JP2002012554A - ヒトのオキサリル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラー
ゼポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ(ＲＮＡ)を提供する。 【解決手段】ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラ
ーゼポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチ
ドを組換え技術により製造するための方法、およびその
ようなポリペプチドに対する抗体を製造するための方法
を開示する。尿結石形成およびシュウ酸過剰尿症の治療
のために治療上有効な量のポリペプチドを提供するため
の、本発明のポリペプチドと適当な薬学的担体との組合
わせもまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオ
チド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、
本発明のポリペプチドは、ヒトのオキサリル−ＣoＡデ
カルボキシラーゼである。

【０００２】尿中でのカルシウム−オキサレート結石の
形成がカルシウムとオキサレートの両方の飽和レベルに
依存することを、証拠は示唆することから、尿路での結
石形成(尿結石形成)を起こしやすい個体では、これらの
イオンの一方または両方の管理が重要であるらしい。尿
結石形成は、米国人の１０％以上を冒している一般的な
尿路問題である(Ｓierakowski,Ｒ.ら、Ｉnvest.Ｕro
l.、１５：４３８−４４１（１９７８）)。尿路結石
は、通常、それらの組成により分類されるが、シュウ酸
カルシウム単独またはリン酸カルシウムが混ざったシュ
ウ酸カルシウムからなるカルシウム結石が最も多く現れ
る(７０％)。シュウ酸カルシウムの沈降は、準安定状態
でのカルシウムとオキサレートの両方のイオンで飽和さ
れる尿に依存するが、オキサレートイオン濃度が尿シュ
ウ酸カルシウム結石の形成により重要であることが議論
されている。

【０００３】血漿および尿中のオキサレートの大部分
は、アスコルビン酸、グリオキシレートの、またより少
ない程度でトリプトファンの内因性代謝に由来する(Ｎa
th,Ｒ.ら、Ｐergamon Ｐress、５５−５８頁（１９８
４）)。さらに、尿オキサレートの１０％〜２０％は、
特に、葉の多い野菜および植物の摂取によって、食物か
ら吸収される。幸いにも、大抵の食物オキサレートは、
管腔内カルシウムにより結合されるらしく、また不溶性
塩として排泄される。従って、摂取されるカルシウムと
吸収されるオキサレートとの間には、逆の関係がある。
(Ｅrnest,Ｄ.Ｌ.ら、Ｇastroenterology、６６：１１１
４−１１２２（１９６４）)。

【０００４】オキサレートの異常合成または過剰吸収の
いずれかが、シュウ酸過剰尿症と呼ばれる重篤な病態を
もたらし得る(Ｌiedtke,Ｒ.Ｒ.ら、Ｕrol.Ｒes.、１
６：１８８−１８９（１９８８）)。この病態は遺伝学
的根拠を有し得るが、事例の非常に大部分は依然として
特発性のままである(Ｎath,Ｒ.ら、Ｐergamon Ｐress、
５５−５８頁（１９８４）)。基礎となる原因がカルシ
ウム代謝の妨害であろうと、または単なるオキサレート
レベルの増加であろうとも、ヒトにおける尿オキサレー
トレベルの増加とシュウ酸カルシウム結石疾患との間に
は、強い関連がある。

【０００５】尿路での結石形成の根拠およびこの障害を
治療するための方法は、近年、集中的な研究課題となっ
ている。血漿および尿オキサレート濃度を低下させる方
法として、植物から得られたオキサリル−ＣoＡデカル
ボキシラーゼ遺伝子がヒトの細胞に挿入されている。オ
キサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ遺伝子は、細菌Ｏx
alobacter formigenesからクローン化されている。Ｌun
g,Ｈ.Ｙ.ら、Ａm.Ｊ.Ｋidney Ｄis.、１７：３８１−５
（１９９１）。

【０００６】従って、血漿、また続いて尿中のオキサレ
ートレベルを低下させる酵素は、シュウ酸カルシウム結
石形成の発生率を減少させるであろう。

【０００７】本発明の一態様により、ヒトのオキサリル
−ＣoＡデカルボキシラーゼである新規成熟ポリペプチ
ド、さらにはまた、そのフラグメント、アナログおよび
誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源
のポリペプチドである。

