JP2001519795A

JP2001519795A - 既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長の変調方法

Info

Publication number: JP2001519795A
Application number: JP54234998A
Authority: JP
Inventors: ヴォルフガンクシャーペル; ヴルフデーイトー
Original assignee: マックスプランクゲゼルシャフトツールフェルデルングデルヴィーセンシャフテンエーファウ
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 2001-10-23
Also published as: PT969877E; EP0969877B1; DE69811348T2; ATE232399T1; EP1304123A3; CA2284922A1; US6592862B1; WO1998044953A1; US20040023881A1; DE69811348D1; EP0969877A1; DK0969877T3; ES2187972T3; EP1304123A2

Abstract

(57)【要約】既存の細動脈連結からの側副動脈及び/またはその他の動脈の成長の変調が記載される。組織または細胞を単球走化性タンパク質(MCP)または前記MCPをコードする核酸分子と接触させることを特徴とする既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長の増進方法が提供される。更に、既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長を増進するための医薬組成物の調製のためのMCPまたは前記MCPをコードする核酸分子の使用が記載される。また、組織または細胞を単球の吸引により既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤と接触させることを特徴とする腫瘍の治療方法が提供される。また、腫瘍の治療用の医薬組成物の調製のための単球の吸引により既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤の使用が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長の変調方法本発明は一般に既存の細動脈連結からの側副動脈またはその他の動脈の成長の変調方法に関する。特に、本発明は組織または細胞を単球走化性タンパク質(MCP )または前記MCPをコードする核酸分子と接触させることを特徴とする既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長の増進方法を提供する。また、本発明は既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の側副成長を増進するための医薬組成物の調製のためのMCPまたは前記MCPをコードする核酸分子の使用に関する。更に、本発明は組織または細胞を単球の吸引により既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤と接触させることを特徴とする腫痘の治療方法に関する。更に、本発明は腫瘍の治療用の医薬組成物の調製のための単球の吸引により既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤の使用を伴う。動脈閉塞疾患の被験者の治療において、現行の治療戦略の殆どがそれらの作用を軽減することを目的とする。治癒的アプローチのみが血管形成（気球拡張）またはバイパス手術を伴う。前者は再狭窄の高いリスクを有し、虚血性心臓疾患のようなある種の動脈閉塞疾患にのみ行い得る。後者は観血的であり、またある種の動脈閉塞疾患に制限される。側副成長の増進に確立された治療はない。成体生物の血管成長は二つの異なるメカニズム、毛細管の成長開始(血管形成) 及び真の側副動脈への既存の細動脈連結のin situ拡大により進行する¹。最近の研究は主成分としての血管内皮成長因子(VEGF)による血管形成をもたらすメカニズムを開示していた^2-6。この特定の内皮マイトジェンはヒポキシアによりアップレギュレートされ、大腿動脈切除後にウサギ後肢に注入された時に血管成長を促進することができる^7,8。しかしながら、これらの研究は血管形成と称されるメカニズムである毛細管成長開始と、真の側副動脈成長を区別しなかった。VEGF は内皮細胞についてのみ分裂促進性であるが、側副動脈成長は内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖を必要とし、顕著なリモデリンクプロセスが生じる^1,9-12。更に、主として毛細管成長開始は、例えば、ブタ心臓中の虚血テリトリーまたは迅速に増殖している腫瘍中で観察される^1,3,13,14。しかしながら、真の側副動脈成長は研究された殆どのモデルで虚血から一時的かつ空間的に解離される。それ故、虚血テリトリー中の血管形成について記載されたような別のメカニズムまたは付加的なメカニズムが側副動脈成長を説明するのに必要とされる。先の研究から、これらの側副動脈は既存の細動脈連結から成長することが知られている¹。しかしながら、VEGF及びその他の成長因子の如き薬剤が動脈閉塞後の血管形成の発生を刺激するのに現在使用されているが、このような薬剤は真の側副動脈への既存の細動脈連結の成長を変調することができるとは考えられない。こうして、本発明の技術上の問題は既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長の変調のための医薬組成物及び方法を提供することである。この技術上の問題の解決が請求の範囲に特徴付けられる実施態様を提供することにより達成される。それ故、本発明は組織または細胞を単球走化性タンパク質(MCP)または前記MCP をコードする核酸分子と接触させることを特徴とする既存の細動脈連結からの側副動脈及ひ／またはその他の動脈の成長の増進方法に関する。本発明の目的のために、既存の細動脈連結からの動脈の成長はまた“動脈形成 ”と称される。特に、“動脈形成”は血液を虚血性組織、腫瘍または炎症の部位に供給する既存の細動脈連結からの内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖による動脈の in situ成長である。