JP2002017360A - α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト体細胞及びその作出方法 - Google Patents
α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト体細胞及びその作出方法Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 α1-3 GT遺伝子をノックアウトした染色体を
有する、マウス以外の哺乳動物の体細胞を提供するこ
と。 【解決手段】 遺伝子ターゲティングの手法をウシ線維
芽細胞に適用することにより、α1-3ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされた哺乳動物
（マウス及びヒトを除く）の体細胞を提供することに成
功した。
有する、マウス以外の哺乳動物の体細胞を提供するこ
と。 【解決手段】 遺伝子ターゲティングの手法をウシ線維
芽細胞に適用することにより、α1-3ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされた哺乳動物
（マウス及びヒトを除く）の体細胞を提供することに成
功した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、α1-3ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ（以下、「α1-3 GT」と言うこと
がある）遺伝子がノックアウトされた哺乳動物（マウス
及びヒトを除く）の体細胞に関する。本発明の体細胞
は、体細胞クローン技術により、α1-3 GT遺伝子がノッ
クアウトされた哺乳動物の作出に有用である。該哺乳動
物の臓器は、異種動物に移植した場合に超急性拒絶反応
を引き起こさないので、該哺乳動物は、移植用臓器のド
ナーとして利用できる。
ルトランスフェラーゼ（以下、「α1-3 GT」と言うこと
がある）遺伝子がノックアウトされた哺乳動物（マウス
及びヒトを除く）の体細胞に関する。本発明の体細胞
は、体細胞クローン技術により、α1-3 GT遺伝子がノッ
クアウトされた哺乳動物の作出に有用である。該哺乳動
物の臓器は、異種動物に移植した場合に超急性拒絶反応
を引き起こさないので、該哺乳動物は、移植用臓器のド
ナーとして利用できる。
【０００２】
【従来の技術】近年臓器移植が末期臓器不全の治療法と
して定着する一方で、ドナー臓器数の不足が社会的な問
題となっているが、これに対する根本的な治療手段とし
て異種移植が注目されている。動物臓器をヒトに移植し
た場合、超急性拒絶反応（以後、「HAR」と略すことが
ある）により、移植臓器は瞬時に拒絶される。HARは動
物臓器に存在するαGalと呼ばれる糖鎖抗原とヒト血清
中に存在する自然抗体が結合することにより起こる(Gal
ili U：Interaction of the natural anti−Gal
antibody with α-galactosyl epitopes：a major obs
tacle for xenotransplantation in humans．Immunolog
y today 14，480-482，1993)。αGal抗原は、α1-3 GT
によって合成される(Joziasse DH，Shaper JH，Van
den Eijinden DH，Van Tunen DH，Shaper NL：Bovi
ne α1→3-galactosyltransferase：Isolation and ch
aracterization of a cDNA clone．J Biolo Chem 2
64，14290-14297，1989)ため、このα1-3GTを持たない
動物を作出することができれば、異種移植においてHAR
を回避することが可能となる。
して定着する一方で、ドナー臓器数の不足が社会的な問
題となっているが、これに対する根本的な治療手段とし
て異種移植が注目されている。動物臓器をヒトに移植し
た場合、超急性拒絶反応（以後、「HAR」と略すことが
ある）により、移植臓器は瞬時に拒絶される。HARは動
物臓器に存在するαGalと呼ばれる糖鎖抗原とヒト血清
中に存在する自然抗体が結合することにより起こる(Gal
ili U：Interaction of the natural anti−Gal
antibody with α-galactosyl epitopes：a major obs
tacle for xenotransplantation in humans．Immunolog
y today 14，480-482，1993)。αGal抗原は、α1-3 GT
によって合成される(Joziasse DH，Shaper JH，Van
den Eijinden DH，Van Tunen DH，Shaper NL：Bovi
ne α1→3-galactosyltransferase：Isolation and ch
aracterization of a cDNA clone．J Biolo Chem 2
64，14290-14297，1989)ため、このα1-3GTを持たない
動物を作出することができれば、異種移植においてHAR
を回避することが可能となる。
【０００３】一方、動物個体において特定の遺伝子を破
壊し、その遺伝子から転写、翻訳されるたんぱく質を消
失させる技術として、遺伝子の相同組換えを利用した遺
