JP2001520003A - Ｕｃｐ３遺伝子発現のレギュレーター - Google Patents

Ｕｃｐ３遺伝子発現のレギュレーター

Info

Publication number
JP2001520003A
JP2001520003A JP2000516010A JP2000516010A JP2001520003A JP 2001520003 A JP2001520003 A JP 2001520003A JP 2000516010 A JP2000516010 A JP 2000516010A JP 2000516010 A JP2000516010 A JP 2000516010A JP 2001520003 A JP2001520003 A JP 2001520003A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
nucleotides
ucp3
gene
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000516010A
Other languages
English (en)
Inventor
アマラル，エム．，キャサリン
ジャン，ニン
チェン，ジン−ロン
Original Assignee
トゥラリック インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by トゥラリック インコーポレイテッド filed Critical トゥラリック インコーポレイテッド
Publication of JP2001520003A publication Critical patent/JP2001520003A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なＵＣＰ３転写レギュレーターを含むＵＣＰ３遺伝子転写のレギュレーターに関する。ＵＣＰ３遺伝子プロモーターは診断法及び製剤開発において使用される。特に、レポーターと作用可能に結合したＵＣＰ３遺伝子プロモーターを含んでなるトランスフェクト細胞は高処理製薬スクリーニングに使用される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 この発明の分野はＵＣＰ３遺伝子の転写プロモーターとドラッグスクリーニン
グにおけるその使用である。
【０００２】背景 脱共役タンパク質(Uncoupling protein: UCP1)と呼ばれるミトコンドリアタン
パク質は体のエネルギー利用調節において重要な役割を担っていると考えられて
いる。このような調節は、体重、食欲、糖代謝、体温、免疫応答等々を含む広範
な生理的制御をもたらす。機構的には、ＵＣＰ１は、他の如何なるエネルギー消
費プロセスにもカップリングしないで、褐色脂肪組織中のミトコンドリア内膜を
横切るプロトン電気化学勾配の放散を許容する経路をつくりだすと考えられてい
る(レビューには、NicholisとLocke (1984) Physiol Rev 64, 1-64を参照された
い)。不幸にも、人々、ウシ、ブタ等々のような大きな成体哺乳動物における体 重調節のような生理学におけるＵＣＰ１の役割は、そのような動物には褐色脂肪
組織がほとんどないので、制限されていると思われる。
【０００３】 ＵＣＰ２は、大きな成体哺乳動物に更により広範に発現される第２の関連した
脱共役タンパク質である(例えば、Fleuryら(1997) Nature Genetics 15, 269-27
2及びTartagliaら(1996) WO96/05861を参照されたい)。エネルギー利用一般、特
に糖尿病と肥満症における役割と一致して、ＵＣＰ２遺伝子は、脂肪摂食に応答
してアップレギュレートされ、高インスリン血症及び肥満症に関連したヒト及び
マウスゲノム領域に遺伝子座が決定される。したがって、この遺伝子のアップレ
ギュレーターはこれらの病気の治療にとって有望視される。ＵＣＰ２遺伝子発現
のレギュレーターを提供するために、我々は、ヒトＵＣＰ２遺伝子の内因性プロ
モーターをクローニングし、転写制御活性を持つ様々な欠失変異体を同定した（
１９９７年４月２５日出願の米国特許出願第０８／８４６０１２号）。
【０００４】 ＵＣＰ３は、大きな成体哺乳動物にまた広範に発現される第３の関連した脱共役
タンパク質である。したがって、この遺伝子のアップレギュレーターは高インス
リン血症や肥満症といった病気の治療に対し大いに有望視される。ＵＣＰ３遺伝
子発現のレギュレーターを提供するために、我々は、天然ＵＣＰ３遺伝子の内因
性プロモーターをクローニングし、転写制御活性を持つ様々な欠失変異体を同定
した。
【０００５】発明の概要 本発明は、ＵＣＰ３遺伝子転写プロモーターに関する方法及び組成物を提供す
る。該組成物は、配列番号：１及び２のうちの少なくとも１つのＵＣＰ３プロモ
ーター、又は少なくとも５０ｂｐの長さでシス転写制御活性を持つその欠失変異
体を含んでなる遺伝子発現の組換えレギュレーターを含む。そのような欠失変異
体で例示的なものは、配列番号：１の塩基４１１−４６０、塩基４６１−５１０
、塩基４０１−５６３、塩基３１９−３２６、塩基９８−１０４、塩基４９−５
６、塩基４９−１０４及び塩基５４７−５５４の少なくとも１つを含んでなる。
好ましい実施態様では、レギュレーターはＧＣ／ＳＰ１、ＧＨ−ＴＲＥ及びＰＲ
／ＧＲ結合部位の少なくとも１つを含む。更なる実施態様では、レギュレーター
は５'非翻訳ＵＣＰ３遺伝子エキソンを含む。しばしば、レギュレーターは上記 変異体と作用可能に結合したＵＣＰ３又は非ＵＣＰ３コアプロモーターを更に含
みうる。
【０００６】 本発明はまた配列番号：１又は２に含まれたこれまでに新規なＵＣＰ３特異的
配列（その補体及び類似体及び例えばＤＮＡにおける対応する配列を持つその補
体を含む)を有し、それに対しての特異的ハイブリダイゼーションを行う（すな わち、ゲノムＤＮＡの存在下で対応する配列番号：１又は２と特異的にハイブリ