これらの血管は冒された組織の外部で大いに成長するが、血管形成プロセスによる疾患組織中で成長開始する毛細管よりも虚血テリトリー、腫瘍または炎症の部位への栄養の送出に極めて重要である。本発明の状況において、“単球走化性タンパク質”または“MCP”という用語は単球に作用して単球活性化蓄積及び移動の強化をもたらすことができるタンパク質及びペプチドを表す³⁵。こうして、本発明によれば、あらゆるMCPまたはMCP に機能上均等であり、即ち、単球を活性化し、吸引することができるその他の物質が本発明の目的に使用し得る。本発明に使用されるMCPの作用は上記特異性に制限されないかもしれないが、それらはまた、例えば、好酸球、リンパ球亜集団及び／または幹細胞に作用し得る。本発明によれば、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)による単球の吸引により、側副動脈の成長及び動脈形成が大腿動脈閉塞後に動物で有意に増進されることがわかった。本発明の範囲内で行った実験は、MCP-1の局所注入が内皮細胞及び／または平滑筋細胞に対する増殖作用と同時の単球蓄積の強化による増進された血管成長のために大腿動脈閉塞後に側副及び末梢のコンダクタンスの両方を増大することを実証する。こうして、MCPまたはMCPをコードする核酸分子が単球をある種の組織または細胞に吸引するのに使用でき、これが順に側副動脈の成長だけでなく、既存の細動脈連結からの動脈の成長（これは幾つかの閉塞性疾患の治癒に必要とされる）をもたらす。 MCP-1は血管平滑筋細胞及び内皮細胞を含む多くの細胞により分泌される14-kD a糖タンパク質であり^29-32、ナノモル以下の濃度で単球走化性を誘発する³³。MC P-1はβケモキンレセプターCCR2及びCCR4(これらは両方とも主として単球により発現されるが、また好塩基性細胞、Ｔリンパ球及びＢリンパ球に存在することがわかった)の強力なアゴニストである³⁴。これらのＧタンパク質結合された７膜貫通ドメインレセプターは単球の活性化及びインテグリンの増大された付着性をもたらし、そのプロセスは最終的に内皮細胞における単球静止をもたらす³⁵。MC P-1遺伝子は大きい種間相同性を示し³⁰、種々のサイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子α）及び免疫グロブリンＧにより誘発し得る³⁶。最近、MCP-1の遺伝子発現及びタンパク質分泌がまたせん断応力及び周期的歪によりアップレギュレートされることがin vitroで示された^16-18。これらの機械力は増大された単球付着をもたらす培養されたヒト内皮細胞中の単球走化性タンパク質-1(MCP-1)分泌を増大することが最近示された^16-18。これらの知見は、増殖インデックスが最高に増大される時に、単球がイヌ心臓中の冠状動脈狭窄の誘発後に側副動脈の血管壁に付着し、移動するという観察を補完する¹⁹。更に、単球蓄積はまた血管形成のブタミクロエンボリゼーションモデルで観察される²⁰。更に、MCP-1mRNAの増大されたレベルがミクロエンボライズされたブタ心筋の虚血性組織²¹だけでなく再灌流された虚血性心筋³⁷中に見られた。しかしながら、単球が血管形成に関係することを示す幾つかの論文^22-24が公表されているが、単球は側副動脈の発生及び動脈形成に役割を果たすとは考えられていなかった²⁵。本発明の方法及び使用に使用されるMCPは従来技術に記載された種々の源から得られる。例えば、Proosl⁶⁹、Dahinden⁷⁰、Alam⁷¹及びOppenheim⁷²を参照のこと。可能性が、機能性部分を含むMCPの種々の誘導体または上記のMCPに機能上均等であるタンパク質の調製について、組換えDNA技術の使用に存する。この状況において、この明細書に使用されるMCPの“機能性均等物”または“機能性部分 ”は単球を吸引する生物学的性質を少なくとも有するMCPの一次構造コンホメーションの一部または全部を有するタンパク質を意味する。前記タンパク質の機能性部分または機能上均等なタンパク質はアミノ酸欠失、例えば、基礎となるDNA の部位誘導突然変異誘発によるアミノ酸配列の置換、挿入、付加及び/または置換によるMCPの誘導体であってもよい。組換えDNA技術は当業壱に公知であり、例えば、Sambrookら(Molecular cloning;A Laboratory Manual,第２編，Cold Spri ng Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour NY(1989))に記載されている。例えば、Tyrへのアミノ酸Leu25及びVal27の突然変異がインターロイキン８（これは通常単球を活性化しない）に新規な単球ケモアトラクタント活性を導入することがわかった⁶⁶。 MCPもしくはその機能性部分またはMCPに機能上均等であるタンパク質は従来技術^69-72に記載されたアミノ酸及びDNA配列を使用する既知の通常の化学合成または組換え技術により生成されてもよく、例えば、MCPは調節配列の制御下の発現後にMCPもしくはその機能性部分またはMCPに機能上均等であるタンパク質をコードするDNA配列で形質転換された好適な細胞または細胞系を培養することにより生成されてもよい。組換えタンパク質の生成に適した技術が、例えば、Sambrook らの上記文献に記載されている。化学合成手段による本発明の方法及び使用に有益な上記のMCP及びタンパク質の構築方法がまた当業者に知られている。別の実施態様において、本発明は既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の側副の成長を増進するための医薬組成物の調製のための単球走化性タンパク質(MCP)または前記MCPをコードする核酸分子の使用に関する。医薬組成物は少なくとも一種の上記のMCP、及び必要により医薬上許される担体または賦形剤を含む。好適な医薬担体の例が当業界で公知であり、食塩加リン酸緩衝液、水、エマルション、例えば、油／水エマルション、種々の型の湿潤剤、滅菌液等が挙げられる。このような担体を含む組成物は通常の方法により製剤化し得る。医薬組成物は好適な投薬量で被験者に投与し得る。投薬レジメは担当医師により患者の状態、疾患の重度及びその他の臨床因子を考慮して決められてもよい。好適な組成物の投与は異なる方法、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与または皮内投与により行なわれてもよい。