【０００８】本発明の別の態様により、そのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたは
ＲＮＡ)を提供する。

【０００９】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドを組換え技術により製造するための方
法を提供する。

【００１０】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを治療目的、例えば、カルシ
ウム−オキサレート結石形成およびシュウ酸過剰尿症を
予防するのに利用するための方法を提供する。

【００１１】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。

【００１２】本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。

【００１３】以下の図面は、本発明の態様を説明するも
のであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定しようとするものではない。

【００１４】第１〜６図は、成熟オキサリル−ＣoＡデ
カルボキシラーゼポリペプチドのcＤＮＡ配列および対
応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準
的な３文字略号を使用する。

【００１５】第７及び８図は、細菌 Ｏxalobacter form
igenes由来のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ(上
の列)と本発明のポリヌクレオチド配列によりコードさ
れるポリペプチド(下の列)との間のアミノ酸配列の比較
である。

【００１６】第９図は、インビトロにおいて転写／翻訳
した後、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
をゲル上で電気泳動した結果を示す。レーン１は、ヒト
のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードする
プラスミドテンプレートである。レーン２は、ヒトのオ
キサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードする、Ｐ
ＣＲから生じたテンプレートであって、Ｍは、分子量マ
ーカーを表す。

【００１７】本発明の一態様により、第１〜６図の推定
アミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ポリペプチ
ド、または１９９４年３月１８日にＡＴＣＣ寄託番号第
７５７１５号として寄託されたクローンのcＤＮＡによ
りコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離さ
れた核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。

【００１８】本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの膵臓
から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見された。そ
れは、５７８アミノ酸残基の成熟タンパク質をコードす
る開放読み枠(オープンリーディングフレーム)を含む。
本発明のタンパク質は、細菌Ｏxalobacter formigenes
由来のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼに対し、
アミノ酸レベルで約５０−６０％相同である。相同性
は、細菌酵素のアミノ酸

【００１９】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、第１〜６図に示すコード配列または寄託されたクロ
ーンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コ
ードの重複または縮重の結果として、第１〜６図のＤＮ
Ａまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドを
コードする異なったコード配列であってもよい。

【００２０】第１〜６図の成熟ポリペプチドまたは寄託
されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ
得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペ
プチドのコード配列、およびリーダーもしくは分泌配列
またはプロプロテイン配列といったような付加的コード
配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場合によ
り、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコ
ード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／
または３'といったような非コード配列。

【００２１】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配
列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付
加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリ
ヌクレオチドを包含する。

【００２２】本発明はさらに、第１〜６図の推定アミノ
酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローン
のcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリ
ヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変
異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異
体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体
であり得る。

【００２３】従って、本発明には、第１〜６図に示すの
と同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポ
リヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、
第１〜６図のポリペプチドまたは寄託されたクローンの
cＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌ
クレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体および
付加並びに挿入変異体が含まれる

【００２４】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、第１〜６図に示すコード配列の天然に存在するアレ
ル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然
に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。
当業界で知られているように、アレル変異体は、１つま
たはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を
有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これ
は、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変え
ない。

【００２５】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細胞宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６
７（１９８４）)。

【００２６】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記
の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ
ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、
また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合に
のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを
意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１〜６図
のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質
的には保有するポリペプチドをコードする。

【００２７】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際は
いつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用
し、または販売するには、実施許諾が要求され得、また
そのような実施許諾は、ここでは付与されない。

【００２８】本発明はさらに、第１〜６図の推定アミノ
酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコー
ドされるアミノ酸配列を有するオキサリル−ＣoＡデカ
ルボキシラーゼポリペプチド、さらにはまた、そのよう
なポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体
に関する。

【００２９】第１〜６図のポリペプチドまたは寄託され
たcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場
合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」
という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ
生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味
する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切
断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチド
を製造することができるプロプロテインが含まれる。

【００３０】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。

【００３１】第１〜６図のポリペプチドまたは寄託され
たcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメ
ント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ
以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基
(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、ま
たそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコー
ドされるものであってもよく、またはコードされたもの
でなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミ
ノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟
ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる
化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他
の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーも
しくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用
される配列、またはプロプロテイン配列といったよう
な、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合している
ものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およ
びアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内で
あると思われる。

