JP2001518306A - 単球由来マクロファージの培養物中でウイルスを複製する方法 - Google Patents

単球由来マクロファージの培養物中でウイルスを複製する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、末梢血単球（「ＰＢＭＣ」）の同種異系的刺激により単球由来マクロファージ中で潜伏性反応性を再活性化する方法、ウイルスを培養する方法、およびウイルス的に許容性の単球由来マクロファージの培養物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、末梢血単球（「ＰＢＭＣ」）の同種異系的刺激またはＩＦＮγを
含む培地を使用するＰＢＭＣの培養により単球由来マクロファージ（「ＭＤＭ」
）中で潜伏性反応性を再活性化する方法、このようなウイルス的に許容性の単球
由来マクロファージの安定な培養物、およびこのような培養物を使用してウイル
スのインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。
発明の背景 ヒトサイトメガロウイルス（「ＨＣＭＶ」）は、免疫無防備状態の個体、例え
ば、移植およびエイズの患者の病的状態および死亡率の主な原因、ならびに先天
性分娩欠陥の主要な原因である、偏在的病原体である（Ｂｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ
．、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｐｐ．２４９３−２５２３（Ｆｉｅｌｄ
ｓ ｅｔ ａｌ．、編、１９９６）。ＨＣＭＶは、また、アテローム性動脈硬化
症の発生、冠状血管形成後の再発狭窄症、器官移植患者における慢性拒絶反応（
Ｇｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊａｍａ ２６１：３５６１−３５６６（１９
８９）；Ｍｅｌｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏａｓｓｅｙ １７：８９９−９
０３（１９９５）；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、ＮＥＩＭ ３３５：６２４−６３
０（１９９６））および骨髄移植患者にお 生命の初期においてＨＣＭＶに感染するようになり、そして地理的位置に依存し
て、成人の６０〜１００％はウイルスのキャリヤーである（Ｂｒｉｔｔ ｅｔ
ａｌ．、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｐｐ．２４９３−２５２３（Ｆｉｅ
ｌｄｓ ｅｔ ａｌ．、編、１９９６）。
他のヘルペスウイルスと同様、ＨＣＭＶは、一次感染後宿主において一生の潜
伏を確立し、これは感染性ウイルスを産生しないウイルスゲノムの持続性により
特徴づけられる。他のヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン−バールウイル
スおよび単純ヘルペスウイルスについての潜伏のそれぞれの部位はＢ細胞および
ニューロンである（Ｋｉｅｆｆ、Ｆｉｅｌｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｐｐ．２３４
３−２３９６（Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．、編、１９９６）；Ｒｏｉｚｍａｎ
ｅａｌ、Ｆｉｅｌｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｐｐ．２２３１−２２９６（Ｆｉｅｌ
ｄｓ ｅｔ ａｌ．、編、１９９６））。しかしながら、潜伏性ＨＣＭＶの伝染
は血液産物の輸注、骨髄の移植、および充実器官を通して起こることが示された
（Ｂｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｆｉｅｌｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｐｐ．２４９３
−２５２３（Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ、編、１９９６）；Ｃｈｏｕ、ＮＥＵＭ
２１４；１４１８−１４２３（１９８６）；Ｍｅｙｅｒｓ、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．８１：２７−３８（１９８６）；Ｔｅｇｔｍｅｉｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｐａｔ
ｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１１３：２３６−２４５（１９８９））が、潜伏性ま
たは持続性ウイルスを収容する細胞の同一性は未知である。ＨＣＭＶに加えて、
他のウイルスを収容する細胞の同一性は不明瞭であり、そしてこのようなウイル
スを培養する方法は未知である。
ＣＭＶの潜伏性および再活性化に関係するメカニズムを理解するための、いく
つかの動物モデルが確立された（Ｂｒｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐ
ｌａｎｔａｔｉｏｎ ４１：６９５−６９８（１９８６）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ
ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３９：２９０−２９６（１９
８５）；Ｒｅｄｄｅｈａｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１
８５−１９３（１９９４）；Ｙａｇｙｕ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｐｒ
ｏｃ．２５：１１５２−１１５４（１９９３））。ネズミの器官移植モデルにお
いて、ネズミサイトメガロウイルス（「ＭＣＭＶ」）の再活性化はドナーと受容
体との間の免疫抑制および組織不適合性の状態により影響を受けることが示され
た（Ｂｒｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３９：
２９０−２９６（１９８５）；Ｒｅｄｄｅｈａｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．１７９：１８５−１９３（１９９４）；Ｙａｇｙｕ ｅｔ ａｌ．、
Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｐｒｏｃ．２５：１１５２−１１５４（１９９３））。ＭＣＭ
Ｖにより潜伏的に感染されたマウスにおいて、脾臓、腎臓、および骨髄はウイル
スの重要な源であることが示された（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：７６２−７６８（１９８２）；Ｍｅｒｃｅｒ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：９８７−９９７（１９８８）；Ｏｌｄｉｎｇ
ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４１：５６１−５７２（１９７５））。
潜伏的に感染された動物においてウイルスの活性化は、チオグリコレートの腹腔
内注射（Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２７：１６８−
１７９（１９９７））または同種異系的刺激（Ｓｃｈｍａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．
、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１６６：１４０３−１４０７（１９９２））により起こ
ることが示された。潜伏的に感染した動物の末梢血は、また、同種異系的刺激は
ＭＣＭＶ複製を活性化させるので、ウイルスの溜であることが証明された（Ｓｃ
ｈｍａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１６６：１４０３−１４０
７（１９９２）；Ｏｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４１：
５６１−５７２（１９７５）；Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．７０：７６２−８７６（１９８２）；Ｍｅｒｃｅｒ ｅｔ ａｌ．
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２；９８７−９９７（１９８８）；Ｋｏｆｆｒｏｎ ｅｔ
ａｌ．、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．−Ｓｕｐｐｌ．９９：６１２（１
９９５））；Ｓｔｏｄｄａｒｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６２４
３−６２５３（１９９４）；Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
２２７：１６８−１７９（１９９７））。
ヒトにおいて、ＨＣＭＶ疾患を有する患者から得られた器官の組織および末梢
血を検査すると、ＰＢＭＣはＨＣＭＶのウイルスの溜であることが示唆される（
Ｃｈｏｕ、ＮＥＪＭ ３１４：１４１８−１４２３（１９８６）；Ｍｅｙｅｒｓ
、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８１：２７−３８（１９８６）；Ｔａｙｌｏｒ−Ｗｉｅｄ
ｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０５９−２０６４
（１９９１）；Ｔｅｇｔｍｅｉｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ
．１１３：２３６−２４５（１９８９）；Ｇｎａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ．１３２：２３９−２４８（１９８８））。ＨＣＭＶ−血清反応
陽性ドナーから得られた分離されたＰＢＭＣの集団をさらに分析すると、単球は
優勢を占める感染された細胞の型として同定された（Ｔａｙｌｏｎ−Ｗｉｅｄｅ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０５９−２０６４（
１９９１））。単球中のウイルスの複製は遺伝子の発現の初期の事象に制限され
る（Ｉｂａｎｅｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６５８１−６５８８
（１９９１））が、ＨＣＭＶの疾患において初期において器官の組織を検査する
と、組織のマクロファージにおける広範なウイルス遺伝子の発現が証明された（
Ｇｎａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３２：２３９−２４８
（１９８８）；Ｓｉｎｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｓｉ．１７３：
２４０−２４５（１９９６））。
末梢血中のＣＤ１４＋単球は、骨髄性／顆粒球前駆体に由来する、最終的に分
化した細胞である。抗原プロセシング事象の間のＴ細胞およびＢ細胞との接触に
よる、単球のｉｎ ｖｉｖｏ刺激は、免疫エフェクター細胞としての機能するマ
クロファージへの単球の分化を誘導する。種々の組織培養のプロトコールは単球
由来マクロファージ（「ＭＤＭ」）のｉｎ ｖｉｖｏ発生を模擬することが確立
され、ここでプロトコールはサイトカイン、マイトジェン、コルチコステロイド
、またはリポ多糖（「ＬＰＳ」）を使用して単球の処理を包含する（Ａｄａｍｓ
ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｐ．７７−１１５（Ｌｅｗ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．、編、１９９２）において概観されている）。Ｃａｕｘ ｅ
ｔ ａｌ．は、ＦＡＣＳソーティングを使用して、ＣＤ１４＋、ＣＤ１ａ＋細胞
の一時的集団がＭＤＭの分化において発育相を表すことを報告している（Ｃａｕ
ｘ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５−７０６（１９９６）
）。これらの方法により誘導されたＭＤＭはある種のマクロファージ向性ウイル
スのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に使用されてきている（Ｇｅｎｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１４２８−１４４１（１９８８）；Ｍ
ａｔｌｏｕｂｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：７３４０−７３４
９（１９９３）；Ｓｃｈｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３２
８０−３２８８（１９９０））。Ｒｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．、は、ＨＨＶ８で
感染した内因性ＣＤ６８＋、ＣＤ８３＋骨髄間質細胞を同定した（Ｒｅｔｔｉｇ
ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１８５１−１８５４（１９９７））
。しかしながら、ＭＤＭ中のＨＣＭＶの培養は困難であることが証明され、しば
しば不発感染を生じた（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：６１３４−６１３８（１９８４）；Ｔａｙｌｏｒ
−Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１５９７−１６
０４（１９９４））。
ＨＣＭＶ許容性マクロファージを発生するＰＢＭＣのマイトジェン決定に頼る
、ＭＤＭ分化系がまた開発された。この方法により分化されたマクロファージは
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、外因的ＨＣＭＶ感染に対して感受性であるが、潜伏的に感染
した個体から得られたＰＢＭＣからのＨＣＭＶを再活性化する試みは、この方法
または他の方法を使用して、不成功に終わった（Ｔａｙｌｏｒ−Ｗｉｅｄｅｍａ
ｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１５９７−１６０４（１９９４）
）。したがって、潜伏的ＨＣＭＶ感染の特異的細胞の溜を同定し、このような細
胞の培養物を単離し、そしてＨＣＭＶがその中で複製する細胞を培養する方法を
確立することが要求されており、ここで細胞はＨＣＭＶおよび／または追加のウ
イルスで潜伏的に感染されるか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させることが
できる。
発明の要約 本発明は、潜伏性ウイルス、例えば、ＨＣＭＶ感染の特異的細胞の溜を最初に
同定した。本発明は、また、同種異系的に刺激された単球由来のマクロファージ
（「ＭＤＭ」）の長期間の培養物中で、ＨＣＭＶおよび他のウイルスを再活性化
する方法を提供する。マクロファージ（ＣＤ１４）および樹枝状細胞のマーカー
（ＣＤ８３）の双方を発現する、ＭＤＭの骨髄性系列細胞の表現型から、感染性
ウイルスが回収された。さらに、これらの細胞は外因的ウイルス感染に対して許
容性である。これらの観察は、ＨＣＭＶおよび他のウイルスが末梢血中の骨髄性
系列細胞中で真の潜伏状態を確立するという、第１の証拠を提供する。
１つの面において、本発明は、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージ
中で、哺乳動物ウイルスを包含するウイルスを複製させる方法を提供する。この
方法は、下記の工程を含む：（ａ）単球を生存可能な、同種異系的に刺激された
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と流体連絡させた条件下に、単球を培養して単球を
活性化させて、単球由来マクロファージに分化させるか、あるいは単球を活性化
させてウイルス的に許容性の単球由来マクロファージに分化させるために十分な
量において、ＩＦＮγからなるコンディショニングされた培地に前記単球を暴露
させる条件下に、前記単球を培養し、そして（ｂ）単球由来マクロファージ中で
ウイルスを複製させ、ここでウイルスは単球中で潜伏性であるか、あるいは培養
物に外因的に添加される。
他の面において、本発明は、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージを
使用してウイルス産生のインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。こ
の方法は、下記の工程を含む：（ａ）単球を生存可能な、同種異系的に刺激され
た末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）と流体連絡させた条件下に、単球を培養して
単球を活性化させて、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージに分化させ
るか、あるいは単球を活性化させてウイルス的に許容性の単球由来マクロファー
ジに分化させるために十分な量において、ＩＦＮ−γからなるコンディショニン
グされた培地に単球を暴露させる条件下に、単球を培養し、（ｂ）単球由来マク
ロファージ中でウイルスを複製させ、ここでウイルスは単球中で潜伏性であるか
、あるいは培養物に外因的に添加され、（ｃ）ウイルス産生を阻害する能力を有
することが推測される物質と、工程（ｂ）の単球由来マクロファージを接触させ
、そして（ｄ）単球由来マクロファージ中のウイルス産生のレベルを検出する。
他の面において、本発明は、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージの
培養物を提供し、ここで単球由来マクロファージは同種異系的に刺激された末梢
血単球細胞（「ＰＢＭＣ」）に暴露させた単球に由来するか、あるいはＩＦＮ−
γからなるコンディショニングされた培地に暴露させ、ここで暴露時間および濃
度は、（ｉ）単球がウイルス的に許容性の単球由来マクロファージへ活性的に分
化するのを刺激し、そして（ｉｉ）単球由来マクロファージ中のウイルス産生を
刺激するために十分であり、そして、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファ
ージは非同種異系的刺激単球よりも少なくとも１０，０００倍大きいウイルスを
産生する。
他の面において、本発明は、少なくとも８５％がＣＤ８３およびＣＤ１４を支
持するとして規定される集団を有するウイルス的に許容性の単球由来マクロファ
ージの培養物を提供する。他の面において、本発明は、少なくとも８５％がＣＤ
８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ６４およびＣＤ１４を支持するとして規定され
る集団を有するウイルス的に許容性の単球由来マクロファージの培養物を提供す
る。
他の面において、本発明は、下記の特徴を有するウイルス的に許容性の単球由
来マクロファージの安定な培養物を提供する：（ｉ）樹枝状細胞のマーカーＣＤ
６８、ＣＤ８３、およびＣＤ１ａからなる、（ｉｉ）マクロファージ細胞のマー
カーＣＤ６４およびＣＤ１４からなる、および（ｉｉｉ）ＣＤ１４＋単球に由来
する。
他の面において、本発明は、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージを
培養する方法を提供する。この方法は、単球を生存可能な、同種異系的に刺激さ
れた末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）と流体連絡させた条件下に、単球を培養す
るか、あるいはＩＦＮγからなるコンディショニングされた培地に単球を暴露さ
せる条件下に、単球を培養して、単球を活性化させて単球由来マクロファージに
分化させる工程を含む。
１つの態様において、単球由来マクロファージはＣＤ８３またはＣＤ１４を支
持する細胞の主要な集団を有する。他の態様において、単球由来マクロファージ
は、細胞の８５％がＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ６４およびＣＤ１４を
支持する、細胞の集団を有する。１つの態様において、単球由来マクロファージ
はヒトである。１つの態様において、哺乳動物のウイルスは、サイトメガロウイ
ルス（「ＣＭＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス
（「ＨＩＶ」）、ヒトヘルペスウイルス６（「ＨＨＶ６」）、ヒトヘルペスウイ
ルス７（「ＨＨＶ７」）およびヒトヘルペスウイルス８（「ＨＨＶ８」）から成
る群より選択される。１つの態様において、ウイルスは潜伏性である。
１つの態様において、物質はウイルスのプロテアーゼのインヒビターである。
他の態様において、物質はウイルスが発生する核酸に結合するアンチセンス分子
である。１つの態様において、物質はウイルスゲノムによりコードされるｍＲＮ
Ａに対して相補的であるアンチセンス分子である。１つの態様において、物質は
ウイルスゲノムによりコードされるｍＲＮＡに対して相補的であるリボザイムで
ある。１つの態様において、物質はＣＭＶ ＤＮＡポリメラーゼ、ＵＬ８０、お
よびＵＬ８９から成る群より選択されるウイルスタンパク質を阻害する。
発明の具体的な説明 Ｉ．序論 本発明は、樹枝状マーカーを発現しかつ潜伏性ウイルス、例えば、ＨＣＭＶの
感染を収容する、単球由来マクロファージ（「ＭＤＭ」）を最初に記載する。こ
れらの培養物は、ウイルス的に許容性である、すなわち、それらは潜伏感染の再
活性化を支持しそして、また、外因的ウイルスで産生的に感染することができる
。こうして、本発明は、ＭＤＭのウイルス的に許容性の培養物、ウイルス的に許
容性のＭＤＭを培養する方法、および培養物を使用してウイルス産生のインヒビ
ターを阻害する方法を提供する。
重要なことには、本発明は、ウイルスを研究するために、例えば、ウイルスの
潜伏性の維持に関係するメカニズムを同定し、そして潜伏性ウイルスの再活性化
および初期のウイルス感染を仲介する細胞の活性化経路を探査するために使用す
ることができる。さらに、これらの細胞および培養法はウイルスの免疫学的監視
機構を検査する重要な道具を提供する。これらの細胞および培養法は、また、ウ
イルスの再活性化を防止しかつウイルス産生を阻害する療法的アプローチを同定
するために有用である。本発明の細胞および方法は、また、潜伏的に感染した細
胞を培養する手段を提供しかつウイルスゲノムの存在について細胞を検査するこ
とによって、潜伏性ウイルスが感染した患者を診断するために有用である。
ＩＩ．定義 本明細書において使用するとき、下記の用語は特記しない限りそれらに帰属さ
れる手段を有する。
「複製」は、細胞からの感染性粒子を産生する手段として、ウイルスが複製し
、そのゲノムを翻訳する能力を意味する。
「ウイルス許容性」（Ｖｉｒｕｌｌｙ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）は、細胞、例
えば、単球由来マクロファージが外因的ウイルスにより産生的に感染されるか、
あるいは潜伏性ウイルスの感染，例えば、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ＣＭ
Ｖ、ＨＣＶ、およびＨＩＶを再活性化（ｒｅａｃｔｉｎａｔｅ）することができ
る、細胞の特性を意味する。
「安定な培養物」は、発育、次いでそれ以上の分化の間に、一時的に出現する
細胞と反対に、最終的に分化した細胞の培養物を意味する。
「同種異系的刺激」（ａｌｌｏｙｅｎｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、（
１）抗原の接触または細胞を異なるＭＨＣハプロタイプ（「細胞仲介」）との混
合により、可溶性因子、例えば、ＩＦＮ−γのようなサイトカインを産生するよ
うに誘発された細胞により仲介されるか、あるいは（２）可溶性因子、例えば、
ＩＦＮ−γのようなサイトカイン（「サイトカイン仲介」）により直接的に仲介
される、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、およびその他）の間の細胞
の分化および／または増殖的事象を意味する。例えば、同種異系的刺激の間に、
単球を活性化して単球由来マクロファージに分化させる。同様に、Ｔ細胞を活性
化して細胞障害性またはヘルパーＴ細胞およびその他に増殖および分化させる。
典型的には、本発明の同種異系的刺激はｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。細胞仲介の
同種異系的刺激のために、典型的には細胞、例えば、ＰＢＭＣの異種集団を異な
るハプロタイプのＰＢＭＣと混合させる。直接的サイトカイン仲介の同種異系的
刺激のために、ＰＢＭＣまたは細胞のより均質な集団を使用する。サイトカイン
仲介刺激は、コンディショニングされた培地（すなわち、細胞を成長させる培地
）を使用するか、あるいはサイトカインを外因的に添加された培地中で起こする
ことができる。
「流体連絡」は、水溶液中で連絡にある細胞を意味する。流体連絡は、水溶液
中で細胞の間の直接的接触により仲介される連絡、あるいは連絡は水溶液中で可
溶性因子、例えば、サイトカインにより仲介される、半透膜により分離された細
胞の間の連絡を包含する。
「末梢血単球」または「ＰＢＭＣ」は、赤血球を除去された、血液に由来する
血管リンパ系細胞の異種集団を意味する。
「単球」は、単球食細胞系列の分化した細胞、例えば、ＣＤ１４＋である細胞
を意味する（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕ
ｌ編、第３版、１９９３）参照）。
「単球由来マクロファージ」または「ＭＤＭ」は、さらにマクロファージに分
化された単球に由来する単球食細胞系列の抗原提示細胞の１つの型である（例え
ば、Ｐａｕｌ、ｓｕｐｒａ参照）。
「培養」は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで成長する細胞を意味する
。
「潜伏性」は、宿主細胞がウイルスのゲノムを含有するが、ゲノムの発現が完
全にまたは部分的に抑制された、ウイルス感染の１つの型を意味する。潜伏的感
染を「再活性化」してウイルスの複製、転写、および感染性粒子の産生を発生さ
せることができる（例えば、Ｗｈｉｔｅ ＆ Ｆｅｎｎｅｒ、Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第４版、１９９４）参照）。
「ＣＤ８３」、「ＣＤ１４」、「ＣＤ６８」、「ＣＤ１ａ」、「ＣＤ６４」、
「ＣＤ４」、および「ＣＤ８」ｈａ、特定の細胞表面の分子の名称である。これ
らの細胞表面の分子はしばしば特定の細胞の型に関連し、そして特定の細胞を同
定するためのマーカーとして使用することができる（例えば、Ｐａｕｌ、ｓｕｐ
ｒａ参照）。例えば、ＣＤ４およびＣＤ８はＴ細胞のマーカー、ＣＤ８３、ＣＤ
６８、およびＣＤ１ａは樹枝状細胞のマーカーであり、そしてＣＤ１４およびＣ
Ｄ６４はマクロファージのマーカーである。ＣＤ１４とＣＤ８３との組合わせを
使用して、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージを同定することができ
る。ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ６４、ＣＤ１４、およびＣＤ８３をまた組合わせ
て使用して、ウイルス的に許容性のＭＤＭ（アロ−ＭＤＭ）を同定することがで
きる。
「リボザイム」は、特定の核酸配列を有するターゲットＲＮＡをリボヌクレア
ーゼ活性により切断する、触媒ＲＮＡ分子を意味する。ヘアピンリボザイム、ハ
ンマーヘッドリボザイム、ＲＮアーゼリボザイム（すなわち、原核生物または真
核生物からの天然に存在するＲＮアーゼＰリボザイムに由来するリボザイム）を
包含する、リボザイムを構築する一般的方法はこの分野において知られている（
例えば、Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２５：２８９−３１７（１９９４）参照（一般に、グル
ープＩリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、ＲＮアー
ゼＰ、およびアックスヘッド（ａｘｈｅａｄ）リボザイムを包含する、リボザイ
ムの外観を提供する））。
「アンチセンス」核酸は、選択するターゲット配列に対して相補的でありかつ
ターゲット分子と特異的にハイブリダイゼーションすることができる核酸を意味
する。アンチセンスという用語は、また、アンチセンスＲＮＡが転写される発現
カセット中でＤＮＡ配列を包含する。アンチセンス核酸はターゲットポリヌクレ
オチドにハイブリダイゼーションし、そしてターゲット核酸の転写、プロセシン
グ、翻訳または他の活性を妨害する。アンチセンス核酸は、例えば、転写開始部
位または鋳型への結合によるＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへ
の結合を妨害することによって、ＤＮＡの複製またはＤＮＡの転写を阻害するこ
とができる。それは、例えば、ＲＮＡ転写物の領域、例えば、リボソーム結合部
位への結合により、ｍＲＮＡのプロセシング、ｍＲＮＡへのポリ（Ａ）の付加ま
たはｍＲＮＡの翻訳を妨害することができる。それは細胞の阻害メカニズムを促
進する、例えば、ＲＮアーゼ作用を介するＲＮＡ分解を促進することができる。
阻害ポリヌクレオチドを二本鎖ＤＮＡの主要な溝に結合して、三重らせんまたは
「トリプレックス」構造を形成することができる。したがって、アンチセンス核
酸を使用する阻害法は、異なるメカニズムにより働く特異的遺伝子の発現の変更
に対する、多数の異なるアプローチを包含する（例えば、Ｈｅｌｅｎｅ ＆ Ｔ
ｏｕｌｍｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４９：９９−１
２５（１９９０）参照）。
他に対して相補的である核酸は、水素結合の形成を包含する塩基対を通すター
ゲット核酸に結合することができる核酸を意味する。核酸とターゲット配列との
間の相補的ハイブリダイゼーションは、核酸が実質的にターゲット配列のみに結
合するとき、起こり、ハイブリダイゼーション複合体を形成し、このときターゲ
ットはポリヌクレオチドと他の成分との異種混合物の中に存在する。このような
ハイブリダイゼーションはターゲット配列の存在を確定する。相補的核酸は他の
無関係の配列に結合することがあるが、形成したハイブリダイゼーション複合体
の少なくとも８０％、好ましくは９０％またはそれ多くはターゲット配列ととも
に形成されている。
「ウイルス産生」および「ウイルスを産生する」は、ウイルスが感染した細胞
が複製し、ウイルスゲノムを転写し、および／またはウイルス粒子を作る能力を
意味する。感染は再活性化された潜伏的感染であるか、あるいは外因的に添加さ
れたウイルスを介する感染であることができる。ウイルスは野生型または突然変
異したウイルスであることができる。ウイルスの突然変異は双方の天然に存在す
る、化学的または物理的に誘導または組換え的に導入された突然変異を包含する
。
「ウイルス産生の阻害」またはウイルスの「インヒビター」は、ウイルスの生
活環の任意の段階、例えば、潜伏的感染の再活性化、初期の感染、ウイルスの複
製、ウイルスの転写、ウイルスの翻訳、およびウイルス粒子のパッケージングを
妨害する分子を意味する。このような分子は本発明の培養物を使用して同定する
ことができ、そしてタンパク質のインヒビター、アンチセンス核酸、リボザイム
、およびその他のような分子であることができる。ウイルス産生を阻害する能力
を有することが推測される物質で処理された、単球由来マクロファージを、イン
ヒビターを含まない対照試料と比較する。対照試料（インヒビターで未処理であ
る）に、１００の相対ウイルス産生値を割り当てる。対照に関するウイルス産生
値が約７５、好ましくは５０、より好ましくは２５であるとき、ウイルス産生の
阻害は達成される。
用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖の形成のデオキシリボヌクレオチドまた
はリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。特記しない限り、この
用語は、参照核酸に類似する結合性質を有しかつ天然に存在するヌクレオチドに
類似する方法で代謝される、天然のヌクレオチドの既知のアナローグを含有する
核酸を包含する。特記しない限り、特定の核酸配列は、また、その保存的に修飾
された変異型（例えば、デジェネレイトコドンの置換）および相補的配列ならび
に明白に示した配列を含蓄的に包含する。詳しくは、デジェネレイトコドンの置
換は、１またはそれ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位置が混
合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された、配列を発生させるこ
とによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）
；Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．
、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ９：９１−９８（１９９４））。核酸とい
う用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換
的に使用される。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基
のポリマーを意味するために互換的に使用される。この用語は、１またはそれ以
上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的アナローグ
である、アミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーに適
用される。
本明細書において使用するとき、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」
は、１またはそれ以上の型の化学結合を通して、通常相補的塩基の対合を通して
、通常水素結合を通して、相補的配列のターゲット核酸に結合することができる
核酸として定義される。本明細書において使用するとき、プローブは天然の（す
