl、2％CTABを含む100mM Tris-HCl緩衝
液（pH8.0）中で65℃、30分間処理した。次いで、菌糸
懸濁液に半量のクロロホルム：イソアミルアルコール
（24:1v/v）を加え、65℃、30分間処理し、22,000×ｇ
で5分間遠心分離して得られた水層に、1/10量の1.4M Na
Clを含む10％CTAB溶液を加え、ついで半量のクロロフォ
ルム：イソアミルアルコール（24:1v/v）を加え、65
℃、30分間処理した。遠心分離後の水層に等量のイソプ
ロパノールを加え、再度遠心分離を行い、得られた核酸
の沈殿を1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）
に溶解した。
島産の罹病葉体から分離したP.porphyrae菌株、P.marin
um菌株である。CBS312.93、P.porphyrae菌株であるIFO3
0800菌株より全ＤＮＡを抽出した。すなわち、コンミー
ル寒天培地に生育させた菌糸を1lのArasaki Ｂ培地に植
菌し、20℃で15日間培養した。得られた菌糸を液体窒素
中で磨砕して菌糸粉末を得た。この菌糸粉末100mgを20m
M EDTA、1.4M NaCl、2％CTABを含む100mM Tris-HCl緩衝
液（pH8.0）中で65℃、30分間処理した。次いで、菌糸
懸濁液に半量のクロロホルム：イソアミルアルコール
（24:1v/v）を加え、65℃、30分間処理し、22,000×ｇ
で5分間遠心分離して得られた水層に、1/10量の1.4M Na
Clを含む10％CTAB溶液を加え、ついで半量のクロロフォ
ルム：イソアミルアルコール（24:1v/v）を加え、65
℃、30分間処理した。遠心分離後の水層に等量のイソプ
ロパノールを加え、再度遠心分離を行い、得られた核酸
の沈殿を1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）
に溶解した。
【０００９】rＤＮＡのうち、5.8S rＤＮＡを含むITS領
域は、既知のプライマーITS4（５’−ＴＣＣＴＣＣＧＣ
ＴＴＡＴＴＡＴＡＴＧＣ−３’）およびITS5（５’−Ｇ
ＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ−３’）
を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、1.5mM MgCl
2，200μM dNTPs，0.6μMのITS4およびITS5プライマ
ー、1.25ユニットのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社
製）、100ngの抽出全ＤＮＡから成る50μlの反応液で行
った。反応パラメーターとして、最初に95℃、3分間の
熱変性、次いで95℃、１分間の熱変性、55℃、30秒間の
アニーリング、72℃、1分間の伸長反応を30サイクル、
最後に72℃、5分間の伸長反応を設定した。
域は、既知のプライマーITS4（５’−ＴＣＣＴＣＣＧＣ
ＴＴＡＴＴＡＴＡＴＧＣ−３’）およびITS5（５’−Ｇ
ＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ−３’）
を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、1.5mM MgCl
2，200μM dNTPs，0.6μMのITS4およびITS5プライマ
ー、1.25ユニットのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社
製）、100ngの抽出全ＤＮＡから成る50μlの反応液で行
った。反応パラメーターとして、最初に95℃、3分間の
熱変性、次いで95℃、１分間の熱変性、55℃、30秒間の
アニーリング、72℃、1分間の伸長反応を30サイクル、
最後に72℃、5分間の伸長反応を設定した。
【００１０】約900塩基対（bp）のＰＣＲ産物は、1.5％
の低融点アガロースゲル（ニッポンジーン社製）を用い
た電気泳動で回収し、Dye Terminator Cycle Sequencin
g Kit（PE Biosystems 社製）によりラベル後、ABI PRI
SM Model 373A ＤＮＡ sequender（PE Biosystems 社
製）を用いてITS領域のＤＮＡ塩基配列を決定した。
の低融点アガロースゲル（ニッポンジーン社製）を用い
た電気泳動で回収し、Dye Terminator Cycle Sequencin
g Kit（PE Biosystems 社製）によりラベル後、ABI PRI
SM Model 373A ＤＮＡ sequender（PE Biosystems 社
製）を用いてITS領域のＤＮＡ塩基配列を決定した。
【００１１】図１にP.porphyraeのrＤＮＡ領域の塩基配
列とその各領域を示す。図１に示したように、P.porphy
raeのITS1，5.8S rＤＮＡ，ITS2領域は、それぞれ174，
158，452bpであった。供試した6菌株の5.8S rＤＮＡを
含むITS領域のＤＮＡ塩基配列は全て一致していた。決
定したITS領域の塩基配列を、ジーンバンクのデータベ
ースに登録されている他のPythium属菌種および海洋細
菌のITS領域の塩基配列と比較した結果、ITS1およびITS
2領域の塩基配列に大きな違いが認められたため、これ
らの領域塩基配列を基に、P.porphyraeおよびP.marinum
に特異的なオリゴヌクレチドプライマー、すなわち図１
に示したＰＰ−１（５’−ＴＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴ
ＣＣＴＣＴＣＧ−３’）、およびＰＰ−２（５’−ＣＣ
ＣＡＡＡＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣ−３’）の２つ
のプライマーの塩基配列を作成した。
列とその各領域を示す。図１に示したように、P.porphy
raeのITS1，5.8S rＤＮＡ，ITS2領域は、それぞれ174，
158，452bpであった。供試した6菌株の5.8S rＤＮＡを
含むITS領域のＤＮＡ塩基配列は全て一致していた。決
定したITS領域の塩基配列を、ジーンバンクのデータベ
ースに登録されている他のPythium属菌種および海洋細
菌のITS領域の塩基配列と比較した結果、ITS1およびITS
2領域の塩基配列に大きな違いが認められたため、これ
らの領域塩基配列を基に、P.porphyraeおよびP.marinum
に特異的なオリゴヌクレチドプライマー、すなわち図１
に示したＰＰ−１（５’−ＴＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴ
ＣＣＴＣＴＣＧ−３’）、およびＰＰ−２（５’−ＣＣ
ＣＡＡＡＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣ−３’）の２つ
のプライマーの塩基配列を作成した。
【００１２】本プライマーの特異性を検証するためにア
マノリ類に病原性を持つP.porphyrae（IFO30800）およ
びP.marinum（CBS312.93）、他の病原性を有するPythiu
m属の病原菌P.aphanidermatum（IFO7030），P.irregula
re（IFO30346），P.spinosum（IFO7031），P.ultimum
（IFO32210）の６種の病原性カビ菌株および海苔漁場の
海水中に存在する海洋細菌から抽出した全ＤＮＡ100ng
を鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、P.porphyrae
およびP.marinumの両菌株においては予想される約700bp
のＤＮＡ断片の増幅が確認されたが、他菌株においてＤ
ＮＡ断片の増幅は認められなかった。
マノリ類に病原性を持つP.porphyrae（IFO30800）およ
びP.marinum（CBS312.93）、他の病原性を有するPythiu
m属の病原菌P.aphanidermatum（IFO7030），P.irregula
re（IFO30346），P.spinosum（IFO7031），P.ultimum
（IFO32210）の６種の病原性カビ菌株および海苔漁場の
海水中に存在する海洋細菌から抽出した全ＤＮＡ100ng
を鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、P.porphyrae
およびP.marinumの両菌株においては予想される約700bp
のＤＮＡ断片の増幅が確認されたが、他菌株においてＤ
ＮＡ断片の増幅は認められなかった。
【００１３】（実施例２）オリゴヌクレオチドプライマ
ーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いたＰＣＲによるP.porp
hyrae遊走子の検出を次のように試験した。
ーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いたＰＣＲによるP.porp
hyrae遊走子の検出を次のように試験した。
【００１４】Arasaki Ｂ培地で生育させたP.porphyrae
菌糸を50mlの半海水に移し、20℃で15時間緩やかに振盪
した。放出された遊走子を20μmのナイロンメッシュで
濾過採取し、1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH
8.0）に懸濁後、１から10,000個の遊走子を含む10μl量
の試料液を調製した。試料液を95℃で20分間処理後、全
量を40μlのＰＣＲ反応液（オリゴヌクレオチドプライ
マーＰＰ−１およびＰＰ−２を含む）に添加してＰＣＲ
を行った。その結果、遊走子１個のＤＮＡを鋳型とした
場合においても、予想される約700bpのＤＮＡ断片の増
幅が確認された。かくして特別に作成したオリゴヌクレ
オチドプライマーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いたＰＣ
Ｒにより、赤腐れ病病原菌であるP.porphyraeおよびP.m
arinumの菌糸、感染初期の発芽型遊走子のみならず、海
水中に存在する感染前の非発芽型遊走子をも検出とする
ことが可能であることが分かった。
菌糸を50mlの半海水に移し、20℃で15時間緩やかに振盪
した。放出された遊走子を20μmのナイロンメッシュで
濾過採取し、1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH
8.0）に懸濁後、１から10,000個の遊走子を含む10μl量
の試料液を調製した。試料液を95℃で20分間処理後、全
量を40μlのＰＣＲ反応液（オリゴヌクレオチドプライ
マーＰＰ−１およびＰＰ−２を含む）に添加してＰＣＲ
を行った。その結果、遊走子１個のＤＮＡを鋳型とした
場合においても、予想される約700bpのＤＮＡ断片の増
幅が確認された。かくして特別に作成したオリゴヌクレ
オチドプライマーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いたＰＣ
Ｒにより、赤腐れ病病原菌であるP.porphyraeおよびP.m
arinumの菌糸、感染初期の発芽型遊走子のみならず、海
水中に存在する感染前の非発芽型遊走子をも検出とする
