JP2001520027A - チオレドキシン還元による食物蛋白質の消化性向上 - Google Patents

チオレドキシン還元による食物蛋白質の消化性向上

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Abstract

(57)【要約】 小ジチオールタンパク質であるチオレドキシンは、主要食物タンパク質、アレルゲン性タンパク質、及び、特に動物及び植物源に由来する広範囲の食品に存在するアレルゲン性タンパク質に対する特異的な還元剤である。すべての標的タンパク質は、チオレドキシンによりスルフヒドリル（SH）レベルに還元されるジスルフィド（S-S）結合を含んでいる。このタンパク質は、酸化（S-S）状態においてはアレルゲン的に活性であり、消化性が低い。還元（SH状態）されたとき、アレルゲン性を喪失し及び／又は消化性が高くなる。NADP-チオレドキシンレダクターゼを経てNADPHにより（生理学的条件）又は化学的還元剤であるジチオスレイトールにより活性化（還元）されたとき、チオレドキシンは還元を行う。感作したイヌを用いた皮膚試験及び給餌実験により、摂取前の還元チオレドキシンによる処理により食品のアレルゲン性を除去又は減少させることが示された。研究により、チオレドキシン還元後のペプシン及びトリプシンによる食品及び食物タンパク質の消化が増加したことが示された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、出願番号第０８／３２６９７６号（１９９４年１０月２１日）の部
分継続出願であり、後者は出願番号第０８／２１１６７３号（１９９４年４月１
２日）の部分継続出願であり、さらに後者は出願番号第０７／９３５００２号（
１９９２年８月２５日、現時点で放棄）の部分継続出願であり、さらに後者は出
願番号第０７／７７６１０９号（１９９１年１０月１２日、現時点で放棄）の部
分継続出願である。
【０００２】 本発明は、チオールレドックス蛋白質を使用して、種子蛋白質（例えば穀物蛋
白質）、酵素インヒビター蛋白質、蛇毒蛋白質および他のある種の蛋白質の分子
内ジスルフィド結合を還元することに関する。より具体的には、本発明はチオレ
ドキシンおよびグルタレドキシンを使用して、グリアジン、グルテニン、アルブ
ミンおよびグロブリンを還元して練り粉（ドウ）および焼き上げ製品の品質を改
善し新規なドウを作出し、さらに、シスチン含有蛋白質（例えばアミラーゼおよ
びトリプシンインヒビター）を還元して飼料および穀物製品の品質を改善する。 さらに、本発明は、プルラナーゼを抑制する新規な蛋白質の単離およびこの新
規な蛋白質のチオールレドックス蛋白質による還元を含む。本発明は、さらに油
貯蔵種子に特徴的な２Ｓアルブミン蛋白質のチオレドキシンによる還元を含む。
さらにまた、本発明は、ヘビ神経毒並びにある種の昆虫およびサソリ毒のin vit
roでの不活化および各個体での対応する毒性の治療を含む。本発明はまた、チオ
レドキシンを用いて、食物アレルゲンのアレルギー誘発性を減少させ、食物蛋白
質の蛋白質分解および食品の消化性を高めることを含む。
【０００３】 本発明は、米国科学財団（National Science Foundation)のグラントコントラ
クトＤＣＢ８８−２５９８０号およびＤＭＢ８８−１５９８０号によって政府の
支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００４】従来技術 葉緑体は、フェレドキシン、フェレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ並
びにチオレドキシンｆおよびｍで構成されるフェレドキシン／チオレドキシン系
を含む。チオレドキシンｆおよびｍは、光と光合成酵素の調節を結びつける（B.
B. Buchanan(1991), "Regulation of CO2 assimilation in oxygenic photosynt
hesis: The ferredoxin/thioredoxin sysytem.Perspective om its discovery,
present status and future development", Arch. Biochem. Biophys. 288:1-9;
R. Scheibe(1991), "Redox-modulation of chloroplast enzymes. A common pr
inciple for individual control", Plant Physiol. 96:1-3)。いくつかの研究 によって、植物はまた、動物およびほとんど微生物について確立された系と類似
する系を含むことが示された。この系では、チオレドキシン（ｈ型）は、以下の
ようにＮＡＤＰＨおよび酵素ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）
によって還元される：
【０００５】 NTR (1) NADPH+H++チオレドキシンｈ 酸化―→NADP+チオレドキシンｈ 還元
【０００６】 （F.J. Florencio et al.(1988), Arch. Biochem. Biophys. 266:496-507; T.C.
Johnson et al.(1987), Plant Physiol. 85:446-451; G. Suske et al.(1979),
Z. Naturforsch, C. 34:214-221)。これまでに証明された事柄によって、ＮＡＤ
Ｐ／チオレドキシン系は、植物組織に広く分布し、さらにミトコンドリア、小胞
体および細胞質ゾルに収納されていると言われている（J. Bodenstein-Lang et
al.(1989), FEBS Lett.258:22-26; F. Marcus et al.(1991), Arch. Biochem. B
iophys. 287:195-198)。 チオレドキシンｈはまた、炭水化物代謝の細胞質ゾル酵素、ピロホスフェート
フラクトース−６−Ｐ、１−ホスホトランスフェラーゼまたはＰＦＰを還元によ
って活性化させることが知られている（F. Kiss et al.(1991), Arch. Biochem.
Biophys. 287:337-340)。
【０００７】 種子は、ＮＡＤＰ／チオレドキシン系が植物生理活性の基であるとされる唯一
の組織である。さらにまた、チオレドキシンｈは、実験室でチオニンを還元する
ことが示された（T.C. Johnson et al.(1987), Plant Physiol. 85:446-451）。
チオニンは可溶性の穀物種子蛋白質でシスチンに富む。ジョンソンらの研究では
、コムギのプロチオニンは、下記の等式２および３にしたがいＮＡＤＰ−チオレ
ドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）およびチオレドキシンｈを介してＮＡＤＰＨに
よって実験的に還元された。
【０００８】 NTR (2) NADPH+チオレドキシンｈ 酸化―→NADP+チオレドキシンｈ 還元 (3) ピューロチオニン酸化+チオレドキシンｈ 還元―→ピューロチオニン還元+チ
オレドキシンｈ 酸化
【０００９】 例えばコムギ、ライムギ、オオムギ、トウモロコシ、アワ、モロコシおよびコ
メのような穀物種子は、４つの主要な蛋白質群を含有する。これらの４つの群は
、アルブミン、グロブリン、グリアジンおよびグルテニンまたは同等な蛋白質で
ある。チオニンはアルブミン群に属する。現在のところ、コムギおよびライムギ
は、麸質（グルテン）またはドウが形成されるただ２つの穀物である。グルテン
は、ドウに粘着性を与える粘りけのある弾性およびゴム様蛋白質複合体である。
グルテンは主にグリアジンおよびグルテニン蛋白質で構成される。それは、ライ
ムギまたはコムギのドウが水で洗浄されたときに形成される。パンのドウにその
弾性型特性を与えるのはグルテンである。他の主要な穀類（オオムギ、トウモロ
コシ、モロコシ、エンバク、アワおよびコメ）に由来する粉さらに植物（ダイズ
）に由来する粉では、コムギやライムギで用いられる条件下ではグルテン様ネッ
トワークは得られない。
【００１０】 グルテニンおよびグリアジンはシスチン含有種子貯蔵蛋白質で不溶性である。
貯蔵蛋白質とは、発芽中に分解され、発芽中の苗木の成長と発生のために使用さ
れる種子中の蛋白質である。プロラミンは、グリアジンに匹敵するコムギ以外の
穀粒中の貯蔵蛋白質で、一方、グルテリンは、グルテニンに匹敵するコムギ以外
の穀粒中の貯蔵蛋白質である。コムギの貯蔵蛋白質は全種子蛋白質の総計８０％
を占める（D.D. Kasarda et al.(1976), Adv. Cer. Sci. Tech. 1:158-236; T.B
. Osborne et al.(1893), Amer. Chem. J. 15:392-471)。グルテニンおよびグリ
アジンはドウの形成、したがってパンの品質に重要であると考えられる。種子貯
蔵蛋白質の可溶性は還元にしたがって増加することがin vitroのの実験から判明
した（P.R. Shewy et al.(1985), Adv. Cer. Sci. Tech. 7:1-83）。しかしなが
ら以前にはグルテニンおよびグリアジンの還元はドウの品質を改善させるよりは
むしろ低下させると考えられていた（L.K. Dahle et al.(1966), Cereal Chem.
43:682-688）。これは、おそらく化学還元剤による非特異的還元がドウの軟化を
もたらしたためである。“ ストレートドウ”および“ 予備醗酵”法は、ドウの
製造およびその後の酵母でふくらませるパン製品の製造では２つの主要な一般的
方法である。
【００１１】 ストレートドウ法の場合、粉、水または他の液体および他のドウ成分（これに
は酵母、穀粒、塩、ショートニング、砂糖、酵母栄養物、ドウコンディショナー
および保存料が含まれるがこれらに限定されない）の全てを混ぜ合わせてドウを
作り、混合して部分的または完全にデベロップさせる。得られたドウを個々の工
程または所望の最終製品の特性に応じて一定の時間醗酵させることができる。
【００１２】 次の工程は、機械または手作業によって、焼き上げ後に目的の正味重量を確実
に達成できるように十分な重量を有する適切なサイズにドウを分割することであ
る。このドウ片はしばしば丸められ様々な時間寝かせられる（中間検査（Interm
ediate Proof))。これによってシーティングおよびモールディング調製の前にド
ウを“ リラックス”させることができる。この時間は通常５−１５分であるが 、個々の処理工程の条件および調合に応じて大きく変動させることができる。続
いてドウ片を機械的または手作業によって適切な形状にし、通常はその後ベーキ
ングの前に最後の“ 検査”が施される。続いて、所望の最終製品を得るために ドウ片を種々の時間、温度および蒸気条件で焼き上げる。
【００１３】 予備醗酵法では、酵母を他の成分と混合し、パンまたはロールドウを最終混合
する前に種々の時間醗酵させる。これらのシステムに関する製パン業用語には“
水醸造（Water Brew）”、“ 液体醗酵”、“ リキッドスポンジ”および“ ス
ポンジ／ドウ”が含まれる。０−１００％の割合の粉を他の成分と混合する。他
の成分には水、酵母栄養物およびドウコンディショナーが含まれるがこれらに限
定されない。混合物を一定時間規定条件下または周囲環境条件下で醗酵させる。
典型的な時間は１−５時間の範囲である。醗酵物はそのまま使用するか、または
後で使用するために冷却してバルクタンクまたはこね桶に保存する。残りの成分
を添加し（粉、固有の成分、さらに別の添加物、さらに添加される水など）、ド
ウを混合して部分的または完全にデベロップさせる。
【００１４】 続いてドウを種々の時間醗酵させる。典型的には、残りの成分の添加前にある
程度の醗酵が生じるので、必要な時間は極めて短い（すなわち１０−２０分）が
、装置および製品のタイプにしたがって変動が見られる。第二の醗酵工程の後、
続いてドウをストレートドウ法のように処理する。
【００１５】 本明細書で用いられるように、“ ドウ混合物”という用語は、粉または荒挽 き粉および液体（例えばミルクまたは水）を最小限含む混合物を指す。 本明細書で用いられるように、“ ドウ”という用語は、粉または荒挽き粉お よび液体（例えばミルクまたは水）を最小限含む、弾性を有する柔軟な蛋白質ネ
ットワーク混合物を指す。 本明細書で用いられるように、“ ドウ成分”という用語は、以下の成分のい ずれか（ただしこれらに限定されない）を含む：粉、水または他の液体、穀粒、
酵母、スポンジ、塩、ショートニング、砂糖、酵母栄養物、ドウコンディショナ
ーおよび保存料。
【００１６】 本明細書で用いられるように、“ 焼き上げ製品”には全てのタイプのパン、 酵母醗酵および化学醗酵パン、並びに白パンおよびバラエティーパン、並びにロ
ール、イングリッシュマッフィン、ケーキおよびクッキー、砂糖菓子被覆物、ク
ラッカー、ドーナツおよび他の甘味を有するドウ製品、パイおよびピザ外皮、プ
レッツェル、平パンおよび他の偏平パン、トルティーヤ、パスタ製品、並びに冷
蔵および冷凍ドウ製品が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００１７】 チオレドキシンは粉中のアルブミンを還元するために用いられてきたが、チオ
ールレドックス蛋白質は、グルテニンおよびグリアジンにも他の水に不溶性の貯
蔵蛋白質にも用いられたことがなく、またドウおよび焼き上げ製品の品質向上に
も用いられたことがない。チオールレドックス蛋白質はまたグルテンの品質改善
、したがってその価値の向上のために用いられたこともなく、穀類（例えばオオ
ムギ、トウモロコシ、モロコシ、エンバク、アワおよびコメ）もしくはダイズ粉
からドウを製造するために用いられたこともない。
【００１８】 多くの穀類種子はまた、外来酵素の抑制物質として作用することが判明した蛋
白質を含む。これらの酵素インヒビターは、ある種の有害な微生物に対して防御
作用を有することが示唆されている（F. Garcia-Olmedo et al.(1987), Oxford
Surveys of Plant Molecular and Cell Biology 4:275-335; Y. Birk (1976), M
eth. Enzymol. 45:695-739; M. Laskowski, J.(1980), Ann. Reo. Biochem. 49:
593-626)。そのようなタイプの２つの抑制物質は、アミラーゼインヒビターおよ
びトリプシンインヒビターである。さらに、オオムギのプロテインインヒビター
（本実験では検査しなかった）は、同じ供給源に由来するα−アミラーゼを抑制
するという証拠が得られている（R.J. Weselake et al.(1983), Plant Physiol.
72:809-812)。
【００１９】 残念ながら、インヒビター蛋白はしばしば望ましくない作用をある種の食品に
引き起こす。ダイズのトリプシンインヒビター、特にクニツ（Kunitz）トリプシ
ンインヒビター（ＫＴＩ）およびボウマン＝バーク（Bowman-Birk)トリプシンイ
ンヒビター（ＢＢＴＩ）蛋白の場合、いずれのダイズ製品も人または家畜が摂取
する前に先ず不活化されねばならない。これら２つのインヒビター蛋白は、水素
化ホウ素ナトリウムによって化学的に還元されたときトリプシンインヒビターと
して活性を失うことが知られている（Y. Birk(1985), Int. J. Peptide Protein
Res. 25:113-131; Y. Birk(1976), Meth. Enzymol. 45:695-739）。プロテアー
ゼを抑制する他の蛋白質と同様にこれらのインヒビターは分子内ジスルフィドを
含み、通常は熱および蛋白分解による不活化に対して安定である（Birk(1976)上
掲書；Garcia-Olmedo et al.(1987)上掲書；Ryan(1980)）。現在のところ、イン
ヒビターによってもたらされる悪影響を最小限にするために、これらダイズのト
リプシンインヒビターおよび動物および人間の食品中の他のトリプシンインヒビ
ターはこれら食品を高温に暴露することによって処理されている。しかしながら
、加熱処理は完全にはインヒビター活性を排除しえない。さらに、この処理工程
は高価であるだけでなく、重要な栄養的価値をもつ他の蛋白質の多くもまた破壊
する。例えば、１２０℃３０分でダイズ粉のＢＢＴＩの完全な不活化が得られる
が、最初のＫＴＩ活性の約２０％が残存する（Friedman et al.(1991))。インヒ
ビターの完全な不活化に要求されるより長時間のまたはより高温での処理によっ
て、シスチン、アルギニンおよびリジンのようなアミノ酸が破壊される（Chae e
t al.(1984); Skrede & Krogdahl(1985)）。
【００２０】 さらにまた、α−アミラーゼ活性を必要とするいくつかの工業的な方法が存在
する。１例は、オオムギで麦芽をつくるもので、これは活性なα−アミラーゼを
必要とする。チオールレドックス蛋白質還元による、オオムギのアミラーゼ／ズ
ブチリシン（ａｓｉ）インヒビターおよび他の穀類におけるその同等物のごとき
インヒビターの不活化は、現在用いられている工程よりもより迅速にα−アミラ
ーゼの活性を完全に発揮させ、それによって麦芽生成または同様なプロセスに必
要な時間を短縮させることができる。
【００２１】 チオールレドックス蛋白質は以前にもトリプシンまたはアミラーゼインヒビタ
ー蛋白を不活化するために用いられた。トリプシンインヒビター（例えばクニツ
およびボウマン＝バークインヒビター蛋白）の還元によってそれらの抑制作用は
低下した（Y. Birk(1985), Int. J. Peptide Protein Res. 25:113-131）。人お
よび家畜消費用にデザインされたダイズ製品中のインヒビターのチオールレドッ
クス蛋白質連関還元では加熱を必要としないかまたは蛋白質変性のために現在必
要とされている温度より低い温度が要求され、したがって変性のためのコストが
削減され、さらにダイズ蛋白質の品質が向上するであろう。食品製造業界では化
学添加物に代わるものを探索しているので、生理学的還元剤、いわゆるクリーン
添加物（すなわち“ 有害な化学物質”と見なされる成分を含まない添加物）は 極めて望ましい。さらにまた、粉の品質にとって重要なコムギおよび種子の主要
な貯蔵蛋白質（例えばグリアジンおよびグルテニン）を生理的還元剤（例えばチ
オールレドックス蛋白質）によって制御された態様で選択的に還元する能力は、
コムギおよびライムギに由来するドウの特性を改善するために、さらに他の穀粒
粉（例えば穀類の粉）またはキャッサバもしくはダイズの粉からドウを製造する
ために製パン業界では有用であろう。
【００２２】 油を貯蔵する種子（例えばヒマの実およびブラジルナッツ）（Kreis et al.(1
989); Youle & Huang(1981))に特徴的な２Ｓアルブミン蛋白質族（これらは胚乳
または子葉内の蛋白小体内に収納されている（Ashton et al.(1976); Weber et
al.(1980))は、典型的には２つの分子内ジスルフィド結合によって連結された異
なるサブユニット（１つは７から９ｋＤａおよび他方は３から４ｋＤａ）から成
る。大きい方のサブユニットは２つの分子内ジスルフィド基を含み、小さい方の
サブユニットはジスルフィド基をもたない。２Ｓ大サブユニットの分子内ジスル
フィドは、ダイズのボウマン＝バークインヒビターのものと相同性を示す（Krei
s et al.(1989)）が、生理学的条件下で２Ｓ蛋白質が還元を受ける能力について
は全く分かっていない。
【００２３】 これらの２Ｓアルブミン蛋白質はメチオニンに富む。最近になって、ブラジル
ナッツの２Ｓ蛋白質を産生する遺伝子導入ダイズが作製された。そのようなダイ
ズの２Ｓ蛋白質の還元はドウのネットワークへのダイズ蛋白の取り込みを高め、
メチオニンに富むダイズパンを作ることができるであろう。さらに、これら２Ｓ
蛋白質はしばしばアレルゲンとなる。２Ｓ蛋白質の還元はそのアレルギー活性を
消失させるであろう。
【００２４】 プルラナーゼ（“ 分枝除去酵素”）は、穀物種子の胚乳澱粉をα−１，６結 合を切断することによって分解させる酵素である。プルラナーゼは、醸造工業お
よびベーキング工業にとって基本的な酵素である。プルラナーゼは、麦芽生成お
よび添加砂糖または他の炭水化物の非存在下で実施されるある種のベーキング工
程で澱粉を分解するために必要である。適切なプルラナーゼ活性を得ることは、
特に麦芽製造工業では問題である。ジチオスレイトール（ＤＴＴ；チオレドキシ
ンのための化学的還元剤）は穀物調製物（例えばオオムギ、エンバクおよびコメ
粉）のプルラナーゼを活性化することが随分前から知られていた。生理学的に許
容できる系を用いてプルラナーゼ活性を惹起させ適切に高める方法は、より迅速
に麦芽を生成する方法につながり、さらに砂糖の利用性を高めることによりアル
コール含有量を高めたアルコール飲料（例えばビール）が得られるであろう。
【００２５】 ヘビによる咬傷に起因する死亡および永久的損傷は、多くのアフリカ、アジア
および南米諸国の重大な問題であり、さらにまた米国の南部および西部のいくつ
かの地域における主要な問題でもある。ヘビの蛇毒は、分子内（鎖内）シスチン
、およびいくつかの事例では分子間（鎖間）シスチンに存在するジスルフィド（
Ｓ−Ｓ）架橋を有する活性蛋白成分（一般に数個）を特徴とする。ある毒素基内
のシスチンの位置は非常に保存的である。毒性に対する分子内Ｓ−Ｓ基の重要性
は、これらの基の還元はマウスでの毒性の消失をもたらすという報告から明らか
である（C.C. Yang(1967), Biochim. Biophys. Acta. 133:346-355; B.D. Howar
d(1977), Biochemistry 16:122-125）。ヘビ神経毒は、運動神経末端から神経伝
達物質の遊離を変化させ、シナプス前でもシナプス後でも機能できる蛋白質であ
る。ヘビ神経毒により障害された個体で観察される共通の症状には、浮腫、水腫
、疼痛、めまい、患部の痛みまたは麻痺、けいれん、筋肉収縮、腎不全とともに
長期におよぶ壊死および個体の全体的衰弱などが含まれる。
【００２６】 シナプス前神経毒は２つの群に分類される。第一の群、β−神経毒には３つの
異なる種類の蛋白質が含まれ、各々は、高度の保存性を示すホスホリパーゼＡ2 成分を有する。ホスホリパーゼＡ2活性をもたらす蛋白質は６から７つのジスル フィド架橋を有する。β−神経毒に属するものは単鎖（例えばコードトキシン、
ノテキシンおよびアグキストロトキシン）または多鎖（例えばクロトキシン、セ
ルレオトキシンおよびヴィペラトキシン）のいずれかである。β−ブンガロトキ
シン（これは２つのサブユニットで構成される）は第三の群を構成する。これら
サブユニットの１つは、哺乳類の膵臓のクニツ型プロテイナーゼインヒビターと
相同である。多鎖β−神経毒はそれらの蛋白成分がイオン的に連結され、一方、
β−ブンガロトキシンの２つのサブユニットは分子間ジスルフィドにより供給結
合によって連結されている。β−ブンガロトキシンのＢ鎖サブユニット（これも
また哺乳類の膵臓のクニツ型プロテイナーゼインヒビターと相同である）は３つ
のジスルフィド結合を有する。
【００２７】 第二のシナプス前毒素群、促進性神経毒は酵素活性を欠き、２つの亜群を有す
る。第一の亜群、デンドロトキシン類は、哺乳類の膵臓のクニツ型トリプシンイ
ンヒビターと相同な５７から６０のアミノ酸をもつただ１つのポリペプチド配列
を有し、電圧感受性カリウムチャンネルを阻害する。第二の亜群、例えばファシ
クリン類（例えばファシクリン１およびファシクリン２）はコリンエステラーゼ
インヒビターで、それ以外には重点的に研究されていない。
【００２８】 シナプス後神経毒は長神経毒または短神経毒のいずれかに分類される。各型は
Ｓ−Ｓ基を含むが、ペプチドは固有でホスホリパーゼＡ2にもクニツまたはクニ ツ型インヒビター蛋白にも類似しない。短神経毒（例えばエラブトキシンａおよ
びエラブトキシンｂ）は６０から６２アミノ酸の長さで４つの分子内ジスルフィ
ド結合を有する。長神経毒（例えばα−ブンガロトキシンおよびα−コブラトキ
シン）は６５から７４残基を含み、５つの分子内ジスルフィド結合を有する。ま
た別の型の毒素、細胞毒はシナプス後作用を示すが、その毒性態様は明らかにさ
れていない。これらの細胞毒は不明瞭な薬理作用（例えば溶血、細胞溶解、筋肉
の脱分極）を示す。それらは神経毒よりも毒性は少ない。細胞毒は通常は６０ア
ミノ酸を含み、４つの分子内ジスルフィド結合を有する。ヘビ神経毒は全て複数
の分子内ジスルフィド結合を有する。
【００２９】 有毒なヘビの咬傷を治療するために個体の救急治療後に用いられる従来のヘビ
抗毒素は、主としてウマで製造した蛇毒抗体の静脈注射を必要とする。蛇毒の侵
入後どの程度の期間、蛇毒抗体を投与できるか、さらに有効であるかは不明であ
るが、２４時間までの使用が推奨されている。蛇毒抗体治療は一般には静脈液（
例えば血漿）、アルブミン、血小板または特異的凝集因子の投与によって達成さ
れる。さらに、補助医薬、例えば抗生物質、抗ヒスタミン剤、抗破傷風薬剤、鎮
痛剤、鎮静剤がしばしば投与される。いくつかの事例では、ショック、腎不全お
よび呼吸不全を最小限にするために一般的治療手段がとられる。咬傷近傍にカル
シウム−ＥＤＴＡを投与し、さらに傷の周辺を除去する以外には、毒素の中和お
よび血流中への毒素取り込みの予防につながる限局化のための治療手段は知られ
ていない。これらの限局化治療の意義には問題があり、さらにウマ血清に感受性
を有する個体にはこれらの治療は通常は留保される（F.E. Russell(1983), "Sna
ke Venom Poisning", Schollum International, Inc. Great Neck, NY)。 本明細書で規定される“ 個体”という用語は人または動物を指す。
【００３０】 現在使用されている蛇毒抗体のほとんどは、ウマ血清に感受性を有する患者（
患者の５％）でアレルギー反応をもたらす以外に有害な副作用を生じるという点
で問題が多い。非アレルギー反応には発熱性ショックおよび補体枯渇が含まれる
（J.P. Chippaur et al.(1991), "Reptile Venoms and Toxins"(A.T. Tu, ed.),
Marcel Dekker, Inc., pp.529-555）。
【００３１】 チオレドキシンは、ＮＡＤＰＨおよびチオレドキシンレダクターゼの存在下で
細菌の神経毒（破傷風およびボツリヌスＡ）をin vitroで還元することが示され
た（G. Schiavo et al.(1990), Infection and Immunity 58:4136-4141; A. Kis
tner et al.(1992), Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 345:227-234）。
チオレドキシンは、破傷風毒素の鎖間ジスルフィド連結の還元に有効で、そのよ
うにして還元された破傷風毒素はもはや神経毒性をもたない（Schiavo et al.上
掲書）。しかしながらボツリヌスＡ毒素のチオレドキシンによる鎖間ジスルフィ
ドの還元ははるかに緩慢であると報告された（Kistner et al.上掲書）。本発明
の中で調べたヘビの神経毒とは対照的に、破傷風研究グループ（Schiavo et al.