伝子ターゲティング(gene targeting)が知られている。
この技術を利用して、特定の遺伝子を破壊したいわゆる
「ノックアウトマウス」が知られており、その作出方法
はほぼ確立されている。
壊し、その遺伝子から転写、翻訳されるたんぱく質を消
失させる技術として、遺伝子の相同組換えを利用した遺
伝子ターゲティング(gene targeting)が知られている。
この技術を利用して、特定の遺伝子を破壊したいわゆる
「ノックアウトマウス」が知られており、その作出方法
はほぼ確立されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、遺伝子
ターゲティングにより、特定の遺伝子を破壊した哺乳動
物の作出は、今日においてもマウスにおいてのみ可能で
ある。これはマウスにおいて胚性幹細胞（以下、ES細胞
と略す）が樹立されていることによる。ES細胞が樹立さ
れていない、マウス以外の動物種における遺伝子ターゲ
ティングは現在まで成功していない。従って、現在、ヒ
トに対する臓器のドナーとして有望な、ウシやブタのよ
うな大型哺乳動物のα1-3 GT遺伝子をノックアウトする
ことは成功していない。
ターゲティングにより、特定の遺伝子を破壊した哺乳動
物の作出は、今日においてもマウスにおいてのみ可能で
ある。これはマウスにおいて胚性幹細胞（以下、ES細胞
と略す）が樹立されていることによる。ES細胞が樹立さ
れていない、マウス以外の動物種における遺伝子ターゲ
ティングは現在まで成功していない。従って、現在、ヒ
トに対する臓器のドナーとして有望な、ウシやブタのよ
うな大型哺乳動物のα1-3 GT遺伝子をノックアウトする
ことは成功していない。
【０００５】本願発明者らは、α1-3 GT遺伝子をノック
アウトした、マウス以外の哺乳動物（ヒトを除く）を、
体細胞クローン技術により作出することに想到した。す
なわち、α1-3 GT遺伝子をノックアウトした染色体を有
する哺乳動物体細胞の核を、同種哺乳動物の除核未受精
卵に移植し、胚発生させた後、同種動物の子宮に戻すこ
とにより、α1-3 GT遺伝子をノックアウトした哺乳動物
を作出することに想到した。この体細胞クローン技術を
行うためには、α1-3 GT遺伝子をノックアウトした染色
体を有する哺乳動物の体細胞を先ず作出する必要があ
る。
アウトした、マウス以外の哺乳動物（ヒトを除く）を、
体細胞クローン技術により作出することに想到した。す
なわち、α1-3 GT遺伝子をノックアウトした染色体を有
する哺乳動物体細胞の核を、同種哺乳動物の除核未受精
卵に移植し、胚発生させた後、同種動物の子宮に戻すこ
とにより、α1-3 GT遺伝子をノックアウトした哺乳動物
を作出することに想到した。この体細胞クローン技術を
行うためには、α1-3 GT遺伝子をノックアウトした染色
体を有する哺乳動物の体細胞を先ず作出する必要があ
る。
【０００６】従って、本発明の目的は、α1-3 GT遺伝子
をノックアウトした染色体を有する、マウス以外の哺乳
動物の体細胞を提供することである。
をノックアウトした染色体を有する、マウス以外の哺乳
動物の体細胞を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、ウシ線維芽細胞のゲノミックＤＮＡ中のα1-
3 GT遺伝子の触媒領域(catalytic domain)の５’末端側
領域及びその上流のイントロン領域の一部にまたがる領
域にホスフォグリセリン酸キナーゼ１(PGK-1)プロモー
ターと、その制御を受けるネオマイシン耐性遺伝子とを
相同組換えにより挿入することによって染色体中のα1-
3 GT遺伝子をノックアウトし、このように染色体中のα
1-3 GT遺伝子が予想通りにノックアウトされたことをＰ
ＣＲにより確認することにより、染色体中のα1-3 GT遺
伝子がノックアウトされたウシ線維芽細胞を実験的に作
出することに成功し、本発明を完成した。
究の結果、ウシ線維芽細胞のゲノミックＤＮＡ中のα1-
3 GT遺伝子の触媒領域(catalytic domain)の５’末端側
領域及びその上流のイントロン領域の一部にまたがる領
域にホスフォグリセリン酸キナーゼ１(PGK-1)プロモー
ターと、その制御を受けるネオマイシン耐性遺伝子とを
相同組換えにより挿入することによって染色体中のα1-
3 GT遺伝子をノックアウトし、このように染色体中のα
1-3 GT遺伝子が予想通りにノックアウトされたことをＰ
ＣＲにより確認することにより、染色体中のα1-3 GT遺
伝子がノックアウトされたウシ線維芽細胞を実験的に作
出することに成功し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、α1-3 GT遺伝子がノ
ックアウトされた哺乳動物（マウス及びヒトを除く）の
体細胞を提供する。
ックアウトされた哺乳動物（マウス及びヒトを除く）の
体細胞を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の体細胞は、マウス及びヒ
ト以外の哺乳動物由来のものである。哺乳動物として
は、特に限定されないが、ヒトに対する臓器移植のドナ
ーとして用いる点を考慮すると、大型哺乳動物、すなわ
ち、成長した個体の体重が５０ｋｇ以上の哺乳動物が好
ましく、とりわけ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ等
の家畜が入手容易性の観点から好ましい。これらの中で