好ましい実施態様において、本発明の方法及び使用に使用される前記MCPはMCP -1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1αRANTES、J-309もしくはその他のあらゆるCC- ケモカインまたはN-ファルネシルペプチド、C5a、ロイコトリエンB4もしくは血小板活性化因子(PAF)^35,48のような古典的ケモアトラクタントからなる群から選ばれる。特に好ましい実施態様において、本発明の方法及び使用は、好ましくは冠状動脈疾患、脳閉塞疾患、末梢閉塞疾患、内臓閉塞疾患、腎臓動脈疾患及び隔膜動脈不全からなる群から選ばれる閉塞性疾患を患う被験者の治療のためである。更に好ましい実施態様において、本発明の方法及び使用は動脈を損傷または破壊する薬剤もしくは放射線または手術措置への暴露の間またはその後の被験者の治療のためである。好ましい実施態様において、本発明の方法及び使用に使用されるMCPは組換えM CPである。本発明の方法及び使用に使用し得るMCPをコードするDNA配列は従来技術、例えば、Garcia-Zepeda³⁴に記載されている。更に、MCPのDNA配列及びアミノ酸配列はGene Bankデータベースで入手し得る。上記のように、組換えタンパク質の生成方法は当業者に公知である。例えば、Sambrookの上記文献を参照のこと。更に好ましい実施態様において、医薬組成物は成長因子、好ましくは繊維芽細胞成長因子または血管内皮成長因子(VEGF)と連係の投与に設計される。この実施態様は毛細管の成長開始（血管形成）及び真の側副動脈への既存の細動脈連結の in situ拡大の両方の増進に特に適している。例えば、MCP-1の如きMCP、及びVEG Fの如き成長因子を含む医薬組成物が末梢血管疾患または冠状動脈疾患の治療に使用し得る。別の好ましい実施態様において、本発明の方法は (a)細胞を被験者から得、 (b)MCPをコードする核酸分子を前記細胞に導入し、それにより単球の吸引に適した形態のMCPの発現及び分泌を与え、そして (c)工程(b)で得られた細胞を被験者に再度導入することを特徴とする。 MCP及びMCPをコードする核酸分子は単独または組み合わせて、また必要により医薬上許される担体または賦形剤と一緒に投与されることが本発明により考えられる。前記核酸分子は細胞のゲノムに安定に組み込まれてもよく、または染色体外の形態で維持されてもよい。一方では、ウイルスベクターがある種の細胞または組織、好ましくは既存の細動脈連結の周囲の細胞及び組織をトランスフェクトするのに使用し得る。核酸分子及び/またはタンパク質を特定の細胞にターゲティングすることができる要素が従来技術、例えば、Somia，Proc．Natl．Acad．S ci.,USA92(1995),7570-7574に記載されている。こうして、本発明の方法及び使用を体細胞遺伝子治療に使用することが可能であり、これはex vivo技術またはi n vivo技術による細胞への機能性遺伝子の導入に基いており、これは遺伝子移入の最も重要な応用の一つである。例えば、Schaper⁷³及びその中に引用された文献を参照のこと。こうして、好ましい実施態様において、本発明の使用のための医薬組成物に含まれる核酸分子は、例えば、前記核酸分子の直接導入または前記核酸分子を含むプラスミド、リポソーム中のプラスミド、もしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）の導入による単球の吸引に適した形態でin v ivoの細胞によるMCPの発現及び分泌のために設計される。先に説明したように、既存の細動脈連結からの動脈の成長は腫瘍への栄養の送出に必須である。こうして、腫瘍への前記血管の成長が抑止される場合、腫瘍増殖の抑止及び/または抑制が予想されるべきである。それ故、本発明はまた組織または細胞を単球の吸引により既存の細動脈連結からの側副動脈及び/またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤と接触させることを特徴とする腫瘍の治療方法に関する。既存の細動脈連結からの側副動脈及び/またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤はペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さい有機分子、ホルモン、神経伝達物質、ペプチド擬態、またはPNA（Mihler,Nature Medicine 1(1995),879- 880;Hupp,Cell 83(1995),237-245;Gibbs,Cell 79(1994),193-198）であってもよい。更に、本発明は胛痙の治療用の医薬組成物の調製のための単球の吸引により既存の細動脈連結からの側副動脈及び/またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤の使用に関する。好ましい実施態様において、上記の本発明の方法及び使用に使用される薬剤は MCPの生物活性を抑制し、かつ/またはMCPのレセプターにより単球中で誘発される細胞内シグナルを抑制し、好ましくは前記薬剤はMCPとそのレセプターの相互作用を阻止する。MCPの種々のレセプターが従来技術、例えば、Charo⁶⁸及びChem okine Receptors⁶²に記載されている。更に、MCP-レセプターのリン酸化がレセプター脱感作及び内在化を媒介し、レセプターのリン酸化部位を変化することにより、MCP-1及び関連ケモカインに対する白血球の走化性応答が変調し得ることが最近示された⁶⁷。別の好ましい実施態様において、前記レセプターはCCR1、CCR2、CCR4及びCCR5 からなる群から選ばれる。好ましい実施態様において、MCPとそのレセプターの相互作用を抑制する薬剤は (i)抗MCP抗体及び抗MCP-レセプター抗体、及び/または (ii) MCPタンパク質の非刺激形態及びMCP-レセプターの可溶性形態からなる群から選ばれる。抗MCP抗体または抗MCP-レセプター抗体は抗原として精製MCPまたはそのレセプターもしくは部分を使用して公知の方法により調製し得る。モノクロナール抗体は、例えば、Kohler及びMilstein,Nature 256(1975),495、及びGalfre,Meth.Enz ymol.73(1981),3に記載された技術により調製でき、これらは免疫された動物に由来する牌臓細胞へのマウスミエローマ細胞の融合を含む。