なわち、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）または修飾された塩基（７−デアザグアノシン、
イノシン、およびその他）を包含することができる。さらに、プローブ中の塩基
は、それがハイブリダイゼーションを妨害しないかぎり、ホスホジエステル結合
以外の連鎖により結合することができる。当業者は理解するように、プローブは
ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシイに依存して、プローブの配列
との完全な相補性を欠如するターゲット配列に結合することができる。プローブ
は好ましくは直接的に、例えば、アイソトープ、発色団、ルミフォアー、色素源
で標識化するか、あるいは間接的に、例えば、ストレプトアビジン複合体を後に
結合できるビオチンで標識化することができる。プローブの存在または非存在を
アッセイすることによって、相補的ターゲット核酸の配列またはサブ配列の存在
または非存在を検出することができる。
「標識化核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、共有結合により、リン
カーを通してまたはイオン、ファン・デル・ワールスまたは水素結合を通して、
標識に結合させて、プローブに結合した標識の存在を検出することによって、プ
ローブの存在を検出できるようにする。
「抗体」は、分析物（抗原）に特異的に結合しかつ認識する、１またはそれ以
上の免疫グロブリン遺伝子、またはそれらのフラグメントにより実質的にコード
されるポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、
ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域の遺伝子
、ならびに無数の免疫グロブリンの可変領域の遺伝子を包含する。軽鎖はカッパ
またはラムダとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、ま
たはイプシロンとして分類され、これらは引き続いて、それぞれ、免疫グロブリ
ンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体からなる。各四量体はポリ
ペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ
ａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、
抗原を認識する約１００または１１０またはそれ多いアミノ酸の可変領域を定め
る。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、軽鎖お
よび重鎖を意味する。
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして存在するか、あるいは種々のペ
プチダーゼを使用する消化により産生された、任意の適切に特性決定されたフラ
グメントとして存在することができる。したがって、例えば、ペプシンは抗体を
ヒンジ領域におけるジサルファイド結合より下で消化して、Ｆａｂの二量体であ
るＦ（ａｂ’）２を産生し、二量体それ自体はジサルファイド結合によりＶＨ−
ＶＬに結合した軽鎖である。Ｆ（ａｂ’）２を温和な条件下に還元してヒンジ領
域においてジサルファイド結合を破壊し、これによりＦ（ａｂ’）２二量体をＦ
ａｂ’モノマーは、本質的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄ
ａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３））。
種々の抗体フラグメントを無傷の抗体の消化により定義されるが、当業者は理解
するように、このようなフラグメントは化学的に、または組換えＤＮＡ法を使用
することによって新たに合成することができる。こうして、抗体という用語は、
本明細書において使用するとき、また、全抗体の修飾により産生された抗体フラ
グメント、あるいは組換えＤＮＡ法を使用して新たに合成されたもの（例えば、
一本鎖ＦＶ）を包含する。
用語「イムノアッセイ」は、分析物に特異的結合する抗体を使用するアッセイ
である。イムノアッセイは、特定の抗体の特異的結合の性質を使用して、ターゲ
ットを単離し、および／または分析物を定量することにより特徴づけられる。
ＩＩＩ．単球由来マクロファージ マクロファージは、骨髄の中に見出される前駆体幹細胞に由来する、最終的に
分化した細胞である。この幹細胞は、究極的に血液リンパ系のすべての細胞に導
く、普通の多能幹細胞であると考えられる（例えば、下記の文献を参照のこと：
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９
３）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、編、第２版、１９８４
））。特定の成熟的微小環境内において、この多能性幹細胞は骨髄性幹細胞に発
育し、次いで特定の発育系列に掛かり合う（単球由来マクロファージの分化に関
係するタンパク質の論考については、例えば、Ｐａｕｌ、ｓｕｐｒａを参照のこ
と）。
マクロファージ系列への発育の掛かり合いは、マクロファージの分化した前駆
体である単球により証明される。単球は血液、組織、および多分骨髄の中に位置
する貯蔵隔室の中を循環しているのが見出される。組織において、単球はさらに
マクロファージに発育する。通常の条件下に、単球またはマクロファージは分裂
しない。
マクロファージは、すべての組織および取り囲む血管の中に、そして上皮細胞
に密接して見出される。異なる組織中のマクロファージは顕著な性質を発生する
ことができる。例えば、腹腔、肺、肝臓、腎臓、骨髄、および脾臓からのマクロ
ファージは、に対して特異的な細胞のレセプター、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現
、および酸化的代謝を有する。それらの主要な機能は、環境を究明し、刺激因子
に対して応答し、そしてＭＨＣクラスＩＩを介して抗原を提示することである。
したがって、マクロファージは食作用において活性であり、ここでマクロファー
ジは細胞外流体を採取し、また、広い範囲の分子に対して表面レセプターを発現
する。この方法において、マクロファージは微生物を取り上げ、サイトカインお
よび外来タンパク質に対して応答することができる。これらの環境的刺激因子に
対する応答において、マクロファージは免疫系の他の細胞に対して内存化した抗
原を提示し、種々の分子を分泌する。こうして、マクロファージは炎症および免
疫学的反応、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介するＴ細胞に対する抗原の提示
に参加する。
ＩＶ．細胞の培養および同種異系的刺激 Ａ．同種異系的刺激およびウイルスの感染または再活性化 本発明の単球由来マクロファージの培養物は、同種異系的刺激反応から誘導さ
れる。同種異系的刺激に暴露される細胞を適当な源から単離し、異種または均質
、例えば、末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）または単球であることができる。細
胞仲介同種異系的刺激反応のために、ＰＢＭＣは典型的には本発明の単球由来マ
クロファージの培養物源として使用される。ＰＢＭＣはほぼ４〜６％の単球を含
有する。単球は、また、２時間の付着で急速に単離することができる。
赤血球から単核細胞を分離することによって、全血試料からＰＢＭＣを調製す
る。多数のＰＢＭＣ単離法、例えば、速度沈降法、等密度沈降法、アフィニティ
ー精製法、およびフローサイトメトリーが存在する。典型的には、ＰＢＭＣは赤
血球から密度勾配（等密度）遠心法により分離し、ここで細胞はそれらの自身の
密度に等しい溶液中の平衡位置に沈降する。密度勾配遠心法のために、生理学的
媒質を使用すべきであり、溶液の密度は高く、そして媒質は浸透圧をほとんど発
揮してはならない。密度勾配遠心法は、溶液、例えば、ナトリウムジトリゾエー
ト−ポリスクロース、フィコール、デキストラン、およびパーコールを使用する
（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ
ｓ（第３版、１９９４）参照）。このような溶液は商業的に入手可能であり、例
えば、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥＲ（Ｓｉｇｍａ）である。
典型的には、抗凝固処理した血液または血漿を、標準的手順に従い。勾配で層
状化し、遠心する（例えば、Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：
３７３７−３７４３（１９９５）参照）。
例えば、Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．における手順を使用して、赤血球およびペレッ
トからの顆粒球は沈降するが、リンパ球および他の単核細胞、例えば、単球は血
漿／密度勾配の界面に止まる（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏ
ｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（第３版、１９９４）参照）。
選択した細胞を単離した後、同種異系的刺激および単球由来マクロファージ（
「ＭＤＭ」）の分化を発生する条件下に細胞を培養する。細胞仲介同種異系的刺
激は、ミスマッチのハプロタイプおよび抗原に対する増殖および分化の応答であ
る。混合ハプロタイプを介する同種異系的刺激は、混合リンパ球または白血球反
応（「ＭＬＲ」）として普通に知られている。よく知られているＭＬＲの１例は
「１方向」反応であり、ここで２つの個体からのＰＢＭＣを混合し、一方の個体
からの細胞を照射またはミトマイシンＣ処理により不活性化させてある。１組の
細胞を不活性化し、他の組の細胞のみは増殖的応答を行う。しかしながら、本発
明の培養物において、反応はまた「２方向」反応として実施することができ、こ
こで双方の組の細胞を刺激して増殖させる。こうして、本発明のＭＤＭ培養物は
１またはそれ以上の遺伝子型を有することができる。
同種異系的刺激は細胞によりサイトカインの産生に依存するので、半透膜を使
用して、同種異系的に刺激されたＰＢＭＣから単球が単離される条件下に、単球
由来マクロファージを培養することもできる。２つの異なるハプロタイプを有す
る個体から細胞、典型的にはＰＢＭＣを混合し、１つの隔室の中に入れるが、細
胞、例えば、ＰＢＭＣまたはより均質な単球の集団（２人のドナーのうちの１人
または第３のドナーからの）を第２隔室の中に入れる。２つの隔室を半透膜によ
り分離し、ここで隔室は流体連絡にある。このようにして、第１隔室中の同種異
系的に刺激されたＰＢＭＣが産生する可溶性因子を第２隔室中の単球を刺激して
ＭＤＭに分化させるために有効である。このような培養装置の１つの例は、トラ
ンスウェルシステム（商業的に入手可能である）であり、ここで下部に０．４５
ミクロンの膜を有する小さいウェルをより大きいウェルの内側に入れる。ＭＤＭ
に分化させるべき単球またはＰＢＭＣを小さいウェルの中に入れ、そしてハプロ
タイプ混合ＰＢＭＣをより大きいウェルの中に入れる。コンディショニングした
培地またはトランスウェルシステムをサイトカイン仲介同種異系的刺激のために
使用することができる。また、サイトカインが外因的に添加された培地を使用す
ることができ、そして培地は細胞と前もって接触されていない。
サイトカインは単球由来マクロファージへの単球の分化を促進するので、同種
異系的刺激は無細胞系において実施することもできる。無細胞、サイトカイン仲
介同種異系的刺激反応において、単一の個体からのＰＢＭＣまたは単球をサイト
カイン，例えば、ＩＦＮ−γで直接的に処理して、ＭＤＭへの単球の分化を活性
化する（例えば、実施例ＩＩ参照）。この型の同種異系的刺激反応をサイトカイ
ン仲介同種異系的刺激と呼ぶ。
例えば、混合ハプロタイプを使用する１つの型の細胞仲介同種異系的刺激反応
において、２つの異なる血液異なるからの典型的には等しい数の生存可能な細胞
を混合する。約１×１０６〜１×１０８細胞／ｍｌ、好ましくはほぼ１〜２×１
０７細胞／ｍｌの濃度で細胞を入れる。好ましくは、付着性培地、例えば、イス
コーブ完全培地をプレーティングのために使用する。培地は典型的には抗生物質
、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、
マイコスタチンおよびその他、好ましくはペニシリンおよびストレプトマイシン
を含有する。培地は、また、血清、好ましくは非熱処理ヒトＡＢ血清を１０％の
濃度で含有する。血清を選択したウイルスに対する抗体について試験すべきであ
る。例えば、ＭＤＭ培養物をＨＣＭＶで感染または再活性化すべきとき、血清は
ウイルス（ＨＣＭＶ）およびウイルスに対する抗体を含有してはならない。
標準的条件下に適当な時間、好ましくは４８時間培養した後、細胞を洗浄して
非付着性細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）を除去する。この時点において、
単球は培養支持体に付着した。次いでほぼ５０％の使用済み培地：５０％の新鮮
な培地から構成された培地中で培養物を維持する。付着後に使用した培地は典型
的には増殖用培地、例えば、ＡＩＭ−Ｖ（Ｇｉｂｃｏ）と付着性培地、例えば、
イスコーブとの混合物である。培地の比は臨界的ではない。好ましくは、培地は
６０％の増殖用培地および３０および付着性培地（イスコーブ）である。この培
地は３〜４日毎に補充され、そして培養物を刺激後９０日まで維持することがで
きる。付着後、培養物はほぼ１０４〜１０４細胞／ｍｌの細胞密度を有する。
ＭＤＭ培養物を同種異系的刺激後ほぼ２２〜２６日に潜伏性ウイルスの再活性
化について検査するか、あるいは同種異系的刺激後ほぼ８〜１０日に外因的ウイ
ルスで感染させる。外因的ウイルスのストックで感染させるために、典型的には
１〜１００の感染多重度（「ＭＯＩ」）を使用して細胞を感染させる（例えば、
実施例Ｉ参照）。次いで細胞を標準的条件下に培養し、後述するように、ウイル
スの存在について検査する。外因的ウイルスまたは再活性化ウイルスで感染した
細胞を、非感染培養物および非ウイルス的許容性培養物と比較する。典型的には
、本発明のウイルス的許容性培養物は非許容性細胞よりも約１０，０００倍より
大きいウイルスを産生する。ＭＤＭ培養物の感染または再活性化のための哺乳動
物ウイルスは、例えば、ＨＣＶ、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ＨＩＶ、およ
びＨＣＶを包含する。ウイルスのストックは商業的に入手可能な源、例えば、Ａ
ＴＣＣ、または患者の単離物（例えば、ＨＣＭＶ単離物ＰＯまたはＰＥ、実施例
Ｉ）から得られる。ウイルスのストックを標準的手順に従い力価測定し、維持す
る（例えば、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅ
ｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；実施例Ｉ参照）。
Ｂ．細胞培養物 一般に、細胞培養の環境は、細胞成長のための支持体、気相、培地、および温
度のような因子の考察を包含する。支持体に結合させた単層中で成長する細胞、
例えば、単球のために、典型的にはプラスチック皿またはフラスコを使用する。
他の人工的支持体、例えば、ガラスおよび金属を使用することができる。支持体
はしばしばエッチングにより処理するか、あるいはコラーゲン、コンドロネクチ
ン、フィブロネクチン、およびラミニンのような物質でコーティングすることに
よって処理する。培養容器の型は培養条件、例えば、多ウェルのプレート、ペト
リ皿、組織培養管、フラスコ、およびその他に依存する。細胞を最適条件下に成
長させ、ここで最適条件は細胞の型に基づいて実験的に決定される。例えば、付
着前に、ＭＤＭ培養に典型的な細胞密度は１×１０６〜１×１０８細胞／ｍｌの
培地で変化し、そして付着後、典型的な細胞密度はほぼ１×１０４〜１×１０６
細胞／ｍｌである。
気相の重要な構成成分は酸素および二酸化炭素である。典型的には、大気の酸
素のテンションをＭＤＭ培養物に使用する。気体透過性キャップを使用するか、
あるいは培養容器の密閉を防止することによって、培養容器を通常インキュベー
ターの雰囲気の中にベントして気体交換を可能とする。二酸化炭素は、細胞培地
中の緩衝剤とともに、ｐＨの安定化においてある役割を演じ、典型的にはインキ
ュベーター中に１〜１０％の濃度で存在する。同種異系的刺激およびＭＤＭ培養
のために好ましいＣＯ２濃度は５％である。
培養した細胞を通常インキュベーター中で成長させる。インキュベーターは、
温度の局所的変化を説明する、適当な温度、例えば、細胞を得た動物の体温を提
供する。一般に、３７℃はＭＤＭ細胞の培養に好ましい温度である。大部分のイ
ンキュベーターはほぼ大気の条件に加湿される。
規定された細胞培地は包装された、プレミックスの粉末または前もって滅菌さ
れた溶液として入手可能である。普通に使用される培地の例は、イスコーブ培地
、ＡＩＭ−Ｖ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、およびマッコイ培地を包含する
（例えば、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ
ａｌｏｇｕｅ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ
ａｌｏｇｕｅ参照）。イスコーブ完全培地は付着前培養のために好ましく、そし
て混合増殖用および付着培地は付着後培養のために好ましい。規定された細胞培
地はしばしば５〜２０％の血清、例えば、ヒト、ウマ、仔ウシ、および胎仔ウシ
血清で補充される。同種異系的刺激およびＭＤＭ培養のために好ましい血清は、
１０％の非熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）である。培地は通常緩衝化し
て、好ましくは７．２〜７．４のｐＨに細胞を維持する。培地の他の補助物質は
、例えば、抗体、アミノ酸、糖類、および成長因子を包含する。
Ｖ．培養した単球由来マクロファージの検出および特性決定 選択の細胞、例えば、ＰＢＭＣまたは単球を同種異系的に刺激し、そして安定
な培養においてＭＤＭに分化させた後、ウイルスの再活性化および感染に対する
許容性について細胞を検査する。典型的には、ＭＤＭ培養物を使用して、潜伏的
感染、例えば、ＨＣＭＶの再活性化を検査する。樹枝状細胞のマーカーを発現す
るマクロファージは、また、ＨＣＭＶ以外の潜伏性ウイルスのための溜を構成す
ることができる。
あるいは、培養物はまた外因的ウイルス感染の研究に有用である。本発明の培
養物は、感染しかつ単球由来マクロファージ中で複製する、多数の型の哺乳動物
のウイルス、例えば、下記のウイルスを研究するために適当である：ＨＣＭＶ（
ヒトサイトメガロウイルス）、ヘルペスファミリーのＤＮＡウイルス；ＨＨＶ６
、ＨＨＶ７およびＨＨＶ８（ヒトヘルペスウイルス６、７、および８）、カポー
ジ肉腫に関連するヘルペスファミリーのＤＮＡウイルス）；ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウ
イルス）；フラビウイルスファミリーのＲＮＡウイルス；およびＨＩＶ（ヒト免
疫不全ウイルス）、レンチウイルスファミリーのＲＮＡウイルス。
種々の技術を使用して、ウイルスによるＭＤＭの感染を検査することができる
。核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅技術を使用して、ウイルスのゲノム
および転写を検出する。この分野において知られている多数の免疫学的技術の任
意の１つを使用して、ウイルスのタンパク質および粒子を検出する。感染した細
胞から上清を単離し、次いで他の細胞をウイルスで感染させることによって、ウ
イルスの力価および感染性を検査する。例えば、ヒト繊維芽細胞のような細胞を
普通に使用して、連続希釈およびプラーク形成アッセイに従い、ウイルスの力価
を測定する。
ＭＤＭのウイルス感染を検出する、これらの技術を多数の用途に使用する。ウ
イルスゲノム配列の検出は、潜伏的感染の診断のために有用である。ウイルスの
転写物、タンパク質、および粒子の検出は、ウイルス産生のインヒビターの作用
の検査に有用である。ウイルスのゲノム、転写物、タンパク質、および粒子の検
出は、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏのウイルスの生活環の研究に有用である。
Ａ．核酸の検出 本発明の細胞からのウイルスのＤＮＡおよびＲＮＡの検出に使用する技術は、
核酸ハイブリダイゼーションをベースとする、広範な種類の技術、例えば、ノザ
ンブロット、サザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡフィンガープリンティン
グ、ＲＮアーゼ保護、およびフィルターハイブリダイゼーションを包含する。核
酸ハイブリダイゼーション技術の１つの変法は、核酸の増幅をベースとする変法
、例えば、逆転写（「ＲＴ」）、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガー
ゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）、および核酸配列をベースとする増幅（「ＮＡＳＢＡ
」）を包含する。これらの方法において使用する検出可能な成分は、例えば、標
識化ポリヌクレオチドのプローブ、増幅またはＲＴ反応における標識の直接的組
込み、および標識化ポリヌクレオチドのプライマーを包含する。
ハイブリダイゼーションアッセイのために使用する核酸のプローブおよびプラ
イマーは、ターゲットのウイルスの遺伝子または転写物に対してハイブリダイゼ
ーションするように選択される。プローブはＤＮＡまたはＲＮＡ分子、ならびに
それらの合成の、天然に存在しないアナローグであることができる。ハイブリダ
イゼーション条件は、本明細書において議論するように、当業者により選択され
る。プライマーおよびプローブは配列および長さが異なることができるが、主要
な識別の因子は機能の１つである：プライマーは、典型的には、ＲＴおよびＰＣ
Ｒ反応におけるように、ターゲット核酸のＤＮＡ合成のための開始点として働く
が、プローブは典型的には相補的ターゲット核酸に対してハイブリダイゼーショ
ンおよびその検出のために使用される。プライマーまたはプローブの典型的な長
さは約７〜約５０ヌクレオチドの範囲であることができる。プライマーまたはプ
ローブは、また、ターゲット核酸に対するプライマーまたはプローブのハイブリ
ダイゼーションの検出のために、検出可能な成分で標識化することができる。
１つの好ましいハイブリダイゼーションアッセイは逆転写である。逆転写はＲ
ＮＡをＤＮＡにコピーする増幅法である。逆転写は、第１鎖のｃＤＮＡを合成し
、典型的には次のようにして実施される。ＲＮＡをランダムヘキサマーのプライ
マーまたは特異的プライマーと混合し、７０℃に５分間加熱して核酸を変性し（
サーマルサイクラーをこの工程に使用することができる）、次いで氷上で冷却す
る。反応混合物を、酵素の製造業者の使用説明書に従うか、あるいはキットの使
用説明書に従い調製し、変性されたＲＮＡおよびヘキサマーの混合物に添加し、
適当な温度、通常４２℃においてインキュベートする。反応混合物を含有する管
を７０℃に１０分間加熱することによって、反応を停止させる。沈降および短時
間の遠心により、第１鎖のｃＤＮＡを収集し、アリコートと新しい管に取り、こ
こでそれをドライアイス上で急速に凍結させ、必要に応じて、後に使用するため
に、−７０℃において貯蔵することができる。
ハイブリダイゼーションアッセイのために他の好ましい型は、ＰＣＲ（ポリメ
ラーゼ連鎖反応）およびＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）のような増幅をベースとす
るアッセイである。このようなアッセイを実施する標準的技術はこの分野におい
て知られている（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎ
ｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
（Ｅｒｌｉｃｈ編、１９８９）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ、Ｇ
ｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｎｓｋｙ、＆ Ｗｈｔｉｔｅ編、１９９０）；Ｍａｔｔ
ｉｌａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４９６７
（１９９１））；Ｅｃｋｅｒｔ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７（１９９１））；Ｗａｌｌａｃｅ
ｅｔ ａｌ．、Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｉｎ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ
ａｎｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．３０７−３２２（Ｐｆｉｅｆｅｒ編、１９
９６）。ＲＴおよびＰＣＲ反応は同一アッセイにおいてしばしば使用され、そし
てＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる。ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡのＤＮＡへの逆転写および引
き続くＤＮＡ増幅反応を単一の反応において組合わせる。最適な逆転写、ハイブ
リダイゼーション、および増幅条件は、使用する１またはそれ以上のプライマー
およびターゲットの配列の組成および長さ、および実施者が選択する実験方法に
依存して変化するであろう。種々のガイドラインを使用して、適当なプライマー
の配列およびハイブリダイゼーション条件を選択することができる（例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒａ参照）。
例えば、ＰＣＲは典型的には緩衝化水溶液中で、好ましくはｐＨ７〜９におい
て実施される。デオキシヌクレオチド三リン酸を合成混合物に適切な量で添加し
、生ずる溶液を約８５〜１００℃に約１〜１０分間加熱することができる。この
任意の加熱期間後、プライマーのハイブリダイゼーションのために、溶液を約２
０〜４０℃に放冷する。重合のための物質を混合物に添加し、そしてこの分野に
おいて知られている条件下に、典型的にはサーマルサイクラーを使用して、反応
を発生させる。室温から重合のための物質がもはや効率よく機能しない温度より
ちょうど上までの温度において、この合成反応を起こすことができる。重合のた
めの物質は、プライマーエクステンション産物の合成を達成するように機能する
、任意の化合物または系であることができ、酵素を包含する。この目的に適当な
酵素は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩまたはクレノー
断片、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼを
包含する。
ウイルスゲノム配列の存在を検出する最後の好ましい方法は、サザンハイブリ
ダイゼーションである。簡単に述べると、ＤＮＡを細胞から単離し、制限酵素で
消化する。消化したＤＮＡを緩衝液中においてアガローススラブ上で展開し、膜
に移す。ウイルスの核酸に対して特異的にハイブリダイゼーションする、標識化
プローブを使用して、膜に対するハイブリダイゼーションを実施する（例えば、
Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｓ
ｕｐｒａ；実施例ＩＩＩ参照）。
また、ウイルスが感染した細胞はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによ
り同定することができる。標準的方法に従い、組織または細胞の試料をガラスス
ライド上に固定し、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術とともに使用す
るために透過性とする。試料を固定した後、選択したウイルス核酸に対して特異
的にハイブリダイゼーションするプライマーを試料に対してハイブリダイゼーシ
ョンさせ、次いでプライマーのハイブリダイゼーションを、例えば、ＲＴ−ＰＣ
Ｒプロトコールまたは本明細書に記載する他の方法に従い、検出する。
前述の、ハイブリダイゼーションを検出する、これらの方法は、一般に、検出
可能な成分の使用を含む。検出可能な成分を含むプライマーおよびプローブを、
この分野において知られている標準的方法により合成する（例えば、Ａｕｓｂｅ
ｌ ｅｔａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ参照
）。検出可能な成分は直接的または間接的に検出可能であり、プライマーまたは
プローブに関連させることができる。直接的に検出可能な成分は、例えば、分子
の５’末端において３２Ｐで標識化されたポリヌクレオチド、または放射性ヌク
レオチド組込んだポリヌクレオチドを包含する。間接的に検出可能な成分は、例
えば、ストレプトアビジンにより認識されるビオチニル化ヌクレオチド組込んだ
ポリヌクレオチド、または放射能標識化相補的配列のための結合相手であるヌク
レオチド配列を包含する。
検出可能な成分は、しばしば、測定可能なシグナル、例えば、放射性、色素形
成、または蛍光シグナルを発生し、これらは、例えば、ウイルス産生を検出する
物質の能力を測定するための、結合した検出可能な成分を定量するために使用す
ることができる。シグナルの定量は、この分野において知られている方法、例え
ば、シンチレーションカウンティング、デンシトメトリー、またはフローサイト
メトリーにより達成される。
好ましくは、アプライド・バイオ・システムス（Ａｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ）または他の商業的に入手可能なオリゴヌクレオチドの合成装置を製
造業者により提供される規格書に従い使用して、オリゴヌクレオチドを合成する
。任意の適当な方法、例えば、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法
、またはそれらの自動化された態様を使用して、オリゴヌクレオチドを製造する
ことができる。１つのこのような態様において、ジエチルホスホルアミダイトを
出発物質として使用し、そしてジエチルホスホルアミダイトは、下記の文献に記
載されているように、合成することができる：Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．
、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９（１９８１）、お
よび米国特許第４，４５８，０６６号。
また、プラスミドまたは他のベクターを使用して、核酸、例えば、プローブを
組換え的に製造することができる。ヌクレオチド配列の複製および転写するため
に、適当なプロモーター、複製配列、選択可能なマーカー、およびその他を含め
ることによって、原核生物または真核生物中で機能するように、ベクターを適合
させることができる。ベクターの構築およびトランスフェクトされた細胞中の遺
伝子の複製および発現は、また、この分野においてよく知られている分子クロー
ニング技術の使用を包含する（例えば、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒ
ａ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍ
ｅｌ、Ｖｏｌ．５２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（１
９８７））。遺伝情報を細胞の中に輸送するために使用する特定のベクターは、
また、特には臨界的ではない。問題の配列を含有するベクターを、複製および発
現のために宿主細胞の中に形質転換することができる。宿主細胞の中に遺伝物質
を導入するために使用する特定の手順は、特には臨界的ではない。利用する特定
の手順は、遺伝子を発現できる宿主細胞の中に少なくとも１つの遺伝子を首尾よ
く導入することができることのみが必要である（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅ
ｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ；Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒａ参照）。
Ｂ．ウイルスのタンパク質および細胞表面のマーカーの免疫学的検出 核酸のハイブリダイゼーション技術を使用するウイルスの遺伝子および遺伝子
の発現に加えて、ウイルスのタンパク質を検出し、そしてウイルス産生を阻害す
る能力について試験する物質の阻害活性を測定するために、イムノアッセイを使
用することもできる。イムノアッセイを使用して、例えば、ウイルス産生を阻害
する物質についてのアッセイにおいて、感染した細胞におけるウイルスタンパク
質の産生を定性的または定量的に分析することができる。適用可能な技術の一般
的外観は、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（１９８８）の中に見出すことができる。
１．ウイルスタンパク質に対する抗体 ウイルスタンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体を産生する方法は、この分野において知られている（例えば、Ｃｏｌｉ
ｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（
１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａｃ；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）；およびＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７（１９７５）参照）。このような
技術は、ファージまたは同様なベクター中の組換え抗体のライブラリーからの抗
体の選択により抗体の産生、ならびにウサギまたはマウスを免疫化することによ
るポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生を包含する（例えば、Ｈ
ａｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８
９）；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９
８９）参照）。