ダイズする）のに十分なハイブリダイゼーションプローブ及び複製／増幅プライ
マーを提供する。そのようなプライマー又はプローブは少なくとも１２、好まし
くは少なくとも２４、更に好ましくは３６塩基長である。
【０００７】 本発明はまた開示されたＵＣＰ３レギュレーターを含んでなる細胞及びベクタ
ーを提供し、これらには非ＵＣＰ３遺伝子と作用可能に結合したかかるレギュレ
ーターを含んでなる細胞が含まれる。そのような細胞は、ＵＣＰ３プロモーター
の活性を制御する薬剤を同定するための開示方法において使用される。そのよう
な方法の一例としては、上記薬剤が存在しない場合に遺伝子が第一の発現を示す
条件下で細胞を候補薬剤と接触させ；遺伝子の第二の発現の存在を検出するもの
で、ここで、上記第一の発現と第二の発現の差異により、上記薬剤がＵＣＰ３遺
伝子プロモーターの活性を制御することが示される。
【０００８】 本発明はまた、転写複合体形成アッセイを含む転写レギュレーターの他のアッ
セイを提供する。そのようなアッセイの例としては、候補薬剤が存在しない場合
にレギュレーターと転写因子が第一の会合を形成する条件下で、開示されたレギ
ュレーターを含んでなるＤＮＡを転写因子と候補薬剤と組み合わせ；レギュレー
ターと転写因子の第二の会合の存在を検出することを含み、ここで第一の会合と
第二の会合の差異により、薬剤がＵＣＰ３プロモーターと転写因子の会合を変調
することが示されるものが含まれる。主題の核酸レギュレーターは、診断法にお
ける使用を含む、その他の様々な用途を有している。特に、開示されたプロモー
ター由来のハイブリダイゼーションプローブとＰＣＲプライマーがＵＣＰ３遺伝
子を含む試料中の遺伝子変異を同定するために使用される。
【０００９】発明の詳細な記載 主題の核酸は合成／非天然配列のものか及び／又は単離される、すなわち、天
然の状態で付随している物質の少なくとも幾らかを伴わず、この量は、与えられ
た画分中に存在する全核酸の重量の好ましくは少なくとも約０．５％，より好ま
しくは少なくとも約５％を構成し、通常は、天然染色体上で結合しているもの以
外のヌクレオチド（群）に結合した天然配列又は非天然配列を含んでなることを
意味する組換え体である。配列番号：１及び２の核酸配列又はそのフラグメント
を含んでなる核酸は、そのような配列又はフラグメントを、天然染色体上で結合
しているもの以外の配列が直ぐ隣に位置している末端か、天然染色体上で結合し
ているもの以外の配列が直ぐ隣に位置しているか末端にある１０ｋｂ、好ましく
は２ｋｂよりも小さい負のフランキング領域が隣に位置している末端に含んでい
る。核酸は通常はＲＮＡもしくはＤＮＡであるが、他の塩基又はヌクレオチド類
似体を含んでなる核酸を使用して安定性を修正する等々もしばしば好適である。
【００１０】 主題の核酸は広い利用範囲を有し、これにはハイブリダイゼーションプローブ
、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等々としての用途；ＵＣＰ３遺伝子及び遺伝子
転写物の存在を検出するための用途、更なるＵＣＰ３相同体及び構造的類似体を
コードする核酸を検出しまたは増幅するための用途、遺伝子療法での応用や様々
なスクリーニングアッセイでの用途が含まれる。
【００１１】 診断法においては、ＵＣＰ３プロモーター特異的ハイブリダイゼーションプロ
ーブが臨床及び研究用試料中の野生型または変異体ＵＣＰ３対立遺伝子を同定す
る際に使用される。変異誘発遺伝子は高処理の臨床診断法のための対立遺伝子特
異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを産生するために使用される。治療
法では、治療用ＵＣＰ３核酸が活性ＵＣＰ３の細胞発現又は細胞内濃度又は利用
能を変調するために使用される。例えばＵＣＰ３核酸は活性なＵＣＰ３タンパク
質の細胞発現又は細胞内濃度又は利用能を変調するために使用される。ＵＣＰ３
抑制核酸は典型的にはアンチセンスで、開示された天然ＵＣＰ３転写物配列の補
体を含んでなる一本鎖配列、特に非翻訳エキソン１である。与えられたＵＣＰ３
タンパク質の発現のアンチセンス変調には遺伝子制御配列と作用可能に結合した
アンチセンス核酸を用いてもよい。遺伝子の転写がｍＲＮＡをコードする内因性
ＵＣＰ３と結合することができるアンチセンス転写物を産出するように配向され
たプロモーター配列を持つＵＣＰ３配列を含んでなるベクターによって細胞をト
ランスフェクトする。あるいは、ＵＣＰ３タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ
又はｍＲＮＡと結合する一本鎖アンチセンス核酸を、宿主中の又は宿主から一時
的に単離された標的細胞に、標的タンパク質の発現を大幅に減少させる濃度にて
投与してもよい。ＵＣＰ３発現の増強は、対応する遺伝子産物の機能的発現を増
加させるＵＣＰ３核酸を標的細胞型内に導入することにより行われる。そのよう
な核酸はＵＣＰ３発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能的発現をアップレギュ
レートするベクター、又は変異誘発遺伝子の標的補正のための置換ベクターであ
ってもよい。核酸を生細胞に導入する技術は当該分野において知られており、レ
トロウィルスベースのトランスフェクション、ウィルスコートタンパク質リポゾ
ーム媒介トランスフェクション等々が含まれる。
【００１２】 本発明はＵＣＰ３遺伝子転写のレベルで活性な薬理学上の薬剤又は薬剤のリー
ド化合物を同定するための効果的な方法を提供する。当該方法は、リード化合物
のための化学ライブラリの自動化されたコスト効率の良い高処理スクリーニング
に受け入れられる。転写レギュレーターに対する非常に多様なアッセイが提供さ
れており、これには細胞ベース転写アッセイ、プロモーター−タンパク質結合ア
ッセイ等々が含まれる。例えば、開示されたルシフェラーゼレポータ作成物が、