【００３２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。「単離された」と
いう用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然
に存在するなら、天然の環境)から除去されていること
を意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在
するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されて
いないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは
全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチド
はベクターの部分となり得、および／またはそのような
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分と
なり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天
然の環境の部分ではないという点で、なお単離されてい
る。

【００３３】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。

【００３４】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトラ
ンスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。
該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、フ
ァージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、
またはオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ遺伝子を
増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培
養することができる。温度、pＨ等といったような培養
条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培
養条件であって、当業者に明らかであろう。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロ
ウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったような
ウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベク
ターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能で
ある限り、使用することができる。

【００３６】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。

【００３７】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現
制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ
合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例とし
て、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダ
Ｐ_Ｌプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知
られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も
含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配
列も含み得る。

【００３８】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマ
ーカー遺伝子を含むのが好ましい。

【００３９】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主をトランスフォームするために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella ty
phimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；ＤrosophilaおよびＳf９といったような昆虫細
胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったよ
うな動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明
細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。

【００４０】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含んでなる。この実施態
様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該
配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配
列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが
多数、当業者に知られていて、市販されている。以下の
ベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ
６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pbs、pＤ１０、ファージス
クリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript Ｓ
Ｋ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮ
Ｈ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−
３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharm
acia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯ
Ｇ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、p
ＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他の
いずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中
で複製可能であって、生存可能である限り、使用するこ
とができる。

【００４１】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。

【００４２】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄi
bner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecula
r Ｂiology（１９８６）)。

【００４３】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。

【００４４】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 第２版、Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９)により記載
されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。

【００４５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。

【００４６】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピ
シリン耐性遺伝子並びにＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、および下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配
列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリ
ーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場
合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例え
ば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易
化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパ
ク質をコードすることができる。

【００４７】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなる
であろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主
には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typ
himurium、およびＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、
並びにＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。

【００４８】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadis
on、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。

【００４９】適当な宿主株をトランスフオーメーション
して、その宿主株を適当な細胞密度までの増殖させた
後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温
度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさら
なる期間培養する。

【００５０】細胞を、一般的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。

【００５１】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。

【００５２】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１
７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを
発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含ま
れる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および
５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。
ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、お
よびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転
写遺伝要素を与えることができる。

【００５３】オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポ
リペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法
により、組換え細胞培養物から回収して、精製すること
ができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成
熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することが
できる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰ
ＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。

【００５４】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。

【００５５】本発明のオキサリル−ＣoＡデカルボキシ
ラーゼポリペプチドを使用して、オキサレートイオンの
血漿および尿レベルを減少させることにより、尿結石形
成を予防することができる。

【００５６】本発明のオキサリル−ＣoＡデカルボキシ
ラーゼポリペプチドを使用して、シュウ酸過剰尿症をま
た治療または予防することもできる。シュウ酸過剰尿症
は、オキサレートの異常合成または過剰吸収のいずれか
により特徴付けられ、これは、オキサレートイオンの分
解により予防することができ、またこれが、この障害の
予防となり得る。

【００５７】本発明のポリペプチドは、同様の生物学的
活性を有する他の分子を同定するのに有用である。スク
リーニングの例は、既知のＤＮＡ配列を使用してオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成することにより、オキサリ
ル−ＣoＡデカルボキシラーゼ遺伝子のコード領域を単
離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補
的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトの
cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーを
スクリーニングするために使用して、ライブラリーのど
のメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定す
る。

【００５８】本発明は、オキサリル−ＣoＡデカルボキ
シラーゼの、その基質に対する相互作用を高める薬物
(アゴニスト)を同定するために、薬物をスクリーニング
する方法を提供する。アゴニストは、オキサリル−Ｃo
Ａデカルボキシラーゼの、その基質に対する親和性を増
加させる。例として、オキサレートイオンを薬物の存在
下に標識化オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼとイ
ンキュベートする。次いで、薬物がこの相互作用を高め
る能力を、当業界で既知の方法により測定することがで
きるであろう。

【００５９】オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼポ
リペプチドはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多
い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現に
より、本発明に従って使用することができる。