上掲書）は、その破傷風毒素について実施した研究で、チオレドキシン還元毒素
は鎖間ジスルフィド結合を還元したという証拠を見出せなかった。さらにまた、
ボツリヌスで実施された研究でチオレドキシンが鎖間ジスルフィドを還元したと
いう証拠も得られなかった。破傷風およびボツリヌス毒素は、ヘビ神経毒とは以
下の点で極めて異なる蛋白質である。（１）ヘビ神経毒は低分子量であり、（２
）分子内ジスルフィド結合に富み、（３）トリプシンおよび他の動物性プロテア
ーゼに耐性を有し、（４）酵素改変（例えばタンパク分解性切断）なしに活性を
示し、（５）多くの事例で動物性蛋白質（例えばホスホリパーゼＡ2およびクニ ツ型プロテアーゼ）と相同性を示し、（６）ほとんどの事例で、分子間ジスルフ
ィド結合を欠き、さらに（７）熱およびプロテアーゼのような因子に対し安定で
ある。
【００３２】 １％β−メルカプトエタノールとの６時間保温および８Ｍ尿素＋３００ｍＭβ
−メルカプトエタノールとの保温によるin vitroでのヘビ神経毒の還元的不活化
が、文献に報告された（B.D. Howard et al.(1977), Biochemistry 16:122-125;
C.C. Yang(1967), Biochim. Biophys. Acta. 133:346-355)。しかしながら、こ
れらの条件は生理学的なものからほど遠い。本明細書で規定するように、毒素蛋
白質についての“ 不活化”という用語は、毒素がレセプターに結合できないと いう点で、もはやin vitroで生物学的に活性をもたないということを意味する。
さらに本明細書で用いられるように、“ 無毒化”とは“ 不活化”という用語の
延長であり、毒素が動物の毒性試験によって決定されるように個体内で中和され
たことを意味する。
【００３３】 蜂毒は少なくとも４０の個々の成分による複合体の混合物で、主要成分をメリ
チンおよびホスホリパーゼＡ2として含有し（それぞれ蜂毒の全重量の５０％お よび１２％を占める）、さらに微量成分、例えば小型蛋白質およびペプチド、酵
素、アミンおよびアミノ酸を含む。 メリチンは、２６のアミノ酸から成る分子量２８４０のポリペプチドである。
それはジスルフィド架橋をもたない。油水界面に対する高い親和性の故に、この
蛋白質は細胞膜のリン脂質二重層にその編成構造を攪乱しながら浸透する。メリ
チンは単独では毒性をもたないが、膜構造を変化させ、それによって蜂毒に存在
するホスホリパーゼＡ2の加水分解活性、他の主要な成分および主要アレルゲン を増強させる。
【００３４】 蜂毒ホスホリパーゼＡ2は１２８のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖で、４つの ジスルフィド架橋によって架橋され、炭水化物を含んでいる。蜂毒の主な毒性作
用は、メリチンに付随して達成されるホスホリパーゼＡ2の強力な加水分解活性 によるものである。 蜂毒の他の毒性蛋白質は低分子量を有し、重要な構造的役割を果たすように思
われる少なくとも２つのジスルフィド架橋を含む。それらに含まれるものは、プ
ロテアーゼインヒビター（６３−６５アミノ酸）、ＭＣＤまたは４０１−ペプチ
ド（２２アミノ酸）およびアパミン（１８アミノ酸）である。
【００３５】 数千種のハチが存在するが、ミツバチ（Apis mellifera）のみが顕著なアレル
ギー反応を引き起こす。この反応は、局所の不快感から致死的な全身反応、例え
ばショック、低血圧、呼吸困難、意識不明、ぜい鳴呼吸および／または胸部圧迫
まで範囲が広い。このような事例で用いることができるただ１つの治療はエピネ
フリンの注射である。
【００３６】 ハチの刺し傷の治療で重要なものはアレルギー反応について個体を治療するこ
とだけではない。“ キラー”またはアフリカ化バチ、多様なミツバチはヨーロ ッパ型ミツバチよりもはるかに攻撃的で、南北両アメリカの危険の代表である。
アフリカ化およびヨーロッパ型バチの蜂毒の致死性は同じであるように思われる
が（M. Schumacher et al.(1989), Nature 337:413）、蜂の巣での行動パターン
は完全に異なっている。アフリカ化バチはコロニーの攪乱により迅速により多く
の数で反応し、より多くの刺し傷をもたらす（A.M. Collins et al.(1982), Sci
ence 218:72-74）。アフリカ化バチの集団攻撃は、１個体に数千の刺し傷をもた
らし死を招く。“ キラー”バチは、アフリカ型バチ（Apis mellifera scutella
ta)およびヨーロッパ型バチ（Apis mellifera mellifera）との間の種間交配の 結果と思われる。アフリカ型バチは、熱帯にいっそう順応したハチで蜂蜜生産を
改善する目的で１９５６年にブラジルに導入された。アフリカ化バチは南アメリ
カから北アメリカに移動し、テキサスおよびフロリダでそれらが報告された。
【００３７】 メキシコ、ブラジル、北アフリカおよび中東のいくつかの地域では、サソリは
人に生命の危険性を与えている。しかしながら、ブシデ（Buthidae）科のサソリ
だけ（Androctonus、Buthus、Centruroides、LeiurusおよびTityus属）が人に毒
性をもつ。サソリ毒の化学組成はヘビまたはハチ毒のような複合体ではない。サ
ソリ毒はムコ多糖類、少量のヒアルロニダーゼおよびホスホリパーゼ、低分子量
分子、プロテアーゼインヒビター、ヒスタミン遊離物質および神経毒（例えばセ
ロトニン）を含んでいる。この神経毒は、神経筋接合部の電圧感受性イオンチャ
ンネルに影響を与える。この神経毒は３つから４つのジスルフィド架橋をもつ塩
基性ポリペプチドで、２つの群、ナトリウムチャンネルを阻害する６１から７０
アミノ酸をもつペプチド、およびカリウムチャンネルを阻害する３６から３９ア
ミノ酸をもつペプチドに分類できる。非生理学的還元剤（例えばＤＴＴまたはβ
−メルカプトエタノール）による神経毒ジスルフィドの還元によってその毒性は
失われた（D.D. Watt et al.(1972), Toxicon 10:173-181）。
【００３８】 有毒なサソリに刺された動物の症状には、興奮、呼吸困難、痙攣、麻痺、死亡
が含まれる。現在のところ、抗毒素がサソリの刺し傷に対する唯一の解毒薬であ
る。この毒素が入手可能である否かが抗毒素製造における主要な問題である。蛇
毒と違って、サソリ毒では標本当たりの毒素収量が限定されており、さらにいく
つかの事例では乾燥毒素の保存によってその毒性が変化するので、サソリ毒は採
集が非常に困難である。抗毒素製造のまた別の問題は、その神経毒は非常に抗原
性に乏しいということである。
【００３９】 生理学的条件下でのヘビ、ハチおよびサソリの毒素の還元的不活化はこれまで
報告されたことがなく、チオールレドックス剤（例えば還元リポ酸、ＤＴＴまた
は還元チオレドキシン）が、個体でこれらの毒に対して解毒剤として機能できる
ことも提唱されたことがない。
【００４０】 食物アレルギーは国内でも国際的にも重要な昔からの問題である。米国の人口
で１２才以下の小児の５％および成人の１％が臨床症状を有する（Advers React
ions to Foods--AAAI and NIAD Report(1984), NIH Pub.No.84-2442, pp.2,3)。
いくつかの国々では、この数字はもっと大きく、世界全体ではこの問題は、特に
幼児では増加していると考えられる（T. Matsuda & R. Nakamura(1993), Molecu
lar structure and immunological properties of Food Allergens, Trends in
Food Science & Technology 4, 289-293）。この問題は広範囲の食品に広がって
いる。一般的に食物アレルギーは、遺伝子導入食品に関する懸念の結果として多
くの分析が実施された
【００４１】 ミルクは、特に幼児では顕著な問題を提起する。コムギおよびダイズアレルギ
ーは、新世代がこれらの食品を取り入れるにつれますます重要になり、ペット（
特にイヌ）フードでも関心が高まっている。牛肉、米および卵もまた多くの個体
で重大なアレルギーを引き起こし、ペットフードとしてもまた重大な関心事であ
る。
【００４２】 上記の食品における主要なアレルギー性蛋白質の多くが分子内ジスルフィド（
Ｓ−Ｓ）結合を有するが、これまでのところ食物アレルギーを最小限にするため
に、２つの処置、すなわち（１）加熱、および（２）酵素による蛋白分解が工業
的に実施された。いずれの場合も、部分的な成功しか得られなかった。最善の事
例でも目的の蛋白質が熱に安定であったので、加熱処理は、アレルギー誘発性は
低下させたがこの問題を完全には排除できなかった。さらにまた、加熱は、栄養
的に重要なアミノ酸（例えばリジン、システインおよびアルギニン）を破壊する
ことによって製品の品質を低下させる。酵素的蛋白分解はアレルギー誘発性をよ
り効果的に低下させるが、所望の食品特性（例えば風味）は通常失われ、さらに
この処置はコストがかかる。したがって、アレルギー性食品に適用したとき、風
味および栄養を失うことなくアレルギー誘発性を低下または消失させる生理学的
に安全な系は極めて貴重であろう。
【００４３】発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、ノンチオニンシスチン含有蛋白を還元する方法を提供するこ
とである。 本発明の第二の目的は、チオールレドックスを単独で、または還元剤もしくは
還元系と合わせて用いて粉または種子に存在するグルテニンまたはグリアジンを
還元する方法を提供することである。 本発明の目的はまた、チオールレドックスを単独で、または還元剤もしくは還
元系と合わせて用いて、ドウの強度および焼き上げ製品の特性、例えばより良好
なパン質、焼き上げ製品の柔らかさおよびパンの嵩高さを改善する方法を提供す
ることである。 本発明のまた別の目的は、そのような方法を実施する場合に有用なチオールレ
ドックス蛋白質を含む製剤を提供することである。
【００４４】 本発明のさらに別の目的は、コメ、トウモロコシ、ダイズ、オオムギ、エンバ
ク、キャッサバ、モロコシまたはアワの粉からドウを製造する方法を提供する。 さらにまた別の本発明の目的は、改良グルテンの製造方法、またはコムギおよ
びライムギ以外の穀粒からグルテン様生成物を製造する方法を提供することであ
る。 本発明のまた別の目的は、ジスルフィド結合を有する酵素抑制蛋白質を還元す
る方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、チオレドキシンを発現または過剰発現するように
遺伝子操作を施した酵母細胞を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼを発現ま
たは過剰発現するように遺伝子操作を施した酵母細胞を提供することである。 本発明のまた別の目的は、そのような遺伝子操作酵母細胞を用いてドウまたは
焼き上げ製品の品質を改善する方法を提供することである。 本発明のなお別の目的は、１つ以上の分子内シスチンを含む非チオニン、非葉
緑体蛋白の分子内ジスルフィド結合を還元する方法を提供することであって、本
方法はシスチン含有蛋白質を含む液体または基質にチオールレドックス蛋白質を
添加し、チオールレドックス蛋白質を還元し、さらにチオールレドックス蛋白質
の手段によってシスチン含有蛋白質を還元することを含む。
【００４５】 本発明のまた別の目的は、ジスルフィド結合を有し分子量が８から１５ｋＤａ
の単離プルラナーゼ抑制蛋白質を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、オオムギまたはコムギ胚乳に由来するプルラナー
ゼの活性を高める方法を提供することであって、本方法は、プルラナーゼを含む
液体または基質にチオレドキシンを添加し、チオレドキシンを還元しそれによっ
てプルラナーゼ活性を高めることを含む。 本発明のなお別の目的は、１つまたは２つ以上の分子内シスチンを有する動物
毒の有毒蛋白質を還元する方法を提供することであって、本方法は、シスチン含
有蛋白質を当該蛋白質の還元に有効な量のチオールレドックス（ＳＨ）剤と接触
させ、当該１つまたは２つ以上の分子内シスチンの１つまたは２つ以上のジスル
フィド架橋を還元するために十分な時間接触を維持し、それによって当該神経毒
蛋白を還元することを含む。チオールレドックス（ＳＨ）剤は、還元チオレドキ
シン、チオレドキシン存在下の還元リポ酸、ＤＴＴまたはチオレドキシン存在下
のＤＴＴで、ヘビ神経毒蛋白はシナプス前神経毒でもまたはシナプス後神経毒で
もよい。
【００４６】 本発明のさらに別の目的は、ヘビ神経毒蛋白質およびチオールレドックス（Ｓ
Ｈ）剤を含む組成物を提供することである。 本発明のまた別の目的は、１つまたは２つ以上の分子内シスチンを有する動物
毒の有毒蛋白質を還元する方法を提供することであって、本方法は、当該蛋白質
の還元に有効な量のＮＡＤＨ−チオレドキシンレダクターゼ、ＮＡＤＰＨまたは
ＮＡＤＰＨ生成系およびチオレドキシンと当該蛋白質とを接触させ、１つまたは
２つ以上の分子内シスチンの１つまたは２つ以上のジスルフィド架橋を還元させ
るために十分な時間接触を維持し、それによって当該蛋白質を還元することを含
む。 本発明のさらにまた別の目的は、１つまたは２つ以上の分子内シスチンを有す
るヘビ神経毒をin vitroで不活化させる方法を提供することであって、本方法は
、薬剤の量が毒素の還元に有効である当該毒素含有液にチオールレドックス（Ｓ
Ｈ）剤を添加することを含む。 本発明のさらに別の目的は、個体における動物毒の毒性を治療する方法を提供
することであって、本方法は、動物毒の毒性を受けた個体に毒素の還元または軽
減に有効な量のチオールレドックス（ＳＨ）剤を投与することを含む。
【００４７】 本発明の目的にしたがえば、チオールレドックス蛋白質をドウ成分と混合して
ドウを形成し、当該ドウを焼き上げる工程を含む、ドウの特性を改良する方法が
提供される。 さらにまた、本発明の目的にしたがえば、チオールレドックス蛋白質を種子製
品と混合し、還元剤または還元系によってチオールレドックス蛋白質を還元し、
さらに還元チオールレドックス蛋白質によって酵素インヒビターを還元し、酵素
インヒビターの還元が当該酵素インヒビターを不活化する工程を含む、穀粒食物
製品中の酵素インヒビター蛋白質を不活化させる方法が提供される。
【００４８】 本明細書で使用されるチオールレドックス蛋白質にはチオレドキシンおよびグ
ルタレドキシンを含むことができる。チオレドキシンには、大腸菌（E. coli)チ
オレドキシン、チオレドキシンｈ、ｆおよびｍ並びに動物のチオレドキシンが含
まれるが、ただしこれらに限定されない。本明細書で用いられるチオレドキシン
の還元剤にはリポ酸または、ＮＡＤＰチオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）と
併用されるＮＡＤＰＨのような還元系が含まれるであろう。グルタレドキシンの
還元剤には、還元系ＮＡＤＰＨおよびグルタチオンレダクターゼと併用される還
元グルタチオンが含まれるであろう。ＮＡＤＰＨは、ＮＡＤＰＨ発生物質または
発生組成物、例えばグルコース６−ホスフェート、ＮＡＤＰおよび酵母のような
供給源に由来するグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼから成るもので
置き換えることができる。ＮＡＤＰＨ発生物質は、ドウ製造工程の開始時にチオ
レドキシンおよびＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼと一緒に添加される。 本発明はまたシステイン含有蛋白質についても実施できることは留意されるべ
きである。システインを先ず酸化し、続いてチオールレドックス蛋白質により還
元する。
【００４９】 本発明の目的にしたがえば、アレルギー誘発食品蛋白のアレルギー誘発性を減
少させる方法が提供される。この方法は、ある量のチオレドキシン、ＮＴＲおよ
びＮＡＤＰＨ、または当該蛋白質のアレルギー誘発性の減少に有効なチオレドキ
シンとともにある量のＤＴＴと当該蛋白質を接触させ、工程（ａ）の接触蛋白質
を動物に与え、それによって、当該動物が未処理蛋白質を与えられた場合に発生
していたと思われるアレルギー症状を減少させる工程を含む。
【００５０】 本発明のまた別の目的は低アレルギー誘発性食品を提供することである。この
食品は、ＮＴＲおよびＮＡＤＰＨの存在下でチオレドキシンで前処理することに
よて低アレルギー性にされる。このような食品は、牛肉、ミルク、ダイズ、卵、
コメまたはコムギであろう。 本発明のさらに別の目的は、食物蛋白質の蛋白分解性、したがって消化性を改
善する方法を提供し、結果的にいっそう消化のよい食品を提供することである。
これらの食品は、チオレドキシン還元剤（例えば上記で述べたもの）の存在下で
チオレドキシンで前処理することによって、蛋白分解に対して感受性が高められ
、さらに消化性が増す。適切な食品にはダイズ、ナッツ、ミルク、乳漿、牛肉、
卵、パン、他の小麦製品、および他の穀粒製品が含まれる。
【００５１】発明の詳細な説明 この詳細な説明においては、以下の定義及び略語を使用する。 ＣＭ −特定のパン小麦のα-アミラーゼインヒビター ＤＳＧ −マカロニ小麦から単離された特定のα-アミラーゼインヒビ ター ＤＴＮＢ −２'５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸) ＮＴＲ −ＮＡＤＰ-チオレドキシンレダクターゼ ｍＢＢｒ −モノブロバイメイン(monobromobimane) ＮＡＤＰ−ＭＤＨ −ＮＡＤＰマレイン酸デヒドロゲナーゼ ＦＢＰアーゼ −フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ ＳＤＳ −ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ −ジチオスレイトール シリアル −キビ、小麦、オート麦、大麦、米、モロコシ、又はライ麦 ＢＢＴＩ −Bowman-Birk大豆トリプシンインヒビター ＫＴＩ −Kunitz大豆トリプシンインヒビター ＰＡＧＥ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＴＣＡ −トリクロロ酢酸
【００５２】 酵素インヒビタータンパク質の実験 出発材料 材料 パン小麦(Triticum aestivum L, cv. Talent)及びマカロニ小麦(Triticum dur um. Desf., cv. Mondur)の種子を研究室の貯蔵物から得た。 試薬 酵素アッセイ用の化学薬品と精薬品、及びドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)- ポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、それぞれSigma Chemical Co. 及びBioRad 研究所から購入した。モノブロモバイメイン(ｍＢＢｒ、商標名Thiolite)は、Ca
lbiochemから購入した。他の化学薬品は、市販品から、入手可能な最高品質のも
のを購入した。 酵素 大腸菌由来のチオレドキシン及びＮＴＲは、American Diagnostics, Inc.から
購入し、形質転換された細胞から単離して各タンパク質を過剰発現させた。組換
えプラスミド、ｐＦＰ１含有のチオレドキシン菌株は、J.-P. Jacquot博士(de l
a Motte-Guery, F.ら(1991) Eur. J. Biochem. 196：287-294)によって好意的に
提供された。組換えプラスミド、ｐＰＭＲ２１含有のＮＴＲ菌株は、Marjorie R
ussel博士及びPeter Model博士(Russel, M.ら(1988) J. Biol. Chem. 263：9015
-9019)によって好意的に提供された。これらタンパク質の単離手順は、次のよう
な変化についての研究で述べられている：Ribi 細胞分画器中1.7×107Pa(25,000
psi)で細胞を切断し、Florencio ら(Florencio, F.J.ら(1988)Arch. Biochem. B
iophys. 266：496-507) によって記載されているように、レッドアガロース工程
なしでＮＴＲを精製した。サッカロミセスセレビジエ(パン酵母１型)を、以下の
変化を伴うFlorencioらによってホウレン草の葉用に開発された手順で単離した ：縣濁された細胞[１部の細胞：５部の縣濁液(w/v)]を、３つの流路を有するRib
i細胞分画器中3×108Pa(40,000psi)で切断した。 チオレドキシンｈ及びＮＴＲは、ホウレン草の葉用に開発された手順(Florenc
io, F.J.ら(1988), Arch. Biochem. Biophys. 266：496-507)で小麦の胚から単 離した。ＮＡＤＰ−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(ＮＡＤＰ-ＭＤＨ)及びフルクト ース-1,6-ビスホスファターゼ(ＦＢＰアーゼ)は、それぞれコーン(Jacquot, J.-
P.ら(1981)，Plant Physiol. 68：300-304)及びホウレン草(Crawford, N.A.ら(1
989), Arch. Biochem. Biophys. 271：223-239)の葉から精製した。大腸菌のグ ルタレドキシン及び子ウシ胸腺のチオレドキシンは、A. Holmgren教授から得た 。
【００５３】 α-アミラーゼ及びトリプシンインヒビター ＣＭ-１タンパク質は、以前に記載されたように(Kobrehel, K.ら(1991),Cerea
l Chem. 68：1-6)、パン小麦粉のアルブミン−グロブリンフラクションから単離
した。また、マカロニ小麦(Kobrehel, K.ら(1989),J. Sci. Food Agric. 48：44
1-452)のグルテニンフラクションからのＤＳＧタンパク質(ＤＳＧ-１及びＤＳＧ
-２)の単離には、公表された手順を使用した。ＣＭ-１、ＤＳＧ-１及びＤＳＧ- ２タンパク質は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であった。ト リプシンインヒビターは、Flucaから得たコーンカーネル由来の１つを除き、Sig
ma Chemical Co.から購入した。すべての場合に、市販の調製品は、ＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥ(クーマシーブルー染色)で予想されるように移動した単一のタンパク質成分
を示したが、特定の調製品ではバンドはシャープではなかった。 他のタンパク質 パン小麦由来のピュロチオニンα及びマカロニ小麦由来のピュロチオニンα- １及びβは、D.D. Kasarda博士及びB.L. Jones博士から好意的に提供された。Ｓ
ＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べると、ピュロチオニンαの試料は ピュロチオニン科の２つのメンバーを含んでいた。ピュロチオニンα-１及びβ は、共にＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であった。 ルーチン法の工程 酵素活性化アッセイ ＮＡＤＰ-ＭＤＨ、ＦＢＰアーゼ、ＮＴＲ及びチオレドキシンｈアッセイ法は 、指摘された軽微の変更を伴って、Florencio, F.J.ら(1988), Arch. Biochem.
Biophys. 266：496-506に従った。酵素活性化アッセイのたのプレインキュベー ションの時間は、特に言及しない限り２０分である。 (ｍＢＢｒ蛍光標識及びＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析) 研究中のタンパク質の直接還元は、Crawfordら(Crawford, N.A.ら(1989), Arc
h. Biochem. Biophys. 271：223-239)の方法を変更して測定した。反応は、最終
量0.1mlで１０mMのＥＤＴＡ及び１６％のグリセロールを含む１００mMのリン酸 カリウム緩衝液、ｐＨ7.1中で行った。指示どおり、0.7μg(0.1μM)のＮＴＲ及 び１μg(0.8μM)のチオレドキシン(大腸菌由来の両者をルーチン的に、１mMのＮ
ＡＤＰＨ及び１０μg(２〜１７μM)の標的タンパク質を含有する７０μlの緩衝 溶液に添加した。チオレドキシンがジチオスレイトール(ＤＴＴ、0.5mM)で還元 されるとき、ＮＡＤＰＨ及びＮＴＲが除外された。還元型グルタチオンについて
のアッセイを同様に行ったが、最終濃度は１mMであった。２０分のインキュベー
ション後、１００ナノモルのｍＢＢｒを添加し、さらに１５分反応を続けた。反
応を停止して過剰のｍＢＢｒを誘導体化するため、１０μlの１０％ＳＤＳ及び １０μlの１００mMβ-メルカプトエタノールを加え、試料をゲルに塗布した。グ
ルタレドキシンによる還元の場合、チオレドキシン及びＮＴＲは、１μg(0.8μM
)の大腸菌グルタレドキシンで置き換え、ホウレン草の葉(Florencio, F.J.ら(19
88), Arch. Biochem. Biophys. 266：496-507)から精製された1.4μg(0.14μM) のグルタチオンレダクターゼ及び1.5mMのＮＡＤＰＨを用いた。 ゲル(17.5％w/v、1.5mm厚)は、Laemmli(Laemmli, U.K.(1970), Nature 227：6
80-685)に従って調製し、定電流(９mA)で１６時間展開させた。電気泳動に次い で、ゲルを４０％メタノール及び１０％酢酸の溶液に入れ、４〜６時間数回溶液
を変えて浸漬した。そして、ゲルを近紫外光による蛍光バンドについて調べ、Cr
awfordら(Crawford, N.A.ら(1989), Arch. Biochem. Biophys. 271：223-239)に
従って写真撮影した(露出時間２５秒)。最後に、ゲルをクーマシーブルーで染色
し、従来通りに脱染した(Crawford, N.A.ら(1989), Arch. Biochem. Biophys. 2
71：223-239)。
【００５４】 標識タンパク質の定量化 ＮＡＤＰ／チオレドキシン系による試験タンパク質の還元率の定量的な指標を
得るために、Crawfordら(Crawford, N.A.ら(1989), Arch. Biochem. Biophys. 2
71：223-239)の方法の変形を使用してＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 で見られる蛍光バンドの強度を調べた。ネガをPharmacia Ultrascanレーザー濃 度計を用いてスキャンし、ピーク下の面積を各タンパク質について測定された標
準曲線と比較して定量化した。後者の測定のため、各タンパク質(濃度範囲１〜 ５μg)を0.5mM ＤＴＴの存在下３分間１００℃で加熱して還元した。ＳＤＳによ
る反応の停止後、標準物質を２分間１００℃で加熱して過剰のｍＢＢｒをβ-メ ルカプトエタノールで誘導体化することを除き、上述のようにｍＢＢｒで標識化
した。蛍光バンドの強度は添加したタンパク質の量に比例するので、還元は使用
した条件下で完了すると想定した。 実施例１ α-アミラーゼインヒビターのチオレドキシン連結還元 酵素活性化アッセイ 葉緑体酵素の活性化において特定のチオレドキシンを置換する可能性は、ある
タンパク質のチオール基が可逆的なレドックス変化を起こす能力についての一試
験である。外部細胞小器官のタンパク質の場合生理的でないとしても、この試験
はいくつかの研究で有用であることがわかった。その一例は、ピュロチオニンで
あり、チオレドキシンｈで還元されると葉緑体ＦＢＰアーゼを活性化する(Wada,
K.ら(1981), FEBS Lett. 124：237-240、及びJohnson, T.C.ら(1987), Plant P
hysiol. 85：446-451)。ＦＢＰアーゼは、その生理的活性化因子はチオレドキシ
ンｆであり、チオレドキシンｈにより影響されない。この実施例では、シスチン
−リッチなタンパク質のＦＢＰアーゼ及びＮＡＤＰ-ＭＤＨを活性化する能力を 上述したように試験した。マカロニ小麦由来のα-アミラーゼインヒビター(ＤＳ
Ｇ-１及びＤＳＧ-２)は、酵素の活性化に有効であることがわかった；しかし、 ＦＢＰアーゼよりもむしろＮＡＤＰ-ＭＤＨに対する特異性を示すことにおいて ピュロチオニンとは異なる(表１)。α-アミラーゼインヒビターは、還元型チオ レドキシンｈの存在下でのみ活性であり、それ自体はこれら条件下でＮＡＤＰ- ＭＤＨをほとんど活性化しなかった。ＤＳＧ-１及びＤＳＧ-２は、反応順序(Ｄ ＴＴ→チオレドキシン→ＤＳＧ→ＮＡＤＰ-ＭＤＨ)に従って、ＤＴＴ-還元型チ オレドキシンｈの存在下ＮＡＤＰ-リンゴ酸デヒドロゲナーゼを活性化した。 ２００μlの１００mM Tris-HCl緩衝液、ｐＨ7.9に含まれる活性化のための完 全な系は、１０mMのＤＴＴ、0.7μgのコーンの葉ＮＡＤＰ-ＭＤＨ、0.25μgの小
麦チオレドキシンｈ及び１０μgのＤＳＧ-１又はＤＳＧ-２であった。ある研究 では、ＤＴＴの代わりに２０mMのβメルカプトエタノール(β-ＭＥＴ)を使用し た。プレインキュベーションに次いで、ＮＡＤＰ-ＭＤＨを分光光度的にアッセ イした。
【００５５】 酵素の活性化アッセイでは、チオレドキシンｈはＤＴＴで還元された：予想ど
おり、β-メルカプトエタノール(β-ＭＥＴ)のようなモノチオールは、これら条
件下で有意な比率ではチオレドキシンを還元せず(Jacquot, J.-P.ら(1981), Pla
nt Physiol. 68：300-304；Nishizawa, A.N.ら(1982),“葉緑体分子生物学にお ける方法”,(M. Edelman, R.B. Hallick及びN.-H. Chua発行)707-714ページ、El
sevier Biomedical Press, New York、及びCrawford, N.A.ら(1989), Arch. Bio
chem. Biophys. 271：223-239)、ＤＴＴを置換しなかった。 ＮＡＤＰ-ＭＤＨの活性度は、一定のチオレドキシンｈ濃度で添加したＤＳＧ-
１及びＤＳＧ-２のレベルに比例した。同一のＤＴＴ処方を上述のように使用し た。ＤＳＧ-１又はＤＳＧ-２の濃度を変化させることを除き、前述と同一条件に
した。一定不変のＤＳＧ濃度で試験した場合、ＮＡＤＰ-ＭＤＨは、チオレドキ シンｈの増加に伴って活性度が増した。チオレドキシンｈの濃度を変化させるこ
とを除き、条件は上述と同様にした。 ＤＳＧタンパク質と同様であるが、低分子量のパン小麦タンパク質であるＣＭ
-１も、表１に示されるように２０μgのＣＭ-１を使用した場合、ＮＡＤＰ-ＭＤ
Ｈを活性化したが、ＦＢＰアーゼは活性化しなかった。結果は、チオレドキシン ｈ は種々のα-アミラーゼインヒビターを還元し、順次、式４〜６に従ってＮＡ ＤＰ-ＭＤＨを活性化することを示す。これらのタンパク質は、ＤＴＴがチオレ ドキシンの非存在下で添加されても酵素の活性化に効果がなかった。
【００５６】 (4) DTT還元+チオレドキシンｈ 酸化―→チオレドキシンｈ 還元+DTT酸化 (5) α−アミラーゼインヒビター酸化+チオレドキシンｈ 還元―→α−アミラー ゼインヒビター還元+チオレドキシンｈ 酸化 (6) α−アミラーゼインヒビター還元+NADP-MDH酸化（不活性）―→α−アミラ ーゼインヒビター酸化+ NADP-MDH還元（活性）
【００５７】 表１葉緑体ＮＡＤＰ−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びフルクトースビスホスファター ゼの活性化におけるチオレドキシン還元型トリプシンインヒビター、チオニン及 びα−アミラーゼインヒビターの有効性 （ＤＴＴ→チオレドキシン→指示タンパク質→標的酵素） *活性度,nkat/mg タンパク質 Mr,kDa S-S基 NADP-MDH FBPase α−アミラーゼインヒビター **DSG-2 17 5 2 0 **DSG-1 14 5 2 0 ++CM-1 12 5 12 0 トリプシンインヒビター シスチン-リッチ(植物) コーンカーネル 12 5 5 0 ダイズ Bowman-Birk 8 7 3 0 他のタイプ オボムコイド 28 9 2 0 ダイズ Kunitz 20 2 2 0 オボインヒビター 49 14 1 0 ウシの肺(アプロチニン) 7 3 痕跡 2 チオニン **ピュロチオニン−α1 6 4 1 39 **ピュロチオニン−β 6 4 痕跡 5 ++ピュロチオニン−α 6 4 0 14 *これらの値は、ホウレンソウの葉緑体チオレドキシンｍ（ＮＡＤＰ−ＭＤ
Ｈ）及びチオレドキシンｆでそれぞれ得られた４０及び５５０の対応値に匹敵す
る。 **マカロニ小麦由来 ++パン小麦由来
【００５８】 この実施例では、試験したＤＳＧ又は他のタンパク質の質量が２０μgである こと以外、上述のようにＮＡＤＰ-ＭＤＨの活性化を行った。ＦＢＰアーゼの活 性化は、１μgの大腸菌チオレドキシン及び２０μgの指示タンパク質で、標準的
なＤＴＴアッセイを使用して調べた。上記の値は、これら条件下で大腸菌チオレ
ドキシンで見られる制限された活性化に対して補正されている。 実施例２ ＤＴＮＢ還元アッセイ チオールのレドックス活性についての第２試験は、４１２nmでの吸収の増加に
より測定されるスルフヒドリル試薬、２',５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)(
ＤＴＮＢ)の還元を触媒する能力である。ここで、アッセイしたタンパク質は、 ＮＴＲによるＮＡＤＰＨ及びチオレドキシンで還元された。ＤＴＮＢアッセイは
、マカロニ小麦(ＤＳＧ-１と２)及びパン小麦(ＣＭ-１)の両者由来のα-アミラ ーゼインヒビターに有効であることがわかった。ＮＡＤＰ／チオレドキシン系で
還元されると(この場合大腸菌由来のＮＴＲ及びチオレドキシンを使用)、ＤＳＧ
-１又はＤＳＧ-２のどちらかが、顕著にＤＴＮＢの還元(ＮＡＤＰＨ→ＮＴＲ→ チオレドキシン→ＤＳＧ→ＤＴＮＢ)を増強した。ＤＴＮＢ還元アッセイは、１ ０μgのチオレドキシンと１０μgのＮＴＲ及び２０μgのＤＳＧ-１又はＤＳＧ- ２で行った。また、ＣＭ-１もＤＴＮＢ還元アッセイで有効であり、ＮＡＤＰ-Ｍ
ＤＨ活性化(表１)によるのと同様に、ＤＳＧタンパク質よりも検出可能に活性で
あった。ＣＭ-１アッセイの条件は、ＤＳＧタンパク質は省略してピュロチオニ ンαを２０μg又はＣＭ-１を２０μg用いたこと以外は、ＤＳＧ／ＤＴＮＢアッ セイと同様である。このようにして実施例１の酵素活性化の実験を確証し、α- アミラーゼインヒビターがＮＡＤＰ／チオレドキシン系によって生理的に還元さ
れうることがわかった。これらの条件下、ＤＴＮＢの還元を促進する上でα-ア ミラーゼインヒビターの役割は、式７〜９にまとめられる。
【００５９】 NTR (7) NADPH+チオレドキシン酸化―→チオレドキシン還元+NADP (8) チオレドキシン還元+α−アミラーゼインヒビター酸化―→チオレドキシン 酸化 +α−アミラーゼインヒビター還元 (9) α−アミラーゼインヒビター還元+DTNB酸化―→α−アミラーゼインヒビタ ー酸化+DTNB還元 実施例３ タンパク質還元の測定 モノブロモバイメイン(ｍＢＢｒ)の有効性及び植物系での使用に適応すること
から、植物タンパク質のスルフヒドリル基の新しい測定技術が得られた(Crawfor
d, N.A.ら(1989), Arch. Biochem. Biophys. 271：223-239)。ＳＤＳ-ポリアク リルアミドゲル電気泳動と組み合わせて、複雑な混合物についてさえ、ｍＢＢｒ
を使用してレドックス活性タンパク質のスルフヒドリルの状態変化を定量化でき
る。従って、この技術をインヒビタータンパク質に適用して、チオレドキシンに
よる還元力を確認した。ここで、試験タンパク質は、それ自体は既にＤＴＴ又は
ＮＡＤＰＨ及びＮＴＲで還元されたチオレドキシンによって還元された。還元さ
れたタンパク質のｍＢＢｒ誘導体を調製し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電 気泳動によって他の成分から分離し、その還元状態を蛍光により調べた。後述す
る実験では、大腸菌由来のチオレドキシンは、各標的タンパク質の還元に有効で
あることがわかった。類似の実験で、チオレドキシンｈ及び子ウシ胸腺のチオレ
ドキシンは、それぞれ種子及び動物源由来のタンパク質を還元することが明らか
になった。 酵素の活性化及び色素還元実験の確認において、ＤＳＧ-１はチオレドキシン の存在下で効果的に還元された。インキュベーションに次いで、タンパク質をｍ
ＢＢｒで誘導体化し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後蛍光を可視化 した。還元は、ＤＴＴのみではずっと少なく、ＧＳＨでは取るに足らなかった。
チオレドキシンに対する同様の所要量が、ＣＭ-１及びＤＳＧ-２の還元で観測さ
れた(データは示さず)。使用したチオレドキシンは大腸菌由来であったが、小麦
チオレドキシンｈで同様の結果が得られた。また、ＤＴＴをＮＡＤＰＨ及びＮＴ
Ｒで置き換えた場合にもチオレドキシンが必要であった(データは示さず)。
【００６０】 実施例４ シスチン−リッチな植物トリプシンインヒビターのチオレドキシン連結還元 小麦の種子の主要な可溶性シスチン−リッチタンパク質が、外来性のα-アミ ラーゼのインヒビターとして作用するのに対して、多くの他の種子のシスチン−
リッチなタンパク質は活性を欠き、特定の場合、動物源由来のトリプシンの特異
的なインヒビターとして作用する。これらタンパク質は、水素化ホウ素ナトリウ
ムのような強い化学還元剤で還元されうるが(Birk, Y.(1985), Int. J. Peptide
Protein Res. 25：113-131、及びBirl, Y.(1976), Meth. Enzymol. 45：695-73
90)、生理的条件下で還元されるという証拠はほとんどない。従って、トリプシ ンインヒビターがチオレドキシンによって還元される能力を試験することは興味
深い。試験したシスチン−リッチな代表としては、大豆Bowman-Birk及びコーン カーネルトリプシンインヒビターがある。両者の場合の結果は明白である：各イ
ンヒビターは、ＤＴＴ−還元型チオレドキシンの存在下で添加されると、ＮＡＤ
Ｐ-ＭＤＨを活性化し(ＦＢＰアーゼは活性化しない)、それぞれＮＡＤＰＨ、Ｎ ＴＲ及びチオレドキシンの存在下でＤＴＮＢを還元した(データは示さず)。 α-アミラーゼインヒビターについてわかったように、シスチン−リッチなト リプシンインヒビターのチオレドキシン依存性還元は、ｍＢＢｒ／ＳＤＳ-ポリ アクリルアミドゲル電気泳動法によって直接観測できるだろう。従って、ＤＴＴ
による有意な還元は、高度に蛍光性の高速移動バンドを示すBowman-Birk(ＢＢＴ
Ｉ)インヒビターと、チオレドキシンに遅れて移動する高度に蛍光性のバンドを 示すコーンカーネルのトリプシンインヒビター(ＣＫＴＩ)との両者を有する還元
型チオレドキシンの存在下でのみ観察された。
【００６１】 実施例５ 他のトリプシンインヒビター及びピュロチオニンのチオレドキシン連結還元 種子由来のシスチン−リッチなトリプシンインヒビターが、チオレドキシンに
よる特異的な還元を起こしうるという知見を考慮すると、他のタイプのトリプシ
ンインヒビタータンパク質が、この特質を共有するかという問題が生じた。この
研究中に、そのようなインヒビターのいくつか--大豆Kunitz、ウシの肺のアプロ
チニン、卵白のオボインヒビター及びオボムコイドトリプシンインヒビター--を
試験した。試験したパラメータは、上述のシスチン−リッチなタンパク質のよう
に広範ではないが、他のトリプシンインヒビターも酵素の活性化及びｍＢＢｒ／
ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の両者で測定すると、チオレドキシ ンによって特異的に還元される能力を示すことがわかった。上述のシスチン−リ
ッチなタンパク質の場合のように、研究のこの段階で試験したトリプシンインヒ
ビター(大豆Kunitz及び動物のトリプシンインヒビター)は、ＮＡＤＰ-ＭＤＨを 活性化したが、ＦＢＰアーゼは活性化しなかった(表１)。ウシの肺のアプロチニ
ンは例外で、ＮＡＤＰ-ＭＤＨよりＦＢＰアーゼを効果的に活性化した。アプロ チニンはここで研究したシスチンの高含量を示す(約１０％)特定の種子のタンパ
ク質に似ているとも考えられる(Kassel, B.ら(1965), Biochem. Biophys. Res.