多数のウイルスタンパク質の免疫原を使用して、ウイルスタンパク質と特異的
に反応する抗体を製造することができる。例えば、一般的に前述したように、組
換えウイルスタンパク質またはその抗原性フラグメントを単離し、真核細胞また
は原核細胞中で発現させ、そして精製することができる。組換えタンパク質は、
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生に好ましい免疫原である。
あるいは、合成ウイルスペプチドを担体タンパク質に結合させ、免疫原として使
用することができる。天然に存在するタンパク質を、また、純粋な形態または不
純物の形態で使用することができる。次いで、抗体を産生することができる動物
に、産物を注入する。タンパク質を測定するイムノアッセイにおいて、引き続い
て使用するために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を発生させる
。抗原として使用するために適当なウイルスタンパク質は、ヘルペスウイルス（
例えば、ＨＨＶ６〜８またはＣＭＶ）の主要な初期タンパク質および糖タンパク
質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ；ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、ホスホタンパク質ｐ
２４、ＲＴ、およびプロテアーゼ；ＨＣＶ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、および
構造タンパク質Ｃを包含する。
ポリクローナル抗体を製造する方法はこの分野において知られている。標準的
アジュバント、例えば、フロインドアジュバント、および標準的免疫化プロトコ
ールを使用して、マウスまたはウサギの同系交配系統をタンパク質で免疫化する
。被験採血を取り、選択したウイルス抗原に対する反応性の力価を測定すること
によって、免疫原調製物に対する動物の免疫応答をモニターする。免疫原に対し
て適当に高い抗体力価が得られたとき、血液を動物から収集し、抗血清を製造す
る。必要に応じて、抗血清をさらに分画してタンパク質に対して反応性の抗体を
濃縮することができる（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ参照）。
当業者に知られている種々の技術によりモノクローナル抗体を得ることができ
る。簡単に述べると、所望の抗原で免疫化した動物からの脾細胞を、普通に骨髄
腫細胞との融合により、永久分裂能化させる（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．６：５１１−５１９（１９７６）参照）。
永久分裂能化の別法は、ＥＢウイルス、オンコジーン、またはレトロウイルスを
使用する形質転換、あるいは他のこの分野においてよく知られている方法を包含
する。単一の永久分裂能化細胞から発生単一のコロニーを、所望の特異性および
抗原に対してアフィニティーを有する抗体の産生についてスクリーニングし、そ
して種々の技術、例えば、脊椎動物の宿主の腹腔の中への注入により、このよう
な細胞が産生するモノクローナル抗体を増強することができる。あるいは、Ｈｕ
ｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９
）により概説されている一般的プロトコールに従い、ヒトＢ細胞からのＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその
結合性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ、例
えば、固体の支持体上に固定化された免疫原を使用する固相イムノアッセイにお
いて免疫原タンパク質に対する力価を測定する。１０４またはそれより大きい力
価を有するポリクローナル抗血清を選択し、競合結合イムノアッセイを使用して
、非ウイルスタンパク質またはさらに他の相同的タンパク質に対する交差反応性
について試験する。特異的ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は通
常少なくとも約０．１ｍＭ、より通常少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくと
も約０．１μＭまたはそれよりすぐれた、最も好ましくは０．０１μＭまたはそ
れよりすぐれたＫｐで結合するであろう。
いったんウイルスの特異的抗体が入手されると、ウイルスタンパク質を種々の
イムノアッセイ法により検出することができる。免疫学的およびイムノアッセイ
の手順については、下記の文献を参照のこと：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ編、第７版、１９
９１参照）。そのうえ、本発明のイムノアッセイは、下記の文献において広範に
概観されている、いくつかの遠心法の任意のものに従い実施することができる：
Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；およびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ
。
２．免疫学的結合アッセイ ウイルスタンパク質の発現は、感染または潜伏的感染の再活性化のシグナルで
ある。ウイルス産生の阻害は、また、ウイルスタンパク質の発現レベルをモニタ
ーすることによって測定することができる。したがって、多数のよく認識されて
いる免疫学的結合アッセイの任意のアッセイにより、ウイルスタンパク質を検出
しおよび／または定量することができる（例えば、米国特許第４，３６６，２４
１号、米国特許第４，３７６，１１０号、米国特許第４，５１７，２８８号、お
よび米国特許第４，８３７，１６８号参照）。一般的イムノアッセイの概観につ
いては、下記の文献を参照のこと：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｖｏｌ．３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ（Ａｓａｉ編、１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ編、第７版、１９９１）。典型的
には、疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、分析物（この場合にお
いて、ウイルスタンパク質またはその抗原性サブ配列）に特異的に結合しかつし
ばしばそれを固定化する「捕捉因子」を利用する。捕捉因子は分析物に特異的に
結合する成分である。当業者によく知られておりかつ前述した、多数の手段によ
り、抗体を製造することができる。
イムノアッセイは、また、捕捉因子および分析物により形成された結合性複合
体に特異的に結合しかつそれを標識化する標識化因子をしばしば利用する。標識
化因子は、それ自体、抗体／分析物複合体からなる成分の１つであることができ
る。こうして、標識化因子は標識化されたウイルスのポリペプチドまたは標識化
された抗体であることができる。あるいは、標識化因子は抗体／抗原複合体に特
異的に結合する第３成分、例えば、他の抗体であることができる。
１つの態様において、標識化因子は標識を支持する第２抗体である。あるいは
、第２抗体は標識を欠如するが、引き続いて、第２抗体が由来する種の抗体に対
して特異的な、標識化された第３抗体により結合されることができる。第２抗体
は検出可能な成分、例えば、ビオチンで修飾することができ、この検出可能な成
分に、第３の標識化された分子、例えば、酵素標識化ストレプトアビジンは特異
的に結合することができる。
免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合することができる他のペプチド、例
えば、プロテインＡまたはタンパク質Ｇをまた標識化因子として使用することが
できる。これらのタンパク質は、ストレプトコッカルの細菌の細胞壁の通常の構
成成分である。それらは種々の種からの免疫グロブリンの定常領域に対して強い
非免疫原性反応性を示す（一般的に、Ｋｒｏｎｖａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ
ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２（１９８５）
）。
アッセイを通じて、試薬の各組合わせ後に、インキュベーションおよび／また
は洗浄の工程を必要とすることがある。インキュベーション工程は約５秒〜数時
間好ましくは約５分〜約２４時間で変化させることができる。しかしながら、イ
ンキュベーション時間はアッセイのフォーマット、分析物、溶液の体積、濃度、
およびその他に依存するであろう。通常、アッセイは周囲温度において実施され
るであろうが、ある範囲の温度、例えば、１０℃〜４０℃において実施すること
ができる。
試料中のウイルスタンパク質を検出するイムノアッセイは競合的または非競合
的であることができる。非競合的イムノアッセイは、捕捉された分析物（この場
合において、タンパク質）の量を直接測定するアッセイである。１つの好ましい
「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、捕捉因子（抗ウイルスタンパク質
の抗体）を固体の支持体に直接結合させて、固体の支持体上に捕捉因子を固定化
することができる。次いで、固定化された抗体は試験試料の中に存在するウイル
スタンパク質を捕捉する。こうして固定化されたウイルスタンパク質は次いで標
識化因子、例えば、標識を支持する第２ウイルスタンパク質の抗体により結合さ
れる。あるいは、第２抗体は標識を欠如することができるが、引き続いて、第２
抗体が由来する種の抗体に対して特異的な、標識化された第３抗体を第２抗体に
結合させることができる。第２抗体を検出可能な成分、例えば、ビオチンで修飾
することができ、この検出可能な成分に、第３の標識化された分子、例えば、酵
素標識化ストレプトアビジンは特異的に結合することができる。
競合アッセイにおいて、試料の中に存在するウイルスタンパク質（分析物）の
量は、試料の中に存在する分析物により捕捉因子（抗ウイルスタンパク質の抗体
）から置換された（または競合する）添加された（外因的）分析物の量を測定す
ることによって、間接的に測定される。１つの競合的アッセイにおいて、既知の
量の、この場合において、選択したウイルスタンパク質を試料に添加し、次いで
試料を捕捉因子、この場合において、選択したウイルスタンパク質に特異的に結
合する抗体と接触させる。抗体に結合するウイルスタンパク質の量は、試料の中
に存在するウイルスタンパク質の濃度に逆比例する。特に好ましい態様において
、抗体を固体の支持体上に固定化する。抗原／抗体の複合体の中に存在するウイ
ルスタンパク質の量を測定するか、あるいは残留する非複合化タンパク質の量を
測定することによって、抗体に結合したウイルスタンパク質の量を決定すること
ができる。ウイルスタンパク質の量は、標識化ウイルスタンパク質の分子を準備
することによって検出することができる。
ハプテン阻害アッセイは他の好ましい競合アッセイである。このアッセイにお
いて、既知の分析物を固体の支持体上に固定化し、そして既知量の抗体を試料に
添加する。次いで固定化された試料を、抗原および抗体を含有する試料と接触さ
せる。抗体に結合するウイルスタンパク質の量は、試料の中に存在するウイルス
タンパク質の濃度に逆比例する。再び、抗体の固定化された画分または溶液の中
に残留する抗体の画分により、固定化された抗体の量を検出することができる。
前述したように、検出は間接的であることができ、ここで抗体に特異的に結合す
る標識化成分を引き続いて添加することによって、抗体は標識化されるか、ある
いは間接的である。
ウェスタンブロット（イムノブロット）を使用して、試料中のウイルスタンパ
ク質の存在を検出し、定量する。この技術は、一般に、分子量に基づいてゲル電
気泳動により試料のタンパク質を分離し、分離されたタンパク質を適当な固体の
支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘
導化されたナイロンフィルター）に移し、そして選択した抗原に特異的に結合す
る抗体と試料をインキュベートすることからなる。抗体は固体の支持体上の抗原
に特異的に結合する。これらの抗体は直接標識化するか、あるいは引き続いて一
次抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識化ヒツジ抗マウス抗体）を
使用して検出することができる。
他のアッセイのフォーマットはリポソームイムノアッセイ（「ＬＩＡ」）を包
含し、これは特定の分子（例えば、抗体）に結合し、包膜された試薬またはマー
カーを解放するように設計されたリポソームを使用する。次いで解放された化学
物質を標準的技術に従い検出する（Ｍｏｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｍｅｒ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１（１９８６）参照）。
当業者は理解するように、イムノアッセイにおいて非特異的結合を最小化する
ことがしばしば望ましい。特に、アッセイが固体の支持体上に固定化された抗原
または抗体を含む場合、支持体に非特異的に結合する量を最小化することが望ま
しい。このような非特異的結合の手段は当業者によく知られている。典型的には
、この技術は支持体をタンパク質の組成物でコーティングすることを包含する。
特に、タンパク質の組成物、例えば、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、無脂
肪粉末状ミルク、およびゼラチンは広く使用されており、粉末状ミルクは最も好
ましい。
アッセイにおいて使用される特定の標識または検出可能な基は、アッセイにお
いて使用される抗体の特異的結合を妨害しないかぎり、本発明の決定的な面では
ない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的性質を有する、任意の物
質であることができる。このような検出可能な標識はイムノアッセイの分野にお
いてよく開発されてきており、そして、一般に、このような方法において有用な
大部分の標識を本発明に適用することができる。こうして、標識は分光的、光化
学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能
な、任意の組成を有する。本発明において有用な標識は、磁気ビーズ（例えば、
ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネ
ート、テキサスレッド、ローダミン、およびその他）、放射能標識（例えば、３
Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて普通
に使用されている他のもの）、および比色標識、例えば、コロイド状金または着
色したガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラ
テックス、およびその他）ビーズを包含する。
この分野においてよく知られている方法に従い、標識をアッセイの所望の成分
に直接的または間接的にカップリングすることができる。上に示したように、広
範な種類の標識化を使用することができ、標識の選択は必要な感受性、化合物と
の結合、安定性の要件、入手可能な計装、および廃棄の条件の各々に依存する。
非放射性標識化はしばしば間接的手段により結合される。一般に、リガンド分
子（例えば、ビオチン）を分子に共有結合させる。次いでリガンドは抗リガンド
（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合し、この分子は固有的に検出可能で
あるか、あるいはシグナル系、例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化
学発光化合物に共有結合される。多数のリガンドおよび抗リガンドを標識化され
た、天然に存在する抗リガンドと組み合わせて使用することができる。あるいは
、任意のハプテンまたは抗原性化合物を抗体と組み合わせて使用することができ
る。
分子は、また、シグナル発生化合物に、例えば、酵素または蛍光団との複合化
により、直接複合化することができる。標識として重要な酵素は主としてヒドロ
ラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグルコシダーゼ、またはオキ
シダーゼ、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物は、フルオレセインおよ
びその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウベリフェロン、およ
びその他を包含する。化学発光化合物は、ルシフェリン、および２，３−ジヒド
ロフタラジンジオン、例えば、ルミノールを包含する。使用できる種々の標識化
またはシグナル生成系の概観については、米国特許第４，３９１，９０４号を参
照のこと。
標識化を検出する手段はこの分野においてよく知られている。こうして、例え
ば、標識が放射性標識である場合、検出手段はシンチレーションカウンターまた
はオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムを包含する。標識が蛍光
標識である場合、それは蛍光色素を適当な波長で励起させ、そして生ずる蛍光を
検出することによって検出することができる。蛍光は視的に、写真フィルムによ
り、電子的検出器、例えば、電化結合素子（「ＣＣＤ」）または光電子増倍管お
よびその他の使用により検出することができる。同様に、酵素標識は酵素のため
に適当な基質を準備し、そして生ずる反応産物を検出することによって検出する
ことができる。最後に、簡単な比色標識は単に標識に関連する色を観測すること
によって検出することができる。こうして、種々のディップスティックアッセイ
において、結合した金はしばしばピンクを示すが、種々の結合したビーズはビー
ズの色に見える。
いくつかのアッセイのフォーマットは標識化成分の使用を必要としない。例え
ば、凝集アッセイを使用してターゲット抗体の存在を検出することができる。こ
の場合において、抗原をコーティングした粒子はターゲット抗体を含む試料によ
り凝集する。このフォーマットにおいて、成分を標識化することは不必要であり
、そしてターゲット抗体の存在は簡単な視的検査により検出される。
ＶＩ．ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージの特性決定 前述の免疫学的および核酸の技術は、また、特異的細胞のマーカーを使用して
、本発明のウイルス的に許容性の単球由来マクロファージを単離することができ
る。種々の細胞の精製法はこの分野において知られている。典型的には、細胞を
単離する物理的分離技術と組み合わせて使用するために、物理的または機能的マ
ーカーを選択する。例えば、細胞を精製するために免疫学的技術と組み合わせて
、細胞表面の分子がしばしば使用される。例えば、本発明のウイルス的に許容性
のＭＤＭは、マクロファージ細胞表面のマーカーＣＤ１４およびＣＤ６４、およ
び樹枝状細胞のマーカーＣＤ６８、ＣＤ１ａおよびＣＤ８３を発現する。ＨＣＶ
による潜伏的感染は他の適当なマーカーである。あるいは、ウイルス的許容性の
機能的特性を使用してＭＤＭを単離することができる。本発明のＭＤＭについて
、細胞表面のマーカーＣＤ１４およびＣＤ８３は単離のための好都合な物理的マ
ーカーを提供する。したがって、ＣＤ１４およびＣＤ８３に対する抗体を使用し
て細胞を同定する（マーカーとして使用する追加の抗原については、実施例ＩＶ
を参照のこと）。ＣＤ１４、ＣＤ８３および他の細胞表面の抗原は商業的に入手
可能である。
前述したように、抗体を抗原に結合させる、多数の技術はこの分野において知
られている。抗体が結合した細胞は標識化するか、あるいはしないことができる
。いったん抗体が細胞に結合したとき、物理的分離技術を使用して、培養中の細
胞の残部から抗体結合細胞を分離する。例えば、細胞をアフィニティーカラムの
上を通過させるか、あるいはフローサイトメトリーに付すことができる。他の技
術は、密度勾配遠心法、免疫パニング、磁気活性化細胞ソーティング、およびフ
ィコール勾配の電気泳動またはカーテン電気泳動を包含する（例えば、Ｆｒｅｓ
ｈｎｅｙ、ｓｕｐｒａ参照）。単離後、精製されたＭＤＭ細胞を前述したように
培養する。
ＶＩＩ． ウイルス活性化、ウイルスインヒビター、およびウイルス感染につい
てのアッセイ 本発明は、ＨＣＭＶ潜伏的感染を再活性化することができる、安定なＭＤＭの
ウイルス的許容性培養物を最初に提供する。こうして、これらの培養物を使用し
て、ウイルス産生および潜伏的感染の再活性化を阻害する物質を同定することが
できる。ウイルス産生は、例えば、ＨＨＶ６〜８、ＨＩＶ、およびＨＣＶならび
にＨＣＭＶであることができる。
ウイルス産生を阻害する分子の能力は、前述の種々のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセ
イ、例えば、イムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセイを使用
して、アッセイすることができる。ウイルス産生のインヒビターは、潜伏的感染
および外因的感染の双方の、哺乳動物のウイルス疾患の薬学的治療剤として有用
である。特に、ウイルス産生のインヒビターは潜伏性ウイルスの感染の再活性化
を防止するために使用することができる。
ウイルス産生の潜在的インヒビターである分子は、アンチセンス核酸、リボザ
イム、小さい化学的分子、およびタンパク質を包含する。ウイルス産生の阻害の
ためのターゲットは、酵素、例えば、ウイルスゲノムの複製に関係するウイルス
ポリメラーゼ、ウイルス転写のアクチベーター、ウイルスプロテアーゼ、例えば
、ＵＬ８０、ＵＬ８９、およびＨＩＶプロテアーゼ、およびウイルス粒子の成分
を包含する。インヒビターはターゲット遺伝子、ｍＲＮＡ、およびタンパク質で
あることができる。種々の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポ
レーション、感染、リポフェクション、受動的拡散、脂質溶解度、および活性輸
送により、インヒビターを細胞に導入することができる。
ウイルス産生の潜在的インヒビターで処理された細胞の試料またはアッセイを
、インヒビターを含まない対照試料と比較して、阻害の程度を検査する。典型的
には、ＭＤＭの培養物を外因的に添加されたウイルスまたは潜伏性ウイルスで感
染させる。対照の非感染培養物と平行して、細胞の試料を潜在的インヒビターで
処理し、適当な期間の間インキュベートし、次いでウイルス産物について検査す
る。対照試料（インヒビターで未処理）に、１００の相対的ウイルス産生活性値
を割り当てる。対照に関するウイルス産生活性値が約７５、好ましくは５０、よ
り好ましくは２５であるとき、ウイルス産生の阻害は達成される。
ウイルス産生のインヒビターの効能を決定するために、細胞をウイルス遺伝子
の発現産物についてアッセイする。前述の核酸および免疫学的技術を使用して、
ウイルス転写、ウイルスタンパク質の発現、およびウイルス粒子を検出すること
ができる。
前述したように、ウイルス感染の特性決定は、また、有用なｉｎ ｖｉｔｒｏ
診断道具である。潜伏的感染の間に、典型的にはウイルスゲノムは部分的または
全体的に抑制される。こうして、ウイルスゲノムを収容する細胞を同定し、次い
で潜伏的感染を再活性化する能力について、またはウイルスゲノムの配列の存在
について検査しなくてはならない。前述の本発明の培養法およびアッセイは、ウ
イルス、例えば、ＨＣＭＶで潜在的に潜伏的に感染された細胞を単離し、そして
細胞を検査して細胞が感染されたか否かを決定する手段を提供する。
この明細書に引用したすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物およ
び特許出願が特別にかつ個々に引用することによって本明細書の一部とされるよ
うに示される場合、引用することによって本明細書の一部とされる。
理解を明瞭とする目的で例示および実施例により本発明を多少詳細に説明した
が、本発明の教示にかんがみて当業者にとって容易に明らかなように、本発明の
精神または範囲から逸脱しないである種の変化および変更が可能である。
実施例 下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきで
はない。本質的に同様な結果を生ずるように変化または変更することができる、
種々の非決定的なパラメーターは、当業者は容易に認識するであろう。実施例 Ｉ： 同種異系的またはマイトジェンの刺激によるＰＢＭＣからのマクロ
ファージの発生はＨＣＭＶの変更された成長を生ずる 方法 Ａ． 同種異系的に刺激されたＰＢＭＣ培養物の確立 同種異系的に刺激されたＭＤＭ（「Ａｌｌｏ−ＭＤＭ」）を製造するために、
以前に記載されているように（Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．、１９９５）ＨＩＳＴＯ
ＰＡＱＵＥＲ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）上の密度勾配
遠心法により、３２人の健康な血液ドナーの血液試料からＰＢＭＣを単離した。
引き続いて、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトアビジン（１００μ
ｇ／ｍｌ、双方はＧｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから）および１０％の
ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、非熱不活性化
、抗ＣＭＶ陰性）を含有するイスコーブ完全培地の中にＰＢＭＣを懸濁させた。
同種異系的刺激検査のために、２人の異なる血液ドナーからの等しい数の細胞を
１．８×１０７細胞／ｍｌの濃度で混合した後、プリマリア（Ｐｒｉｍａｒｉａ
）皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をプレートした。５％ＣＯ２中で３
７℃において４８時間培養した後、非付着性細胞を取出した。培養物を洗浄し、
５０％の使用済み培地／５０％の新鮮な培地から構成された培地中で維持し、培
地を刺激後９０日まで３〜４日毎に補充した。以前に記載されているように（Ｆ
ｉｓｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１８５５−１８６２（１９９６
））個々のドナーからのＰＢＭＣをコンカナバリンＡで刺激することによって、
対照細胞の培養物を確立した。刺激後第１日を、初期のＰＢＭＣの単離および同
種異系的刺激またはコンカナバリンＡ刺激後の日として定義する。潜在的ＨＣＭ
Ｖ再活性化のためのドナーはＨＣＭＶ陽性であり、外因的ウイルスの培養のため
のドナーはそのウイルスに対して血清反応陰性であった。
また、トランスウェル系を使用して、培養を確立した。この系において、２人
のドナーからのＰＢＭＣを混合し、外側のウェルの中に入れた。ドナーの一方ま
たは第３のドナーからのＰＢＭＣを内側のウェルの中に入れ、このウェルは下部
に０．４５ミクロンの膜を有した。この膜は２つの隔室中のＰＢＭＣを流体連絡
に維持させる。４８時間後、内側のウェル中の細胞をプレートし、洗浄してＭＤ
Ｍ培養物を確立した。
Ｂ．ＭＤＭ培養物のＨＣＭＶ感染 ＨＣＭＶの２つの最近の患者の単離物を使用して、ＭＤＭの一次培養物を感染
させた。ＨＣＭＶ疾患を有する移植患者から、これらの単離物（ＰＯおよびＰＥ
）を単離した。感染したヒト繊維芽細胞（「ＨＦ」）培養物の上清から、−７０
℃で貯蔵する無細胞ウイルスのストックを調製した。実験において使用するウイ
ルス系統をＨＦ細胞中で１５回以下継代した。同種異系的刺激またはコンカナバ
リンＡで刺激後８〜１０日に、ＭＤＭ培養物をＨＦ上清で１〜１０の感染多重度
（「ＭＯＩ」）で感染させた。モック感染のために、非感染培養物からの培地に
細胞を暴露させた。培養物を３日毎に供給し、感染後異なる時点でウイルス力価
のアッセイのために収集した。
Ｃ．イムノサイトメトリー ８ウェルのチャンバーのスライドまたはプリアマリア（Ｐｒｉｍａｒｉａ）９
６ウェルのプレート中で成長させた、感染したＨＣＭＶおよびモック感染したＭ
ＤＭ培養物を感染後異なる時点において収集した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、リ
ン酸塩緩衝化１％パラホルムアルデヒド（「ＰＦＡ」）またはメタノール／アセ
トン（１：１）中で室温において１０分間固定し、ＰＢＳ中の０．３％トリトン
−Ｘ１００で透過性とした。細胞をＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清または１０％
ヒトＡＢ血清で室温において３０分間ブロックし、その後、異なるＨＣＭＶ遺伝
子産物に対する抗体で１：１００希釈で室温において１〜１６時間ブロックし、
主要な即時型タンパク質（ウサギ抗ＭＩＥ（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２６９９−２７０８（１９８９））、またはｇＢ（マウ
ス抗ｇＢ（ＵＬ５５））に対する抗体でブロックした。双方モノクローナル抗体
はＷｉｌｌｉａｍ Ｂｒｉｔｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ
、アラバマ州バービンガム）から提供された（Ｂｒｉｔｔ ＆ Ｖｕｇｌｅｒ、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６７４７−６７５４（１９９２））。
細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート−テ
トラメチル（「ＦＩＴＣ」）結合ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ抗体で室温に
おいて１〜２時間、一次抗体の結合を検出した。細胞表面のマーカーについて二
重イムノサイトメトリーを生きている細胞について実施した後、固定し、ＨＣＭ
Ｖ ＩＥ抗原について染色した。染色された細胞をＰＢＳ中で洗浄し、スロー・
フェイド・アンチフェイド・キット（Ｓｌｏｗ ｆａｄｅ Ａｎｔｉｆａｄｅ
Ｋｉｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｄｂｅｓ Ｉｎｃ．、オレゴン州エウゲ
ン）の中に取り付けて最小蛍光退色を保証した。蛍光陽性の細胞を直立または倒
立ライツ（Ｌｅｉｔｚ）蛍光顕微鏡で可視化し、感染した細胞を計数した。
Ｄ．樹枝状細胞の培養 ＰＢＭＣを前述したように単離し、プリマリアプレート上にプレートして単球
を付着させた。２時間培養した後、無血清培地中で３回洗浄して非付着性細胞を
除去し、そして以前に記載されているように（Ｓａｌｌｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８（１９９４））付着性細胞
をＩｌ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激
した。１％のピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した未熟樹
枝状細胞を、培養の最初の１２日間発育させた。樹枝状およびマクロファージの
マーカーの発現を決定するフローサイトメトリー分析のために、細胞の試料を第
１２日に収集した。小さい、丸い樹枝状細胞をＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）、
ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）、またはＴＮＦ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）で２日間
刺激した。その後、付着性樹枝状細胞を本明細書において記載するようにＨＣＭ
Ｖで１０のＭＯＩでチャレンジするか、あるいはモック感染させた。結果 Ａ．ＨＣＭＶを使用する外因的感染 コンカナバリンＡ刺激ＰＢＭＣ（「Ｃｏｎ Ａ−ＭＤＭ」）またはＡｌｌｏ−
ＭＤＭにより発生したマクロファージにおいて、ウイルスの複製の特性を比較し
た。１０の感染多重度（「ＭＯＩ」）のＡｌｌｏ−ＭＤＭのＨＣＭＶ感染は、細
胞の急速な溶解性感染を生じた。細胞変性作用（「ＣＰＥ」）は感染後の日数（
「ｄｐｉ」）３に検出可能であり、そして感染したＡｌｌｏ−ＭＤＭの＞８０％
の溶解は７ｄｐｉに観察された。１のＭＯＩの感染は、２０日の観察期間にわた
って非溶解性であった。対照的に、Ｃｏｎ Ａ−ＭＤＭのＨＣＭＶ感染はＭＯＩ
＞１０において９０ｄｐｉまでの間隔で非溶解性であった。
Ｂ．ウイルス産生の検出 Ａｌｌｏ−ＭＤＭにおけるＨＣＭＶの複製の反応速度を検査するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ感染した培養物を種々の時点において感染性ウイルスの産生につい
てモニターした。Ａｌｌｏ−ＭＤＭにおけるＨＣＭＶの複製の反応速度は急速で
あり、そして細胞および細胞外の双方の画分において有意な量のウイルスが見出
された。これらの特性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長するＨＣＭＶについてプロト
タイプの細胞である繊維芽細胞中のウイルスの複製に類似する。対照的に、Ｃｏ
ｎ Ａ−ＭＤＭにおけるウイルスの複製は遅延され、より低いレベルのウイルス
の複製を示し、そしてウイルスは細胞の画分に関連してのみ見出された。
Ａｌｌｏ−ＭＤＭにおける非制限ＨＣＭＶの複製についての同種異系的刺激の
重要性は、ＨＬＡが同一の双生児からのＰＢＭＣを混合することによって誘導さ
れた培養物中でウイルスの複製が欠如することによって証明された。ＨＣＭＶ感
染したＡｌｌｏ−ＭＤＭの頻度を、即時型（「ＩＥ」）ならびに後期糖タンパク
質Ｂ（「ｇＢ」）抗原の免疫蛍光による検出によりアッセイした。Ｃｏｎ Ａ−
ＭＤＭ培養物中のウイルス抗原を発現する細胞の小さい数（＜１０％）と対照的
に、Ａｌｌｏ−ＭＤＭの５０％より大きい比率は１２ｄｐｉにおいてＩＥおよび
ｇＢの双方の抗原を発現した。さらに、構造タンパク質ｇＢの発現の反応速度は
Ａｌｌｏ−ＭＤＭ内の急速な産生と相関した。マイトジェン的に分化したＭＤＭ
に比較して、同種異系的に推進された分化プロセスにより発生されたマクロファ
ージ中のＨＣＭＶの高度に変更された激しい成長を、これらの観察は証明する。
Ａｌｌｏ−ＭＤＭはマクロファージのマーカー（ＣＤ１４およびＣＤ６４）お
よび樹枝状細胞のマーカー（ＣＤ８３およびＣＤ１ａ）双方を発現するが、これ
に対してＣｏｎ Ａ−ＭＤＭはマクロファージのマーカー（ＣＤ１４およびＣＤ
６４）のみを発現する。いくつかの樹枝状細胞をＡｌｌｏ−ＭＤＭに関係付ける
ことができるので、ＨＣＭＶの複製を樹枝状細胞において検査した。単球が濃縮
された培養物をＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで処理することによって、単球由来