【００６０】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
スビボにおいてオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
をコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で
操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患
者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含
むレトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当業界で
既知の方法により操作することができる。

【００６１】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細
胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で
知られているように、細胞をインビボにおいて処理し
て、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるため
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投
与することができる。そのような方法により本発明のポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合
わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用
することができるアデノウイルスであってもよい。

【００６２】本発明のポリペプチドは、適当な薬学的担
体と組み合わせて使用することができる。そのような組
成物は、治療上有効な量のポリペプチド、および薬学上
許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのよう
な担体には、これに限定されるものではないが、生理食
塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含ま
れる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。

【００６３】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチドは、他
の治療化合物と共に使用することができる。

【００６４】該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、
筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、
便利な方法で投与することができる。オキサリル−Ｃo
Ａデカルボキシラーゼは、具体的な徴候を治療および／
または予防するのに有効な量で投与される。一般に、オ
キサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼは、少なくとも約
１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、
１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるで
あろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮
に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg
(体重)である。

【００６５】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と
関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。

【００６６】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。cＤＮＡ
のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１
つ以上のエクソンをスパン(span)しないプライマーを迅
速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。
次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含
む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用す
る。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらの
ハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与える
であろう。

【００６７】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマッピング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。

【００６８】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッ
ドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５００または６００塩基とい
う短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０
００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグ
ナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が
高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが得られるクローンの使用を
必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２,０
００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、
４,０００以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割
合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Ｖerma
ら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔech
niques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）
を参照。

【００６９】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。

【００７０】次に、病気に冒された個体と冒されていな
い個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定
する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまた
は全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体にお
いても認められないなら、その変異は疾患の原因となる
ものであるらしい。

【００７１】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。

【００７２】冒された個体と冒されていない個体との比
較は、通例、染色体スプレッドから見ることができる
か、またはそのcＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを利用し
て検出することができる、欠失またはトランスロケーシ
ョンといったような、染色体における構造変化を先ず探
す。最後には、変異の存在を確認するために、また変異
を多型性から区別するために、幾つかの個体由来の遺伝
子の完全な配列決定が必要とされる。

【００７３】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。

【００７４】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。次いで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。

【００７５】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗
体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁におい
て)が含まれる。

【００７６】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに
適合し得る。

【００７７】本発明はまた、シュウ酸過剰尿症に対する
感受性を検出するための診断アッセイにも関する。その
ようなアッセイは、血液または血清試料、尿等といった
ような試料中のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
レベルを検出することにより達成することができる。オ
キサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼレベルは、例え
ば、当業界で既知の方法によるイムノアッセイ技術によ
り検出することができる。そのようなアッセイの例は、
オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ抗原に、特異的
な２つの抗体、好ましくは、それらの抗体の１つが、例
えば、指示酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ
のような、適当な標識を結合させることにより標識され
ているモノクローナル抗体を利用するサンドイッチアッ
セイである。未標識化抗体は、固形担体上にあるのが好
ましい。抗原が存在するなら、抗原は両方の抗体に結合
するであろう。ペルオキシダーゼが結合した抗体を抗原
に結合させた後、そのペルオキシダーゼを利用して、測
定可能である着色生成物を生成させることができ、また
その濃度は、試料中の抗原の量と関係がある。酵素の触
媒的性質のため、その系はシグナルを大きく増幅する。
低レベルのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼは、
シュウ酸過剰尿症に対する感受性を表す。本発明をさら
に、以下の実施例に関して記載するが、しかし、本発明
は、そのような実施例に限定されないことを理解すべき
である。部または量は全て、特にことわらない限り、重
量単位である。

【００７８】以下の実施例の理解を容易にするために、
幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載
する。

【００７９】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されてい
て、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろ
う。

【００８０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮ
Ａ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。
特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者
により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従っ
て変えることができる。消化後、その反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメン
トを単離する。

【００８１】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇ
oeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。

【００８２】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さ
ないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェー
トを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ
イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、
脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートする
であろう。

【００８３】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。特にことわらない限り、トランスフォーメーション
は、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、
５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されて
いるようにして行った。