細胞ベースの転写アッセイのためにＨｅＬａ細胞のような細胞をトランスフェク
トする目的で使用される。具体的には、ＨｅＬａ細胞がマイクロタイタープレー
トに蒔かれ、ルシフェラーゼ発現によるモニターにより、ＵＣＰ３遺伝子プロモ
ーターの転写制御を変調するリード化合物に対しての候補薬剤ライブラリをスク
リーニングするために使用される。例示的なプロモーター−タンパク質結合アッ
セイは以下に記述する。以下の実施例、すなわち例示的なプロモーター欠失変異
体及びスクリーニングアッセイは例証のために提供するもので、本発明を限定す
るものではない。
【００１３】実施例 培養ＨｅＬａ細胞のトランスフェクション 一過性トランスフェクションを、リン酸カルシウム沈降法により培養ＨｅＬａ
細胞を用いて実施した。５ｕｇのプロモーター−ルシフェラーゼプラズミドＤＮ
Ａを、１ｕｇのｐＭＳＶ発現ベクター又は１ｕｇのｐＭＳＶ−ＴＲ発現ベクター
の何れかと共に同時形質移入させた。試料は２ｕｇのサケ精子ＤＮＡ及び０．２
ｕｇのβガラクトシダ−ゼ内部参照発現ベクターと共に共沈させ、６ウェルの細
胞培養皿内の接着ＨｅＬａ細胞の上に塗布した。１６時間後、細胞をリン酸緩衝
食塩水で洗浄し、１０％のウシ胎児血清が補充された新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２培
地を再供給した。更に２４時間後、製造社（プロメガ）の推奨に従って細胞を収
集し、溶解し、ルシフェラーゼ及びβガラクトシダ−ゼ酵素活性を検定した。
【００１４】ヒト及びマウスＵＣＰ３ゲノムクローンの単離 ヒト及びマウスのＵＣＰ３遺伝子のプロモーター領域、第一エキソン及び残り
の５'非翻訳領域を含むゲノムクローンを、ｈＵＣＰ３及びｍＵＣＰ３コード配 列由来のＰＣＲ増幅プローブを用いるバクテリオファージｌライブラリのハイブ
リダイゼーションスクリーニングにより得た。クローンは更に、ＲＡＣＥ ＰＣ Ｒ増幅によって得られた、５'非翻訳領域配列由来のＰＣＲプローブを用いた再 度のハイブリダイゼーションにより確認した。ゲノムクローンは、pBluescript
KSII（ストラタジーン）中にサブクローニングされ、アプライドバイオシステム
（Applied Biosystems）ＤＮＡシークエンサーを用いて配列決定した。プロモー
ター配列については、ＮＣＢＩサーバーでＢＬＡＳＴ検索を行った；その結果、
既知の如何なる配列に対しても相同性が見出されなかった。インデントされて保
存されたオリゴヌクレオチド（表１のアラインメントを参照）がＵＣＰ３遺伝子
に対するプライマー及びプローブに使用された。
【００１５】 ヒト及びマウスのＵＣＰ３遺伝子における第一非翻訳エキソン及び上流ＤＮＡ
のＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号：１及び２に示す。ヒト及びマウス遺伝子に対
して多数の転写因子結合部位、スプライス部位及び転写開始部位が表１及び２に
それぞれ示されている。 表１−ヒトＵＣＰ３遺伝子転写開始、スプライス及び因子結合部位。 配列番号：１ 配列番号：１ 部位 ヌクレオチド 部位 ヌクレオチド c-Myc 1132-1138 HiNF-A 1115-1121 IBP-1 1355-1360 AP-2 961-968 C/EBP 1006-1013 HC3 269-274 NF-IL6 266-274 GCF 396-403 GH-CSE2 843-849 GH-CSE1 853-859 HNF5 566-572 GR 602-1607 AP-1 1944-1950 AP-2 1525-1532 開始部位 1461,1399-1548 イントロンI 1549-2000
【００１６】 表２−マウスＵＣＰ３遺伝子転写開始、スプライス及び因子結合部位。 配列番号：２ 配列番号：２ 部位 ヌクレオチド 部位 ヌクレオチド c-Myc 4716-4722 MyoD 4675-4681 ガンマIRE 4851-4859 NF-kB 4701-4712 PR 4861-4869 NFIL6 4405-4414 C/EBP 4287-4295 MyoD 3929-3935 SRF 3915-3925 AP-2 3706-3714 NF-IL6 3204-3214 p53 3062-3072 HiNF-A 2968-2976 b-α-tabuli 2801-2810 AP-1 2410-2418 GH-CSE1 1974-1982 インスリン応答性 1152-1159 CREB 791-799 AP-2 293-301 GcF 4996-5003 ApoE-B2 5381-5393 開始 4935-4948 エキソン 4935-5080 イントロン 5081-5436
【００１７】欠失変異体作成及び活性分析 ヒトＵＣＰ３遺伝子及び様々なその欠失変異体の５'フランキング領域のプロ モーター活性は、哺乳動物株化細胞を用いる一過性トランスフェクションアッセ
イにおいて簡便にスクリーニングされる。例示されるアッセイは、図１及び２の
ＨｅＬａ細胞ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイである。選択されたプ
ロモーター欠失を標的プライマーを用いたＰＣＲにより増幅する。実証された欠
失に対する増幅プライマー対を以下に示す。 タグ／未タグ ヌクレオチドエンドヌクレア−ゼ部位 配列 att-Mlu1 ATTACGCGT att-Hind III ATTAGCTT att-EcoR１ ATTGAATTC Mlu1(core) CGCG