Commun. ２０：463-468)。 これらタンパク質の１つであるKunitzインヒビターのチオレドキシン連結還元
についての蛍光は、ｍＢＢｒ／ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動ゲル内での 高い蛍光性の低速移動バンドによって実証された。その還元形態で、Kunitzイン
ヒビターは蛍光性の高速移動バンドも生成した。この低分子量種の性質は未知で
ある。ゲル上のその位置により、それはKunitz調製品中の混入物として存在する
Bowman-Birkインヒビターを表すと考えられる；しかし、このような成分はクー マシーブルー染色ＳＤＳゲル中には見えなかった。所望分子量の単一の蛍光バン
ドを生じる動物のインヒビターは、還元用のチオレドキシンをも必要とした(デ ータは示さず)。 以前の結果の確認として、チオレドキシン還元型ピュロチオニンは一貫してＦ
ＢＰアーゼを活性化し、以前に試験された型であるピュロチオニン-αは、ＮＡ ＤＰ-ＭＤＨを活性化しなかった(表１)(Wada, K.ら(1981), FEBS Lett. 124：23
7-240)。しかし、パン小麦由来のピュロチオニン-αとは対照的に、以前には調 べなかった２つのピュロチオニン(マカロニ小麦由来のピュロチオニンα-１及び
β)は、検出可能にＮＡＤＰ-ＭＤＨを活性化した(表１)。また、マカロニ小麦の
２種のピュロチオニンは、ＦＢＰアーゼを活性化する能力が異なっていた。これ
らピュロチオニンの活性度の相違は、それらのアミノ酸配列の強い類似性(Jones
, B.L.ら(1977), Cereal Chem. 54：511-523)及びチオレドキシンによる還元を 起こす能力を考えると予想外であった。ピュロチオニン(ここではα型)の還元に
ついてのチオレドキシンの要求量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ蛍光法により観測した。
【００６２】 実施例６ 還元の定量化 上記実施例は、チオレドキシンがＣＭ及びＤＳＧインヒビターのようなα-ア ミラーゼ、及び種子並びに動物源由来のトリプシンインヒビターを含む種々のタ
ンパク質を還元することを示している。定性的な意味では明かであるが、上記結
果は還元率の定量的な指標を与えていない。従って、Crawfordら(Crawford, N.A
.ら(1989), Arch. Biochem. Biophys. 271：223-239)の以下の手順に従って実験
を行った。 表２に示されるように、種子のインヒビタータンパク質の大腸菌ＮＡＤＰ／チ
オレドキシン系による還元率は時間に依存し、２時間後に、タンパク質によって
１５〜４８％還元された。主なタンパク質の成分によって発光された蛍光に基づ
いた結果により、チオレドキシンがα-アミラーゼ及びトリプシンインヒビター の還元で触媒的に作用することがわかる。２時間後に還元されたタンパク質の、
添加されたチオレドキシンに対する比率は、最も多く還元されたタンパク質(大 豆Bowman-Birkのトリプシンインヒビター)と最も少なく還元されたタンパク質( コーンカーネルのトリプシンインヒビター)との両者について１以上であった-- すなわち、２時間の還元時間後のそれぞれの比率は７及び２であった。表２の値
は、標準的アッセイ条件下で得たものであり、それら条件を変更して還元を最適
化することを試みたものではない。 以下のタンパク質濃度を使用した(ナノモル)：チオレドキシン、0.08；ＮＴＲ
、0.01；ピュロチオニン-β、1.7；ＤＳＧ-１、0.7；コーンカーネルトリプシン
インヒビター、1.0；Bowman-Birkトリプシンインヒビター、1.3；及びKunitzト リプシンインヒビター、0.5。指示時間の相違を除き、他の条件は実施例１〜４ と同様である。
【００６３】 表２mBBR/SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いたNADP/チオレドキシン系に よる種子タンパク質の還元率 還元後タンパク質 ２０分 １２０分 ピューロチオニン−β 15 32 ＤＳＧ−１ 22 38 コーンカーネルトリプシンインヒビター 3 15 Bowman-Birkトリプシンインヒビター 25 48 Kunitzトリプシンインヒビター 14 22
【００６４】 実施例７ 還元剤としての大腸菌グルタレドキシン 細菌及び動物は、チオールレドックスタンパク質、グルタレドキシンを含むこ
とが知られており、リボヌクレオチド還元のような反応でチオレドキシンを置換
できる(Holmgren, A.(1985), Annu. Rev. Biochem. 54：237-271)。グルタレド キシンは、式１０及び式１１に示されるように還元される。 グルタチオンレダクターゼ (10) NADPH+GSSG―――――――――――→2GSH+NADP (11) 2GSH+グルタレドキシン酸化→GSSG+グルタレドキシン還元 これまでに、グルタレドキシンが高等植物由来のタンパク質と相互作用するこ
とは実証されていない。大腸菌由来のグルタレドキシンを用いてこの能力を試験
し、種子タンパク質については現在研究中である。比重走査を連結したｍＢＢｒ
／ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で還元活性度を観測した。上述し た条件下でグルタレドキシンはチオレドキシンを有効に置換することもあるが、
すべての場合ではないことが観察された。このようにして、グルタレドキシンは
以下の還元に活性であることがわかった(数は、還元の大腸菌チオレドキシンに 対するパーセントを示す)：ＤＳＧ-１及びＣＭ-１α-アミラーゼインヒビター( それぞれ１４７％及び２１０％)；コーンカーネルトリプシンインヒビター(４２
４％)；及びピュロチオニン(α、α１及びβ型についてそれぞれ８２，１３３，
及び１２０％)。グルタレドキシンは、ＤＳＧ-２α-アミラーゼインヒビターと 大豆のBowman-Birk及びKunitzトリプシンインヒビターの還元では有効でなかっ た。動物源由来のトリプシンインヒビターもグルタレドキシンに対して混同した
応答を示した。卵白オボインヒビターは有効に還元されたのに対して(大腸菌チ オレドキシンに対して５５％の還元)、卵白オボムコイドインヒビター及びウシ の肺のアプロチニンには作用しなかった。以前に報告されたように(Wolosiuk, R
.Aら(1977), Nature 266：565-567)、グルタレドキシンは、有意には、葉緑体、
ＦＢＰアーゼ及びＮＡＤＰ-ＭＤＨのチオレドキシン連結酵素の活性化において 即効性還元剤としてチオレドキシンを置換しなかった(データは示さず)。 上記実施例は、試験した酵素インヒビタータンパク質にはグルタレドキシン及
びチオレドキシンによって還元されうるものがあることを示している。チオレド
キシンに対するそれらの特異性は、α-アミラーゼインヒビター(ＤＳＧ-２)、及
び数種のトリプシンインヒビター(Kunitz、Bowman-Birk、アプロチニン、及びオ
ボムコイドインヒビター)を含む。チオレドキシン又はグルタレドキシンの何れ かで還元されるタンパク質は、ピュロチオニン、２種のα-アミラーゼインヒビ ター(ＤＳＧ-１、ＣＭ-１)、植物由来のシスチン−リッチなトリプシンインヒビ
ター(コーンカーネルインヒビター)、及び動物由来のトリプシンインヒビター( 卵白オボインヒビター)を含む。これらの結果は、グルタレドキシンは植物に存 在するかという問題を提起した。グルタレドキシンは緑藻類中には存在するが(T
sang, M.L.-S. (1981), Plant Physiol. 68：1098-1104)、高等植物には存在し ないと報告された。
【００６５】 表１に示されるＮＡＤＰ-ＭＤＨ及びＦＢＰアーゼ標的酵素の活性度は、生理 的な葉緑体タンパク質(チオレドキシンｍ又はｆ)による活性化後にみられる活性
度に対して相対的に低いが、示された値は繰り返し示されたので、真実であると
考えられる。おそらく、インヒビタータンパク質によって示される酵素の特異性
は、生理的には関連しないが、達した特有な構造を還元に反映するのだろう。こ
のような還元型構造は、種子又は動物細胞内での機能に関係するかを考えること
が残っている。 還元現象に関連するチオレドキシン(又はグルタレドキシン)の生理的な因果関
係は、標的タンパク質の機能が不明の場合に非常に興味深い。本結果は、新しい
可能性を提案する。チオレドキシンが広範な種類のインヒビタータンパク質を生
理的条件下で還元するという知見は、区画の仕切りがない場合に細胞内で還元が
起こりうることを示唆している。 実施例８ 大豆ミール中の大豆トリプシンインヒビターの不活性化 この実験の目的は、大豆のBowman-Birk及びKunitzトリプシンインヒビターを 不活性化することである。以下の手順を動物の餌の調製に適用した。１０ｇの大
豆ミールに0.2μgのチオレドキシン、0.1μgのＮＡＤＰ-チオレドキシンレダク ターゼ及び５００ナノモルのＮＡＤＰＨを１Ｍ Tris-HCl緩衝液、ｐＨ7.9と共に
加え、5.25mlの３０mM Tris-HClを得た。上記混合物を３０分間室温で放置した 。大豆トリプシンインヒビターの直接還元は、前述(Kobrehel, K.ら(1991), J.
Biol. Chem. 266：16135-16140)のｍＢＢｒ蛍光標識／ＳＤＳ-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法を使用して測定した。トリプシン活性用に処理した小麦粉の能
力の分析は、インスリン及びＢＡＥＥ(Na-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエス テル)アッセイ(Schoellmann, G.ら(1963), Biochemistry 252:1963；Gonias. S.
L.ら(1983), J. Biol. Chem. 258：14682)を変形して行った。この分析から、Ｎ
ＡＤＰ／チオレドキシン系でそのように処理された大豆ミールはトリプシンを阻
害しないことがわかった。
【００６６】 実施例９ シリアル中のα-アミラーゼインヒビターの不活性化 １０ｇの大麦麦芽に0.2μgのチオレドキシン、0.1μgのＮＡＤＰ-チオレドキ シンレダクターゼ及び５００ナノモルのＮＡＤＰＨを１Ｍ Tris-HCl緩衝液、ｐ Ｈ7.9と共に加え、5.25mlの３０mM Tris-HClを得た。上記混合物を３０分間室温
で放置した。α-アミラーゼインヒビターの直接還元は、前述(Kobrehel, K.ら(1
991), J. Biol. Chem. 266：16135-16140)のｍＢＢｒ蛍光標識／ＳＤＳ-ポリア クリルアミドゲル電気泳動法を使用して測定した。α-アミラーゼ活性はデンプ ンからのマルトースの遊離に続いて観測される(Bernfeld, P.(1995), Methods i
n Enzymol. １：149)。この分析から、ＮＡＤＰ／チオレドキシン系でそのよう に処理された大麦はα-アミラーゼを阻害しないことがわかった。 シリアルタンパク質の還元 材料及び方法 植物材料 マカロニ小麦(Triticum durum, Desf. cv. Monroe)の種子及びセモリナ（semo
lina）は、K. Kahn博士から好意的に提供された。 小麦種子の発芽 プラスチックのペトリ皿中、５mlの脱イオン水で湿らせた３層のワットマン＃
１ろ紙上に２０〜３０個の種子を置いた。暗いチャンバー内、室温で４日間発芽
させた。 試薬／精薬品 生化学品と凍結乾燥された結合酵素は、Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO) から得た。大腸菌のチオレドキシン及びＮＴＲは、American Diagnostica, Inc.
(Greenwich, CT)から購入した。小麦のチオレドキシンｈ及びＮＴＲは胚から単 離し、ホウレン草の葉用に開発された手順(Florencio, F.J.ら(1988), Arch. Bi
ochem. Biophys. 266：496-507)に従った。大腸菌のグルタレドキシンは、A. Ho
lmgren教授が好意的に提供してくれた。ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳 動用の試薬は、Bio-Rad 研究所(Richmond, CA)から購入した。モノブロモバイメ
イン(ｍＢＢｒ)又はThioliteは、Calbiochem Co.(San Diego, CA)から得た。乳 酸アルミニウム及びメチルグリーンは、Fluka Chemicals Co.(Buchs, スイス)の
製品である。 グリアジン及びグルテニン 不溶性貯蔵タンパク質の単離のため、２５℃で順次以下の溶液１mlを用いて指
示時間、セモリナ(0.2ｇ)を抽出した：(１)５０mM Tris-HCl、ｐＨ7.5(２０分) ；(２)７０％エタノール(２時間)；及び(３)0.1Ｍ酢酸(２時間)。抽出の際、試 料を電気回転板上に置き、かつボルテックスミキサーで時々撹拌した。各溶液に
よる抽出後、試料をエッペンドルフ型微量遠心管中で遠心分離させ(12,000rpm、
５分)、上清フラクションを分析用に保存した。各抽出の間に、ペレットを１ml の水で洗浄し、前と同様に遠心分離で収集し、その上清の洗浄フラクションを処
分した。慣習により、そのフラクションを命名した：(１)アルブミン／グロブリ
ン；(２)グリアジン；及び(３)グルテニン。
【００６７】 タンパク質のインビトロｍＢＢｒ標識化 反応は、１００mMのTris-HCl緩衝液、ｐＨ7.9中で行った。１mMのＮＡＤＰＨ 及び１０μgの標的タンパク質を含有するこの緩衝液７０μlに、指示通りに0.7 μgのＮＴＲ及び１μgのチオレドキシン(特に言及しない限り両者とも大腸菌由 来)を添加した。ジチオスレイトール(ＤＴＴ)でチオレドキシンが還元されたと き、ＮＡＤＰＨ及びＮＴＲを省いてＤＴＴを加え、0.5mMにした。還元型グルタ チオンのアッセイを同様に行ったが、最終濃度は１mMにした。２０分間のインキ
ュベーション後、１００ナノモルのｍＢＢｒを添加してさらに１５分間反応を続
けた。反応を停止させるため、過剰のｍＢＢｒを誘導体化し、１０μlの１０％ ＳＤＳ及び１０μlの１００mM β-メルカプトエタノールを加え、試料をゲルに 塗布した。グルタレドキシンによる還元のため、チオレドキシン及びＮＴＲを１
μgの大腸菌グルタレドキシン、1.4μgのグルタチオンレダクターゼ(ホウレン草
の葉から精製)及び1.5mMのＮＡＤＰＨで置換した。 タンパク質のインビボｍＢＢｒ標識化 指示時間で、乾燥種子又は発芽している実生(同様の根長に基づいて選択)をペ
トリ皿から取り除き、胚又は発芽した軸を除去した。各ロットから５つの胚乳を
秤量し、液体Ｎ2中、乳鉢と乳棒で粉砕した。液体Ｎ2の最後の痕跡がちょうど消
失したときに、１００mM Tris-HCl、ｐＨ7.9の緩衝液中2.0mM ｍＢＢｒを１ml添
加した。解凍した混合物をさらに１分間粉砕して微量遠心管に移した。上清の体
積を調整して適切なｍＢＢｒ又は緩衝溶液と合わせて１mlにした。上述の発芽し
た実生の胚乳から、アルブミン／グロブリン、グリアジン及びグルテニンのタン
パク質フラクションを抽出した。抽出したタンパク質フラクションを使用するま
で−２０℃で保存した。対照緩衝液は、各時間点でインキュベートした。 ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ｍＢＢｒ-誘導化試料のＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動は、Laemmli, U.K
. (1970), Nature 227：680-685 に記載のように、１５％ゲル中ｐＨ8.5で行っ た。１６時間９mAの一定電流で、1.5mm厚のゲルを展開させた。
【００６８】 未変性のゲル電気泳動 異種のグリアジンを分離するため、未変性のポリアクリルアミドゲル電気泳動
を、６％のゲル中(グリアジンを４種に分離するように設計された手順)で、Bush
uk及びZillman(Bushuk, W.ら(1978), Can. J. Plant Sci. 58：505-515)に記載 され、Sapirstein及びBushuk(Sapirstein, H.D.ら(1985), Cereal Chem. 62：37
2-377)によって耐力壁ゲル用に変形された手順で行った。１００mlの最終体積の
ゲル溶液は、6.0ｇのアクリルアミド、0.3ｇのビスアクリルアミド、0.024ｇの アスコルビン酸、0.2mgの硫酸鉄ヘプタハイドレート及び0.25ｇの乳酸アルミニ ウムを含んでいた。乳酸でｐＨを3.1に調節した。ゲル溶液を２時間氷上で脱気 し、重合化触媒として0.5mlの３％過酸化水素を添加した。作業中の緩衝液も、 １リットルに0.5ｇの乳酸アルミニウムが含まれた乳酸で、ｐＨを3.1に調節した
。５０mAの一定電流で、電気泳動を約４時間続けた。メチルグリーン追跡用色素
で標識された溶媒の前部がゲル末端から約１cmに移動したとき、電気泳動を終了
した。 ｍＢＢｒの除去／蛍光写真撮影 電気泳動後、ゲルを１２％(w/v)トリクロロ酢酸に入れて４〜６時間浸漬し、 溶液を１回交換してタンパク質を固定させた；それから、ゲルを４０％メタノー
ル／１０％酢酸溶液に移して８〜１０時間で過剰ｍＢＢｒを除去した。遊離の及
びタンパク質が結合された両者につき、紫外光源(365nm)に合わせたライトボッ クスにゲルを置いて、ｍＢＢｒの蛍光を可視化した。過剰(遊離)のｍＢＢｒの除
去後、ゲルをポラロイドのPositive／Negative Landfilm、５５型で、黄色のラ ッテンゼラチンフィルターNo.８を通して撮影した(カットオフ＝460nm)(露出時 間２５〜６０秒、ｆ4.5)(Crawford, N.A.ら(1989), Arch. Biochem. Biophys. 2
71：223-239)。 タンパク質染色／脱染色／写真撮影 ＳＤＳ-ゲルを、４０％メタノール／１０％酢酸中、クーマシーブリリアント ブルーR-250により１〜２時間で染色し、前述のように一昼夜で脱染色した(Craw
ford, N.A.ら(1989), Arch. Biochem. Biophys. 271：223-239)。２４０mlの１ ２％トリクロロ酢酸中、0.1ｇのクーマシーブリリアントブルーR-250(１０mlの ９５％メタノールに溶解)を含有するろ過液中で、乳酸アルミニウム未変性ゲル を一昼夜染色した。ゲルを１２％トリクロロ酢酸中で一昼夜脱染色した(Bushuk,
W.ら(1978), Can. J. Plant Sci. 58：505-515、及びSapirstein, H.D.ら(1985
)、Cereal Chem. 62：372-377)。 タンパク質染色ゲルをポラロイド５５型フィルムで撮影してプリント及びネガ
を作成した。プリントを使用してバンド移動距離及び荷電効力を測定した。 蛍光ゲルのポラロイドネガ及び湿ったタンパク質染色ゲルのプリントをレーザ
ー濃度計で走査した。蛍光は、GelScan XL ソフトウェアで積分後ピーク面積を 計算して定量化した。
【００６９】 酵素アッセイ 以下の活性度を既述の方法で粗製抽出物について測定した：ヘキソキナーゼ(B
aldus, B.ら(1981), Phytochem. 20：1811-1814)、グルコース-6-リン酸デヒド ロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Schnarrenberger, C.ら(197
3), Arch. Biochem. Biophys. 154：438-448)、グルタチオンレダクターゼ、Ｎ ＴＲ及びチオレドキシンｈ(Florencio, F.J.ら(1988), Arch. Biochem. Biophys
. 266：496-507)。 タンパク質の定量 タンパク質の濃度は、Bradford法(Bradford, M.(1976) Anal. Biochem. 72：2
48-256)により、標準物質としてBio-Rad 試薬及びウシ血清アルブミンを用いて 定量した。 サブユニットの分子量の定量 グリアジン及びグルテニンのサブユニットの分子量は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル 上で２セットの分子量標準物質(ｋＤａ)を用いて計算した。第１セットは、ＢＳ
Ａ(６６)、卵白アルブミン(４５)、大豆トリプシンインヒビター(20.1)、ミオグ
ロビン(１７)、チトクロムｃ(12.4)及びアプロチニン(6.5)からなる。他のセッ トは、BioRad Prestained Low ＳＤＳ-ＰＡＧＥ標準物質：ホスホリラーゼｂ(１
１０)、ＢＳＡ(８４)、卵白アルブミン(４７)、炭酸アンヒドラーゼ(３３)、大 豆トリプシンインヒビター(２４)及びライソザイム(１６)である。 実施例１０ グリアジンの還元 一世紀前のOsborneと共同研究者の先駆的な貢献の結果として、種子タンパク 質は希薄溶液及び有機溶媒中の溶解性に基づいて分画できる(２０)。小麦の場合
、胚乳(小麦粉又はセモリナ)の調製は、歴史的に以下の４つの溶液で順次抽出し
て必要とされるタンパク質フラクションを得る：(ｉ)水、アルブミン；(ii)塩水
、グロブリン；(iii)エタノール／水、グリアジン；及び(iv)酢酸／水、グルテ ニン。広範な証拠により、種々のタンパク質が各フラクションに豊富に含まれる
ことがわかった。例えば、アルブミン及びグロブリンフラクションは、多くの酵
素を含み、グリアジン及びグルテニンフラクションは、発芽に必要な貯蔵タンパ
ク質中にある。 上述の実施例１、４及び５は、種子自体又は大腸菌から誘導されたＮＡＤＰ／
チオレドキシン系によって還元される多くの水溶性種子タンパク質（アルブミン
／グロブリン、例えばα-アミラーゼインヒビター、シスチン−リッチなトリプ シンインヒビター、他のトリプシンインヒビター及びチオニン）について記述し
ている。小麦種子由来の不溶性貯蔵タンパク質、すなわち代表的にはグリアジン
及びグルテニンフラクションを還元する系の能力については後述する。指示添加
によるインキュベーションに次いで、グリアジンタンパク質をｍＢＢｒで誘導体
化し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に蛍光を可視化した。この最 初のグリアジンゲルのレーンは以下の通りであった：１．対照：添加せず。２．
ＧＳＨ／ＧＲ／ＮＡＤＰＨ：還元型グルタチオン、グルタチオンレダクターゼ( ホウレン草の葉由来)及びＮＡＤＰＨ。３．ＮＧＳ：ＮＡＤＰＨ、還元型グルタ チオン、グルタチオンレダクターゼ(ホウレン草の葉由来)及びグルタレドキシン
(大腸菌由来)。４．ＮＴＳ：ＮＡＤＰＨ、ＮＴＲ、及びチオレドキシン(大腸菌 由来の両タンパク質)。５．ＭＥＴ／Ｔ(Ｅｃ)：β-メルカプトエタノール及びチ
オレドキシン(大腸菌)。６．ＤＴＴ。７．ＤＴＴ／Ｔ(Ｅｃ)：ＤＴＴ及びチオレ
ドキシン(大腸菌)。８．ＤＴＴ／Ｔ(Ｗ)：小麦チオレドキシンｈによる以外は７
と同じ。９．ＮＧＳ,-グリアジン：グリアジンタンパク質フラクションがないこ
と以外３と同じ。１０．ＮＴＳ,-グリアジン：グリアジンタンパク質フラクショ
ンがないこと以外４と同じ。ｍＢＢｒとの反応性に基づき、グリアジンフラクシ
ョンは、広範にチオレドキシンによって還元された。還元を起こす主要メンバー
は、２５〜４５kDaの範囲の分子量を示した。種子のα-アミラーゼ及びトリプシ
ンインヒビタータンパク質についての実施例１、４及び５でわかるように、グリ
アジンは、未変性のｈ又は大腸菌型のチオレドキシン(両者均一)によって還元さ
れた；ＮＡＤＰＨ(及びＮＴＲ)又はＤＴＴは、チオレドキシンの還元剤として役
立ちうる。グルタチオン及びグルタレドキシン--特定の大腸菌及び哺乳類の酵素
系でチオレドキシンを置換できるが、高等植物に存在することは知られていない
タンパク質では、ずっと狭い範囲の還元が観察された。
【００７０】 グリアジンフラクションは、α、β、γ及びωと呼ばれる４つの異なった型の
タンパク質からなり、未変性のポリアクリルアミドゲル電気泳動で酸性条件下分
離できる(Bushuk, W.ら(1978), Can. J. Plant Sci. 58：505-515；Kasarda, D.
D.ら(1976), Adv. Cer. Sci. Tech. １：158-236；Sapirstein, H.D.ら(1985),
Cereal Chem. 62：372-377；及びTatham, A.S.ら(1990), Adv. Cer. Sci. Tech.