も、体細胞クローン技術が進んでいるウシが好ましい。
ト以外の哺乳動物由来のものである。哺乳動物として
は、特に限定されないが、ヒトに対する臓器移植のドナ
ーとして用いる点を考慮すると、大型哺乳動物、すなわ
ち、成長した個体の体重が５０ｋｇ以上の哺乳動物が好
ましく、とりわけ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ等
の家畜が入手容易性の観点から好ましい。これらの中で
も、体細胞クローン技術が進んでいるウシが好ましい。
【００１０】本発明の体細胞の種類は特に限定されず、
いかなる組織由来の細胞であってもよいが、遺伝子導入
の容易さの観点から線維芽細胞が好ましい。
いかなる組織由来の細胞であってもよいが、遺伝子導入
の容易さの観点から線維芽細胞が好ましい。
【００１１】α1-3 GT遺伝子をノックアウトした体細胞
の作出の具体的方法は、下記実施例に詳述されており、
その原理は図１に模式的に示されている。下記実施例で
は、ウシ線維芽細胞のα1-3 GT遺伝子の触媒領域のエク
ソン部分の５’末端領域及びその上流のイントロン部分
にまたがる領域(Sma I-Pst I領域）にＰＧＫ−１プロモ
ーターとネオマイシン耐性遺伝子を相同組換えにより挿
入することによってα1-3 GT遺伝子をノックアウトし
た。さらに、意図する相同組換えが実現された細胞を選
択するのに、ＰＣＲによるチェックを採用した。すなわ
ち、相同組換えにより挿入された領域とハイブリダイズ
するプライマーと、ウシα1-3 GT遺伝子の触媒領域の、
染色体遺伝子から排除されないエクソン部分にハイブリ
ダイズするプライマーとを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ
断片の増幅が起きた細胞を選択するという手法を考え出
した。動物細胞の遺伝子導入にこのような手法を採用し
た点は、本願発明者らの独創によるものである。
の作出の具体的方法は、下記実施例に詳述されており、
その原理は図１に模式的に示されている。下記実施例で
は、ウシ線維芽細胞のα1-3 GT遺伝子の触媒領域のエク
ソン部分の５’末端領域及びその上流のイントロン部分
にまたがる領域(Sma I-Pst I領域）にＰＧＫ−１プロモ
ーターとネオマイシン耐性遺伝子を相同組換えにより挿
入することによってα1-3 GT遺伝子をノックアウトし
た。さらに、意図する相同組換えが実現された細胞を選
択するのに、ＰＣＲによるチェックを採用した。すなわ
ち、相同組換えにより挿入された領域とハイブリダイズ
するプライマーと、ウシα1-3 GT遺伝子の触媒領域の、
染色体遺伝子から排除されないエクソン部分にハイブリ
ダイズするプライマーとを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ
断片の増幅が起きた細胞を選択するという手法を考え出
した。動物細胞の遺伝子導入にこのような手法を採用し
た点は、本願発明者らの独創によるものである。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１３】1． 黒毛和牛α1-3GT cDNAの単離 黒毛和牛の末梢血10mlからLYMPHO SEPARATION MEDIUM
（商品名、米国オハイオ州のICN Biomedicals社製）を
用いて、末梢血リンパ球を分離した。この末梢血リンパ
球からISOGEN（商品名、日本ジーン社製）を用いて全RN
Aを得た。既に発表されているウシα1-3GT cDNAの塩基
配列(GenBank Accession No. J04989)に基づいて作製し
たオリゴヌクレオチド（センス鎖：5'-AGCTCAGTAGAACTT
GGTACT-3'、アンチセンス鎖：5'-CATCTGATTACCACAGGTTC
ATT-3'）をプライマー、先に黒毛和牛末梢血リンパ球か
ら分離した全RNAをテンプレートとしてRT-PCRを行い、
1.4kbの黒毛和牛α1-3GT cDNAを単離した(Joziasse D
H，Shaper JH，Van denEijinden DH，Van Tunen D
H，Shaper NL：Bovine α1→3-galactosyltransferas
e：Isolation and characterization of a cDNA cl
one．J. BioloChem 264，14290-14297，1989)。な
お、上記センスプライマーは、上記ｃＤＮＡ配列の402
〜425 ntに、アンチセンスプライマーは、上記ｃＤＮＡ
配列の1739〜1760 ntにハイブリダイズする。
（商品名、米国オハイオ州のICN Biomedicals社製）を
用いて、末梢血リンパ球を分離した。この末梢血リンパ
球からISOGEN（商品名、日本ジーン社製）を用いて全RN
Aを得た。既に発表されているウシα1-3GT cDNAの塩基
配列(GenBank Accession No. J04989)に基づいて作製し
たオリゴヌクレオチド（センス鎖：5'-AGCTCAGTAGAACTT
GGTACT-3'、アンチセンス鎖：5'-CATCTGATTACCACAGGTTC
ATT-3'）をプライマー、先に黒毛和牛末梢血リンパ球か
ら分離した全RNAをテンプレートとしてRT-PCRを行い、
1.4kbの黒毛和牛α1-3GT cDNAを単離した(Joziasse D
H，Shaper JH，Van denEijinden DH，Van Tunen D