【０００１８】 H1: att-Mlu1-(配列番号:1、ヌクレオチド 1-20) att-Hind III(配列番号:1の逆補体、ヌクレオチド 1981-2000) H2 att-Mlu1-(配列番号:1、ヌクレオチド 1-20) att-Hind III-(配列番号:1の逆補体、ヌクレオチド 1529-1548) H3 att-Mlu1-(配列番号:1、ヌクレオチド 200-219) att-Hind III-(配列番号:1の逆補体、ヌクレオチド 1529-1548) H4 att-Mlu1-(配列番号:1、ヌクレオチド 1091-1110) att-Hind III-(配列番号:1の逆補体、ヌクレオチド 1529-1548) H5 att-Mlu1-(配列番号:1、ヌクレオチド 1286-1306) att-Hind III-(配列番号:1の逆補体、ヌクレオチド 1529-1548) H6 att-Mlu1-(配列番号:1、ヌクレオチド 1462-1482) att-Hind III-(配列番号:1の逆補体、ヌクレオチド 1529-1548) H7 att-Mlu1-(配列番号:1、ヌクレオチド 1-20) att-Hind III-(配列番号:1の逆補体、ヌクレオチド 1068-1090) H8 att-Mlu1-(配列番号:1、ヌクレオチド 1286-1306) att-Hind III-(配列番号:1の逆補体、ヌクレオチド 1441-1461) M1 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 1-25) att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5411-5436) M2 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 1-25) att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5054-5080) M3 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 3751-3778) att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5054-5080) M4 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 3940-3967) att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5054-5080) M5 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 4581-4612) att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5054-5080) M6 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 4840-4867) att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5054-5080) M7 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 4930-4958) att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5054-5080)
【００１９】 欠失は任意の所望の変形形に組換えられ得る。例えば、内部欠失は、ライゲー
ションが続く５'及び３'欠失の双方を増幅することにより、直ぐに調製される。
あるいは、ＵＣＰ３プロモーター欠失は非ＵＣＰ３プロモーターエレメントと融
合されて、異種混成プロモーターを形成しうる。内部欠失および異種混成作成物
は次のように例示される： M8 1a及び1b対; 2a及びb対 1a. att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 1-25) 1b. att-EcoR1-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 3727-3751) 2a. att-EcoR1-(配列番号:2、ヌクレオチド 4840-4870) 2b. att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5054-5080) M9 1a. att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 3249-3274) 1b. att-EcoR1-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 3727-3751) 2a. att-EcoR1-(配列番号:2、ヌクレオチド 4840-4870) 2b. att-Hind III-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 5054-5080) M10 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 1-25) att-EcoR1-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 3727-3751) M11 att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 3940-3967) att-EcoR1-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 4910-4935) M12 1a. att-Mlu1-(配列番号:2、ヌクレオチド 3940-3967) 1b. att-EcoR1-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 4823-4842) 2a. att-EcoR1-(配列番号:2、ヌクレオチド 4863-4887) 2b. att-EcoR1-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 4910-4935) M13及びM14- ＰＣＲをアニールしないオリゴ Mlu１-(配列番号:2、ヌクレオチド 4843-4862) Mlu１-(配列番号:2の逆補体、ヌクレオチド 4843-4862)