10：1-78)。ωグリアジンを除き、それぞれの種はシスチン(Ｓ-Ｓ)基を含むこ とにより、チオレドキシンによる還元力が強い。この研究で、指示添加によるイ
ンキュベーション後、タンパク質をｍＢＢｒで誘導体化し、酸性−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動後に蛍光を可視化した。この研究の第２グリアジンゲルのレ
ーンは、以下の通りであった：１．対照：添加せず。２．ＧＳＨ：還元型グルタ
チオン、３．ＧＳＨ／ＧＲ／ＮＡＤＰＨ：還元型グルタチオン、グルタチオンレ
ダクターゼ(ホウレン草の葉由来)及びＮＡＤＰＨ。４．ＮＧＳ：ＮＡＤＰＨ、還
元型グルタチオン、グルタチオンレダクターゼ(ホウレン草の葉由来)及びグルタ
レドキシン(大腸菌由来)。５．ＮＧＳ＋ＮＴＳ：４と６の組合せ。６．ＮＴＳ：
ＮＡＤＰＨ、ＮＴＲ、及びチオレドキシン(大腸菌由来の両タンパク質)。７．Ｍ
ＥＴ／Ｔ(Ｅｃ)：β-メルカプトエタノール及びチオレドキシン(大腸菌)。８． ＤＴＴ／Ｔ(Ｅｃ)：ＤＴＴ及びチオレドキシン(大腸菌)。９．ＮＴＳ(-Ｔ)：チ オレドキシンがないこと以外６と同じ。１０．ＮＧＳ＋ＮＴＳ,-グリアジン：グ
リアジンフラクションがないこと以外５と同じ。 チオレドキシン還元型グリアジンフラクションを未変性ゲル電気泳動にかけた
とき、チオレドキシンによって最も特異的に還元されることがわかったタンパク
質をαフラクション中に回収した。β及びγグリアジンの活性な還元があったが
、表３にまとめられた濃度計の結果から明かなように、これらのグループ内の還
元は特異的でない、すなわち相対的に高レベルの還元がグルタチオン及びグルタ
レドキシンでも達成された。ＤＴＴ−還元型チオレドキシンによりγグリアジン
は強く還元された。予測どおり、ωグリアジンの還元はなかった。証拠により、
チオレドキシン(未変性ｈ又は大腸菌のいずれか)は、特定のグリアジン、特にα
型を特異的に還元することがわかる。
【００７１】 表３ 異なる型のグリアジンの還元剤特異性還元剤 グリアジン％ 相対的還元 α β γ 凝集体* なし 22.4 30.4 24.3 29.2 グルタチオン 36.4 68.1 60.6 60.1 グルタレドキシン 43.5 83.3 79.7 61.5 チオレドキシン 100.0 100.0 100.0 100.0* ゲルに入らないタンパク質 ＮＡＤＰ／チオレドキシン系による還元後のα、β、γ及び凝集体のピーク下
の面積は：それぞれ4.33、8.60、5.67及び0.74吸収単位かけるミリメーターであ
った。これらを組合せた面積は、チオレドキシンが第２ゲルでＤＴＴによって還
元されたときに、実施例１０のような反応条件で観察された面積の約６５％であ
った。 実施例１１ グルテニンの還元 チオレドキシンに対する応答について試験すべき種子タンパク質の残りのグル
ープであるグルテニンは、最も水に溶けにくいが、おそらく最も興味深い。グル
テニンは、小麦粉及びセモリナの調理特性に重要であるため、長年にわたり注目
を引いてきた(MacRitchie, F. ら(1990), Adv. Cer. Sci. Tech. 10：79-145)。
従って、このグループのタンパク質を還元するチオレドキシンの能力を試験する
ことは、現研究の主目的である。 ｍＢＢｒ／ＳＤＳ-ＰＡＧＥ法を適用し、第１ゲルによる実施例１０と同様の 条件のとき、いくつかのグルテニンはチオレドキシンによって特異的に還元され
た。最も広範な還元は、低分子量の範囲(３０〜５５kDa)で観察された。高分子 量の範囲で観察された還元は、特に１００kDa領域以上でほとんど目立たないが まだ明かであった。示されないが、１３０kDaの範囲でも還元は起こりうる。グ リアジンのような特定のグルテニンは、かなりグルタチオン及びグルタレドキシ
ンによって還元された。しかし、すべての場合、還元はチオレドキシンで多く、
ある場合にはチオレドキシンに特異的であった(表４、３０〜４０及び６０〜１ １０kDa範囲のタンパク質に注目せよ)。試験した他の小麦タンパク質について観
察されるように、未変性ｈと大腸菌チオレドキシンの両者が活性であり、ＮＡＤ
ＰＨと対応するＮＴＲ又はＤＴＴのどちらかで還元されうる。従って、グリアジ
ンについてわかったように、特定のグルテニンは、例え有効的でないにしても、
グルタチオン及びグルタレドキシンによって他のものも還元されたにもかかわら
ず、チオレドキシンによってインビトロで特異的に還元された。
【００７２】 ＮＡＤＰ-ＭＤＨのＤＳＧ-１又は-２α-アミラーゼインヒビターによる活性化
におけるチオレドキシンｈの効果についての研究である実施例１と同様の反応条
件である。 表４ グルテニンの還元剤特異性還元剤 グルテニン％ 相対的還元* 60-110kDa 40-60kDa 30-40kDa なし 8 23 16 グルタチオン 31 51 29 グルタレドキシン 50 72 40 チオレドキシン* 100 100 100* NADP/チオレドキシン系による還元後の３つの分子量クラス（高いから低い）下
の面積は：それぞれ1.5、5.67及び5.04 吸収単位×ミリメーター 実施例１２ インビボ還元実験 上記実施例は、チオレドキシンは、インビトロで試験した場合、小麦グリアジ
ン及びグルテニンフラクションの成分を特異的に還元することを示している。し
かし、この結果は、これらのタンパク質が発芽の際インビボで還元されるかどう
か--我々の知識に対して以前に提起されていない問題(Shutov, A.D.ら(1987), P
hytochem. 26：1557-1566) に関して何の指標も提供していない。
【００７３】 この問題に答えるため、ｍＢＢｒ／ＳＤＳ-ＰＡＧＥ法を発芽している種子中 のタンパク質の還元状態を観察するのに適用した。我々は、Osborneフラクショ ンの成分の還元が時間と共に顕著に増加し、２〜３日の発芽後にピークに達する
ことを観察した。観察された還元の増加は、グリアジンについての２倍からアル
ブミン／グロブリンについての３倍まで及びグルテニンについては５倍の範囲で
あった。結果は、主要な小麦タンパク質のグループの代表的なものは発芽のとき
に還元されるが、正味のレドックス変化はグルテニンで最大であることを示唆し
ている。 種子貯蔵タンパク質は、発芽の際に還元を起こすという新しい証拠を提供する
が、結果は、還元がどのように、すなわちグルタチオン又はグルタレドキシンに
よって達成されるかに関しては何も示していない。この点についての情報を得る
ため、主要なチオレドキシン−連結グリアジン(３０〜５０kDa)及びグルテニン(
３０〜４０、４０〜６０kDa)のインビボ還元レベルをインビトロ測定で決定され
た還元と比較した(表４参照)。この目的のため、発芽の際インビボで及び適切な
酵素系によりインビトロで観察されたクーマシー染色タンパク質に対する蛍光率
を計算した。結果(主要チオレドキシン連結グリアジンは分子量範囲が２５〜４ ５kDa、及びグルテニンは分子量範囲が３０〜６０kDaであった)は、グルタチオ ンがグリアジンフラクションのインビボ還元の有意部分(９０％まで)を占めるが
、これは還元にチオレドキシンを必要とすると考えられるグルテニンの場合でな
かったことを示唆している。グルタチオン(又はグルタレドキシン)に基づくであ
ろう還元のレベルは、発芽している種子で測定される還元型グルテニンのレベル
を占めるには不十分であった。 実施例１３ 酵素の測定 チオレドキシンｈのＮＴＲ連結還元に必要なＮＡＤＰＨ源も調査した。他の系
におけるＮＡＤＰＨの生成に機能する酵素、特に酸化的ホスフェート経路のデヒ
ドロゲナーゼについて、セモリナを分析した。表５にまとめた結果は、胚乳抽出
物はこの経路を経てグルコースからＮＡＤＰＨを生成するのに必要な酵素：ヘキ
ソキナーゼ、グルコース６-リン酸デヒドロゲナーゼ及び６-ホスホグルコン酸デ
ヒドロゲナーゼを含むという従前の証拠を確認している(Tatham, A.S.ら(1990),
Adv. Cer. Sci. Tech. 10：1-78)。表５に見られるグルコース６-リン酸デヒド
ロゲナーゼの活性度が還元型チオレドキシンに非感受性であることは注目すべき
である。この点、胚乳酵素は、葉由来の葉緑体対応物よりもむしろ細胞基質に似
ている(Fickenscher, K.ら(1986), Arch. Biochem. Biophys. 247：393-402；Bu
chanan, B.B. (1991), Arch. Biochem. Biophys. 288：1-9；Scheibe, R.ら(199
0), Arch. Biochem. Biophys. 274：290-297)。
【００７４】 小麦粉についての以前の結果(Johnson, T.C.ら(1987), Planta 171：321-331 ；Suske, G.ら(1979), Z. Naturforsch. C 34：214-221)から予測されるように 、セモリナもチオレドキシンｈ及びＮＴＲを含んでいた(表５)。興味深いことに
、活性度の測定に基づくと、ＮＴＲは調べた栽培品種からの調製品中で比率制限
成分であると考えられる。表５：セモリナにおけるチオレドキシンｈの還元に効果を及ぼす酵素の活性度 （グルコース→Glu-6-P→6-P-グルコネート→NADP→チオレドキシンｈ） タンパク質 活性度（nkat/mg タンパク質） ヘキソキナーゼ 0.28 グルコース-6-P-デヒドロゲナーゼ 0.45 6-P-グルコン酸デヒドロゲナーゼ 0.39 NTR 0.06 チオレドキシンｈ 0.35 この結果は、チオレドキシンｈが小麦種子の発芽に関係する代謝プロセスを高
めるシグナルとして機能することを示唆している。そのＮＴＲ及びＮＡＤＰＨに
よる還元に次いで(酸化的ペントースホスフェート経路による生成)、チオレドキ
シンｈは酵素の活性化のみならず、貯蔵タンパク質の移動においても機能すると
考えられる。
【００７５】 実施例１４ パン生地の品質の改良 ＮＡＤＰ／チオレドキシン系を用いて小麦粉のタンパク質を還元することによ
って、パン生地の品質を改良した。還元型チオレドキシンは、タンパク質の他の
部分と架橋してその折りたたみ形状を安定化しているイオウ−イオウ結合を特異
的に切断する。これらの架橋が切断されると、タンパク質は開かれ、パン中の他
のタンパク質と結びついて連結格子を生じ、パン生地の弾性網目構造を形成する
。その網目構造は醗酵プロセスでイーストよって生成される二酸化炭素を捕捉す
るので、パン生地が増量する。還元型チオレドキシンがグリアジン及びグルテニ
ンを活性化し、それらを結合させてパン生地を強化したと提唱する。還元型チオ
レドキシンは、パン生地生成の際に形成されるタンパク質の網目構造を強化した
。これらの試験のため(フランスのMontpellierのローカルな製粉業者から得た中
品質の小麦粉、又はフランスのMontpellierのローカルな製粉業者から得た低品 質の小麦粉で、主にAppolo品種である小麦粉のいずれかを１０gm使用して)、0.2
μgの大腸菌チオレドキシン、0.1μgの大腸菌ＮＡＤＰ-チオレドキシンレダクタ
ーゼ及び５００ナノモルのＮＡＤＰＨを１Ｍ Tris-HCl、ｐＨ7.9緩衝液と共に添
加して5.25mlの３０mM Tris-HCl酵素系混合物を得た。ミクロ−ファリノグラフ 中３０℃で酵素系混合物を１０gmの小麦粉と混合して反応させた。生成したファ
リノグラフの測定により、ＮＡＤＰ／チオレドキシン系の添加によりパン生地が
強化されることがわかった。低品質の小麦粉では、ファリノグラフの読みは、パ
ン生地が還元系の存在下で形成された後、少なくとも４分間安定であったが、こ
れが添加されていない対照ではパン生地形成後すぐに読みが下がった。改良効果
は持続し、実験の間中維持された。換言すると、ミクロ−ファリノグラフの読み
は、パン生地形成後７分で、低品質小麦粉の対照(酵素系無添加)が３７５ブラベ
ンダー単位に対してＮＡＤＰ／チオレドキシン系(ＮＡＤＰ、チオレドキシン及 びＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼ)の成分で処理された同一の低品質小 麦粉では４５０ブラベンダー単位である。 さらに、上記と同様に１０gmのAppolo小麦粉で、ＮＡＤＰＨの濃度をナノモル
でなく５００μモルにしてファリノグラフの試験を行った。ファリノグラフの測
定により、ＮＡＤＰＨのこの量でもパン生地の品質が明らかに改良されることが
わかった。
【００７６】 パン生地のより高いファリノグラフ測定値は、改良されたパン生地の強度及び
よりよいクラム(crumb)質、改良されたテクスチャー及び嵩高さのような改良さ れた焼成品の特性に対応する。また、単離タンパク質によるインビボ分析に基づ
いて、未変性小麦種子のＮＡＤＰ／チオレドキシン系もパン生地の強化に有効だ
ろう。 焼成目的及び本発明の他の観点のため、約0.1〜3.0μgのチオレドキシン(好ま
しくは大腸菌又はチオレドキシンｈ)、約0.1〜2.0μgのレダクターゼ及び約３０
〜５００ナノモルのＮＡＤＰＨを小麦粉約１０gm毎に加えた。チオレドキシン及
びレダクターゼの選択レベルは、小麦粉の品質に依る。一般に、小麦粉の品質が
高いほど高レベルのチオレドキシン及びレダクターゼが必要である。また、チオ
レドキシンは、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ-チオレドキシン-チオレドキシンレダクタ
ーゼ還元系に代えてリポ酸によっても還元できる。牛乳又は水のようなパン生地
の他の成分を加える。しかし、液体は最初にＮＴＲ／チオレドキシン系に加えて
から小麦粉に加える。 醗酵目的のイーストは、還元型チオレドキシンが貯蔵タンパク質を還元する機
会を持った後に加えることが好ましい。そして、パン生地を処理して通常の生地
のように耐久的にし、形作り等し、焼成する。 ＮＡＤＰＨは、この実施例でも以下の実施例でも１００μM グルコース６-ホ スフェート、１００μM ＮＡＤＰ及びイーストのような供給源由来の0.05単位(0
.2μグラム)のグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼから成るようなＮＡＤＰ Ｈ生成源で置き換えることができる。ＮＡＤＰＨ生成源は、チオレドキシン及び
ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼと共にパン生地製造プロセスの最初に添
加する。 １０gmのAppolo栽培品種(ＣＶ)小麦を、4.25mlのＨ2Ｏと0.90mlのTris-HCl(３
０mM、ｐＨ7.9)に含まれる２０μlのＮＡＤＰ(２５mM)、２０μlのＧ６Ｐ(２５m
M)、0.25μgのＧ６ＰＤアーゼ、0.1μgのＮＴＲ及び0.2μgのチオレドキシンｈ で反応させたとき、高いファリノグラフ測定値が得られた。また、これと同じ反
応混合物であるが、ＮＴＲ又はチオレドキシンがないものと１０gmのAppolo小麦
を反応させたときも高いファリノグラフ測定値が得られた。
【００７７】 実施例１５ 小麦パンの焼成の研究 コンピューター監視パナソニック焼成装置を使用して焼成試験を行った。 パンの組成： 対照 小麦粉*： 200gm(ドライ) 水： 70％水分 塩(NaCl)： 5.3ｇ イースト： 4.8ｇ(サッカロミセスセレビジエ、SafInstant) (ドライイースト粉末) *小麦粉試料は、対照的な焼成品質(動物の餌用及び低品質から高い焼成品質を
有する他のグレードを含む)を有する純粋な小麦栽培品種から得た。 アッセイ アッセイ用のパン生地は、対照プラスＮＡＤＰチオレドキシン系(ＮＴＳ)及び
／又はＮＡＤＰ生成系を指示通りに変えた量のすべての成分を含む。 （実験条件） -- 小麦粉及び塩を秤量して混合する。 -- 水分７０％になるような体積の水をベーキングパンに入れた。 -- 小麦粉と塩の混合物を水に加え、コンピューター監視焼成プログラムを開
始させた。プログラム完了に３時間９分７秒かかった。 -- アッセイに関しては、小麦粉−塩混合物を添加する前に酵素系成分を水に
添加した。 -- ２０分３秒混練後、自動でイーストを加えた。 パナソニック装置を監視するプログラムは以下の通りである：セグメント 持続時間 混練条件 加熱 混練 00:00:03 T1 オフ 混練 00:05:00 T2 オフ 混練 00:05:00 T1 オフ 静止 00:10:00 T0 オフ 混練 00:17:00 T2 オフ 混練 00:07:00 T1 オフ 静止 00:30:00 T0 32℃になるまで 混練 00:00:04 T1 32℃ 静止 01:15:00 T0 32℃ 焼成 00:14:00 T0 180℃になるまで 焼成 00:26:00 T0 180℃ 混練条件：T0 ＝ 混練せず(モーター静止) T1 ＝ 通常の混練 T2 ＝ 交互に３秒の混練、３秒の静止 パン塊の体積は、焼成の終了時、パン塊が室温になった時に測定した。 栽培品種THESEEのアッセイ フランスの小麦栽培品種Theseeは、優れたパン焼成品質を有するとして分類さ
れている。下表６は、そのアッセイの結果を示す。
【００７８】 表６ NADPH NTR Th 塊の体積 (μmol) (μg) (μg) (cm3) 相対的単位 対照 0 0 0 1690 100 サンプル 6.0 30 60 1810 107 6.0 30 0 1725 102 6.0 0 60 1720 102 6.0 0 0 1550 92 0 30 60 1800 107 *NADPH 30 60 1620 96 生成系 *NADPH 30 60 1630 96 生成系 ＋ATP,グルコース NTR 及び 6.0 9.4 20 1750 104 Th イースト由来 *NADPH生成系の組成, ATP 及びグルコース 添加体積 NADP, 25 mモル濃度 700 μl (17.5μmole) グルコース-6-ホスフェート, 25 mモル濃度 700μl (17.5μmole) グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(50μg/ml) 175μl (8.75μg) ATP, 25 mモル濃度 700μl (17.5μmole) グルコース, 25 mモル濃度 700μl (17.5μmole) 表６に示されるように、完全なＮＴＳを6.0μモルのＮＡＤＰＨ、３０μgのＮ
ＴＲ及び６０μgのＴｈの濃度で用いて、２００ｇのThesee小麦粉からこの実施 例で上述した量及び条件で焼成したときに、増量した塊体積が得られた。特に言
及しない限り、ＮＴＲ及びチオレドキシン(ｔｈ)は大腸菌由来である。生成系を
用いたとき、又はＮＴＲ若しくはＴｈのどちらかを省略したときには同様の増加
は起こらなかった。また、系の成分量を上記量の約半分以下にしたときにも塊の
体積に有意な効果は生じなかった。 栽培品種APOLLOのアッセイ このフランスの小麦栽培品種は、パン焼成が低品質であると分類されている。
このアッセイで使用したＮＴＲ及びチオレドキシンは大腸菌由来である。下表７
は、２００gmのApollo小麦粉を用いたアッセイの結果を示す。この場合も特に言
及しない限り量及び条件は実施例の最初に記載したのと同様である。
【００７９】 表７ NADPH NTR Th 塊の体積 (μmol) (μg) (μg) (cm3) 相対的単位 対照 0 0 0 1400 100 サンプル 6.0 30 60 1475 105 *NADPH 30 60 1530 109 生成系 ＋ATP,グルコース *NADPH 0 0 1430 102 生成系 ＋ATP,グルコース *NADPH 6 0 1430 102 生成系 *NADPH 6 7 1440 103 生成系 ＊生成系、ＡＴＰ及びグルコースの成分は、表４と同様である。 栽培品種ARBONのアッセイ フランスの小麦栽培品種Arbonは餌用に使用され、パン焼成には不適と分類さ れている。以下の表８及び表９は、実施例の最初に記載したパン生地の量及び条
件でＮＴＳ又はＮＡＤＰＨとＮＴＲを使用することによって、Arbonから、改良 されたパン塊の体積が得られることを示している。アッセイで使用したＮＴＲ、
チオレドキシン、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰＨ生成系の成分の量は、表８及び表９
に示した。表９に示されるように、完全ＮＴＳを使用したArbonパンの品質の改 良は、対照と比較すれば明らかである。
【００８０】 表８ NADPH NTR Th 塊の体積 (μmol) (μg) (μg) (cm3) 相対的単位 対照 0 0 0 1350 サンプル 0.1-0.6 3-4 3-4 20%まで対照より高い >2.0 >20 >20 対照以下
【００８１】 表９ ローフ体積処理 cm3 相対ユニット 完全なNTS 1650 122 −チオレドキシン 1690 125 −NTR 1520 113 −チオレドキシン、NTR 1540 114 −NADPH 1440 107 −NADPH 1560 116 ＋*NADPH生成システム−NTS（対照） 1350 100 NADPH、0.6μモル チオレドキシン、3.5μｇ NTR、3μｇ *生成システム： 3.5μモル、NADP 3.5μモル、グルコース-6-リン酸 1.75μg、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ
【００８２】実施例16 ライコムギパン焙焼試験 ライコムギとは、コムギ／ライムギのハイブリッドであり、一般にニワトリ用
飼料として使用される。これは、コムギよりも栄養があるが、特に比較的先進国
において、全般的にパン製造には適しているとは考えられていない。従ってライ
コムギ粉から焙焼されたローフに対するNTSシステム及びその変種の作用を試験 した。特に記さない限りは、焙焼条件及びドウ成分は、実施例15のコムギ粉につ
いて記したものであった。表Xに示したように、ライコムギドウがチオレドキシ ン、NTR、NADPH生成システムを表に記載された量含む場合に、ローフ体積が改善
された。しかし、NTS（すなわち、チオレドキシン、NTR及びNADPH）を使用した 場合には、相当する改善は認められなかった。パンの質感をより粘着性があり安
定したものにする改善も、表Xに示したようにNTR、Th、NADPH生成システムを使 用した場合に生じた。
【００８３】 表10.ライコムギ粉（Juan種）から焙焼したローフに対するNADP／チオレドキシ ンシステム(NTS)の作用 ローフ体積治療 cm3 相対ユニット 完全なNTS 1230 94 −NTS（対照） 1310 100−NADPH、＋*NADPH 1390 106 NADPH、0.6μモル チオレドキシン、3.5μｇ NTR、3μｇ *生成システム： 4.5μモル、NADP 4.5μモル、グルコース-6-リン酸 4.5μg、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ
【００８４】実施例17 モロコシ、トウモロコシ及びコメの粉に対するNADPH／チオレドキシンシステム の作用も調べた。焙焼条件は、実施例15のコムギ粉に関して記したものであった
。このアッセイにおいて使用したNTSの成分量は、次のようであった：8μモルの
NADPH、40.5μgのNTR、及び54μgのチオレドキシン。チオレドキシン及びNTRは 両方とも大腸菌に由来した。本試験のNTSを含有するパンは、特にトウモロコシ 及びモロコシにおいて、質感及び安定性の改善を示した。
【００８５】実施例18 ライコムギ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、コメ、モロコシ、トウモロコシ 及びテフのエタノール−可溶性及びミリステート−可溶性の貯蔵タンパク質の還 元 特に記さない限りは、本実施例において使用した材料及び方法は、前述の「穀類
タンパク質の還元、材料及び方法」の項に記載されたものである。
【００８６】ライコムギ、ライムギ、オオムギ、オートムギ及びテフ 反応は30mM Tris-HCl緩衝液（pH7.9）中で行った。前述のように、大腸菌のNTR
0.7μg及びチオレドキシン1μg又は酵母のチオレドキシン2μgを、指定されたよ
うに、1mM NADPH及び25〜30μgの抽出された貯蔵タンパク質を含有する該緩衝液
70μlに添加した。エタノール抽出した貯蔵タンパク質は、粉10g毎に70％エタノ
ール50mlを用い、2時間抽出して得た。テフの場合は、粉砕した種子200mgを抽出
した。ミリステートで抽出したタンパク質は、蒸留水5mlを溶媒とするミリスチ ン酸ナトリウム8mgで、粉1gを2時間抽出して得た。NADPH、NTR及びチオレドキシ
ンの組合せは、NADPH／チオレドキシンシステム(NTS)として公知である。指定の
ように、グルタチオン(GSH)2.5mMを還元体として、1.5mM NADPH及びホウレンソ ウ葉のグルタチオンレダクターゼ1.4μgの非存在(GSH)又は存在(GR／GSH／NADPH
)下のいずれかで添加した。20分間インキュベーションした後、mBBr 100nmolを 添加し、かつ反応を更に15分間継続した。反応を停止しかつ過剰なmBBrを誘導す
るために、10％SDS 10μL及び100mM 2-メルカプトエタノール10μLを添加し、そ
の後試料をゲルに載せた。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法については、
N.A. Crawfordらの論文（Arch. Biochem. Biopys.、271:223-239(1989)）に記載
されている。
【００８７】コメ、モロコシ及びトウモロコシ 反応は30mM Tris-HCl緩衝液（pH7.9）中で行った。タンパク質をチオレドキシン
で還元する場合には、緩衝液70μlに下記を添加した：1.2mM NADPH、種子タンパ
ク質分画10〜30μg、大腸菌NTR 0.5μg及び大腸菌チオレドキシン1μg。グルタ チオンによる還元については、チオレドキシン及びNTRを、2.5mM還元型グルタチ
オン及び1μgグルタチオンレダクターゼ（パン酵母、シグマ・ケミカル社）に交
換した。ジチオスレイトールによる還元については、NADPH、チオレドキシン及 びNTRを省き、0.5mMジチオスレイトールを添加した。全ての場合において、イン
キュベーション時間は20分間であった。その後、10mM mBBr溶液10μlを添加し、
かつ反応を更に15分間継続した。反応を停止しかつ過剰なmBBrを誘導するために
、10％SDS 10μl及び100mM 2-メルカプトエタノール10μlを添加し、その後試料
をゲルに載せた。各試行において、抽出されたタンパク質を得るために、粉砕し
た種子1gを、蒸留水5mlを溶媒とするミリスチン酸ナトリウム8mgにより抽出した
。タンパク質の最初のレドックス状態での測定以外は、試料は22℃で2時間抽出 し、その後16,000rpmで20分間遠心分離し、mBBrを添加した。最初のレドックス 状態の測定では、mBBrは、窒素大気下でミリステートと共に添加し、引き続き抽
出した。
【００８８】 オートムギ、ライコムギ、ライムギ、オオムギ及びテフの粉からのミリステート
で抽出したタンパク質の還元試験の分離用SDSS-ポリアクリルアミド電気泳動ゲ ルを調製した。テフのチオレドキシンに関連した緩衝液及びエタノール−抽出し
たタンパク質の程度を示すゲルも調製した。オートムギ、ライコムギ、ライムギ
、オオムギ、テフ／ミリステート抽出試験の全てにおいて、粉はまず50mM Tris-
HCl緩衝液（pH7.5）で20分間抽出し、その後70％エタノールで2時間抽出した。 更にトウモロコシ、モロコシ及びコメのミリステート抽出したタンパク質のゲル
も調製した。トウモロコシ、モロコシ及びコメについて、粉砕した種子を、ミリ
ステートのみで抽出した。従ってトウモロコシ、モロコシ及びコメについては、
ミリステート抽出物は総タンパク質を示すが、オートムギ、ライコムギ、ライム
ギ、オオムギ及びテフについては、これらの粉は先に緩衝液及びエタノールで抽
出されているので、ミリステート抽出物は、グルテニン等量分画のみを表してい
る。ゲルが示す結果は、オートムギ、ライコムギ、ライムギ、オオムギ及びテフ
からミリステートで抽出（グルテニン等量）したタンパク質では、GSH又はGSH／
GR／NADPHと比べて、NTSが最も効果的であることを示した。NTSは更に、コメの 総タンパク質でも最も効果があった。還元型グルタチオンは、トウモロコシ及び
モロコシ由来の総タンパク質でより効果が大きかった。
【００８９】トウモロコシ、モロコシ及びコメの結論 ミリステート−抽出タンパク質の還元状態に対するNTS対グルタチオンレダクタ ーゼの作用に関連した第一のゲルにおいて、処理(1)では、mBBr存在下でのミリ ステート抽出を、窒素大気下で行った；処理(2)においては、ミリステート抽出 タンパク質に、先にタンパク質を還元せずに、mBBrを添加した；処理(3)におい ては、ミリステート抽出タンパク質を、NADP／チオレドキシンシステム(NTS)に より還元した；処理(4)において、ミリステート抽出タンパク質を、NADPH、グル
タチオン及びグルタチオンレダクターゼで還元した。ミリステート−抽出タンパ
ク質のin vivo還元状態及びチオレドキシンに関係したin vitro還元に関連した 第二のゲルにおいて、処理(1)は、第一のゲルの処理(2)と同じであり；処理(2) では、種子を窒素下mBBrが存在する中でミリステレートで抽出し；処理(3)では 、種子をミリステレートで抽出し、NTSにより還元し、その後mBBrを添加し；及 び処理(4)は、タンパク質をDTTで還元した以外は、処理(3)と同じであった。第 一のゲルの処理(1)及び第二のゲルの処理(2)は、穀粒中のタンパク質の最初のレ
ドックス状態を示していた。３種の穀類全てについて、種子中のタンパク質は高
度に還元されていた。大気中で抽出された場合、タンパク質は、特にモロコシ及
びコメにおいて、酸化されていた。酸化されたタンパク質は、再度還元され、全
ての場合においてNTSで最大となった。コメについて、チオレドキシンに関する 還元は、比較的特異的であり；トウモロコシについて、グルタチオンは、チオレ
ドキシンと同程度有効であり、モロコシについて、グルタチオンはチオレドキシ
ンよりもわずかにより有効であった。ジチオスレイトールは、還元体として様々
な効果を示した。これらの実験は、これらの穀類の貯蔵タンパク質が、コムギの
場合よりも特異性が低いことを実証し、かつチオレドキシンがドウ組織（networ
k）を構築しようとする場合には、これをグルタチオンが存在及び非存在の両方 で試験しなければならないことを示唆している。
【００９０】 コムギのグルテニン及びグリアジンの、各々酵母NADP／チオレドキシンシステム
による還元試験のゲルも調製した。グルテニンは、粉10g当たり0.1M酢酸50mlを 用い、2時間抽出することにより得た。グリアジンは、粉10g当たり70％エタノー
ル50mlを用い、2時間抽出して得た。これらのゲルは、酵母システムが、コムギ の貯蔵タンパク質のふたつの主要グループの還元において非常に活性があること
を示した。
【００９１】 ライコムギ、ライムギ、オートムギ及びオオムギの粉からエタノール−抽出した
タンパク質の還元に関するゲルを、各々調製した。結果は、ライコムギ、ライム
ギ及びオートムギのエタノール−抽出タンパク質では、NTSが最も有効であるこ とを示した。オオムギのエタノール−抽出タンパク質は、対照において還元され
、かつチオレドキシン又はグルタチオンはほとんど効果が無かった。
【００９２】実施例19 クニツ及びボーマン・バークダイズトリプシンインヒビタータンパク質の活性及 び安定性に対するチオレドキシンに関連した還元の作用 材料及び方法 植物材料 デュラム・コムギ（トリチカム・デュラム(Triticum durum)、Desf. cv. Monroe
）は、Dr. Kahnから寄贈されたものである。コムギ胚芽は、シグマ・ケミカル社
（セントルイス、MO）から得た。
【００９３】化合物及び酵素 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)用の試薬
は、バイオラド・ラボラトリー社（リッチモンド、CA）から、DTTはベーリンガ ー・マンハイム・バイオケミカル社（インディアナポリス、IN）から得た。L-1-
トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン(TPCK)−処理したトリプシ ン（XIII型、T8640）、サブチリシン（VIII型：細菌サブチリシン、カールスバ ーグ、P5380）、KTI(T9003)、BBTI(T9777)、アゾカゼイン及び他の化学物質は、
シグマ・ケミカル社（セントルイス、MO）から購入した。大腸菌のチオレドキシ
ン及びNTRは、各タンパク質を過剰発現するように形質転換した細胞から単離し た。組換えプラスミドpFPIを有するチオレドキシン株は、Dr. J. P. Jacquot（d
e La Motte-Gueryら、1991年）のご好意により入手した。組換えプラスミドpPMR
21を有するNTR株は、Dr. Marjorie Russel及びDr.Peter Modelのご好意により入
手した（Russel及びModel、1988年）。これらのタンパク質について使用した単 離法は、これらの試験について以下の点を変更し得た：細胞は、Ribi細胞分画装
置において、25,000psiで破壊し、NTRは、Florencioらの論文（1988年）に記載 されたように、レッドアガロース工程を行わずに精製した。大腸菌のチオレドキ
シン及びNTRは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べたところ、各々、 純度が100％及び90％であった。コムギのチオレドキシンhは、先に示したように
精製した（Johnsonら、1987年）。
【００９４】コムギ種子の発芽 コムギ種子を、Generic Bleach 50容量％に室温で1時間浸漬し、不稔化し、その
後蒸留水で完全に洗浄した。不稔化した種子を、プラスチック製のペトリ皿内の
クロラムフェニコール100μg/mlを含有する蒸留水で湿らせたワットマンろ紙を 二枚重ねした上に置いた。発芽は、暗室において室温で、最大5日間継続した。
【００９５】コムギプロテアーゼの調製 根及び徒長枝を切断することにより5日目の発芽したコムギ種子から単離した胚 乳（生の重量10〜15g）を、10mMβ−メルカプトエタノールを含有する5倍容量の
200mM酢酸ナトリウム（pH4.6）中、4℃で30分間抽出した。ホモジネートを、48,
000gで20分間、4℃で遠心分離した。ペレットを廃棄し、上清溶液を30〜70％硫 酸アンモニウムで分画した。プロテアーゼ調製物を示す分画を、10mMβ−メルカ
プトエタノールを含有する最小容量の20mM酢酸ナトリウム（pH4.6）中に再懸濁 し、かつこの緩衝液に対して一晩4℃で透析した。アゾカゼインを基質としてア ッセイすると、このプロテアーゼ調製物は、至適pHをおよそ4.6に示し、少なく とも1週間4℃で安定していた。
【００９６】トリプシンインヒビターの還元及びタンパク質分解の感受性 特に記さない限り、トリプシンインヒビター（0.4mg/ml）の還元を、10mM EDTA を含有する20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.9）0.1ml中で、30℃で2時間行っ た。チオレドキシン、NTR、及びNADPHの濃度は、各々、0.024mg/ml、0.02mg/ml 及び0.25mMであった。還元体としてDTTを使用し、EDTA及びNADP／チオレドキシ ンシステムの成分を除いた。還元後、インヒビター混合物のアリコートを、トリ
プシン阻害活性又はタンパク質分解の感受性のいずれかの測定のために採取した
。サブチリシン試験においては、このインヒビター混合物（50μl）は、サブチ リシンと直接混合し、かつ室温で1時間インキュベーションした。コムギプロテ アーゼ調製物について、このインヒビター混合物（50μl）のpHを、200mM酢酸ナ
トリウム35μl（pH4.6）を混合することにより最初は4.7に調節し；その後コム ギプロテアーゼ調製物10μlを添加し、インキュベーションを37℃で2時間継続し
た。サブチリシンによる消化を停止するために、消化混合物に、100mMフェニル メチルスルホニルフルオリド(PMSF)2μl及び10％SDS 10μlを添加した。植物プ ロテアーゼ調製物については、消化は、等量のSDS試料緩衝液[0.125M Tris-HCl 、pH6.8、4重量％SDS、20容量％グリセロール、10容量％β-メルカプトエタノー
ル、及び0.02重量％ブロモフェノールブルー]を添加することにより停止した。 タンパク質分解産物は、12％又は16％SDSポリアクリルアミドスラブゲルを用い る電気泳動により分析した（Laemmli、1970年）。乾燥したスラブゲルを、レー ザー濃度計（ファルマシア-LKBウルトラスキャンXL）によりスキャンニングし、
かつKTI及びBBTIタンパク質バンドのピーク面積を、ファルマシア社のGelScan X
Lソフトウェアプログラムを用いて積分し得た。
【００９７】アッセイ チオレドキシン及びNTRを、前述のFlorencioらの論文（1988年）に従いアッセイ
した。トリプシン活性は、50mM Tris-HCl、pH7.9において、基質としてN-ベンゾ
イル-L-アルギニンエチルエステルを用い、吸光度253nmの増大による（Mundyら 、1984年）か、もしくは、アゾカゼイン基質からのトリクロロ酢酸(TCA)-可溶性
分画へのアゾ色素の放出（下記参照）により測定した。トリプシン阻害活性は、
トリプシン（5〜10μg）を、50mM Tris-HCl、pH7.9中で、適量のKTI又はBBTIと 共に、室温で5分間プレインキュベーションし、その後タンパク質分解活性につ いて測定した。これら２種の基質は、同様のデータをもたらし、結果は一方の基
質について示した。
【００９８】 アゾカゼイン基質からの、pH4.7におけるTCA溶液へのアゾ色素の放出後に、コム
ギのプロテアーゼ活性を測定した。20mM酢酸ナトリウム（pH4.6）及び10mMβ-メ
ルカプトエタノールの溶液中のコムギプロテアーゼ50μlを、200mM酢酸ナトリウ
ム（pH4.6）50μl及び2％アゾカゼイン100μl（20mMリン酸ナトリウム、pH7.0中
）へと添加した。37℃で1時間インキュベーションした後、10％TCA 1mlを添加し
、この混合物を室温で10分間静置した。微量遠心機（8000g）により5分間遠心分
離した後、上清溶液1mlを採取し、1N NaOH 1mlと混合した。440nmにおいて吸光 度を測定した。タンパク質濃度は、対照としてウシ血清アルブミンを用いる、バ
イオラド社の試薬により決定した（Bradford、1976年）。
【００９９】結果 トリプシン阻害活性 ダイズの20kDaのクニツ及び8kDaのボーマン・バークトリプシンインヒビターは 、各々、2及び7個のジスルフィド基を有する（Birk、1976年；Wilson、1988年）
。これらの生理的機能は確立されていないが、これらの２種のインヒビターは、
マメ科の種子への広範な分布及びそれらの栄養障害、例えば栄養過多及び関連し
た膵の機能不全を惹起する可能性のために、集中的に研究されている。表I及びI
Iに示し、かつ先の実施例において説明したように、KTI及びBBTIは、大腸菌又は
植物に由来するNADP／チオレドキシンシステムによって特異的に還元される。還
元型のグルタチオン及びグルタレドキシン（ある種の動物及び細菌システムにお
いてチオレドキシンと置き換わることが可能であるが、植物においては生成する
ことが確かめられていない、チオールタンパク質（Holmgren、1985年））は無効
であった。
【０１００】 チオレドキシンによる還元の結果を調べるために、KTI及びBBTIの酸化型及び還 元型のトリプシン阻害活性を比較した。表XIに示したように、NADP／チオレドキ
シンシステム(NTS)と共に30℃で2時間プレインキュベーションした結果は、実質
的にトリプシン阻害活性が失われていた（すなわち、阻害されない対照に比べて
トリプシン活性が増大した。）。更に詳細に述べると、NADP／チオレドキシンシ
ステムは、KTI及びBBTIのトリプシン活性を、各々、3-及び6-倍増加するように 作用した。同様の結果が、チオレドキシンの非生理的置換体であるDTTで、及び 天然のジチオールであるリポ酸により還元されたチオレドキシンで得られた。DD
T単独との長いインキュベーション（室温で一晩）は、両インヒビターの完全な 又はほとんど完全な失活をもたらした（データは示さず）。DTTとは異なり、リ ポ酸は、チオレドキシンが存在しない場合、顕著にKTI及びBBTIを還元（失活） しなかった。
【０１０１】 表11.NADP／チオレドキシンシステム、DTT又は還元されたリポ酸による還元後の
トリプシン阻害に対するダイズトリプシンインヒビターの能力の変化 相対的トリプシン活性*処置 KTI BBTI インヒビターなし 100 100 インヒビター 酸化型 17.0 11.5 NTSによる還元1 55.6 70.6 DTTによる還元2 68.6 88.9 LA/Trx hによる還元3 40.5 87.8 ＊阻害されない対照トリプシンの比活性は、基質としてN-ベンゾイル-L-アルギ ニンエチルエステルを用い、0.018ΔA253nm／μg／分であった。 1. 大腸菌NTS（NADP／チオレドキシンシステム）による還元は30℃で2時間行っ
た。 2. DTT(1mM)による還元は、30℃で1時間行った。 3. リポ酸（LA、0.4mM）及びコムギチオレドキシンh(Trx h)による還元は、30 ℃1時間行った。リポ酸(0.4mM)のみ存在する場合、トリプシン活性はKTIについ て20.0％、BBTIについて12.5％であった。
【０１０２】 Friedmanとその同僚は、イオウ還元体（硫酸ナトリウム、N-アセチル-L-シス テイン、還元型グルタチオン、又はL-システイン）の存在下において加熱したダ
イズ粉は、トリプシンインヒビターを失活したことを認め、恐らくこれはダイズ
粉中の他のタンパク質によるジスルフィド結合の還元又は相互交換(interchange
)の結果であると考えた（Friedman及びGumbmann、1986年；Friedmanら、1982年 、1984年）。これらの還元体によるトリプシンインヒビターの失活は、被験ラッ
トにおいて、粉の消化性及び栄養価を向上した（Friedman及びGumbmann、1986年
）。これらの初期の知見と考え合わせると、今回の知見は、チオレドキシンによ
り標的とされるKTI及びBBTIの両方のジスルフィド結合が、トリプシン阻害活性 にとって重要であることを明らかにしている。
【０１０３】熱安定性 概してプロテアーゼインヒビタータンパク質は、加熱のような失活処理に対して
安定である。この安定性は、少なくともある程度は、ジスルフィド結合の架橋に
起因している（Birk、1976年；Ryan、1981年）。還元によるジスルフィド結合の
破壊が、熱安定性を低下することは公知である（Friedmanら、1982年）。チオレ
ドキシンによる還元が同様の結果をもたらすかどうかという問題が生じる。
【０１０４】 表XIIに示した結果は、この問題に対する肯定的な回答を提供している。80℃で1
5分間加熱した場合、チオレドキシン−還元型KTIは完全にそのトリプシン阻害能
を失うが、その酸化型は、当初の活性の半分程度の活性を維持している（表XII ）。酸化型BBTIはより安定しており、100℃で25分間加熱後も、そのトリプシン 阻害活性の大半を維持している。にもかかわらず、KTIのように、BBTI還元型は 、加熱により完全に失活した（表XII）。これらの結果は、(i)KTI及びBBTIは還 元時に熱に対する増大した感度を示す；及び(ii)溶液中の純粋なBBTIは、溶液中
の純粋なKTIよりもより熱安定性であるという先の知見に一致している。粉につ いて逆もまた真である（すなわちKTIはBBTIよりも熱安定性である（Friedmanら 、1982年及び1991年；並びに、DiPietro及びLiener、1989年））。
【０１０５】表XII. クニツ及びボーマン・バークトリプシンインヒビターの熱安定性：大腸 菌NADP／チオレドキシンシステムによる酸化、その後の還元 相対トリプシン活性*処理 KTI BBTI インヒビターなし 100 100 インヒビター、非加熱 酸化型 26.6 9.4 還元型 76.4 84.2 インヒビター、80℃で15分間加熱 酸化型 52.3 nd1 還元型 98.7 nd インヒビター、100℃で25分間加熱 酸化型 nd 17.2 還元型 nd 98.4 *トリプシンの比活性は、基質としてアゾカゼインを用い、0.319ΔA440nm／mg／
分であった。失活に使用した温度は、我々の条件下でのトリプシンインヒビター
の熱安定性を示すために設計された初期の実験において決定した。 1. nd：測定されず
【０１０６】プロテアーゼ感受性 KTI及びBBTIの還元型が、トリプシン以外のプロテアーゼに対する低下した安定 性を示すかどうかを検証するために、KTI及びBBTIの還元型及び酸化型の両方を 、コムギのプロテアーゼ調製物又はサブチリシンと共にインキュベーションし、
かつSDS-PAGEによりそのタンパク質分解産物を分析した。タンパク質分解の程度
は、レーザー濃度計により、SDSゲル上の完全なタンパク質の存在度(abundance)
を測定することにより決定した。発芽５日目のコムギ種子からのプロテアーゼ調
製物について試験した場合、クニツインヒビターの酸化型は、ほとんど完全な消
化に対する抵抗性を示したが、チオレドキシン還元型はプロテアーゼの作用を受
けやすかった。表XIIIに示したように、KTIの約80％が、NADP／チオレドキシン システム(NTS)の全ての成分に左右される反応において減成された。BBTIは、酸 化型タンパク質がKTIよりもよりタンパク質分解を受けやすいことを示した以外 は、同じパターンを示した。植物プロテアーゼ調製物をサブチリシンで置き換え
た場合の両インヒビターについても、同様の作用が認められた（データは示さず
）。タンパク質分解反応の性質は調べなかったが、SDSゲル上でペプチド産物が 検出されなかったことは注目される。
【０１０７】表13.植物プロテアーゼ調製物によるタンパク質分解に対するクニツ及びボーマ ン・バークインヒビターの感受性に対するチオレドキシンが関連した還元の作用 1 相対存在度2 処理 KTI BBTI インヒビターなし 100 100 プロテアーゼ 還元システムなし 97.9 67.2 大腸菌NTS3 22.1 16.0 NTS−チオレドキシン 90.2 nd4 NTS−NADPH 97.7 nd NTS−NTR 97.9 nd 1. 大腸菌チオレドキシンシステムによる30℃で2時間の還元後、pHを200mM酢酸
ナトリウムの添加により4.7に調節した。その後コムギプロテアーゼ調製物を添 加し、かつ37℃で2時間インキュベーションし、引き続きSDS-PAGE分析を行った 。 2. レーザー濃度計で測定。 3. NTS：NADP／チオレドキシンシステム 4. nd：測定されず
【０１０８】 本実施例は、チオレドキシン、又はジチオスレイトール(DTT)による還元が、両 方のタンパク質の失活をもたらし、かつそれらの熱及びプロテアーゼに対する感
受性を増大することを示している。これらの結果は、インヒビタータンパク質の
チオレドキシンが関連した還元が、それらの工業的加工及び種子の発芽の両方に
関連していることを示している。
【０１０９】 これらの結果は、KTI及びBBTIのトリプシン阻害活性にとって、ジスルフィド結 合が必須であるという結論を確認している（Birk、1985年；Friedman及びGumbma
nn、1986年；Friedmanら、1982年、1984年）。これらの研究は、還元（失活）が
生理的条件でも生じ得る（すなわち、NADPHで還元されたチオレドキシンにより 低温で）ことも示している。低温でトリプシンインヒビターを失活する能力は、
両方のトリプシンインヒビターの完全な失活の可能性のある方法を提供し、これ
によりダイズ製品の品質を向上し、かつエネルギーを節約する。KTIを完全に失 活する方法の必要性は、BBTIが完全に失活されるような条件下であっても、KTI の活性の20％はダイズ粉に安定して維持されるので、重要である（Friedmanら、
1991年）。
【０１１０】 この結果は、更にKTI及びBBTIのプロテアーゼ感受性に関する新たな情報ももた らしている。これらの還元後のプロテアーゼ感受性の増大は、種子の発芽時にこ
れらのプロテアーゼインヒビターに曝露されると、NADP／チオレドキシンシステ
ムが、これらのインヒビタータンパク質が修飾（失活）されかつ事実上分解され
るようなメカニズムとして利用されることを示唆している（Baumgartner及びChr
ispeels、1976年；Chrispeels及びBaumgarter、1978年；Orfら、1977年；Wilson
、1998年；Yoshikawaら、1979年）。前述のように、NADP−チオレドキシンシス テムが、コムギ種子の発芽時にタンパク質の動員(mobilizing)において同様の役
割を果たすという証拠がある。
【０１１１】実施例20 チオレドキシンによるトウゴマ種子2Sアルブミンタンパク質の還元 下記のトウゴマ種子の2Sタンパク質を還元するスルフヒドリル試薬の試験結果（
Sharief及びLi、1982年；Youle及びHuang、1978年）は、チオレドキシンは、2S ラージサブユニットの分子内ジスルフィドを積極的に還元するが、これらの二個
のサブユニットに結合している分子間ジスルフィドは還元しないことを示してい
る。
【０１１２】材料及び方法 材料 トウゴマ種子（リシナス・コムニスL.・バル・ハレ(Ricinus communis L. var H
ale)）は、ボスウェル・エンタープライズ社（プレインビュー、TX）から得た。
生化学試薬は、シグマ・ケミカル社（セントルイス、MO）から入手した。大腸菌
のチオレドキシン及びNTRは、各タンパク質を過剰発現するように形質転換した 細胞から単離した。組換えプラスミドpFPIを含むチオレドキシン株は、Dr. J. P
. Jacquotのご好意により入手した（de La Mott-Gueryら、1991年）。組換えプ ラスミドpPMR21を含む株は、Dr. Marjorie RusselとDr. Peter Modelのご好意に
より入手した（Russl及びModel、1988年）。チオレドキシン及びNTRは各々、de
La Mott-Gueryらの論文（1991年）及びFlorencioらの論文（1988年）に記載され
た方法により精製した。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の試薬は、バ イオラド・ラボラトリー社（リッチモンド、CA）から購入した。モノブロモビマ
ン(mBBr)又はチオライト(Thiolite)は、カルビオケム社（サンディエゴ、CA）か
ら入手した。他の化学物質は、販売業者から購入し、かつ最高品質のものが入手
できた。NADP-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びフルクトース-1,6-ビスリン酸は、
それぞれ、トウモロコシの葉（Jacquotら、1981年）及びホウレンソウの葉（Nis
hizawa、1982年）から精製した。チオレドキシンhは、ホウレンソウタンパク質 について示された方法に従ってコムギ種子から単離した（Florencioら、1988年 ）。グルタチオンレダクターゼは、ホウレンソウの葉から調製した（Florencio ら、1988年）。
【０１１３】プロテインボディーの単離 プロテインボディーを、非水性の方法により単離した（Yatsu及びJacks、1968年
）。殻付きの乾燥トウゴマ種子15gを、グリセロール40ml中で、ワーニング・ブ レンダーを用いて30秒間ブレンディングした。この混合物を、４枚重ねのナイロ
ン布を通してろ過した。粗抽出物を、ベックマンJ2-21M遠心分離機とJS-20ロー ターを用いて、272×gで5分間遠心分離した。遠心分離後、上清分画を収集し、4
1,400×gで20分間遠心分離した。プロテインボディーを含むペレットを、グリセ
ロール10ml中に再懸濁し、遠心分離し（41,400×gで20分間）、ペレットを収集 した。この洗浄工程を２回繰り返した。ペレットを100ml Tris-HCl緩衝液（pH8.