H，Shaper NL：Bovine α1→3-galactosyltransferas
e：Isolation and characterization of a cDNA cl
one．J. BioloChem 264，14290-14297，1989)。な
お、上記センスプライマーは、上記ｃＤＮＡ配列の402
〜425 ntに、アンチセンスプライマーは、上記ｃＤＮＡ
配列の1739〜1760 ntにハイブリダイズする。
【００１４】2． ウシα1-3GTゲノミックDNAの単離 ウシ遺伝子DNAライブラリーをCLONETECH社（米国カリフ
ォルニア州）より購入した。先に単離した黒毛和牛α1-
3GT cDNAをプローブとして用いて、ウシ遺伝子DNAライ
ブラリーのスクリーニングを行った。その結果、ウシα
1-3GT ゲノミックDNAの触媒領域をコードしている部位
を含んだクローン(GA7)が得られ、その制限酵素部位を
調べた（図１）。また、GA7の塩基配列を部分的に調べ
たところ、GenBank Accession No. J04989に記載されて
いるウシα1-3GT cDNAの第８８２番目以降の領域（マウ
スのゲノミックα1-3GT遺伝子のExon 9に相当）、すな
わち、α1-3 GTの触媒領域を含んでいることが明らかに
なった。図１に示されたGA7の制限酵素地図において、
長方形で示されている部分がα1-3 GTのエクソン領域で
あり、GA7の３’末端側領域は、cDNAよりも3'方向下流
の塩基配列を含んでいた。なお、後述の相同組換えにお
いて切断されるPst I部位は、GenBank Accession No. J
04989に記載されているウシα1-3GT cDNAの第１２６４
番目と第１２６５番目の間が切断部位であり、5'側の切
断部位であるSma I部位は、該エクソンよりも上流のイ
ントロン中に存在する（図１参照）。
ォルニア州）より購入した。先に単離した黒毛和牛α1-
3GT cDNAをプローブとして用いて、ウシ遺伝子DNAライ
ブラリーのスクリーニングを行った。その結果、ウシα
1-3GT ゲノミックDNAの触媒領域をコードしている部位
を含んだクローン(GA7)が得られ、その制限酵素部位を
調べた（図１）。また、GA7の塩基配列を部分的に調べ
たところ、GenBank Accession No. J04989に記載されて
いるウシα1-3GT cDNAの第８８２番目以降の領域（マウ
スのゲノミックα1-3GT遺伝子のExon 9に相当）、すな
わち、α1-3 GTの触媒領域を含んでいることが明らかに
なった。図１に示されたGA7の制限酵素地図において、
長方形で示されている部分がα1-3 GTのエクソン領域で
あり、GA7の３’末端側領域は、cDNAよりも3'方向下流
の塩基配列を含んでいた。なお、後述の相同組換えにお
いて切断されるPst I部位は、GenBank Accession No. J
04989に記載されているウシα1-3GT cDNAの第１２６４
番目と第１２６５番目の間が切断部位であり、5'側の切
断部位であるSma I部位は、該エクソンよりも上流のイ
ントロン中に存在する（図１参照）。
【００１５】3．TVの構築 GA7のEcoRI-SalIフラグメント（5.3kb）をpBluescript
KS（-）(Stratagene社製）にサブクローニングした（BS
819）。BS819をPstIで消化、自己連結(self-ligate)
し、EcoRI- PstIフラグメント（4.3kb）を取り除いた
（図２）。これからBamHIフラグメント（1.0kb）を取り
だし、pKJ2（米国メリーランド州LIFE TECHNOLOGY社
製）のBamHI部位にサブクローニングした（コントロー
ルベクター(CV))。CVをNdeIで消化し、さらに平滑末端
化した。これをEcoRIで消化し、取り出した2.1kbのフラ
グメントをpBluescriptKS（-）のEcoRI-SmaI部位にサブ
クローニングした（BS216）（図３）。BS216をEcoRIで
消化し、さらに平滑末端化、自己連結し、EcoRI部位を
取り除いた（BS220）（図４）。
KS（-）(Stratagene社製）にサブクローニングした（BS
819）。BS819をPstIで消化、自己連結(self-ligate)
し、EcoRI- PstIフラグメント（4.3kb）を取り除いた
（図２）。これからBamHIフラグメント（1.0kb）を取り
だし、pKJ2（米国メリーランド州LIFE TECHNOLOGY社
製）のBamHI部位にサブクローニングした（コントロー
ルベクター(CV))。CVをNdeIで消化し、さらに平滑末端
化した。これをEcoRIで消化し、取り出した2.1kbのフラ
グメントをpBluescriptKS（-）のEcoRI-SmaI部位にサブ
クローニングした（BS216）（図３）。BS216をEcoRIで
消化し、さらに平滑末端化、自己連結し、EcoRI部位を
取り除いた（BS220）（図４）。
【００１６】BS220をテンプレートとし、2種類のプライ
マー（426BamHI：GCGGATCCTACATTCCCTTCGGCGAAGGGGAT、
426XhoI：CCCTCGAGCATTGGGAATTTTGACTGGTC）を用いてPC
Rをおこない、得られた0.8kbフラグメントをＰＣＲ産物
クローニング用ベクターであるpGEM-T vector（米国ウ
ィスコンシン州Promega社製）にサブクローニングした