樹枝状細胞（ＭＤＤＣ）が得られた。ＭＤＤＣは樹枝状細胞のマーカーＣＤ１ａ
およびＣＤ８３を発現したが、単球／マクロファージのマーカーＣＤ１４および
ＣＤ６４を発現しなかった。ＭＤＤＣのＨＣＭＶｉｎ ｖｉｔｒｏ感染は、細胞
の２５〜４５％中で１ｄｐｉにおいてＩＥの発現を生じた。しかしながら、ＩＥ
または後期のウイルス抗原は２０ｄｐｉまでのこの間隔を過ぎて検出されなかっ
た。成熟ＤＣを得るためのＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−γによるＭＤＤＣの追加の
刺激は、刺激後第１２日までに未刺激の細胞において観測された発現を超えてウ
イルスの複製を増加しなかった。これらの結果が示すように、Ａｌｌｏ−ＭＤＭ
、Ｃｏｎ Ａ−ＭＤＭおよびＭＤＤＣのすべてはＣＤ１４＋単球に由来するが、
ＨＣＭＶはこれらの異なる細胞の型の各々において異なる複製パターンを表示す
る。実施例ＩＩ ： Ａｌｌｏ−ＭＤＭの発生はサイトカインＩＦＮ−γ、およびＣＤ
１４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞により仲介される 方法 Ａ．ＰＢＭＣ下位集団の陰性の選択 ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を消耗したＡｌｌｏ−ＭＤＭ培養物を得るため
に、ミニＭＡＣＳ系（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａ
ｄｂａｃｈ、ドイツ国）をそれぞれの細胞の型の陰性の選択のために使用した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞（抗ヒトＬｅｕ−３ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（抗ヒトＬｅｕ−２ａ
、双方はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）またはイソ型対照血清（マウ
スＩｇＧ１Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）に対して
向けられたモノクローナル抗体で、新しく単離したＰＢＭＣを染色した。５００
μｌの無血清イスコーブ培地中の１×１０８細胞を力価過剰のそれぞれの抗体と
４℃において４５分間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、２
５０μｌのＭＡＣＳ緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のＢＳＡを含有す
るＰＢＳ）の中に再懸濁させ、１６０μｌのラット抗マウスＩｇＧ１結合ＭＡＣ
Ｓビーズと４℃において２０分間インキュベートした。
各ＭＡＣＳカラムを１５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、それぞれの試料
を添加した。流れ抵抗下に磁場中のカラムを通して流すことによって、ＭＡＣＳ
ビーズに結合したＰＢＭＣを試料から排除した。各カラムを４ｍｌのＭＡＣＳ緩
衝液で洗浄し、収集した細胞を無血清培地中で２回洗浄し、完全６０／３０培地
中に再懸濁させた。
２人のドナーからの細胞を前述したように同種異系的に刺激した。各Ａｌｌｏ
−ＭＤＭ培養物の確立前に、陰性選択の前後の各試料の小さいアリコートをフロ
ーサイトメトリーにより分析して各試料の満足な純度を保証した。
Ｂ．ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩのブロッキングの実験 Ｔ細胞と単球との間の相互作用をブロックするために、ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、
またはＨＬＡ−ＤＲ（双方はＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈから、メイン州ウェストブル
ック）の定常領域、またはイソ型対照（マウスＩｇＧ２ａまたはマウスＩｇＧ２
ｂ、双方はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対して向けられたモノクローナル抗体を
３５μｇ／ｍｌの濃度において７×１０７と４℃において、同種異系的に刺激前
に、イスコーブ完全培地中で７×１０７細胞と１時間インキュベートした。その
後、培養物中の非付着性細胞および抗体を無血清培地中の３回の洗浄により除去
し、Ａｌｌｏ−ＭＤＭ培養物を完全６０／３０培地中で３０日間まで培養した。
Ｃ．Ａｌｌｏ−ＭＤＭ培養物中の中和 中和実験のために、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＧＦ−αまた
はＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ＭＤＭ培養物中の産生され
たそれぞれのサイトカインをブロックした。抗体を培養物に同種異系的刺激と同
時に添加し、刺激後４８時間培養物の中に存在させた。その後、培養物中の非付
着性細胞および抗体を無血清培地中の３回の洗浄により除去し、Ａｌｌｏ−ＭＤ
Ｍ培養物を完全６０／３０培地中で３０日間まで培養した。
Ｄ．標準的樹枝状細胞培養物へのサイトカインの添加 ＰＢＭＣを標準的条件下にＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとともに培養して、単
球由来樹枝状細胞を産生した（例えば、Ａｎｎａｌｓ Ｓｕｒｇ．２２６：１−
５（１９９７）参照）。樹枝状細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで本明細書に記載する条
件下にＨＣＭＶで感染させた。次いでＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの別々のおよ
び同時の添加により、いくつかの培養物を処理して、これらの標準的方法に従い
培養した細胞中のウイルスの成長に対するサイトカインの効果を検査した。前述
したように、ウイルスタンパク質ＩＥおよびｇＢに対する抗体を使用して、ウイ
ルスの成長を測定する。感染後第１、３、８、１２、および２０日に、ウイルス
の成長を測定する。結果 Ａ．ＰＢＭＣからのＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＭＨＣ分子の消
耗 ＨＣＭＶ許容性Ａｌｌｏ−ＭＤＭの発育のために重要であるＰＢＭＣ集団内の
細胞の因子を同定するために、陰性選択技術に従いＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細
胞をＰＢＭＣから消耗させた。これらの実験のために、Ａｌｌｏ−ＭＤＭ培養物
の確立前に、それぞれの細胞の型を各ドナーのＰＢＭＣから排除した。陰性選択
の前後に、フローサイトメトリー分析を細胞について実施して、残留する細胞の
表現型が３％より低いようにした。ウイルスの抗原投与前のＰＢＭＣからのＣＤ
４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの消耗は、ＩＥを発現するＡｌｌｏ−ＭＤ
Ｍの数を９０％減少させ、そしてウイルス産生を３〜４対数だけ減少させた。
同種異系的刺激前に、ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩに対して向けら
れた中和性抗体をＰＢＭＣに添加すると、また、ウイルスは３〜４対数だけ減少
した。
これらの実験が証明するように、同種異系的反応によるＨＣＭＶ許容性Ａｌｌ
ｏ−ＭＤＭの発生はＣＤ４＋およびＣＤ８＋双方のＴ細胞ならびにＨＬＡクラス
ＩおよびＩＩの分子を含む。ＨＣＭＶ許容性Ａｌｌｏ−ＭＤＭの形成をブロック
するＨＬＡクラスＩおよびＩＩに対して向けられた抗体の能力は、また、Ｔ細胞
の接触がこれらの細胞の特異的分化に必要であることを証明する。
Ｃｏｎ Ａ−ＭＤＭを使用する同様な実験において、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではなく
ＣＤ８＋Ｔ細胞の消耗、およびＨＬＡクラスＩＩＩ分子ではなくＨＬＡクラスＩ
分子の中和はＭＤＭにおけるウイルスの力価を有意に減少することが示された。
これらの観察が示唆するように、ＨＬＡクラスＩ経路を通るＣＤ８＋Ｔ細胞と単
球との接触は、Ａｌｌｏ−ＭＤＭおよびＣｏｎ Ａ−ＭＤＭの双方の発生におい
て重要である。したがって、２つの系の間の決定的な差は、ＨＣＭＶ許容性Ａｌ
ｌｏ−ＭＤＭの発育のためのＣＤ４＋Ｔ細胞仲介メカニズムによる単球の分化で
ある。
Ｂ．Ａｌｌｏ−ＭＤＭ培養物からのサイトカインの消耗 特定のサイトカインが許容性Ａｌｌｏ−ＭＤＭ中の潜在的ＨＣＭＶの再活性化
を仲介するかどうかを決定するために、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＧＭ
−ＣＳＦ、またはＩＦＮ−γに対する中和活性を有するポリクローナル抗体をＡ
ｌｌｏ−ＭＤＭ培養物に別々に添加した。Ａｌｌｏ−ＭＤＭ培養物中のＩＦＮ−
γの中和は、ウイルス抗原ＩＥおよびｇＢを発現する細胞の有意な減少、ならび
に感染性ウイルスの産生の４対数の減少を生じさせた。さらに、ＩＬ−２の中和
は感染した細胞の数を減少させるように見えた。上に列挙したサイトカインの残
部の中和は、潜在的ＨＣＭＶを再活性化する培養物の能力に影響を与えなかった
。このデータが示すように、特にＩＦＮ−γはＡｌｌｏ−ＭＤＭ中の潜伏性ウイ
ルスの成長に要求される。また、このデータが示すように、Ａｌｌｏ−ＭＤＭの
分化はＧＭ−ＣＳＦの除去により影響を受けるように見えないので、Ａｌｌｏ−
ＭＤＭは新しい細胞の型である。対照的に、ＴＮＦ−γの中和は感染したＣｏｎ
Ａ−ＭＤＭ中のウイルス力価を減少させた。
Ｃ．潜在的ＨＣＭＶの再活性化およびサイトカインの消耗 血清の抗体についてＥＬＩＳＡにより、そしてＰＢＭＣ中のＨＣＭＶのＤＮＡ
の存在についてＰＣＲにより、ドナーをＨＣＭＶの暴露について試験した。前述
したように、中和性抗体を培養物に添加した。中和性抗体を添加しないで感染後
１４〜２１日にＨＣＭＶ ＩＥタンパク質が検出され、そして刺激後２１および
３５日の間に付着性細胞において後期ＨＣＭＶｇＢ抗原が検出された。刺激後５
２日に、ＩＥ陽性細胞を定量した。刺激後の最初の４８時間に、ＩＬ−１、ＩＬ
−２、ＴＮＦ−γ、ＴＧＦ−β、またはＧＭ−ＣＳＦではなく、ＩＦＮ−γの中
和は、ＨＣＭＶ陽性Ａｌｌｏ−ＭＤＭの数を８０〜９５％減少させた。これらの
結果が示すように、Ａｌｌｏ−ＭＤＭ中の潜在的ＨＣＭＶの再活性化はＩＦＮ−
γの産生に依存する。
Ｄ．単球由来樹枝状細胞培養物 単球由来樹枝状細胞培養物をＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを使用する刺激を介
する標準的手順により、単球由来樹枝状細胞培養物を培養した。これらの細胞は
、単球由来マクロファージよりも異なる分化した細胞の型である。ほぼ８日後、
樹枝状細胞を本明細書において記載するように外因的に添加したＨＣＭＶで感染
した。細胞は、ウイルス抗原の発現の欠如により証明されるように、ＨＣＭＶの
成長について許容性ではなかった（上を参照）。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは
培養物のウイルスの許容性に対する効果をもたなかった。実施例ＩＩＩ ： 健康な血液ドナーから得られたＡｌｌｏ−ＭＤＭからの潜在的
ＨＣＭＶの再活性化およびＨＣＭＶの特性決定 方法 Ａ．ウイルス力価のアッセイ ＭＤＭ培養物からの上清を感染後の異なる日に収集し、そして２％の胎仔ウシ
血清（「ＦＢＳ」）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン
および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地の中に、
付着性細胞をこすり取って入れることによって、ＭＤＭを収集した。上清または
超音波処理したＭＤＭ細胞をＨＦの単層上にサブコンフルエンシーにおいてプレ
ートした。３７℃でウイルスを最初の２４時間付着させた後、細胞を培地中で２
回洗浄し、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのスト
レプトマイシン、および０．５％のオートクレーブ処理したＳｅａＫｅｍアガロ
ース（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ培地をオーバーレイした。培養物を１４
日間インキュベートし、４日毎に供給した。細胞をＰＢＳ中の２５％のホルムア
ルデヒドで１５分間固定し、０．０５％のメチレンブルー溶液で染色し、プラー
クを計数した（Ｗｅｎｔｗｏｒｔ ＆ Ｆｒｅｎｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘ
ｐｅｒ．Ｂｉｏｌ ＆ Ｍｅｄ．１３５：２５３−２５８（１９７０））。
Ｂ．Ａｌｌｏ−ＭＤＭ中のＨＣＭＶの複製の検出 前述したように、２人の健康な血液ドナーからＰＢＭＣを混合することによっ
て、Ａｌｌｏ−ＭＤＭ培養物を確立した。ＨＣＭＶ遺伝子産物の検出、および／
またはウイルスの回収のために、試料を第１、１０、１７、２６、３６、４６、
５４、６０、７０、８０および９０日に収集した。視的単離のために、超音波処
理した細胞を９６ウェルのプレートまたは２５ｃｍ２の培養フラスコ中のＨＦ（
ヒト繊維芽細胞）上にサブコンフルエンシーでプレートした。４ぽ毎に供給しな
がら９６ウェルのプレート中のＨＦ細胞を１７〜２０日間インキュベートし、固
定し、ＩＥに対するポリクローナル抗体を使用してＨＣＭＶ ＩＥ抗原の存在に
ついて染色した（Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３７３７−
３７４３（１９９５））。
ＰＣＲ分析のために、示した時点においてこすり取りにより細胞の試料を収集
した。それぞれ、ＱＩＡＧＥＮ ＢｌｏｏｄおよびＣｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
ＤＮＡキットおよびＲＮｅａｓｙキットを製造業者の使用説明書に従いを使用し
て、ＤＮＡおよびＲＮＡを調製した。ＨＣＭＶ特異的プライマーをネステッドＲ
Ｔ−ＰＣＲ反応において使用して、ＩＥおよびっ１５０ＲＮＡを検出した（Ｓｓ
ｄｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９９３）。ＤＮＡまたはＲＮＡの存在につい
て陽性の対照として、グルコース−６−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ（「Ｇ
６ＰＤ」）を検出するプライマーを各試料について使用した（Ｓｓｄｅｒｂｅｒ
ｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３１６６−３１７５（１９９３））
。ＨＣＭＶ ＩＥおよびＧ６ＰＤについてのＰＣＲ分析に使用したプライマーは
イントロンをスパンし、ＤＮＡおよびＲＮＡの増幅からの異なる大きさのバンド
を生じたが、これに対してｐｐ１５０遺伝子はイントロンを含有せず、同一大き
さのＤＮＡおよびＲＮＡのＰＣＲ生成物を生じた。ＰＣＲ生成物を１％のアガロ
ースゲル上の直接的ゲル分析により可視化した。
Ａｌｌｏ−ＭＤＭ中のＨＣＭＶタンパク質の発現を検出する実験ならびにウイ
ルスおよび細胞のタンパク質を共局在化する二重標識実験において、イムノサイ
トメトリーで記載したように、共焦点顕微鏡検査と組み合わせて免疫蛍光を利用
した。
Ｃ．ヒト繊維芽細胞の感染およびサザン分析 実験室のＨＣＭＶ系統ＡＤ１６９の無細胞ウイルスストック、Ｔｏｗｎｅなら
びに急性ＨＣＭＶ疾患を有する骨髄移植の患者に由来する臨床単離物またはそれ
ぞれのドナー対からのＡｌｌｏ−ＭＤＭからの細胞超音波処理物を使用してＨＦ
培養物を感染させた。細胞変性作用が観測されたとき（再活性化された系統につ
いて１０〜１６週／実験室の系統について７〜９週）ＤＮＡをＨＦから調製した
。非感染ＨＦ細胞からの全体のＤＮＡの１０μｇをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化した後、３２Ｐ標識化コスミドクローンｐＣＭ１０５８およびｐＣＭ
１０４８およびｐＣＭ１０３９を使用するサザンブロット分析を実施した（Ｆｌ
ｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ、Ｂ．ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１８：３９−４６（１９
８２））。結果 ＨＣＭＶは同種異系の血液輸注、器官または骨髄の移植のレシピエントにおい
て頻繁に再活性化しそしてウイルスはｉｎ ｖｉｔｒｏ感染の間にＡｌｌｏ−Ｍ
ＤＭ中で変更された成長を示すので、自然に感染した健康な血液ドナーから得ら
れた同種異系的に刺激されたＰＢＭＣ中でウイルスがその潜在的状態から再活性
化することができるかどうかを見るために、ウイルスを検査した。
Ａ．ＰＢＭＣのＡｌｌｏ−刺激およびＨＣＭＶの再活性化 血清の抗体についてＥＬＩＳＡにより、そしてＰＢＭＣ中のＨＣＭＶのＤＮＡ
の存在についてＰＣＲにより、ドナーをＨＣＭＶの暴露について試験した。組織
適合性ドナーの対からのＰＢＭＣを混合することによって、同種異系的に刺激さ
れた細胞培養物を確立した（方法について前述したように）。同種異系的刺激後
４８時間に、非付着性細胞を培養物から除去し、そしてＡｌｌｏ−ＭＤＭを９０
日まで４毎に供給しながら、Ａｌｌｏ−ＭＤＭを維持した。
Ｂ．細胞試料をこれらの培養物から示した間隔において収集し、ＲＴ−ＰＣＲ
によりＨＣＭＶ遺伝子の発現について評価した。Ａｌｌｏ−ＭＤＭ中のＨＣＭＶ
特異的タンパク質の存在を免疫蛍光により検出し、そして超音波処理した細胞お
よびヒト繊維芽細胞（「ＨＦ」）同時培養によりウイルス産生を評価した。５／
５同種異系的に刺激された培養物中で刺激後１７日に、ＨＣＭＶ即時型（「ＩＥ
」）ＲＮＡは最初に検出された。また、後期外皮タンパク質ｐｐ１５０が４／５
培養物中で刺激後１７日に観測された。興味あることには、１つのドナー対（ド
ナー対Ｂ）において、ｐｐ１５０の発現は同種異系的刺激後５４日まで検出され
なかった。
ＨＣＭＶ ＲＮＡの発現と一致して、刺激後１７〜６０日の間において付着性
細胞中のＩＥタンパク質および後期タンパク質ｇＢが検出された。１７日前にＨ
ＣＭＶ転写物およびタンパク質がＡｌｌｏ−ＭＤＭ中で検出することができなか
ったことは、ウイルスが潜在性であり、そしてこの細胞の集団で持続的でないこ
とを示す。ｐｃｍタンパク質を含有するＡｌｌｏ−ＭＤＭの頻度は、ウイルス抗
原が各培養物において最初に検出されたとき、１〜１２／１０００（０．１〜１
．２％）であった。刺激後６０日までに、細胞の２〜２５％は異なるＡｌｌｏ−
ＭＤＭ培養物中でＨＣＭＶタンパク質を発現した。この間隔において培養物のあ
るものの中の感染した細胞の大きい数は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再活性化されたウ
イルスを有するＡｌｌｏ−ＭＤＭの再感染を反映するようである。
Ｃ．再活性化されたＨＣＭＶを使用するヒト繊維芽細胞の感染 Ａｌｌｏ−ＭＤＭ中の感染性ウイルスの存在を証明するために、ＨＣＭＶ陽性
培養物から得られた細胞を刺激後９０日までに７〜１０毎に収集した。細胞の試
料を超音波処理し、ＨＦ上にプレートし、そしてＨＦの感染をＨＣＭＶ ＩＥに
ついて免疫蛍光により確認した。感染性ウイルスはこの方法によりＡｌｌｏ−Ｍ
ＤＭ培養物の５／５において刺激後２６〜６１日に証明された。対照的に、Ｃｏ
ｎ Ａ−ＭＤＭが同一個体のドナーからＰＢＭＣのマイトジェンの刺激により誘
導されるとき、ウイルスは刺激後９０日までに検出することができなかった。
興味あることには、ＨＣＭＶ再活性化は２人のＨＣＭＶ血清反応陰性ドナー（
ドナー対Ｃ）から得られたＡｌｌｏ−ＭＤＭにおいて観測された。しかしながら
、これらのドナーの１人はＨＣＭＶ ＤＮＡ陽性であり、これはこのドナー対か
らのウイルスの回収と一致する。同一ドナーからのＣｏｎ Ａ−ＭＤＭにおける
再活性化の不成功およびＡｌｌｏ−ＭＤＭにおけるＨＣＭＶの再活性化の成功は
、ＰＢＭＣの分化プロセスにおける基本的差を意味する。
異なるドナー対から得られたＡｌｌｏ−ＭＤＭの超音波処理物とインキュベー
トしたＨＦ細胞から、長期間のウイルス単離の培養物を確立して、再活性化され
た感染性ＨＣＭＶ系統の回収および特性決定を可能とした。１０〜１６週の培養
後、６／７ドナー対からの細胞の超音波処理物で感染させたＨＦ細胞において、
細胞変性作用が観測された。Ａｌｌｏ−ＭＤＭから得られた再活性化ＨＣＭＶ系
統はＨＦ中でゆっくり複製し、急性感染した個体から得られたＨＣＭＶ単離物と
同様に、極端に細胞関連性であった。
Ｄ．感染したヒト繊維芽細胞中のＨＣＭＶの制限酵素分析 再活性化ウイルスで感染したＨＦ細胞からのＨＣＭＶ ＤＮＡについて制限酵
素分析を実施して、各単離物の遺伝子型を決定した。この分析において、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩでＨおよびＨα単離物を消化して得られたフラグメン
トの大きさは同一であることが示された。さらに、制限酵素分析は、また、再活
性化ウイルスの単離物が実験室の単離物ＡＤ１６９およびＴｏｗｎｅならびに急
性ＨＣＭＶ疾患（Ｐｏ）を有する患者から得られた単離物と異なることを証明す
る。これらの実験は再活性化ウイルス系統のユニークな遺伝子型を明瞭に証明す
る。実施例ＩＶ ： 樹枝状細胞のマーカーを発現するマクロファージにおいてＨＣＭ
Ｖの再活性化は起こる 方法 下記の細胞の表現型マーカーに対して向けられたモノクローナル抗体を使用し
て、蛍光活性化細胞分析装置（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）を細胞表面の発現のすべての分析について使用した：ＣＤ４、
ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ１ａ、ＣＤ
８３、ＨＬＡクラスＩ分子、ＨＬＡクラスＩＩ分子、ＣＤ４０、ＶＣＡＭ−１お
よびＩＣＡＭ−１。イソ型対照抗体（マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ
２ｂ）および二次抗体で染色した細胞のバックグラウンドの染色に対して発生さ
せたＦＩＴＣ（「ＦＬ１」）またはフィコエリトリン（「ＦＬ２」）の試料の対
数蛍光を表示するヒストグラムドから、平均の蛍光値を得た。
陰性選択により調製された試料の純度の分析のために、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ
１９、ＣＤ５６（抗体はＢｅｃｋｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎまたはＤａｋｏｐ
ａｔｔｓから購入した）陽性細胞の陰性選択前後のＰＢＭＣ試料のＦＩＴＣ（「
ＦＬ１」）を表示するヒストグラムドを発生させた。陰性対照中の非感染細胞の
バックグラウンドの染色を含まないように陽性細胞についてのレベルを設定する
ことによって、陽性細胞の百分率を推定した。結果 ＨＣＭＶを再活性化した細胞の型を同定するために、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細
胞、骨髄性細胞、および樹枝状細胞上で発現した、特定の細胞表面のマーカーの
発現について、Ａｌｌｏ−ＭＤＭをフローサイトメトリーにより分析した。新鮮
な単球と、組換えＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで単球を刺激して発生させた樹枝
状細胞とを使用して、対照分析を実施した（Ｓａｌｌｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８（１９９４））。
Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞のマーカーは付着性細胞の画分の中に存在しな
かった。Ａｌｌｏ−ＭＤＭは、単球／マクロファージのマーカーＣＤ１４および
ＣＤ６４の顕著に均一な表面の発現を証明した。樹枝状細胞のマーカーＣＤ１ａ
およびＣＤ８３の高いレベルの発現がまた観測された。二重標識のフローサイト
メトリー分析により証明されるように、実験の時間経過を通じてＣＤ１４および
ＣＤ８３の双方の共局在化がＡｌｌｏ−ＭＤＭにおいて絶えず観測された。対照
的に、対照樹枝状細胞はＣＤ１ａおよびＣＤ８３を発現したが、前に報告された
ようにＣＤ１４について陰性であった（Ｓａｌｌｕｓｏｔ、ｓｕｐｒａ）。
高いレベルのＨＬＡクラスＩＩ、ＨＬＡクラスＩ、ＣＤ１３、ＶＣＡＭ−１、
ＩＣＡＭ−１およびＣＤ４０がＡｌｌｏ−ＭＤＭ上に、ならびに単球および樹枝
状細胞上に観測された。これらのマーカーの発現のパターンは、異なるドナー対
から得られたＡｌｌｏ−ＭＤＭにおいて終始一貫した。
二重標識の免疫蛍光共焦点顕微鏡検査により、ＨＣＭＶに対する抗体を樹枝状
およびマクロファージの抗原に対する抗体と組み合わせて利用して、ウイルスの
細胞起源を確証した。ドナーＡから得られた細胞はＨＣＭＶ ＩＥならびにＣＤ
８３およびＣＤ１４を刺激後２８日に発現したが、刺激後２６日にＨＣＭＶ抗原
に対して均一に陰性であった。こうして、再活性化ウイルスを収容する細胞はＣ
Ｄ１４およびＣＤ８３の双方を発現した。
前述の観測は、健康な個体の末梢血中の骨髄性系列の細胞が潜在的ＨＣＭＶの
源であり、これは同種異系的に刺激されると、感染性ウイルスを再活性化すると
いう最初の証拠を提供する。従来、ＣＤ１４およびＣＤ８３の二重陽性の細胞は
、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで刺激されたＣＤ３４＋造血性子孫の細胞の分化
の間における一時的表現型であるとして報告された（Ｃａｕｘ ｅｔ ａｌ．、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５−７０６（１９９６））。ＣＤ１４＋細胞
は全体のＰＢＭＣのほぼ１０％を表すので、１〜１２細胞／１０００Ａｌｌｏ−
ＭＤＭ中のウイルスの検出はＨＣＭＶで潜伏的に感染されたＰＢＭＣの０．０１
〜０．１２％の頻度を意味する。実施例Ｖ ： ＨＨＶ８血清反応陽性ドナーからのＰＢＭＣの同種異系的刺激後の
ＨＨＶ８の再活性化 前述したように、ＨＨＶ８血清反応陽性および血清反応陰性のドナーからの同
時培養したＰＢＭＣを使用して、Ａｌｌｏ−ＭＤＭを調製した。８日間の培養後
、溶解サイクル関連ＯＲＦ５９に対する抗体で細胞を標識化した（前述の免疫蛍
光方法、参照）。Ａｌｌｏ−ＭＤＭはＯＲＦ５９の発現を示す。対照的に、Ｃｏ
ｎ Ａ−ＭＤＭは潜伏性タンパク質ＯＲＦ７３の発現のみを示し、溶解サイクル
の製造を発現しない。実施例ＶＩ ： ＨＩＶ−１のＴ細胞向性およびマクロファージ向性系統によりＡ
ｌｌｏ−ＭＤＭの感染 前述したように、Ａｌｌｏ−ＭＤＭを調製し、Ｔ細胞向性、マクロファージ向
性、および二重向性系統で感染させた。前述したように、ｐ２４の発現を免疫蛍
光により検査した。Ａｌｌｏ−ＭＤＭは産生的に各系統により感染された。実施例ＶＩＩ ： トランスウェル系を使用するＨＣＭＶ血清反応陰性ドナーから
のＡｌｌｏ−ＭＤＭコンディショニングされた培地で刺激されたＣＤ１４＋単球
中のＨＣＭＶの再活性化 サイトカインまたは他の可溶性因子がＨＣＭＶ許容性ＭＤＭに単球を分化させ
るために十分であるかどうかを決定するために、同種異系的に刺激されたＭＤＭ
コンディショニングされた培地を使用して、天然に感染された血清反応陽性ドナ
ーから得られたＣＤ１４＋単球を分化させた。２人の血清反応陰性ドナーのアロ
反応から単一の血清反応陽性ドナーからの単球を分離するために、トランスウェ
ル系を使用した。ドナーからのＰＢＭＣを２時間付着させた後、非付着性細胞を
除去した。平行培養物からのアロコンディショニングされた培地を、刺激後１、
３、５、および７日に、付着した単球に添加した。コンディショニングされた培
地は、平行アロ−ＭＤＭ細胞培養物に類似する形態学およびウイルス許容性を有
するＭＤＭに、単球を分化させるために十分であった。免疫蛍光を使用して、Ｈ
ＣＭＶ特異的タンパク質ＩＥ８６およびｇＢを発現するＭＤＭを同定した。ＩＥ
８６およびｇＢ陽性細胞は、刺激後１６および２１日の双方において、血清反応
陽性ドナーからのＭＤＭ中で検出されたが、血清反応陰性ドナーまたはコンディ
ショニングされた培地を供給されなかった培地からのＭＤＭ中で検出されなかっ
た。これらの観測が示すように、同種異系的刺激の間に産生するサイトカインは
Ａｌｌｏ−ＭＤＭ中でＨＣＭＶを再活性化するために十分である。実施例ＶＩＩＩ ： Ａｌｌｏ−ＭＤＭおよびＣｏｎ Ａ−ＭＤＭについてのサイ
トカインのプロフィル ウイルス的に許容性のＡｌｌｏ−ＭＤＭの培養の間に産生されるサイトカイン
を決定するために、Ａｌｌｏ−ＭＤＭ、Ｃｏｎ Ａ−ＭＤＭおよび未刺激のマク
ロファージのサイトカインのプロフィルを検査した。培養上清を刺激後６、ＨＬ
ＡクラスＩおよびＩＩ、２４、３６、および４８時間、および３、５、および８
日に収集した。前述したように、イムノアッセイを使用して下記のサイトカイン
について培養物を分析した：ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−
γ。サイトカインの分析において、Ｃｏｎ Ａ−ＭＤＭに比較してＡｌｌｏ−Ｍ
ＤＭにおいて、これらの成長因子の産生の実質的な差が生ずることが示された。
これらの結果は、これらの２つの単球由来細胞の型の間の表現型の差を際立たせ
る。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年４月１２日（２０００．４．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 単球由来マクロファージの培養物中でウイルスを複製する方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、末梢血単球（「PBMC」）の同種異系的 (allogeneic) 刺激により
、またはIFN γを含む培地を使用するPBMCの培養により単球由来マクロファージ
（「MDM 」）中で潜伏性反応性を再活性化する方法、このようなウイルス許容性
単球由来マクロファージの安定な培養物、およびこのような培養物を使用してウ
イルスのインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。
【０００２】 発明の背景 ヒトサイトメガロウイルス（「HCMV」）は、免疫無防備状態の個体、例えば、
移植およびエイズの患者の病的状態および死亡率の主な原因、ならびに先天性分
娩欠陥の主要な原因である、偏在的病原体である（Britt et al.、Fields Virol
ogy 、pp.2493-2523(Fields et al.、編、1996）。
【０００３】 HCMVは、また、アテローム性動脈硬化症の発生、冠状血管形成後の再発狭窄症
、器官移植患者における慢性拒絶反応（Grattan et al.、Jama 261:3561-3566(1
989);Melnick et al. 、Bioassey 17:899-903(1995);Zhou et al. 、NEIM 335:6
24-630(1996)）および骨髄移植患者における慢性移植片／宿主疾患（Loennqvist
et al. 、Transplantation 38:465-468(1984);Soederberg et al.、Transplant
ation 61:600-609(1996)）。大部分の個体は生命の初期においてHCMVに感染する
ようになり、そして地理的位置に依存して、成人の60〜100%はウイルスのキャリ
ヤーである（Britt et al.、Fields Virology 、pp.2493-2523(Fields et al.、
編、1996）。
【０００４】 他のヘルペスウイルスと同様、HCMVは、一次感染後宿主において一生の潜伏性
(latency) を確立し、これは感染性ウイルスを産生しないウイルスゲノムの持続
性により特徴づけられる。他のヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン−バー
ルウイルスおよび単純ヘルペスウイルスについての潜伏のそれぞれの部位はＢ細
胞およびニューロンである（Kieff 、Field Virology pp.2343-2396(Fields et
al. 、編、1996）；Roizmaneal、Field Virology pp.2231-2296(Fields et al.
、編、1996）) 。
【０００５】 しかしながら、潜伏性HCMVの伝染は血液産物の輸注、骨髄の移植、および充実
器官を通して起こることが示された（Britt et al.、Field Virology pp.2493-2
523(Fields et al、編、1996);Chou、NEUM 314;1418-1423(1986);Meyers 、Amer
.J.Med.81:27-38(1986);Tegtmeier 、Arch.Pathol.Lab.Med.113:236-245(1989))
が、潜伏性または持続性ウイルスを収容する細胞の同一性は未知である。HCMVに
加えて、他のウイルスを収容する細胞の同一性は不明瞭であり、そしてこのよう
なウイルスを培養する方法は未知である。
【０００６】 CMV の潜伏性および再活性化に関係するメカニズムを理解するための、いくつ
かの動物モデルが確立された(Bruning et al. 、Transplantation 41:695-698(1
986);Hamilton et al.、Transplantation 39:290-296(1985);Reddehase et al.
、J.Exp.Med.179:185-193(1994);Yagyu et al.、Transpl.Proc.25:1152-1154(19
93))。ネズミの器官移植モデルにおいて、ネズミサイトメガロウイルス（「MCMV
」）の再活性化はドナーと受容体との間の免疫抑制および組織不適合性の状態に
より影響を受けることが示された(Bruning et al. 、Transplantation 41:695-6
98(1986);Hamilton et al.、Transplantation 39:290-296(1985);Reddehase et
al. 、J.Exp.Med.179:185-193(1994);Yagyu et al.、Transpl.Proc.25:1152-115
4(1993))。
【０００７】 MCMVにより潜伏的に感染されたマウスにおいて、脾臓、腎臓、および骨髄はウ
イルスの重要な源であることが示された(Jordan et al.、J.Clin.Invest.70:762
-768(1982);Mercer et al.、J.Virol.62:987-997(1988);Olding et al.、J.Exp.