5）3mlで抽出し、可溶性（「マトリックス」）分画を得た。残留している不溶性
（「クリスタロイド」）分画は、前述のような遠心分離により収集し、その後10
0mM Tris-HCl緩衝液（pH8.5）を溶媒とする6M尿素3mlで抽出した。
【０１１４】2Sタンパク質精製法 2Sタンパク質を、Tully及びBeevers（1976年）の変法により調製した。前記マト
リックスタンパク質分画を、5mM Tris-HCl緩衝液（pH8.5）（緩衝液A）で平衡と
したDEAE-セルロースカラム(DE-52)に載せ、かつ緩衝液Aを溶媒とする0〜300mM
NaCl勾配により溶離した。2Sタンパク質含有分画を一緒にし、かつ凍結乾燥によ
り濃縮した。濃縮した分画を、150mM NaClを含有する緩衝液Aで平衡化したファ ルマシア社のFPLCスーパーロース-12(HR 10/30)カラムに載せた。スーパーロー ス-12カラムから得た2Sタンパク質含有分画を、緩衝液Aで平衡化したFPLCモノQ
HR 5/5カラムに載せた。このカラムを、緩衝液A 3ml、緩衝液Aを溶媒とする0〜3
00mM NaClの直線勾配溶液20ml、及び最後に1M NaCl含有緩衝液Aにより順に溶離 した。この方法で精製した2Sタンパク質は、クーマシーブルー染色したSDSポリ アクリルアミドゲルにおいて夾雑物を含んでいなかった（Kobrehel、1991年）。
【０１１５】分析法 タンパク質の還元は、Crawfordら（1989年）のモノブロモビマン(mBBr)／SDSポ リアクリルアミドゲル電気泳動法によりモニタリングした。標識したタンパク質
を、先の「穀類タンパク質の還元、方法及び材料」の項に記したように定量した
。タンパク質は、Bradfordの方法（1976年）により測定した。
【０１１６】酵素アッセイ／還元実験 チオレドキシン及び2Sタンパク質の存在下でのNADP-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ 及びフルクトース-1,6-ビスリン酸のアッセイについては、Wadaら（1981年）の プロトコールを用いた。アッセイは、添加されたチオレドキシン量がトウゴマの
2Sタンパク質を還元するのには十分であるが、標的酵素を容易に感知できるほど
に活性化するには不十分であるような条件下で行った。全てアッセイは25℃で行
った。特に記さない限りは、使用したチオレドキシン及びNTRは大腸菌に由来し た。ジチオスレイトール及び大腸菌チオレドキシンによる還元後、mBBr／SDSポ リアクリルアミドゲル電気泳動により、精製時の2Sタンパク質をモニタリングし
た（Crawfordら、1989年；Kobrehelら、1991年）。
【０１１７】 トウゴマ種子由来のマトリックス及びクリスタロイドタンパク質の還元は、mBBr
／SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により調べた。このゲルのレーン（示 さず）は次のようであった：1及び7、対照：無添加；2及び8、GHS／GR／NADPH；
還元型グルタチオン、グルタチオンレダクターゼ（ホウレンソウ葉由来）及びNA
DPH；3及び9、NGS：NADPH、還元型グルタチオン、グルタチオンレダクターゼ（ ホウレンソウ葉由来）及び大腸菌由来のグルタレドキシン；4及び10、NTS：NADP
H、NTR、及びチオレドキシン（両タンパク質は大腸菌由来）；5及び11、NADPH；
6及び12、NADPH及び大腸菌NTRである。反応は、100mM Tris-HCl緩衝液（pH7.8）
において行った。既述のように、0.7μg NTR及び1μgチオレドキシンを、1mM NA
DPH及び標的タンパク質（処理1−6は8μgマトリックスタンパク質及び処理7−12
は10μgクリスタロイドタンパク質）を含有するこの緩衝液70μlに添加した。グ
ルタチオンによるアッセイは同様に行ったが、最終濃度は2mMで、1.4μgグルタ チオンレダクターゼ、1μgグルタレドキシン、及び1.5mM NADPHであった。反応 時間は20分間であった。
【０１１８】 更にmBBr／SDS−PAGE法を用いて、トウゴマ種子2Sタンパク質のジスルフィド結 合の還元についてチオレドキシンの特異性を調べた。ゲル（示さず）のレーンは
次のようであった：(1)対照（無添加）；(2)対照＋NTS（マトリックス及びクリ スタロイドタンパク質と同じ条件）；(3)対照（100℃で3分間加熱）；(4)対照＋
2mM DTT（100℃で3分間加熱）。2Sタンパク質5μg及び指定された添加物を含有 する試料を、30mM Tris-HCl（pH7.8）において20分間インキュベーションした。
その後mBBr 80nmolを添加し、反応を更に15分間継続した後、mBBr／SDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により分析した。
【０１１９】結果 トウゴマ貯蔵タンパク質は、種子の成熟時にはプロテインボディー中に保持され
ているが、これはそれらの溶解度を基に2種の分画に分けることができる。より 可溶性のタンパク質は、プロテインボディー外側セクション（「マトリックス」
）に、より可溶性が低いものは内側（「クリスタロイド」）に収容されている。
現在の研究では、このマトリックス成分及びクリスタロイド成分は単離され、細
胞のチオール、すなわちグルタチオン、グルタレドキシン及びチオレドキシンに
よりそれらが還元を受ける能力が決定されている。グルタレドキシンは触媒活性
のあるチオール基を有する12kDaタンパク質であり、これは細菌及び動物の特定 の酵素反応においてチオレドキシンと置き換わることができる（Holmgrenら、19
85年）が、植物において生成は確認されていない。
【０１２０】 これらの結果は、トウゴマ種子の多くの貯蔵タンパク質が試験したチオールによ
り還元されるにもかかわらず、マトリックスの2Sタンパク質のラージサブユニッ
トに相当する低分子量のタンパク質のみが、チオレドキシンに対する厳密な特異
性を示すことを示唆している。クリスタロイド分画の特定の比較的高分子量のタ
ンパク質は還元を受けたが、これらの場合、グルタレドキシンとチオレドキシン
の間にほとんど差異はなかった。従ってトウゴマ種子の2Sラージサブユニットは
、チオレドキシン−特異性還元を受ける先に論じたシスチン−含有タンパク質に
類似しているように思われた。これらの実験は、この特異性を確認し、かつこの
還元されたタンパク質の特定の特性を説明するために設計した。予想されたよう
に、ジスルフィド基の欠如は、2Sスモールサブユニットが、本質的にいずれの被
験還元体であってもmBBrと反応しないことを示した。
【０１２１】 レーザー濃度計によりその蛍光バンドをモニタリングした場合、トウゴマ種子の
2Sラージサブユニットの還元は、NADH／チオレドキシンシステムの全ての成分（
NADPH、NTR及びチオレドキシン）に左右されることがわかった（表XIV）。他の チオレドキシンに関連したタンパク質（葉緑体酵素を含む）については、2Sラー
ジサブユニットの還元におけるチオレドキシン活性は、ジチオスレイトール(DTT
)により化学的に、もしくは、NADPH及びNTRにより酵素的のいずれかで低下され る。NADPチオレドキシンシステム、DTT単独、及びDTT＋チオレドキシンによる25
℃で20分間の還元の程度は、各々、84％、67％、及び90％である。同様に、一般
に前述のジスルフィドタンパク質でかなりの減少が認められた（Johnsonら、198
7年）。他の種子タンパク質と同様に、天然のコムギのチオレドキシンh及び大腸
菌のチオレドキシンは、DTTによる2Sタンパク質の還元において互換的に使用す ることができる（データは示さず）。
【０１２２】 表14.様々なスルフヒドリル還元剤によるトウゴマ種子2Sタンパク質の還元の程 度。マトリックス及びクリスタロイドタンパク質の測定と同様の反応条件。100 ％の還元は、2Sタンパク質を2％SDS及び2.5％β-メルカプトエタノール存在下で
の3分間加熱した場合に得られるものに相当する。NTS：NADPH、NTR及びチオレド
キシン（いずれも大腸菌タンパク質）；GSH／GR／NADPH：還元型グルタチオン、
グルタチオンレダクターゼ（ホウレンソウ葉由来）及びNADPH；NGS：NADPH、還 元型グルタチオン、グルタチオンレダクターゼ（ホウレンソウ葉由来）及びグル
タレドキシン（大腸菌由来）。 処置 相対還元率（％） 対照 0 NADP／チオレドキシンの完全なシステム 84 NADP−チオレドキシン 0 NADP−NADPH 0 NADP−NTR 0 還元型グルタチオン 0 NADP／グルタレドキシンの完全システム 0 DTT 67DTT＋チオレドキシン 90
【０１２３】 トウゴマ種子の2Sタンパク質を還元するチオレドキシンの能力も、酵素活性化ア
ッセイにおいて明白であった。ここで、チオレドキシンによって標的化されたタ
ンパク質（この場合2S）を用いて、葉緑体のチオレドキシンに関連した酵素、NA
DP−リンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはフルクトース-1,6-ビスリン酸を活性化し た。現時点で試験したタンパク質のほとんどで、2Sタンパク質はより効果的にNA
DP−リンゴ酸デヒドロゲナーゼを活性化し、かつフルクトースビスリン酸との活
性はほとんど示さなかった（2.6対0.0nmol／分／mgタンパク質）。
【０１２４】 トウゴマ種子2Sタンパク質は、分子内ジスルフィドに加え、分子間ジスルフィド
を含む。従って2Sタンパク質は、これら2種の結合のチオレドキシン特異性を決 定する機会を提供する。この目的のために、トウゴマ種子2Sタンパク質を、(i)N
ADP／チオレドキシンシステムにより室温で酵素的に、及び(ii)DTTにより100℃ で化学的に還元した。mBBrと反応した後、この還元されたタンパク質を、更なる
スルフヒドリル試薬を添加せずにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、 分析した。結果は、チオレドキシンは分子内ジスルフィドを積極的に還元したが
、分子間ジスルフィドとは効果が非常に少なかったことを示した。
【０１２５】 この結果は、油を産生する植物であるトウゴマ種子2Sタンパク質の還元に対する
チオレドキシンの役割を拡大する。チオレドキシンは、2Sタンパク質のラージサ
ブユニットの分子内ジスルフィドを還元し、かつラージ及びスモールサブユニッ
トに結合している分子間ジスルフィドに対する活性はほとんど示さなかった。ダ
イズのトリプシンインヒビターの結果を基に、チオレドキシンによる分子内ジス
ルフィドの還元は、タンパク質分解に対するジスルフィドタンパク質の感受性を
顕著に増大することは明らかである（Jiaoら、1992年a）。しかし、コムギの主 要貯蔵タンパク質について認められるように、2Sタンパク質の還元が、そのタン
パク質分解による減成の以前に生じるかどうか（Youle及びHuang、1978年）は依
然研究中である。この研究から生じる関連した疑問点は、トウゴマ2Sタンパク質
が、ブラジルナッツなどの他の油を産生する植物と同様に（Altenbachら、1987 年；Ampeら、1986年）、貯蔵タンパク質の機能の他に機能を有するかどうかであ
る。
【０１２６】実施例21 特異的インヒビタータンパク質の失活による穀類のプルラナーゼのチオレドキシ ン依存型脱阻害 プルラナーゼアッセイ 1. マルトトリオースの検量線： 水又は緩衝液0.1又は0.2mlを溶媒とするマルトトリオースの一連の濃度（0〜2mg
）を、微量遠心管中に作製した。これに、ジニトロサリチル酸(DA)試薬（DA 1g 、酒石酸ナトリウムカリウム30g、及び2N NaOH 20mlを混合し、水で最終容量100
mlとする）0.2mlを添加した。この試薬は、温水浴中で溶解した。この混合物を1
00℃で5分間加熱し、水浴中で冷やした（室温）。各試料を、水2mlを含有するガ
ラス管に移した。水に対してのA493を測定した。ΔA493 [マルトトリオース含有
試料のA493を、ブランク（マルトトリオース非含有）のA493から減じた値]を、 マルトトリオース濃度に対してプロットした。
【０１２７】 2. プルラナーゼ活性アッセイ： 基質プルランからの還元糖の放出により、プルラナーゼ活性を測定した。典型的
にはプルラナーゼ試料10〜100μl（20mM Tris-HCl、pH7.5、又は5〜20酢酸ナト リウム、pH4.6を溶媒とする）を、200mM酢酸ナトリウム（pH5.5）25〜100μl（ この緩衝液はアッセイの終了時のpH5.5をもたらす。）及び2重量％プルラン10〜
20μlと混合した。この混合物を、プルラナーゼ活性に応じて、37℃で30〜120分
間インキュベーションした。反応を、DA試薬200μlを添加することによって停止
した。その後前述のように還元糖を測定した。
【０１２８】 注意 1. プルラナーゼ供給源として、粗抽出物の透析により得たプルラナーゼ粗抽出
物、又は透析した30〜60％硫酸アンモニウム分画から得たプルラナーゼを使用す
る場合は、粗抽出物中に還元糖が存在するのでアッセイ前に完全に透析しなけれ
ばならない。言い換えると、透析した粗抽出物又は透析した30〜60％硫酸アンモ
ニウム分画の粗プルラナーゼ試料のバックグラウンドは非常に高い。この場合、
ブランクは下記のように作製する：まずDA試料200μlを添加し、その後酵素試料
、プルラン及び緩衝液を添加する。 2. DTT（又はβ-メルカプトエタノール(MET)もしくはGSH）の最終濃度が、アッ
セイ混合物中2mM以上である場合は、OD493値は、DTT（MET、GSH）を含まない試 料の値よりも高くなるであろう。アッセイ時にはDTTが存在しない試料のブラン クに、反応終了時にDTT（MET、GSH）を添加しなければならない。確実にアッセ イ混合物中のDTTの最終濃度が2mM以下であるように注意しなければならない。
【０１２９】プルラナーゼインヒビター抽出物及び硫酸アンモニウム分画の精製 オオムギ麦芽200gを電気コーヒーミルで粉砕し、細かい粉末とし、5重量％NaCl
600ml中で30℃で3時間抽出した。30,000g、4℃で25分間遠心分離した後、上清を
固形硫酸アンモニウムで沈殿し分画した。30〜60％飽和硫酸アンモニウムにより
沈殿したタンパク質を、最小容量の20mM Tris-HCl（pH7.5）中に溶解し、この緩
衝液に対して一晩4℃で透析した。
【０１３０】DE52クロマトグラフィー 透析した試料を遠心分離し、不溶性物質を除去し、上清を2Nギ酸でpH4.6に調節 した。酸で変性したタンパク質をペレット化した後、上清をNH4OHによりpH7.5に
再度調節し、20mM Tris-HCl（pH7.5）で平衡化したDE52カラム（2.5×26cm）に 載せた。前記緩衝液80mlで洗浄した後、カラムを、0〜500mM Tris-HCl（pH7.5）
の直線勾配で溶離した。6.7mlの分画を収集した。プルラナーゼは、約325mM NaC
lで溶離し、そのインヒビターは、約100mM NaClで溶出した。更にプルラナーゼ は、CM32（20mM酢酸ナトリウム、pH4.6）及びセファクリル-200HR（200mM NaCl 及び1mM EDTAを含有する30mM Tris-HCl、pH7.5）クロマトグラフィーにより精製
した。プルラナーゼインヒビタータンパク質は下記のように精製した。
【０１３１】CM32クロマトグラフィー DE52工程から得たプルラナーゼインヒビター試料（約90ml）を、150mlのフラス コに入れ、70℃の水浴中で20分間インキュベーションした。遠心分離後、透明化
した試料を次に2Nギ酸でpH4.6に調節し、20mM酢酸ナトリウム（pH4.6）に対して
透析した。透析時に生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を、20mM酢酸ナト
リウム（pH4.6）で平衡化したCM32カラム（2.5×6cm）上でクロマトグラフィー を行った。タンパク質を、20mM酢酸ナトリウム（pH4.6）200mlを溶媒とする0〜0
.4M NaClの直線勾配で溶離した。プルラナーゼ阻害活性を有する分画（5.0ml／ 分画）を一緒にし、透析し、かつ再度20mM酢酸ナトリウム（pH4.0）200mlを溶媒
とする0.2〜1M NaClの直線勾配を用い、CM32カラム（2.5×6cm）上でクロマトグ
ラフィーを行った。
【０１３２】セファデックスG-75ろ過 ２回目のCM32クロマトグラフィー工程から得たプルラナーゼインヒビター分画を
、透析バッグ中に入れ、固形ショ糖に対し濃縮し、その後200mM NaCl及び1mM ED
TAを含有する30mM Tris-HCl（pH7.5）で平衡化したセファデックスG-75カラム（
2.5×85cm）で分離した。プルラナーゼインヒビター活性を示す分画（3.6ml／分
画）を一緒にし、固形ショ糖に対して透析することで濃縮し、その後10mM Tris-
HCl（pH7.5）に対して透析した。
【０１３３】プルラナーゼインヒビターの同定及び精製 発芽時に、デンプンは、α−、β−アミラーゼ、及びプルラナーゼ（脱分枝酵素
、R-酵素とも称される）によりグルコースに転換される。アミラーゼの調節が集
中的に研究されているが、種子におけるプルラナーゼの調節についてはほとんど
わかっていない。Yamada（Yamada, J.、Carbohydrate Research、90:153-157(19
81)）は、還元剤（例えばDTT）又はプロテアーゼ（例えばトリプシン）と一緒の
穀類粉のインキュベーションが、プルラナーゼ活性を活性化することを報告して
おり、このことは還元又はタンパク質分解が、プルラナーゼが発芽時に活性化さ
れるメカニズムであることを示唆している。コメ粉と同様に、発芽したコムギ種
子又はオオムギ麦芽から得たプルラナーゼ抽出物は、低い活性を示し、かつDTT と一緒の20〜30分のプレインキュベーションによって、3〜5倍活性化された。し
かし、粗抽出物（硫酸アンモニウム30〜60％分画の透析物）の陰イオン又は陽イ
オン交換クロマトグラフィーによる精製後、総プルラナーゼ活性は、DTTと一緒 にプレインキュベーションせず、アッセイした場合のカラムに載せた試料の値よ
りも2〜3倍増大し、DTTはプルラナーゼに対し全く、又はほとんど作用を有さな い。
【０１３４】 ひとつの可能性は、発芽されたコムギ種子又はオオムギ麦芽は高いプロテアーゼ
活性を示すので、プルラナーゼは精製工程のタンパク質分解によって活性化され
たかもしれないということである。これが該当する場合、プロテアーゼインヒビ
ター混合物の添加は、精製時のプルラナーゼの活性化を阻害するであろう。これ
とは対照的に、プロテアーゼインヒビターを使う多くの実験が、これを証明する
ことに失敗している。別の可能性は、硫酸アンモニウムにより沈殿し、プルラナ
ーゼを阻害するようなインヒビターが存在するということであった。DTTの役割 は、還元することであり、その結果このプロテインインヒビターを失活し、プル
ラナーゼの活性化をもたらす。これに沿って、オオムギ麦芽から得た硫酸アンモ
ニウムの30〜60％分画を、20mM Tris-HCl（pH7.5）で平衡化したDE52カラム（2.