【００２０】 ＰＣＲフラグメントはMluI及びHindIIIにより消化される制限酵素であり、pGL
-2B又はpGL-2P（プロメガ）のMluI及びHindIII部位にサブクローニングされる。
リン酸カルシウム沈降法により培養されたＨｅＬａ細胞を用いて一過性トランス
フェクションが実施される。４０時間後、細胞を収集し、溶解し、ルシフェラー
ゼ活性を検定する。例示的な突然変異体を、ある範囲の転写活性について示す（
図１、２）。
【００２１】AP-２-ＵＣＰ３遺伝子プロモーター結合アッセイに対するプロトコール Ａ． 試薬： −ニュートラライトアビジン：ＰＢＳ中に２０μｇ／ｍｌ。 −阻害バッファー：ＰＢＳ中に５％のＢＳＡ、０．５％のトウィーン２０
；室温で１時間。 −アッセイバッファー：１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．６、０.２５ｍＭのEDTA、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、 ５０ｍＭのBME、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。 − ３３Ｐ AP-2 １０ｘストック：２００,０００−２５０,０００ｃｐｍの
標識AP-2（ベックマンカウンター）が補填された１０−6−１０−8Ｍの「非放射
性」AP-2。スクリーニングの間に４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。 −プロテアーゼ阻害剤カクテル（１０００Ｘ）：１０ｍｌのＰＢＳ中に１
０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン
（ＢＭＢ＃２３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ−６５０６
）、２５ｍｇのロイペプチン（ＢＭＢ＃１０１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳ
Ｆ（ＢＭＢ＃９１７５７５）、及び２ｍＭのＮａＶｏ３（シグマ＃Ｓ−６５０８
）。 −オリゴヌクレオチド保存：（特異的ビオチン化）。ビオチン化オリゴ１
７pmol/μｌ、AP-2部位を含むＵＣＰ３遺伝子プロモーター：(BIOTIN)-(配列番 号：１の塩基９５０−９７０)。
【００２２】 Ｂ． アッセイプレートの調製： −４℃で一晩かけてウェル当り１２０μｌの保存Ｎ−アビジンでコーティ
ング。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。 −１５０μｌの阻害バッファーで阻害。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。
【００２３】 Ｃ． アッセイ： −４０μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。 −１０μｌの化合物又は抽出物を添加。 −１０μｌの３３Ｐ−AP−２（２０,０００−２５,０００ｃｐｍ／０．１
−１０ｐｍｏｌ／ウェル＝１０−９−１０−７Ｍ最終濃度）を添加。 −２５℃で１５分間振とう。 −２５℃で更に４５分間インキュベート。 −４０μＭのオリゴ混合物（１ngのｓｓ−DNAと共にアッセイバッファー 中に１.０ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −室温で１時間インキュベート −２００μｌのＰＢＳで４回洗浄することにより反応を停止。 −１５０μｌのシンチレーションカクテルを添加。 −トップカウントをカウント。
【００２４】 Ｄ． （各プレート上にある）全アッセイ用の対照： ａ．非特異的結合（オリゴ非添加）。 ｂ．８０％阻害で特異的な可溶性オリゴ。
【００２５】 本明細書において引用した刊行物と特許出願の全てを、あたかもそれぞれ個々
の刊行物又は特許出願が出典明示により特にここに取り込まれることが示されて
いるように、出典明示によりここに取り込む。前記の発明の理解を容易にするた
めに例証と実施例によりある程度詳細に記載したが、この発明の教示に照らせば
、添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、ある変更と修正を行って
もよいことは当業者であれば容易に分かるであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣａＰＯ4が形質移入されたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラー ゼ酵素活性の発現を誘発するｈＵＣＰ３プロモーター作成物を示す。細胞はトラ
ンスフェクション１８時間後に収集し、ルシフェラーゼを検定した。
【図２】 ＣａＰＯ4が形質移入されたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラー ゼ酵素活性の発現を誘発するｈＵＣＰ３プロモーター作成物を示す。細胞はトラ
ンスフェクション１８時間後に収集し、ルシフェラーゼを検定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジャン，ニン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94080, サウス サンフランシスコ，コーポレイト ドライブ ２，トゥラリック インコー ポレイテッド内 (72)発明者 チェン，ジン−ロン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94080, サウス サンフランシスコ，コーポレイト ドライブ ２，トゥラリック インコー ポレイテッド内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR56 QR60 QR62 QR77 QR80 QS34 QS36 4B065 AA01X AA57X AA87X AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA44 CA46