Med.141:561-572(1975))。潜伏的に感染された動物においてウイルスの活性化は
、チオグリコレートの腹腔内注射(Pollock et al. 、Virology 227:168-179(199
7)) または同種異系的刺激(Schmader et al.、J.Inf.Dis.166:1403-1407(1992))
により起こることが示された。
【０００８】 潜伏的に感染した動物の末梢血は、また、同種異系的刺激はMCMV複製を活性化
させるので、ウイルスの溜であることが証明された(Schmader et al.、J.Inf.Di
s.166:1403-1407(1992);Olding et al. 、J.Exp.Med.141:561-572(1975);Jordan
et al. 、J.Clin.Invest.70:762-876(1982);Mercer et al.、J.Virol.62;987-9
97(1988);Koffron et al. 、Scand.J.Inf.Dis.-Suppl.99:612(1995));Stoddart
et al.、J.Virol.68:6243-6253(1994);Pollock et al. 、Virology 227:168-179
(1997)) 。
【０００９】 ヒトにおいて、HCMV疾患を有する患者から得られた器官の組織および末梢血を
検査すると、PBMCはHCMVのウイルスの溜であることが示唆される(Chou 、NEJM 3
14:1418-1423(1986);Meyers 、Am.J.Med.81:27-38(1986);Taylor-Wiedeman et a
l.、J.Gen.Virol.72:2059-2064(1991);Tegtmeier、Arch.Pathol.Lab.Med.113:23
6-245(1989);Gnann et al.、Am.J.Pathol.132:239-248(1988))。HCMV−血清反応
陽性ドナーから得られた分離されたPBMCの集団をさらに分析すると、単球は優勢
を占める感染された細胞の型として同定された(Taylon-Wiedeman et al. 、J.Ge
n.Virol.72:2059-2064(1991)) 。
【００１０】 単球中のウイルスの複製は遺伝子の発現の初期の事象に制限される(Ibanez et
al.、J.Virol.65:6581-6588(1991)) が、HCMVの疾患において初期において器官
の組織を検査すると、組織のマクロファージにおける広範なウイルス遺伝子の発
現が証明された(Gnann et al. 、Am.J.Pathol.132:239-248(1988);Sinzger et a
l.、J.Inf.Dsi.173:240-245(1996))。
【００１１】 末梢血中のCD14+ 単球は、骨髄性／顆粒球前駆体に由来する、最終的に分化し
た細胞である。抗原プロセシング事象の間のＴ細胞およびＢ細胞との接触による
、単球のin vivo 刺激は、免疫エフェクター細胞としての機能するマクロファー
ジへの単球の分化を誘導する。種々の組織培養のプロトコールは単球由来マクロ
ファージ（「MDM 」）のin vivo 発生を模擬することが確立され、ここでプロト
コールはサイトカイン、マイトジェン、コルチコステロイド、またはリポ多糖（
「LPS 」）を使用して単球の処理を包含する(Adams et al. 、The Macrophage p
p.77-115(Lewis et al. 、編、1992) において概観されている）。Caux et al.
は、FACSソーティングを使用して、CD14+ 、CD1a+ 細胞の一時的集団がMDM の分
化において発育相を表すことを報告している(Caux et al.、J.Exp.Med.184:695-
706(1996))。
【００１２】 これらの方法により誘導されたMDM はある種のマクロファージ向性ウイルスの
in vitro増殖に使用されてきている(Gendelmann et al.、J.Exp.Med.167:1428-1
441(1988);Matloubian et al. 、J.Virol.67:7340-7349(1993);Schrier et al.
、J.Virol.64:3280-3288(1990)) 。Rettig et al. 、は、HHV8で感染した内因性
CD68+ 、CD83+ 骨髄間質細胞を同定した(Rettig et al.、Science 276:1851-185
4(1997))。しかしながら、MDM 中のHCMVの培養は困難であることが証明され、し
ばしば不発感染を生じた(Rice et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:6134-6138
(1984);Taylor-Wiedemann et al.、J.Virol.68:1597-1604(1994)) 。
【００１３】 HCMV許容性マクロファージを発生するPBMCのマイトジェン決定に頼る、MDM 分
化系がまた開発された。この方法により分化されたマクロファージはin vitro、
外因的HCMV感染に対して感受性であるが、潜伏的に感染した個体から得られたPB
MCからのHCMVを再活性化する試みは、この方法または他の方法を使用して、不成
功に終わった(Taylor-Wiedemann et al.、J.Virol.68:1597-1604(1994)) 。した
がって、潜伏的HCMV感染の特異的細胞の溜を同定し、このような細胞の培養物を
単離し、そしてHCMVがその中で複製する細胞を培養する方法を確立することが要
求されており、ここで細胞はHCMVおよび／または追加のウイルスで潜伏的に感染
されるか、あるいはin vitroで感染させることができる。
【００１４】 発明の要約 本発明は、潜伏性ウイルス、例えば、HCMV感染の特異的細胞の溜を最初に同定
した。本発明は、また、同種異系的に刺激された単球由来のマクロファージ（「
MDM 」）の長期間の培養物中で、HCMVおよび他のウイルスを再活性化する方法を
提供する。マクロファージ（CD14）および樹枝状細胞のマーカー（CD83）の双方
を発現する、MDM の骨髄性系列細胞の表現型から、感染性ウイルスが回収された
。さらに、これらの細胞は外因的ウイルス感染に対して許容性である。これらの
観察は、HCMVおよび他のウイルスが末梢血中の骨髄性系列細胞中で真の潜伏状態
を確立するという、第1 の証拠を提供する。
【００１５】 1 つの面において、本発明は、ウイルス許容性単球由来マクロファージ中で、
哺乳動物ウイルスを包含するウイルスを複製させる方法を提供する。この方法は
、下記の工程を含む：（ａ）単球を生存可能な、同種異系的に刺激された末梢血
単核細胞（PBMC）と流体連絡させた条件下に、単球を培養して単球を活性化し、
単球由来マクロファージに分化させるか、あるいは単球を活性化させてウイルス
許容性単球由来マクロファージに分化させるために十分な量において、IFN γか
らなるコンディショニングされた培地に前記単球を暴露させる条件下に、前記単
球を培養し、そして（ｂ）単球由来マクロファージ中でウイルスを複製させ、こ
こでウイルスは単球中で潜伏性であるか、あるいは培養物に外因的に添加される
。
【００１６】 他の面において、本発明は、ウイルス許容性単球由来マクロファージを使用し
てウイルス産生のインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。この方法
は、下記の工程を含む：(a) 単球を生存可能な、同種異系的に刺激された末梢血
単核細胞 (「PBMC」）と流体連絡させた条件下に、単球を培養して単球を活性化
させて、ウイルス許容性単球由来マクロファージに分化させるか、あるいは単球
を活性化させてウイルス許容性単球由来マクロファージに分化させるために十分
な量において、IFN-γからなるコンディショニングされた培地に単球を暴露させ
る条件下に、単球を培養し、(b) 単球由来マクロファージ中でウイルスを複製さ
せ、ここでウイルスは単球中で潜伏性であるか、あるいは培養物に外因的に添加
され、(c) ウイルス産生を阻害する能力を有することが推測される物質と、工程
(b) の単球由来マクロファージを接触させ、そして(d) 単球由来マクロファージ
中のウイルス産生のレベルを検出する。
【００１７】 他の面において、本発明は、ウイルス許容性単球由来マクロファージの培養物
を提供し、ここで単球由来マクロファージは同種異系的に刺激された末梢血単球
細胞（「PBMC」）に暴露させた単球に由来するか、あるいはIFN-γからなるコン
ディショニングされた培地に暴露させ、ここで暴露時間および濃度は、(i) 単球
がウイルス許容性単球由来マクロファージへ活性的に分化するのを刺激し、そし
て(ii)単球由来マクロファージ中のウイルス産生を刺激するために十分であり、
そして、ウイルス許容性単球由来マクロファージは非同種異系的刺激単球よりも
少なくとも10,000倍大きいウイルスを産生する。
【００１８】 他の面において、本発明は、少なくとも85％がCD83およびCD14を支持するとし
て規定される集団を有するウイルス許容性単球由来マクロファージの培養物を提
供する。他の面において、本発明は、少なくとも85％がCD83、CD68、CD1a、CD64
およびCD14を支持するとして規定される集団を有するウイルス許容性単球由来マ
クロファージの培養物を提供する。 他の面において、本発明は、下記の特徴を有するウイルス許容性単球由来マク
ロファージの安定な培養物を提供する：(i) 樹枝状細胞のマーカーCD68、CD83、
およびCD1aからなる、(ii) マクロファージ細胞のマーカーCD64およびCD14から
なる、および(iii) CD14+ 単球に由来する。
【００１９】 他の面において、本発明は、ウイルス許容性単球由来マクロファージを培養す
る方法を提供する。この方法は、単球を生存可能な、同種異系的に刺激された末
梢血単核細胞（「PBMC」）と流体連絡させた条件下に、単球を培養するか、ある
いはIFN γからなるコンディショニングされた培地に単球を暴露させる条件下に
、単球を培養して、単球を活性化させて単球由来マクロファージに分化させる工
程を含む。
【００２０】 1 つの態様において、単球由来マクロファージはCD83またはCD14を支持する細
胞の主要な集団を有する。他の態様において、単球由来マクロファージは、CD83
、CD68、CD1a、CD64及びCD14を担持する細胞の大集団を有する。他の態様におい
て、単球由来マクロファージは、細胞の85% がCD83、CD68、CD1a、CD64およびCD
14を支持する、細胞の集団を有する。1 つの態様において、単球由来マクロファ
ージはヒトである。一つの態様において、同種性刺激された細胞 CD4+ 及び CD8 + 細胞を含む。
【００２１】 1 つの態様において、哺乳動物のウイルスは、サイトメガロウイルス（「CMV
」）、C 型肝炎ウイルス（「HCV 」）、ヒト免疫不全ウイルス（「HIV 」）、ヒ
トヘルペスウイルス6(「HHV6」）、ヒトヘルペスウイルス7(「HHV7」）およびヒ
トヘルペスウイルス8(「HHV8」）から成る群より選択される。1 つの態様におい
て、ウイルスは潜伏性である。
【００２２】 1 つの態様において、物質はウイルスのプロテアーゼのインヒビターである。
他の態様において、物質はウイルスが発生する核酸に結合するアンチセンス分子
である。1 つの態様において、物質はウイルスゲノムによりコードされるmRNAに
対して相補的であるアンチセンス分子である。1 つの態様において、物質はウイ
ルスゲノムによりコードされるmRNAに対して相補的であるリボザイムである。1
つの態様において、物質はCMV DNA ポリメラーゼ、UL80、およびUL89から成る群
より選択されるウイルスタンパク質を阻害する。
【００２３】 発明の具体的な説明 I. 序論 本発明は、樹枝状マーカーを発現しかつ潜伏性ウイルス、例えば、HCMVの感染
を収容する、単球由来マクロファージ（「MDM 」）を最初に記載する。これらの
培養物は、ウイルス的に許容性である、すなわち、それらは潜伏感染の再活性化
支持しそして、また、外因的ウイルスで産生的に感染することができる。こうし
て、本発明は、MDM のウイルス的に許容性の培養物、ウイルス的に許容性のMDM
を培養する方法、および培養物を使用してウイルス産生のインヒビターを阻害す
る方法を提供する。
【００２４】 重要なことには、本発明は、ウイルスを研究するために、例えば、ウイルスの
潜伏性の維持に関係するメカニズムを同定し、そして潜伏性ウイルスの再活性化
および初期のウイルス感染を仲介する細胞の活性化経路を探査するために使用す
ることができる。さらに、これらの細胞および培養法はウイルスの免疫学的監視
機構を検査する重要な道具を提供する。これらの細胞および培養法は、また、ウ
イルスの再活性化を防止しかつウイルス産生を阻害する療法的アプローチを同定
するために有用である。本発明の細胞および方法は、また、潜伏的に感染した細
胞を培養する手段を提供しかつウイルスゲノムの存在について細胞を検査するこ
とによって、潜伏性ウイルスが感染した患者を診断するために有用である。
【００２５】 II. 定義 本明細書において使用するとき、下記の用語は特記しない限りそれらに帰属さ
れる意味を有する。 「複製」は、細胞からの感染性粒子を産生する手段として、ウイルスが複製し
、そのゲノムを翻訳する能力を意味する。 「ウイルス許容性」(virally permissive)は、細胞、例えば、単球由来マクロ
ファージが外因的ウイルスにより産生的に感染されるか、あるいは潜伏性ウイル
スの感染，例えば、HHV6、HHV7、HHV8、CMV 、HCV 、およびHIV を再活性化 (re
activate) することができる、細胞の特性を意味する。 「安定な培養物」は、発育、次いでそれ以上の分化の間に、一時的に出現する
細胞と反対に、最終的に分化した細胞の培養物を意味する。
【００２６】 「同種異系的刺激」(allogenic stimulation) は、(1) 抗原の接触または細胞
を異なるMHC ハプロタイプ（「細胞仲介」）との混合により、可溶性因子、例え
ば、IFN-γのようなサイトカインを産生するように誘発された細胞により仲介さ
れるか、あるいは(2) 可溶性因子、例えば、IFN-γのようなサイトカイン（「サ
イトカイン仲介」）により直接的に仲介される、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ
細胞、単球、およびその他）の間の細胞の分化および／または増殖的事象を意味
する。例えば、同種異系的刺激の間に、単球を活性化して単球由来マクロファー
ジに分化させる。
【００２７】 同様に、Ｔ細胞を活性化して細胞障害性またはヘルパーＴ細胞およびその他に
増殖および分化させる。典型的には、本発明の同種異系的刺激はin vitroで起こ
る。細胞仲介の同種異系的刺激のために、典型的には細胞、例えば、PBMCの異種
集団を異なるハプロタイプのPBMCと混合させる。直接的サイトカイン仲介の同種
異系的刺激のために、PBMCまたは細胞のより均質な集団を使用する。サイトカイ
ン仲介刺激は、コンディショニングされた培地（すなわち、細胞を成長させる培
地）を使用するか、あるいはサイトカインを外因的に添加された培地中で起こす
ことができる。
【００２８】 「流体連絡」は、水溶液中で連絡にある細胞を意味する。流体連絡は、水溶液
中で細胞の間の直接的接触により仲介される連絡、あるいは連絡は水溶液中で可
溶性因子、例えば、サイトカインにより仲介される、半透膜により分離された細
胞の間の連絡を包含する。 「末梢血単球」または「PBMC」は、赤血球を除去された、血液に由来する血管
リンパ系細胞の異種集団を意味する。 「単球」は、単球食細胞系列の分化した細胞、例えば、CD14+ である細胞を意
味する（例えば、Fundamental Immunology(Paul 編、第3 版、1993) 参照) 。
【００２９】 「単球由来マクロファージ」または「MDM 」は、さらにマクロファージに分化
された単球に由来する単球食細胞系列の抗原提示細胞の1 つの型である（例えば
、Paul、supra 参照）。 「培養」は、ex vivo またはin vivo で成長する細胞を意味する。 「潜伏性」は、宿主細胞がウイルスのゲノムを含有するが、ゲノムの発現が完
全にまたは部分的に抑制された、ウイルス感染の1 つの型を意味する。潜伏的感
染を「再活性化」してウイルスの複製、転写、および感染性粒子の産生を発生さ
せることができる（例えば、White & Fenner、Medical Virology( 第4 版、1994
) 参照）。
【００３０】 「CD83」、「CD14」、「CD68」、「CD1a」、「CD64」、「CD4 」、および「CD
8 」は、特定の細胞表面の分子の名称である。これらの細胞表面の分子はしばし
ば特定の細胞の型に関連し、そして特定の細胞を同定するためのマーカーとして
使用することができる（例えば、Paul、supra 参照）。例えば、CD4 およびCD8
はＴ細胞のマーカー、CD83、CD68、およびCD1aは樹枝状細胞のマーカーであり、
そしてCD14およびCD64はマクロファージのマーカーである。CD14とCD83との組合
わせを使用して、ウイルス許容性単球由来マクロファージを同定することができ
る。CD68、CD1a、CD64、CD14、およびCD83をまた組合わせて使用して、ウイルス
的に許容性のMDM （アロ−MDM ）を同定することができる。
【００３１】 「リボザイム」は、特定の核酸配列を有するターゲットRNA をリボヌクレアー
ゼ活性により切断する、触媒RNA 分子を意味する。ヘアピンリボザイム、ハンマ
ーヘッドリボザイム、RNアーゼリボザイム（すなわち、原核生物または真核生物
からの天然に存在するRNアーゼP リボザイムに由来するリボザイム）を包含する
、リボザイムを構築する一般的方法はこの分野において知られている（例えば、
Castanotto et al. 、Advances in Pharmacology 25:289-317(1994) 参照（一般
に、グループI リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、
RNアーゼP 、およびアックスヘッド（axhead) リボザイムを包含する、リボザイ
ムの外観を提供する））。
【００３２】 「アンチセンス」核酸は、選択するターゲット配列に対して相補的でありかつ
ターゲット分子と特異的にハイブリダイゼーションすることができる核酸を意味
する。アンチセンスという用語は、また、アンチセンスRNA が転写される発現カ
セット中でDNA 配列を包含する。アンチセンス核酸はターゲットポリヌクレオチ
ドにハイブリダイゼーションし、そしてターゲット核酸の転写、プロセシング、
翻訳または他の活性を妨害する。アンチセンス核酸は、例えば、転写開始部位ま
たは鋳型への結合によるDNA またはRNA ポリメラーゼのプロモーターへの結合を
妨害することによって、DNA の複製またはDNA の転写を阻害することができる。
【００３３】 それは、例えば、RNA 転写物の領域、例えば、リボソーム結合部位への結合に
より、mRNAのプロセシング、mRNAへのポリ(A) の付加またはmRNAの翻訳を妨害す
ることができる。それは細胞の阻害メカニズムを促進する、例えば、RNアーゼ作
用を介するRNA 分解を促進することができる。阻害ポリヌクレオチドを二本鎖DN
A の主要な溝に結合して、三重らせんまたは「トリプレックス」構造を形成する
ことができる。したがって、アンチセンス核酸を使用する阻害法は、異なるメカ
ニズムにより働く特異的遺伝子の発現の変更に対する、多数の異なるアプローチ
を包含する（例えば、Helene & Toulme 、Biochim.Biophys.Acta.1049:99-125(1
990)参照）。
【００３４】 他に対して相補的である核酸は、水素結合の形成を包含する塩基対を通すター
ゲット核酸に結合することができる核酸を意味する。核酸とターゲット配列との
間の相補的ハイブリダイゼーションは、核酸が実質的にターゲット配列のみに結
合するとき、起こり、ハイブリダイゼーション複合体を形成し、このときターゲ
ットはポリヌクレオチドと他の成分との異種混合物の中に存在する。このような
ハイブリダイゼーションはターゲット配列の存在を確定する。相補的核酸は他の
無関係の配列に結合することがあるが、形成したハイブリダイゼーション複合体
の少なくとも80％、好ましくは90％またはそれ多くはターゲット配列とともに形
成されている。
【００３５】 「ウイルス産生」および「ウイルスを産生する」は、ウイルスが感染した細胞
が複製し、ウイルスゲノムを転写し、および／またはウイルス粒子を作る能力を
意味する。感染は再活性化された潜伏的感染であるか、あるいは外因的に添加さ
れたウイルスを介する感染であることができる。ウイルスは野生型または突然変
異したウイルスであることができる。ウイルスの突然変異は双方の天然に存在す
る、化学的または物理的に誘導または組換え的に導入された突然変異を包含する
。
【００３６】 「ウイルス産生の阻害」またはウイルスの「インヒビター」は、ウイルスの生
活環の任意の段階、例えば、潜伏的感染の再活性化、初期の感染、ウイルスの複
製、ウイルスの転写、ウイルスの翻訳、およびウイルス粒子のパッケージングを
妨害する分子を意味する。このような分子は本発明の培養物を使用して同定する
ことができ、そしてタンパク質のインヒビター、アンチセンス核酸、リボザイム
、およびその他のような分子であることができる。ウイルス産生を阻害する能力
を有することが推測される物質で処理された、単球由来マクロファージを、イン
ヒビターを含まない対照試料と比較する。対照試料（インヒビターで未処理であ
る）に、100 の相対ウイルス産生値を割り当てる。対照に関するウイルス産生値
が約７５、好ましくは50、より好ましくは25であるとき、ウイルス産生の阻害は
達成される。
【００３７】 用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖の形成のデオキシリボヌクレオチドまた
はリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。特記しない限り、この
用語は、参照核酸に類似する結合性質を有しかつ天然に存在するヌクレオチドに
類似する方法で代謝される、天然のヌクレオチドの既知のアナローグを含有する
核酸を包含する。特記しない限り、特定の核酸配列は、また、その保存的に修飾
された変異型（例えば、デジェネレイトコドンの置換）および相補的配列ならび
に明白に示した配列を含蓄的に包含する。
【００３８】 詳しくは、デジェネレイトコドンの置換は、１またはそれ以上の選択された（
またはすべての）コドンの第３位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン
残基で置換された、配列を発生させることによって達成することができる(Batze
r et al.、Nucleic Acids Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.、J.Biol.Chem.26
0:2605-2608(1985);Cassol et al. 、1992;Rossolini et al. 、Mol.Cell.Probe
s 9:91-98(1994))。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によりコー
ドされるmRNAと互換的に使用される。
【００３９】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基
のポリマーを意味するために互換的に使用される。この用語は、１またはそれ以
上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的アナローグ
である、アミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーに適
用される。
【００４０】 本明細書において使用するとき、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」
は、１またはそれ以上の型の化学結合を通して、通常相補的塩基の対合を通して
、通常水素結合を通して、相補的配列のターゲット核酸に結合することができる
核酸として定義される。本明細書において使用するとき、プローブは天然の（す
なわち、A 、G 、C またはT ）または修飾された塩基（7-デアザグアノシン、イ
ノシン、およびその他）を包含することができる。さらに、プローブ中の塩基は
、それがハイブリダイゼーションを妨害しないかぎり、ホスホジエステル結合以
外の連鎖により結合することができる。
【００４１】 当業者は理解するように、プローブはハイブリダイゼーション条件のストリン
ジェンシイに依存して、プローブの配列との完全な相補性を欠如するターゲット
配列に結合することができる。プローブは好ましくは直接的に、例えば、アイソ
トープ、発色団、ルミフォアー、色素源で標識化するか、あるいは間接的に、例
えば、ストレプトアビジン複合体を後に結合できるビオチンで標識化することが
できる。プローブの存在または非存在をアッセイすることによって、相補的ター
ゲット核酸の配列またはサブ配列の存在または非存在を検出することができる。
【００４２】 「標識化核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、共有結合により、リン
カーを通してまたはイオン、ファン・デル・ワールスまたは水素結合を通して、
標識に結合させて、プローブに結合した標識の存在を検出することによって、プ
ローブの存在を検出できるようにする。
【００４３】 「抗体」は、分析物（抗原）に特異的に結合しかつ認識する、１またはそれ以
上の免疫グロブリン遺伝子、またはそれらのフラグメントにより実質的にコード
されるポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、
ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域の遺伝子
、ならびに無数の免疫グロブリンの可変領域の遺伝子を包含する。軽鎖はカッパ
またはラムダとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、ま
たはイプシロンとして分類され、これらは引き続いて、それぞれ、免疫グロブリ
ンのクラス、IgG 、IgM 、IgA 、IgD およびIgE を規定する。
【００４４】 典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体からなる。各四量体はポリ
ペプチド鎖の2 つの同一の対から構成され、各対は1 つの「軽」鎖（約25ｋＤａ
）および1 つの「重」鎖（約50〜70ｋＤａ）を有する。各鎖のN 末端は、抗原を
認識する約100 または110 またはそれ多いアミノ酸の可変領域を定める。可変軽
鎖(VL ) および可変重鎖(VH ) という用語は、それぞれ、軽鎖および重鎖を意味
する。
【００４５】 抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして存在するか、あるいは種々のペ
プチダーゼを使用する消化により産生された、任意の適切に特性決定されたフラ
グメントとして存在することができる。したがって、例えば、ペプシンは抗体を
ヒンジ領域におけるジサルファイド結合より下で消化して、Fab の二量体である
F(ab')2 を産生し、二量体それ自体はジサルファイド結合により VH − CH 1 に
結合した軽鎖である。F(ab')2 を温和な条件下に還元してヒンジ領域においてジ
サルファイド結合を破壊し、これによりF(ab')2 二量体をFab'モノマーは、本質
的にヒンジ領域の部分を有するFab である（Fundamental Immunology(Paul 編、
第3 版、1993) ）。
【００４６】 種々の抗体フラグメントを無傷の抗体の消化により定義されるが、当業者は理
解するように、このようなフラグメントは化学的に、または組換えDNA 法を使用
することによって新たに合成することができる。こうして、抗体という用語は、
本明細書において使用するとき、また、全抗体の修飾により産生された抗体フラ
グメント、あるいは組換えDNA 法を使用して新たに合成されたもの（例えば、一
本鎖Fv）を包含する。 用語「イムノアッセイ」は、分析物に特異的結合する抗体を使用するアッセイ
である。イムノアッセイは、特定の抗体の特異的結合の性質を使用して、ターゲ
ットを単離し、および／または分析物を定量することにより特徴づけられる。
【００４７】 III. 単球由来マクロファージ マクロファージは、骨髄の中に見出される前駆体幹細胞に由来する、最終的に
分化した細胞である。この幹細胞は、究極的に血液リンパ系のすべての細胞に導
く、普通の多能幹細胞であると考えられる（例えば、下記の文献を参照のこと：
Fundamental Immunology(Paul 編、第3 版、1993);Immunology(Hood et al.、編
、第2 版、1984) ）。特定の成熟的微小環境内において、この多能性幹細胞は骨
髄性幹細胞に発育し、次いで特定の発育系列に掛かり合う（単球由来マクロファ
ージの分化に関係するタンパク質の論考については、例えば、Paul、supra を参
照のこと）。
【００４８】 マクロファージ系列への発育の掛かり合いは、マクロファージの分化した前駆
体である単球により証明される。単球は血液、組織、および多分骨髄の中に位置
する貯蔵隔室の中を循環しているのが見出される。組織において、単球はさらに
マクロファージに発育する。通常の条件下に、単球またはマクロファージは分裂
しない。
【００４９】 マクロファージは、すべての組織および取り囲む血管の中に、そして上皮細胞
に密接して見出される。異なる組織中のマクロファージは顕著な性質を発生する
ことができる。例えば、腹腔、肺、肝臓、腎臓、骨髄、および脾臓からのマクロ
ファージは、に対して特異的な細胞のレセプター、MHC クラスII分子の発現、お
よび酸化的代謝を有する。それらの主要な機能は、環境を究明し、刺激因子に対
して応答し、そしてMHC クラスIIを介して抗原を提示することである。
【００５０】 したがって、マクロファージは食作用において活性であり、ここでマクロファ
ージは細胞外流体を採取し、また、広い範囲の分子に対して表面レセプターを発
現する。この方法において、マクロファージは微生物を取り上げ、サイトカイン
および外来タンパク質に対して応答することができる。これらの環境的刺激因子
に対する応答において、マクロファージは免疫系の他の細胞に対して内存化した
抗原を提示し、種々の分子を分泌する。こうして、マクロファージは炎症および
免疫学的反応、例えば、MHC クラスII分子を介するＴ細胞に対する抗原の提示に
参加する。
【００５１】 IV. 細胞の培養および同種異系的刺激 A. 同種異系的刺激およびウイルスの感染または再活性化 本発明の単球由来マクロファージの培養物は、同種異系的刺激反応から誘導さ
れる。同種異系的刺激に暴露される細胞を適当な源から単離し、異種または均質
、例えば、末梢血単核細胞（「PBMC」）または単球であることができる。細胞仲
介同種異系的刺激反応のために、PBMCは典型的には本発明の単球由来マクロファ
ージの培養物源として使用される。PBMCはほぼ４〜６％の単球を含有する。単球
は、また、２時間の付着で急速に単離することができる。
【００５２】 赤血球から単核細胞を分離することによって、全血試料からPBMCを調製する。
多数のPBMC単離法、例えば、速度沈降法、等密度沈降法、アフィニティー精製法
、およびフローサイトメトリーが存在する。典型的には、PBMCは赤血球から密度
勾配（等密度）遠心法により分離し、ここで細胞はそれらの自身の密度に等しい
溶液中の平衡位置に沈降する。密度勾配遠心法のために、生理学的媒質を使用す
べきであり、溶液の密度は高く、そして媒質は浸透圧をほとんど発揮してはなら
ない。密度勾配遠心法は、溶液、例えば、ナトリウムジトリゾエート−ポリスク
ロース、フィコール、デキストラン、およびパーコールを使用する（例えば、Fr
eshney、Culture of Animal Cells(第3 版、1994) 参照) 。このような溶液は商
業的に入手可能であり、例えば、HISTOPAQUER (Sigma) である。
【００５３】 典型的には、抗凝固処理した血液または血漿を、標準的手順に従い、勾配で層
状化し、遠心する（例えば、Fish et al. 、J.Virol.69:3737-3743(1995)参照）
。例えば、Fish et al. における手順を使用して、赤血球およびペレットからの
顆粒球は沈降するが、リンパ球および他の単核細胞、例えば、単球は血漿／密度
勾配の界面に止まる（例えば、Freshney、Culture of Animal Cells(第3 版、19
94) 参照) 。
【００５４】 選択した細胞を単離した後、同種異系的刺激および単球由来マクロファージ（
「MDM 」）の分化を発生する条件下に細胞を培養する。細胞仲介同種異系的刺激
は、ミスマッチのハプロタイプおよび抗原に対する増殖および分化の応答である
。混合ハプロタイプを介する同種異系的刺激は、混合リンパ球または白血球反応
（「MLR 」）として普通に知られている。よく知られているMLR の１例は「１方
向」反応であり、ここで２つの個体からのPBMCを混合し、一方の個体からの細胞
を照射またはミトマイシンC 処理により不活性化させてある。１組の細胞を不活
性化し、他の組の細胞のみは増殖的応答を行う。しかしながら、本発明の培養物
において、反応はまた「２方向」反応として実施することができ、ここで双方の
組の細胞を刺激して増殖させる。こうして、本発明のMDM 培養物は１またはそれ
以上の遺伝子型を有することができる。
【００５５】 同種異系的刺激は細胞によりサイトカインの産生に依存するので、半透膜を使
用して、同種異系的に刺激されたPBMCから単球が単離される条件下に、単球由来
マクロファージを培養することもできる。２つの異なるハプロタイプを有する個
体から細胞、典型的にはPBMCを混合し、１つの隔室の中に入れるが、細胞、例え
ば、PBMCまたはより均質な単球の集団（２人のドナーのうちの１人または第3 の
ドナーからの）を第2 隔室の中に入れる。２つの隔室を半透膜により分離し、こ
こで隔室は流体連絡にある。
【００５６】 このようにして、第１隔室中の同種異系的に刺激されたPBMCが産生する可溶性
因子を第２隔室中の単球を刺激してMDM に分化させるために有効である。このよ
うな培養装置の１つの例は、トランスウェルシステム（商業的に入手可能である
）であり、ここで下部に0.45ミクロンの膜を有する小さいウェルをより大きいウ
ェルの内側に入れる。MDM に分化させるべき単球またはPBMCを小さいウェルの中
に入れ、そしてハプロタイプ混合PBMCをより大きいウェルの中に入れる。コンデ
ィショニングした培地またはトランスウェルシステムをサイトカイン仲介同種異
系的刺激のために使用することができる。また、サイトカインが外因的に添加さ
れた培地を使用することができ、そして培地は細胞と前もって接触されていない
。
【００５７】 サイトカインは単球由来マクロファージへの単球の分化を促進するので、同種
異系的刺激は無細胞系において実施することもできる。無細胞、サイトカイン仲
介同種異系的刺激反応において、単一の個体からのPBMCまたは単球をサイトカイ
ン，例えば、IFN-γで直接的に処理して、MDM への単球の分化を活性化する（例
えば、実施例II参照）。この型の同種異系的刺激反応をサイトカイン仲介同種異
系的刺激と呼ぶ。
【００５８】 例えば、混合ハプロタイプを使用する１つの型の細胞仲介同種異系的刺激反応
において、２つの異なる血液異なるからの典型的には等しい数の生存可能な細胞
を混合する。約1 ×106 〜1 ×108 細胞／ml、好ましくはほぼ1 〜2 ×107 細胞
／mlの濃度で細胞を入れる。好ましくは、付着性培地、例えば、イスコーブ完全
培地をプレーティングのために使用する。培地は典型的には抗生物質、例えば、
ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、マイコスタ
チンおよびその他、好ましくはペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する
。培地は、また、血清、好ましくは非熱処理ヒトAB血清を１０％の濃度で含有す
る。血清を選択したウイルスに対する抗体について試験すべきである。例えば、
MDM 培養物をHCMVで感染または再活性化すべきとき、血清はウイルス（HCMV）お
よびウイルスに対する抗体を含有してはならない。
【００５９】 標準的条件下に適当な時間、好ましくは４８時間培養した後、細胞を洗浄して
非付着性細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）を除去する。この時点において、
単球は培養支持体に付着した。次いでほぼ５０％の使用済み培地：５０％の新鮮
な培地から構成された培地中で培養物を維持する。付着後に使用した培地は典型
的には増殖用培地、例えば、AIM-V(Gibco)と付着性培地、例えば、イスコーブと
の混合物である。培地の比は臨界的ではない。好ましくは、培地は６０％の増殖
用培地（例えばAIM-V)および３０および付着性培地（イスコーブ）である。この
培地は３〜４日毎に補充され、そして培養物を刺激後90日まで維持することがで
きる。付着後、培養物はほぼ104 〜106 細胞／mlの細胞密度を有する。
【００６０】 MDM 培養物を同種異系的刺激後ほぼ22〜26日に潜伏性ウイルスの再活性化につ
いて検査するか、あるいは同種異系的刺激後ほぼ8 〜10日に外因的ウイルスで感
染させる。外因的ウイルスのストックで感染させるために、典型的には1 〜100
の感染多重度（「MOI 」）を使用して細胞を感染させる（例えば、実施例I 参照
）。次いで細胞を標準的条件下に培養し、後述するように、ウイルスの存在につ
いて検査する。外因的ウイルスまたは再活性化ウイルスで感染した細胞を、非感
染培養物および非ウイルス的許容性培養物と比較する。
【００６１】 典型的には、本発明のウイルス的許容性培養物は非許容性細胞よりも約10,000
倍より大きいウイルスを産生する。MDM 培養物の感染または再活性化のための哺
乳動物ウイルスは、例えば、HCV 、HHV6、HHV7、HHV8、HIV 、およびHCV を包含
する。ウイルスのストックは商業的に入手可能な源、例えば、ATCC、または患者
の単離物（例えば、HCMV単離物POまたはPE、実施例I ）から得られる。ウイルス
のストックを標準的手順に従い力価測定し、維持する（例えば、Ausbel et al.