5×26cm）に載せた。塩の直線勾配で溶離した後、「脱阻害された」（「活性化 された」）プルラナーゼを、約325mM NaClで溶出したタンパク質ピーク（分画番
号44〜60）として同定した。プルラナーゼ活性がピークの分画（分画番号45）50
μlを他のタンパク質分画50μlと共に含有するプレインキュベーション混合物中
のプルラナーゼ活性のアッセイは、プルラナーゼ阻害活性を示すタンパク質ピー
クが、分画番号8〜25の間で、約100mM NaClによりDE52カラムから溶離されたこ とを示した。
【０１３５】 更にプルラナーゼインヒビター試料は、pH4.6及び4.0でのCM32を用いる２個の連
続する陽イオン交換クロマトグラフィー工程、及びセファデックスG-75によるろ
過により精製した。
【０１３６】プルラナーゼインヒビターの特性 予備実験は、プルラナーゼインヒビタータンパク質が、70℃で10分間pH4.0での 処理に対し抵抗性であること示した。セファデックスG-75ゲルろ過及びSDS-PAGE
のプロフィールを基に、プルラナーゼインヒビターは、分子量8〜15kDa±2kDaを
有している。更にこの研究は、このタンパク質がチオレドキシンで還元可能な結
合（S-S）を有することを示した。
【０１３７】 これらの研究は、表XVに示したように、遍在するジチオールタンパク質であるチ
オレドキシンが、オオムギ及びコムギの胚乳のプルラナーゼを阻害するこれまで
は不明であったジスルフィド−含有タンパク質の特異的還元剤として利用される
ことがわかった。
【０１３８】表15. NADP／チオレドキシンシステムによって還元された後のプルラナーゼイン ヒビタータンパク質の活性の変化 処理 相対プルラナーゼ活性 インヒビターなし 100 インヒビター 酸化型 30.1 DTTによる還元型 46.1 大腸菌Trx/DTTによる還元型 95.1 大腸菌NTSによる還元型 40.4 GSH／NADPH／GRによる還元型 33.6
【０１３９】 インヒビタータンパク質の還元は、そのプルラナーゼを阻害する能力を排除し、
これによりプルラナーゼ酵素が活性化される。これらの研究は、表XVに示したよ
うに、NADPH、NADP-チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及びチオレドキシン（NAD
P／チオレドキシンシステム）からなる生理システムにより、更にはチオレドキ シン(Trx)及びジチオスレイトールにより、プルラナーゼ酵素を活性化すること が可能であることを例証している。これらの知見は、更に、プルラナーゼの還元
的活性化がどのようにして生じるか（すなわち、特異的（これまでは不明であっ
た）インヒビターが還元され、これによって失活され、結果的に該酵素が活性化
される）を説明している。この反応において活性のあるチオレドキシンは、大腸
菌又は種子の胚乳（チオレドキシンh）のようないくつかの供給源から得ること ができる。インヒビタータンパク質の還元的失活(I)及びプルラナーゼ酵素の脱 阻害(II)におけるチオレドキシンの役割を、式１及び２において示した。 (I)チオレドキシン酸化＋NADPH→（NTR）→チオレドキシン還元＋NADP (II)チオレドキシン酸化＋[E失活：I酸化]→チオレドキシン酸化＋E活性＋I還元
【０１４０】 要約すると、粗胚乳抽出物を、カラムクロマトグラフィー法により分画した。こ
れらの工程は、プルラナーゼ酵素からプロテインインヒビターを分離するために
利用される。次にいくつかの工程によりインヒビタータンパク質の純度を高めた
。mBBr／SDS-PAGE法を使用し、この新規タンパク質のジスルフィド基（複数）が
、チオレドキシンによって特異的に還元されたこと、及び還元されたタンパク質
は、プルラナーゼを阻害する活性を喪失したことを決定した。種子の特定の他の
ジスルフィドタンパク質（例えばダイズのクニツ及びボーマン・バークトリプシ
ンインヒビター）のように、プルラナーゼインヒビタータンパク質は、葉緑体NA
DP-リンゴ酸デヒドロゲナーゼを活性化する能力を示した。これらの実験におい て、ジチオスレイトールを用いて、チオレドキシンを還元し、これは次にインヒ
ビターを還元し、これによりデヒドロゲナーゼ酵素が活性化された。
【０１４１】実施例22 チオレドキシン及びNADP-チオレドキシンレダクターゼを過剰発現するための酵 母細胞の操作 2種のサッカロミセス・セレビシアエのチオレドキシン遺伝子（Muller, E.G.D. 、J. Biol. Chem.、266:9194-9202(1991)）であるTRX1及びTRX2を、例えばYEp24
のような、高コピー数のエピソームベクターに、例えばグリセルアルデヒド-3- リン酸-デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ又はホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子 などの解糖系プロモーターのような、強力な構成的プロモーターエレメントの制
御下でクローニングした。組換え構築物を、抗チオレドキシン−ウサギ抗血清を
用いる定量的ウェスタンブロット法により、チオレドキシンの過剰発現について
評価し（Muller, E.G.D.、J. Biol. Chem.、264:4008-4014(1989)）、チオレド キシン遺伝子及びプロモーターエレメントの最良の組合せを選択した。最良のチ
オレドキシンの過剰発現システムを伴う細胞を、ドウ改良のためのチオレドキシ
ン供給源として用いた。
【０１４２】 NADP-チオレドキシンレダクターゼ遺伝子を、そのアミノ末端配列から推定され たオリゴヌクレオチドプローブを調製し、クローニングした。ホウレンソウの葉
について説明された方法の変法を用いて、該酵素を酵母細胞から調製した（Flor
encio, F. J.ら、Arch. Biochem. Biophys.、266:496-507(1988)）。純粋なレダ
クターゼ酵素のアミノ末端を、アプライド・バイオシステムズ社の気相式タンパ
ク質シークエンサーを用い、自動化されたExaman分解による微量配列決定により
決定した。この配列を基に、かつ酵母において使用したコドンを用いて、20-塩 基の24-ボールド(bold)変性DNAプローブを調製した。このプローブをハイブリダ
イズし、サザンブロット分析により、EcoRI及びPstIによって切断された酵母DNA
を単離した。最大活性領域を、アガロースゲルから取り出し、pUC19プラスミド ベクターに挿入した（Szekeres, M.ら、J. Bacteriol.、173:1821-1823(1991)）
。形質転換後、プラスミド含有大腸菌コロニーを、標識したオリゴヌクレオチド
プローブを使用するコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした
（Vogeli, G.ら、Methods Enzymol.、152:407-415(1987)）。このクローンを、 前述のSzekeresらの論文に従ってDNAを配列決定することにより、NADP-チオレド
キシンレダクターゼの遺伝子を保持することを確定した。一旦同定したNADP-チ オレドキシンレダクターゼ遺伝子は、TRX1及びTRX2酵母チオレドキシン遺伝子に
ついて、前述のように酵母において過剰発現した。NADP-チオレドキシンレダク ターゼを過剰発現する酵母細胞をレダクターゼ供給源として用いて、ドウの品質
を改善した。
【０１４３】 実施例２３：遺伝子操作酵母細胞を用いたドウの品質改善 実施例２３の説明にしたがい２つの酵母チオレドキシンおよび酵母ＮＡＤＰ−
チオレドキシンレダクターゼを過剰発現させるために操作したビール酵母菌（Sa
ccharomyces cerevisiae）細胞を、既に確立された方法（例えば超音波処理）に
よって溶解し、続いて凍結乾燥させる。チオレドキシンおよびＮＡＤＰ−チオレ
ドキシンレダクターゼを過剰発現している培養から得た乾燥細胞をまとめて、粉
の補充に用いてドウの品質を改善する。ひとまとめにした溶解乾燥細胞の２／１
０グラムを約３００から約５００ナノモルのＮＡＤＰＨと合わせて、３０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ５．２５ｍｌを得るために１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７
．９）に加える。反応は、実施例１４で述べたように３０℃でミクロファリノグ
ラフで実施する。実施例１４で示された改善と同様なドウの品質改善が観察され
る。
【０１４４】 実施例２４：グルテンの改善 ドウの品質に対するＮＡＤＰ／チオレドキシンのプラスの効果は、グルテン調
製でこの系を用いる選択の自由を与える。この目的は、グルテンの収量および特
性を変化させ、したがって、（１）より強力なグルテンを得ることによって（弾
性の増加、展延性の改善）；（２）ＮＡＤＰ−チオレドキシン系よって還元され
た可溶性蛋白質を蛋白質ネットワーク内に捕捉し、それによってそれら可溶性蛋
白質がグルテン生成中に流出するのを防止することによってその技術的価値を高
める。この方法（１０ｇの粉を用いる）では、０．２μｇの大腸菌チオレドキシ
ン、０．１μｇの大腸菌ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼおよび３００か
ら５００ナノモルのＮＡＤＰＨを、５．２５ｍｌの３０ｍＭトリス−ＨＣｌを生
成するために１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）に一緒に添加する。グ
ルテンは、通常の浸出法にしたがって室温で製造する。グルテンの収量は重量で
決定され、グルテンの強度は古典的なマニュアルストレッチ法によって決定され
る。ＮＡＤＰ／チオレドキシン系を用いるこの処置によって得られるグルテン生
成物は、粉または他の穀粒の添加物として用いられる。
【０１４５】 実施例２５：非コムギまたはライムギ粉からドウを製造する方法 このテスト（トウモロコシ、コメまたはモロコシに由来する製粉１０ｇを用い
る）の場合、０．２μｇの大腸菌チオレドキシン、０．１μｇの大腸菌ＮＡＤＰ
−チオレドキシンレダクターゼおよび５００ナノモルのＮＡＤＰＨを、５．２５
ｍｌの３０ｍＭトリス−ＨＣｌを生成するために１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ７．９）に一緒に添加する。反応は、ミクロファリノグラフを用いて３０℃
で１０ｇの製粉をこの酵素系と混合することによって実施する。ファリノグラフ
の測定では、添加したＮＡＤＰ−チオレドキシン系によってコムギ様のドウ特性
が示された。酵素系を含まないコントロールでは、混合によってドウが生成され
なかったので、ミクロファリノグラフの読みは検出されなかった。形成されたド
ウは永続性で、その粘稠性は操作中維持される。最終生成物は、コムギに由来す
るドウで形成されたネットワークと類似している。
【０１４６】 動物毒素の還元 本発明は、ハチ、サソリおよびヘビ毒に含まれる毒性惹起蛋白質を化学的に還
元し、それによってこれらの毒の生物学的活性を変化させるとともに、チオール
レドックス（ＳＨ）剤の手段、すなわち還元チオレドキシン、チオレドキシンま
たはＤＴＴの存在下の還元リポ酸によって動物性毒素、特にヘビの神経毒の毒性
を減少させる方法を提供する。チオレドキシンの還元は、好ましくはＮＡＤＰ−
チオレドキシン系（ＮＴＳ）を介して生じる。先に述べたように、ＮＴＳは、Ｎ
ＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）およびチオレドキ
シンを含む。" チオールレドックス剤"という用語は、非還元状態の薬剤および 還元状態またはスルフヒドリル（ＳＨ）状態の薬剤の両方を指すために文献では
時に用いられてきた。本明細書で規定されるように、" チオールレドックス（Ｓ
Ｈ）剤"という用語は、還元チオールレドックス蛋白質または合成剤（例えばＤ ＴＴ）を意味する。
【０１４７】 神経毒の還元は、液体である媒体、例えば血液、リンパ液もしくは緩衝液など
で、または、個体である媒体、例えば細胞もしくは他の生体組織で生じるであろ
う。本明細書で用いられるように、" 液体"という用語単独では個体に存在する 生物学的液体を意味しない。 チオールレドックス剤が動物毒をin vitroで不活化し、さらに個体で毒性を失
わせる性能は、本発明の薬剤が、これら毒性惹起動物毒の成分中の分子内ジスル
フィド結合を還元する能力におそらく左右される。 全てのヘビの神経毒（シナプス前作用性およびシナプス後作用性の両者）が還
元され、さらに本発明のチオールレドックス（ＳＨ）剤によって少なくとも部分
的にin vitroで不活化される。本発明にしたがってin vitroで不活化されたヘビ
神経毒は抗毒素の製造で抗原として有用である。神経毒素は、好ましくは適切な
緩衝液中でチオールレドックス（ＳＨ）剤と保温することにより不活化される。
好ましい緩衝液はトリス−ＨＣｌ緩衝液であるが、他の緩衝液（例えばリン酸緩
衝液）も用いることができる。好ましいチオールレドックス（ＳＨ）剤は還元チ
オレドキシンである。
【０１４８】 ヘビ神経毒を不活化するために有効な量は、１００μｌ中のヘビ神経毒１０μ
ｇにつき、還元チオレドキシンは約０．１μｇから５．０μｇ、好ましくは約０
．５μｇから１．０μｇ；約１．０μｇのチオレドキシンの存在下で還元リポ酸
は約１ナノモルから２０ナノモル、好ましくは５ナノモルから１５ナノモル；還
元ＤＴＴは（好ましくは約１．０μｇのチオレドキシンの存在下で）約１０ナノ
モルから２００ナノモル、好ましくは５０ナノモルから１００ナノモルである。 ＮＡＤＰ−チオレドキシン系の成分を用いてヘビ神経毒を不活化する場合に有
効な量は、１００μｌ中のヘビ神経毒１０μｇにつき、チオレドキシンは約０．
１μｇから５．０μｇ、好ましくは約０．５μｇから１．０μｇ；ＮＴＲは約０
．１μｇから２．０μｇ、好ましくは０．２μｇから１．０μｇ；ＮＡＤＰＨは
約０．０５マイクロモルから０．５マイクロモル、好ましくは約０．１マイクロ
モルから０．２５マイクロモルの範囲である。
【０１４９】 不活化した場合、この不活化神経毒およびチオールレドックス（ＳＨ）薬剤な
どを含む緩衝液は、動物（例えばウマ）に注射して抗毒素を製造してもよいし、
また注射の前にさらに熱またはホルムアルデヒドで処理してもよい。 本発明のチオールレドックス（ＳＨ）剤はまた、有毒なヘビに咬まれて神経毒
に冒されている個体の治療に用いることもできる。還元されたチオールレドック
ス（ＳＨ）剤投与の好ましい方法は、ヘビの咬傷周辺の皮下に数回注射するもの
である。
【０１５０】 個体で神経毒を無毒化するために用いられる正確なチオールレドックス（ＳＨ
）剤の量は、もちろん咬傷から個体が実際に受けた神経毒の量に左右される。し
かしながら、ネズミでヘビの神経毒の毒性を無毒化または減少させるために有効
な量は、マウスの体重１グラムにつき還元チオレドキシンで約０．０１μｇから
０．３μｇ、好ましくは約０．０２μｇから０．０５μｇ；約０．０５μｇのチ
オレドキシンの存在下で還元リポ酸で約０．１ナノモルから３．０ナノモル、好
ましくは０．２ナノモルから１．０ナノモル；好ましく約０．０５μｇのチオレ
ドキシンの存在下でＤＴＴで約１．０ナノモルから３０ナノモル、好ましくは２
．０ナノモルから５．０ナノモルである。 ＮＡＤＰ−チオレドキシン系の成分を用いてネズミでヘビの神経毒を無毒化す
るために有効な量は、ネズミの体重１グラムにつき、チオレドキシンで約０．０
１μｇから０．３μｇ、好ましくは約０．０２μｇから０．０５μｇ；ＮＴＲで
約０．００５μｇから０．１２μｇ、好ましくは０．０１μｇから０．０２５μ
ｇ；ＮＡＤＰＨで約５ナノモルから３０ナノモル、好ましくは約１０ナノモルか
ら１５ナノモルの範囲である。
【０１５１】 ＮＴＳを個体に投与する好ましい方法はまた複数回の皮下注射による。人で使
用する場合に好ましいチオールレドックスは、ＮＡＤＰチオレドキシン系を介し
て、またはリポ酸もしくはＤＴＴとともに投与されるヒトのチオレドキシンであ
る。 神経毒を産生し、本発明の方法で不活化または無毒化できる有毒なヘビの部分
的なリストは文献に記載されている（J.-P. Chippaur et al.(1991), "Reptile
Venoms and Toxins"(A.T. Tu, ed.), Marcel Dekker, Inc.(pp.529-555）、この
文献は参照により本明細書に含まれる）。 動物毒を不活化または無毒化することに関する本発明の他の特徴および利点は
以下の実施例で確認できる。
【０１５２】 実施例２６：ハチ、サソリおよびヘビ毒の還元実験およびｍＢＢｒによる標識 反応は、以下のプロテアーゼインヒビターを含む３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．９）中の５０μｇ動物毒（最終容積１００μｌ）で実施した：フ
ェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチンおよびペプス
タチン（アッセイに用いた最終濃度はそれぞれ１００μＭ、１μＭおよび１μＭ
）。還元剤としてＮＡＤＰＨとともに、本混合物はまた４μｇのチオレドキシン
、３．５μｇのＮＴＲ（ともに大腸菌由来）および１２．５ｍＭのＮＡＤＰＨを
含んでいた。チオレドキシン（４μｇ、大腸菌またはヒト）がＤＴＴによって還
元される場合、ＮＡＤＰＨおよびＮＴＲを省略し、ＤＴＴを０．５ｍＭの濃度に
添加した。最終濃度５ｍＭおよび１．５μｇのグルタチオンレダクターゼおよび
１２．５ｍＭのＮＡＤＰＨの存在下で実施した点を除き、ＧＳＨによるアッセイ
を同様に実施した。混合物は室温で２０分保温し、続いてｍＢＢｒを１．５ｍＭ
の濃度に添加し、反応を室温で１５分継続させた。反応を停止させ、１００ｍＭ
のβ−メルカプトエタノール１０μｌ、２０％ＳＤＳ５μｌおよび５０％グリセ
ロール１０μｌを添加して過剰のｍＢＢｒを誘導した。続いて、先に述べたよう
にサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１５３】 ＮＡＤＰ−チオレドキシンによる同じ実験をプロテアーゼインヒビターを添加
せずに実施した。 種々の還元剤を用い、プロテアーゼインヒビターの存在下で室温で２０分保温
した後、サンプルをｍＢＢｒで誘導し、電気泳動で分離し蛍光を分析した。全て
の事例でチオレドキシン（大腸菌またはヒト）は特異的に動物毒の成分を還元す
ることが示された。このゲルはまた、チオレドキシンは、反応がプロテアーゼイ
ンヒビターの非存在下で実施されるとき同様な態様で動物毒の成分を還元するこ
とを示した。
【０１５４】 プロテアーゼインヒビターの存在下および非存在下でのハチ、サソリおよびヘ
ビ毒のＮＡＤＰ−チオレドキシン系による還元もまた、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲルｎＢＢｒ工程を用いて示された。任意のインヒビターの存在下または非
存在下でＮＴＳを用い室温で２０分保温した後、電気泳動によって分離し、さら
に蛍光を先に述べたように調べた。 材料： 動物毒：Apis melliferaのハチ毒、Androctonus australisのサソリ毒、およ びBungarus multicinctusのヘビ毒をシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.)(S
t Louis, MO）から購入した。 プロテアーゼインヒビター：フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）、ロイペプチンおよびペプスタチンはシグマケミカル社（St. Louis, MO)か
ら購入した。
【０１５５】 動物毒の無毒化 ハチ、サソリおよびヘビ毒の無毒化はマウスの皮下に注射して決定する。アッ
セイは３組で実施する。注射の前に、動物毒をリン酸緩衝食塩水（１０ｍＭのＮ
ａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）中の０．１５ＭＮａＣｌ）で以下のＬ
Ｄ50（マウス１グラム当たり）の２倍の濃度に希釈する：Apis melliferaのハチ
毒、２．８μｇ；Androctonus australisのサソリ毒、０．３２μｇ；およびBun
garus multicinctusのヘビ毒、０．１６μｇ。注射後、５、１０、３０、６０分
後、および４、１２、２４時間後、チャレンジマウスの個々の群に（１）静脈内
、および（２）皮下（最初の注射部位の周囲の複数の箇所に注射）に注射した。
チオレドキシンは以下により還元する：（１）大腸菌ＮＡＤＰ−チオレドキシン
系（０．０８μｇのチオレドキシン、０．０７μｇのＮＴＲおよび２５ナノモル
のＮＡＤＰＨを用いる）；（２）ＤＴＴまたは還元リポ酸によって還元されたチ
オレドキシン（０．０８μｇの大腸菌またはヒトチオレドキシンを１ナノモルの
ジチオスレイトールまたは１ナノモルの還元リポ酸に添加）。濃度は動物に注射
された動物毒１μｇ当たりのものである。全ての溶液はリン酸緩衝食塩水で調製
される。 無毒化に対するチオレドキシンの効果は、（１）チオレドキシンをもたないコ
ントロール群とＬＤ50を比較し、さらに（２）壊死、腫脹および対象の動物の一
般的不快から明らかな局所反応の程度を追跡することによって決定される。
【０１５６】 ヘビ神経毒を還元する還元実験−材料と方法 毒素： ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ2、エラブトキシンｂおよびβ−ブンガロトキシン はシグマケミカル社（St. Louis, MO)から購入した。ホスホリパーゼＡ2は３． ２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4溶液（ｐＨ５．５）として提供されたので、この蛋白質 をセントリコン３ＫＤａカットオフ膜を用いて３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．９）で透析した。α−ブンガロトキシンおよびα−ブンガロトキシン
125Ｉはシャラ＝バロール博士（Dr. Shalla Verrall）から分与された。
【０１５７】 試薬および精製化学物質： ＤＬ−α−リポ酸、ダイズのＬ−α−ホスファチジルコリン、ＮＡＤＰＨおよ
びβ−メルカプトエタノールはシグマケミカル社（St. Louis, MO)から購入し、
モノブロモバイメイン（ｍＢＢｒ、商標名チオライト）はカルビオケム社（Calb
iochem)(San Diego, CA)から購入した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動用試薬はバイオラド＝ラボラトリーズ（Bio-Rad
Laboratories)(Richmond, CA）から購入した。
【０１５８】 蛋白質および酵素： 文献(Jiano et al.(1992), Ag. Food Chem. 印刷中）の記載にしたがってチオ
レドキシンおよびＮＴＲは大腸菌から精製した。チオレドキシンｈはコムギの胚
芽から精製し（F.J. Florencio et al.(1988), Arch. Biochem. Biophys. 266:4
96-507）、チオレドキシンｆおよびｍはホウレンソウの葉から精製した（F.J. F
lorencio et al.,上掲書）。ヒトのチオレドキシンはエマヌエル＝ウォールマン
博士（Dr. Emanuelle Wollman)から分与された。ＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲ
ナーゼはトウモロコシの葉から精製し（J.-P.Jacqot et al.(1981), Plant Phys
iol. 68:300-304)、グルタチオンレダクターゼはホウレンソウの葉から精製した
(F.J. Florencio et al.上掲書）。大腸菌グルタレドキシンはＡ．ホームグレン
教授（Prof. A. Holmgren)から分与された。
【０１５９】 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動： ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、１．５ｍｍの厚さの１０−２０
％の濃度勾配ゲルで実施した。電気泳動は、４０ｍＡの定常電流で３時間展開し
た。電気泳動の後、ゲルを１２％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸に２時間浸漬し、
続いて４０％メタノールと１０％酢酸を含む溶液に移し、１２時間過剰なｍＢＢ
ｒを除去した。蛋白質結合ｍＢＢｒの蛍光は、紫外線光源（３６５ｎｍ）を取り
つけたライトボックスにゲルを静置して決定した。黄色ラッテン（Wratten)ゼラ
チンフィルター８号（カットオフ＝４６０ｎｍ）を通してポラロイド陽画／陰画
ランドフィルム（５５型）でゲルの写真を撮影した（ｆ４．５で露出時間４０秒
）。０．１２５％（ｗ／ｖ）のクマシーブルーＲ−２５０溶液（１０％酢酸およ
び４０％、メタノール中）でゲルを１時間蛋白染色した。クーマシーブルーを除
いた同じ溶液中でゲルを脱色した。 蛍光ゲルおよび乾燥染色ゲルのポラロイド陰画をレーザーデンシトメーター（
Pharmacia LKB Ultroscan XL）で走査した。ゲルスキャンＸＬソフトを用いて面
積またはピークの高さを検定してバンドを定量した。
【０１６０】 実施例２７：毒素の還元とｍＢＢｒによる標識 反応は、最終容積１００μｌの３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９
）中の標的毒素１０μｇ、０．８μｇのチオレドキシン、０．７μｇのＮＴＲ（
ともに大腸菌由来）および２．５ｍＭのＮＡＤＰＨを用いて実施した。チオレド
キシンをＤＴＴで還元する場合、ＮＡＤＰＨおよびＮＴＲは省略し、ＤＴＴを０
．５ｍＭの濃度に添加した。最終濃度が１ｍＭである点を除き、ＧＳＨによるア
ッセイは同様に実施した。グルタレドキシンによる還元の場合、チオレドキシン
およびＮＴＲは、１μｇの大腸菌グルタレドキシン、０．３８μｇグルタチオン
レダクターゼ（ホウレンソウの葉から部分精製）、１ｍＭのＧＳＨおよび２．５
ｍＭのＮＡＤＰＨに置き換えた（これら４つの成分の組み合わせはＮＡＤＰＨ／
グルタレドキシン系と称する）。リポ酸の還元形による還元は、単独および０．
８μｇのチオレドキシンと合わせて、１００μｌの容積中で２つの濃度、１００
μＭおよび２００μＭで実施した。エラブトキシンｂおよびα−ブンガロトキシ
ンの場合は３７℃で２時間、β−ブンガロトキシンの場合は室温で１時間、さら
にホスホリパーゼＡ2の場合には室温で２０分混合物を保温した。保温後、ｍＢ Ｂｒを１．５ｍＭに添加し、さらに反応を１５分室温で継続させた。反応を停止
させ、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノールを１０μｌ、２０％ＳＤＳを５μ
ｌ、および５０％グリセロールを１０μｌ添加して過剰のｍＢＢｒを導入した。
続いてサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。
【０１６１】 完全な毒素還元は２ｍＭのＤＴＴ中でサンプルを煮沸することによって達成し
た。冷却後、サンプルをｍＢＢｒで標識し、前述のように処置したが、ただし全
てのサンプルはゲルに添加する前に再度２分間煮沸した。ジチオスレイトール（
ＤＴＴ）並びにチオレドキシンおよびリポ酸の還元形は、２−メルカプトエタノ
ールおよびグルタチオンのようなモノチオール還元剤と異なりジチオール還元剤
である。ＤＴＴは合成によって製造される化学物質であるが、一方、チオレドキ
シンおよびリポ酸は細胞内に存在する。エラブトキシンｂは、ＮＴＳ、ＤＴＴお
よびチオレドキシン並びに還元リポ酸およびチオレドキシンによって顕著に還元
される。エラブトキシンｂとともに、リポ酸は、ジチオスレイトールよりも特異
的な還元剤であることが示された。ジチオスレイトールはチオレドキシンの非存
在下で部分的に毒素を還元し、一方、還元リポ酸は毒素を還元しなかった（レー
ン８）。この結果はまた、ＮＴＳまたはＤＴＴ＋チオレドキシンは、α−ブンガ
ロトキシンおよびβ−ブンガロトキシンの特異的還元剤であることを示した。
【０１６２】 実施例２８：ＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼの活性化 葉緑体のＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼを活性化するヘビ毒素の能力は
、以下のチオレドキシンの限定濃度（チオレドキシンによる酵素の活性化を限定
するため）で５μｇの毒素を予備保温することによって調べた：大腸菌チオレド
キシン、０．２５μｇ；ヒト、０．９μｇ；コムギ、１．１５μｇ；ホウレンソ
ウｆおよびｍ、それぞれ０．３７５および０．１２５μｇ。精製ＮＡＤＰ−マレ
ートデヒドロゲナーゼ、１．４μｇを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９
）、表示のチオレドキシン、および１０ｍＭのＤＴＴを含む溶液（最終容積０．
２ｍｌ）に加えた。２５分後、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）（０．
７９ｍｌ）を含む１ｍｌ容量の１ｃｍキュベットに１６０μｌの予備保温混合物
を注入した。５０ｍＭのオキサル酢酸５０μｌを添加して反応を開始させた。Ｎ
ＡＤＰＨ酸化は、３４０ｎｍの吸収の変化を４通りのチャンネルチェンジャーを
搭載したベックマン分光光度計を用いてモニターして追跡した。この実験の結果
は、様々に還元したチオレドキシンによるエラブトキシンｂの還元は、ＮＡＤＰ
−マレートデヒドロゲナーゼを活性化するこの毒素の生物学的能力を顕著に変化
させることを示した。この結果は、効果に差は有るけれども、調べた全てのチオ
レドキシンはこの毒素作用の制限にある程度効果があることを示した。
【０１６３】 実施例２９：エラブトキシンｂの蛋白分解アッセイ エラブトキシンｂの１０μｇを３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９
）（総容積１００μｌ）と３７℃で２時間保温した。表示のように、この緩衝液
には０．８μｇのチオレドキシン、０．７μｇのＮＴＲおよび２．５ｍＭＮＡＤ
ＰＨを補充した。チオレドキシンがＤＴＴで還元されるとき、ＮＴＲおよびＮＡ
ＤＰＨは省略し、ＤＴＴを０．５ｍＭの濃度に添加した。保温に続いて、サンプ
ルを０．４および２μｇのトリプシンで３７℃で１０分消化した。ＤＴＴ（５０
ｍＭ溶液４．８μｌ）、２０％ＳＤＳを５μｌおよび５０％グリセロールを１０
μｌを添加し、サンプルを３分煮沸し、続いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
に付した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、蛋白質のバンドを上記のようにデ
ンシトメーターで走査して定量した。アッセイの結果を下記の表ＸＶＩに示す。
これらの結果は、ヘビ神経毒（エラブトキシンｂ）の還元はこの毒素を蛋白質分
解に対していっそう感受性にすることを示している。この結論を拡大解釈すれば
、解毒剤として還元チオレドキシンの投与は、動物毒のプロテアーゼによる蛋白
分解性不活化の増進によって毒素の破壊が促進されるであろう。
【０１６４】 表ＸＶ１ エラブトキシンｂの酸化形および還元形のトリプシンに対する感受性 消化されたエラブトキシンｂの％ 処置 ０．４μｇトリプシン ２μｇのトリプシン コントロール ０．０ ３４．１ 還元、ＮＴＳ ２１．１ ５７．８ 還元、ＤＴＴ ３．１ ４０．６ 還元、ＤＴＴ＋Ｔｒｘ ２８．０ ７１．８ エラブトキシンｂ（１０μｇ）を３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）
中で以下のように３７℃で２時間予備保温した：" コントロール"、無添加；" 大腸菌ＮＡＤＰ／チオレドキシン系（ＮＴＳ）による還元"、チオレドキシン、 ＮＴＲおよびＮＡＤＰＨ；" ＤＴＴによる還元"、ＤＴＴ；ＤＴＴ＋チオレドキ シンによる還元"、大腸菌チオレドキシンを補充したＤＴＴ。予備保温に続いて 、０．４μｇおよび２μｇのトリプシンを表示のように添加し、さらにＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１６５】 実施例３０：ホスホリパーゼＡ2アッセイ β−ブンガロトキシンのホスホリパーゼＡ2成分の酸化形および還元形の活性 を、文献（Lobo de Araujo et al.(1987), Toxicon 25:1181-1188)の記載にした
がい分光光度計で酸性度の変化を追跡して決定した。還元実験の場合は、０．８
μｇチオレドキシン、０．７μｇＮＴＲおよび７ｍＭのＮＡＤＰＨを含む３０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）（最終容積３５μｌ）中で１０μｇの毒
素を保温した。室温で１時間保温した後、１０ｍＭのＣａＣｌ2、１００ｍＭの ＮａＣｌ、４ｍＭのナトリウムコレート、１７５μＭのダイズホスファチジルコ
リンおよび５５μＭのフェノールレッドを含むアッセイ溶液（ｐＨ７．６に調整
）１ｍｌを含む１ｃｍのキュベットに２０μｌの反応混合物を添加した。ベック
マンＤｕモデル２４００分光光度計で５５８ｎｍの吸収の変化を測定して反応を
追跡した。実験の結果は、β−ブンガロトキシンはチオレドキシンによって還元
されたときそのホスホリパーゼ活性の大半を失うことを示した。これらの結果は
、ヘビに咬まれた後還元チオレドキシンを投与することは、ホスホリパーゼＡ2 活性を除去することによってこの毒素の無毒化を促進するであろうという結論と
一致する。
【０１６６】 実施例３１：α−ブンガロトキシンのアセチルコリンレセプターへの結合 α−ブンガロトキシン結合を培養マウス細胞を用いて放射能標識毒素によって
分析した（Y. Gu et al.(1985), J. Neurosci. 5:1909-1916）。マウス細胞（Ｃ 2 系）を文献(Y. Gu et al. 上掲書）の記載にしたがって増殖させ、２４穴（ウ ェル）プラスチック製組織培養プレート（Falcon）で約３０００細胞／ウェルの
密度で平板培養した。増殖培養液を４８時間後に融合培養液と交換し、９６時間
後に再び交換した。さらに２日増殖させた後で培養をアッセイに用いた。
【０１６７】 α−ブンガロトキシンの結合は３つの異なる処置を施した細胞を用いて決定し
た：〔Ａ〕リン酸緩衝食塩水（１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4中の０．
１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１００μｌ中で３７℃で２時間、１０ｎＭのα
−ブンガロトキシン125Ｉ（２６２Ｃｉ／mmole)を、４μｇのチオレドキシン、 ３．５μｇのＮＴＲ（ともに大腸菌由来）および６．２５ｍＭのＮＡＤＰＨと予
備保温した。２時間保温した後、混合物をマウスの細胞を含むウェルに移し、リ
ン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、さらに３７℃で２時間保温した。
【０１６８】 〔Ｂ〕細胞をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した後、ウェル当たり１０ｎＭのα
−ブンガロトキシン125Ｉ（２００μｌのリン酸緩衝食塩水中）を添加した。３ ７℃で２時間保温した後、細胞をリン酸緩衝食塩水で再度洗浄して未結合毒素を
除いた。表示のように、０．６８ｍＭのＣａＣｌ2、０．４９ｍＭのＭｇＣｌ2、
４μｇチオレドキシン、３．５μｇＮＴＲおよび６．２５ｍＭのＮＡＤＰＨを補
充した２００μｌのリン酸緩衝食塩水をウェルに添加した。このプレートを３７
℃で２時間保温した。ＮＴＲおよびＮＡＤＰＨはＤＴＴを用いる処理からは省略
し、ＤＴＴは１．２５ｍＭの濃度で添加した。
【０１６９】 〔Ｃ〕細胞を２回リン酸緩衝食塩水で洗浄し、４μｇのチオレドキシン、３．
５μｇのＮＴＲおよび６．２５ｍＭのＮＡＤＰＨを含む溶液２００μｌを各ウェ