更に、前記MCPまたはそれらのレセプターの抗体またはそのフラグメントは、例えば、Harlow及びLa ne“Antibodies,A Laboratory Manual”,CSH Press,Cold Spring Harbour，1988に記載されている方法を使用することにより得られる。これらの抗体はモノクロナール抗体、ポリクローナル抗体または合成抗体並びに抗体のフラグメント、例えば、Fab、Fv、またはscFvフラグメント等であってもよい。MCP の非刺激形態及びMCP-レセプターのアンタゴニストは、例えば、Gong⁶⁵に記載されている。別の実施態様において、側副動脈の成長及び/または動脈形成を抑制する薬剤はMCPまたはそのレセプターのアンチセンスRNAである。MCPをコードする遺伝子及び/またはそのレセプターをコードする遺伝子の発現を不活化することが望ましいかもしれない。これは、例えば、MCPまたはそのレセプターをコードするmRN A転写産物またはその部分の相補ストランドに相当し、または含む核酸分子を使用することにより達成し得る。このような分子はDNAもしくはRNAまたはこれらのハイブリッドであってもよい。更に、前記核酸分子は、例えば、オリゴヌクレオチドアンチセンスアプローチに普通使用されるチオエステル結合及び/またはヌクレオチド類似体を含んでもよい。前期修飾は細胞中のエンドヌクレアーゼ及び /またはエキソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化に有益であるかもしれない。前記核酸分子はまた細胞中の前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適当なベクターにより転写されてもよい。このような核酸分子はMCPまたはそのレセプターをコードするmRNAを特異的に開裂するリボザイム配列を更に含んでもよい。更に、MCPまたはそのレセプターをコードする遺伝子の領域に相補性であるオリゴヌクレオチドが設計でき(三重らせん;Lee Nucl.Acids Res.6(197 9),3073;Cooney,Science 241(1988),456及びDervan,Science 251(1991)を参照のこと)、それによりMCPまたはそのレセプターの転写及び生成を阻止する。好ましい実施態様において、アンチセンスRNAは血管細胞または腫瘍への既存の細動脈連結の周囲の細胞中で発現されるように設計される。好ましい実施態様において、本発明の方法及び使用は、好ましくは結腸癌、肉腫、乳癌、頭部／首の癌、中皮腫、グリア芽細胞腫、リンパ腫及び髄膜種からなる群から選ばれる血管腫瘍である腫瘍の治療に使用される。好ましい実施態様において、本発明の使用における医薬組成物はカテーテルにより動脈内経路、静脈内経路、腹腔内経路または皮下経路による投与について設計される。本発明の実施例において、MCP-1タンパク質のヒト形態が浸透圧ミニポンプにより局所投与された。MCP-1と同じ経路により２種の動物に注入されたB rdUについての陽性免疫組織化学染色は、側副循環への物質の局所送出が実施可能であることを実証した。前記MCP及びそのコードする核酸分子は種々の形態で治療目的に使用し得る。本明細書に記載されたように、移植ポンプにより局所に、または動脈もしくは静脈の巨丸剤として、特別に設計されたカテーテルもしくはその他の装置により全身または局所に投与される。それらはまた側副動脈成長が促進されることを要するあらゆるその他の組織または筋肉内に注射し得る。また、それらは注射の前にマイクロカプセルまたは微小球体に結合し得る。別のアプローチはプラスミド、もしくはリポソームに封入されたプラスミド、またはウイルスベクターを使用して、遺伝子移入アプローチを使用することであろう。二重気球またはその他のカテーテルのような多重装置が設計されたin viv o遺伝子移入アプローチが使用されてもよく、または上記のように標的組織への直接注射によるものであってもよい。また、血管成長が促進または抑制される必要がある組織に滞在することが知られている細胞を生体から分離するex vivoアプローチを使用することが可能であり、次いでこれらの細胞は上記方法の一つを使用してトランスフェクトされ、再度注射される。本発明の使用及び方法は既存の細動脈連結からの側副動脈及び/またはその他の動脈の成長の変調に関係し、または依存すると従来知られていなかった全ての種類の疾患の治療に使用し得る。本発明の方法及び使用はヒトに使用されることが望ましいかもしれないが、動物の治療がまた本明細書に記載された方法及び使用により含まれる。図面の簡単な説明図１：ウサギ後肢中の大腿動脈閉塞後の単球／マクロファージ蓄積。Ａ）単球が切除された側副動脈の壁に付着する(矢印)。緑色（明るい）に染色する二つの別のマクロファージは既に血管壁に侵入していた。Ｂ）マクロファージがまた低い肢中に細胞間に見られる(矢印)。Ｃ）及びＤ）緑色（明るい）に染色する単球／マクロファージがMCP1で治療された動物中に極めて多数である(スケールバー：2 0mm)。図２：大腿動脈閉塞の１週間後のウサギ後肢の死後の血管造影図。Ａ）MCP-1治療によらない。Ｂ）局所MCP-1注入の１週間後。典型的ならせん状の外観を有する側副血管の密度がMCP-1で治療された動物の後肢中で著しく増大される。図３：Ａ）増殖マーカーとしてミニポンプにより連続的に注入され、アクチンのマーカーとしてのファロイジン-TRITCで対比染色されたブロモデオキシウリジン (BrdU)の染色(緑色（明るい）の蛍光)。大腿動脈閉塞の第一週中の内皮細胞及び平滑筋細胞中のBrdUの顕著なとり込み。Ｂ）正常なひ腹筋中のCD31の抗体による毛細管の比染色。Ｃ）閉塞の１週間後のCD31について染色された同じ筋肉。毛細管の数が増加した。Ｄ）閉塞及びMCP1注入の１週間後のひ腹筋。毛細管がMCP1治療後に多数である(全ての写真中のスケールバー：20mm)。図４：急性、１週間、３週間後の閉塞または閉塞なしの対照後肢と比較した局所 MCP-1注入による大腿動脈閉塞の１週間後のウサギ後肢の正味のコンダクタンス。MCP-1で治療された動物の正味のコンダクタンスは同じ時間の大体動脈閉塞後の対照動物よりも有意に高く、閉塞されなかった肢の値に達した(急性閉塞と較べて^*p<0.05かつ^**p<0.01;MCP-1治療しない閉塞の１週間と較べて+p<0.05)。図５：異なる領域中の急性、１週間、及び３週間後の対照後肢と比較した局所MC P-1注入による大腿動脈閉塞の１週間後のウサギ後肢の側副動脈コンダクタンス。MCP-1で治療された動物の側副コンダクタンスは四頭筋及び長内転筋領域で同じ時間の大体動脈閉塞後の対照動物よりも有意に高かった。