、supra;Sambrook et al.supra; 実施例I 参照）。
【００６２】 B. 細胞培養物 一般に、細胞培養の環境は、細胞成長のための支持体、気相、培地、および温
度のような因子の考察を包含する。支持体に結合させた単層中で成長する細胞、
例えば、単球のために、典型的にはプラスチック皿またはフラスコを使用する。
他の人工的支持体、例えば、ガラスおよび金属を使用することができる。支持体
はしばしばエッチングにより処理するか、あるいはコラーゲン、コンドロネクチ
ン、フィブロネクチン、およびラミニンのような物質でコーティングすることに
よって処理する。
【００６３】 培養容器の型は培養条件、例えば、多ウェルのプレート、ペトリ皿、組織培養
管、フラスコ、およびその他に依存する。細胞を最適条件下に成長させ、ここで
最適条件は細胞の型に基づいて実験的に決定される。例えば、付着前に、MDM 培
養に典型的な細胞密度は1 ×106 〜1 ×108 細胞/ml の培地で変化し、そして付
着後、典型的な細胞密度はほぼ1 ×104 〜1 ×106 細胞/ml である。
【００６４】 気相の重要な構成成分は酸素および二酸化炭素である。典型的には、大気の酸
素のテンションをMDM 培養物に使用する。気体透過性キャップを使用するか、あ
るいは培養容器の密閉を防止することによって、培養容器を通常インキュベータ
ーの雰囲気の中にベントして気体交換を可能とする。二酸化炭素は、細胞培地中
の緩衝剤とともに、ｐＨの安定化においてある役割を演じ、典型的にはインキュ
ベーター中に1 〜10％の濃度で存在する。同種異系的刺激およびMDM 培養のため
に好ましいＣＯ2 濃度は５％である。
【００６５】 培養した細胞を通常インキュベーター中で成長させる。インキュベーターは、
温度の局所的変化を説明する、適当な温度、例えば、細胞を得た動物の体温を提
供する。一般に、３７℃はMDM 細胞の培養に好ましい温度である。大部分のイン
キュベーターはほぼ大気の条件に加湿される。
【００６６】 規定された細胞培地は包装された、プレミックスの粉末または前もって滅菌さ
れた溶液として入手可能である。普通に使用される培地の例は、イスコーブ培地
、AIM-V 、RPMI 1640 、DMEM、およびマッコイ培地を包含する（例えば、Gibco
BRL/Life Technologies Catalogue and Reference Guide;Sigma Catalogue 参照
）。イスコーブ完全培地は付着前培養のために好ましく、そして混合増殖用およ
び付着培地は付着後培養のために好ましい。
【００６７】 規定された細胞培地はしばしば５〜２０％の血清、例えば、ヒト、ウマ、仔ウ
シ、および胎仔ウシ血清で補充される。同種異系的刺激およびMDM 培養のために
好ましい血清は、10％の非熱不活性化ヒトAB血清(Sigma) である。培地は通常緩
衝化して、好ましくは7.2 〜7.4 のｐＨに細胞を維持する。培地の他の補助物質
は、例えば、抗体、アミノ酸、糖類、および成長因子を包含する。
【００６８】 V. 培養した単球由来マクロファージの検出および特性決定 選択の細胞、例えば、PBMCまたは単球を同種異系的に刺激し、そして安定な培
養においてMDM に分化させた後、ウイルスの再活性化および感染に対する許容性
について細胞を検査する。典型的には、MDM 培養物を使用して、潜伏的感染、例
えば、HCMVの再活性化を検査する。樹枝状細胞のマーカーを発現するマクロファ
ージは、また、HCMV以外の潜伏性ウイルスのための溜を構成することができる。
【００６９】 あるいは、培養物はまた外因的ウイルス感染の研究に有用である。本発明の培
養物は、感染しかつ単球由来マクロファージ中で複製する、多数の型の哺乳動物
のウイルス、例えば、下記のウイルスを研究するために適当である：HCMV（ヒト
サイトメガロウイルス）、ヘルペスファミリーのDNA ウイルス；HHV6、HHV7およ
びHHV8（ヒトヘルペスウイルス6 、7 、および8 ）、カポージ肉腫に関連するヘ
ルペスファミリーのDNA ウイルス）；HCV （Ｃ型肝炎ウイルス）；フラビウイル
スファミリーのRNA ウイルス；およびHIV （ヒト免疫不全ウイルス）、レンチウ
イルスファミリーのRNA ウイルス。
【００７０】 種々の技術を使用して、ウイルスによるMDM の感染を検査することができる。
核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅技術を使用して、ウイルスのゲノムお
よび転写を検出する。この分野において知られている多数の免疫学的技術の任意
の１つを使用して、ウイルスのタンパク質および粒子を検出する。感染した細胞
から上清を単離し、次いで他の細胞をウイルスで感染させることによって、ウイ
ルスの力価および感染性を検査する。例えば、ヒト繊維芽細胞のような細胞を普
通に使用して、連続希釈およびプラーク形成アッセイに従い、ウイルスの力価を
測定する。
【００７１】 MDM のウイルス感染を検出する、これらの技術を多数の用途に使用する。ウイ
ルスゲノム配列の検出は、潜伏的感染の診断のために有用である。ウイルスの転
写物、タンパク質、および粒子の検出は、ウイルス産生のインヒビターの作用の
検査に有用である。ウイルスのゲノム、転写物、タンパク質、および粒子の検出
は、また、in vitroのウイルスの生活環の研究に有用である。
【００７２】 A. 核酸の検出 本発明の細胞からのウイルスのDNA およびRNA の検出に使用する技術は、核酸
ハイブリダイゼーションをベースとする、広範な種類の技術、例えば、ノザンブ
ロット、サザンブロット、ドットブロット、DNA フィンガープリンティング、RN
アーゼ保護、およびフィルターハイブリダイゼーションを包含する。核酸ハイブ
リダイゼーション技術の１つの変法は、核酸の増幅をベースとする変法、例えば
、逆転写（「RT」）、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR 」）、リガーゼ連鎖反応（
「LCR 」）、および核酸配列をベースとする増幅（「NASBA 」）を包含する。こ
れらの方法において使用する検出可能な成分は、例えば、標識化ポリヌクレオチ
ドのプローブ、増幅またはRT反応における標識の直接的組込み、および標識化ポ
リヌクレオチドのプライマーを包含する。
【００７３】 ハイブリダイゼーションアッセイのために使用する核酸のプローブおよびプラ
イマーは、ターゲットのウイルスの遺伝子または転写物に対してハイブリダイゼ
ーションするように選択される。プローブはDNA またはRNA 分子、ならびにそれ
らの合成の、天然に存在しないアナローグであることができる。ハイブリダイゼ
ーション条件は、本明細書において議論するように、当業者により選択される。
【００７４】 プライマーおよびプローブは配列および長さが異なることができるが、主要な
識別の因子は機能の１つである：プライマーは、典型的には、RTおよびPCR 反応
におけるように、ターゲット核酸のDNA 合成のための開始点として働くが、プロ
ーブは典型的には相補的ターゲット核酸に対してハイブリダイゼーションおよび
その検出のために使用される。プライマーまたはプローブの典型的な長さは約７
〜約５０ヌクレオチドの範囲であることができる。プライマーまたはプローブは
、また、ターゲット核酸に対するプライマーまたはプローブのハイブリダイゼー
ションの検出のために、検出可能な成分で標識化することができる。
【００７５】 １つの好ましいハイブリダイゼーションアッセイは逆転写である。逆転写はRN
A をDNA にコピーする増幅法である。逆転写は、第１鎖のcDNAを合成し、典型的
には次のようにして実施される。RNA をランダムヘキサマーのプライマーまたは
特異的プライマーと混合し、70℃に5 分間加熱して核酸を変性し（サーマルサイ
クラーをこの工程に使用することができる）、次いで氷上で冷却する。
【００７６】 反応混合物を、酵素の製造業者の使用説明書に従うか、あるいはキットの使用
説明書に従い調製し、変性されたRNA およびヘキサマーの混合物に添加し、適当
な温度、通常４２℃においてインキュベートする。反応混合物を含有する管を70
℃に10分間加熱することによって、反応を停止させる。沈降および短時間の遠心
により、第１鎖のcDNAを収集し、アリコートと新しい管に取り、ここでそれをド
ライアイス上で急速に凍結させ、必要に応じて、後に使用するために、-70 ℃に
おいて貯蔵することができる。
【００７７】 ハイブリダイゼーションアッセイのために他の好ましい型は、PCR （ポリメラ
ーゼ連鎖反応）およびLCR （リガーゼ連鎖反応）のような増幅をベースとするア
ッセイである。このようなアッセイを実施する標準的技術はこの分野において知
られている(PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplificat
ion(Erlich編、1989);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(In
nis 、Gelfland、Sninsky 、& Whtite編、1990);Mattila et al.、Nucleic Acid
s Res.19:4967(1991));Eckert & Kunkel、PCR Methods and Applications 1:17(
1991));Wallace et al. 、Ligase Chain Reaction 、in Technology for Detect
ion of DNA Damage and Mutations 、pp.307-322(Pfiefer編、1996) 。
【００７８】 RTおよびPCR 反応は同一アッセイにおいてしばしば使用され、そしてRT−PCR
と呼ばれる。RT−PCR はRNA のDNA への逆転写および引き続くDNA 増幅反応を単
一の反応において組合わせる。最適な逆転写、ハイブリダイゼーション、および
増幅条件は、使用する１またはそれ以上のプライマーおよびターゲットの配列の
組成および長さ、および実施者が選択する実験方法に依存して変化するであろう
。種々のガイドラインを使用して、適当なプライマーの配列およびハイブリダイ
ゼーション条件を選択することができる（例えば、Sambrook et al. 、supra 参
照）。
【００７９】 例えば、PCR は典型的には緩衝化水溶液中で、好ましくはｐＨ７〜９において
実施される。デオキシヌクレオチド三リン酸を合成混合物に適切な量で添加し、
生ずる溶液を約85〜100 ℃に約1 〜10分間加熱することができる。この任意の加
熱期間後、プライマーのハイブリダイゼーションのために、溶液を約20〜40℃に
放冷する。重合のための物質を混合物に添加し、そしてこの分野において知られ
ている条件下に、典型的にはサーマルサイクラーを使用して、反応を発生させる
。
【００８０】 室温から重合のための物質がもはや効率よく機能しない温度よりちょうど上ま
での温度において、この合成反応を起こすことができる。重合のための物質は、
プライマーエクステンション産物の合成を達成するように機能する、任意の化合
物または系であることができ、酵素を包含する。この目的に適当な酵素は、例え
ば、大腸菌(E.coli)DNA ポリメラーゼI またはクレノー断片、TaqDNAポリメラー
ゼ、および他の入手可能なDNA ポリメラーゼを包含する。
【００８１】 ウイルスゲノム配列の存在を検出する最後の好ましい方法は、サザンハイブリ
ダイゼーションである。簡単に述べると、DNA を細胞から単離し、制限酵素で消
化する。消化したDNA を緩衝液中においてアガローススラブ上で展開し、膜に移
す。ウイルスの核酸に対して特異的にハイブリダイゼーションする、標識化プロ
ーブを使用して、膜に対するハイブリダイゼーションを実施する（例えば、Ausb
el et al. 、supra;Sambrook et al.supra; 実施例III 参照）。
【００８２】 また、ウイルスが感染した細胞はin situ ハイブリダイゼーションにより同定
することができる。標準的方法に従い、組織または細胞の試料をガラススライド
上に固定し、in situ ハイブリダイゼーション技術とともに使用するために透過
性とする。試料を固定した後、選択したウイルス核酸に対して特異的にハイブリ
ダイゼーションするプライマーを試料に対してハイブリダイゼーションさせ、次
いでプライマーのハイブリダイゼーションを、例えば、RT−PCR プロトコールま
たは本明細書に記載する他の方法に従い、検出する。
【００８３】 前述の、ハイブリダイゼーションを検出する、これらの方法は、一般に、検出
可能な成分の使用を含む。検出可能な成分を含むプライマーおよびプローブを、
この分野において知られている標準的方法により合成する（例えば、Ausbel et
al. 、supra;Sambrook et al.supra参照）。検出可能な成分は直接的または間接
的に検出可能であり、プライマーまたはプローブに関連させることができる。直
接的に検出可能な成分は、例えば、分子の５’末端において32Ｐで標識化された
ポリヌクレオチド、または放射性ヌクレオチド組込んだポリヌクレオチドを包含
する。間接的に検出可能な成分は、例えば、ストレプトアビジンにより認識され
るビオチニル化ヌクレオチド組込んだポリヌクレオチド、または放射能標識化相
補的配列のための結合相手であるヌクレオチド配列を包含する。
【００８４】 検出可能な成分は、しばしば、測定可能なシグナル、例えば、放射性、色素形
成、または蛍光シグナルを発生し、これらは、例えば、ウイルス産生を検出する
物質の能力を測定するための、結合した検出可能な成分を定量するために使用す
ることができる。シグナルの定量は、この分野において知られている方法、例え
ば、シンチレーションカウンティング、デンシトメトリー、またはフローサイト
メトリーにより達成される。
【００８５】 好ましくは、アプライド・バイオ・システムス(Aplied Bio Systems)または他
の商業的に入手可能なオリゴヌクレオチドの合成装置を製造業者により提供され
る規格書に従い使用して、オリゴヌクレオチドを合成する。任意の適当な方法、
例えば、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法、またはそれらの自動
化された態様を使用して、オリゴヌクレオチドを製造することができる。１つの
このような態様において、ジエチルホスホルアミダイトを出発物質として使用し
、そしてジエチルホスホルアミダイトは、下記の文献に記載されているように、
合成することができる：Beaucage et al. 、Tetrahedron Letters 22:1859(1981
) 、および米国特許第4,458,066 号。
【００８６】 また、プラスミドまたは他のベクターを使用して、核酸、例えば、プローブを
組換え的に製造することができる。ヌクレオチド配列の複製および転写するため
に、適当なプロモーター、複製配列、選択可能なマーカー、およびその他を含め
ることによって、原核生物または真核生物中で機能するように、ベクターを適合
させることができる。ベクターの構築およびトランスフェクトされた細胞中の遺
伝子の複製および発現は、また、この分野においてよく知られている分子クロー
ニング技術の使用を包含する（例えば、Ausbel et al. 、supra;Sambrook et al
.supra;Berger & Kimmel、Vol.52、Methods in Enzymology 、Guide to Molecul
ar Cloning Techniques 、(1987)) 。
【００８７】 遺伝情報を細胞の中に輸送するために使用する特定のベクターは、また、特に
は臨界的ではない。問題の配列を含有するベクターを、複製および発現のために
宿主細胞の中に形質転換することができる。宿主細胞の中に遺伝物質を導入する
ために使用する特定の手順は、特には臨界的ではない。利用する特定の手順は、
遺伝子を発現できる宿主細胞の中に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入する
ことができることのみが必要である（一般に、Sambrook et al.supra;Ausbel et
al.、supra 参照）。
【００８８】 B. ウイルスのタンパク質および細胞表面のマーカーの免疫学的検出 核酸のハイブリダイゼーション技術を使用するウイルスの遺伝子および遺伝子
の発現に加えて、ウイルスのタンパク質を検出し、そしてウイルス産生を阻害す
る能力について試験する物質の阻害活性を測定するために、イムノアッセイを使
用することもできる。イムノアッセイを使用して、例えば、ウイルス産生を阻害
する物質についてのアッセイにおいて、感染した細胞におけるウイルスタンパク
質の産生を定性的または定量的に分析することができる。適用可能な技術の一般
的外観は、Harlow & Lane 、A Laboratory Manual(1988) の中に見出すことがで
きる。
【００８９】 1. ウイルスタンパク質に対する抗体 ウイルスタンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体を産生する方法は、この分野において知られている（例えば、Coligan
、Current Protocols in Immunology(1991);Harlow & Lane 、suprac;Goding 、
Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2 版、1986);およびKohler
& Milstein 、Nature 、256:495-497(1975) 参照）。このような技術は、ファ
ージまたは同様なベクター中の組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択によ
り抗体の産生、ならびにウサギまたはマウスを免疫化することによるポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体の産生を包含する（例えば、Hase et al. 、
Science 246:1275-1281(1989);Ward et al. 、Nature 341:544-546(1989)参照）
。
【００９０】 多数のウイルスタンパク質の免疫原を使用して、ウイルスタンパク質と特異的
に反応する抗体を製造することができる。例えば、一般的に前述したように、組
換えウイルスタンパク質またはその抗原性フラグメントを単離し、真核細胞また
は原核細胞中で発現させ、そして精製することができる。組換えタンパク質は、
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生に好ましい免疫原である。
あるいは、合成ウイルスペプチドを担体タンパク質に結合させ、免疫原として使
用することができる。
【００９１】 天然に存在するタンパク質を、また、純粋な形態または不純物の形態で使用す
ることができる。次いで、抗体を産生することができる動物に、産物を注入する
。タンパク質を測定するイムノアッセイにおいて、引き続いて使用するために、
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を発生させる。抗原として使用す
るために適当なウイルスタンパク質は、ヘルペスウイルス（例えば、HHV6〜8 ま
たはCMV ）の主要な初期タンパク質および糖タンパク質gB、gDおよびgH；HIV 糖
タンパク質gp120 、ホスホタンパク質p24 、RT、およびプロテアーゼ；HCV 糖タ
ンパク質E1およびE2、および構造タンパク質C を包含する。
【００９２】 ポリクローナル抗体を製造する方法はこの分野において知られている。標準的
アジュバント、例えば、フロインドアジュバント、および標準的免疫化プロトコ
ールを使用して、マウスまたはウサギの同系交配系統をタンパク質で免疫化する
。被験採血を取り、選択したウイルス抗原に対する反応性の力価を測定すること
によって、免疫原調製物に対する動物の免疫応答をモニターする。免疫原に対し
て適当に高い抗体力価が得られたとき、血液を動物から収集し、抗血清を製造す
る。必要に応じて、抗血清をさらに分画してタンパク質に対して反応性の抗体を
濃縮することができる（Harlow & Lane 、supra 参照）。
【００９３】 当業者に知られている種々の技術によりモノクローナル抗体を得ることができ
る。簡単に述べると、所望の抗原で免疫化した動物からの脾細胞を、普通に骨髄
腫細胞との融合により、永久分裂能化させる（Kohler & Milstein 、Eur.J.Immu
nol.6:511-519(1976) 参照）。永久分裂能化の別法は、EBウイルス、オンコジー
ン、またはレトロウイルスを使用する形質転換、あるいは他のこの分野において
よく知られている方法を包含する。
【００９４】 単一の永久分裂能化細胞から発生単一のコロニーを、所望の特異性および抗原
に対してアフィニティーを有する抗体の産生についてスクリーニングし、そして
種々の技術、例えば、脊椎動物の宿主の腹腔の中への注入により、このような細
胞が産生するモノクローナル抗体を増強することができる。あるいは、Huse et
al. 、Science 246:1275-1281(1989) により概説されている一般的プロトコール
に従い、ヒトB 細胞からのDNA ライブラリーをスクリーニングすることによって
、モノクローナル抗体またはその結合性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を
単離することができる。
【００９５】 モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ、例
えば、固体の支持体上に固定化された免疫原を使用する固相イムノアッセイにお
いて免疫原タンパク質に対する力価を測定する。104 またはそれより大きい力価
を有するポリクローナル抗血清を選択し、競合結合イムノアッセイを使用して、
非ウイルスタンパク質またはさらに他の相同的タンパク質に対する交差反応性に
ついて試験する。特異的ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は通常
少なくとも約0.1mM 、より通常少なくとも約1 μM 、好ましくは少なくとも約0.