ルに添加した。いくつかの事例では、ＮＴＲおよびＮＡＤＰＨは１．２５ｍＭの
ＤＴＴと置き換えた。このプレートを３７℃で２時間保温した。続いて細胞をリ
ン酸緩衝食塩水で２回洗浄して添加した還元剤を除去した。０．６８ｍＭのＣａ
Ｃｌ2および０．４９ｍＭのＭｇＣｌ2および１０ｎＭのα−ブンガロトキシン12 5 Ｉを含むリン酸緩衝食塩水２００μｌを各ウェルに添加した。３７℃２時間保 温を続けた。このアッセイの結果は表ＸＶＩＩに示す。この実験は、チオレドキ
シンによって還元したとき、β−ブンガロトキシンは、もはやアセチルコリンに
結合できないことを示している。これを動物完全体に拡大解釈すれば、チオレド
キシン連関還元メカニズムは、毒素がそのレセプターに結合することを不能にし
て無毒化させるであろう。
【０１７０】 各α−ブンガロトキシン結合アッセイは３組で実施した。非特異的結合は、１
００倍過剰の非標識α−ブンガロトキシンを保温混合物に添加して測定した。保
温時間経過後、全ての事例で細胞をリン酸緩衝液で洗浄して未結合毒素を除去し
た。結合毒素の量は、０．１ＭのＮａＯＨ中で細胞を可溶化させ、ガンマ計測器
で放射能を測定して決定した。
【０１７１】 表ＸＶＩＩ マウス細胞のアセチルコリンレセプターへのα−ブンガロトキシンの結合 処置Ａ： ３７℃、２時間 ３７℃、２時間 毒素＋還元剤−−−−−−−＞細胞−−−−−−−＞停止 還元剤無し １００．０（結合％） ＮＴＳ ０．０ ＤＴＴプラスチオレドキシン ０．０ ＮＴＳマイナスＮＴＲ ６３．０ ＮＴＳマイナスチオレドキシン ７８．０ ＮＴＳマイナスＮＡＤＰＨ １０１．０ 処置Ｂ： ３７℃、２時間 ３７℃、２時間 毒素＋細胞−−−−−−−＞細胞洗浄＋還元剤−−−−−−−＞停止 還元剤無し １００．０（結合％） ＮＴＳ ７８．０ ＤＴＴプラスチオレドキシン ７６．０処置Ｃ： ３７℃、２時間 ３７℃、２時間 細胞＋還元剤−−−−−−−＞細胞洗浄＋毒素−−−−−−−＞停止 還元剤無し １００．０（結合％） ＮＴＳ ６８．７ ＤＴＴ ８５．０ ＤＴＴプラスチオレドキシン ６８．８ 大腸菌ＮＴＳ：チオレドキシン、ＮＴＲおよびＮＡＤＰＨ
【０１７２】 実施例３２：動物での解毒例 ヘビの神経毒の無毒化はマウスへの皮下注射で決定した。注射の前に、毒素を
リン酸緩衝食塩水（１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）中の
０．１５ＭのＮａＣｌ）でＬＤ50の２倍までの濃度に希釈した（ＬＤ50は投与動
物群の５０％が死亡する毒素量と規定される）。毒性試験の場合、以下の神経毒
濃度がＬＤ50（マウス当たり）に相当する：エラブトキシンｂ、０．０５μｇ−
０．１５μｇ；α−ブンガロトキシン、０．３μｇ；およびβ−ブンガロトキシ
ン、０．０８９μｇ。注射後５、１０、３０、６０分並びに４、１２および２４
時間で、チャレンジマウスのそれぞれの群に（１）静脈内、および（２）皮下に
注射した（皮下の場合には、最初の注射部位の周辺に複数の局所注射を実施した
）。チオレドキシンは以下のようにして還元した：（１）０．０８μｇのチオレ
ドキシン、０．０７μｇのＮＴＲおよび２５ナノモルのＮＡＤＰＨを用いる大腸
菌ＮＡＤＰ−チオレドキシン系；（２）チオレドキシン＋１−２ナノモルの還元
リポ酸（０．０８μｇの大腸菌チオレドキシンまたは０．２０μｇのヒトのチオ
レドキシンを用いる）；（３）５ナノモルのジチオスレイトールとともに０．０
８μｇの大腸菌チオレドキシンまたは０．２０μｇのヒトのチオレドキシンを用
いる。（濃度は動物に注射した毒素のμｇ当たりで、全ての溶液はリン酸緩衝食
塩水で調製される。）
【０１７３】 無毒化に対するチオレドキシンの効果は、（１）チオレドキシンをもたないコ
ントロール群とＬＤ50を比較するか；（２）壊死、腫脹および動物に対する一般
的不快によって明瞭な局所反応の程度を追跡するか；組織損傷のインジケーター
としてクレアチニンキナーゼの血中レベルを追跡することによって決定する。ク
レアチニンキナーゼ（これは筋肉細胞の破壊の結果として血中に遊離される）は
、シグマケミカル社（St. Louis, MO)から入手できる標準的なアッセイキットを
用いてモニターする。
【０１７４】 ヘビの咬傷の症状は複数で、多様な因子によって左右される。結果として、症
状は患者によって異なる。それにもかかわらず、チオレドキシンによる処置が人
間の場合に軽減できる共通の症状がある。特にチオレドキシン処置は、ヘビの咬
傷による神経毒性および関連する作用に付随する症状を軽減できるであろう。こ
れらには、腫脹および水腫、疼痛、並びに咬傷周辺の水疱形成の減少；正常なパ
ルス速度の回復；咬傷域の壊死の限定；影響を受ける部分の最小化が含まれる。
これらの症状を最小限にすることによって、患者の一般的状態の改善がもたらさ
れる。
【０１７５】 食物蛋白質およびアレルゲンの還元： 本発明は、主要な食物蛋白質、特に食物アレルゲン蛋白質のジスルフィド結合
を化学的に還元する方法、およびこれらの蛋白質を含む食品が摂取された場合に
生じるアレルゲン誘発性を減少または排除する方法を提供する。本発明はまた、
食物蛋白質したがって食物の消化性を向上させる方法を提供する。ジスルフィド
結合はチオレドキシンによってスルフヒドリル（ＳＨ）レベルに還元される。他
の主要な細胞性チオール還元剤、グルタチオンはこの能力では活性をもたなっか
た。これらの蛋白質は、酸化（Ｓ−Ｓ）状態ではアレルギー誘発活性を有する。
チオレドキシンで処理されたとき（ＳＨ状態）、それらはアレルギー誘発性を失
う。チオレドキシンは、酵素ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼを介してＮ
ＡＤＰＨによるか、（生理的条件）またはジチオスレイトール、合成化学還元剤
により活性化（還元）されるとき、この還元を引き起こす。
【０１７６】 還元チオレドキシンが食物によって引き起こされるアレルギー誘発性をどの程
度減少または排除できるかは、還元チオレドキシンが食物中のアレルギー誘発性
蛋白質の分子内ジスルフィド結合を還元する能力に左右される。
【０１７７】 食物をチオレドキシンで有効な時間、有効な温度で処理したとき、還元チオレ
ドキシンによって、分子内ジスルフィド結合を有する食物蛋白質が還元され、こ
れらの蛋白質を含む食物のアレルギー誘発性が少なくとも低下し、さらに消化性
を向上させることができる。食物との保温に有効な温度は約４℃から５５℃であ
るが、ジスルフィド結合の還元が可能ないずれの温度も許容される。保温に有効
な時間は約２０分から２時間であるが、重ねて言えば、食物の品質を顕著に低下
させることなくジスルフィド結合の還元が可能ないずれの時間も許容される。例
えば、これらの蛋白質はまた約４℃で約４８時間の保温によって還元され、還元
状態が維持される。 還元チオレドキシンでの処理でアレルギー誘発性が低下し、さらに消化性が向
上する食物の例は、牛肉、ミルク、ダイズ、卵、米、小麦およびナッツである。
【０１７８】 哺乳類によって摂取される食物のアレルギー誘発性を低下させ、さらに消化性
を向上させる好ましい方法は、ＮＡＤＰ−チオレドキシン系（ＮＴＳ）の成分を
用いて食物を予備処理または保温するものである。一般には、これらの成分の有
効な量は、食物中の蛋白質１．０ｍｇにつきチオレドキシンが約０．０１ｍｇか
ら４．０ｍｇ、好ましくは約０．１０ｍｇから２ｍｇ；ＮＴＲが約０．０１ｍｇ
から４．０ｍｇ、好ましくは約０．２０ｍｇから２ｍｇ；およびＮＡＤＰＨが約
１μモルから２５０μモル、好ましくは約２５μモルから１００μモルの範囲で
ある。もちろん、各成分の有効量は、他の成分の量、保温時間および温度の他に
個々の食物並びに当該食物中の内在的チオレドキシンおよびその還元剤の量にし
たがって変動するであろう。例えば、上記のチオレドキシンの量は、食物蛋白質
１グラムにつき１ｍｇのＮＴＲおよび１００μモルのＮＡＤＰＨを使用する場合
を基準に決定した。ＮＡＤＰＨの範囲は、１ｍｇのＮＴＲおよび１ｍｇのチオレ
ドキシンを使用する場合を基準に決定した。適切な成分量はまた、食物の前処理
並びに動物の種類および状態に影響される。 個々の食物のアレルギー誘発性を低下させ、さらに消化性を向上させることに
関する本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例で確認することができる。
【０１７９】実施例33 チオレドキシンによるミルク、ダイズ、コムギ及び牛肉の処理 本実施例のために、ストックの1〜5の生理的食塩水(PBS)希釈物、1:20質量/容
量(w/v)、牛乳アレルゲン抽出物(カタログ No.3390JG, Miles, Inc., Elkhart,
Ind.)、ストックの1〜10のPBS希釈物、1:10 w/v、ダイズアレルゲン抽出物(カタ
ログ No.3597ED, Miles, Inc., Elkhart, Ind.) 及びストックの1〜5のPBS希釈 物、1:10 w/v、コムギアレルゲン抽出物(カタログ No.3708ED, Miles, Inc., El
khart, Ind.)を調製した。更に、ストックの1〜5のPBS希釈物、1:10 w/v、市販 牛肉抽出物(カタログ No.3078JF, Miles, Inc., Elkhart, Ind.)を調製した。 牛乳の場合、0.1mlの希釈物を、NADP/チオレドキシン系(NTS)で処理した。前 記の系は、本例においてはアレルゲンを4.8μgのチオレドキシン、4.2μgのNTR 及び1mM NADPH (最終容積0.2ml)と共にインキュベートすることから構成されて いた。第2のサンプルを、1.5mM DTT及び4.8μgのチオレドキシン(最終容積0.2) と共にインキュベートした0.1mlの希釈ミルクアレルゲンを使用して調製した。 本実施例及び下記の実施例を含むすべてのアレルゲン研究において、使用したチ
オレドキシン及びNTRを、前記の記載と同様にして、これらのタンパク質を過剰 発現するように形質転換したE. coliから精製した(de lamotte-Guery, F.ら (19
91) Eur. J. Biochem. 196:287-294及びRussel,m. ら(1988) J. Biol. Chem. 26
3:9015-9019)。ダイズ及びコムギについて、0.05mlの希釈物を、2.4μgのチオレ
ドキシン、2.1μgのNTR及び1mM NADPHと共にインキュベートした。更に、同一の
処理をしたPBSの対照サンプルを調製した。更にDTT処理したダイズ及びコムギサ
ンプルを、1.5mM DTT及び2.4μgのチオレドキシンと共にインキュベートした別 のアレルゲン希釈物の0.05mlを使用して調製した。対照並びにすべてのダイズ及
びコムギサンプルの最終容積は0.1mlであった。ミルク及びコムギ調製物を室温 下で25分間、ダイズ抽出物を37℃で1時間25分インキュベートした。牛肉につい て、0.05mlの希釈物を2.4μgのチオレドキシン、2.1μgのNTR及び1mM NADPH (最
終容積0.1ml)と共に37℃で25分間インキュベートした。別の0.05mlのサンプルを
室温で行ったこと以外は同様に処理した。インキュベート後、1×103〜1×106又
は1×103〜1×107の1mlの希釈物を、それぞれの処理食品抽出調製物のために調 製した。希釈サンプルは30分以内に試験に使用した。
【０１８０】実施例34 mBBr蛍光標識/SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用した、NADP/チオレド キシン系による食品アレルゲンの還元及び蛋白質分解の増加の測定 方法 本実施例のために、実施例33に記載するストック牛乳、牛肉及びコムギ抽出物
のPBSを用いた1〜2.5、1〜5及び1〜1.5の希釈物をそれぞれ調製した。50μlのこ
れらの希釈物に、2.4μg チオレドキシン、2.1μg NTR及び1mM NADPH (最終容積
, 0.1ml)を添加した。対照は、50μlの特定希釈した抽出物及び50μlのPBSから 構成された。調製物を室温下で25分間、更に37℃でインキュベートした。インキ
ュベート後、8μlの80mM mBBrを添加し、反応を室温下で15分間続けた。反応を 停止させ、過剰量のmBBRを10μlの100mM β−メルカプトエタノール、10μlの20
% SDS及び10μlの50% グリセロールを添加することにより誘導体化した。サンプ
ルを、前記のmBBr/SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動技術により分析した。 結果は、室温及び37℃下において、NTSはアレルゲン抽出物中のタンパク質を効 率的に還元したことを示している。追加の研究において、実施例33に記載のダイ
ズストック抽出物のPBS希釈物をNTSで同様に処理した場合、mBBr標識/SDS-PAGE 法を使用した分析は、チオレドキシンがダイズタンパク質をも還元したことを示
している。しかしながら、ダイズ、牛乳、コムギ、卵及び牛肉のアレルゲン性タ
ンパク質をグルタチオン、グルタチオンレダクターゼ及びNADPHと共にインキュ ベートとき、処理したアレルゲン性タンパク質はわずかに還元又は全く還元され
なかったことを示している。 市販のコメアレルゲン抽出物(カタログNo.3549ED, Miles, Inc., Elkhart, In
d.)のPBS希釈物を同様にNTSと共にインキュベートし、mBBr/SDS-PAGE技術を使用
して分析したところ、還元チオレドキシンがコメアレルゲン性タンパク質を還元
したことが示された。 別の研究においては、NTSにより還元され、更にトリプシンと共にインキュベ ートした実施例33に記載の市販抽出物由来の食品アレルゲン性タンパク質は、NT
Sで処理しなかった対照よりもタンパク質分解の感受性が増加したことを観察し た。還元の分析は、mBBr/SDS-PAGE技術を使用して行った。更にこの研究におい ては、10μgのNTS還元精製ミルクアレルゲンタンパク質、β−ラクトグロブリン
(Sigma Chemical Co.)を2μgのトリプシンで処理したとき、蛋白質分解は100%で
あり、一方、同一のトリプシンで処理した酸化β−ラクトグロブリンでは50%で あった。10μgの別の精製ミルクアレルゲン、酸化β−ラクトアルブミン(Sigma
Chemical Co.)を同様に2μgのトリプシンで処理したとき、注目すべきタンパク 質分解は起こらなかった。しかしながら、NTSで還元した10μgの精製α−ラクト
アルブミンはトリプシンにより80%が還元された。更に0.8μgのチオレドキシン 及び0.5mM DTTにより還元したラクトアルブミンは、2μgのトリプシンにより100
%タンパク質分解された。
【０１８１】実施例35 卵白タンパク質の還元 乾燥ニワトリ卵白をSigma Chemical Co.より購入した。卵白の全タンパク質の
約80%がアレルゲンである。20mg/ml 卵白溶液を、PBS中で再懸濁した。すべての
物質が溶解したわけではないので、14,000 RPMで2分間遠心分離した。可溶性卵 白タンパク質を、mBBr蛍光標識及びSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動技術分
析を使用した還元の研究に使用した。使用した処理は、対照（還元剤なし）、NT
S、DTT＋チオレドキシン、還元グルタチオン(GSH)及び還元グルタチオン/グルタ
チオンレダクターゼ/NADPHであった。反応は、最終容積が100μlの20mg/ml卵白 懸濁液由来の23μlの可溶性タンパク質を用いてPBS中で行った。NTSにおいて、7
.5mM NADPH、2.4μg チオレドキシン及び2.1μg NTRを使用した。チオレドキシ ンをDTTで還元したとき、NADPH及びNTRを省略し、DTTを1.5mMまで添加した。使 用したGSH濃縮物は3mMであった。GSH/GR/NADPH系による還元のために、3mM GSH 、4μg GR及び7.5mM NADPHを使用した。混合物を室温下で1時間インキュベート した。インキュベート後、7μlの80mM mBBrを添加し、反応を室温下で15分間続 けた。反応を停止させ、過剰量のmBBRを10μlの100mM β−メルカプトエタノー ル、10μlの20% SDS及び10μlの50% グリセロールを添加することにより誘導体 化した。サンプルを、前記のmBBr/SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により 分析した。結果は、NTS及びDTT＋チオレドキシンは、約80%がアレルゲンである 卵白タンパク質の還元において非常に効果的であることを示している。GSH又はG
SH/GR/NADPHは、対照と同一の還元レベルであり、それゆえ無効な卵白タンパク 質還元剤であることを示している。
【０１８２】実施例36 アレルゲン性の研究のための動物の感作 本研究に使用した動物は、高IgE産生スパニエル犬の近交系コロニーから同腹 仔の異なるペアとして生まれたアトピー性の犬であった。 9頭の同腹仔（オス4頭、メス5頭）が、兄弟を親とする近交系応答メス犬に生 まれた。生後1日において、牛乳、ダイズ及びコメの研究のために、9頭の同腹仔
を2つのグループに分けた。5頭からなるグループ1には、0.2mlミョウバン中の実
施例33に記載の市販ダイズ抽出物1μgを右腋窩に皮下（SQ）注射し、4頭からな るグループ2には、0.2ml塩水及び0.2mlミョウバン中に可溶化した市販の乾燥牛 乳抽出物（実施例33記載）の1μgを右腋窩にSQ注射した。更に全9頭に、0.2mlミ
ョウバン中のストック1:10 w/v コメアレルゲン抽出物(カタログ No.3549ED, Mi
les, Inc. Elkhart, Ind.) の1μgを右腋窩にSQ注射した。 3、7及び11週齢において、すべての仔を、弱毒化ジステンパー−肝炎ワクチン
(Pitman-Moore, Washington's Crossing, Pa.)を肩にSQワクチン接種した。それ
ぞれのワクチン化2及び9日後、新生仔期間の間に与えたのと同一の食品抗原を与
えた。例えば、グループ1の5頭には、0.2mlミョウバン中のダイズ抽出物の1μg を与え、グループ2の4頭には、0.2mlミョウバン中の牛乳の1μgを与えた。全9頭
の仔には、0.2mlミョウバン中のコメ抽出物の1μgをそれぞれ右及び左腋窩にSQ 注射した。 125I-標識ウサギ抗イヌIgE血清(Frick, O. L.ら(1983) Am. J. Vet. Res. 44:
440-445)をRASTアッセイにおいて使用した。臭化シアン活性化ろ紙ディスクと1
00μgのダイズ、牛乳又はコメ抗原とを、標準RASTプロトコルにより反応させた(
Wide, L.ら(1967) Lancet 2:1105-1107)。非アトピー性雑種仔からの新生犬臍帯
血清を、負の対照又はベースラインcpmとして使用した。 仔を6週間授乳し、通常のPuppy Chow(Ralston-Purina Company, St. Louis,Mo
.)へと離乳した。これは、感作タンパク質、ダイズミール、乾燥乳清及びもみ殻
を含んでいた。仔には、カリフォルニア大学デーヴィス校動物資源サービス獣医
学部における獣医学的ケア及び監督下において、1日1回給餌し、水を自由に与え
た。６ヶ月後、仔に、通常のField & Farm Dog Chowを給餌した。 3及び4月齢の間において、仔が特定の食品抗原に対するIgE抗体を産生してい ることを見いだしたとき、同腹仔の9頭すべてに、二重盲検で、各240mlのダイズ
又は牛乳乳児用配合物、豆腐、粥又はバニラ風味のVivonexタンパク質加水分解 物(Norwich-Eaton Co., Norwich, Conn.)を早朝に給餌した。攻撃前及び2時間間
隔で1日中、腹部まわりを臍レベルで測定した。仔を、かゆみ又は発疹、嘔吐及 び排便の回数及び特徴の臨床的徴候並びに呼吸困難及び鼻汁について獣医技術者
により厳密に観察した。仔を前記の反応の徴候について4日間モニターした。次 の攻撃的給餌を7日後に行った。 同腹仔の9頭すべてが体重増加し、医学的問題なしに正常に発育した。仔は感 作した食品で攻撃しないかぎり下痢又はその他の胃腸管系の徴候を示さなかった
。更に皮膚又は呼吸異常は起こらなかった。ワクチン接種又は免疫化に対する有
害反応は存在しなかった。 3つの食物タンパク質に対するイヌIgE-RASTを、静脈血サンプリングとともに2
週間間隔で続けた。 有意に多量のIgE-抗食物抗体が、対照よりも、対応のミルク(p<0.05、4ヶ月時
に攻撃したとき)及びダイズ(p<0.0005、最初の3ヶ月間)で免疫した動物により産
生した。IgE-抗コメ抗体に対する平均力価は5〜10週時に上昇し、安定し、その 後20〜30週齢後に再び激しく上昇した。固形飼料中のダイズ及びミルクをそれぞ
れ給餌したダイズ及びミルク免疫動物において、統計学的に有意な下痢及び腹部
膨張反応は起こった。 牛乳、ダイズ、コムギ及び牛肉に対してアレルギー性の8頭からなる別のグル ープを、前記の方法と同様にして発育させた。前記の高IgE産生スパニエル犬の 近交系コロニーにおける別の同腹仔由来の4頭の同腹仔に、実施例33に記載のス トック牛乳、ダイズ、コムギ及び牛肉アレルゲン抽出物の1μgを右腋窩にSQ注射
した。同一の同腹仔由来の4頭の仔を対照とした。8頭すべての仔に、0.2mlミョ ウバン中のコメ抽出物の1μgを右腋窩にSQ投与した。前記と同様にして仔にワク
チン接種し、各ワクチン接種2日後及び9日後に新生仔として受けたのと同量の同
一食物抗原を与えた。前記と同様にして、適切な感作タンパク質を含む食品(す なわち、牛乳、ダイズ、牛肉及びコムギ)を同様のスケジュールで給餌した。前 記のダイズ及びミルクアレルギー性動物と同様に、免疫化したイヌは、対照より
も有意に大量のIgE抗食品抗体（コムギ及び牛肉抗体を含む）を産生した。更に 免疫化動物においては、コムギ、牛肉、ダイズ又はミルクを含む食品で攻撃した
とき、統計学的に有意な下痢及び腹部膨張反応は起こった。
【０１８３】実施例37 還元チオレドキシンで処理した食物アレルゲンにおけるアレルゲン性の低下の皮 膚試験の測定 実施例33に記載のチオレドキシン処理食物アレルゲン希釈物の各100μl希釈物
のアリコートを、実施例36に記載の適切に感作したイヌの腹部の皮膚へ皮内注射
した（例えば、牛乳感作動物には牛乳希釈物を注射した）。アレルゲン希釈物の
注射の前に、イヌの前肢静脈に、4mlの0.5%エバンスブルー色素を注射した。ア レルギー反応を示すイヌは、アレルゲン注射領域において青色の膨疹を発症した
。発症10分後、膨疹の大きさ（長さ及び幅）を測定した。膨疹の観察された大き
さ及び各アレルゲン調製物の濃度範囲の注射後の希釈限界点を、アレルゲン性の
指標として使用した。チオレドキシン処理により、ダイズの1×105希釈について
50%の保護が、ダイズの1×106希釈について完全な保護が、更に牛肉の1×105希 釈について少なくとも部分的な保護が与えられたことを見いだした（それぞれ、
図1，2、3、4及び5を参照）。
【０１８４】実施例38 還元チオレドキシンで処理した食物アレルゲンのアレルゲン性の飼育試験の測定 給餌の約1週間前に、実施例36に記載の方法で感作したイヌを、前記の実施例 に記載の市販のアレルゲン抽出物を使用して、適切な食品アレルゲンを用いて皮
膚内で皮膚試験を行った。これらの結果に基づいて、動物を「対照」グループ及
び「チオレドキシン処理」グループに分けた。各グループは、相補的な感受性に
ついての代表者、すなわち各グループについて選択された同数の強、中、弱反応
体から構成された。別言しない限り、グループは3頭から構成された（実験あた り6頭）。給餌攻撃の3日前から5日後の間、イヌをHill's Prescription Diet Ca
nine d/d diet (Hill's Division of Colgate Palmolive Co., Topeka, Kan.)に
おいて維持した。この期間中、臨床的徴候、例えば吐き気及び嘔吐について観察
した。更に、排便をモニターし、試験食品に対するアレルギー反応の指標として
点数付けした。イヌの排便は、アレルギー性食餌攻撃の3日前から3日後にカウン
トし、堅さを数で表示した。1=硬い、2=軟らかい、3=流動性。次いで、排便回数
と堅さのファクターとを乗じて排便スコアを計算した。試験する食品アレルゲン
に対するアレルギー反応の指標として、各グループ（「対照」又は「チオレドキ
シン処理」）についての1日あたりの最終の正味の平均排便スコアを、食品攻撃 後の平均排便スコアから食品攻撃前の平均排便スコアを減算することにより計算
した。1日あたりの高い正味の平均排便スコアは、強いアレルギー反応を示して いる。 食餌を調製及び投与するために使用した手順を下記に示す。別言しない限り、
反応は室温下で行った。
【０１８５】ダイズ 市販のダイズ配合物(鉄を補充したアイソミル（Isomil）, Ross Laboratories
, Columbus, Ohio)の1.026kgを水3リットルに溶解した。溶液を1.925 lの2つの ロットに分け、一方を対照として使用し、他方を下記のようにしてNADP/チオレ ドキシン系(NTS)で処理した。45μmol NADPH、564μg NADP-チオレドキシンレダ
クターゼ (NTR)及び1.125mg チオレドキシンを含む (すべて30mM Tris-HCl緩衝 液（pH 7.9）に溶解)を含む混合物を、5分間プレインキュベートし、次いで1.92
5リットルの配合物の一方のロットへ添加した(以下、「チオレドキシン処理」ロ
ットとする)。チオレドキシン系の添加後、一定に攪拌しながら更に攪拌を追加 の時間続けた。等量の緩衝液を対照ロットへ添加した。インキュベート後、600m
lの配合物を、割り当てたグループの各3頭のイヌへ給餌した。動物へ給餌した部
分は、インキュベート前の25.0gのダイズタンパク質に相当した。コムギ 未漂白のコムギの1.5kgを、3リットルの水に添加し、ガロンサイズワーリング
ブレンダー中で予め37℃に加熱した。1分間の混合後、小麦粉懸濁物を等しく2つ
のロットに分け、一方を対照として使用し、他方を下記に示すようにしてNADP/ チオレドキシン系で処理した。45μmol NADPH, 564μg (NTR)及び1.125mg チオ レドキシンを含む（すべてを30mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.9）に溶解）を含む混 合物を、5分間プレインキュベートし、次いで1つのロットに添加した（以下、「
チオレドキシン処理」ロットとする）。等量の緩衝液を対照ロットに添加した。
両方の調製物を頻繁に攪拌しながら37℃で1時間インキュベートした。600mlを各
調製物から取り出し、1缶（447g（15-3/4オンス））のd/d、小麦なし、コメ／ラ
ムをベースとするドッグフードと混合し、割り当てたロットの3頭へ給餌した。 尚、これらの部分は、25gの小麦タンパク質に相当した。8頭を用いた実験におい
て、小麦粉を2.0kgに増量し、手順をスケールアップした。ミルク 水で再構成した乾燥カーネーション（CARNATION）の調製物を、NADP/チオレド
キシン系と共に同様にインキュベートした。以前の通り、3頭のイヌには未処理 のミルクを与え、3頭には処理したミルクを与えた。イヌに与えた最終部分はは1
0gのミルクタンパク質に相当した。
【０１８６】結果 使用したNADP/チオレドキシン系の成分のレベルは、前記実施例15に記載のド ウよりも有意に高かった。この給餌試験における予備試験においては、mBBr/SDS
-ポリアクリルアミドゲル手順によりインビトロで測定されたように、前記化合 物の高レベルがアレルギー性タンパク質の還元に必要であることが示された。給
餌試験におけるタンパク質mgあたりの各イヌに使用したNADP/チオレドキシン系 の各成分の量は、焙焼試験に使用した量に対して低いことが示された。 小麦粉、ミルク、ダイズ配合物* チオレドキシン 5-X NTR 5-X NADPH 2-X* 示される量は、小麦粉タンパク質1グラムあたり3μg チオレドキシン、1.5μg
NTR及び0.3μmol NADPHを添加した前記の焙焼試験において使用した量に比例し ている。焙焼試験において、ローフを、約200gの小麦粉又は約20gの小麦タンパ ク質を用いて焼いた。給餌試験のために、食品調製物をNADP/チオレドキシン系 の成分と共に、室温下（ミルク及びダイズ）又は37℃（小麦）で1時間インキュ ベートした。 「臨床症状」（嘔吐及び吐き気）及び「排便スコア」（図6）に基づき、チオ レドキシン処理は、ダイズ及び小麦配合物に対するイヌのアレルギー反応を低下
させることを見いだした。ミルク配合物のアレルゲン性も、NTS処理により低下 した。使用したチオレドキシン及びNTRはE. coli由来であるが、その他のソース
、例えば酵母由来のチオレドキシン及びチオレドキシンhを使用してもよいこと に注目すべきである。
【０１８７】実施例39 チオレドキシン処理したミルクタンパク質及び生牛乳の増加した消化性及び低下 したアレルゲン性の測定 ミルクアレルギーは、数種のタンパク質、α−ラクトアルブミン、血清アルブ
ミン、カゼイン及び特にβ−ラクトグロブリン（BLG）により引き起こされる。 本実施例は、ミルクタンパク質及びアレルゲンのジスルフィド結合が、チオレ
ドキシンにより選択的かつ特異的に還元されることを示した。一度還元されると
、これらのアレルゲン（BLG）の活性のほとんどが、アレルゲン性において低下 し、消化性において著しく増加したことが示された。その他のミルクジスルフィ
ドタンパク質のペプシンに対する感受性も、チオレドキシン還元後にある程度増
加した。材料及び方法 アレルゲン源 生牛乳を、カリフォルニア大学デーヴィス校試験農場より入手した。純粋なβ
−ラクトグロブリンＡ及びＢ及びこれら2つの80%混合物を、Sigma Chemical Co.
（St. Louis,Mo）より購入した。動物 実施例36〜38において使用した近交系高IgE産生アトピー性イヌの同一のコロ ニーから得たイヌを、カリフォルニア大学デーヴィス校、獣医学部、動物資源サ
ービスにおいて感作し維持した。誕生時に感作したイヌは、アレルギーに対する
遺伝子的疾病素質について選択され、15年の食品及び花粉過敏症歴を有していた
。化学薬品及び酵素 ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミド(SDS/PAGE)用の試薬を、Sigma 、Boehringer Mannheim、Indianapolis, Ind.及びBiorad Laboratories, Hercul
es, CAより入手した。DTTはBoehringer Mannheimより購入し、モノブロモバイメ
イン（monobromobimane）(mBBr)はCalbiochem, San Diego, CAから購入した。チ
オレドキシン及びNTRは、E. coliの過剰発現株から精製した。グルタチオンレダ
クターゼは、ホウレンソウ葉より、ホウレンソウNTRに使用したのと同一の手順 により精製した。ブタの胃粘膜由来のペプシン、NADPH及びその他の成果化学試 薬はSigmaより購入した。
【０１８８】アトピー性イヌの食品感作 アトピー性イヌのコロニーの2つの同腹仔に由来する新生仔CGB及びGCBに、1日
目において、0.2mlのミョウバン中の牛乳及び牛肉抽出物(Miles, Inc., Elkhart
, Ind.、実施例33)を皮下注射した。第三の同腹仔CBBには、これらと同一のアレ
ルゲンに加えてダイズ抽出物(Miles, Inc.、実施例33)を注射した。感作手順、 仔の試験及び維持手順は、実施例36に記載のものと実質的に同一であった。皮膚試験 皮膚試験の約3分前、各イヌに、4〜5mlのろ過した0.5% エバンスブルー色素溶
液(0.2mlの0.5% エバンスブルー色素／kg体重に相当)を頭部静脈を通して投与し
、皮膚のIgE抗体の判定を増強した。各サンプルの100μlの連続希釈物を腹部の 皮膚に皮内注射し、力価を確立した。15〜20分後、アレルギー反応を、青色の膨
疹反応の大きさ（最大長さ及び幅）を測定することにより決定した。適切な負の
対照(生理学的塩水中で希釈した緩衝液)を各動物試験に含めた。チオレドキシン
、NTR、NADPH及びペプシン単独を用いた反復試験を、一貫して負のものとして行
った。タンパク質アッセイ タンパク質濃度は、標準としてウシγグロブリンを使用したブラッドフォード
法により決定した。純粋BLG濃度は、計算されたモル吸光係数16800(Gill, S. C.
ら(1989), Anal. Biochem. 182:319-326)を使用し、278nmにおける吸光度により
決定した。タンパク質のモデリング BLG構造のモデル（Brownlowら、解像度1.8Åにより決定）が、the Protein Da
ta Bank, Brookhaven National Laboratory (Brownlow, S.ら(1997), "Bovine b
eta-Lactoglobulin at 1.8 Resolution-Still an Enigmatic Lipocalcin", Stru
cture 5:481-495)より提供された。単一の変異C160S (部分的還元)及び二重変異
C160S-C106S (完全還元)を有するタンパク質のモデルを、the Swiss-Model prog
ram (Peitsch,m. C. (1996), "ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools
for automated comparative proteinmodelling", Biochem. Soc. Trans. 24:27
4-279)により構築した。BLGの三次元モデルを、the RasMol program v2.6により
可視化した。
【０１８９】タンパク質還元 タンパク質のジスルフィド結合の還元を、(i)NADP/チオレドキシン系(NTS)（5
μlの25mM NADPH、8μlの0.3mg/ml E. coli チオレドキシン (すなわち、2.4μg
の全チオレドキシン) 及び7μlの0.3mg/ml E. coli NTRから構成される）又は(i
i) NADP/グルタチオン系(NGS)（5μlの25mM NADPH、10μlの30mM 還元グルタチ オン (GSH)及び15μl の0.1mg/ml グルタチオンレダクターゼから構成される） のいずれかの容量100μl中において行った。反応を、10μgの純粋標的タンパク 質又は50μgの生乳のいずれかを含む生理学的緩衝塩水溶液(PBS、すなわち10mM
Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、2.7mM KCl及び137mM NaCl、pH 7.4)中で行った。反応 混合物を4℃で一晩、又は37℃及び55℃で45分間インキュベートした。完全に還 元させるために、サンプルを、5μlの100mM DTTを含むPBS中でインキュベートし
、5分間煮沸した。還元されたタンパク質を、下記のmBBr標識及びゲル電気泳動 によりゲル中で可視化した。還元の程度は、ゲルのスキャニングにより決定した
。ペプシンアッセイ BLG 640μg又はミルク 1mg タンパク質(すなわち約30μl)を、チオレドキシ ン系(NTS)の存在下又は非存在下、4℃(完全還元形態を与える)又は55℃(部分還 元形態を与える)下、前記の条件下でインキュベートした。BLG 320μg又はミル ク 500μg タンパク質を、200μlの疑似胃液(SGF)中、Astwood, J. D.ら (1996)
, "Stability of food allergens to digestion in vitro", Nature Biotechnol
. 14:1269-1273に記載されるようにして処理した。SGFは、0.32% ペプシン(w/v)
及び30mM NaCl（HClでpH 1.2に調節）から構成されていた(Board of Trustees (
編) 1995, Simulated Gastric Fluid, TS., pp. 2053 in the United States Ph
armacopeia 23, The National Formulary 18. United States Pharmacopeial Co
nvention, Inc. Rockville,md.)。反応混合物を37℃でインキュベートし、0、0.