ことが可能であることが分かった。
【００１５】（実施例３）オリゴヌクレオチドプライマ
ーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いたＰＣＲによる乾海苔
および焼海苔に含まれる赤腐れ病罹病海苔葉体の検出を
試験した。
ーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いたＰＣＲによる乾海苔
および焼海苔に含まれる赤腐れ病罹病海苔葉体の検出を
試験した。
【００１６】赤腐れ病の感染が認められなかった海苔葉
体、および赤腐れ病感染初期、中期、末期の海苔葉体で
作製した乾海苔および焼海苔の全形サイズ（21×19cm）
数枚をホモジナイザー（佐久間製作所製）で磨砕した。
海苔粉末１ｇからCTAB法により抽出した全ＤＮＡを、10
mlの1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）に溶
解後、100μgのRnase（ニッポンジーン社製）を添加し
て65℃で１時間処理した。次いで、等量のフェノール：
クロロフォルム：イソアミルアルコール（25:24:1v/v）
を加えて混合し、遠心分離後の水層をアルコール沈殿処
理し、得られた核酸の沈殿を10mlの1mM EDTAを含む10mM
Tris-HCl緩衝液（pH8.0）に溶解した。このうち2μlを
鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰＰ−１お
よびＰＰ−２を用いたＰＣＲを行った。
体、および赤腐れ病感染初期、中期、末期の海苔葉体で
作製した乾海苔および焼海苔の全形サイズ（21×19cm）
数枚をホモジナイザー（佐久間製作所製）で磨砕した。
海苔粉末１ｇからCTAB法により抽出した全ＤＮＡを、10
mlの1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）に溶
解後、100μgのRnase（ニッポンジーン社製）を添加し
て65℃で１時間処理した。次いで、等量のフェノール：
クロロフォルム：イソアミルアルコール（25:24:1v/v）
を加えて混合し、遠心分離後の水層をアルコール沈殿処
理し、得られた核酸の沈殿を10mlの1mM EDTAを含む10mM
Tris-HCl緩衝液（pH8.0）に溶解した。このうち2μlを
鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰＰ−１お
よびＰＰ−２を用いたＰＣＲを行った。
【００１７】その結果、赤腐れ病に罹病した海苔葉体で
調製した乾海苔及び焼海苔から抽出したＤＮＡを鋳型と
した場合においてのみ、予想される約700bpのＤＮＡ断
片の増幅が確認された。したがって、オリゴヌクレオチ
ドプライマーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いたＰＣＲに
より、乾海苔および焼海苔中に含まれる赤腐れ病罹病海
苔葉体を検出することが可能であることが分かり、迅
速、簡便且つ確実に海苔加工製品の品質管理を行えるよ
うになった。
調製した乾海苔及び焼海苔から抽出したＤＮＡを鋳型と
した場合においてのみ、予想される約700bpのＤＮＡ断
片の増幅が確認された。したがって、オリゴヌクレオチ
ドプライマーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いたＰＣＲに
より、乾海苔および焼海苔中に含まれる赤腐れ病罹病海
苔葉体を検出することが可能であることが分かり、迅
速、簡便且つ確実に海苔加工製品の品質管理を行えるよ
うになった。
【００１８】（実施例４）オリゴヌクレオチドプライマ
ーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いた競合ＰＣＲ法による
赤腐れ病病原菌の遊走子の定量法について検討した。
ーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いた競合ＰＣＲ法による
赤腐れ病病原菌の遊走子の定量法について検討した。
【００１９】競合ＰＣＲの反応に必要な、定量の内部標
準となる競合ＤＮＡを次のように作成した。すなわち、
P.porphyraeから抽出した全ＤＮＡを鋳型として、オリ
ゴヌクレオチドプライマーＰＰ−１およびＰＰ−２を用
いたＰＣＲを行い、両末端にＰＰ−１およびＰＰ−２の
塩基配列を含む増幅ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片
をプラスミドベクターpT７Blue(R)（Novagen 社製）に
サブクローン化した。次に、図２に示すように、各種制
限酵素で切断して得られたＤＮＡ断片を調製し、Takara
ＤＮＡ Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて環状化
し、競合ＰＣＲのための内部標準ＤＮＡとした。
準となる競合ＤＮＡを次のように作成した。すなわち、
P.porphyraeから抽出した全ＤＮＡを鋳型として、オリ
ゴヌクレオチドプライマーＰＰ−１およびＰＰ−２を用
いたＰＣＲを行い、両末端にＰＰ−１およびＰＰ−２の
塩基配列を含む増幅ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片
をプラスミドベクターpT７Blue(R)（Novagen 社製）に
サブクローン化した。次に、図２に示すように、各種制
限酵素で切断して得られたＤＮＡ断片を調製し、Takara
ＤＮＡ Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて環状化
し、競合ＰＣＲのための内部標準ＤＮＡとした。