1 μM またはそれよりすぐれた、最も好ましくは0.01μM またはそれよりすぐれ
たＫｐで結合するであろう。
【００９６】 いったんウイルスの特異的抗体が入手されると、ウイルスタンパク質を種々の
イムノアッセイ法により検出することができる。免疫学的およびイムノアッセイ
の手順については、下記の文献を参照のこと：Basic and Clinical Immunology(
Stites & Terr 編、第7 版、1991参照）。そのうえ、本発明のイムノアッセイは
、下記の文献において広範に概観されている、いくつかの遠心法の任意のものに
従い実施することができる：Maggio編、1980);およびHarlow & Lane 、supra 。
【００９７】 2. 免疫学的結合アッセイ ウイルスタンパク質の発現は、感染または潜伏的感染の再活性化のシグナルで
ある。ウイルス産生の阻害は、また、ウイルスタンパク質の発現レベルをモニタ
ーすることによって測定することができる。したがって、多数のよく認識されて
いる免疫学的結合アッセイの任意のアッセイにより、ウイルスタンパク質を検出
しおよび／または定量することができる（例えば、米国特許第4,366,241 号、米
国特許第4,376,110 号、米国特許第4,517,288 号、および米国特許第4,837,168
号参照）。
【００９８】 一般的イムノアッセイの概観については、下記の文献を参照のこと：Methods
in Cell Biology Vol.37:Antibodies in Cell Biology(Asai編、1993);Basic an
d Clinical Immunology(Stites & Terr 編、第7 版、1991) 。典型的には、疫学
的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、分析物（この場合において、ウイ
ルスタンパク質またはその抗原性サブ配列）に特異的に結合しかつしばしばそれ
を固定化する「捕捉因子」を利用する。捕捉因子は分析物に特異的に結合する成
分である。当業者によく知られておりかつ前述した、多数の手段により、抗体を
製造することができる。
【００９９】 イムノアッセイは、また、捕捉因子および分析物により形成された結合性複合
体に特異的に結合しかつそれを標識化する標識化因子をしばしば利用する。標識
化因子は、それ自体、抗体／分析物複合体からなる成分の１つであることができ
る。こうして、標識化因子は標識化されたウイルスのポリペプチドまたは標識化
された抗体であることができる。あるいは、標識化因子は抗体／抗原複合体に特
異的に結合する第３成分、例えば、他の抗体であることができる。
【０１００】 1 つの態様において、標識化因子は標識を支持する第２抗体である。あるいは
、第２抗体は標識を欠如するが、引き続いて、第２抗体が由来する種の抗体に対
して特異的な、標識化された第３抗体により結合されることができる。第２抗体
は検出可能な成分、例えば、ビオチンで修飾することができ、この検出可能な成
分に、第３の標識化された分子、例えば、酵素標識化ストレプトアビジンは特異
的に結合することができる。
【０１０１】 免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合することができる他のペプチド、例
えば、プロテインA またはタンパク質G をまた標識化因子として使用することが
できる。これらのタンパク質は、ストレプトコッカルの細菌の細胞壁の通常の構
成成分である。それらは種々の種からの免疫グロブリンの定常領域に対して強い
非免疫原性反応性を示す（一般的に、Kronval et al.、J.Immunol.111:1401-140
6(1973);Akerstrom et al.、J.Immunol.135:2589-2542(1985))。
【０１０２】 アッセイを通じて、試薬の各組合わせ後に、インキュベーションおよび／また
は洗浄の工程を必要とすることがある。インキュベーション工程は約５秒〜数時
間好ましくは約５分〜約２４時間で変化させることができる。しかしながら、イ
ンキュベーション時間はアッセイのフォーマット、分析物、溶液の体積、濃度、
およびその他に依存するであろう。通常、アッセイは周囲温度において実施され
るであろうが、ある範囲の温度、例えば、10℃〜40℃において実施することがで
きる。
【０１０３】 試料中のウイルスタンパク質を検出するイムノアッセイは競合的または非競合
的であることができる。非競合的イムノアッセイは、捕捉された分析物（この場
合において、タンパク質）の量を直接測定するアッセイである。１つの好ましい
「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、捕捉因子（抗ウイルスタンパク質
の抗体）を固体の支持体に直接結合させて、固体の支持体上に捕捉因子を固定化
することができる。次いで、固定化された抗体は試験試料の中に存在するウイル
スタンパク質を捕捉する。
【０１０４】 こうして固定化されたウイルスタンパク質は次いで標識化因子、例えば、標識
を支持する第２ウイルスタンパク質の抗体により結合される。あるいは、第２抗
体は標識を欠如することができるが、引き続いて、第２抗体が由来する種の抗体
に対して特異的な、標識化された第３抗体を第２抗体に結合させることができる
。第２抗体を検出可能な成分、例えば、ビオチンで修飾することができ、この検
出可能な成分に、第３の標識化された分子、例えば、酵素標識化ストレプトアビ
ジンは特異的に結合することができる。
【０１０５】 競合アッセイにおいて、試料の中に存在するウイルスタンパク質（分析物）の
量は、試料の中に存在する分析物により捕捉因子（抗ウイルスタンパク質の抗体
）から置換された（または競合する）添加された（外因的）分析物の量を測定す
ることによって、間接的に測定される。１つの競合的アッセイにおいて、既知の
量の、この場合において、選択したウイルスタンパク質を試料に添加し、次いで
試料を捕捉因子、この場合において、選択したウイルスタンパク質に特異的に結
合する抗体と接触させる。
【０１０６】 抗体に結合するウイルスタンパク質の量は、試料の中に存在するウイルスタン
パク質の濃度に逆比例する。特に好ましい態様において、抗体を固体の支持体上
に固定化する。抗原／抗体の複合体の中に存在するウイルスタンパク質の量を測
定するか、あるいは残留する非複合化タンパク質の量を測定することによって、
抗体に結合したウイルスタンパク質の量を決定することができる。ウイルスタン
パク質の量は、標識化ウイルスタンパク質の分子を準備することによって検出す
ることができる。
【０１０７】 ハプテン阻害アッセイは他の好ましい競合アッセイである。このアッセイにお
いて、既知の分析物を固体の支持体上に固定化し、そして既知量の抗体を試料に
添加する。次いで固定化された試料を、抗原および抗体を含有する試料と接触さ
せる。抗体に結合するウイルスタンパク質の量は、試料の中に存在するウイルス
タンパク質の濃度に逆比例する。再び、抗体の固定化された画分または溶液の中
に残留する抗体の画分により、固定化された抗体の量を検出することができる。
前述したように、検出は間接的であることができ、ここで抗体に特異的に結合す
る標識化成分を引き続いて添加することによって、抗体は標識化されるか、ある
いは間接的である。
【０１０８】 ウェスタンブロット（イムノブロット）を使用して、試料中のウイルスタンパ
ク質の存在を検出し、定量する。この技術は、一般に、分子量に基づいてゲル電
気泳動により試料のタンパク質を分離し、分離されたタンパク質を適当な固体の
支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘
導化されたナイロンフィルター）に移し、そして選択した抗原に特異的に結合す
る抗体と試料をインキュベートすることからなる。抗体は固体の支持体上の抗原
に特異的に結合する。これらの抗体は直接標識化するか、あるいは引き続いて一
次抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識化ヒツジ抗マウス抗体）を
使用して検出することができる。
【０１０９】 他のアッセイのフォーマットはリポソームイムノアッセイ（「 LIA」）を包含
し、これは特定の分子（例えば、抗体）に結合し、包膜された試薬またはマーカ
ーを解放するように設計されたリポソームを使用する。次いで解放された化学物
質を標準的技術に従い検出する(Monroe et al.、Amer.Clin.Prod.Rev.5:34-41(1
986)参照）。
【０１１０】 当業者は理解するように、イムノアッセイにおいて非特異的結合を最小化する
ことがしばしば望ましい。特に、アッセイが固体の支持体上に固定化された抗原
または抗体を含む場合、支持体に非特異的に結合する量を最小化することが望ま
しい。このような非特異的結合の手段は当業者によく知られている。典型的には
、この技術は支持体をタンパク質の組成物でコーティングすることを包含する。
特に、タンパク質の組成物、例えば、ウシ血清アルブミン（「BSA 」）、無脂肪
粉末状ミルク、およびゼラチンは広く使用されており、粉末状ミルクは最も好ま
しい。
【０１１１】 アッセイにおいて使用される特定の標識または検出可能な基は、アッセイにお
いて使用される抗体の特異的結合を妨害しないかぎり、本発明の決定的な面では
ない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的性質を有する、任意の物
質であることができる。このような検出可能な標識はイムノアッセイの分野にお
いてよく開発されてきており、そして、一般に、このような方法において有用な
大部分の標識を本発明に適用することができる。こうして、標識は分光的、光化
学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能
な、任意の組成を有する。
【０１１２】 本発明において有用な標識は、磁気ビーズ（例えば、 DynabeadsTM) 、蛍光色
素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン
、およびその他）、放射能標識（例えば、3H、125I、35S 、14C 、または32P)、
酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼお
よびELISA において普通に使用されている他のもの）、および比色標識、例えば
、コロイド状金または着色したガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレ
ン、ポリプロピレン、ラテックス、およびその他）ビーズを包含する。
【０１１３】 この分野においてよく知られている方法に従い、標識をアッセイの所望の成分
に直接的または間接的にカップリングすることができる。上に示したように、広
範な種類の標識化を使用することができ、標識の選択は必要な感受性、化合物と
の結合、安定性の要件、入手可能な計装、および廃棄の条件の各々に依存する。
【０１１４】 非放射性標識化はしばしば間接的手段により結合される。一般に、リガンド分
子（例えば、ビオチン）を分子に共有結合させる。次いでリガンドは抗リガンド
（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合し、この分子は固有的に検出可能で
あるか、あるいはシグナル系、例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化
学発光化合物に共有結合される。多数のリガンドおよび抗リガンドを標識化され
た、天然に存在する抗リガンドと組み合わせて使用することができる。あるいは
、任意のハプテンまたは抗原性化合物を抗体と組み合わせて使用することができ
る。
【０１１５】 分子は、また、シグナル発生化合物に、例えば、酵素または蛍光団との複合化
により、直接複合化することができる。標識として重要な酵素は主としてヒドロ
ラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグルコシダーゼ、またはオキ
シダーゼ、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物は、フルオレセインおよ
びその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウベリフェロン、およ
びその他を包含する。化学発光化合物は、ルシフェリン、および２，３−ジヒド
ロフタラジンジオン、例えば、ルミノールを包含する。使用できる種々の標識化
またはシグナル生成系の概観については、米国特許第4,391,904 号を参照のこと
。
【０１１６】 標識化を検出する手段はこの分野においてよく知られている。こうして、例え
ば、標識が放射性標識である場合、検出手段はシンチレーションカウンターまた
はオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムを包含する。標識が蛍光
標識である場合、それは蛍光色素を適当な波長で励起させ、そして生ずる蛍光を
検出することによって検出することができる。蛍光は視的に、写真フィルムによ
り、電子的検出器、例えば、電化結合素子（「CCD 」）または光電子増倍管およ
びその他の使用により検出することができる。
【０１１７】 同様に、酵素標識は酵素のために適当な基質を準備し、そして生ずる反応産物
を検出することによって検出することができる。最後に、簡単な比色標識は単に
標識に関連する色を観測することによって検出することができる。こうして、種
々のディップスティックアッセイにおいて、結合した金はしばしばピンクを示す
が、種々の結合したビーズはビーズの色に見える。
【０１１８】 いくつかのアッセイのフォーマットは標識化成分の使用を必要としない。例え
ば、凝集アッセイを使用してターゲット抗体の存在を検出することができる。こ
の場合において、抗原をコーティングした粒子はターゲット抗体を含む試料によ
り凝集する。このフォーマットにおいて、成分を標識化することは不必要であり
、そしてターゲット抗体の存在は簡単な視的検査により検出される。
【０１１９】 VI. ウイルス許容性単球由来マクロファージの特性決定 前述の免疫学的および核酸の技術は、また、特異的細胞のマーカーを使用して
、本発明のウイルス許容性単球由来マクロファージを単離することができる。種
々の細胞の精製法はこの分野において知られている。典型的には、細胞を単離す
る物理的分離技術と組み合わせて使用するために、物理的または機能的マーカー
を選択する。例えば、細胞を精製するために免疫学的技術と組み合わせて、細胞
表面の分子がしばしば使用される。
【０１２０】 例えば、本発明のウイルス的に許容性のMDM は、マクロファージ細胞表面のマ
ーカーCD14およびCD64、および樹枝状細胞のマーカーCD68、CD1aおよびCD83を発
現する。HCV による潜伏的感染は他の適当なマーカーである。あるいは、ウイル
ス的許容性の機能的特性を使用してMDM を単離することができる。本発明のMDM
について、細胞表面のマーカーCD14およびCD83は単離のための好都合な物理的マ
ーカーを提供する。したがって、CD14およびCD83に対する抗体を使用して細胞を
同定する（マーカーとして使用する追加の抗原については、実施例IVを参照のこ
と）。CD14、CD83および他の細胞表面の抗原は商業的に入手可能である。
【０１２１】 前述したように、抗体を抗原に結合させる、多数の技術はこの分野において知
られている。抗体が結合した細胞は標識化するか、あるいはしないことができる
。いったん抗体が細胞に結合したとき、物理的分離技術を使用して、培養中の細
胞の残部から抗体結合細胞を分離する。例えば、細胞をアフィニティーカラムの
上を通過させるか、あるいはフローサイトメトリーに付すことができる。他の技
術は、密度勾配遠心法、免疫パニング、磁気活性化細胞ソーティング、およびフ
ィコール勾配の電気泳動またはカーテン電気泳動を包含する（例えば、Freshney
、supra 参照）。単離後、精製されたMDM 細胞を前述したように培養する。
【０１２２】 VII. ウイルス活性化、ウイルスインヒビター、およびウイルス感染についての
アッセイ 本発明は、HCMV潜伏的感染を再活性化することができる、安定なMDM のウイル
ス的許容性培養物を最初に提供する。こうして、これらの培養物を使用して、ウ
イルス産生および潜伏的感染の再活性化を阻害する物質を同定することができる
。ウイルス産生は、例えば、HHV6〜8 、HIV 、およびHCV ならびにHCMVであるこ
とができる。
【０１２３】 ウイルス産生を阻害する分子の能力は、前述の種々のin vitroアッセイ、例え
ば、イムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、ア
ッセイすることができる。ウイルス産生のインヒビターは、潜伏的感染および外
因的感染の双方の、哺乳動物のウイルス疾患の薬学的治療剤として有用である。
特に、ウイルス産生のインヒビターは潜伏性ウイルスの感染の再活性化を防止す
るために使用することができる。
【０１２４】 ウイルス産生の潜在的インヒビターである分子は、アンチセンス核酸、リボザ
イム、小さい化学的分子、およびタンパク質を包含する。ウイルス産生の阻害の
ためのターゲットは、酵素、例えば、ウイルスゲノムの複製に関係するウイルス
ポリメラーゼ、ウイルス転写のアクチベーター、ウイルスプロテアーゼ、例えば
、UL80、UL89、およびHIV プロテアーゼ、およびウイルス粒子の成分を包含する
。インヒビターはターゲット遺伝子、mRNA、およびタンパク質であることができ
る。種々の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感
染、リポフェクション、受動的拡散、脂質溶解度、および活性輸送により、イン
ヒビターを細胞に導入することができる。
【０１２５】 ウイルス産生の潜在的インヒビターで処理された細胞の試料またはアッセイを
、インヒビターを含まない対照試料と比較して、阻害の程度を検査する。典型的
には、MDM の培養物を外因的に添加されたウイルスまたは潜伏性ウイルスで感染
させる。対照の非感染培養物と平行して、細胞の試料を潜在的インヒビターで処
理し、適当な期間の間インキュベートし、次いでウイルス産物について検査する
。対照試料（インヒビターで未処理）に、100 の相対的ウイルス産生活性値を割
り当てる。対照に関するウイルス産生活性値が約75、好ましくは50、より好まし
くは25であるとき、ウイルス産生の阻害は達成される。
【０１２６】 ウイルス産生のインヒビターの効能を決定するために、細胞をウイルス遺伝子
の発現産物についてアッセイする。前述の核酸および免疫学的技術を使用して、
ウイルス転写、ウイルスタンパク質の発現、およびウイルス粒子を検出すること
ができる。
【０１２７】 前述したように、ウイルス感染の特性決定は、また、有用なin vitro診断道具
である。潜伏的感染の間に、典型的にはウイルスゲノムは部分的または全体的に
抑制される。こうして、ウイルスゲノムを収容する細胞を同定し、次いで潜伏的
感染を再活性化する能力について、またはウイルスゲノムの配列の存在について
検査しなくてはならない。前述の本発明の培養法およびアッセイは、ウイルス、
例えば、HCMVで潜在的に潜伏的に感染された細胞を単離し、そして細胞を検査し
て細胞が感染されたか否かを決定する手段を提供する。
【０１２８】 この明細書に引用したすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物およ
び特許出願が特別にかつ個々に引用することによって本明細書の一部とされるよ
うに示される場合、引用することによって本明細書の一部とされる。 理解を明瞭とする目的で例示および実施例により本発明を多少詳細に説明した
が、本発明の教示にかんがみて当業者にとって容易に明らかなように、本発明の
精神または範囲から逸脱しないである種の変化および変更が可能である。
【０１２９】 実施例 下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきで
はない。本質的に同様な結果を生ずるように変化または変更することができる、
種々の非決定的なパラメーターは、当業者は容易に認識するであろう。実施例I ： 同種異系的またはマイトジェンの刺激によるPBMCからのマクロファ ージの発生はHCMVの変更された成長を生ずる
【０１３０】方法 A. 同種異系的に刺激されたPBMC培養物の確立 同種異系的に刺激されたMDM(「Allo-MDM」）を製造するために、以前に記載さ
れているように（Fish et al. 、1995) HISTOPAQUER (Sigma Chemical Company)
上の密度勾配遠心法により、32人の健康な血液ドナーの血液試料からPBMCを単離
した。引き続いて、ペニシリン（100IU/ml) 、ストレプトアビジン（100 μg/ml
、双方はGibco Laboratoriesから）および10% のヒトAB血清(Sigma Chemical Co
mpany 、非熱不活性化、抗CMV 陰性）を含有するイスコーブ完全培地の中にPBMC
を懸濁させた。同種異系的刺激検査のために、２人の異なる血液ドナーからの等
しい数の細胞を1.8 ×107 細胞/ml の濃度で混合した後、プリマリア(Primaria)
皿(Becton Dickinson)をプレートした。
【０１３１】 5 ％CO2 中で37℃において48時間培養した後、非付着性細胞を取出した。培養
物を洗浄し、50％の使用済み培地/50 ％の新鮮な培地から構成された培地中で維
持し、培地を刺激後90日まで3 〜4 日毎に補充した。以前に記載されているよう
に(Fish et al.、J.Virol.70:1855-1862(1996)) 個々のドナーからのPBMCをコン
カナバリンA で刺激することによって、対照細胞の培養物を確立した。刺激後第
1 日を、初期のPBMCの単離および同種異系的刺激またはコンカナバリンA 刺激後
の日として定義する。潜在的HCMV再活性化のためのドナーはHCMV陽性であり、外
因的ウイルスの培養のためのドナーはそのウイルスに対して血清反応陰性であっ
た。
【０１３２】 また、トランスウェル系を使用して、培養を確立した。この系において、２人
のドナーからのPBMCを混合し、外側のウェルの中に入れた。ドナーの一方または
第3 のドナーからのPBMCを内側のウェルの中に入れ、このウェルは下部に０．４
５ミクロンの膜を有した。この膜は２つの隔室中のPBMCを流体連絡に維持させる
。４８時間後、内側のウェル中の細胞をプレートし、洗浄してMDM 培養物を確立
した。
【０１３３】 B. MDM 培養物のHCMV感染 HCMVの２つの最近の患者の単離物を使用して、MDM の一次培養物を感染させた
。HCMV疾患を有する移植患者から、これらの単離物（POおよびPE）を単離した。
感染したヒト繊維芽細胞（「HF」）培養物の上清から、-70 ℃で貯蔵する無細胞
ウイルスのストックを調製した。実験において使用するウイルス系統をHF細胞中
で１５回以下継代した。同種異系的刺激またはコンカナバリンA で刺激後8 〜10
日に、MDM 培養物をHF上清で1 〜10の感染多重度（「MOI 」）で感染させた。モ
ック感染のために、非感染培養物からの培地に細胞を暴露させた。培養物を3 日
毎に供給し、感染後異なる時点でウイルス力価のアッセイのために収集した。
【０１３４】 C. イムノサイトメトリー 8 ウェルのチャンバーのスライドまたはプリアマリア(Primaria)96ウェルのプ
レート中で成長させた、感染したHCMVおよびモック感染したMDM 培養物を感染後
異なる時点において収集した。細胞をPBS 中で洗浄し、リン酸塩緩衝化1 ％パラ
ホルムアルデヒド（「PFA 」）またはメタノール／アセトン(1:1) 中で室温にお
いて10分間固定し、PBS 中の0.3 ％トリトン-X100 で透過性とした。
【０１３５】 細胞をPBS 中の10％正常ヤギ血清または10％ヒトAB血清で室温において30分間
ブロックし、その後、異なるHCMV遺伝子産物に対する抗体で1:100 希釈で室温に
おいて1 〜16時間ブロックし、主要な即時型タンパク質（ウサギ抗MIE(Stenberg
et al. 、J.Virol.63:2699-2708(1989)) 、またはgB( マウス抗gB(UL55 ））に
対する抗体でブロックした。双方モノクローナル抗体はWilliam Britt(Universi
ty of Alabama 、アラバマ州バービンガム）から提供された(Britt & Vugler 、
J.Virol.66:6747-6754(1992)) 。
【０１３６】 細胞をPBS 中で3 回洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート−テト
ラメチル（「FITC」）結合ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ抗体で室温において
1 〜2 時間、一次抗体の結合を検出した。細胞表面のマーカーについて二重イム
ノサイトメトリーを生きている細胞について実施した後、固定し、HCMV IE 抗原
について染色した。染色された細胞をPBS 中で洗浄し、スロー・フェイド・アン
チフェイド・キット(Slow fade Antifade Kit)(Molecular Prodbes Inc. 、オレ
ゴン州エウゲン）の中に取り付けて最小蛍光退色を保証した。蛍光陽性の細胞を
直立または倒立ライツ(Leitz) 蛍光顕微鏡で可視化し、感染した細胞を計数した
。
【０１３７】 D. 樹枝状細胞の培養 PBMCを前述したように単離し、プリマリアプレート上にプレートして単球を付
着させた。２時間培養した後、無血清培地中で３回洗浄して非付着性細胞を除去
し、そして以前に記載されているように(Sallusto et al.、J.Exp.Med.179:1109
-1118(1994))付着性細胞をIl-4(1000U/ml)およびGM-CSF(50ng/ml) で刺激した。
1 ％のピルビン酸ナトリウムを含有するRPMI培地中で培養した未熟樹枝状細胞を
、培養の最初の１２日間発育させた。
【０１３８】 樹枝状およびマクロファージのマーカーの発現を決定するフローサイトメトリ
ー分析のために、細胞の試料を第12日に収集した。小さい、丸い樹枝状細胞をIF
N-γ(10ng/ml) 、IFN-γ(500U/ml) 、またはTNF-γ(10ng/ml) 及びTNF-γ(500U/
ml) で2 日間刺激した。その後、付着性樹枝状細胞を本明細書において記載する
ようにHCMVで10のMOI でチャレンジするか、あるいはモック感染させた。
【０１３９】結果 A. HCMVを使用する外因的感染 コンカナバリンA 刺激PBMC（「Con A-MDM 」）またはAllo-MDMにより発生した
マクロファージにおいて、ウイルスの複製の特性を比較した。10の感染多重度（
「MOI 」）のAllo-MDMのHCMV感染は、細胞の急速な溶解性感染を生じた。細胞変
性作用（「CPE 」）は感染後の日数（「dpi 」）3 に検出可能であり、そして感
染したAllo-MDMの＞80％の溶解は7dpiに観察された。1 のMOI の感染は、20日の
観察期間にわたって非溶解性であった。対照的に、Con A-MDM のHCMV感染はMOI
＞10において90dpi までの間隔で非溶解性であった。
【０１４０】 B. ウイルス産生の検出 Allo-MDMにおけるHCMVの複製の反応速度を検査するために、in vitro感染した
培養物を種々の時点において感染性ウイルスの産生についてモニターした。Allo
-MDMにおけるHCMVの複製の反応速度は急速であり、そして細胞および細胞外の双
方の画分において有意な量のウイルスが見出された。これらの特性は、in vitro
で成長するHCMVについてプロトタイプの細胞である繊維芽細胞中のウイルスの複
製に類似する。対照的に、Con A-MDM におけるウイルスの複製は遅延され、より
低いレベルのウイルスの複製を示し、そしてウイルスは細胞の画分に関連しての
み見出された。
【０１４１】 Allo-MDMにおける非制限HCMVの複製についての同種異系的刺激の重要性は、HL
A が同一の双生児からのPBMCを混合することによって誘導された培養物中でウイ
ルスの複製が欠如することによって証明された。HCMV感染したAllo-MDMの頻度を
、即時型（「IE」）ならびに後期糖タンパク質B(「gB」）抗原の免疫蛍光による
検出によりアッセイした。Con A-MDM 培養物中のウイルス抗原を発現する細胞の
小さい数（＜10％）と対照的に、Allo-MDMの50％より大きい比率は１２dpi にお
いてIEおよびgBの双方の抗原を発現した。さらに、構造タンパク質gBの発現の反
応速度はAllo-MDM内の急速な産生と相関した。マイトジェン的に分化したMDM に
比較して、同種異系的に推進された分化プロセスにより発生されたマクロファー
ジ中のHCMVの高度に変更された激しい成長を、これらの観察は証明する。
【０１４２】 Allo-MDMはマクロファージのマーカー（CD14およびCD64）および樹枝状細胞の
マーカー（CD83およびCD1a）双方を発現するが、これに対してCon A-MDM はマク
ロファージのマーカー（CD14およびCD64）のみを発現する。いくつかの樹枝状細
胞をAllo-MDMに関係付けることができるので、HCMVの複製を樹枝状細胞において
検査した。単球が濃縮された培養物をIL-4およびGM-CSFで処理することによって
、単球由来樹枝状細胞(MDDC ）が得られた。
【０１４３】 MDDCは樹枝状細胞のマーカーCD1aおよびCD83を発現したが、単球／マクロファ
ージのマーカーCD14およびCD64を発現しなかった。MDDCのHCMVin vitro感染は、
細胞の25〜45％中で1dpiにおいてIEの発現を生じた。しかしながら、IEまたは後
期のウイルス抗原は20dpi までのこの間隔を過ぎて検出されなかった。成熟DCを
得るためのIFN-γまたはTNF-γによるMDDCの追加の刺激は、刺激後第12日までに
未刺激の細胞において観測された発現を超えてウイルスの複製を増加しなかった
。これらの結果が示すように、Allo-MDM、Con A-MDM およびMDDCのすべてはCD14 + 単球に由来するが、HCMVはこれらの異なる細胞の型の各々において異なる複製
パターンを表示する。
【０１４４】実施例II ： Allo-MDMの発生はサイトカインIFN-γ、および CD4+ および CD8+ T 細胞により仲介される 方法 A. PBMC下位集団の陰性の選択 CD4+ または CD8+ T 細胞を消耗したAllo-MDM培養物を得るために、ミニMACS
系(Milteny Biotec 、Bergish Gladbach、ドイツ国）をそれぞれの細胞の型の陰
性の選択のために使用した。
【０１４５】 CD4+ T 細胞（抗ヒトLeu-3a) 、 CD8+ T 細胞（抗ヒトLeu-2a、双方はBecton
Dickinsonから）またはイソ型対照血清（マウスIgG1Fc、R&D Systems 、ミネソ
タ州ミネアポリス）に対して向けられたモノクローナル抗体で、新しく単離した
PBMCを染色した。500 μl の無血清イスコーブ培地中の1 ×108 細胞を力価過剰
のそれぞれの抗体と4 ℃において45分間インキュベートした。細胞を冷PBS 中で
2 回洗浄し、250 μl のMACS緩衝液（5mM のEDTAおよび0.5 ％のＢＳＡを含有す
るPBS ）の中に再懸濁させ、160 μl のラット抗マウスIgG1結合MACSビーズと4
℃において20分間インキュベートした。
【０１４６】 各MACSカラムを15mlのMACS緩衝液で洗浄した後、それぞれの試料を添加した。
流れ抵抗下に磁場中のカラムを通して流すことによって、MACSビーズに結合した
PBMCを試料から排除した。各カラムを4ml のMACS緩衝液で洗浄し、収集した細胞
を無血清培地中で２回洗浄し、完全60/30 培地中に再懸濁させた。 2 人のドナーからの細胞を前述したように同種異系的に刺激した。各Allo-MDM
培養物の確立前に、陰性選択の前後の各試料の小さいアリコートをフローサイト
メトリーにより分析して各試料の満足な純度を保証した。
【０１４７】 B. HLA クラスI およびHLA クラスIIのブロッキングの実験 T 細胞と単球との間の相互作用をブロックするために、HLA A 、B 、C 、また
はHLA-DR（双方はImmunotechから、メイン州ウェストブルック）の定常領域、ま
たはイソ型対照（マウスIgG2a またはマウスIgG2b 、双方はR&D Systems)に対し
て向けられたモノクローナル抗体を35μg/mlの濃度において7 ×107 と4 ℃にお
いて、同種異系的に刺激前に、イスコーブ完全培地中で7 ×107 細胞と１時間イ
ンキュベートした。その後、培養物中の非付着性細胞および抗体を無血清培地中
の３回の洗浄により除去し、Allo-MDM培養物を完全60/30 培地中で30日間まで培
養した。
【０１４８】 C. Allo-MDM培養物中の中和 中和実験のために、ヒトGM-CSF、IL-1、IL-2、TGF-αまたはIFN-γ(R&D Syste
m)を使用して、MDM 培養物中の産生されたそれぞれのサイトカインをブロックし
た。抗体を培養物に同種異系的刺激と同時に添加し、刺激後４８時間培養物の中
に存在させた。その後、培養物中の非付着性細胞および抗体を無血清培地中の３
回の洗浄により除去し、Allo-MDM培養物を完全60/30 培地中で30日間まで培養し
た。
【０１４９】 D. 標準的樹枝状細胞培養物へのサイトカインの添加 PBMCを標準的条件下にIL-4およびGM-CSFとともに培養して、単球由来樹枝状細
胞を産生した（例えば、Annals Surg.226:1-5(1997) 参照）。樹枝状細胞をin v
itroで本明細書に記載する条件下にHCMVで感染させた。次いでTNF-αおよびIFN-
γの別々のおよび同時の添加により、いくつかの培養物を処理して、これらの標
準的方法に従い培養した細胞中のウイルスの成長に対するサイトカインの効果を
検査した。前述したように、ウイルスタンパク質IEおよびgBに対する抗体を使用
して、ウイルスの成長を測定する。感染後第1 、3 、8 、12、および20日に、ウ
イルスの成長を測定する。
【０１５０】結果 A. PBMCからの CD4+ T 細胞、 CD8+ T 細胞、およびMHC 分子の消耗 HCMV許容性Allo-MDMの発育のために重要であるPBMC集団内の細胞の因子を同定
するために、陰性選択技術に従い CD4+ または CD8+ T 細胞をPBMCから消耗させ
た。これらの実験のために、Allo-MDM培養物の確立前に、それぞれの細胞の型を
各ドナーのPBMCから排除した。陰性選択の前後に、フローサイトメトリー分析を
細胞について実施して、残留する細胞の表現型が3 ％より低いようにした。ウイ
ルスの抗原投与前のPBMCからの CD4+ または CD8+ T 細胞のいずれかの消耗は、
IEを発現するAllo-MDMの数を90％減少させ、そしてウイルス産生を3 〜4 対数だ
け減少させた。
【０１５１】 同種異系的刺激前に、HLA クラスI またはHLA クラスIIに対して向けられた中
和性抗体をPBMCに添加すると、また、ウイルスは3 〜4 対数だけ減少した。 これらの実験が証明するように、同種異系的反応によるHCMV許容性Allo-MDMの
発生は CD4+ および CD8+ T 双方のT 細胞ならびにHLA クラスI およびIIの分子
を含む。HCMV許容性Allo-MDMの形成をブロックするHLA クラスI およびIIに対し
て向けられた抗体の能力は、また、T 細胞の接触がこれらの細胞の特異的分化に
必要であることを証明する。
【０１５２】 Con A-MDM を使用する同様な実験において、 CD4+ T 細胞ではなく CD8+ T 細
胞の消耗、およびHLA クラスIII 分子ではなくHLA クラスI 分子の中和はMDM に
おけるウイルスの力価を有意に減少することが示された。これらの観察が示唆す
るように、HLA クラスI 経路を通る CD8+ T 細胞と単球との接触は、Allo-MDMお
よびCon A-MDM の双方の発生において重要である。したがって、２つの系の間の
決定的な差は、HCMV許容性Allo-MDMの発育のための CD4+ T 細胞仲介メカニズム
による単球の分化である。
【０１５３】 B. Allo-MDM培養物からのサイトカインの消耗 特定のサイトカインが許容性Allo-MDM中の潜在的HCMVの再活性化を仲介するか
どうかを決定するために、IL-1、IL-2、TNF-α、GM-CSF、またはIFN-γに対する
中和活性を有するポリクローナル抗体をAllo-MDM培養物に別々に添加した。Allo
-MDM培養物中のIFN-γの中和は、ウイルス抗原IEおよびgBを発現する細胞の有意
な減少、ならびに感染性ウイルスの産生の４対数の減少を生じさせた。
【０１５４】 さらに、IL-2の中和は感染した細胞の数を減少させるように見えた。上に列挙
したサイトカインの残部の中和は、潜在的HCMVを再活性化する培養物の能力に影
響を与えなかった。このデータが示すように、特にIFN-γはAllo-MDM中の潜伏性
ウイルスの成長に要求される。また、このデータが示すように、Allo-MDMの分化
はGM-CSFの除去により影響を受けるように見えないので、Allo-MDMは新しい細胞
の型である。対照的に、TNF-γの中和は感染したCon A-MDM 中のウイルス力価を
減少させた。
【０１５５】 C. 潜在的HCMVの再活性化およびサイトカインの消耗 同種異系的刺激細胞の培養物を確立し、他のサイトカインが潜在的ウイルスの
再活性化を要するかどうか決定した。血清の抗体についてELISA により、そして
PBMC中のHCMVのDNA の存在についてPCR により、ドナーをHCMVの暴露について試
験した。前述したように、中和性抗体を培養物に添加した。中和性抗体を添加し
ないで感染後14〜21日にHCMV IE タンパク質が検出され、そして刺激後21および
35日の間に付着性細胞において後期HCMV gB 抗原が検出された。刺激後52日に、
IE陽性細胞を定量した。刺激後の最初の48時間に、IL-1、IL-2、TNF-γ、TGF-β