（BS51）（図５）。
マー（426BamHI：GCGGATCCTACATTCCCTTCGGCGAAGGGGAT、
426XhoI：CCCTCGAGCATTGGGAATTTTGACTGGTC）を用いてPC
Rをおこない、得られた0.8kbフラグメントをＰＣＲ産物
クローニング用ベクターであるpGEM-T vector（米国ウ
ィスコンシン州Promega社製）にサブクローニングした
（BS51）（図５）。
【００１７】BS819のEcoRI-BamHIフラグメント（5.3k
b）をpBluescript KS（-）(Stratagene社製）にサブク
ローニングした（BS312）（図６）。BS312をNotIで処理
した後、SmaIで部分処理し、この5.5kbフラグメントをP
KJ2のEcoRV-NotI部位にサブクローニングした(BS41
4）。BS414をSal Iで処理した後、BamHIで部分処理して
5.0kbのフラグメントを得た。このフラグメントをBS51
にサブクローニングした（BS514）（図７）。
b）をpBluescript KS（-）(Stratagene社製）にサブク
ローニングした（BS312）（図６）。BS312をNotIで処理
した後、SmaIで部分処理し、この5.5kbフラグメントをP
KJ2のEcoRV-NotI部位にサブクローニングした(BS41
4）。BS414をSal Iで処理した後、BamHIで部分処理して
5.0kbのフラグメントを得た。このフラグメントをBS51
にサブクローニングした（BS514）（図７）。
【００１８】GA7のSalI-EcoRIフラグメント（5.6kb）を
BS514にサブクローニングした（BS519）。BS519をXhoI
で処理した後、HindIIIで部分処理し、8.5kbフラグメン
トを得、このフラグメントをpMCDT-A（LIFE TECHNOLOG
Y社製）にサブクローニングし、ターゲティングベクタ
ー(TV)を構築した（図８）。
BS514にサブクローニングした（BS519）。BS519をXhoI
で処理した後、HindIIIで部分処理し、8.5kbフラグメン
トを得、このフラグメントをpMCDT-A（LIFE TECHNOLOG
Y社製）にサブクローニングし、ターゲティングベクタ
ー(TV)を構築した（図８）。
【００１９】TV導入により相同組替えが起こった場合
は、ウシα1-3GTゲノミックDNAの触媒領域のエクソンを
中心に1300塩基対がターゲティング構築物により置換さ
れる。
は、ウシα1-3GTゲノミックDNAの触媒領域のエクソンを
中心に1300塩基対がターゲティング構築物により置換さ
れる。
【００２０】4．TVの黒毛和牛胎児線維芽細胞(BFF)への
導入 BFFを10%ウシ胎児血清（以後、FCSと略す、LIFE TECHN
OLOGY社製）を含むダルベッコの修飾イーグル培地(Dulb
ecco's Modified Eagle Medium、以後、DMEMと略
す、LIFE TECHNOLOGY社製）10 mlを培養液とし、10 cm
細胞培養プレート（岩城硝子社製）を用いて、37℃ 5%C
O2インキュベーター内で培養した。コンフルーエントと
なる直前にBFFを回収し、4×106個のBFFを40μlのOPTI-
MEM（LIFETECHNOLOGY社製）に溶解し、20μgのTVをGENE
PULSER II（米国カリフォルニア州のBio-Rad社製）を
用いて導入した。この後、10% FCSを含むDMEMで2回洗浄
し、96穴細胞培養プレート（岩城硝子社製）20枚を用意
し、1well当り、1×103個のBFFを、20% FCSを含む100μ
l のDMEMに溶解し、37℃5%CO2インキュベーター内で培
養した。翌日、1mg/mlのネオマイシン（Geneticin，LIF
E TECHNOLOGY社製）を含んだ培養液に交換した。その
後はネオマイシンを含んだ培養液を3日に一度交換し、1
0日間の細胞培養を行った。なお、ネオマイシンを含む
培養液中で培養して死滅しないネオマイシン耐性細胞
は、相同組換えによりネオマイシン耐性遺伝子がゲノミ
ック遺伝子中に組み込まれた細胞である（ポジティブ選
択）。また、pMCDT-Aベクター（LIFE TECHNOLOGY社製）
には、クローニング部位の下流にジフテリア毒素遺伝子
が組み込まれており、意図する相同組換え以外の組換え
によって、ジフテリア毒素遺伝子を含む断片が挿入され
た細胞は、ジフテリア毒素のために死滅する（ネガティ
ブ選択）。
導入 BFFを10%ウシ胎児血清（以後、FCSと略す、LIFE TECHN
OLOGY社製）を含むダルベッコの修飾イーグル培地(Dulb
ecco's Modified Eagle Medium、以後、DMEMと略
す、LIFE TECHNOLOGY社製）10 mlを培養液とし、10 cm
細胞培養プレート（岩城硝子社製）を用いて、37℃ 5%C
O2インキュベーター内で培養した。コンフルーエントと
なる直前にBFFを回収し、4×106個のBFFを40μlのOPTI-
MEM（LIFETECHNOLOGY社製）に溶解し、20μgのTVをGENE
PULSER II（米国カリフォルニア州のBio-Rad社製）を
用いて導入した。この後、10% FCSを含むDMEMで2回洗浄
し、96穴細胞培養プレート（岩城硝子社製）20枚を用意
し、1well当り、1×103個のBFFを、20% FCSを含む100μ
l のDMEMに溶解し、37℃5%CO2インキュベーター内で培