【００２０】海苔赤腐れ病病原菌の遊走子2,000個から
抽出した全ＤＮＡおよび10pgの内部標準ＤＮＡを鋳型と
して、プライマーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いて、増
幅サイクルのパラメーターを16〜38サイクルの範囲で設
定した競合ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲ
ルで電気泳動した後、エチジウムブロマイド（EtBr）染
色し、紫外線照射下における蛍光強度をFASIII （東洋
紡社製）CCD画像システムを用いて解析し、赤腐れ病病
原菌rＤＮＡおよび内部標準ＤＮＡの増幅効果を調べ
た。その結果、遊走子のＤＮＡに起因する約700bpのＤ
ＮＡ断片および内部標準ＤＮＡに起因する約400bpのＤ
ＮＡ断片は、競合ＰＣＲの20〜32サイクルの範囲で、同
じ増幅率で増幅されることが明らかとなった。
抽出した全ＤＮＡおよび10pgの内部標準ＤＮＡを鋳型と
して、プライマーＰＰ−１およびＰＰ−２を用いて、増
幅サイクルのパラメーターを16〜38サイクルの範囲で設
定した競合ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲ
ルで電気泳動した後、エチジウムブロマイド（EtBr）染
色し、紫外線照射下における蛍光強度をFASIII （東洋
紡社製）CCD画像システムを用いて解析し、赤腐れ病病
原菌rＤＮＡおよび内部標準ＤＮＡの増幅効果を調べ
た。その結果、遊走子のＤＮＡに起因する約700bpのＤ
ＮＡ断片および内部標準ＤＮＡに起因する約400bpのＤ
ＮＡ断片は、競合ＰＣＲの20〜32サイクルの範囲で、同
じ増幅率で増幅されることが明らかとなった。
【００２１】次に、海苔赤腐れ病病原菌の遊走子2,000
個から抽出した全ＤＮＡおよび0.1pg〜10ngの内部標準
ＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰ
Ｐ−１およびＰＰ−２を用いて、30サイクルの競合ＰＣ
Ｒを行った。増幅ＤＮＡ断片のFASIII CCD画像システム
による定量解析の結果、プライマーＰＰ−１およびＰＰ
−２、内部標準ＤＮＡを用いた競合ＰＣＲにより、赤腐
れ病病原菌rＤＮＡおよび内部標準ＤＮＡは共に競合的
に増幅されることが明らかになった。
個から抽出した全ＤＮＡおよび0.1pg〜10ngの内部標準
ＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰ
Ｐ−１およびＰＰ−２を用いて、30サイクルの競合ＰＣ
Ｒを行った。増幅ＤＮＡ断片のFASIII CCD画像システム
による定量解析の結果、プライマーＰＰ−１およびＰＰ
−２、内部標準ＤＮＡを用いた競合ＰＣＲにより、赤腐
れ病病原菌rＤＮＡおよび内部標準ＤＮＡは共に競合的
に増幅されることが明らかになった。
【００２２】かくして、プライマーＰＰ−１およびＰＰ
−２、内部標準ＤＮＡを用いた競合ＰＣＲにより増幅さ
れた遊走子ＤＮＡに起因する約700bpおよび内部標準Ｄ
ＮＡに起因する約400bpのＤＮＡ断片のEtBr染色による
蛍光強度を測定することにより、赤腐れ病病原菌の遊走
子数を定量できることが明らかになった。
−２、内部標準ＤＮＡを用いた競合ＰＣＲにより増幅さ
れた遊走子ＤＮＡに起因する約700bpおよび内部標準Ｄ
ＮＡに起因する約400bpのＤＮＡ断片のEtBr染色による
蛍光強度を測定することにより、赤腐れ病病原菌の遊走
子数を定量できることが明らかになった。
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば、従来海苔漁場において
海苔葉体の病変を視覚的に確認できるまで発見すること
ができなかった海苔赤腐れ病を、発生初期の段階で迅速
に検知することができるので、海苔赤腐れ病の拡大を防
ぐことができる。
海苔葉体の病変を視覚的に確認できるまで発見すること
ができなかった海苔赤腐れ病を、発生初期の段階で迅速
に検知することができるので、海苔赤腐れ病の拡大を防
ぐことができる。
【００２４】
<110> 株式会社 白子 Shirako Co., Ltd. <120> 海苔赤腐れ病病原菌の検出方法およびそれに用い
るオリゴヌクレオチド <130> SI00-1 <160> 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Pythium porphyrae, Pythium marinum <400> 1 tgtgttctgt gctcctctcg <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Pythium porphyrae, Pythium marinum <400> 2 cccaaattgg tgttgcctcc
るオリゴヌクレオチド <130> SI00-1 <160> 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Pythium porphyrae, Pythium marinum <400> 1 tgtgttctgt gctcctctcg <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Pythium porphyrae, Pythium marinum <400> 2 cccaaattgg tgttgcctcc
【図１】P.porphyraeおよびP.marinumのrＤＮＡ領域の
塩基配列を示す図。
塩基配列を示す図。