これらの値は大腿動脈閉塞の３週間後に対照動物で観察された値よりも高い傾向があった(急性閉塞と較べて^*p<0.05かつ^**p<0.01；MCP-1治療しない閉塞の１週間と較べて++p<0.01 )。図６：急性、１週問、３週間の閉塞後の対照後肢と比較した局所MCP-1注入による大腿動脈閉塞の１週間後のウサギ後肢の末梢コンダクタンス。MCP-1で治療された動物の末梢コンダクタンスは同じ時間の大体動脈閉塞後の対照動物よりも有意に高かった。側副動脈コンダクタンスと同様に、これらの値は大腿動脈閉塞の３週間後に対照動物で観察された値よりも高い傾向があった(急性閉塞と較べて^*p<0.05かつ^**p<0.01；MCP-1治療しない閉塞の１週間と較べて++ｐ<0.01)。図７：立体の３次元血管造影図中の幹領域、中央ゾーン領域及びリエントリー領域により同定された側副動脈の数。閉塞の１週間後の側副動脈（右足）の数は担体単独で措置された動物と較べてMCP-1で治療された動物でほぼ２倍高かった。有意差が閉塞されなかった左の対照足に見られなかった。実施例が本発明を説明する。実施例１：動物の大腿動脈閉塞及び薬剤の局所送出本研究を動物の保護に関するドイツの法律の５8に従ってthe State of Hesse, Regierungspasidium Darmstadtの許可により行った。それは米国国立健康協会により発行されたthe Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH P ublication No.85-23,1985に改定)と一致する。12匹のウサギを７日の左右の大腿動脈閉塞にかけた。それらをランダムに指定して浸透圧ミニポンプ（2ML-2Alz a社、USA;10ml/hの速度で2mLの食塩加リン酸緩衝液(PBS)中3mg）により局所に単球走化性タンパク質-1(MCP-1；Pepro Tech社(Rocky Hill,NJ,USA))、浸透圧ミニポンプによりPBSを受け、または治療しなかった。９匹の追加の動物を比較のために大腿動脈閉塞にかけず、急性閉塞または21日の大腿動脈閉塞にかけた。２匹の動物をMCP-1と同じ経路によりブロモデオキシウリジン(BrdU：シグマ・ケミカルズ（セントルイス）)を送出する浸透圧ミニポンプ(2ML-2Alza社、USA)で供給して局所送出系の機能を確かめ、側副動脈及び毛細管の増殖を研究した。初期手術のために、動物をケタミン塩酸塩（体重1kg当り4-8mg）及びキシラジン（体重1kg当り8-9mg）の筋肉内注射により麻酔した。必要により、麻酔薬の補給投薬量（初期の投薬量の10-20％）を静脈内投与した。手術を無菌条件下で行った。大腿動脈を露出し、大腿回旋動脈の分岐の遠位に配置されたカテーテルの先端で上流に位置する無菌ポリエチレンカテーテル（内径1mm、外径1.5mm）でカニユーレ挿入した。カテーテルそれ自体を下腹部の皮膚の下に移植された浸透圧ミニポンプ(2ML-2Alza社、USA)に連結した。ウサギに特別に設計したボディスーツを装備し、これがそれらを自由に移動させたが、自己断節を防止した。それらを大きいケージに一緒に収容し、水及び食物に自由に接近させて移動度を確保した。犠牲前に、動物はケタミン塩酸塩及びキシラジンの別の筋肉内注射を受けた。次いで動物が気管切開を受け、人口呼吸させた。ペントバルビタール（毎時体重1kg当り12mg）で深部麻酔した。頚動脈を連続の圧力モニタリングのためにカニューレ挿入した。サフェナマグナ(saphena magna)動脈（ヒトの前頚骨動脈；ウサギの下肢及び足への主動脈供給）を足首の直ぐ上に露出させ、ポリエチレン管（内径0.58mm、外径0.96mm）でカニューレ挿入した。それらを末梢圧力の測定のためのStatham P23DC圧力変換器（Statham,Spectramed,USA）に連結した。5000単位のヘパリンによるヘパリン処理後に、両方の外腸骨動脈を露出し、内径2.0mmの金属管でカニューレ挿入した。腹部回旋動脈及び精動脈を結さつし、ターニケットを両方の大腿の近位に置いて大腿動脈を開放したままにした。大腿静脈及び坐骨静脈を静脈血液の排出のために切開した。次いで動物を採血し、足を股関節部の上で切断し、灌流装置に迅速に移した。動物は一次手術中またはその後に死ななかった。それはまた大腿動脈閉塞後に壊疸または機能の肉眼的損傷を観察されなかった。２匹の動物が空気塞栓のためにその研究から除外されるべきであった。実験を終了した後、ミニポンプの溜めに残っている全ての液体を回収し、計量した。ブロモデスオキシウリジン（BrdU）を受ける２匹の対照動物では、BrdU染色をいずれかに記載された通常の免疫組織化学方法²⁶により行った。溜めに残っている液体の評価は、10ml/hの速度のポンピングが全ての実験で達成されたことを明らかにした。BrdUについて陽性免疫組織化学染色は、浸透圧ミニポンプによる側副循環への局所注入が実施可能であることを実証した。実施例２：ex vivo圧力−流量関係 Stoecketローラーポンプ(Stoecket GmbH、ドイツ)及びJostraM2膜酸素発生器（Jostra GmbH、ドイツ）を使用して、足を37℃に温めた自己酸素化血液で灌流した。ヘマトクリットを34％〜37％に保ち、酸素飽和を99％に保った。パパベリン（シグマ・ケミカルズ、セントルイス、米国）25mgを灌流液（初回感作容積：60ml）に添加することにより最高の血管拡張を得た。足を３種の異なる圧力レベル（40、60及び80mmHg）で灌流した。安定化後に、放射性微小球体を注射し、シリンジポンプ（BraunMelsung、ドイツ）を使用して、基準サンプルを抜き取った。夫々の圧力レベルについて、ルテニウム、セリウム及びニオブまたはスカンジウムで標識した微小球体（デュポンNENプロダクツ、USA）をランダムに選んだ。これは組織潅流を異なる灌流圧力に関係付けた。T201フローメーター（トランソニック・システムズ社、USA）に連結した超音波インライン・フロー・プローブを使用して全流量を測定した。全身の圧力及び末梢毛細管圧力をStatha m P23DC圧力変換器（Statham,Spectramed,USA）でトレースした。全ての記録を演算化記録システム（MacLab,Apple Microsoft USA）にオンラインで移し、そこからそれらを更なる処理のために回収した。四頭筋、長内転筋及び大内転筋、ひ腹筋、ヒラメ筋及びひ骨筋を足から切開し、夫々の筋肉を近位末端から遠位末端へと五つの連続サンプルに分けた。サンプルを計量し、続いて既に記載されたGe -検出器²⁷を使用して夫々の基準サンプルと一緒に分析した。