養した。翌日、1mg/mlのネオマイシン（Geneticin，LIF
E TECHNOLOGY社製）を含んだ培養液に交換した。その
後はネオマイシンを含んだ培養液を3日に一度交換し、1
0日間の細胞培養を行った。なお、ネオマイシンを含む
培養液中で培養して死滅しないネオマイシン耐性細胞
は、相同組換えによりネオマイシン耐性遺伝子がゲノミ
ック遺伝子中に組み込まれた細胞である（ポジティブ選
択）。また、pMCDT-Aベクター（LIFE TECHNOLOGY社製）
には、クローニング部位の下流にジフテリア毒素遺伝子
が組み込まれており、意図する相同組換え以外の組換え
によって、ジフテリア毒素遺伝子を含む断片が挿入され
た細胞は、ジフテリア毒素のために死滅する（ネガティ
ブ選択）。
【００２１】5． PCRによる相同組替え体の同定 実体顕微鏡を用いて、ネオマイシン耐性コロニーを培養
プレートから回収した。まず、培養液を吸引廃棄し、PB
S 100μlで一回洗浄後、トリプシン-EDTA（GIBCO社製）
20μlを加え、37℃ 5%CO2内で1分間静置した。次に10%
DMEM 200μlを加え、このうち100μlを96穴培養プレー
トへ、残り100μlを0.5mlマイクロチューブヘ移した。9
6穴培養プレートは37℃ 5% CO2内で培養した。0.5mlマ
イクロチューブを10,000回転で5分間遠心する。上清を
捨てたのち、新たに水40μlを加えてBFFを浮遊させた。
プレートから回収した。まず、培養液を吸引廃棄し、PB
S 100μlで一回洗浄後、トリプシン-EDTA（GIBCO社製）
20μlを加え、37℃ 5%CO2内で1分間静置した。次に10%
DMEM 200μlを加え、このうち100μlを96穴培養プレー
トへ、残り100μlを0.5mlマイクロチューブヘ移した。9
6穴培養プレートは37℃ 5% CO2内で培養した。0.5mlマ
イクロチューブを10,000回転で5分間遠心する。上清を
捨てたのち、新たに水40μlを加えてBFFを浮遊させた。
【００２２】ミネラルオイル（米国ミズーリー州SIGMA
社製）を重層し、マイクロチューブをDNA Thermal Cycl
er（商品名、米国ニュージャージー州Perkin-Elmer社
製）に移した。まず、95℃で10分間加熱したのち、温度
を55℃に下げ、ProteinaseK（LIFE TECHNOLOGY社製）1
5μlを加え、その後55℃で120分間静置した。最後に95
℃で10分間加熱した後、マイクロチューブ中のDNA溶液2
0μlをPCR用テンプレートとして用いた。PCR反応液とし
てAmpliTaqGold（Perkin-Elmer社製）を用いた。10 x P
CR buffer5μl，dNTP5μl，MgCl2 4.5μl，水8μlと、
図1中に示したプライマー（20 pM）をそれぞれ0.3μlを
テンプレート20μlに加えた。プライマーの塩基配列
は、センス側が5'-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCG-3'ア
ンチセンス側が5'-GCATTTATGTGCCAGCCACA-3'であった。
社製）を重層し、マイクロチューブをDNA Thermal Cycl
er（商品名、米国ニュージャージー州Perkin-Elmer社
製）に移した。まず、95℃で10分間加熱したのち、温度
を55℃に下げ、ProteinaseK（LIFE TECHNOLOGY社製）1
5μlを加え、その後55℃で120分間静置した。最後に95
℃で10分間加熱した後、マイクロチューブ中のDNA溶液2
0μlをPCR用テンプレートとして用いた。PCR反応液とし
てAmpliTaqGold（Perkin-Elmer社製）を用いた。10 x P
CR buffer5μl，dNTP5μl，MgCl2 4.5μl，水8μlと、
図1中に示したプライマー（20 pM）をそれぞれ0.3μlを
テンプレート20μlに加えた。プライマーの塩基配列
は、センス側が5'-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCG-3'ア
ンチセンス側が5'-GCATTTATGTGCCAGCCACA-3'であった。
【００２３】PCRの反応はDNA Thermal Cycler（商品
名、Perkin-Elmer社製）を用いて行い、サイクルは94℃
-10分が1回、その後94℃-1分、62℃-1分を35回、最後に
62℃‐10分を1回を用いた。反応終了後、直ちに1%アガ
ロースゲルを用いて、電気泳動をおこない、エチジウム
ブロマイドの染色により判定をおこなった。相同組替え
体が得られた場合は、1200塩基対のDNAが増幅される。
名、Perkin-Elmer社製）を用いて行い、サイクルは94℃
-10分が1回、その後94℃-1分、62℃-1分を35回、最後に
62℃‐10分を1回を用いた。反応終了後、直ちに1%アガ
ロースゲルを用いて、電気泳動をおこない、エチジウム
ブロマイドの染色により判定をおこなった。相同組替え
体が得られた場合は、1200塩基対のDNAが増幅される。
【００２４】結果 上記したBFFに対するTVの導入実験を、計20回おこなっ
た。TV導入後、98穴培養プレートにまく細胞数は一回の
実験につき2×106であるので、総数4×107個のBFFを用
いたことになる。
た。TV導入後、98穴培養プレートにまく細胞数は一回の
実験につき2×106であるので、総数4×107個のBFFを用