【実施例】

【００８４】実施例 １ オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼの細菌発現およ
び精製 最初に、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコー
ドするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５７１５号を、処理し
たオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼタンパク質の
５'および３'配列(シグナルペプチド配列なし)に対応す
るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅
し、Ｎco ＩおよびＢgl IIに対応する付加的ヌクレオチ
ドを各々、５'および３'配列に加えた。ＰＣＲフラグメ
ントの生成に使用したプライマーは、ヒトのオキサリル
−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードする配列中の制限
部位の他に、ＯmpＡリーダー配列をコードするであろ
う。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列： を有し、ＢspＨ Ｉ制限酵素部位、続いて、２１ヌクレ
オチドの、ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラー
ゼ遺伝子を含む；３'配列は、 であり、Ｂgl II制限酵素部位に対する相補的配列、翻
訳終止コドン、および少なくとも２０ヌクレオチドの、
ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコード
する配列を含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクタ
ー pＱＥ−６０(Ｑiagen,Ｉnc. ９２５９ Ｅton Ａv
e.、Ｃhatsworth、ＣＡ ９１３１１)上の制限酵素部位
に対応する。pＱＥ−６０は、抗生物質耐性(Ａmp^ｒ)、
細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモ
ーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(Ｒ
ＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードす
る。次いで、pＱＥ−６０をＮco ＩおよびＢgl IIで消
化した。増幅された配列をpＱＥ−６０にライゲートし
て、ヒスチジンタグをコードする配列およびＲＢＳと共
に枠内に挿入した。次いで、そのライゲーション混合物
を使用して、Ｑiagenから商標Ｍ１５／rep４で入手可能
なＥ.coli.株 Ｍ１５／rep４をトランスフォームした。
Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含
み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、またカナ
マイシン耐性(Ｋan^ｒ)も与える。トランスフォーマント
を、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定し
て、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択し
た。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認
した。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp(１００ug
／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ培地中で
の液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養
物を使用して、大きな培養物を１：１００〜１：２５０
の割合で播種した。細胞が、０.４〜０.６の光学密度６
００(Ｏ.Ｄ.^６００)まで増殖した。次いで、ＩＰＴＧ
(イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド)を、
最終濃度が１mＭとなるまで加えた。ＩＰＴＧは、lacＩ
リプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／Ｏのクリ
アリングを誘導し、遺伝子発現を増加させる。細胞をさ
らに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離
(６０００Ｘｇで２０分)により収集した。細胞ペレット
をカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中
で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジン
タグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条
件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィ
ーにより、可溶化したオキサリル−ＣoＡデカルボキシ
ラーゼを精製した。(Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｇenetic Ｅngin
eering、Ｐrinciples ＆Ｍethods、１２：８７−９８
（１９９０）)。ＧnＨＣlからのタンパク質の再生は、
幾つかのプロトコルにより成し遂げることができる。
(Ｊaenicke,Ｒ.およびＲudolph,Ｒ.、Ｐrotein Ｓtruct
ure−Ａ Ｐractical Ａpproach、ＩＲＬ Ｐress、ニュ
ーヨーク（１９９０）)。６モルのグアニジンＨＣl(pＨ
５.０)中、そのカラムからオキサリル−ＣoＡデカルボ
キシラーゼ(純度 ９５％)を溶出し、また再生の目的に
は、３モルのグアニジンＨＣl、１００mＭのリン酸ナト
リウム、１０ミリモルのグルタチオン(還元されている)
および２ミリモルのグルタチオン(酸化されている)に調
節した。