灌流された合計27 の後肢のうちの４つを除外した。何とならば、末梢圧力が得られなかったからであり、１つをサンプリングエラーのため側副コンダクタンス及び毛細管コンダクタンスの測定から除外した。ミニポンプによりPBSを受ける動物と治療を受けない動物の間にコンダクタンスに有意差はなかった(正味のコンダクタンス：57.2+ /-8.60vs69.2+/-10.01;側副コンダクタンス：24.5+/-5.69 vs 25.3+/-3.29;全てのデータの単位はml/分/100mmHgである)。それ故、これらの二つのグループを最終の分析で合わせた。サンプル流量の計算のために、筋肉重量１グラム当りの平均サンプル活性（Am /g）を使用し、筋肉重量１グラム当りの全流量(Ft/g)に関係付け、これは式Fs=F t/Am x Asを使用してサンプル流量(Fs)の計算を可能にした。これは式Fs=Asl Ar x Wr/tに従ってサンプル活性(As)、基準サンプル活性(Ar)、基準サンプルの重量 (Wr)及び基準サンプル抜き取りの時間(t)からのサンプル流量(Fs)の計算と良い相関関係があった。本モデルにおいて、典型的ならせん形成で大腿動脈閉塞後に発生する側副動脈は血液を遠位内転筋領域及び下の足に供給する。全身の圧力(SP)及び末梢圧力を伏在動脈(PP)中で使用した。静脈圧力は大気圧(AP；この場合にはゼロ)に等しかった。動脈抵抗は側副抵抗及び末梢抵抗よりも極めて低いので、それらを無視することができる。SPは側副動脈の幹領域の圧力に相当する。PPはリエントリー領域の圧力であり、下の足中の循環の圧力ヘッドと同じであり、APは末梢循環の静脈末端の圧力と同じである。側副流量(Fc)は遠位内転筋の組織への流量(FdTA)＋下の足の組織への流量(FTII)の合計に等しい(骨への流量は非常に小さく、足への主動脈供給が結さつされた。それ故、これらの値を本発明者らの計算で無視した)。側副抵抗(Rc)を遠位内転筋及び下の足に行く流量により割られた灌流圧力( SP)と末梢圧力(PP)の圧力差と定義した。末梢抵抗(Rp)を下の足への流量(FTII) により割られた末梢圧力(PP)と定義し、正味のコンダクタンスを超音波流量プローブで記録された正味の流量により割られた全身の圧力(SP)と定義した。これらの抵抗の逆数値が側副コンダタタンス、末梢コンダクタンス及び正味のコンダクタンス（Cc、Cp及びCb）に相当する。正圧切片が最高の血管拡張でさえも観察されるので、全てのコンダクタンスを圧力流量関係の傾きから計算した。大腿動脈閉塞の１週間後に、圧力流量関係から計算された正味のコンダクタンスはMCP-1で治療された動物で有意に高かった（142.1+/-31.71ml/分/100mmHg vs 66.2+/-7.76ml/分/100mmHg;p<0.05)(図4)。閉塞の７日後に、MCP-1で治療した動物の正味のコンダクタンスは大腿動脈閉塞の３週間後に未治療の動物よりも高いレベルに達し、閉塞しなかった後肢の値に匹敵した。また、側副コンダクタンスはこの治療を受けない動物と較べてMCP1で治療された動物で閉塞の１週間後に有意に高かった(70.6+/-19.23ml/分/100mmHgvs25.12+ /-2.59ml/分/100mmHg;p<0.01)(図５)。１週問にわたってMCP-1を受けた動物の側副コンダクタンスは側副成長が観察された全ての領域で大腿動脈閉塞の３週問後に未治療の動物よりも大きい傾向があった。また、子牛のコンダクタンスはMCP- 1を受けなかったウサギと較べてMCP-1治療を受けた動物で大腿動脈閉塞の１週間後に有意に高かった(119.3+/-22.37ml/分/100mmHg vs 45.4+/-6.80ml/分/100mmH g;p<0.01)(図６)。全てのデータを平均+/-SEMとして表す。グループ間の比較を不対スチューデントｔ試験により行った。不等分散の場合、 Mann-Whitney Rank Sum試験を使用した。0.05以下の確率値が統計有意差の推定に必要とされた。 MCP-1による治療は側副コンダクタンス及び末梢コンダクタンスの両方を大腿動脈閉塞の７日後に未治療の動物と較べて２倍に増大した。こうしてMCP-1で局所注射された動物は閉塞の１週間後に正常のコンダクタンス値に達し、一方、未治療の動物のコンダクタンス値は閉塞の３週間後でさえも正常レベルにもどらなかった。上記のように、MCP-1は主として単球のケモアトラクタントとして知られている^31,35。それ故、一つの可能な説明は、MCP-1が単球の吸引及び活性化により側副コンダタタンス及び末梢コンダクタンスにその顕著な効果を与え、これが順に内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖をもたらす成長因子を生成することであろう。これは単球がおそらく我々の側副動脈の源である小さい細動脈連結に付着することを必要とする^35,48,49。これらの既存の細動脈連結は、下の足への主動脈供給が閉塞される時にせん断応力の大きな増加を経験する。実施例３：死後の血管造影最高の血管拡張後に足を37℃に温め、Krebs-Henseleit緩衝塩溶液で１分間灌流し、続いてFulton²⁸により開発された処方に従ってビスマス及びゼラチンをベースとする造影剤で灌流した。続いて肢を砕いた氷の上に置くことにより造影剤をゲル化させ、血管造影図を単一封入されたStructurixD7DWフィルム(AGVA、ドイツ)を使用するBalteau放射線装置（Machlett laboratories、USA）で二つの異なる角度で撮影した。得られる立体写真は三次元の側副成長の分析を可能にした。死後の血管造影図は深在大腿動脈の灌流床を内転筋中のサフェナ・パルバ(sap hena palva)動脈の灌流床に連結し、外側大腿回旋動脈の灌流床を四頭筋中のゲヌアレス(genuales)動脈の潅流床に連結する長内転筋、大内転筋及び中間広筋(v astus intermedius muscle)中で主としてらせん状側副を示した。MCP-1治療した動物の後肢から撮影した血管造影図はこれらの側副血管の密度の著しい増大を示した(図2A及びＢ)。側副血管は正常な動物及びMCP-1治療した動物の下の肢の血管造影図には見られなかった。実施例４：組織研究腹部大動脈に内径2mmの金属カニューレを挿入し、胸部を開き、心臓を露出した。すすぎ液の排出を可能にするために右心房を切除した後、固定灌流を食塩加リン酸緩衝液(PBS)中に0.5％のBSA、EDTA５mM、0.317mg/lのアデノシンを含むすすぎ液x1.5で５分間にわたって開始し、続いて20分間にわたってBSAを含まないすすぎ液中の４％のホルマリンで固定した。