いたことになる。
【００２５】結果は、計3個の相同組替え体を得た。TV
導入後に使用した98穴培養プレートの総数は400枚であ
る。98穴培養プレートの穴数を母数とした場合の相同組
替え体が得られる確率は0．07%であった。
導入後に使用した98穴培養プレートの総数は400枚であ
る。98穴培養プレートの穴数を母数とした場合の相同組
替え体が得られる確率は0．07%であった。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、α1-3 GT染色体遺伝子が
ノックアウトされた哺乳動物の体細胞が初めて提供され
た。本発明の体細胞を用いて体細胞クローニングを行う
ことにより、α1-3 GT遺伝子がノックアウトされた哺乳
動物個体が得られる。このような哺乳動物個体は、動物
臓器に存在するαGalと呼ばれる糖鎖抗原を欠いている
ので、その臓器をヒトに移植しても超急性拒絶反応は起
きない。従って、本発明は、異種臓器移植のドナーを提
供する上で大いに威力を発揮するものと期待される。
ノックアウトされた哺乳動物の体細胞が初めて提供され
た。本発明の体細胞を用いて体細胞クローニングを行う
ことにより、α1-3 GT遺伝子がノックアウトされた哺乳
動物個体が得られる。このような哺乳動物個体は、動物
臓器に存在するαGalと呼ばれる糖鎖抗原を欠いている
ので、その臓器をヒトに移植しても超急性拒絶反応は起
きない。従って、本発明は、異種臓器移植のドナーを提
供する上で大いに威力を発揮するものと期待される。
【００２７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL FEDERATION OF AGRICULUTURAL CO-OPERATIVE ASSOCIATIONS et al. <120> Somatic Cell in Which α1-3 galactosyl transferase gene is knocke d out and method for preparing the same <130> 00637 <160>
【００２８】 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer used for amplifying bovine α1-3 galactosyl transfer ase cDNA by PCR <400> 1 agctcagtag aacttggtac t 21
【００２９】 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer used for amplifying bovine α1-3 galactosyl tran sferase cDNA by PCR <400> 2 catctgatta ccacaggttc att 23
【００３０】 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying a DNA fragment by PCR during construc tion of targeting vector <400> 3 gcggatccta cattcccttc ggcgaagggg at 32
【００３１】 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying a DNA fragment by PCR during cons truction of targeting vector <400> 4 ccctcgagca ttgggaattt tgactggtc 29
【００３２】 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer used for amplifying a DNA fragment by PCR for identi fying clones in which the targeted gene was successfully knocked out <400> 5 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccg 27
【００３３】 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer used for amplifying a DNA fragment by PCR for id entifying clones in which the targeted gene was successfully knocked out <400> 6 gcatttatgt gccagccaca 20
【図１】本発明の実施例で行った相同組換えを模式的に
示す図である。
示す図である。
【図２】本発明の実施例で行った、ウシ体細胞への遺伝
子導入に用いたターゲティングベクターの構築方法を説
明するための模式図である。
子導入に用いたターゲティングベクターの構築方法を説
明するための模式図である。
【図３】図２の続きの工程を示す図である。
【図４】図３の続きの工程を示す図である。
【図５】図４の続きの工程を示す図である。
【図６】図５の続きの工程を示す図である。
【図７】図６の続きの工程を示す図である。