【００８５】実施例 ２ インビトロにおける転写および翻訳による ヒトのオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼの発現 ＴＮＴ Ｃoupled Ｒeticulocyte Ｌysate Ｓystem(Ｐro
mega、Ｍadison、ＷＩ)を用いて、オキサリル−ＣoＡデ
カルボキシラーゼのインビトロにおける転写および翻訳
を行った。オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをコ
ードするcＤＮＡをＥcoＲＩ〜ＸhoＩまで方向性に従っ
てクローン化し、ＥcoＲＩ部位は遺伝子の５'末端を規
定し、またＸhoＩ部位は遺伝子の３'末端を規定する。
遺伝子をＴ３の方向で挿入した。Ｔ３は、特異的プロモ
ーターを認識して、ＤＮＡをmＲＮＡに転写する、バク
テリオファージＲＮＡポリメラーゼを定義する。ウサギ
の網状赤血球ライゼートにＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを
補い、メッセージを転写するためにＴ３ ＲＮＡポリメ
ラーゼを、また新生ＲＮＡを翻訳するために網状赤血球
ライゼートを利用して、Ｔ３プロモーターによりタンパ
ク質の発現を行わせる。放射性アミノ酸を翻訳された生
成物に取り入れることにより、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、続いて、オートラジオグラフィーを
利用して、タンパク質発現を分析することができる。よ
り具体的には、オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
ＤＮＡを含むプラスミド１μgを、網状赤血球ライゼー
ト、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよび[^３５Ｓ]−メチオ
ニンと共に、３０℃で１時間インキュベートした。イン
キュベーション後、翻訳物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオ
ートラジオグラフィーにより分析した。主要な翻訳生成
物は、約５５Ｋdで見ることができた。先の教示から見
て、本発明の多数の変更および変化が可能であることか
ら、追記する請求の範囲内で、詳しく記載した以外に、
本発明を行うことができる。

【００８６】

【配列表】（１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： オルセン等 （ii） 発明の名称 ： ヒトのオキサリル−ＣoＡデカ
ルボキシラーゼ （iii） 配列の数 ： ２ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラ
ン，セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン （Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番 （Ｃ） 市 ： ローズランド （Ｄ） 州 ： ニュージャージー （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： 同日 （Ｃ） 分類 ： （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ （Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−８０ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００ （Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： １,８８２塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ５７８アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ：

【図面の簡単な説明】

【図１】 成熟オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
ポリペプチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ
酸配列を示す。

【図２】 成熟オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
ポリペプチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ
酸配列を示す（図１の続きの配列である）。

【図３】 成熟オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
ポリペプチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ
酸配列を示す（図２の続きの配列である）。

【図４】 成熟オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
ポリペプチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ
酸配列を示す（図３の続きの配列である）。

【図５】 成熟オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
ポリペプチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ
酸配列を示す（図４の続きの配列である）。

【図６】 成熟オキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼ
ポリペプチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ
酸配列を示す（図５の続きの配列である）。

【図７】 細菌 Ｏxalobacter formigenes由来のオキサ
リル−ＣoＡデカルボキシラーゼ(上の列)と本発明のポ
リヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド
(下の列)との間のアミノ酸配列の比較である。

【図８】 細菌 Ｏxalobacter formigenes由来のオキサ
リル−ＣoＡデカルボキシラーゼ(上の列)と本発明のポ
リヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド
(下の列)との間のアミノ酸配列の比較である（図７の続
きである）。

【図９】 インビトロにおいて転写／翻訳した後、ヒト
のオキサリル−ＣoＡデカルボキシラーゼをゲル上で電
気泳動した結果を示す。レーン１は、ヒトのオキサリル
−ＣoＡデカルボキシラーゼをコードするプラスミドテ
ンプレートである。レーン２は、ヒトのオキサリル−Ｃ
oＡデカルボキシラーゼをコードする、ＰＣＲから生じ
たテンプレートであって、Ｍは、分子量マーカーを表
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘンリック・オルセン アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ケンドリック・プレイス 182番 (72)発明者 ティモシー・エイ・コールマン アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ボックスベリー・テラス 7512番 (72)発明者 マーク・ディ・アダムス アメリカ合衆国20878メリーランド州ノー ス・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 DA06 EA03 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA44 CA18 DC01 NA14 ZA812 ZC022

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オキサリル−ＣoＡデカルボキシラー
   ゼが必要である患者を治療するための方法であって、治
   療上有効な量の、（ｉ）第１〜６図の推定アミノ酸配列
   （配列番号２）を有するオキサリル−ＣoＡデカルボキ
   シラーゼポリペプチド、並びにそのフラグメント、アナ
   ログおよび誘導体；および（ii）ＡＴＣＣ寄託番号第７
   ５７１５号のcＤＮＡによりコードされるオキサリル−
   ＣoＡデカルボキシラーゼポリペプチド、並びに該ポリ
   ペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体；より
   なる群から選択されるポリペプチドを患者に投与するこ
   とからなる方法。