【図２】内部標準ＤＮＡの作成方法を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｚ 33/569 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (6)
- 【請求項１】 海苔赤腐れ病病原菌Pythium porphyrae
またはPythium marinumのrＤＮＡ領域のＤＮＡ塩基配列
とハイブリダイズし得る海苔赤腐れ病病原菌菌種検出・
同定用オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 （５’−ＴＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣ
ＣＴＣＴＣＧ−３’）および（５’−ＣＣＣＡＡＡＴＴ
ＧＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣ−３’）なる塩基配列を有す
る請求項１記載の海苔赤腐れ病病原菌菌種検出・同定用
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いてＰＣＲ法によりP.porphyraeまた
はP.marinumを検出・同定することを特徴とする海苔赤
腐れ病病原菌の検出方法。 - 【請求項４】 請求項２記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いる請求項３記載の
海苔赤腐れ病病原菌の検出方法。 - 【請求項５】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いて競合ＰＣＲ法により海苔赤腐れ病
病原菌を定量することを特徴とする海苔赤腐れ病病原菌
の定量方法。 - 【請求項６】 請求項２記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いる請求項５記載の
海苔赤腐れ病病原菌の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000303308A JP2002112774A (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | 海苔赤腐れ病病原菌の検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000303308A JP2002112774A (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | 海苔赤腐れ病病原菌の検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002112774A true JP2002112774A (ja) | 2002-04-16 |
Family
ID=18784524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000303308A Pending JP2002112774A (ja) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | 海苔赤腐れ病病原菌の検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002112774A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101126746B (zh) * | 2007-08-03 | 2010-08-18 | 集美大学 | 坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法及其应用 |
| CN108239607A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-07-03 | 邹丹丹 | 一种培养、收集紫菜腐霉菌菌丝的方法 |
| CN112746118A (zh) * | 2020-04-09 | 2021-05-04 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种用于紫菜赤腐病检测的两重pcr引物组及试剂盒 |
-
2000
- 2000-10-03 JP JP2000303308A patent/JP2002112774A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101126746B (zh) * | 2007-08-03 | 2010-08-18 | 集美大学 | 坛紫菜种质鉴定的指纹图谱的构建方法及其应用 |
| CN108239607A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-07-03 | 邹丹丹 | 一种培养、收集紫菜腐霉菌菌丝的方法 |
| CN108239607B (zh) * | 2018-04-10 | 2021-07-27 | 邹丹丹 | 一种培养、收集紫菜腐霉菌菌丝的方法 |
| CN112746118A (zh) * | 2020-04-09 | 2021-05-04 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种用于紫菜赤腐病检测的两重pcr引物组及试剂盒 |
| CN112746118B (zh) * | 2020-04-09 | 2022-09-20 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种用于紫菜赤腐病检测的两重pcr引物组及试剂盒 |
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