25、1、2、4、8、15、30及び60分間のインキュベート後、0.375倍容量の160mM N
a2CO3 (約pH 7)を添加することにより停止させた。次いでタンパク質混合物をSD
S-PAGE (15% ゲル)に付し、下記のようにしてタンパク質をクーマシーブルーで 染色した。示されるように、消化されたサンプルのアレルゲン性を皮膚試験分析
により決定した。
【０１９０】給餌攻撃 純度80% BLG (A及びB形態の混合物)の還元を、各イヌについて100mlの水中で 行った。各グラムのBLGを、104mgのNADPH、1mgのE. coli チオレドキシン及び1m
gのE. coli NTRの水性混合物の添加により処理した。反応は、振盪器中、125 rp
m、37℃で45分間かけて起こった。サンプルを4℃で一晩保存した。翌日、未処理
（対照）又は処理BLG 2.5 gと340g（12オンス）缶のP/D フード(Hills)とを混合
し、イヌに与えた。未負荷の動物には、BLGなしのドッグフードのみを与え、対 照動物には未攻撃BLGと共にドッグフードを与えた。イヌには、最初1/4缶の未処
理食品を与えて胃液の流れを開始させた。15分後、15分の3回の間隔をおいて1/3
缶の食品（2.5gの未処理又はチオレドキシン処理BLGと混合したもの）を与えた 。合間に、イヌをモニターし、そのGI反応を評価した。次いでイヌを観察し、そ
の反応を更に5時間、毎時ごとに記録した。データ分析 前記の食品攻撃イヌの消化反応を、給餌により誘導された嘔吐のタイミング、
容量及び流動性についての値を割り当てることにより評価した。流動性：嘔吐な
し=0、固体の嘔吐=1、液体の嘔吐=2、血液又は胆汁を含む液体の嘔吐=3。容量：
嘔吐なし=0、少量の嘔吐=1、大量の嘔吐=2。タイミング：遅延した嘔吐：=1、即
時の嘔吐=2。タンパク質のmBBR標識及び分析 スルフヒドリル基を、蛍光性mBBR誘導体として可視化した。mBBr 10μlの 100
mM 溶液を、各タンパク質サンプルに添加した。インキュベート20分後、10μlの
100mM 2-メルカプトエタノール、10μlの 20% SDS及び20μl のSDS/PAGE サンプ
ル緩衝液（80%(v/v) グリセロール及び0.005%ブロモフェノールブルーを含む） を添加することにより反応を停止させた。次いでタンパク質を、下記のようにし
てSDS/PAGE (10-20% アクリルアミド勾配)により分離した。電気泳動後、ゲルを
12%トリクロロ酢酸中に1時間おいて固定し、次いで一晩又はそれ以上の間、40%(
v/v)メタノール及び10%(v/v)酢酸中に数回交換しながら浸積し、過剰量のmBBrを
除去した。脱染したゲルを365nm UV光の下に置き、蛍光バンドを可視化した。写
真を、(i)ポラロイド写真(ポジ/ネガ ランドフィルム、タイプ55) 黄色のラッテ
ンフィルター no. 8を通して、露光時間45秒、f4.5により、又は(ii)NucleoTech
CorporationのNucleovisionシステムにより撮影した。.
【０１９１】SDS/PAGE ゲル (10-20%アクリルアミド勾配、厚さ1.5mm又は15%アクリルアミド、厚さ0.
75mm)を、Laemmli, U.K. (1970), "Cleavage of structural proteins during t
he assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227:680-685に従い調
製した。電気泳動後、ゲルを、40%メタノール及び10%酢酸中の0.01%クーマシー ブリリアントブルーR-250で1時間染色し、20%エタノール及び10%酢酸の溶液を用
いて一晩脱染した。脱染後、(i)ポラロイド写真(露光時間 1/15秒、f7)又は(ii)
NucleoTech CorporationのNucleovisionシステムにより写真を撮影した。配列の分析 異なる形態のBLG(酸化、部分還元及び完全還元 10ug)を、SDS-PAGE (10-20% アクリルアミド勾配、厚さ 1.5mm 又は 15% アクリルアミド、厚さ0.75mm)によ りmBBR誘導体として分離した。ゲル内（in-gel）消化法を使用して、構造の特徴
付けを許容するcys残基を含むペプチドを得た(Hwang, B. J.ら(1996), "Interna
l sequence analysis of proteins eluted from polyacrylamide gels", J. Chr
omatogr. B. Biomed. Appl. 686:165-175)。出発物質として使用した乾燥ゲルを
水中に置き、膨潤させ、セロハン層を除去した。次いで適切なBLGバンドを、再 構成したゲルから切り出した。各タンパク質バンドを、1〜2mm片の賽の目に切断
した。要約すると、ゲル片をspeedvac中で脱水し、0.1M Tris緩衝液、pH 9 及び
0.05% SDS, pH9.0（0.03 〜 0.05μg Lys-C エンドペプチダーゼ (Wako)を含有 ）中で再水和し、30℃で一晩インキュベートした。ゲルを水での2時間の抽出を2
回、70%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)での2時間の抽出を2回する ことにより溶離した。プールした抽出物を乾燥し、最少量の6M グアニジン HCl-
Tris, pH 8.2中に溶解した。次いで抽出したペプチドを、ジチオスレイトール(D
TT)で還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した。反応後、混合物を水で4倍
に希釈し、還元されたグアニジウムドデシルサルフェート沈殿物を遠心分離によ
り除去した。溶液中（In-solution）消化を、トリプシンを用いて、希釈完全消 化用反応混合物中で行った。ペプチドを、Applied Biosystems 172 HPLC システ
ムを使用したC18 マイクロボアカラム（microbore column）(1mm×15 cm, VYDAC
)により精製した。サンプルの注射後、カラムを、95% 溶媒A(水中の0.1 % TFA)/
5% 溶媒B(70 アセトニトリル/0/075% TFA)を流量80ul/分で10分間洗浄した。ペ プチドを、5〜70% の溶媒Bの勾配を用いて90分間溶離した。精製したペプチドを
、テニルチオヒドラトイン（thenylthiohydratoin）(PTH)アミノ酸のオンライン
HPLC同定を用いた ABI 477又は470A シークエンサーのいずれかを用いて配列決 定した。Cys160及びCys119のいずれかを含むペプチドを以下のようにして単離し
た。完全酸化タンパク質のジスルフィドは、Cys 106-Cys 119及びCys 60-Cys 16
0に対応した。部分還元又は完全還元形態に含まれるジスルフィド結合を同定す るために、それぞれに唯一のトリプシンペプチドを単離した。部分還元又は完全
還元形態は、共にペプチド: -Leu149-Ser-Phe-Asn-Pro-Thr-Gln-Leu-Glu-Glu-Gl
n-Cys 160-His-Ile162を示した。完全還元されたタンパク質は、更に下記のペプ チド: -Tyr102-Leu-Leu-Phe-Cys106-Met-Glu-Asn-Ser-Ala-Glu-Pro-Glu-Gln-Ser
-Leu-Ala-Cys 119-Gln-Cys 121-Leu-Val-を示した。
【０１９２】結果 チオレドキシン系によるミルクタンパク質の還元 チオレドキシンは、ミルクの最も有力なジスルフィドタンパク質、すなわちBL
Gの還元において有効であった。このために、純粋BLG(A及びB形態)の酸化還元状
態を、NADP/チオレドキシン系(NTS)（NADPH、NTR及びチオレドキシンから構成さ
れる）での処理後にモニターした。前記のようにして、サンプルをNTS系と共に インキュベートし、モノブロモバイメイン(mBBr)/SDS-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動(PAGE)手順を使用して分析した。ここで、前記の通り、mBBRで誘導体化
し、SDS-PAGEで分離した標的タンパク質の還元(-SH)形態は、紫外線で見たとき に蛍光バンドとして現れた。分子内ジスルフィド結合を含むタンパク質のスペク
トルについて前記の実施例において見られるように、純粋BLGのA及びB形態は、 チオレドキシンにより活発に還元された。ミルクに適用したとき、チオレドキシ
ンはBLGを還元しただけでなく、図7におけるゲルについて使用したSDS/PAGE/mBB
r標識手順により決定したようにα−ラクトアルブミンを含む数種のその他のタ ンパク質をも還元した。このゲルに対して、PBS中の50μgの生乳をすべてのレー
ンに適用した。各レーンのその他の変数は以下の通りであった。レーン 1：4℃ における対照、添加なし。レーン2：NTS、55℃。レーン3：NTS、4℃。レーン4：
NGS、55℃。レーン5：NGS、4℃。レーン6：5mM DTT、100℃、5分間。レーン7： クーマシーブルーで染色したことを除いてレーン6と同じ。過剰量のNADPH、NTR 及びチオレドキシンは、実験の間を通して標的ミルクタンパク質を還元状態に維
持したことに注目すべきである。主要(24 kDa)カゼイン成分（α及びβ）の前に
移動するマイナーバンドはκカゼインであった。 温度は、還元に対して興味深くかつ有用な効果を及ぼすことが見いだされた。
図7に示すように55℃（45分間）で処理したとき、BLGは還元されたが、ゲル中に
おける移動度はわずかに変化しただけであった。対照的に、4℃（17時間）でイ ンキュベートしたとき、BLGのバルクの移動度は有意に低下し、新たな形態のタ ンパク質が出現した（図7、レーン3）ゲルスキャニングによる還元の程度の評価
は、55℃においてBLGは部分的に還元され、4℃において完全に還元されたことを
明らかにした。部分的及び完全に還元された形態のトリプシンペプチドのアミノ
酸配列とBLGの既知の構造との比較により、還元の性質についての更なる情報を 得た。
【０１９３】 BLGは2つのジスルフィド結合を含んでいることが知られている。これは両方と
も分子内にあり(図8参照)、一方は明らかに表面に近づきやすく、Ｃ末端近くに 位置しており(Cys66-Cys160)、他方はコアに近く、2つのβシートの間に位置し ている(Cys106-Cys119 又はおそらくCys106-Cys121)。配列決定分析により、露 出したジスルフィド(Cys66-Cys160)が55℃で還元され(部分的還元形態)、更に4 ℃においては隠れたジスルフィド(Cys106-Cys119又はCys106-Cys121)が一緒に還
元される（完全還元形態）ことを確認した(材料及び方法の欄を参照)。BLGの差 動的還元はpHを変化させることにより達成することができた。pH6.8における還 元では、部分的に還元された形態のみが得られ、pH8.0では部分的及び完全還元 形態の混合物が得られた（共に37℃）（データは示さず）。この結果により、中
性より高いpHにおいてBLGは不安定であること(Tanford, C.ら(1959), "Transfor
mation of .beta.-Lactoglobulin at pH 7.5", Biochemistry 81:4032-4036)及 び40℃より高い温度下においては立体配置の変化を受けること(Qi, X. L.ら(199
7), "Effect of temperature on the secondary structure of beta-lactoglobu
lin at pH 6.7, as determined by CD and IR spectroscopy: a test of themol
ten globule hypothesis", Biochem. J. 324:341-346)を示した他人の知見を確 認した。有意なことに、図7に示すBLGについての同様の還元の結果が、NADP/チ オレドキシン系の成分を緩衝液なしに生乳に添加したときに得られた。更に、緩
衝液なしの処理ミルク中のBLGは、4℃で空気中で保存したとき、2日間還元され たままであった（データは示さず）。 図7のゲルのレーン4及び5において見られるように、NADPH及びグルタチオンレ
ダクターゼにより還元状態に維持されるモノチオールグルタチオンは、BLGを還 元し、更にその他のタンパク質をある程度還元したが、NTSよりは効率的ではな かった。その他のジスルフィド還元剤、ジチオスレイトール及びリポ酸は、ヘビ
神経毒についての前記実施例に記載のとおり、チオレドキシンと組み合わせたと
きのみ効果的であった（データは示さず）。
【０１９４】ペプシン及びトリプシンによるミルクタンパク質の消化 実施例19及び29に示されるように、分子内ジスルフィド結合を含む小タンパク
質(例えば、トリプシンインヒビター、ヘビ神経毒)のトリプシン感受性は、チオ
レドキシンによる還元により劇的に増加した。同様に、BLGは同様のパターンに 従う、すなわち、チオレドキシン還元BLGはトリプシン消化に対して感受性が高 く、一方酸化BLG(すなわち、純粋な未処理型)は耐性があった(実施例34参照)。 同様の結果が、純粋なBLGを用いた実施例及び疑似胃液（Astwood, J. D.ら、前 出）に付したミルクを用いた実施例においても得られた。SDS-PAGEにより分離し
、クーマシーブルーで染色したとき、BLGはチオレドキシンで還元した後のみペ プシンで消化されたことを見いだした(図9参照)。図9は、ミニSDS/PAGE及びクー
マシーブルー色素により決定した、酸化及び還元BLGの消化を示している。すべ て37℃においてSGFと共にインキュベートした。13.5μlの SGF混合物を示したと
おりに適用した。図9のゲルについてのその他の変数は以下の通りである。レー ン1：BLG、SGF、 0分。レーン2：BLG、SGF、60分。レーン3：55℃、NTSによる還
元BLG、SGF、0分。レーン4：55℃、NTSによる還元BLG、SGF、60 分。レーン5：4
℃、還元BLG、SGF、0分。レーン6：55℃、還元BLG、SGF、60分。レーン 7、SGF 。レーン8：BLG。図9に示されるように、感受性の差異は著しいものであった。 ミルク中の酸化 BLGは、少なくとも60分間は消化に対して耐性であるが、チオ
レドキシン還元形態は60秒以内に消化されたことが見いだされた(図10A-10Cを参
照)。図10A、10B及び10Cは、ミニ SDS/PAGE及びクーマシーブルー色素により決 定した、チオレドキシン還元後のPBS中で緩衝化されたミルクの消化に対する時 間の効果を示している。サンプル2-10 は、13.5μl の疑似胃液混合物を含み、 サンプル3-10 は 50μg ミルクタンパク質を含んでいた。0、0.25、1、2、4、8 、15、30、60 分のインキュベート後、中和により消化を停止させ、アリコート を図10A、10B及び10Cにおけるゲルの適切な各レーンへ適用した。図10Aのゲルに
おけるその他の変数は緩衝化ミルク対照であった。図10Bのゲルにおいては緩衝 化ミルク、NTS、55℃であった。図10Cのゲルにおいては緩衝化ミルク、NTS、4℃
であった。単一のジスルフィド結合の還元は十分なものであった。BLGの部分的(
55℃)及び完全(4℃)還元形態は、ペプシン感受性において差異を示さなかった( 図10B及び10Cを比較)。有意なことに、たとえチオレドキシンにより部分的に還 元されたとしても、グルタチオン処理サンプルは、疑似胃液による消化に対して
非感受性であった（データは示さず）。α−ラクトアルブミン及びκ−カゼイン
の感受性はチオレドキシン還元により幾分増強されたが、純粋又はミルク中のBL
Gはチオレドキシンによる還元なしには消化されない唯一のタンパク質であるこ とが見いだされた(図7、9及び10A-10Cを参照)。
【０１９５】還元及び消化ミルクタンパク質のアレルギー状態 イヌモデルの皮膚試験を使用したミルクの主要タンパク質(カゼイン、α−ラ クトアルブミン、BSA、BLG)のアレルゲン性の比較により、BLGはミルクの主要ア
レルゲンであり、全膨疹誘導活性の80%の原因であることが明らかになった。更 に、チオレドキシン系で処理したとき、ミルク及びBLGはアレルギー反応を誘導 する能力の低下を示した。従って、アレルゲン性について試験した前記の実施例
の結果と同様に、生乳のアレルゲン性は、試験したイヌの感受性に依存して10〜
300の係数（factor）で低下した(図11A及び11Bを参照)。図11A及び11Bのグラフ は、感受性の異なる2頭のイヌにおける生乳アレルゲンに対する皮膚試験反応の チオレドキシン関連緩和を比較している。図11A及び11Bに示されるように、膨疹
領域（mm2）により決定したI型過敏症反応は、PBS中のミルク溶液の100μlの皮 内注射により誘導された。溶液は、NADP/チオレドキシン系(NTS、4℃)又は未処 理(対照)で前処理した。2頭のイヌの反応は、感受性の相違にも関わらず、チオ レドキシン処理はいずれの場合においてもアレルゲン性を緩和したことを示して
いる(すなわち、弱く(図11B)及び強(図11A)感受性イヌ)。PBS/グリセロール対照
及びNTSは各イヌに対して陰性であったことを見いだした。更に、異なる感受性 を有する多数のイヌを用いた試験により、純粋又はミルク中の部分的又は完全還
元型のBLGのアレルゲン性においては一貫した差異がないことが明らかになった （データは示さず）。従って、皮膚試験は、チオレドキシンによる還元は、エピ
トープアクセシビリティを変化させ、BLG及び可能性のあるその他のミルクタン パク質のアレルゲン性を低下させることを示している。 純粋BLGはミルクと同様のアレルギー反応を示した(図12A及び12Bにおける酸化
及び還元の0時間サンプルを比較)。図12A及び12Bにおいて、酸化「0」分及び還 元「0」分の棒は消化処理前のサンプルを示し、酸化60分及び還元60分の棒はSGF
を含むペプシンで処理したサンプルを示している。皮膚の膨疹領域（mm2）によ り観察したI型過敏症反応は、NADP/チオレドキシン系(NTS) (還元)又は未処理( 酸化対照)で前処理した消化中和BLG（図12A）又はミルク（図12B）の100μlの皮
内注射により誘導された。中和SGF対照は、すべての試験イヌについて陰性であ ったことが見いだされた。更に、皮膚試験は、チオレドキシンのアレルゲン性へ
の影響に関して、BLGの純粋なA及びB形態の間の差異を示さなかった（データは 示さず）。
【０１９６】 BLG及びミルクを用いた皮膚試験により、ペプチド消化は両方の調製物のアレ ルゲン性をほぼ完全に除去したことが明らかになった(図12A及び12Bを参照)。皮
膚試験に基づき、消化を還元に連関させたとき、アレルギー反応は300〜1000減 少した。更に、高及び低感受性イヌの両方において、消化サンプルのアレルゲン
性は最低レベルに減少した。 これらの結果は、(1)チオレドキシンは無傷のタンパク質のエピトープのアク セスビリティを変化させ、ほとんどの動物におけるアレルゲン性を低下させるこ
と、及び(2)例えばBLG等の安定なアレルゲンを、アレルゲン性のほぼ完全な喪失
という結果を伴うペプシン消化に対して感受性にするという結論と一致している
(図13及び14参照)。 最後に、α−ラクトアルブミン及びBLGは、NTS系により還元したときにトリプ
シンにより消化されることを見いだした(実施例34参照)。ペプシンを用いた実施
例において得られた結果と連関して、これらの結果より、チオレドキシンのBLG をプロテアーゼ感受性にする能力を確認した。アトピー性イヌを用いた給餌試験 嘔吐及び下痢を誘導する消化管の不調は、食物アレルゲンの摂取だけでなく、
食物タンパク質の不消化に伴う症状である。更に、これらの症状の重症度は、皮
膚試験を補完するアレルゲンの強さの基準を提供する。胃腸管の反応に対する証
拠を得るために、感受性イヌの食品にBLGを補充した。下記の表VIIIに示される 結果より、2.5gの還元 BLG (2.5gの BLGは、3/4リットルのミルクに対応する)を
含む食品を摂取したイヌは、有意に減少した嘔吐の程度を示した。反復給餌試験
により、平均して約70%の胃液逆流が消失したことが示された。有意なことに、 このパターンは、処理又は未処理BLGを摂取したイヌの単一のセットにおいて観 察された。胃腸管の不調反応の同様の緩和が、表VIIIにおいて使用した各イヌに
与えた食品のBLGを1缶あたり2.5gから1.25gへ減少させることにより観察された(
データは示さず)。これらの観察結果は、粘膜リンパ組織により認識されるアレ ルゲン認識がチオレドキシン処理により緩和されることを示す前記の皮膚試験の
結果を補完する。
【０１９７】表XVIII 未処理又はチオレドキシン処理β−ラクトグロブリンを交互に摂取したイヌのア レルギー反応 上部GIインデックス（Upper GI Index）* 実験A 実験B イヌ 対照 処理 対照 処理 6GCB3 7 -- -- 0 6GCB7 6 -- -- 3 6GCB1 -- 0 5 -- 6GCB4 -- 6 9 -- 6GCB6 -- 0 8 --* 誘導された嘔吐の量及び流動性の基準 上部GIインデックス反応は、チオレドキシン処理又は未処理（対照）BLGの2.5
gを1缶のドッグフードと組み合わせて使用して測定した。インデックスの計算は
、2回の別の給餌試験A及びBの後に行った。上部GIインデックスの引用符は以下 の通りである。嘔吐なし=0、少量の嘔吐=1、大量の嘔吐=2、固体の嘔吐=1、液体
の嘔吐=2、血液又は胆汁を含む嘔吐=3、遅延した嘔吐=1、即時の嘔吐=2。
【０１９８】考察 本実施例において、チオレドキシンは、主要ミルクアレルゲンであるBLGに存 在する分子内ジスルフィド結合を特異的に還元することが見いだされた。条件に
依存して、NADPH及びNTRにより還元されたチオレドキシンは、純粋タンパク質又
はミルクを用いて分析したとき、BLGのジスルフィド結合の1つ又は両方を還元し
た。皮膚試験及び給餌攻撃により実験的に明らかになったエピトープ分布の変化
が、構造モデルにおける分子レベルでみられた(Peitsch,m. C. (1996)、前出)。
コンピューターモデルを使用してBLGの露出したジスルフィド結合(Cys66-Cys160
)を部位特異的突然変異により破壊したとき、125Thr-135Lys エピトープ (Kamin
ogawa, S.ら(1989), "Monoclonal antibodies as probes formonitoring the de
naturation process of bovine .beta.-lactoglobulin", Biochemica et Biophi
sica Acta 998:50-56)は、有意にその位置を近くに変えたが、一方、ジスルフィ
ドから離れたエピトープ(8Lys-19Trp)は変えなかった(図13及び14参照)。埋め込
まれたジスルフィド(Cys106-Cys119 又はおそらくは Cys106-Cys121)の突然変異
は、エピトープの位置のさらなる変異は誘導しなかった。同様の観察結果が、ヒ
トBLGエピトープを用いたモデルにおいて得られた(Ball, G.ら(1994), "Amajor
continuous allergenic epitope of bovine beta-lactoglobulin recognized by
human IgE binding", Clinical and Experimental Allergy 24:758-764)。 本発明の結果は、チオレドキシンによる還元が2通りで標的タンパク質アレル ゲンのアレルゲン性を低下させることを示唆している。還元は、エピトープアク
セシビリティを制限するタンパク質構造を変化させ、消化性を増強する。このよ
うにして、アレルゲンの強度は低下し、更に胃腸管において急速に排出される。
【０１９９】実施例40 ペプシン及びトリプシンによる還元グリアジンの消化 実施例9及び10に記載の小麦粉のエタノール抽出により単離したグリアジン画 分のプロテアーゼ感受性を試験した。前記の実施例10に示されるように、グリア
ジンは、チオレドキシンにより特異的に還元される分子内ジスルフィド結合を含
んでいる。更にグリアジンは小麦における主要食品アレルゲンである（Buchanan
, B. B.ら(1997), "Thioredoxin-linkedmitigation of allergic responses to
wheat", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:5372-5377）。チオレドキシン自体
は、NADPH及びNADP-チオレドキシンレダクターゼにより酵素的に又はジチオスレ
イトール(DTT)により化学的に還元することができる。本実施例については、分 離したグリアジン(1.04mg/ml)のアリコート(50μl)を、チオレドキシン(1.0μg)
と共に又はなしにインキュベートし、1mM DTTの存在下又は非存在下、室温下、p
H 7.5下、Tris-HCl 緩衝液中で1時間還元した。インキュベート終了時に、5μl のトリプシン（Sigma(1mg/ml)）を各サンプルに添加した。サンプルを30℃下で 更なる時間の消化に付した。各サンプルにおいて、消化を、PMSF(フェニルメチ ルスルホニルフルオライド(100mMの2μl)により終了させた。SDS(10%の10μl)及
びグリセロール(50%の15μl)と混合した後、サンプルをSDS-PAGEにより分析した
。電気泳動後、15%ゲルをクーマシーブルーで染色し、メタノール及び酢酸によ り脱染した。タンパク質バンドの分析により、グリアジンは酸化状態（未処理）
では消化に対して安定であるが、チオレドキシンによる還元後は低分子量成分へ
分解されることが証明された。実施例39に示されるように、グリアジンアリコー
トを処理し、トリプシンの代わりにペプシンで処理したときに同様の結果が得ら
れた。
【０２００】 本実施例並びに実施例34及び39は、チオレドキシンによるアレルゲン還元の結
果は、プロテアーゼに対する感受性の著しい増加であることを示している。従っ
て、グリアジン及びBLGの酸化形態はペプシン耐性であるが、還元形態は感受性 が高く、容易に消化された。小麦粉における本質的なチオレドキシンの平均濃度
は約0.01% である(Johnson, T. C.ら(1987), "Reduction of purothionin by th
e wheat seed Thioredoxin system and potential function as a secondary th
iolmessenger in redox control", Plant Physiol. 85:446-451)。これは、小麦
粉1kgあたり約100mg〜約200mg、又は、パンにおいては小麦粉100gあたり約2mgの
チオレドキシンである。しかしながら、小麦粉中の天然チオレドキシンの上限は
、食物タンパク質1gあたり約2mgである。例えば、チオレドキシン還元剤で処理 した高濃度のチオレドキシンを含むパンは、アレルゲン性が低く、消化性の高い
パンであろう。チオレドキシン及びチオレドキシン還元剤で処理した食物タンパ
ク質によるペプシンに対する感受性の増加は、BLGについてのモデリングを通し て分子レベルで観察され、胃腸管における摂取BLGのより迅速な加工を誘導する だろう。すべての動物へ拡張した場合、チオレドキシン系でのミルク及び小麦粉
並びにその他の食品の処理により、アレルゲン性及び消化性の長期間の影響、す
なわち著しい浮腫及び下痢の除去を提供することが期待されるだろう。 ミルクに関するチオレドキシン技術の商業化は、低温殺菌(すなわち、55℃で4
5分間又は4℃で少なくとも10時間)の前後にミルクをNTSで処理することにより達
成されるだろう。前記の応用には下記のものが含まれるだろう。 1．液体状のチオレドキシン系の生乳又は乳清への適用及び低温殺菌工程と連 関させた還元。 2．生乳又は低温殺菌ミルクの還元チオレドキシン結合カラムへの通過。チオ レドキシンはミルクへの適用前にNADPH及びNTRで還元されるだろう。更にチオレ
ドキシンはジチオスレイトールで還元され、ジチオスレイトールは生乳への適用
前の洗浄によりカラムから除去することができる。 3．例えばフルコンテナ又は真空コンテナの使用による賞味期限を延長するた めの、非酸化条件下におけるNTS処理ミルクの貯蔵。 4．低温殺菌後のチオレドキシン及びNTRのミルクへの添加及び使用直前の固体
状NADPの添加。 5．チオレドキシン処理後に、酵素、例えばトリプシンを用いた制限タンパク 質消化へミルクを付すること。製品は、ミルク感受性個体における寛容性の誘導
に使用することができるだろう。
【０２０１】結言 前記の本発明の一般的な説明及び本発明の適用を説明する特定の実施例より、
本発明は多様かつ広大な結果を有することを理解することができる。本発明は基
本的に、新規なドウ及びドウ混合物及び新規なドウの製造方法及びドウ及びパン
の新規な品質改良方法、更には穀物製品における酵素インヒビターの新規な不活
性化方法を提供する。更に本発明は、動物毒素の生物学的活性及び不活性を改変
する新規な方法及び数種の食品、すなわち小麦、卵、ミルク、乳清、大豆、ナッ
ツ及び牛肉のアレルゲン性を除去又は減少させる新規な方法及び食品、特にミル
ク、乳清及びこれらの食品及び小麦食品のタンパク質分解及び消化性を増加させ
る新規な方法を提供する。更に本発明は、プルラナーゼインヒビターである新規
タンパク質及びその不活性化方法を提供する。 本発明が特定の実施態様に結びつけて説明されているが、請求の範囲に定義さ
れる本発明の範囲内において、種々の改変が当業者には明らかであることを認識
すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 大豆アレルゲン抽出物を還元型チオレドキシンで処理することによる大豆アレ
ルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図２】 牛乳アレルゲン抽出物を還元型チオレドキシンで処理することによる牛乳アレ
ルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図３】 小麦アレルゲン抽出物を還元型チオレドキシンで処理することによる小麦アレ
ルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図４】 牛肉アレルゲン抽出物を還元型チオレドキシンで室温で処理することによる牛
肉アレルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図５】 牛肉アレルゲン抽出物を還元型チオレドキシンで３７℃で処理することによる
牛肉アレルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図６】 食餌を還元型チオレドキシンで処理することによる大豆及び小麦に対する胃腸
のアレルゲン性応答の緩和を示す棒グラフである。
【図７】 蛍光及びタンパク質染色によるチオレドキシン連結及びグルタチオン連結還元
の程度を示すＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真である。
【図８】 ジスルフィド架橋及び遊離スルフヒドリルを示す酸化型ウシβ−ラクトグロブ
リンの三次構造の図である。
【図９】 ウシβ−ラクトグロブリンのペプシン消化におけるチオレドキシン連結還元効
果を示すタンパク質染色されたＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真で
ある。
【図１０Ａ】 未処理牛乳の消化における時間の効果を示すタンパク質染色されたＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動ゲルの写真を表す。
【図１０Ｂ】 ５５℃で起こったチオレドキシン連結還元後の牛乳の消化における時間の効果
を示すタンパク質染色されたＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真を表
す。
【図１０Ｃ】 ４℃で起こったチオレドキシン連結還元後の牛乳の消化における時間の効果を
示すタンパク質染色されたＳＤＳポリアリルアミド電気泳動ゲルの写真を表す。
【図１１Ａ】 牛乳に対して高感受性のイヌの皮膚試験応答のチオレドキシン連結緩和を示す
棒グラフである。
【図１１Ｂ】 牛乳に対して低感受性のイヌの皮膚試験応答のチオレドキシン連結緩和を示す
棒グラフである。
【図１２Ａ】 β−ラクトグロブリンのアレルゲン性に及ぼすチオレドキシン−連結還元及び
消化性の効果を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】 牛乳のアレルゲン性に及ぼすチオレドキシン−連結還元及び消化性の効果を示
す棒グラフである。
【図１３】 マウス抗体(ＭＡｂ)エピトープを示す酸化型ウシβ−ラクトグロブリンの三次
構造の図である。
【図１４】 シスチン突然変異誘発後に予測されるモノクローナル抗体エピトープの変化を
示すウシβ−ラクトグロブリンの三次構造のコンピューター生成分子モデルのグ
ラフィックである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｌ 1/305 Ａ２３Ｌ 1/305 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 1111 Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ, 12ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｏａｋｌａｎｄ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 94607−5200，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒ ｉｃａ (72)発明者 デル ヴァル グレゴリオ スイス ツェーハー2024 サン オーバン クレ ド ラ ファン 24 (72)発明者 ロサノ ロサ エメ スペイン エ−28937 モストレス オリ ヴォス ド ペフィアネヴァーダ ５− ＃８ア (72)発明者 イアオ イン アン アメリカ合衆国 フロリダ州 33326− 3529 フォート ローダーデイル ウェス ト ベイリッジ ドライヴ 121 (72)発明者 ウォン ジョシュア エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080 サウス サン フランシスコ ヴ ィューモント テラス ９ (72)発明者 イェー ボイホン シー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94598 ウォルナット クリーク プリム ローズ レーン 3215 Ｆターム(参考） 2B150 AA06 AB20 DC23 4B001 AC05 AC32 BC01 EC05 4B018 LB01 LB04 LB06 LB07 MD20 MD90 ME07 ME11 MF12

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 食品の消化性を増加する方法であって、 (a)食品を、該食品の消化性を増加させるのに効果的な量のチオレドキシン、N
    TR及びNADPHで処理する工程、及び、 (b)工程(a)の処理食品を動物へ投与して、該動物が示す症状により測定される
    該食品の消化性を、対照と比較して増加させる工程 を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 該食品中のタンパク質1gあたりのチオレドキシン量が約0.01
    mg〜4.0mgであり、NTR量が約0.01mg〜4.0mgであり、NADPH量が約1μmol〜250μm
    olである、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該食品中のタンパク質1gあたりのチオレドキシン量が約0.05
    mg〜2.0mgであり、NTR量が約0.10mg〜2.0mgであり、NADPH量が約10μmol〜100μ
    molである、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 該食品中のタンパク質1gあたりのチオレドキシン量が少なく
    とも約0.01mgであり、NTR量が少なくとも約0.01mgであり、NADPH量が少なくとも
    約1μmolである、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 該食品がミルク又はコムギを含んでいる、請求項１に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 該食品がミルクである、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 添加したチオレドキシン、NTR及び添加したNADPHに由来する
    NADPを含むことを特徴とする高消化性食品。
  8. 【請求項８】 該食品中のタンパク質1gあたりにチオレドキシンを２mgより
    多く含むことを特徴とする食品。
  9. 【請求項９】 チオレドキシン、NTR及びNADPHで処理したことを特徴とする
    高消化性食品。
  10. 【請求項１０】 チオレドキシン、NTR及びNADPHで処理したことを特徴とす
    る高消化性ミルク。
  11. 【請求項１１】 チオレドキシン及びチオレドキシン還元剤で処理したこと
    を特徴とする高消化性食品。
  12. 【請求項１２】 1以上の分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質のタ ンパク質分解を増加させる方法であって、 (a)該タンパク質と有効量の還元チオレドキシン又はDTTとをチオール酸化還元
    タンパク質の存在下で接触させる工程、 (b)該接触を、該タンパク質中の1以上のジスルフィド結合を還元するのに十分
    な時間維持して、該タンパク質を還元する工程、及び、 (c)工程(b)を経た該タンパク質とタンパク質分解酵素とを接触させて、該チオ
    レドキシン処理タンパク質のタンパク質分解を対照と比較して増加させる工程、
    を含むことを特徴とする方法。
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