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：１又は２を含んでなるか、又は少なくとも５０ｂ
    ｐの長さであって、配列番号：１のヌクレオチド４１１−４６０；配列番号：１
    のヌクレオチド４６１−５１０；配列番号：１のヌクレオチド４０１−５６３；
    配列暗号：１のヌクレオチド３１９−３２６；配列番号１のヌクレオチド９８−
    １０４；配列番号：１のヌクレオチド４９−５６；配列番号：１のヌクレオチド
    ４９−１０４；配列番号：１のヌクレオチド５４７−５５４；配列番号：１のヌ
    クレオチド１−１５４８；配列番号：１のヌクレオチド２００−１５４８；配列
    番号：１のヌクレオチド１０９０−１５４８；配列番号：１のヌクレオチド１２
    ８５−１５４８；配列番号：１のヌクレオチド１−１０９０；配列番号：１のヌ
    クレオチド１２８５−１４６１；配列番号：２のヌクレオチド１−５０８０；配
    列番号：２のヌクレオチド３７５１−５０８０；配列番号：２のヌクレオチド３
    ９４０−５０８０；配列番号：２のヌクレオチド４５８０−５０８０；配列番号
    ：２のヌクレオチド４８４０−５０８０；配列番号：２のヌクレオチド１−３５
    ７１；配列番号：２のヌクレオチド３９４０−４９３５；及び配列番号：２のヌ
    クレオチド４８４３−４８６２の少なくとも１つを含み、シス転写制御活性を持
    つそのフラグメントを含んでなる組換え又は単離された核酸。
  2. 【請求項２】 配列番号：１のヌクレオチド４１１−４６０；配列番号：１
    のヌクレオチド４６１−５１０；配列番号：１のヌクレオチド４０１−５６３；
    配列番号：１のヌクレオチド４９−１０４；配列番号：１のヌクレオチド１−１
    ５４８；配列番号：１のヌクレオチド２００−１５４８；配列番号：１のヌクレ
    オチド１０９０−１５４８；配列番号：１のヌクレオチド１２８５−１５４８；
    配列番号：１のヌクレオチド１−１０９０；配列番号：１のヌクレオチド１２８
    ５−１４６１；配列番号：２のヌクレオチド１−５０８０；配列番号：２のヌク
    レオチド３７５１−５０８０；配列番号：２のヌクレオチド３９４０−５０８０
    ；配列番号：２のヌクレオチド４５８０−５０８０；配列番号：２のヌクレオチ
    ド４８４０−５０８０；配列番号：２のヌクレオチド１−３５７１；および配列
    番号：２のヌクレオチド３９４０−４９３５の少なくとも１つを含んでなる、請
    求項１に記載の核酸。
  3. 【請求項３】 配列番号：１又は２を含んでなるか、又は少なくとも５０ｂ
    ｐの長さであって配列番号：１のヌクレオチド４０１−５６３；配列番号：１の
    ヌクレオチド１−１５４８；配列番号：１のヌクレオチド２００−１５４８；配
    列番号：１のヌクレオチド１−１０９０；配列番号２のヌクレオチド１−５０８
    ０；配列番号：２のヌクレオチド３７５１−５０８０；配列番号：２のヌクレオ
    チド３９４０−５０８０；配列番号：２のヌクレオチド４５８０−５０８０；配
    列番号：２のヌクレオチド４８４０−５０８０；配列番号：２のヌクレオチド１
    −３５７１；及び配列番号：２のヌクレオチド３９４０−４９３５の少なくとも
    １つを含んでなるそのフラグメントを含んでなる、請求項１に記載の核酸。
  4. 【請求項４】 配列番号：１又は２を含んでなる、請求項１に記載の核酸。
  5. 【請求項５】 表Ｉ又はＩＩの少なくとも１つの結合部位を含んでなる、請
    求項１に記載の核酸。
  6. 【請求項６】 非ＵＣＰ３コアプロモーターに作用可能に結合した請求項１
    に記載の核酸。
  7. 【請求項７】 ５'非翻訳ＵＣＰ３遺伝子エキソンを含んでなる、請求項１ に記載の核酸。
  8. 【請求項８】 非ＵＣＰ３遺伝子に作用可能に結合した請求項１に記載の核
    酸を含んでなる細胞。
  9. 【請求項９】 ＵＣＰ３転写レギュレーターと転写因子の会合を変調する薬
    剤の同定方法において、 請求項１に記載のレギュレーターと転写因子と候補薬剤とを、上記薬剤が存在
    しない場合に上記レギュレーターと上記転写因子が第一の会合を形成する条件下
    で、組み合わせる工程を含んでなり； 上記レギュレーターと上記転写因子の第二の会合の存在を検出し、 上記第一の会合と上記第二の会合の間の差異により、上記薬剤がＵＣＰ３転写
    レギュレーターと上記転写因子の会合を変調することが示される方法。
  10. 【請求項１０】 ＵＣＰ３転写レギュレーターの活性を制御する薬剤を同定
    する方法において、 請求項６に記載の細胞を、上記薬剤が存在しない場合に上記遺伝子が第一の発
    現を示す条件下で、候補薬剤に接触させ； 上記遺伝子の上記第二の発現の存在を検出する工程を含んでなり； 上記第一の発現と上記第二の発現の間の差異により、上記薬剤がＵＣＰ３遺伝
    子転写レギュレーターの活性を制御することが示される方法。
  11. 【請求項１１】 上記遺伝子がレポーターであり、上記検出工程が、該レポ
    ーターの比色又は発光シグナルを検出することを含んでなる、請求項１０に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 上記遺伝子が、上記遺伝子に特異的な核酸へのハイブリダ
    イゼーションにより検出される、請求項１０に記載の方法。