続いて死後の血管造影を実施例３に記載されたようにして行った。これは側副血管、それらの幹領域及びリエントリー領域の正確な局在化及び切除を可能にした。免疫組織化学研究のために、サンプルを20％の蔗糖中に一夜保存し、次いで凍結し、-130℃に窒素冷却したメチルブタン中のコルクに取り付けた。更なる処理まで、それらを-80℃で貯蔵した。BrdUの視覚化のために、20mmのクリオスタット切片をLeica CM 3000 cryotom中で得、シリコーン被覆スライドに取り付け、２モル/lのHCl中で38℃で20分間インキュベートした。PBS中で５分間にわたって３回すすいだ後、それらをBrdUの一次抗体（クローンBU20a、DAKO社）とともにP BS中で1:20で４℃で一夜インキュベートした。検出のために、サンプルをPBS中で１時間にわたって1:100でビオチニル化ロバ抗マウス抗体(DIANOVA社)とともにインキュベートし、続いてPBS中で1:100で30分間にわたってストレプトアビジン -cy2(Biotrend,Koeln,ドイツ)とともにインキュベートした。最後に切片を核染色としての7-アミノアクチノマイシンＤ（PBS中1:50の7-AAD、Molecular Probes ,Eugene,Oregon USA）またはアクチンのマーカーとしてのファロイジン-TRTC(PB S中1:100)で対比染色した。スライドをモビオール(Hoechst,Frankfurt/M,ドイツ )に取り付け、Leica共焦レーザー顕微鏡で見た。同じに処理したが、一次抗体を省いた隣の切片は陰性対照として利用することができた。毛細管内皮細胞の免疫組織化学染色を上記プロトコルに従って行ったが、一次抗体として内皮特異性抗原であるCD31の抗体（DACO、ドイツ）を使用した。マクロファージの染色を一次抗体としてのウサギマクロファージの特異的抗体であるRAM411（DACO、ドイツ）を使用して行った。大腿動脈閉塞後に、単球／マクロファージが切除された側副動脈の血管壁及び下の肢の間隙に蓄積することがわかった(図1A及びＢ)。それらはMCP-1で治療された動物中で多数であった(図1C及びＤ)。更に、白色のプラークがMCP-1を受けた全ての動物中の注入部位付近に肉眼で見られた。これらのプラークはRam11(Dako GmbH,Ha mburg,ドイツ)による免疫組織化学染色により主として単球／マクロファージと同定された多数の単核細胞を含んでいた。注射部位の肉眼検査及び子牛筋肉からの大腿及び組織切片からの側副動脈の組織試験により、MCP-1注射が本発明者らの実験で単球蓄積の増大をもたらすことが明らかになった。BrdUについての切除された側副動脈の陽性染色は、大腿の血管造影で観察された側副血管が本当に増殖しているという証拠を与えた。閉塞の７日後に切除された側副動脈はBrdU染色で内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖を示した(図3A)。毛細管内皮細胞の増殖が下の肢に見られ、閉塞の７日後に毛細管の数の増加をもたらした(対照の足：図3B；閉塞の７日後の足：図3C)。MCP1 治療された動物は閉塞の１週間後に未治療の動物よりも下の肢に多くの毛細管を示し、MCP1による毛細管成長開始の増進を示した(図3D)。連続のBrdU注入後の免疫組織化学研究は、内皮細胞及び同様に平滑筋細胞に関する正常な発生時間が少なくとも６ケ月であり、増殖が正常な動脈に通常見られないという事実³⁹を考慮して、大腿中の側副血管形成が内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖に関与することを明らかに実証した。増殖の程度はアメロイド・コンストリクター配置後のイヌの心臓中の側副動脈の増殖の程度に似ており、腫瘍の増殖の程度に接近する⁴⁰。これはMCP-1が仮定の認められていない慢性血管拡張効果により側副動脈増殖を増進するという可能性を排除しないが、側副コンダクタンスの増大の速さ及ひ大きさはその他の既知の血管拡張剤^41-44よりもはるかに高い。更に、単球は非常に強力な血管拡張剤である酸化窒素シンターゼを培養された大腿内皮細胞中でダウンレギュレートすることが示され、MCP-1が血管拡張を増進するのではなく抑制することを示唆した⁴⁵。それ故、血管拡張は上記知見では説明できそうにない。血管造影図における側副動脈の高密度は、側副動脈成長が側副コンダクタンスの増大の原因であるという概念を更に支持する。大腿とは対照的に、側副動脈の密度が増大され、更に多くの毛細管が閉塞の７日後に対照動物と較べてMCP-1で治療した動物の子牛筋肉からの組織切片に見られた。CD31の抗体(PECAM)を内皮細胞のマーカーとして選んだ。何とならば、この細胞付着分子は内皮細胞で構成的に発現され、それらの表現型または活性化に依存しないからである^46,47。増殖のマーカーとしてBrdUを使用して、子牛筋肉中で増殖している毛細管のみを検出した。その他の血管型はこの領域で成長しないことがわかった。側副コンダクタンスについて、血管拡張による受動血管拡大はその測定を最高の血管拡張で行うことにより末梢コンダクタンス変化の理由として排除し得る。こうして末梢コンダクタンスの変化はおそらく毛細管成長開始に起因する。組織データは多くの単球がMCP-1で治療された動物中で蓄積することを示唆する。単球は多量の成長因子を潜在的に生成することができるので、これは単球が MCP-1治療で見られる変化の媒介物質であるという仮説を更に支持する。要するに、本発明者らの結果は、単球の強力かつ特異的なケモアトラクタントであるMCP-1の局所注入が側副コンダクタンスだけでなく末梢コンダクタンスを著しく増大することができることを示した。血管造影及び組織学上の知見は、この効果が強化された側副動脈及び毛細管の増殖のためであることを示し、単球の付着、活性化及び移動が血管成長の両方の型に重要な役割を果たすことを示唆する。実施例５：側副動脈の数死後の血管造影図を実施例３に記載されたようにして得た。定量化のために、骨を摘出し、大腿筋を広げ、その後に組織をBalteau放射線装置に入れた。これは立体血管造影図におけるそれらの幹領域、中央ゾーン領域及びリエントリー領域により個々の側副動脈の同定及びカウンティングを可能にした。こうしてカウントされた側副動脈の数は四つの異なる観察により独立に得られた場合の個々の動物で異ならなかった。