【図８】図７の続きの工程を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 横山 尚彦 東京都北区田端三丁目23番15−304号 (72)発明者 浦川 真実 北海道河東郡音更町木野大通東14丁目５− 29 (72)発明者 宇留野 勝好 北海道河東郡上士幌町東４線239 (72)発明者 青柳 敬人 北海道河東郡上士幌町字上士幌東３線233 −５号 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 CA05 DA02 EA04 GA30 HA19 HA20 4B063 QQ44 QR32 QR62 QR77 QS25 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC20 BA02 CA60
Claims (7)
- 【請求項１】 α1-3ガラクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子がノックアウトされた哺乳動物（マウス及びヒト
を除く）の体細胞。 - 【請求項２】 前記哺乳動物がウシである請求項１記載
の体細胞。 - 【請求項３】 線維芽細胞である請求項１又は２記載の
体細胞。 - 【請求項４】 哺乳動物（マウス及びヒトを除く）のゲ
ノミックα1-3ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子
中のエクソン領域の少なくとも一部を含むＤＮＡ領域
と、選択マーカー及びその上流にあり該選択マーカーの
発現を制御するプロモーターとを少なくとも含むＤＮＡ
断片とを相同組換えにより組換え、意図する組換えが起
きた細胞を選択することを含む、請求項１記載の体細胞
の作出方法。 - 【請求項５】 哺乳動物がウシである請求項４記載の方
法。 - 【請求項６】 相同組換えにより、ゲノミックα1-3ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子から排除される領
域が、ゲノミックα1-3ガラクトシルトランスフェラー
ゼ遺伝子の触媒領域のエクソン領域の直上流のイントロ
ン領域中にあるSma I部位から該エクソン領域のPst I部
位までの約1300 bpの領域である請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 意図する組換えが起きた細胞を選択する
操作は、前記プロモーターと前記選択マーカーを含む、
相同組換えによりゲノミック遺伝子中に挿入される断片
にハイブリダイズするプライマーと、ゲノミックα1-3
ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子中の染色体から
排除されない領域にハイブリダイズするプライマーを用
いたＰＣＲを行い、増幅産物が得られるか否かを調べる
ことを含む請求項４ないし６のいずれか１項に記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000202748A JP2002017360A (ja) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト体細胞及びその作出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000202748A JP2002017360A (ja) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト体細胞及びその作出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002017360A true JP2002017360A (ja) | 2002-01-22 |
Family
ID=18700232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000202748A Pending JP2002017360A (ja) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト体細胞及びその作出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002017360A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004298180A (ja) * | 2003-03-18 | 2004-10-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ゲノムが改変されたマウス |
| JP2010220615A (ja) * | 2003-03-18 | 2010-10-07 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | ゲノムが改変されたマウス |
| KR101178946B1 (ko) | 2008-02-01 | 2012-09-03 | 한국생명공학연구원 | 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터 |
-
2000
- 2000-07-04 JP JP2000202748A patent/JP2002017360A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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