JP2000516010A 1997-10-09 1998-10-09 Ｕｃｐ３遺伝子発現のレギュレーター Pending JP2001520003A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/948,277 US5849581A (en) 1997-10-09 1997-10-09 Regulators of UCP3 gene expression
US08/948,277 1997-10-09
PCT/US1998/021443 WO1999019457A1 (en) 1997-10-09 1998-10-09 Regulators of ucp3 gene expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001520003A true JP2001520003A (ja) 2001-10-30

Family

ID=25487585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000516010A Pending JP2001520003A (ja) 1997-10-09 1998-10-09 Ｕｃｐ３遺伝子発現のレギュレーター

Country Status (6)

Country Link
US (2) US5849581A (ja)
EP (1) EP1027424A4 (ja)
JP (1) JP2001520003A (ja)
AU (1) AU726567B2 (ja)
CA (1) CA2303844A1 (ja)
WO (1) WO1999019457A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19838837A1 (de) * 1998-08-27 2000-03-02 Boehringer Ingelheim Int Zellspezifische Promoter des Entkopplungsproteins 3
WO2003002062A2 (en) 2001-06-29 2003-01-09 Tularik Inc. Bis-aryl thiazole derivatives
US20050004059A1 (en) * 2003-04-15 2005-01-06 Tularik Inc. Gene amplification and overexpression in cancer
US11279865B2 (en) 2017-09-11 2022-03-22 Saudi Arabian Oil Company Well treatment fluid having an acidic nanoparticle based dispersion, an epoxy resin, and a polyamine
US10683452B2 (en) 2017-09-11 2020-06-16 Saudi Arabian Oil Company Nanosilica dispersion for thermally insulating packer fluid
US10316238B2 (en) 2017-09-11 2019-06-11 Saudi Arabian Oil Company Nanosilica dispersion for thermally insulating packer fluid
US10233380B1 (en) 2017-09-11 2019-03-19 Saudi Arabian Oil Company Well treatment fluid having an acidic nanoparticle based dispersion and a polyamine

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665543A (en) * 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
WO1998045313A1 (en) * 1997-04-04 1998-10-15 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel uncoupling protein and methods of use
WO1998045438A1 (en) * 1997-04-09 1998-10-15 Beth Israel Deaconess Medical Center Ucp3: an uncoupling protein homologue
DE19838837A1 (de) * 1998-08-27 2000-03-02 Boehringer Ingelheim Int Zellspezifische Promoter des Entkopplungsproteins 3

Also Published As

Publication number Publication date
CA2303844A1 (en) 1999-04-22
EP1027424A1 (en) 2000-08-16
US5849581A (en) 1998-12-15
AU9798298A (en) 1999-05-03
AU726567B2 (en) 2000-11-09
WO1999019457A1 (en) 1999-04-22
US5976808A (en) 1999-11-02
EP1027424A4 (en) 2004-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. Nutritional and insulin regulation of fatty acid synthetase and leptin gene expression through ADD1/SREBP1.