血管造影図を片側の大腿動脈閉塞後に浸透圧ミニポンプにより局所にMCP-1を受けた６匹の動物から得、大腿動脈閉塞後に同じ経路により担体PBSを受けた６匹の動物の血管造影図と比較した。結果を図７に示す。閉塞の７日後に、側副動脈の数はPBS単独を受けた動物と比較してMCP-1を受けた動物でほぼ２倍高かった(30.17+/-1.96 vs 16.17+/-1.4;P<0.001)。表１を参照のこと。表１：立体の３次元血管造影図中の幹領域、中央ゾーン領域及びリエントリー領域により同定された側副動脈の数。閉塞の１週間後の側副動脈（右足）の数は担体単独で措置された動物と較べてMCP-1で治療された動物でほぼ２倍高かった。閉塞されなかった左の対照足では有意差が見られなかった。閉塞されなかった対照足中のMCP-1で治療された動物及び担体で措置された動物の間の側副動脈の数に有意差はなく、付加的なメカニズムが閉塞により誘発される側副成長を増進するために必要であることを示唆する。それ故、MCP-1は血管閉塞のない部位中の側副成長またはその他の血管の成長を増進しないであろう。実施例６：MRI走査により見られるMCP-1治療の長期効果 MCP-1で治療された６匹の動物及び６匹の動物を片側大腿動脈閉塞の正確に７日、２週間、１ケ月、２ケ月及び３ケ月後にMRI走査で調べた。解剖学的構造を高分解T1-SE像で分析した。MR-血管造影を3-DFISPシーケンスで行った。灌流をGD- DTPAの静脈内巨丸後にTFL-SR-シーケンスで測定した。分析を異なる筋肉グループに応じて行った。MCP-1で治療した動物中の側副動脈の数は調べた時間枠中で高かった。対照動物とは対照的に、大腿動脈の逆行性ファイリングをMCP-1治療した動物で閉塞の２週間後に既に基準化した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｋ 37/24 35/00 37/02

Claims

【特許請求の範囲】 1. 組織または細胞を単球走化性タンパク質(MCP)または前記MCPをコードする核酸分子と接触させることを特徴とする既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の成長の増進方法。 2. 既存の細動脈連結からの側副動脈及び／またはその他の動脈の側副の成長を増進するための医薬組成物の調製のための単球走化性タンパク質(MCP)または前記MCPをコードする核酸分子の使用。 3. 前記MCPがMCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1α、RANTES、J-309もしくはその他のあらゆるCC-ケモカインまたはN-ファルネシルペプチド、C5a、ロイ CコトリエンB4もしくは血小板活性化因子(PAF)のような古典的ケモアトラクタントからなる群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法または請求の範囲第２項に記載の使用。 4. 閉塞性疾患を患う被験体の治療のための請求の範囲第１項もしくは第３項に記載の方法または請求の範囲第２項もしくは第３項に記載の使用。 5. 閉塞性疾患が冠状動脈疾患、脳閉塞疾患、末梢閉塞疾患、内臓閉塞疾患、腎臓動脈疾患及び隔膜動脈不全からなる群から選ばれた動脈の閉塞性疾患である請求の範囲第４項に記載の方法または使用。 6. 動脈を損傷または破壊する薬剤もしくは放射線または手術措置への暴露中またはその後の被験体の治療のための請求の範囲第１項もしくは第３項に記載の方法または請求の範囲第２項もしくは第３項に記載の使用。 7. MCPが組換えMCPである請求の範囲第１項もしくは第３項〜第６項のいずれか一項に記載の方法または請求の範囲第２項〜第６項のいずれか一項に記載の使用。 8. 医薬組成物が繊維芽成長因子または血管内皮成長因子のような成長因子と一緒の投与のために設計される請求の範囲第２項〜第７項のいずれか一項に記載の使用。 9. (a)細胞を被験体から得、 (b)MCPをコードする核酸分子を前記細胞に導入し、それにより単球の吸引に適した形態のMCPの発現及び分泌を与え、そして (c)工程(b)で得られた細胞を被験体に再度導入することを特徴とする請求の範囲第１項または第３項〜第７項のいずれか一項に記載の方法。 10．医薬組成物中の核酸分子が単球の吸引に適した形態でインビボの細胞による MCPの発現及び分泌のために設計される請求の範囲第２項〜第８項のいずれか一項に記載の使用。 11．組織または細胞を単球の吸引により既存の細動脈連結からの側副動脈及び/ またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤と接触させることを特徴とする腫瘍の治療方法。 12．腫痛の治療用の医薬組成物の調製のための単球の吸引により既存の細動脈連結からの側副動脈及び/またはその他の動脈の成長を抑制する薬剤の使用。 13．薬剤がMCPの生物活性を抑制し、かつ/またはMCPのレセプターにより単球中で誘発される細胞内シグナルを抑制する請求の範囲第11項に記載の方法または請求の範囲第12項に記載の使用。 14．薬剤がMCPとそのレセプターの相互作用を阻止する請求の範囲第13項に記載の方法または使用。 15．レセプターがCCR1、CCR2、CCR4及びCCR5からなる群から選ばれる請求の範囲第14項に記載の方法または使用。 16．MCPとそのレセプターの相互作用を阻止する薬剤が (i)抗MCP抗体及び抗MCP-レセプター抗体、及び/または (ii)MCPタンパク質の非刺激形態及びMCP-レセプターの可溶性形態からなる群から選ばれる請求の範囲第14項または第15項に記載の方法または使用。 17.薬剤がMCPまたはそのレセプターのアンチセンスRNAである請求の範囲第11項に記載の方法または請求の範囲第12項に記載の使用。 18.アンチセンスRNAが血管細胞または腫瘍への既存の細動脈連結の周囲の細胞中で発現されるように設計される請求の範囲第17項に記載の方法または使用。 19.腫瘍が血管腫瘍である請求の範囲第11項もしくは第13項〜第18項のいずれか一項に記載の方法または請求の範囲第12項〜第18項のいずれか一項に記載の使用。 20.腫瘍が結腸癌、肉腫、乳癌、頭部／首の癌、中皮腫、グリア芽細胞腫、リンパ腫及び髄膜種からなる群から選ばれる請求の範囲第19項に記載の方法または使用。 21.医薬組成物がカテーテルにより動脈内経路、静脈内経路、腹腔内経路または皮下経路による投与について設計される請求の範囲第２項〜第８項または第 12項〜第20項のいずれか一項に記載の使用。