、またはGM-CSFではなく、IFN-γの中和は、HCMV陽性Allo-MDMの数を80〜95％減
少させた。これらの結果が示すように、Allo-MDM中の潜在的HCMVの再活性化はIF
N-γの産生に依存する。
【０１５６】 D. 単球由来樹枝状細胞培養物 単球由来樹枝状細胞培養物をIL-4およびGM-CSFを使用する刺激を介する標準的
手順により、単球由来樹枝状細胞培養物を培養した。これらの細胞は、単球由来
マクロファージよりも異なる分化した細胞の型である。ほぼ８日後、樹枝状細胞
を本明細書において記載するように外因的に添加したHCMVで感染した。細胞は、
ウイルス抗原の発現の欠如により証明されるように、HCMVの成長について許容性
ではなかった（上を参照）。TNF-αおよびIFN-γは培養物のウイルスの許容性に
対する効果をもたなかった。
【０１５７】実施例III ： 健康な血液ドナーから得られたAllo-MDMからの潜在的HCMVの再活 性化およびHCMVの特性決定 方法 A. ウイルス力価のアッセイ MDM 培養物からの上清を感染後の異なる日に収集し、そして2 ％の胎仔ウシ血
清（「FBS 」）、２mMのL-グルタミン、100IU/mlのペニシリンおよび100 μg/ml
のストレプトマイシンを含有するDMEM培地の中に、付着性細胞をこすり取って入
れることによって、MDM を収集した。
【０１５８】 上清または超音波処理したMDM 細胞をHFの単層上にサブコンフルエンシーにお
いてプレートした。37℃でウイルスを最初の24時間付着させた後、細胞を培地中
で２回洗浄し、10％のFBS 、2mM のL-グルタミン、100IU/mlのストレプトマイシ
ン、および0.5 ％のオートクレーブ処理したSeaKemアガロース(Sigma) を含有す
るDMEM培地をオーバーレイした。培養物を14日間インキュベートし、4 日毎に供
給した。細胞をPBS 中の25％のホルムアルデヒドで15分間固定し、0.05％のメチ
レンブルー溶液で染色し、プラークを計数した(Wentwort & French、Proc.Soc.E
xper.Biol & Med.135:253-258(1970))。
【０１５９】 B. Allo-MDM 中のHCMVの複製の検出 前述したように、2 人の健康な血液ドナーからPBMCを混合することによって、
Allo-MDM培養物を確立した。HCMV遺伝子産物の検出、および／またはウイルスの
回収のために、試料を第1 、10、17、26、36、46、54、60、70、80および90日に
収集した。視的単離のために、超音波処理した細胞を96ウェルのプレートまたは
25cm2 の培養フラスコ中のHF（ヒト繊維芽細胞）上にサブコンフルエンシーでプ
レートした。4 ぽ毎に供給しながら96ウェルのプレート中のHF細胞を17〜20日間
インキュベートし、固定し、IEに対するポリクローナル抗体を使用してHCMV IE
抗原の存在について染色した(Fish et al.、J.Virol.69:3737-3743(1995)）。
【０１６０】 PCR 分析のために、示した時点においてこすり取りにより細胞の試料を収集し
た。それぞれ、QIAGEN BloodおよびCell culture DNAキットおよびRNeasyキット
を製造業者の使用説明書に従いを使用して、DNA およびRNA を調製した。HCMV特
異的プライマーをネステッドＲＴ−ＰＣＲ反応において使用して、IEおよび150R
NAを検出した(Ssderberg et al. 、1993) 。DNA またはRNA の存在について陽性
の対照として、グルコース-6- ホスファターゼデヒドロゲナーゼ（「G6PD」）を
検出するプライマーを各試料について使用した(Ssderberg et al. 、J.Virol.67
:3166-3175(1993)) 。
【０１６１】 HCMV IE およびG6PDについてのPCR 分析に使用したプライマーはイントロンを
スパンし、DNA およびRNA の増幅からの異なる大きさのバンドを生じたが、これ
に対してpp150 遺伝子はイントロンを含有せず、同一大きさのDNA およびRNA の
ＰＣＲ生成物を生じた。ＰＣＲ生成物を1 ％のアガロースゲル上の直接的ゲル分
析により可視化した。 Allo-MDM中のHCMVタンパク質の発現を検出する実験ならびにウイルスおよび細
胞のタンパク質を共局在化する二重標識実験において、イムノサイトメトリーで
記載したように、共焦点顕微鏡検査と組み合わせて免疫蛍光を利用した。
【０１６２】 C. ヒト繊維芽細胞の感染およびサザン分析 実験室のHCMV系統AD169 の無細胞ウイルスストック、Towne ならびに急性HCMV
疾患を有する骨髄移植の患者に由来する臨床単離物またはそれぞれのドナー対か
らのAllo-MDMからの細胞超音波処理物を使用してHF培養物を感染させた。細胞変
性作用が観測されたとき（再活性化された系統について10〜16週／実験室の系統
について7 〜9 週）DNA をHFから調製した。非感染HF細胞からの全体のDNA の10
μg をEcoRI またはHindIII で消化した後、32P 標識化コスミドクローンpCM105
8 およびpCM1048 およびpCM1039 を使用するサザンブロット分析を実施した(Fle
ckenstein 、B. et al. 、Gene、18:39-46(1982)) 。
【０１６３】結果 HCMVは同種異系の血液輸注、器官または骨髄の移植のレシピエントにおいて頻
繁に再活性化しそしてウイルスはin vitro感染の間にAllo-MDM中で変更された成
長を示すので、自然に感染した健康な血液ドナーから得られた同種異系的に刺激
されたPBMC中でウイルスがその潜在的状態から再活性化することができるかどう
かを見るために、ウイルスを検査した。
【０１６４】 A. PBMCのAllo- 刺激およびHCMVの再活性化 血清の抗体についてELISA により、そしてPBMC中のHCMVのDNA の存在について
PCR により、ドナーをHCMVの暴露について試験した。組織適合性ドナーの対から
のPBMCを混合することによって、同種異系的に刺激された細胞培養物を確立した
（方法について前述したように）。同種異系的刺激後48時間に、非付着性細胞を
培養物から除去し、そしてAllo-MDMを90日まで４毎に供給しながら、Allo-MDMを
維持した。
【０１６５】 B. Allo-MDMにおけるHCMV遺伝子の発現 細胞試料をこれらの培養物から示した間隔において収集し、RT−PCR によりHC
MV遺伝子の発現について評価した。Allo-MDM中のHCMV特異的タンパク質の存在を
免疫蛍光により検出し、そして超音波処理した細胞およびヒト繊維芽細胞（「HF
」）同時培養によりウイルス産生を評価した。5/5 同種異系的に刺激された培養
物中で刺激後１７日に、HCMV即時型（「IE」）RNA は最初に検出された。また、
後期外皮タンパク質pp150 が4/5 培養物中で刺激後17日に観測された。興味ある
ことには、１つのドナー対（ドナー対B)において、pp150 の発現は同種異系的刺
激後54日まで検出されなかった。
【０１６６】 HCMV RNAの発現と一致して、刺激後17〜60日の間において付着性細胞中のIEタ
ンパク質および後期タンパク質gBが検出された。17日前にHCMV転写物およびタン
パク質がAllo-MDM中で検出することができなかったことは、ウイルスが潜在性で
あり、そしてこの細胞の集団で持続的でないことを示す。ｐｃｍタンパク質を含
有するAllo-MDMの頻度は、ウイルス抗原が各培養物において最初に検出されたと
き、1 〜12/1000(0.1 〜1.2%) であった。刺激後60日までに、細胞の2 〜25% は
異なるAllo-MDM培養物中でHCMVタンパク質を発現した。この間隔において培養物
のあるものの中の感染した細胞の大きい数は、in vitroで再活性化されたウイル
スを有するAllo-MDMの再感染を反映するようである。
【０１６７】 C. 再活性化されたHCMVを使用するヒト繊維芽細胞の感染 Allo-MDM中の感染性ウイルスの存在を証明するために、HCMV陽性培養物から得
られた細胞を刺激後90日までに7 〜10毎に収集した。細胞の試料を超音波処理し
、HF上にプレートし、そしてHFの感染をHCMV IE について免疫蛍光により確認し
た。感染性ウイルスはこの方法によりAllo-MDM培養物の5/5 において刺激後26〜
61日に証明された。対照的に、Con A-MDM が同一個体のドナーからPBMCのマイト
ジェンの刺激により誘導されるとき、ウイルスは刺激後90日までに検出すること
ができなかった。
【０１６８】 興味あることには、HCMV再活性化は2 人のHCMV血清反応陰性ドナー（ドナー対
C)から得られたAllo-MDMにおいて観測された。しかしながら、これらのドナーの
1 人はHCMV DNA陽性であり、これはこのドナー対からのウイルスの回収と一致す
る。同一ドナーからのCon A-MDM における再活性化の不成功およびAllo-MDMにお
けるHCMVの再活性化の成功は、PBMCの分化プロセスにおける基本的差を意味する
。
【０１６９】 異なるドナー対から得られたAllo-MDMの超音波処理物とインキュベートしたHF
細胞から、長期間のウイルス単離の培養物を確立して、再活性化された感染性HC
MV系統の回収および特性決定を可能とした。10〜16週の培養後、6/7 ドナー対か
らの細胞の超音波処理物で感染させたHF細胞において、細胞変性作用が観測され
た。Allo-MDMから得られた再活性化HCMV系統はHF中でゆっくり複製し、急性感染
した個体から得られたHCMV単離物と同様に、極端に細胞関連性であった。
【０１７０】 D. 感染したヒト繊維芽細胞中のHCMVの制限酵素分析 再活性化ウイルスで感染したHF細胞からのHCMV DNAについて制限酵素分析を実
施して、各単離物の遺伝子型を決定した。この分析において、HindIII またはEc
oRI でH および Hα単離物を消化して得られたフラグメントの大きさは同一であ
ることが示された。さらに、制限酵素分析は、また、再活性化ウイルスの単離物
が実験室の単離物AD169 およびTowne ならびに急性HCMV疾患(Po ）を有する患者
から得られた単離物と異なることを証明する。これらの実験は再活性化ウイルス
系統のユニークな遺伝子型を明瞭に証明する。
【０１７１】実施例IV ： 樹枝状細胞のマーカーを発現するマクロファージにおいてHCMVの再 活性化は起こる 方法 下記の細胞の表現型マーカーに対して向けられたモノクローナル抗体を使用し
て、蛍光活性化細胞分析装置(FACSCalibur;Beckton Dickinson) を細胞表面の発
現のすべての分析について使用した：CD4 、CD8 、CD19、CD56、CD13、CD14、CD
64、CD1a、CD83、HLA クラスI 分子、HLA クラスII分子、CD40、VCAM-1およびIC
AM-1。イソ型対照抗体（マウスIgG1、IgG2a またはIgG2b)および二次抗体で染色
した細胞のバックグラウンドの染色に対して発生させたFITC（「FL1 」）または
フィコエリトリン（「FL2 」）の試料の対数蛍光を表示するヒストグラムドから
、平均の蛍光値を得た。
【０１７２】 陰性選択により調製された試料の純度の分析のために、CD4 、CD8 、CD19、CD
56（抗体はBeckton Dickinson またはDakopatts から購入した）陽性細胞の陰性
選択前後のPBMC試料のFITC（「FL1 」）を表示するヒストグラムドを発生させた
。陰性対照中の非感染細胞のバックグラウンドの染色を含まないように陽性細胞
についてのレベルを設定することによって、陽性細胞の百分率を推定した。
【０１７３】結果 HCMVを再活性化した細胞の型を同定するために、T 細胞、B 細胞、NK細胞、骨
髄性細胞、および樹枝状細胞上で発現した、特定の細胞表面のマーカーの発現に
ついて、Allo-MDMをフローサイトメトリーにより分析した。新鮮な単球と、組換
えIL-4およびGM-CSFで単球を刺激して発生させた樹枝状細胞とを使用して、対照
分析を実施した(Sallusto et al.、J.Exp.Med.179:1109-1118(1994))。
【０１７４】 T 細胞、B 細胞およびNK細胞のマーカーは付着性細胞の画分の中に存在しなか
った。Allo-MDMは、単球／マクロファージのマーカーCD14およびCD64の顕著に均
一な表面の発現を証明した。樹枝状細胞のマーカーCD1aおよびCD83の高いレベル
の発現がまた観測された。二重標識のフローサイトメトリー分析により証明され
るように、実験の時間経過を通じてCD14およびCD83の双方の共局在化がAllo-MDM
において絶えず観測された。対照的に、対照樹枝状細胞はCD1aおよびCD83を発現
したが、前に報告されたようにCD14について陰性であった(Sallusot 、supra)。
【０１７５】 高いレベルのHLA クラスII、HLA クラスI 、CD13、VCAM-1、ICAM-1およびCD40
がAllo-MDM上に、ならびに単球および樹枝状細胞上に観測された。これらのマー
カーの発現のパターンは、異なるドナー対から得られたAllo-MDMにおいて終始一
貫した。 二重標識の免疫蛍光共焦点顕微鏡検査により、HCMVに対する抗体を樹枝状およ
びマクロファージの抗原に対する抗体と組み合わせて利用して、ウイルスの細胞
起源を確証した。ドナーA から得られた細胞はHCMV IE ならびにCD83およびCD14
を刺激後28日に発現したが、刺激後26日にHCMV抗原に対して均一に陰性であった
。こうして、再活性化ウイルスを収容する細胞はCD14およびCD83の双方を発現し
た。
【０１７６】 前述の観測は、健康な個体の末梢血中の骨髄性系列の細胞が潜在的HCMVの源で
あり、これは同種異系的に刺激されると、感染性ウイルスを再活性化するという
最初の証拠を提供する。従来、CD14およびCD83の二重陽性の細胞は、IL-4および
GM-CSFで刺激されたCD34+ 造血性子孫の細胞の分化の間における一時的表現型で
あるとして報告された（Caux et al. 、J.Exp.Med.184:695-706(1996))。CD14+ 細胞は全体のPBMCのほぼ10％を表すので、1 〜12細胞／1000Allo-MDM中のウイル
スの検出はHCMVで潜伏的に感染されたPBMCの0.01〜0.12％の頻度を意味する。
【０１７７】実施例V ： HHV8血清反応陽性ドナーからのPBMCの同種異系的刺激後のHHV8の再 活性化 前述したように、HHV8血清反応陽性および血清反応陰性のドナーからの同時培
養したPBMCを使用して、Allo-MDMを調製した。8 日間の培養後、溶解サイクル関
連ORF59 に対する抗体で細胞を標識化した（前述の免疫蛍光方法、参照）。Allo
-MDMはORF59 の発現を示す。対照的に、Con A-MDM は潜伏性タンパク質ORF73 の
発現のみを示し、溶解サイクルの製造を発現しない。
【０１７８】実施例VI ： HIV-1 のT 細胞向性およびマクロファージ向性系統によりAllo-MDM の感染 前述したように、Allo-MDMを調製し、T 細胞向性、マクロファージ向性、およ
び二重向性系統で感染させた。前述したように、p24 の発現を免疫蛍光により検
査した。Allo-MDMは産生的に各系統により感染された。
【０１７９】実施例VII ： トランスウェル系を使用するHCMV血清反応陰性ドナーからのAllo -MDMコンディショニングされた培地で刺激されたCD14+ 単球中のHC MVの再活性化 サイトカインまたは他の可溶性因子がHCMV許容性MDM に単球を分化させるため
に十分であるかどうかを決定するために、同種異系的に刺激されたMDM コンディ
ショニングされた培地を使用して、天然に感染された血清反応陽性ドナーから得
られたCD14+ 単球を分化させた。2 人の血清反応陰性ドナーのアロ反応から単一
の血清反応陽性ドナーからの単球を分離するために、トランスウェル系を使用し
た。ドナーからのPBMCを2 時間付着させた後、非付着性細胞を除去した。
【０１８０】 平行培養物からのアロコンディショニングされた培地を、刺激後1 、3 、5 、
および7 日に、付着した単球に添加した。コンディショニングされた培地は、平
行アロ−MDM 細胞培養物に類似する形態学およびウイルス許容性を有するMDM に
、単球を分化させるために十分であった。免疫蛍光を使用して、HCMV特異的タン
パク質IE86およびgBを発現するMDM を同定した。IE86およびgB陽性細胞は、刺激
後16および21日の双方において、血清反応陽性ドナーからのMDM 中で検出された
が、血清反応陰性ドナーまたはコンディショニングされた培地を供給されなかっ
た培地からのMDM 中で検出されなかった。これらの観測が示すように、同種異系
的刺激の間に産生するサイトカインはAllo-MDM中でHCMVを再活性化するために十
分である。
【０１８１】実施例VIII ： Allo-MDMおよびCon A-MDM についてのサイトカインのプロフィル ウイルス的に許容性のAllo-MDMの培養の間に産生されるサイトカインを決定す
るために、Allo-MDM、Con A-MDM および未刺激のマクロファージのサイトカイン
のプロフィルを検査した。培養上清を刺激後6 、12、24、36、および48時間、お
よび3 、5 、および8 日に収集した。前述したように、イムノアッセイを使用し
て下記のサイトカインについて培養物を分析した：IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、
IL-10 、IL-13 、GM-CSF、TGF-β、TNF-α、およびIFN-γ。サイトカインの分析
において、Con A-MDM に比較してAllo-MDMにおいて、これらの成長因子の産生の
実質的な差が生ずることが示された。これらの結果は、これらの２つの単球由来
細胞の型の間の表現型の差を際立たせる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【要約】 本発明は、末梢血単球（「PBMC」）の同種異系的刺激により単球由来マクロフ
ァージ中で潜伏性反応性を再活性化する方法、ウイルスを培養する方法、および
ウイルス許容性単球由来マクロファージの培養物を提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フィッシュ，ケネス エヌ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92122, サン ディエゴ，カミニト プラザ セン トロ 8889 ＃7116 (72)発明者 モセス，アシュリー アメリカ合衆国，オレゴン 97225，ポー トランド，サウス ウエスト バーンズ ロード 7400 ＃261 (72)発明者 ストレブロー，ダニエル アメリカ合衆国，オレゴン 97223，ティ ガード，サウス ウエスト ノース ダコ タ ストリート 12505 (72)発明者 ネルソン，ジェイ アメリカ合衆国，オレゴン 97062，テュ アラティン，サウス ウエスト メドウ ウェイ 21067 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA32 BA33 BA35 CA04 CA12 EA04 GA11 HA11 4B063 QA01 QQ08 QQ10 QR77 4B065 AA93X AA96X AA97X CA46

Claims (65)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ウイルス許容性単球由来マクロファージ中でウイルスを複製させる
    方法において、 （ａ）単球を生存可能な、同種異系的に刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ
    ）と流体連絡させた条件下に、単球を培養して単球を活性化させて、ウイルス許
    容性単球由来マクロファージに分化させ；そして （ｂ）単球由来マクロファージ中でウイルスを複製させ、ここでウイルスは単
    球中で潜伏性であるか、あるいは培養物に外因的に添加される； ことを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】単球由来マクロファージがＣＤ８３またはＣＤ１４を支持する細胞
    の主要な集団を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】単球由来マクロファージがＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ６
    ４およびＣＤ１４を支持する細胞の主要な集団を有する、請求項１に記載の方法
    。
  4. 【請求項４】同種異系的に刺激された細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を包含
    する、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】ウイルスがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（
    ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ
    ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペスウイルス８（Ｈ
    ＨＶ８）から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】ウイルスがＣＭＶである、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】単球由来マクロファージがヒトである、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】ウイルス許容性単球由来マクロファージを使用してウイルス産生の
    インヒビターをスクリーニングする方法において、 （ａ）単球を生存可能な、同種異系的に刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ
    ）と流体連絡させた条件下に、単球を培養して単球を活性化させて、ウイルス的
    に許容性の単球由来マクロファージに分化させ； （ｂ）単球由来マクロファージ中でウイルスを複製させ、ここでウイルスは単
    球中で潜伏性であるか、あるいは培養物に外因的に添加され； （ｃ）ウイルス産生を阻害する能力を有することが推測される物質と、工程（
    ｂ）の単球由来マクロファージを接触させ；そして （ｄ）単球由来マクロファージ中のウイルス産生のレベルを検出する； ことを含んで成る方法。
  9. 【請求項９】単球由来マクロファージがＣＤ８３またはＣＤ１４を支持する細胞
    の主要な集団を有する、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】単球由来マクロファージがＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ
    ６４およびＣＤ１４を支持する細胞の主要な集団を有する、請求項８に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】同種異系的に刺激された細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を包
    含する、請求項８に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ウイルスが潜伏性である、請求項８に記載の方法。
  13. 【請求項１３】単球由来マクロファージがヒトである、請求項８に記載の方法。
  14. 【請求項１４】物質がウイルスプロテアーゼのインヒビターである、請求項８に
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】物質がウイルスが発生する核酸に結合するアンチセンス分子であ
    る、請求項８に記載の方法。
  16. 【請求項１６】物質がウイルスゲノムによりコードされるｍＲＮＡに対して相補
    的であるアンチセンス分子である、請求項８に記載の方法。
  17. 【請求項１７】物質がウイルスゲノムによりコードされるｍＲＮＡに対して相補
    的であるリボザイムである、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】ウイルスがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス
    （ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨ
    Ｖ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペスウイルス８（
    ＨＨＶ８）から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】物質がスがＣＭＶである、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】物質がＣＭＶ ＤＮＡポリメラーゼ、ＵＬ８０、およびＵＬ８９
    から成る群より選択されるウイルスタンパク質を阻害する、請求項１８に記載の
    方法。
  21. 【請求項２１】単球由来マクロファージが同種異系的に刺激された末梢血単球細
    胞（ＰＢＭＣ）に暴露させた単球に由来し、ここで暴露時間および濃度は、（ｉ
    ）単球が単球由来マクロファージへ活性的に分化するのを刺激し、そして（ｉｉ
    ）単球由来マクロファージ中のウイルス産生を刺激するために十分であり、そし
    て、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージが非同種異系的刺激単球より
    も少なくとも１０，０００倍大きいウイルスを産生する、ウイルス的に許容性の
    単球由来マクロファージの安定な培養物。
  22. 【請求項２２】単球由来マクロファージの大部分がＣＤ８３およびＣＤ１４を支
    持する、請求項２１に記載の培養物。
  23. 【請求項２３】単球由来マクロファージがＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ
    ６４およびＣＤ１４を支持する細胞の主要な集団を有する、請求項２１に記載の
    培養物。
  24. 【請求項２４】ウイルスがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス
    （ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨ
    Ｖ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペスウイルス８（
    ＨＨＶ８）から成る群より選択される、請求項２１に記載の培養物。
  25. 【請求項２５】物質がスがＣＭＶである、請求項２４に記載の培養物。
  26. 【請求項２６】少なくとも８５％がＣＤ８３およびＣＤ１４を支持するとして規
    定される集団を有するウイルス的に許容性の単球由来マクロファージの安定な培
    養物。
  27. 【請求項２７】単球由来マクロファージがＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ
    ６４およびＣＤ１４を支持する細胞の少なくとも８５％の集団を有する、請求項
    ２６に記載の培養物。
  28. 【請求項２８】ウイルスが潜伏性である、請求項２６に記載の培養物。
  29. 【請求項２９】単球由来マクロファージがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃ
    型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウ
    イルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペ
    スウイルス８（ＨＨＶ８）から成る群より選択されるウイルスを産生する、請求
    項２６に記載の培養物。
  30. 【請求項３０】物質がスがＣＭＶである、請求項２９に記載の培養物。
  31. 【請求項３１】単球由来マクロファージがヒトである、請求項２６に記載の培養
    物。
  32. 【請求項３２】単球を生存可能な、同種異系的に刺激された末梢血単核細胞（Ｐ
    ＢＭＣ）と流体連絡させた条件下に、単球を培養して単球を活性化させて、ウイ
    ルス的に許容性の単球由来マクロファージに分化させる工程からなる、ウイルス
    的に許容性の単球由来マクロファージを培養する方法。
  33. 【請求項３３】単球由来マクロファージがＣＤ８３またはＣＤ１４を支持する細
    胞の主要な集団を有する、請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】単球由来マクロファージがＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ
    ６４およびＣＤ１４を支持する細胞の主要な集団を有する、請求項３２に記載の
    方法。
  35. 【請求項３５】同種異系的に刺激された細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を包
    含する、請求項３２に記載の方法。
  36. 【請求項３６】単球由来マクロファージがヒトである、請求項３２に記載の方法
    。
  37. 【請求項３７】下記の特徴： （ｉ）樹枝状細胞のマーカーＣＤ６８、ＣＤ８３、およびＣＤ１ａからなる、 （ｉｉ）マクロファージ細胞のマーカーＣＤ６４およびＣＤ１４からなる、お
    よび （ｉｉｉ）ＣＤ１４＋単球に由来する、 を有するウイルス的に許容性の単球由来マクロファージの安定な培養物。
  38. 【請求項３８】ウイルス許容性単球由来マクロファージ中でウイルスを複製させ
    る方法において、 （ａ）ＣＤ１４＋単球を活性化させてウイルス的に許容性の単球由来マクロフ
    ァージに分化させるために十分な量において、ＩＦＮγからなるコンディショニ
    ングされた培地に前記単球を暴露させる条件下に、前記単球を培養し、そして （ｂ）単球由来マクロファージ中でウイルスを複製させ、ここでウイルスは前
    記単球中で潜伏性であるか、あるいは培養物に外因的に添加される、 ことを含んで成る方法。
  39. 【請求項３９】単球由来マクロファージがＣＤ８３またはＣＤ１４を支持する細
    胞の主要な集団を有する、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】単球由来マクロファージがＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ
    ６４およびＣＤ１４を支持する細胞の主要な集団を有する、請求項３８に記載の
    方法。
  41. 【請求項４１】ウイルスがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス
    （ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨ
    Ｖ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペスウイルス８（
    ＨＨＶ８）から成る群より選択される、請求項３８に記載の方法。
  42. 【請求項４２】ウイルスがＣＭＶである、請求項４１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】単球由来マクロファージがヒトである、請求項３８に記載の方法
    。
  44. 【請求項４４】ウイルス許容性単球由来マクロファージを使用してウイルス産生
    のインヒビターをスクリーニングする方法において、 （ａ）ＣＤ１４＋単球を活性化させてウイルス的に許容性の単球由来マクロフ
    ァージに分化させるために十分な量において、ＩＦＮγからなるコンディショニ
    ングされた培地に前記単球を暴露させる条件下に、前記単球を培養し、 （ｂ）単球由来マクロファージ中でウイルスを複製させ、ここでウイルスは単
    球中で潜伏性であるか、あるいは培養物に外因的に添加され、 （ｃ）ウイルス産生を阻害する能力を有することが推測される物質と、工程（
    ｂ）の単球由来マクロファージを接触させ、そして （ｄ）単球由来マクロファージ中のウイルス産生のレベルを検出する、 を含んで成る方法。
  45. 【請求項４５】単球由来マクロファージがＣＤ８３またはＣＤ１４を支持する細
    胞の主要な集団を有する、請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】単球由来マクロファージがＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ
    ６４およびＣＤ１４を支持する細胞の主要な集団を有する、請求項４４に記載の
    方法。
  47. 【請求項４７】ウイルスが潜伏性である、請求項４４に記載の方法。
  48. 【請求項４８】単球由来マクロファージがヒトである、請求項４４に記載の方法
    。
  49. 【請求項４９】ウイルスがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス
    （ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨ
    Ｖ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペスウイルス８（
    ＨＨＶ８）から成る群より選択される、請求項４４に記載の方法。
  50. 【請求項５０】ウイルスがＣＭＶである、請求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】単球由来マクロファージが同種異系的に刺激された末梢血単球細
    胞（ＰＢＭＣ）に暴露させたＣＤ１４＋単球に由来し、ここで量および暴露時間
    は、（ｉ）ＣＤ１４＋単球が単球由来マクロファージへ活性的に分化するのを刺
    激し、そして（ｉｉ）単球由来マクロファージ中のウイルス産生を刺激するため
    に十分であり、そして、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージは非同種
    異系的刺激単球よりも少なくとも１０，０００倍大きいウイルスを産生する、ウ
    イルス的に許容性の単球由来マクロファージの安定な培養物。
  52. 【請求項５２】単球由来マクロファージの大部分がＣＤ８３およびＣＤ１４を支
    持する、請求項５１に記載の培養物。
  53. 【請求項５３】単球由来マクロファージの大部分がＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１
    ａ、ＣＤ６４およびＣＤ１４を支持する、請求項５１に記載の培養物。
  54. 【請求項５４】単球由来マクロファージがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃ
    型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウ
    イルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペ
    スウイルス８（ＨＨＶ８）から成る群より選択されるウイルスを産生する、請求
    項５１に記載の培養物。
  55. 【請求項５５】物質がスがＣＭＶである、請求項５４に記載の培養物。
  56. 【請求項５６】少なくとも８５％がＣＤ８３およびＣＤ１４を支持するとして規
    定される集団を有するウイルス的に許容性の単球由来マクロファージの安定な培
    養物。
  57. 【請求項５７】集団がＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ６４およびＣＤ１４
    を支持する細胞の少なくとも８５％を有する、請求項５６に記載の培養物。
  58. 【請求項５８】ウイルスが潜伏性である、請求項５６に記載の培養物。
  59. 【請求項５９】単球由来マクロファージがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃ
    型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトヘルペスウ
    イルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペ
    スウイルス８（ＨＨＶ８）から成る群より選択されるウイルスを産生する、請求
    項５６に記載の培養物。
  60. 【請求項６０】物質がスがＣＭＶである、請求項５９に記載の培養物。
  61. 【請求項６１】単球由来マクロファージがヒトである、請求項５６に記載の培養
    物。
  62. 【請求項６２】ＣＤ１４＋単球を活性化させてウイルス的に許容性の単球由来マ
    クロファージに分化させるために十分な量において、ＩＦＮγからなるコンディ
    ショニングされた培地に前記単球を暴露させる条件下に、前記単球を培養する工
    程からなる、ウイルス的に許容性の単球由来マクロファージを培養する方法。
  63. 【請求項６３】単球由来マクロファージがＣＤ８３またはＣＤ１４を支持する細
    胞の主要な集団を有する、請求項６２に記載の方法。
  64. 【請求項６４】単球由来マクロファージがＣＤ８３、ＣＤ６８、ＣＤ１ａ、ＣＤ
    ６４およびＣＤ１４を支持する細胞の主要な集団を有する、請求項６２に記載の
    方法。
  65. 【請求項６５】単球由来マクロファージがヒトである、請求項６２に記載の方法
    。
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