Izumo et al. Thyroid hormone receptor α isoforms generated by alternative splicing differentially activate myosin HC gene transcription
Prabhu et al. Regulation of the expression of cyclin-dependent kinase inhibitor p21 by E2A and Id proteins
Chesnokov et al. p53 inhibits RNA polymerase III-directed transcription in a promoter-dependent manner
Lin et al. NF-1C, Sp1, and Sp3 are essential for transcription of the human gene for P450c17 (steroid 17α-hydroxylase/17, 20 lyase) in human adrenal NCI-H295A cells
JP2002528066A (ja) Ｔ細胞誘導性因子（ｔｉｆ）をコードする単離された核酸分子、コードされたタンパク質およびその使用
Fritz et al. RNA-binding protein RBMS3 is expressed in activated hepatic stellate cells and liver fibrosis and increases expression of transcription factor Prx1
Mao et al. STAT5 binding contributes to lactational stimulation of promoter III expressing the bovine acetyl-CoA carboxylase alpha-encoding gene in the mammary gland
JP2001512698A (ja) 新規な老化因子遺伝子ｐ２３の単離
Okubo et al. Down-regulation of promoter I. 3 activity of the human aromatase gene in breast tissue by zinc-finger protein, Snail (SnaH)
US5807740A (en) Regulators of UCP2 gene expression
Dentice et al. Pendrin is a novel in vivo downstream target gene of the TTF-1/Nkx-2.1 homeodomain transcription factor in differentiated thyroid cells
JP2001520003A (ja) Ｕｃｐ３遺伝子発現のレギュレーター
Jiang et al. Identification of Sp1 as the transcription factor for the alternative promoter P2 of the bovine growth hormone receptor gene
Nikovits et al. Isolation and characterization of an avian slow myosin heavy chain gene expressed during embryonic skeletal muscle fiber formation
Xu et al. Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor II (COUP-TFII) and hepatocyte nuclear factor 4gamma (HNF-4gamma) and HNF-4alpha regulate the bovine growth hormone receptor 1A promoter through a common DNA element
CN106831975B (zh) 热休克转录因子1在调控15kDa硒蛋白表达中的应用
Hayama et al. Isolation and characterization of the human CLC-5 chloride channel gene promoter
Malkki et al. The human hexokinase II gene promoter: functional characterization and detection of variants among patients with NIDDM
JP2003526321A (ja) 合成ベータ細胞による糖尿病の治療
Lenasi et al. Functional study of the equine β-casein and κ-casein gene promoters
Limesand et al. Purα, a single-stranded deoxyribonucleic acid binding protein, augments placental lactogen gene transcription
JP2002519059A (ja) ミオスタチン遺伝子の新規なプロモーター配列
Garami et al. An E-box motif conveys inhibitory activity on the atrial natriuretic peptide gene
Ono et al. HNF-1 regulates the liver-specific transcription of the chipmunk HP-20 gene

Legal Events

Date Code Title Description
A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20040406